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KR102003904B1 - 안정화된 알파-헬릭스 이차 구조를 갖는 펩타이드-고분자 결합체 제조방법 및 이를 이용해 제조된 펩타이드-고분자 결합체 - Google Patents

안정화된 알파-헬릭스 이차 구조를 갖는 펩타이드-고분자 결합체 제조방법 및 이를 이용해 제조된 펩타이드-고분자 결합체 Download PDF

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KR102003904B1 KR1020160104089A KR20160104089A KR102003904B1 KR 102003904 B1 KR102003904 B1 KR 102003904B1 KR 1020160104089 A KR1020160104089 A KR 1020160104089A KR 20160104089 A KR20160104089 A KR 20160104089A KR 102003904 B1 KR102003904 B1 KR 102003904B1
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임용범
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연세대학교 산학협력단
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Abstract

본 발명에 따른 펩타이드-고분자 결합체의 제조방법 및 이를 통해 제조된 펩타이드-고분자 결합체는, 펩타이드 리간드의 특이적 형태를 유지하면서 생물학적 상호작용 효과를 효과적으로 향상시킬 수 있도록, 다중 알파 헬릭스 리간드가 2차원 구조를 안정적으로 유지하면서 동시에 구축하기 위한 것이다.

Description

안정화된 알파-헬릭스 이차 구조를 갖는 펩타이드-고분자 결합체 제조방법 및 이를 이용해 제조된 펩타이드-고분자 결합체{manufacturing method of peptide-polymer conjugate with stabilized α-helices, peptide-polymer conjugate thereby}
본 발명은 펩타이드-고분자 결합체 합성을 위한 방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 알파-헬릭스 펩타이드의 다중 안정화 및 중합체 형성을 위한 스태플링 중합법을 활용한 새로운 펩타이드-고분자 결합체 제조방법과 이를 통해 제조된 펩타이드-고분자 결합체에 관한 것이다.
일반적으로 생체거대분자는 생물학적 기능을 수행하기 위하여, 특정 표적물질에 대해 우수한 친화성(affinity)과 선택성(selectivity)을 갖는다.
이와 같은 생체거대분자의 활성에 있어서 가장 중요한 요소는 상기 생체거대분자를 구성하는 펩타이드의 접힌 구조라 할 수 있다. 이러한 펩타이드의 접힌 구조는 특정 환경 조건을 유지함으로써, 상기 이차 구조의 형태를 안정적으로 제어할 수 있다. 허나 생체거대분자(예를 들어 단백질)로부터 펩타이드로 분리되게 되면, 펩타이드의 접힌 구조는 안정화되지 못하고, 활성을 갖지 못하는 무질서한 형태로 풀어져버리게 된다.
따라서 이와 같은 문제를 해결하고자 주위 환경에 영향을 받지 않으면서, 펩타이드의 이차 구조를 장기간 안정화하기 위한 다양한 연구들이 수행되어 왔다. 이들 대부분은 생체거대분자에서 가장 많이 사용되며 가장 중요한 활성을 갖는 구조인 알파-헬릭스 이차 구조의 펩타이드에 대한 연구들이였다.
이러한 연구들 중에서 가장 대표적인 연구로는 알파-헬릭스 이차 구조의 안정화를 위하여, 펩타이드를 고리형 분자로 자기조립함으로써 상기 펩타이드의 알파-헬릭스 이차 구조가 고리 내에 고정되도록 한 발명이 공지된 바 있다.
상기 고리형 펩타이드의 제조는 선형 펩타이드를 합성하는 것보다 과정이 복잡하고, 수율이 낮으며, 정제가 어렵다는 단점들로 인해, 상업화에 제한이 따랐다. 게다가 이러한 펩타이드 단량체는 어느 하나의 상호작용에 대해서만 특이성을 가질 뿐, 다중 상호작용을 표적할 수 없다는 근본적인 한계점이 존재한다.
본 발명은 상술한 문제점들을 극복하고, 다중 알파-헬릭스 이차구조를 안정적으로 갖는 펩타이드들을 동시에 구축할 수 있는 단일단계 합성법을 제공하기 위해 예의 연구 노력한 결과, 본 발명을 완성하기에 이르렀다.
대한민국 공개특허공보 제10-2016-0049529호
본 발명은 상기와 같은 문제점을 감안하여 안출된 것으로, 본 발명의 목적은 펩타이드-고분자 결합체 제조방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 아크릴로일기로 치환된 알파-헬릭스 펩타이드를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 아크릴로일기로 치환된 알파-헬릭스 펩타이드가 중합되어 형성된 펩타이드-고분자 결합체를 제공하는 것이다.
본 발명은 상기 목적을 이루기 위하여,
Ⅰ) 아크릴로일기로 치환된 알파-헬릭스 펩타이드를 합성하는 단계; 및
Ⅱ) 상기 Ⅰ) 단계로부터 합성된 아크릴로일기로 치환된 알파-헬릭스 펩타이드, 수용성 단량체 및 중합개시제를 용매에 용해하여 Ⅰ) 단계로부터 합성된 아크릴로일기로 치환된 알파-헬릭스 펩타이드의 아크릴로일기를 폴리아크릴아미드로 중합하는 단계;를 포함하는 펩타이드-고분자 결합체의 제조방법을 제공한다.
상기 Ⅰ) 단계의 아크릴로일기로 치환된 알파-헬릭스 펩타이드는 적어도 두 개의 라이신 잔기를 가지는 알파-헬릭스 펩타이드이고, 상기 알파-헬릭스 펩타이드에서 두 개의 라이신 잔기는 측쇄 아민기(입실론 아민기)의 수소를 아크릴로일기로 치환한 것일 수 있다.
상기 알파-헬릭스 펩타이드에서 반드시 두 개의 라이신 잔기는 반드시 서로 정확한 위치에 형성되어 있는 것으로, 상기 두 개의 라이신 잔기는 상기 알파-헬릭스 펩타이드 내에서 어느 하나의 라이신 잔기의 위치가 i라고 할 때, 이를 기준으로 7번째 위치(i+7)에 다른 라이신 잔기가 배치되어 있는 것일 수 있다.
상기 Ⅰ) 단계의 아크릴로일기로 치환된 알파-헬릭스 펩타이드는 적어도 상기 적어도 두 개의 라이신 잔기를 갖고, 상기 알파-헬릭스 펩타이드에서 반드시 두 개의 라이신 잔기는 i, i+7 번째 위치에 배치되어 있어야 하고, 상기 i, i+7 번째 위치에 배치된 라이신 잔기의 측쇄 아민기(입실론 아민기)의 수소가 아크릴로일기로 치환된 것일 수 있다.
상기 적어도 두 개의 라이신 잔기를 갖는 알파-헬릭스 펩타이드는 하기 서열번호 1 내지 10으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 알파-헬릭스 펩타이드인 것일 수 있다.
상기 용매는 트리스 완충액, 인산 완충액, 인산, 아세트산, 포름산, 염산, 황산, 질산, 시트르산, 헥사플루오로아이소프로판올 (hexafluoroisopropanol, HFIP), 헥사플루오로프로판올 (hexafluoropropanol, HFP), HFA(hexafluoroacetone), 트리플루오로아세트산(trifluoroacetic acid, TFA), 디아이소프로필 에틸아민(diisopropylethylamine), 및 메틸이미다졸리움 클로라이드(methylimidazolium chloride)로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상인 것일 수 있다.
상기 수용성 단량체는 아크릴아미드, 아크릴로니트릴, 아크릴로일클로리드, 메타크릴아미드, N-히드록시메틸아크릴아미드, N,N-디메틸아크릴아미드, N-아세타미도아크릴아미드, 2-아미노에틸메타크릴레이트, N,N-디메틸아미노에틸 메타크릴레이트, 알릴알콜, 2-히드록시에틸아크릴레이트, 2-히드록시에틸메타크릴레이트 및 2-히드록시프로필메타크릴레이트로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상인 것일 수 있다.
상기 중합개시제는 아조비스이소부티로니트릴(azobisisobutyronitrile(AIBN)), 암모늄 퍼설레이트(ammonium persulfate(APS)) 및 N,N,N′,N′-테트라메틸렌디아민(N,N,N′,N′-tetramethylenediamine(TEMED))로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상인 것일 수 있다.
상기 Ⅰ) 단계로부터 합성된 아크릴로일기로 치환된 알파-헬릭스 펩타이드와 상기 수용성 단량체는 1 : 10 내지 1 : 100 몰비로 혼합되는 것일 수 있다.
본 발명은 상기 다른 목적을 이루기 위하여, 아크릴로일기로 치환된 알파-헬릭스 펩타이드에 관한 것으로,
상기 알파-헬릭스 펩타이드는 적어도 두 개의 라이신 잔기를 가지고, 상기 알파-헬릭스 펩타이드 내에서 어느 하나의 라이신 잔기의 위치가 i라고 할 때, 이를 기준으로 7번째 위치(i+7)에 다른 라이신 잔기가 배치되어 있으며,
상기 라이신 잔기 중에서 두 개의 라이신 잔기는 측쇄 아민기의 수소가 모두 아크릴로일기로 치환된 것을 특징으로 하는 아크릴로일기로 치환된 알파-헬릭스 펩타이드를 제공한다.
