KR102005507B1 - 통합 유전자 분석 장치 - Google Patents
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Abstract
본 발명에 따르면, 마그네틱 비드와 혼합되어 마이크로 유체 칩(11)을 통해 흐르는 시료를 농축시킬 수 있는 자석(12) 및, 상기 농축된 시료로부터 유전자를 추출할 수 있도록 상기 시료를 가열할 수 있는 히터(13)를 구비한, 시료의 농축 및 추출부(10); 상기 추출된 유전자의 정제를 위한 시약 및 유전자의 PCR 증폭을 위한 시약을 수용하는 하나 이상의 튜브(T, T')들과, 상기 튜브들 각각에 추출된 유전자, 시약 또는 유전자 및 시약의 혼합물을 포함하는 유체를 주입하거나, 상기 튜브들 각각으로부터 상기 유체를 흡입하는 피펫(31)과, 상기 피펫(31)을 수평 왕복이동 및 승강 이동시키는 X-Z 스테이지를 구비하는, 유전자의 정제부; 상기 유전자의 정제부에서 정제된 유전자를 상기 피펫과 상기 X-Y 스테이지를 이용하여 주입받고, 열원을 이용하여 유전자를 증폭하는 유전자 증폭부(30); 및, 상기 증폭된 유전자가 담긴 튜브(T')에 인접하게 설치되어 유전자 증폭량을 검출하는 광학계(50);를 구비하는, 통합 유전자 분석 장치가 제공된다.
Description
본 발명은 시료의 농축, 추출, 유전자 증폭(PCR, polymerase chain reaction) 및 분석이 가능한 통합 분석 장치에 관한 것으로, 칩을 이용한 시료의 농축, 열을 이용한 DNA 추출, PCR 기기를 이용한 추출된 DNA 의 유전자 증폭 검사 및 분석을 통합적으로 시행하는 통합 유전자 분석 장치에 관한 것이다.
본 발명에 따른 통합 유전자 분석 장치에서는 시료의 농축, 추출, 유전자 증폭 및 분석이 가능하며, 수집된 시료의 농축, 추출, 유전자 증폭의 과정을 순차적으로 수행할 수 있다.
본원 발명은 국가 연구개발사업으로서 농림축산식품부의 지원을 받아서 수행된 것으로서, 구체적인 내용은 다음과 같다.
연구관리전문기관 : 농림식품기술기획평가원
연구사업명 : 고부가가치식품개발사업
연구과제명 : 현장 식품안전을 위한 휴대용 분석기 개발 및 상용화
과제 번호: 316073-03
주관기관 : 비아이티밸류
연구기간 : 2016.8.30 - 2018.12.31
생물학적 위해 요소인 살모넬라균이나 노로바이러스는 식중독을 유발시키는 것으로 알려져 있는데, 식중독이란 자연독이나 유해물질이 함유된 음식물을 섭취함으로써 발생되며, 세균성, 화학성, 그리고 미생물 독성대사물질에 의한 식중독 등이 있다. 식중독은 간편 식품 형태의 식품공급 및 소비보편화 추세, 고령인구의 증가에 따라서 빈번하게 발생된다. 즉. 식중독균에 대한 노출 위험이 상존하며, 지구 온난화로 인한 유해미생물 자연배양조건이 조성되고 있으며, 식품의 생산, 유통, 소비의 대형화 추세에 따라 식중독균 감염이 증가하고 있다. 이러한 식중독 발생은 인간의 건강에 해를 끼칠 뿐 아니라, 관련 의료비를 증가시키고, 관련 식품산업의 막대한 기회손실을 야기한다.
식중독균 검사방법으로는 가장 일반적으로 배지법이 사용되고 있는데, 이는 특정 식중독균만이 자랄 수 있는 배지(영양분)를 이용하여 존재여부를 판단하는 방법이다. 배지법은 공인된 방법이기는 하지만, 과다한 시간 및 전문화된 인력이 필요하므로 현장에서는 사용하기 어렵다. 한편 식중독균 검사 방법의 일종인 유전자법은 식중독균의 특정유전자를 인식하는 방법으로 배지법에 비해 신속(5-20시간)하고 정확하나, 고가의 유전자 검사기기가 필요하고 유전자를 추출을 위한 전처리 과정을 진행하기 위해선 전문인력이 필요하므로, 현장에서 식중독균을 검사하기에 부적절하다. 효소법(ELISA)은 식중독균에 반응하는 특정항체를 이용하는 방법으로 간단하지만 검사할 수 있는 균이 제한되며, 현장에서 검사가 어렵다. 마지막으로, ATP법은 생명체의 에너지원을 측정하는 방법으로 간단하나 정확하게 식중독균을 측정할 수 없다.