상기 알파-헬릭스 펩타이드는 서열번호 1 내지 10 중에서 선택되는 어느 하나인 것일 수 있다.
본 발명은 상기 또 다른 목적을 이루기 위하여,
상기 아크릴로일기로 치환된 알파-헬릭스 펩타이드에서 아크릴로일기와 수용성 단량체가 중합되어 형성된 것으로, 중합된 선형 고분자를 주쇄로 하고, 상기 중합된 선형 고분자에 적어도 하나 이상의 알파-헬릭스 펩타이드가 고정되어 있는 것을 특징으로 하는 펩타이드-고분자 결합체를 제공한다.
상기 알파-헬릭스 펩타이드는 서열번호 1 내지 10 중에서 선택되는 어느 하나인 것일 수 있다.
상기 펩타이드-고분자 결합체는 상기 알파-헬릭스 펩타이드의 알파-헬릭스 이차구조가 안정화되어 있는 것일 수 있다.
상기 펩타이드-고분자 결합체는 0 내지 60 ℃ 하에서, CD 스펙트럼에서 [θ]208/[θ]222 비가 1 내지 1.5인 것일 수 있다.
상기 펩타이드-고분자 결합체는 0 내지 100 ℃에서도 CD 스펙트럼에서 [θ]208/[θ]222 비를 0.8 이상 유지하고 있는 것일 수 있다.
상기 펩타이드-고분자 결합체는 상기 알파-헬릭스 펩타이드 3 내지 20개가 고정되어 있는 것일 수 있다.
본 발명에 따른 펩타이드-고분자 결합체의 제조방법은 펩타이드의 특이적인 이차 구조를 안정적으로 유지하도록 함과 동시에 복수 개의 펩타이드가 선형 고분자 상에 고정되도록 제조하는 방법에 관한 것으로, 단일 혼합 공정을 통해 펩타이드-고분자 결합체를 간단하면서도 쉽게 합성할 수 있다는 장점을 갖는다.
이러한 펩타이드-고분자 결합체의 제조방법은 복수 개의 펩타이드를 선형 고분자 상에 동시에 고정할 수 있을 뿐만 아니라, 이차 구조를 안정화하여 생물학적 상호작용을 효과적으로 향상시키는 효과를 달성할 수 있다.
상기 신규한 펩타이드-고분자 결합체와 이를 제조하는 새로운 방법은 아크릴로일기로 개질된 펩타이드와 수용성 단량체 사이에 라디칼 중합을 유도하여 수행된 것으로, 이는 다가 생체거대분자 간의 상호작용을 조절하기 위해 개발될 수 있는 알파-헬릭스 펩타이드-고분자 결합체를 제조할 수 있는 가장 단순하면서도 가장 강력한 합성법이다.
또한 상기 제조방법을 통해 제조된 펩타이드-고분자 결합체는 복수 개의 서로 동일하거나 상이한 활성을 갖는 펩타이드를 동시에 고정하도록 합성할 수 있으므로, 다양한 적용분야에 활용될 수 있는 장점이 있다.
도 1a는 본 발명에 따른 펩타이드-고분자 결합체의 합성과정을 개략적으로 나타낸 도면이다.
도 1b는 본 발명에 따른 실시예 1로부터 제조된 펩타이드-고분자 결합체의 전반적인 합성과정을 구체적으로 나타낸 도면이다.
도 2a는 본 발명에 따른 펩타이드-고분자 결합체의 구조를 나타낸 도면이다.
도 2b는 본 발명에 따른 아크릴로일기로 치환된 알파-헬릭스 펩타이드의 구조를 나타낸 도면이다.
도 3은 증류수 상에서의 제조예 1로부터 제조된 아크릴로일기로 치환된 알파-헬릭스 펩타이드의 CD 스텍트럼이다.
도 4는 10% HFIP 용액(HFIP:water=1:9, v/v) 상에서의 제조예 1로부터 제조된 아크릴로일기로 치환된 알파-헬릭스 펩타이드의 CD 스텍트럼이다.
도 5는 실시예 1로부터 제조된 펩타이드-고분자 결합체(9 μM)의 CD 스펙트럼이다
도 6은 다양한 온도하에서 제조된 제조예 1의 아크릴로일기로 치환된 알파-헬릭스 펩타이드의 CD 스펙트럼이다.
도 7은 다양한 온도하에서 실시예 1로부터 제조된 펩타이드-고분자 결합체의 CD 스펙트럼이다.
도 8은 상기 CD 스펙트럼으로부터 얻은 온도에 따른 [θ]222/[θ]208 비를 나타낸 그래프이다.
도 9는 제조예 1로부터 제조된 아크릴로일기로 치환된 알파-헬릭스 펩타이드의 CD 스펙트럼이다.
도 10은 증류수에서 중합반응을 실시하여 제조된 실시예 2의 펩타이드-고분자 결합체의 CD 스펙트럼이다.
도 11은 인산 완충액에서 중합반응을 실시하여 제조된 실시예 3의 펩타이드-고분자 결합체의 CD 스펙트럼이다.
도 12는 트리스 완충액(Tris buffer; 15 mM, pH7.5)에서 중합반응을 실시하여 제조된 실시예 4의 펩타이드-고분자 결합체의 CD 스펙트럼이다.
도 13은 제조예 3으로부터 제조된 아크릴로일기로 치환된 알파-헬릭스 펩타이드의 CD 스펙트럼이다.
도 14는 비교예 1로부터 제조된 펩타이드-고분자 결합체의 CD 스펙트럼이다.
도 15는 단백질 마커와 실시예 5로부터 제조된 펩타이드-고분자 결합체의 SDS-PAGE의 결과를 나타낸 사진이다. 도 15에서 M은 단백질 마커이고, P는 실시예 5로부터 제조된 펩타이드-고분자 결합체를 나타낸다. 또한 우측 이미지는 형광이미지이다.
도 16은 본 발명에 따른 제조예 1 내지 3의 아크릴로일기로 치환된 알파-헬릭스 펩타이드의 구조를 구체적으로 나타낸 도면이다.
도 17a는 제조예 1에 따른 아크릴로일기로 치환된 알파-헬릭스 펩타이드의 MALDI-TOF mass 스펙트럼이다.
도 17b는 제조예 2에 따른 아크릴로일기로 치환된 알파-헬릭스 펩타이드의 MALDI-TOF mass 스펙트럼이다.
도 17c는 제조예 3에 따른 아크릴로일기로 치환된 알파-헬릭스 펩타이드의 MALDI-TOF mass 스펙트럼이다.
이하에서, 본 발명의 여러 측면 및 다양한 구현예에 대해 더욱 구체적으로 살펴보도록 한다.
본 발명의 일 측면은
Ⅰ) 아크릴로일기로 치환된 알파-헬릭스 펩타이드를 합성하는 단계; 및
Ⅱ) 상기 Ⅰ) 단계로부터 합성된 아크릴로일기로 치환된 알파-헬릭스 펩타이드, 수용성 단량체 및 중합개시제를 용매에 용해하여 Ⅰ) 단계로부터 합성된 아크릴로일기로 치환된 알파-헬릭스 펩타이드의 아크릴로일기와 수용성 단량체를 중합하는 단계;를 포함하는 펩타이드-고분자 결합체의 제조방법에 관한 것이다. 이의 구체적인 과정이 도 1a에 나타나 있다.
상기 Ⅰ) 단계의 아크릴로일기로 치환된 알파-헬릭스 펩타이드는 상기 알파-헬릭스 이차 구조를 갖는 펩타이드는 통상의 제조방법이라면 이에 제한되지 않고 사용하여 합성될 수 있고, 바람직하게는 Fmoc 고체상 펩타이드 합성 프로토콜을 사용하여 합성된 것일 수 있다. 구체적으로 Fmoc 고체상 펩타이드 합성 프로토콜을 사용하여 아래 과정을 통해 제조되는 것이 바람직하다.
ⅰ) 고체상 레진에 제1 아미노산 잔기를 결합시키는 단계;
ⅱ) 상기 제1 아미노산 잔기에 있는 Fmoc 보호기를 제거하고, 상기 제1 아미노산 잔기 상에 다음 제2 아미노산 잔기를 연결하는 단계;
ⅲ) 상기 ⅱ) 단계를 반복하여 i, i+7번째 위치에 배치된 두 개의 라이신 잔기의 측쇄 아민기(입실론 아민기)만 Dde 보호기로 보호된, 하기 서열번호 1 내지 10 중에서 선택되는 어느 하나의 알파-헬릭스 펩타이드를 합성하는 단계;
ⅳ) 상기 알파-헬릭스 펩타이드에서 상기 i, i+7번째 위치에 배치된 상기 두 개의 라이신 잔기의 측쇄 아민기(입실론 아민기)를 보호하고 있는 Dde 보호기를 제거하고, 상기 라이신 잔기의 측쇄 아민기(입실론 아민기)의 수소를 아크릴로일기로 치환하여 아크릴로일기로 치환된 알파-헬릭스 펩타이드를 합성하는 단계; 및
ⅴ) 상기 아크릴로일기로 치환된 알파-헬릭스 펩타이드를 고체상 레진에서 분리하는 단계;를 통해 제조되는 것을 특징으로 한다(도 1b).