이와 같이 기존의 방법 및 장비들은 병원성 미생물을 검출하는데 많은 시간이 소요되거나, 정확도가 부족하여 감염 여부와 감염에 대한 즉각적 조치 및 예방을 하기 어렵다. 또한, 시료를 분석하기 위한 고가의 의료 장비가 필요하며, 이를 작동하고 결과를 분석할 전문 인력이 반드시 필요하다는 단점이 있다. 미생물뿐만 아니라 노로바이러스와 같은 감염성 바이러스를 검출하기 위해서는 배지법으로는 검사가 어려우며, 일반적으로 바이러스 내에 존재하는 유전자를 추출한 후에 유전자증폭과정인 PCR과 같은 분석 실험을 통해 검출하여야 한다. 따라서, 식중독균검사를 비롯한 유해물질검사를 위해 현장에서 비 전문가라도 손쉽게 검사할 수 있고 시료 전처리와 유전자 증폭 검사과정을 통합한 유해물질 검사용 통합 분석 시스템에 대한 필요성이 있다.
식품 유해물질을 검사하는 기존의 방법은, 균을 배양하여 수를 증대시켜 정량적 분석을 하는 것으로, 균별로 자라나는 배지의 특성이 달라 이들을 이용하여 균을 식별해 왔다. 그러나 이러한 방법은 최종결과를 얻는데 있어, 장비가 갖추어진 실험실에서 교육받은 전문가에 의해 전배양, 선택배양을 거쳐 확인시험을 하는데는 2-3일 정도의 긴 시간이 필요하다. 면역적인 방법인 래피트 테스트 키트(Rapid test kit)가 있으나 이 역시 배양 과정후 각 균별 시험을 하기 때문에 배양법과 같이 많은 시간이 필요하고 총 균수의 측정은 어렵고, 정확도가 떨어진다. 이러한 배양법이나 면역적인 방법은 병원균의 신속한 검출이 어렵기 때문에 식중독 예방보다는 식중독 발생 후 역학 분석과 원인 규명에 주로 쓰인다.
현재 식품 등을 대상으로 사용되는 분자진단 기술인 PCR(Polymerase Chain Reacion, 중합효소연쇄반응) 기법은 분석결과는 정확한 방법이나 이 역시 16-24시간 동안 예비 증균을 하여야 한다. 검출이 8 시간 이내로 이루어지는 기술은 대장균 등을 중심으로 개발되었으나, 육류나 우유 등의 축산물 시료가 아닌 농산물 시료에서는 배양시간의 부족으로 그 감도가 매우 떨어진다는 연구 결과가 있다. 그러나 예비 증균 배양 없이 분자 진단을 수행할 경우, 미량의 식중독균 검출시 위음성(False Negative)율이 높아지므로 현장진단을 위해서는 식품 시료에 존재하는 병원균의 선택적 분리와 농축이 필요하고, 분리 농축된 병원균에서 연속적인 공정으로 신속한 핵산 추출 및 이를 이용한 유전자 진단기술 개발이 요구된다.
PCR 을 이용한 신속검출법과 전통적인 배지 검출법 모두 식품에서 검출한계가 대략 각각 103 - 105 CFU/g수준이어서 식중독사고 원인균규명에 한계가 있고, 식중독 예방을 위한 현장 검사로서의 의미가 없어 다양한 방법으로 세균을 분리-농축하는 기법들에 관한 연구가 진행 중이다.
미생물 분석을 위해서는 다양한 환경과 생물학적 시료로부터 타겟이 되는 미생물을 순도 높게 분리하는 것이 중요하다. 마이크로유체(Microfluidics) 기술은 1~100μm 수준의 크기를 갖는 채널에서 시료를 다루는 기술로서, 마이크로유체 칩은 체적에 대한 표면 비율(surface to volume ratio)이 크고, 연속적인 시료의 이송이 가능하다. 또한 마이크로유체 칩은 시료의 소비가 적고, 휴대성이 있고, 다양한 기술들과의 접목을 통하여 분석 효율이 향상되는 등의 장점이 있어 다양한 분야에 적용된다. 마이크로유체 기반의 미생물 분리 기술은 특이적 미세유체 채널의 형상을 이용하여 크기에 따라 미생물을 분리하는 hydrophoresis, 타겟 미생물과 특이적으로 바인딩하는 항체와의 항원-항체 반응을 이용한 affinity based separation, 전기장 내 하전된 입자의 거동을 이용하여 분리하는 electrophoresis와 dielectrophoresis 등으로 나눌 수 있다.
그러나, 이러한 전처리과정은 전문적인 기술이 필요하고, 시간이 많이 걸려 현장에서 식품바이러스, 식품/세균, 감염성 질환등을 검사,분석하는데 가장 큰 장애요인이어서, 이를 손쉽게 하는 연구가 필요하다.
본 발명의 목적은 상기와 같은 문제점을 해결하기 위해 시료의 농축, 유전자 추출, PCR 유전자 증폭, 분석이 통합적으로 이루어지는 통합 유전자 분석 장치를 제공하는 것이다. 본 발명에서는 마그네틱 비드를 이용한 시료의 농축, 열을 이용한 유전자 추출, PCR 분석이 가능한 히팅, 냉각 온도 사이클링, 광학계를 이용한 결과의 분석이 각각 모듈별로 구성되어 있고, 이 모듈을 하나의 시스템으로 완성하여 시료투입부터 결과분석까지 가능한 유해물질 검사용 통합 유전자 분석 장치가 제공된다.
또한 휴먼 감염성질환등 농축이 필요하지 않는 경우는, 혈액과 같은 샘플로부터 유전자 추출, PCR을 통한 유전자 증폭, 분석이 통합적으로 이루어지는 통합 유전자 분석 장치를 제공하는것이다.
본 발명에 따르면, 마그네틱 비드와 혼합되어 마이크로 유체 칩을 통해 흐르는 시료를 농축시킬 수 있는 자석 및, 상기 농축된 시료로부터 유전자를 추출할 수 있도록 상기 시료를 가열할 수 있는 히터를 구비한, 시료의 농축 및 추출부;
상기 추출된 유전자의 정제를 위한 시약 및 유전자의 PCR 증폭을 위한 시약을 수용하는 하나 이상의 튜브들과, 상기 튜브들 각각에 추출된 유전자, 시약 또는 유전자 및 시약의 혼합물을 포함하는 유체를 주입하거나, 상기 튜브들 각각으로부터 상기 유체를 흡입하는 피펫과, 상기 피펫을 수평 왕복이동 및 승강 이동시키는 X-Z 스테이지를 구비하는, 유전자의 정제부;
상기 유전자의 정제부에서 정제된 유전자를 상기 피펫과 상기 X-Y 스테이지를 이용하여 주입받고, 열원을 이용하여 유전자를 증폭하는 유전자 증폭부; 및,
상기 증폭된 유전자가 담긴 튜브에 인접하게 설치되어 유전자 증폭량을 검출하는 광학계;를 구비하는, 통합 유전자 분석 장치가 제공된다.
본 발명의 다른 특징에 따르면, 농축이 필요하지 않은 샘플로부터 유전자를 추출할 수 있도록 상기 시료를 가열할 수 있는 히터를 구비한, 시료의 추출부;
상기 추출된 유전자의 정제를 위한 시약 및 유전자의 PCR 증폭을 위한 시약을 수용하는 하나 이상의 튜브들과, 상기 튜브들 각각에 추출된 유전자, 시약 또는 유전자 및 시약의 혼합물을 포함하는 유체를 주입하거나, 상기 튜브들 각각으로부터 상기 유체를 흡입하는 피펫과, 상기 피펫을 수평 왕복이동 및 승강 이동시키는 X-Z 스테이지를 구비하는, 유전자의 정제부;
상기 유전자 정제부에서 정제된 유전자를 상기 피펫과 X-Z스테이지를 이용하여 주입받고, 열원을 이용하여 유전자를 증폭하는 유전자 증폭부; 및,
상기 증폭된 유전자가 담긴 튜브에 인접하게 설치되어 유전자 증폭량을 검출하는 광학계;를 구비하는, 통합 유전자 분석 장치가 제공된다.
본 발명의 다른 특징에 따르면, 상기 자석은 상기 마이크로 유체 칩에 대하여 인접한 위치와 상기 마이크로 유체 칩으로부터 이격된 위치 사이에서 이동할 수 있으며, 상기 자석이 마이크로 유체 칩에 인접한 위치에서는 마그네틱 비드와 결합된 유전자가 마이크로 유체 칩의 내측 표면에 부착됨으로써 시료의 농축이 이루어질 수 있다.