상기 ⅲ) 단계에서의 알파-헬릭스 펩타이드는 적어도 두 개의 라이신 잔기를 가지고, 있는 알파-헬릭스 펩타이드이고, 상기 두 개의 라이신 잔기는 상기 알파-헬릭스 펩타이드 내에서 어느 하나의 라이신 잔기의 위치가 i라고 할 때, 이를 기준으로 7번째 위치(i+7)에 다른 라이신 잔기가 배치되어 있는 것으로, 보다 바람직하게는 서열번호 1 내지 10 중에서 선택되는 어느 하나일 수 있다.
즉, 펩타이드를 합성하는 과정(ⅱ) 단계 반복)을 통해 적어도 두 개의 라이신 잔기를 갖는, 서열번호 1 내지 10로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 알파-헬릭스 펩타이드를 합성한다. 이때, i, i+7번째 위치에 배치되는 라이신 잔기는 반드시 측쇄 아민기(입실론 아민기)를 Dde 보호기로 보호된 아미노산 잔기를 이용하여 합성하고, 나머지 아미노산 잔기(i, i+7번째 위치 외의 위치에 배치되어 있는 라이신 잔기 포함)는 Dde 보호기를 제외한 나머지 보호기로 보호된 것을 사용하는 것이 바람직하다.
이를 통해 i, i+7번째 위치에 배치된 두 개의 라이신 잔기의 측쇄 아민기(입실론 아민기)만 Dde 보호기로 보호된, 하기 서열번호 1 내지 10 중에서 선택되는 어느 하나의 알파-헬릭스 펩타이드를 합성하게 된다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 상술한 구조의 알파-헬릭스 펩타이드를 이용할 경우, 상기 펩타이드 내에 두 개 이상의 라이신 잔기를 가지고 있다하더라도 i, i+7번째 위치에 배치되는 라이신 잔기의 측쇄 아민기(입실론 아민기)만 Dde 보호기로 보호되어 있기 때문에, 하기 단계를 통해 상기 i, i+7번째 위치에 배치되는 라이신 잔기의 측쇄 아민기(입실론 아민기)만 아크릴로일기로 치환할 수 있기 때문이다.
다만, i, i+7번째 위치에 배치되는 라이신 잔기의 측쇄 아민기(입실론 아민기)의 수소만 아크릴로일기로 치환된 알파-헬릭스 펩타이드를 제조하기 위해서는 가장 바람직하게 서열번호 1과 같이 i, i+7번째 위치에만 라이신 잔기가 배치된 알파-헬릭스 펩타이드를 사용할 수 있다.
상기 ⅳ) 단계를 위해서, 상기 알파-헬릭스 펩타이드를 2 내지 5 % 히드라진이 용해된 DMF 용액에 혼합한 다음, 여기에 아크릴로일 클로라이드(acryloyl chloride) 10 당량, DIPEA가 용해된 NMP 용액 20 당량을 처리하는 것일 수 있다.
상술한 과정을 통해 상기 알파-헬릭스 펩타이드의 i, i+7번째 위치에 배치된 두 개의 라이신 잔기의 측쇄 아민기의 수소만 모두 아크릴로일기로 치환한, 아크릴로일기로 치환된 알파-헬릭스 펩타이드를 합성할 수 있다.
상술한 과정을 통해 Ⅰ) 아크릴로일기로 치환된 알파-헬릭스 펩타이드를 합성하는데, 상기 Ⅰ) 단계의 아크릴로일기로 치환된 알파-헬릭스 펩타이드는 적어도 상기 두 개의 라이신 잔기를 갖고,
상기 알파-헬릭스 펩타이드에서 반드시 두 개의 라이신 잔기는 측쇄 아민기(입실론 아민기)의 수소가 아크릴로일기로 치환된 것일 수 있다.
상기 알파-헬릭스 펩타이드에서 상기 두 개의 라이신 잔기는 반드시 서로 정확한 위치에 형성되어 있는 것으로, 상기 두 개의 라이신 잔기는 상기 알파-헬릭스 펩타이드 내에서 어느 하나의 라이신 잔기의 위치가 i라고 할 때, 이를 기준으로 7번째 위치(i+7)에 다른 라이신 잔기가 배치되어 있는 것일 수 있다.
상기 Ⅰ) 단계의 아크릴로일기로 치환된 알파-헬릭스 펩타이드는 적어도 상기 두 개의 라이신 잔기를 갖고, 상기 알파-헬릭스 펩타이드에서 반드시 두 개의 라이신 잔기는 i, i+7 번째 위치에 배치되어 있어야 하고, 상기 i, i+7 번째 위치에 배치된 라이신 잔기의 측쇄 아민기(입실론 아민기)의 수소가 아크릴로일기로 치환된 것일 수 있다.
상기 적어도 두 개의 라이신 잔기를 갖는 알파-헬릭스 펩타이드는 하기 서열번호 1 내지 10으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 알파-헬릭스 펩타이드인 것일 수 있다.
[서열번호 1] p53 peptide
Gln Ser Gln Gln Thr Phe Lys Asn Leu Trp Arg Leu Leu Lys Gln Asn
[서열번호 2] p53 peptide
Gln Ser Gln Gln Thr Phe Lys Asn Leu Trp Lys Leu Leu Lys Gln Asn
[서열번호 3] p53 peptide
Leu Ser Gln Gln Thr Phe Lys Asn Leu Trp Arg Leu Leu Lys Gln Asn
[서열번호 4] p53 peptide
Leu Ser Gln Glu Thr Phe Lys Asn Leu Trp Lys Leu Leu Lys Gln Asn
[서열번호 5] p53 peptide
Leu Ser Gln Glu Thr Phe Lys Asp Leu Trp Lys Leu Leu Lys Glu Asn
[서열번호 6] p53 peptide
Leu Ser Gln Lys Thr Phe Ser Asp Leu Trp Lys Leu Leu Pro Glu Asn
[서열번호 7] p53 peptide
Leu Ser Gln Glu Lys Phe Ser Asp Leu Trp Lys Lys Leu Pro Glu Asn
[서열번호 8] p53 peptide
Leu Ser Gln Glu Thr Phe Ser Asp Lys Trp Lys Leu Leu Pro Glu Lys
[서열번호 9] p53 wild type peptide
Leu Ser Gln Glu Thr Phe Lys Asp Lys Trp Arg Leu Leu Lys Gln Asn
[서열번호 10] p53 wild type peptide
Gln Ser Gln Gln Thr Phe Lys Asn Leu Trp Arg Lys Lys Lys Gln Asn
Ⅱ) 상기 Ⅰ) 단계로부터 합성된 아크릴로일기로 치환된 알파-헬릭스 펩타이드, 수용성 단량체 및 중합개시제를 용매에 용해하여 Ⅰ) 단계로부터 합성된 아크릴로일기로 치환된 알파-헬릭스 펩타이드의 아크릴로일기와 수용성 단량체를 중합한다.
상기 용매는 트리스 완충액, 인산 완충액, 인산, 아세트산, 포름산, 염산, 황산, 질산, 시트르산, 헥사플루오로아이소프로판올 (hexafluoroisopropanol, HFIP), 헥사플루오로프로판올 (hexafluoropropanol, HFP), HFA(hexafluoroacetone), 트리플루오로아세트산(trifluoroacetic acid, TFA), 디아이소프로필 에틸아민(diisopropylethylamine), 및 메틸이미다졸리움 클로라이드(methylimidazolium chloride)로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상일 수 있는데, 바람직하게 알파-헬릭스 펩타이드의 알파-헬릭스 이차 구조를 가장 안정적으로 유지하도록 하는 HFIP를 사용하여 제조할 수 있다.
상기 수용성 단량체는 아크릴아미드, 아크릴로니트릴, 아크릴로일클로리드, 메타크릴아미드, N-히드록시메틸아크릴아미드, N,N-디메틸아크릴아미드, N-아세타미도아크릴아미드, 2-아미노에틸메타크릴레이트, N,N-디메틸아미노에틸 메타크릴레이트, 알릴알콜, 2-히드록시에틸아크릴레이트, 2-히드록시에틸메타크릴레이트 및 2-히드록시프로필메타크릴레이트로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상일 수 있는데, 바람직하게는 상기 수용성 단량체로 아크릴아미드를 사용할 수 있다,
상기 중합개시제는 아조비스이소부티로니트릴(azobisisobutyronitrile(AIBN)), 암모늄 퍼설레이트(ammonium persulfate(APS)) 및 N,N,N′,N′-테트라메틸렌디아민(N,N,N′,N′-tetramethylenediamine(TEMED))로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상일 수 있다.
또한, 상기 Ⅰ) 단계로부터 합성된 아크릴로일기로 치환된 알파-헬릭스 펩타이드와 상기 수용성 단량체는 1 : 10 내지 1 : 100 몰비로 혼합되어 제조된다면 알파-헬릭스 이차 구조가 안정화되어 형성된 펩타이드-고분자 결합체를 얻을 수 있다. 다만 CD 스펙트럼에서 208 ㎚, 222 ㎚ 두 점에서 음의 피크 강도비(θ]222/[θ]208 비)가 1 이상(0-60 ℃)인 매우 안정한 알파-헬릭스 이차 구조를 갖는 펩타이드-고분자 결합체를 제조하기 위해서는 바람직하게는 1 : 15 내지 1 : 25 몰비로 혼합되는 것일 수 있다.
본 발명의 다른 측면은 아크릴로일기로 치환된 알파-헬릭스 펩타이드에 관한 것으로,
상기 알파-헬릭스 펩타이드는 적어도 두 개의 라이신 잔기를 가지고, 상기 알파-헬릭스 펩타이드 내에서 어느 하나의 라이신 잔기의 위치가 i라고 할 때, 이를 기준으로 7번째 위치(i+7)에 다른 라이신 잔기가 배치되어 있으며,
상기 라이신 잔기 중에서 상기 i, i+7 번째 위치에 배치된 두 개의 라이신 잔기는 측쇄 아민기의 수소가 모두 아크릴로일기로 치환된 것을 특징으로 하는 아크릴로일기로 치환된 알파-헬릭스 펩타이드에 관한 것이다. 이의 일예에 대한 구조가 도 2c에 구체적으로 나타나 있다.
상기 알파-헬릭스 펩타이드로 상기 알파-헬릭스 펩타이드 내에서 어느 하나의 라이신 잔기의 위치가 i라고 할 때, 이를 기준으로 4번째 위치(i+4)에 다른 라이신 잔기가 배치되어 있는 것은, 이후 형성된 펩타이드-고분자 결합체에서 알파-헬릭스 이차 구조를 충분히 고정되지 못하고, 풀어져 펩타이드 고유의 활성을 유지하지 못하는 문제가 발생하기 때문에, 상기 알파-헬릭스 펩타이드는 상기 알파-헬릭스 펩타이드 내에서 어느 하나의 라이신 잔기의 위치가 i라고 할 때, 이를 기준으로 7번째 위치(i+7)에 다른 라이신 잔기가 배치되어 있는 것이 바람직하다.
즉, 상기 알파-헬릭스 펩타이드는 알파-헬릭스 이차구조의 턴(turn) 당 3,6 잔기를 가지고 있고, 이들 중에서 i, i+7 번째의 잔기쌍(residue pair)이 알파-헬릭스 이차구조의 펩타이드에서 동일한 방향으로 위치하고 있기 때문에, 상기와 같은 위치에 라이신 잔기가 존재하는 알파-헬릭스 이차구조를 갖는 펩타이드를 사용하거나, 종래 알파-헬릭스 이차구조를 갖는 펩타이드에서 상기 위치에 존재하는 잔기를 라이신 잔기로 치환한 것을 사용할 수 있다.
본 발명은 상기 알파-헬릭스 이차 구조를 가지면서, i, i+7 번째의 잔기쌍(residue pair)에 라이신 잔기가 존재하는 펩타이드라면, 펩타이드-고분자 결합체를 제조할 수 있다.
이는 하기 후술하는 실험예에서 나타난 바와 같이, 아미노산 서열에 있어서 i, i+7 번째의 잔기쌍(residue pair)이 모두 라이신 잔기로 되어 있는 서열번호 1 내지 10(일예로 p53으로부터 유래된 펩타이드)을 이용하여 아크릴로일기로 치환된 알파-헬릭스 펩타이드가 제조되었고, 이로부터 알파-헬릭스 이차 구조가 안정적으로 구속되어 있는 펩타이드-고분자 결합체가 제조되었음을 확인한 것으로부터 유추할 수 있다.
다시 말해 본 발명의 아크릴로일기로 치환된 알파-헬릭스 펩타이드를 제조함에 있어서, 알파-헬릭스 펩타이드의 아미노산 서열은 상기 알파-헬릭스 펩타이드 내에서 어느 하나의 라이신 잔기의 위치가 i라고 할 때, 이를 기준으로 7번째 위치(i+7)에 다른 라이신 잔기가 배치되어 있는 것이라면 특별히 이에 한정되지 않는다 할 것이다.
보다 구체적으로 상기 알파-헬릭스 펩타이드는 서열번호 1 내지 10으로 표시되는 어느 하나이상일 수 있다. 보다 바람직하게 상기 알파-헬릭스 펩타이드는 서열번호 1 또는 2일 수 있다.
상기 알파-헬릭스 펩타이드가 상기 알파-헬릭스 펩타이드 내에서 어느 하나의 라이신 잔기의 위치가 i라고 할 때, 이를 기준으로 7번째 위치(i+7)에 다른 라이신 잔기가 배치되어 있지 않는 것이라면, 알파-헬릭스 아미노산 서열을 포함하고 있음에도 불구하고, 이후 펩타이드-고분자 결합체를 형성함에 있어서 알파-헬릭스 이차 구조가 안정화되지 못하고 풀어진 형태로 존재한다.
상기 아크릴로일기로 치환된 알파-헬릭스 펩타이드는 C 말단에 형광체를 더 포함할 수 있는데, 상기 형광체는 특별히 이에 제한되지 않으나, DEABA, Dapoxyl 및 카르복시플루오레세인(FAM)로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나일수 있다.
바람직하게 본 발명에 따른 아크릴로일기로 치환된 알파-헬릭스 펩타이드는 하기 [구조식 1] 또는 [구조식 2]으로 표시되는 것 중에서 선택되는 어느 하나일 수 있다.
[구조식 1]
Figure 112016079579019-pat00001
[구조식 2]
Figure 112016079579019-pat00002
본 발명에 따른 상술한 구조의 아크릴로일기로 치환된 알파-헬릭스 펩타이드는 알파-헬릭스 이차 구조가 알파-헬릭스 안정화제(HFIP) 하에서만 안정적으로 유지되어, 생물학적 활성을 나타낸다. 허나, 이를 기반으로 하여 펩타이드-고분자 결합체를 제조하면 알파-헬릭스 안정화제 하에서뿐만 아니라 알파-헬릭스 안정화제가 전혀 없는 일반적인 완충액 또는 증류수 하에서도 CD 스펙트럼에서 208 ㎚, 222 ㎚ 두 점에서 음의 피크 강도비(θ]222/[θ]208 비)가 1 이상(0-60 ℃)인 것을 확인할 수 있다.
즉, 본 발명에 따른 펩타이드-고분자 결합체는 용매에 상관없이 매우 안정적인 알파-헬릭스 이차 구조를 갖는 장점을 갖게됨을 알 수 있다.
본 발명의 또 다른 측면은 상기 아크릴로일기로 치환된 알파-헬릭스 펩타이드에서 아크릴로일기와 수용성 단량체가 중합되어 형성된 것으로, 중합된 선형 고분자를 주쇄로 하고, 상기 중합된 선형 고분자에 적어도 하나 이상의 알파-헬릭스 펩타이드가 고정되어 있는 것을 특징으로 하는 펩타이드-고분자 결합체에 관한 것이다.
일반적으로 특정 생체거대분자가 특정 표적 물질에 특이적으로 결합하여 상호작용을 효과적으로 적용하도록 하기 위해서는, 표적 물질에 대한 우수한 친화성(affinity)과 선택성(selectivity)이 요구된다.
이러한 생체거대분자의 친화성(affinity)과 선택성(selectivity)은 리간드 역할을 하는, 펩타이드의 이차 구조의 구조적 안정성을 유지하느냐에 따라 크게 좌우된다.
종래에는 상기 펩타이드의 이차 구조를 구속하고 안정화하기 위하여 형태학적 엔트로피를 감소시키기 위해, 하나의 알파-헬릭스 펩타이드를 고리화하여 고리형 펩타이드로 합성하였다.
허나, 이러한 고리형 펩타이드는 합성 과정이 어렵고, 수율이 낮으며 정제과정이 복잡하다는 단점을 가질 뿐만 아니라, 하나의 펩타이드 단량체로 하나의 고리형 펩타이드만을 제조할 수 있기 때문에, 다중 상호작용을 표적하는 것이 불가능하다.
허나, 본 발명에서는 복수 개의 알파-헬릭스 펩타이드가 서로 결합되어 있으면서도, 안정한 알파-헬릭스 이차 구조를 효과적으로 유지하고 있을 뿐만 아니라, 제조과정 또한 단순 혼합을 통해 매우 간단하고 쉽게 합성할 수 있는 펩타이드-고분자 결합체를 제안하고 있다.
본 발명에 따른 펩타이드-고분자 결합체는 아크릴로일기로 치환된 알파-헬릭스 펩타이드에서 아크릴로일기와 수용성 단량체가 중합되어 형성된 것으로, 상기 아크로일기와 수용성 단량체를 동시다발적으로 중합하여, 중합된 선형 고분자를 주쇄로 하고, 상기 중합된 선형 고분자에 적어도 하나 이상의 알파-헬릭스 펩타이드가 고정되어 있는 것을 특징으로 한다. 이의 구조는 도 2a에 구체적으로 나타내었다.
도 2a에서 적색으로 표시한 부분은 알파-헬릭스 펩타이드이고, 청색으로 표시한 부분은 선형 고분자이며, 흑색선으로 표기된 부분은 상기 알파-헬릭스 펩타이드와 선형 고분자 사이를 연결하는 브릿지 부분으로, 상기 알파-헬릭스 펩타이드의 라이신의 측쇄 아민기의 일부(탄화수소 부분)이다.