본 발명의 다른 특징에 따르면, 상기 마이크로 유체 칩은 유입구, 유출구 및 상기 유입구와 유출구를 연결하는 채널을 구비하고, 상기 유입구에 연결된 시린지 펌프에 의하여 유체가 주입되고, 상기 유출구로부터 배출된 유체는 상기 피펫에 의하여 흡입된다.
본 발명의 다른 특징에 따르면, 상기 자석이 마이크로 유체 칩에 인접한 위치에서, 상기 마이크로 유체 칩에 물 또는 세정용 버퍼를 주입함으로써 마그네틱 비드와 결합되지 않은 불순물을 마이크로 유체 칩체 칩의 외부로 배출할 수 있다.
본 발명의 다른 특징에 따르면, 상기 튜브의 개방된 상단을 폐쇄시키기 위한 튜브 커버 부착부를 포함한다.
본 발명의 다른 특징에 따르면, 상기 튜브커버 부착부는 내열필름과 열압착부를 이용하여 튜브의 개방된 상단을 밀폐할 수 있다.
본 발명의 실시에 따른 유해물질 측정용 통합 분석기기는 시료의 농축, 추출, PCR 증폭, 분석을 순차적으로 진행하여 하나의 시스템으로 구현이 되어, 사용자가 간단하게 유해물질의 자가 검출 및 관리가 가능하게 된다. 시료투입부터 결과 분석까지 하나의 시스템으로 이뤄짐에 따른 효과는 다음과 같다.
- 전처리 기능을 자동화하여 식품유해물질이나 감염성질환검사를 신속하게 할 수 있다.
- 복잡한 검사 공정을 자동화하여 비전문가도 손쉽게 검사가 가능하다.
- 실험실외부에서 검사 결과를 확인할 수 있어, 현장검사가 가능하다.
- 농축기능을 자동화 하여 배양이 어려웠던 노로바이러스검사에 적용할 수 있다.
- 공정별로 다양한 장비가 필요했으나 본 발명 하나로 모두 공정을 수행할 수 있다.
- 주요 공정별로 모듈식으로 제작하여 농축이 필요하지 않은 혈액과 같은 시료의 경우 농축과정을 사용하지 않고, 추출/정제과정, 유전자 증폭/분석과정만을 적용하여 바이러스/세균검사, 감염성 질환등을 검사할 수 있다.
도 1 은 본 발명에 따른 통합 유전자 분석 장치를 개략적으로 도시한 구성도이다.
도 2 는 마이크로 유체 칩의 구성을 나타내는 개략적인 사시도이다.
도 3a 는 자석을 도시하고, 도 3b 는 자석이 브래킷에 고정된 상태를 나타낸다.
도 4 는 자석과 마이크로 유체 칩의 결합 상태를 개략적으로 도시한다.
도 5 는 유전자의 정제 및 증폭부의 구성을 개략적으로 도시한다.
도 6 은 도 5 에 도시된 유전자의 정제 및 증폭부의 구성을 구현한 예를 도시하는 사시도이다.
도 7 은 도 4 및 도 6 을 참조하여 설명된 개별 구성을 통합시킨 통합 유전자 분석 장치의 전체적인 사시도이다.
도 2 는 마이크로 유체 칩의 구성을 나타내는 개략적인 사시도이다.
도 3a 는 자석을 도시하고, 도 3b 는 자석이 브래킷에 고정된 상태를 나타낸다.
도 4 는 자석과 마이크로 유체 칩의 결합 상태를 개략적으로 도시한다.
도 5 는 유전자의 정제 및 증폭부의 구성을 개략적으로 도시한다.
도 6 은 도 5 에 도시된 유전자의 정제 및 증폭부의 구성을 구현한 예를 도시하는 사시도이다.
도 7 은 도 4 및 도 6 을 참조하여 설명된 개별 구성을 통합시킨 통합 유전자 분석 장치의 전체적인 사시도이다.
본 발명에서 시료의 농축은 타켓 시료와 특이적으로 결합하는 마그네틱 비드(magnetic bead)를 사용하게 된다. 시료와 결합된 마그네틱 비드는 자성을 가지고 있으며, 자석을 이용하여 마그네틱 비드와 결합된 시료만 선택적으로 농축할 수 있다. 시료 농축용 자석은 탈착이 가능한 형태로 모터등의 이송부와 연결되어 시료 농축시에는 자석이 결합되고, 농축 후 자석을 제거하여 농축된 시료만 얻을 수 있게 된다. 시료 농축시에는 마이크로 유체 칩(microfluidic chip)등을 사용하여 시료를 일정 속도로 상기 마이크로 유체 칩 내부에 유동시킨다.