상기 알파-헬릭스 펩타이드의 라이신의 측쇄 아민기의 수소를 치환한 아크릴로일기는 수용성 단량체와 중합하여 선형 고분자를 형성하였기 때문에, 상기 라이신의 측쇄 아민기의 탄화수소 부분이 상기 알파-헬릭스 펩타이드와 선형 고분자 사이를 연결하는 브릿지 역할을 하게 된다.
상기 중합된 선형 고분자 상에 고정된 알파-헬릭스 펩타이드는, 아크로일기와 결합된 라이신 잔기의 측쇄 아민기에 의해 상기 선형 고분자와 거대고리화 브릿지를 형성함으로써, 상기 알파-헬릭스 이차 구조를 구속하여 안정화하고 있다.
상기 아크릴로일기로 치환된 알파-헬릭스 펩타이드는 서로 동일한 아미노산 서열을 갖는 아크릴로일기로 치환된 알파-헬릭스 펩타이드이거나 서로 상이한 아미노산 서열을 갖는 서로 다른 아크릴로일기로 치환된 알파-헬릭스 펩타이드일 수 있다.
따라서, 상기 펩타이드-고분자 결합체는 상기 알파-헬릭스 펩타이드에 따라 복수 또는 단일 활성을 가지도록 제어할 수 있다.
상기 펩타이드-고분자 결합체는 서로 동일하거나, 상이한 복수 개의 알파-헬릭스 펩타이드들을 상기 중합된 선형 고분자 상에 고정하고 있기 때문에, 상기 알파-헬릭스 펩타이드 내에 존재하는 알파-헬릭스 이차 구조가 풀어짐없이 안정적으로 구속되어 있는 것을 알 수 있다.
보다 구체적으로 상기 펩타이드-고분자 결합체는 0 내지 60 ℃ 하에서, CD 스펙트럼에서 [θ]208/[θ]222 비가 1 내지 1.5 인 것을 확인할 수 있는데, 이를 통해 본 발명에 따른 펩타이드-고분자 결합체의 이차 구조가 매우 안정적으로 유지되고 있음을 알 수 있다.
특히 상기 펩타이드-고분자 결합체는 0 내지 100 ℃에서도 CD 스펙트럼에서 [θ]208/[θ]222 비를 0.8 이상 유지하는, 고온 상에서도 이차 구조가 매우 안정적으로 유지되고 있음을 확인하였다.
상기 펩타이드-고분자 결합체는 상기 알파-헬릭스 펩타이드 3 내지 20개가 상기 선형 고분자 상에 고정되어 있을 수 있다.
본 발명은 생체 내 조건(트리스 완충액 혹은 인산 완충액)에서도 안정적으로 이차 구조를 유지하고 있었을 뿐만 아니라, 100 ℃의 고온에서도 [θ]208/[θ]222 비가 0.8 이상으로 펩타이드-고분자 결합체 내에 펩타이드의 이차 구조 안정화 상태가 유지되고 있음을 확인하였다.
이를 통해 본 발명에 따른 펩타이드-고분자 결합체는 다양한 생활성을 갖는 알파-헬릭스 펩타이드를 포함하고 있으면서도, 장기간 고온에서도 안정적으로 이차 구조를 유지할 수 있기 때문에, 다양한 약물전달체계, 센서 및 진단분야 등에 적용할 수 있을 것으로 예상된다.
이하 본 발명을 바람직한 실시예를 참고로 하여 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있도록 상세히 설명한다. 그러나 본 발명은 여러 가지 상이한 형태로 구현될 수 있으며, 여기에서 설명하는 실시예에 한정되는 것은 아니다.
시약
Fmoc-아미노산과 커플링 시약 및 Anaspec(U.S.A.). General chemicals은 Novabiochem(Germany)로부터 구입하였다. 그 외에 나머지 시약은 모두 시그마 알드리치(U.S.A)로부터 구매하였다.
측정방법
1) 원이색성 (Circular Dichroism ) 분광학(Spectroscopy)
CD 스펙트럼은 펠티어 온도 컨트롤러(Peltier temperature controller)(Applied Photophysics., Ltd.)가 구비된 Chirascan Circular Dichroism spectrometer를 사용하여 기록되었다. 측정하고자 하는 펩타이드의 CD 스펙트럼은 190-260 nm에서 측정하여 기록되었다.
2) SDS-PAGE
형광체로 라벨링된 아크릴로일기로 치환된 알파-헬릭스 펩타이드(제조예 2; FAM-bisAAm-p53)를 이용하여 제조된 실시예 2의 펩타이드-고분자 결합체를 2X 트리신(tricine) 시료 완충액에 혼합하고, 이를 동결건조한 다음, 90 ℃에서 10 분간 가열하였다. 상기 트리스-트리신(tris-tricine) 폴리아크릴아미드 겔은 10% 아크릴아미드 겔을 포함하는 겔을 사용하여, SDS-PAGE를 실시하였다. 전기영동으로 이동함에 있어서, 전기영동 완충액으로 0.1 M 트리스(Tris), 0.1 M 트리신(tricine) 및 0.1 % SDS을 포함하는 upper 완충액과 pH 8.9까지 조절되어 제조된 0.2 M 트리스(Tris)로 이루어진 lower 완충액을 사용하였다. 전기영동은 120 V에서 수행하였고, 전기영동이 완료된 후 상기 젤에 UV를 조사하여 결과를 관찰하였다.
제조예 1 내지 3. 아크릴로일기로 치환된 펩타이드 합성.
아크릴로일기로 치환된 펩타이드를 합성하기 위하여, 아래 표 1의 아미노산 서열을 갖는 펩타이드를 제조하고, 상기 합성된 펩타이드에 존재하는 라이신 잔기의 측쇄 아민기(입실론 아민기)의 수소를 아크릴로일기로 치환한 펩타이드(표 2)를 제조하였다.
서열번호(펩타이드명) 서열
p53(서열번호 1) Ac-QSQQTFKNLWRLLKQN-NH2
BH3(서열번호 2) Ac-EDIIRNIARHLAKVGDKNLDRSIW-NH2
펩타이드명 서열
bisAAm-p53
(제조예 1)
Figure 112016079579019-pat00003
FAM-bisAAm-p53
(제조예 2)
Figure 112016079579019-pat00004
bisAAm-BH3
(제조예 3)
Figure 112016079579019-pat00005
상기 제조예 1 내지 3의 서열의 확대 도면을 하기 도 16에 순서대로 나열하였다.
먼저 하기 서열번호 1의 펩타이드를 TributeTM 펩타이드 합성기(Protein Technologies, Inc.)의 표준 Fmoc 프로토콜을 사용하여 Rink Amide MBHA 레진 LL(Novabiochem)으로 합성하였고, 결합체로 2-(1H-benzotriazole-1-yl)-1,1,3,3-tetramethyluronium hexafluorophosphate (HBTU)를 사용하였다.
스탠다드 아미노산 보호기는 Lys(Dde)를 제외한 나머지를 이용하였고, 다만 라이신 잔기(Lys)의 입실론 아민기는 N-[1-(4,4-dimethyl-2,6-dioxocyclohex-1-ylidene)ethyl](Dde) groups를 보호기로 사용하였다.
아세틸레이트화를 위해, 상기 레진(50 μmol of N-terminal amine groups)에 acetic anhydride 10 당량(eq)과 diisopropylethylamine(DIPEA)(in N-methyl-2-pyrrolidone (NMP)) 20 당량(eq)을 처리하여, 3 시간 동안 혼합하였다. 이후, 상기 레진을 NMP와 dimethylformamide(DMF)를 사용하여 세적한 후, 2% 히드라진을 용해한 DMF 용액을 사용하여 라이신 잔기의 측쇄 아민기를 보호하고 있는 Dde 보호기를 제거하였다.
아크릴로일화(acryloylation)는 acryloyl chloride 10 당량, DIPEA를 용해한 NMP 용액 20당량을 상기 레진에 처리하여 3 시간동안 반응시켰다.
형광체로 라벨링된 펩타이드의 경우, 표준 Fmoc 프로토콜을 사용하여 레진에 결합되어 있는 펩타이드의 N-말단에 5(6)-carboxyfluorescein 결합시켜 제조하고, HBTU 대신에 2-(7-Aza-1H-benzotriazole-1-yl)-1,1,3,3-tetramethyluronium hexafluorophosphate(HATU)를 사용하며, 상기 커플링 반응을 밤새(overnight) 수행하였다.
상기 합성된 펩타이드를 레진으로부터 분리하기 위하여, 상기 레진에 고정된 펩타이드를 cleavage 칵테일(cocktail)[TFA:1,2-ethanedithiol:thioanisole](95:2.5:2.5)로 4 시간 동안 처리하고, 이후 tert-butyl methyl ether(TBME) 용액을 사용하여 고체화(triturated)한 다음 상기 과정을 통해 수득한 펩타이드를 역상 HPLC(reverse-phase HPLC)[water-acetonitrile with 0.1% TFA]로 정제하였다. 이때 상기 쳅타이드 분자의 무게는 MALDI(matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight) mass spectrometry(Microflex LRF20, Bruker)(도 17a, b, c 참조)로 확인하였다.
실시예 1 : 펩타이드 -고분자 결합체의 제조
상기 제조예 1로부터 수득된 펩타이드와 acrylamide solution(100 mM)을 1 : 100 몰비가 되도록 혼합하였다. Hexafluoro-2-propanol(HFIP)와 water을 최종 농도 10% HFIP(vol%)가 되도록 첨가한 다음, 1 시간동안 반응시켰다. 중합과정은 10% ammonium persulfate(APS) 1 ㎕와 10% tetramethylethylenediamine(TEMED) 1 ㎕를 첨가에 의해 개시되어, 2 시간 동안 반응을 수행하였다. 총 반응 부피는 1 ㎖로 하였고, HFIP를 증발시키고 물로 HFIP의 부피 손실을 채워 펩타이드-고분자 결합체를 제조하였다.
실시예 2 : 증류수에서 제조된 펩타이드 -고분자 결합체.
상기 제조예 1로부터 수득된 펩타이드와 acrylamide solution(100 mM)을 1 : 20 몰비가 되도록 혼합하였다는 점과 상기 HFIP 대신에 증류수만을 첨가한 것을 제외하고는 상기 실시예 1과 모두 동일하게 펩타이드-고분자 결합체를 제조하였다.
실시예 3 : 인산 완충액에서 제조된 펩타이드 -고분자 결합체.
상기 HFIP 대신에 인산 완충액(10 mM, pH 7.4)을 첨가한 것을 제외하고는 상기 실시예 1과 모두 동일하게 펩타이드-고분자 결합체를 제조하였다.
실시예 4 : 인산 완충액에서 제조된 펩타이드 -고분자 결합체.
상기 HFIP 대신에 트리스 완충액(Tris buffer; 15 mM, pH 7.5)을 첨가한 것을 제외하고는 상기 실시예 1과 모두 동일하게 펩타이드-고분자 결합체를 제조하였다.
실시예 5 : 펩타이드 -고분자 결합체의 제조
제조예 1로부터 수득된 펩타이드 대신 제조예 2로부터 수득된 펩타이드를 사용하였다는 것과 상기 제조예 2로부터 수득된 펩타이드와 acrylamide solution(100 mM)을 1 : 20 몰비가 되도록 혼합하였다는 점을 제외하고는 상기 실시예 1과 모두 동일하게 펩타이드-고분자 결합체를 제조하였다.
비교예 6 : 펩타이드 -고분자 결합체의 제조
제조예 1로부터 수득된 펩타이드 대신 제조예 3으로부터 수득된 펩타이드를 사용하고, 상기 제조예 3으로부터 수득된 펩타이드와 acrylamide solution(100 mM)을 1 : 20 몰비가 되도록 혼합하였다는 것을 제외하고는 상기 실시예 1과 모두 동일하게 펩타이드-고분자 결합체를 제조하였다.
실험예 1 : 원이색성 (Circular Dichroism ) 분광학(Spectroscopy) 분석-1.
알파-헬릭스 이차구조의 펩타이드에 있어서, 알파-헬릭스 이차구조의 턴(turn) 당 3,6 잔기를 가지고 있고, 이들 중에서 i, i+4 또는 i, i+7 번째의 잔기쌍(residue pair)이 알파-헬릭스 이차구조의 펩타이드에서 동일한 방향으로 위치하고 있기 때문에, 상기와 같은 위치에 라이신 잔기가 존재하는 알파-헬릭스 이차구조를 갖는 펩타이드를 사용하거나, 종래 알파-헬릭스 이차구조를 갖는 펩타이드에서 상기 위치에 존재하는 잔기를 라이신 잔기로 치환하여 사용하였다.
다만 실험예에서는 상기와 같은 위치에 라이신 잔기가 존재하는 알파-헬릭스 이차구조를 갖는 펩타이드(서열번호 1, 2)를 이용하여 펩타이드-고분자 결합체를 합성하여 사용하였다.
구체적으로 서열번호 1은 상기 알파-헬릭스 펩타이드 내에서 어느 하나의 라이신 잔기의 위치가 i라고 할 때, 이를 기준으로 7번째 위치(i+7)에 다른 라이신 잔기가 배치되어 있는, 두 개의 라이신 잔기를 갖는 알파-헬릭스 펩타이드로, p53 펩타이드로부터 유래된 서열을 사용하였다.
상기 제조예 1 내지 3으로부터 제조된 아크릴로일기로 치환된 알파-헬릭스 펩타이드의 구조 및 이의 안정성을 분석하였다.
도 3은 증류수 상에서의 제조예 1로부터 제조된 아크릴로일기로 치환된 알파-헬릭스 펩타이드의 CD 스텍트럼이고, 도 4는 10% HFIP 용액(HFIP:water=1:9, v/v) 상에서의 제조예 1로부터 제조된 아크릴로일기로 치환된 알파-헬릭스 펩타이드의 CD 스텍트럼이다.
이때 온도는 25 ℃였고, 상기 펩타이드의 농도는 6 μM이였다.
도 3에 나타난 바와 같이 증류수 내에서 제조예 1로부터 제조된 아크릴로일기로 치환된 알파-헬릭스 펩타이드(bisAAm-p53)는 알파-헬릭스 이차 구조가 안정화되지 않고, 풀어진 상태임을 확인할 수 있었다.
반면 도 4에 나타난 바와 같이 10% HFIP 용액 내에서는 제조예 1로부터 제조된 아크릴로일기로 치환된 알파-헬릭스 펩타이드의 알파-헬릭스 이차 구조가 안정화된 것을 알 수 있다. 즉 본 발명에 따라 제조된 아크릴로일기로 치환된 알파-헬릭스 펩타이드는 강한 알파-헬릭스 유도제의 존재하에서 알파-헬릭스 이차 구조가 안정화되는 것을 확인하였다. 이는 CD 스펙트럼에서 알파-헬릭스 이차 구조를 의미하는 208 ㎚와 222 ㎚에서 음성 밴드가 진하게 관찰된 것을 통해 알 수 있다.
실험예 2 : 원이색성 (Circular Dichroism ) 분광학(Spectroscopy) 분석-2.
제조예 1로부터 제조된 아크릴로일기로 치환된 알파-헬릭스 펩타이드(bisAAm-p53)는 10% HFIP 용액(최종 농도를 기준으로 한)에 녹인 후, 100 배 몰랄 아크릴아미드를 혼합하고, APS(ammonium persulfate)와 TEMED(N,N,N',N'-tetramethylethylenediamine)을 첨가하여 유도된 자유 라디칼 중합 반응을 통해 펩타이드-고분자 결합체를 제조하였다. 제조된 알파헬릭스 펩타이드 다중합체 9 μM을 0.2 %HIFP 용액으로 희석하였다.
도 5는 실시예 1로부터 제조된 펩타이드-고분자 결합체(9 μM)의 CD 스펙트럼이다.
이때, 원이색성(Circular Dichroism; CD) 분광학(Spectroscopy) 분석은 측정방법 1)에 따라 수행하였다.
도 5에 나타난 바와 같이, 실시예 1로부터 제조된 펩타이드-고분자 결합체에서 이차 구조의 안정화가 증가되었음을 확인할 수 있었는데, 이는 203 ㎚와 222 ㎚에서 각각 음의 피크를 선명하게 확인하였다는 것과 190 ㎚에서도 양의 최대 피크가 청색편이한 것을 통해 알 수 있다.
우선, 0.2% HFIP 용액은 실질적으로 제조예 1로부터 제조된 아크릴로일기로 치환된 알파-헬릭스 펩타이드(bisAAm-p53)의 이차 구조를 안정화하는 효과를 가지지 못하고, 비카이랄성 폴리아크릴아미드 그 자체는 어떠한 CD 스펙트럼 피크도 가지고 있지 않기 때문에, 상기 0.2% HFIP와 폴리아크릴아미드는 도 5의 CD 스펙트럼에 어떠한 영향도 미치지 않았음은 확실하다.
즉, 실시예 1로부터 제조된 펩타이드-고분자 결합체에서 이차 구조 안정화 상태를 나타내는 피크가 관찰되고 있는 것은, 상기 펩타이드-고분자 결합체의 구조에 의한 것이라는 것을 알 수 있고, 이는 제조예 1로부터 제조된 아크릴로일기로 치환된 알파-헬릭스 펩타이드(bisAAm-p53)가 비닐 중합 반응을 통해 중합될 때, 상기 제조예 1로부터 제조된 아크릴로일기로 치환된 알파-헬릭스 펩타이드(bisAAm-p53)에 존재하는 두 개의 아크릴로일기 사이에 거대고리화 형태에 따른 거리 정합(distance-matching)이 형성됨에 따라 즉각적으로 상기 안정화된 이차 구조를 고정화하기 때문이라 여겨진다(봉합 중합; stapling polymerization).
실험예 3 : 원이색성 (Circular Dichroism ) 분광학(Spectroscopy) 분석-3.