시료의 추출은 바이러스나 박테리아등의 유해물질에 열을 가해 표면을 용해시키는 방법을 사용한다. 이 때 열원은 세라믹 히터나 열전소자등의 다른 열원을 사용하기도 한다. 추출된 유전자는 시린지 펌프(syringe pump)등을 사용하여 칩 밖에 있는 튜브에 수집된다. 수집된 유전자는 그대로 증폭에 사용되기도 하지만, 통상적으로 불순물이 포함되어 있으므로, PCR 분석전에 정제 과정을 거쳐야 한다. 정제 과정은 피펫을 이용하여 수행되는데, 시약이 담겨 있는 튜브로 피펫이 z 축 스테이지를 통해서 이동하면서 이루어진다. z축 스테이지의 피펫에는 시린지 펌프가 구비되어 시약을 흡입 및 배출할 수 있다.
농축 및 추출 과정을 거쳐서 모여진 유전자를 피펫을 이용하여 흡입한 후, 세정 버퍼(washing buffer)가 담겨진 시약에 분주하고, 이와 같은 과정을 반복하여 정제과정을 거치게 된다.
정제과정을 거친 유전자는 피펫이 구비된 z축 스테이지를 사용하여 PCR이 가능한 칩 또는 튜브에 옮겨지게 된다. 이때 PCR에 필요한 마스터 믹스(master mix)등의 시약도 피펫을 이용하여 PCR 칩 또는 튜브에 정해진 양으로 주입된다.
정제과정에 사용하는 세정 버퍼 및 PCR 시약은 튜브에 미리 담겨져 있다. z축 스테이지에 구비된 피펫은 상하로 움직일 수 있고 수평으로 왕복 이송될 수 있고, 시린지 펌프가 피펫과 연결 작동하여 시약을 흡입 및 배출할 수 있다. z 축 스테이지는 수평 이동할 수 있어서 각각의 튜브 위를 이동하면서 시약을 순차적으로 상이한 튜브로 옮길 수 있다. z축 스테이지는 하강하여 시료를 흡입한 후 다시 상승하고, 세정 버퍼가 담긴 튜브위로 이동하여 시료를 분주하게 된다. 이후에 다시 시료를 흡입하여 PCR 튜브로 옮기고, 마스터 믹스(master mix), 프라이머(primer) 등 PCR에 필요한 시약들도 흡입하여 PCR 튜브로 옮기게 된다.
추출된 유전자나 이를 정제한 유전자 및 PCR 시약이 담긴 PCR 튜브에 열을 가해 PCR 사이클링(cycling)을 수행하게 된다. 이때 열원으로는 펠티어 소자를 이용하거나 또는 고온 공기등을 이용할 수 있다. PCR 튜브의 상부 또는 측면에는 광학계가 설치되어 있어서 결과를 분석할 수 있다.
시료는 마그네틱 비드와 혼합하여 시린지 펌프등을 이용하여 마이크로 유체 칩 내부에 주입된다. 마그네틱 비드와 결합된 시료은 상부 및 하부에 위치한 자석의 자력에 의해 칩의 내부에서 벽면으로 이끌려 칩내부 벽면에 붙게 되고, 마그네틱 비드와 결합된지 않은 불순물등은 물이나 버퍼등을 흘려보내 칩 외부로 배출되어 진다. 이와 같은 결과로 칩 내부에 타겟 시료만 농축이 되어진다. 농축된 시료는 자석을 제거한 후 물이나 버퍼등을 흘려보내면 함께 칩의 다른 위치로 보내거나 칩 외부로 내보내진다. 이때, 농축된 타켓 시료로부터 유전자를 추출하기 위해서는 유전자 추출용 Lysis 시약을 이용하거나 열원을 이용하여 유전자를 추출할 수 있다. 추출된 유전자는 세정(washing) 등의 과정을 거쳐 순수 유전자(DNA,RNA)만을 정제하고 되고, 정제된 유전자를 칩 또는 튜브로 이동한다. 여기에 마스터 믹스(master mix) 등의 PCR 시약을 주입한 후 온도 사이클링을 하여 유전자 증폭을 하고, 이를 광학계로 분석하여 결과를 얻게 된다. 농축, 추출, PCR, 분석의 기능이 구현된 모듈이 통합적으로 구성되어 순차적으로 식품 유해물질 바이러스나 사람이나 가축등이 감염성 질환등을 측정하게 된다.