펩타이드-고분자 결합체에서의 알파-헬릭스 이차 구조가 안정화되는 것을 정량적으로 확인하고자 하였고, 이를 위해 제조예 1의 아크릴로일기로 치환된 알파-헬릭스 펩타이드와 실시에 1의 펩타이드-고분자 결합체를 각각 10% TFE(2,2,2-trifluoroethanol)에 용해하고 HFIP보다 약한 알파-헬릭스 이차 구조 안정화제를 사용하여 다양한 온도에서 상기 각각에 대한 알파-헬릭스 이차 구조 안정화 정도를 측정하여 정량적으로 나타내었다.
도 6은 다양한 온도하에서 제조된 제조예 1의 아크릴로일기로 치환된 알파-헬릭스 펩타이드(free bisAAm-p53)의 CD 스펙트럼이며, 도 7은 다양한 온도하에서 실시예 1로부터 제조된 펩타이드-고분자 결합체(polymerized bisAAm-p53)의 CD 스펙트럼이며, 도 8은 상기 CD 스펙트럼으로부터 얻은 온도에 따른 [θ]222/[θ]208 비를 나타낸 그래프이다. 이때 bisAAm-p53:아크릴아미드=1:100의 몰비로 혼합되어 제조된 것이다.
이때, 원이색성(Circular Dichroism; CD) 분광학(Spectroscopy) 분석은 측정방법 1)에 따라 수행하였다.
도 6 내지 8에 나타난 바와 같이, 모든 온도 조건에 있어서 실시예 1로부터 제조된 펩타이드-고분자 결합체(도 7)가 제조예 1의 아크릴로일기로 치환된 알파-헬릭스 펩타이드(도 6)보다 높은 [θ]222/[θ]208 비를 가지고 있음을 확인하였다.
상기 [θ]222/[θ]208 비는 펩타이드 내에 존재하는 알파-헬릭스 이차 구조 정도를 나타내는 것으로, 상기 [θ]222/[θ]208 비의 수치가 증가하는 것은 알파-헬릭스 이차 구조의 정도가 증가하는 것을 의미한다.
더욱이 상기 알파-헬릭스 이차 구조와 관련된 208 ㎚, 222 ㎚에서 선명한 두 개의 음의 피크는 오직 펩타이드-고분자 결합체에서만 관찰되고 있는데(도 7 참조), 이를 통해 아크릴로일기로 치환된 알파-헬릭스 펩타이드가 본 발명에 따른 펩타이드-고분자 결합체로 중합됨에 따라, 상기 펩타이드 내에 알파-헬릭스 이차 구조가 더욱 안정화되었음이 확실하게 증명되었다 할 수 있다.
실험예 4 : 제조예 1의 아크릴로일기로 치환된 알파- 헬릭스 펩타이드의 몰분 율이 중합에 따른 알파- 헬릭스 이차 구조 안정화에 미치는 영향.
본 실험을 진행하기에 앞서, CD 스펙트럼을 측정하기 전에 시료로부터 모든 남아있는 HFIP를 원심분리기를 사용하여 증발시켰다.
도 9는 제조예 1로부터 제조된 아크릴로일기로 치환된 알파-헬릭스 펩타이드의 CD 스펙트럼이고, 도 10은 증류수에서 중합반응을 실시하여 제조된 실시예 2의 펩타이드-고분자 결합체의 CD 스펙트럼이며, 도 11은 인산 완충액에서 중합반응을 실시하여 제조된 실시예 3의 펩타이드-고분자 결합체의 CD 스펙트럼이며, 도 12는 트리스 완충액(Tris buffer; 15 mM, pH7.5)에서 중합반응을 실시하여 제조된 실시예 4의 펩타이드-고분자 결합체의 CD 스펙트럼이다. 이때 bisAAm-p53 : 아크릴아미드 = 1 : 20의 몰비로 혼합되어 제조된 것이다.
도 9 내지 12에 나타난 바와 같이, 실시예 1로부터 제조된 펩타이드-고분자 결합체에 있어서, 혼합되는 제조예 1로부터 제조된 아크릴로일기로 치환된 알파-헬릭스 펩타이드의 몰분율을 5% 증가시켜 제조한 경우 208 ㎚, 222 ㎚ 두 점에서 음의 피크가 선명하게 형성된 것을 보아 알파-헬릭스 이차 구조가 안정화된 것을 알 수 있다. 이러한 알파-헬릭스 이차 구조의 안정화는 상기 아크로일기로 치환된 알파-헬릭스 펩타이드에서 상기 아크로일기와 아크릴아미드의 중합반응에 의해 상기 펩타이드의 알파-헬릭스 이차 구조가 봉합된 효과라 단언할 수 있다.
게다가 생리적인 완충액 조건에서도 상기 안정화된 알파-헬릭스 이차 구조를 갖는 펩타이드로 이루어진 다중합체가 제조되었음을 확인하였다. 따라서, 상기 알파-헬릭스 이차 구조가 안정화된 펩타이드 다중합체는 생물학적 조건에서도 펩타이드 및 고분자 상호작용을 형성할 수 있음을 알 수 있다.
실험예 5 : 원이색성 (Circular Dichroism ) 분광학(Spectroscopy) 분석-4.
알파-헬릭스 이차구조의 펩타이드에 있어서, 알파-헬릭스 이차구조의 턴(turn) 당 3,6 잔기를 가지고 있고, 이들 중에서 i, i+4 또는 i, i+7 번째의 잔기쌍(residue pair)이 알파-헬릭스 이차구조의 펩타이드에서 동일한 방향으로 위치하고 있기 때문에, 상기와 같은 위치에 라이신 잔기가 존재하는 알파-헬릭스 이차구조를 갖는 펩타이드를 사용하거나, 종래 알파-헬릭스 이차구조를 갖는 펩타이드에서 상기 위치에 존재하는 잔기를 라이신 잔기로 치환하여 사용하였다.
다만 본 실험예에서는 i, i+4의 위치에 라이신 잔기가 위치한 알파-헬릭스 이차구조를 갖는 펩타이드(제조예 3; 서열번호 2)를 이용하여 펩타이드-고분자 결합체를 합성하여 사용하였다.
우선 제조예 3으로부터 제조된 아크릴로일기로 치환된 알파-헬릭스 펩타이드에서의 알파-헬릭스 이차 구조의 안정화 여부를 확인하고, 중합 후 비교예 1로부터 제조된 펩타이드-고분자 결합체에서의 알파-헬릭스 이차 구조 안정화 여부를 측정하여 비교하였다.
도 13은 제조예 3으로부터 제조된 아크릴로일기로 치환된 알파-헬릭스 펩타이드의 CD 스펙트럼이고, 도 14는 비교예 1로부터 제조된 펩타이드-고분자 결합체의 CD 스펙트럼이다.
도 13 및 도 14에 나타난 바와 같이 i , i+4 위치에 라이신 잔기가 위치하고, 상기 라이신 잔기의 측쇄 아민기(입실론 아민기)의 수소가 아크릴로일기로 치환된 제조예 3의 알파-헬릭스 펩타이드는 알파-헬릭스 이차 구조가 안정화되지 못하고 풀어져 있음을 확인할 수 있다.
더욱이 제조예 3의 아크릴로일기로 치환된 알파-헬릭스 펩타이드는 비교예 1의 펩타이드-고분자 결합체로 중합된다 하더라도 알파-헬릭스 이차 구조를 안정화하기 못하고 있음을 확인할 수 있었다.
즉, 본 발명에 있어서 i, i+7 위치에 라이신 잔기가 위치한 알파-헬릭스 펩타이드에서, 상기 위치에 존재하는 라이신 잔기의 측쇄 아민기(입실론 아민기)의 수소를 아크릴로일기로 치환하고, 여기에 아크릴아마이드를 첨가하여 중합한 경우에만 알파-헬릭스 이차 구조가 안정화되는 것을 확인할 수 있다.
실험예 6 : SDS-PAGE 분석.
본 발명에 있어서, 복수 개의 제조예 2로부터 제조된 아크릴로일기로 치환된 알파-헬릭스 펩타이드들이 어떻게 중합되는지, 즉 실시예 5로부터 제조된 펩타이드-고분자 결합체가 실제로 아크릴아미드와 결합되어 있는지를 확인하여야만 했는데, 왜냐하면 CD 스펙트럼에는 폴리아크릴아미드가 검출되지 않기 때문이며, 펩타이드와 폴리아크릴아미드는 서로 다른 분자 특성을 가지고 있기 때문이다.
하지만 본 발명에 따른 펩타이드-고분자 결합체에서 펩타이드와 폴리아크릴아미드의 결합여부를 측정하는데 있어서, 고분자의 분자 무게를 검출하기 위한 통상적인 방법(예로 SEC(size exclusion chromatography))은 표준 시약이 명확하지 않아, 이를 응용하여 측정하기에는 어려움이 있었다.
따라서 실시예 5로부터 제조된 펩타이드-고분자 결합체의 중합 정도(DP; degree of polymerization) 조사하여 이를 확인하기로 하였다.
도 15는 단백질 마커와 실시예 5로부터 제조된 펩타이드-고분자 결합체의 SDS-PAGE의 결과를 나타낸 사진이다. 도 15에서 M은 단백질 마커이고, P는 실시예 5로부터 제조된 펩타이드-고분자 결합체를 나타낸다. 또한 우측 이미지는 형광이미지이다.
도 15에 나타난 바와 같이, 알파-헬릭스 펩타이드의 크기가 매우 작기 때문에 일반적인 염색기술로는 겔 상에 로딩된 펩타이드를 시각화할 수 없다는 문제가 있기 때문에, 제조예 2에서와 같이 아크릴로일기로 치환된 알파-헬릭스 펩타이드를 형광으로 라벨화한 것을 사용하였다.
실시예 5로부터 제조된 펩타이드-고분자 결합체를 SDS-PAGE에 로딩한 결과, 도 15에 나타난 바와 같이, 7 kDa에서 강한 밴드가 관찰되었고, 30 kDa, 40 kDa에서는 약학 밴드가 관찰되었다. 이는 제조예 2의 아크릴로일기로 치환된 알파-헬릭스 펩타이드 MW가 2.5 kDa이기 때문이다.
도 15의 SDS-PAGE 결과를 통해 제조예 2에서와 같이 아크릴로일기로 치환된 알파-헬릭스 펩타이드 3 개, 12 개, 16 개 분자를 포함하고 있다는 것을 알 수 있다.
이러한 결과를 종합하면 본 발명에 따른 단일 합성 과정을 통해, 3 내지 16 개의 안정화된 알파-헬릭스 이차 구조를 갖는 펩타이드가 하나의 선형 고분자에 봉합 중합(stapling polymerization)되어 있는 펩타이드-고분자 결합체를 얻을 수 있었고, 상기 펩타이드-고분자 결합체가 형성되었으며, 형성된 펩타이드-고분자 결합체 내에 펩타이드의 이차 구조도 안정화 상태로 속박되어 있는 것을 확인하였다.
상기에서는 본 발명의 바람직한 실시예에 대하여 설명하였지만, 본 발명은 이에 한정되는 것은 아니고, 본 발명의 기술 사상 범위 내에서 여러 가지로 변형하여 실시하는 것이 가능하고, 이 또한 첨부된 특허 청구 범위에 속하는 것은 당연하다.
<110> Yonsei University <120> manufacturing method of peptide-polymer conjugate with stabilized alpha-helices, peptide-polymer conjugate thereby <130> 6693 <160> 10 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> p53 peptide <400> 1 Gln Ser Gln Gln Thr Phe Lys Asn Leu Trp Arg Leu Leu Lys Gln Asn 1 5 10 15 <210> 2 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> p53 peptide <400> 2 Gln Ser Gln Gln Thr Phe Lys Asn Leu Trp Lys Leu Leu Lys Gln Asn 1 5 10 15 <210> 3 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> p53 peptide <400> 3 Leu Ser Gln Gln Thr Phe Lys Asn Leu Trp Arg Leu Leu Lys Gln Asn 1 5 10 15 <210> 4 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> p53 peptide <400> 4 Leu Ser Gln Glu Thr Phe Lys Asn Leu Trp Lys Leu Leu Lys Gln Asn 1 5 10 15 <210> 5 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> p53 peptide <400> 5 Leu Ser Gln Glu Thr Phe Lys Asp Leu Trp Lys Leu Leu Lys Glu Asn 1 5 10 15 <210> 6 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> p53 peptide <400> 6 Leu Ser Gln Lys Thr Phe Ser Asp Leu Trp Lys Leu Leu Pro Glu Asn 1 5 10 15 <210> 7 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> p53 peptide <400> 7 Leu Ser Gln Glu Lys Phe Ser Asp Leu Trp Lys Lys Leu Pro Glu Asn 1 5 10 15 <210> 8 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> p53 peptide <400> 8 Leu Ser Gln Glu Thr Phe Ser Asp Lys Trp Lys Leu Leu Pro Glu Lys 1 5 10 15 <210> 9 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> p53 wild type peptide <400> 9 Leu Ser Gln Glu Thr Phe Lys Asp Lys Trp Arg Leu Leu Lys Gln Asn 1 5 10 15 <210> 10 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> p53 wild type peptide <400> 10 Gln Ser Gln Gln Thr Phe Lys Asn Leu Trp Arg Lys Lys Lys Gln Asn 1 5 10 15

Claims (16)

  1. Ⅰ) 아크릴로일기로 치환된 알파-헬릭스 펩타이드를 합성하는 단계; 및
    Ⅱ) 상기 Ⅰ) 단계로부터 합성된 아크릴로일기로 치환된 알파-헬릭스 펩타이드, 수용성 단량체 및 중합개시제를 용매에 용해하여 Ⅰ) 단계로부터 합성된 아크릴로일기로 치환된 알파-헬릭스 펩타이드의 아크릴로일기를 폴리아크릴아미드로 중합하는 단계;를 포함하고,
    상기 Ⅰ) 단계의 아크릴로일기로 치환된 알파-헬릭스 펩타이드는, 서열번호 1 내지 10 중에서 선택되는 어느 하나로 표시되는 알파-헬릭스 펩타이드의 i, i+7 번째 위치에 배치된 라이신 잔기의 측쇄 아민기(입실론 아민기)의 수소가 아크릴로일기로 치환된 것을 특징으로 하는 펩타이드-고분자 결합체의 제조방법.
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 삭제
  5. 삭제
  6. 제1항에 있어서,
    상기 용매는 트리스 완충액, 인산 완충액, 인산, 아세트산, 포름산, 염산, 황산, 질산, 시트르산, 헥사플루오로아이소프로판올 (hexafluoroisopropanol, HFIP), 헥사플루오로프로판올 (hexafluoropropanol, HFP), HFA(hexafluoroacetone), 트리플루오로아세트산(trifluoroacetic acid, TFA), 디아이소프로필 에틸아민(diisopropylethylamine), 및 메틸이미다졸리움 클로라이드(methylimidazolium chloride)로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는 펩타이드-고분자 결합체의 제조방법.
  7. 제1항에 있어서,
    상기 수용성 단량체는 아크릴아미드, 아크릴로니트릴, 아크릴로일클로리드, 메타크릴아미드, N-히드록시메틸아크릴아미드, N,N-디메틸아크릴아미드, N-아세타미도아크릴아미드, 2-아미노에틸메타크릴레이트, N,N-디메틸아미노에틸 메타크릴레이트, 알릴알콜, 2-히드록시에틸아크릴레이트, 2-히드록시에틸메타크릴레이트 및 2-히드록시프로필메타크릴레이트로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는 펩타이드-고분자 결합체의 제조방법.
  8. 제1항에 있어서,
    상기 중합개시제는 아조비스이소부티로니트릴(azobisisobutyronitrile(AIBN)), 암모늄 퍼설레이트(ammonium persulfate(APS)) 및 N,N,N′,N′-테트라메틸렌디아민(N,N,N′,N′-tetramethylenediamine(TEMED))로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는 펩타이드-고분자 결합체의 제조방법.
  9. 제1항에 있어서,
    상기 Ⅰ) 단계로부터 합성된 아크릴로일기로 치환된 알파-헬릭스 펩타이드와 상기 수용성 단량체는 1 : 10 내지 1 : 100 몰비로 혼합되는 것을 특징으로 하는 펩타이드-고분자 결합체의 제조방법.
  10. 아크릴로일기로 치환된 알파-헬릭스 펩타이드에 관한 것으로,
    서열번호 1 내지 10 중에서 선택되는 어느 하나로 표시되는 알파-헬릭스 펩타이드의 i, i+7 번째 위치에 배치된 두 개의 라이신 잔기는 측쇄 아민기의 수소가 모두 아크릴로일기로 치환된 것을 특징으로 하는 아크릴로일기로 치환된 알파-헬릭스 펩타이드.
  11. 삭제
  12. 제10항에 따른 아크릴로일기로 치환된 알파-헬릭스 펩타이드에서 아크릴로일기와 수용성 단량체가 중합되어 형성된 것으로,
    중합된 선형 고분자를 주쇄로 하고,
    상기 중합된 선형 고분자에 적어도 하나 이상의 알파-헬릭스 펩타이드가 고정되어 있는 것을 특징으로 하는 펩타이드-고분자 결합체.
  13. 제12항에 있어서,
    상기 펩타이드-고분자 결합체는 상기 알파-헬릭스 펩타이드의 알파-헬릭스 이차구조가 안정화되어 있는 것을 특징으로 하는 펩타이드-고분자 결합체.
  14. 제12항에 있어서,
    상기 펩타이드-고분자 결합체는 0 내지 60 ℃ 하에서, CD 스펙트럼에서 [θ]208/[θ]222 비가 1 내지 1.5 인 것을 특징으로 하는 펩타이드-고분자 결합체.
  15. 제12항에 있어서,
    상기 펩타이드-고분자 결합체는 0 내지 100 ℃에서도 CD 스펙트럼에서 [θ]208/[θ]222 비를 0.8 이상 유지하고 있는 것을 특징으로 하는 펩타이드-고분자 결합체.
  16. 제12항에 있어서,
    상기 펩타이드-고분자 결합체는 상기 알파-헬릭스 펩타이드 3 내지 20개가 고정되어 있는 것을 특징으로 하는 펩타이드-고분자 결합체.
KR1020160104089A 2016-08-17 2016-08-17 안정화된 알파-헬릭스 이차 구조를 갖는 펩타이드-고분자 결합체 제조방법 및 이를 이용해 제조된 펩타이드-고분자 결합체 Active KR102003904B1 (ko)

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