유전자 추출 과정에서는 먼저 마그네틱 비드와 결합된 시료에 열을 가하거나 추출용 라이시스(Lysis)시약을 통해 추출이 가능하다. 열을 이용할 경우에, 시료에 열을 가하면 세포가 파괴되고, 세포 내부의 DNA 가 외부로 노출된다. 열은 히터를 사용하거나, 자석에 전류를 가하여 생성하게 할 수 있다. 추출된 유전자는 상기와 같이 자석을 제거한 후 물이나 버퍼를 칩내부로 흘려보내면 자석에 의해 칩내부에 마그네틱비드와 함께 붙어있었던 유전자가 칩 내부에서 분리되고, 주입된 물이나 버퍼와 함께 칩 내부 또는 외부의 특정위치로 모인다.
칩은 내부에 채널이 있는 마이크로플루이딕칩을 사용한다. 마이크로플루이딕칩은 내부에 시약이 흐를 수 있는 채널이 있고 이 채널은 유입구 및 유출구와 연결되어 있다. 유입구에 시린지 펌프등을 이용하여 시약을 주입하면 채널을 따라 흐르다가 유출구로 배출된다.
자석은 플레이트에 소형의 자석들을 여러개 결합하여 판 형태로 제작되거나 넓은 판형태의 자석을 사용한다. 자석은 고정용 브라켓에 결합이 되어 칩의 윗면과 아랫면에 위치하게 된다. 마그네틱비드와 결합된 샘플이 칩내부의 채널을 통해 흐르게 되는데 이 때 상,하부 자석의 자력에 의해 마그네틱 비드는 칩의 벽면에 고정되게 된다. 자석을 제거하면 마그네틱 비드들은 벽면에서 분리되고 버퍼를 주입하면 칩 내의 다른 위치로 이동하거나 유츌부(outlet)를 통해 칩 외부에 모이게 된다.
상기와 같이 추출과정을 통해 외부에 모아진 타겟 샘플 유전자는 유전자 뿐만 아니라 마그네틱비드, 버퍼, 기타 불순물등이 혼합되어 있다. PCR을 위해서 상기와 같이 추출된 유전자를 분순물과 함께 사용하기도 하고, 이러한 혼합물에서 순수 유전자만을 분리하는 정제과정을 통해 정제된 유전자를 이용 PCR을 하기도 한다. 상기와 같이 정제과정이 필요할 경우 본 발명에서는 유전자 정제(purification)을 위해서 모터로 구동하는 2축 스테이지와 미리 충전된 시약이 들어 있는 튜브들을 이용하여 유전자를 정제한다. 정제용 시약들은 미리 충전된 카트리지에 주입되어 있다. 피펫(pipet)팁이 구비된 Z 축 스테이지와, Z 축 스테이지부를 수평으로 왕복시킬 수 있는 X 축 스테이지가 구비된다. z축 스테이지의 일단에는 소모성 피펫팁이 부착되며, 피펫팁은 피펫팁 내부에 구멍이 뚫린 홀더에 고정되고, 홀더는 실린지 펌프와 연결되어 마이크로 유체 칩 내부 또는 외부에 모인 상기 유전자 혼합물을 흡입하여 정제를 위한 특정위치로 배출한다. Z축, X축 스테이지는 모터, LM 가이드, 풀리등으로 구성되어 유전자혼합물이니 정제과정중인 유전자 혼합물을 이동하면서 작업이 가능하게 한다. 위 과정을 거쳐 정제된 유전자(DNA, RNA)는 다음 PCR을 수행할 수 있도록 상기 Z축 스테이지 및 X축 스테이지와 피펫팁을 이용하여 별도의 칩 또는 튜브로 이동하게 된다. 이동된 유전자에 마스터 믹스(master mix) 등의 시약을 주입하고, 유전자와 시약을 혼합한 후 PCR(유전자 증폭)을 진행하게 된다. PCR 은 샘플의 유전자와 마스터 믹스 시약, 프라이머(primer)를 섞은 용액에 열을 가해서 온도를 상승, 하강 시키게 되는데, 정해진 온도 싸이클을 반복하게 되면 유전자량이 증가하는 유전자 증폭결과를 얻을 수 있다. 이때 온도를 상승 및 하강시키기 위한 열원으로는 펠티어 소자 또는 고온 공기, 레이저등을 사용할 수 있다. 증폭된 유전자는 PCR 칩 또는 튜브의 상부 또는 측면에 광학계를 이용하여 유전자 증폭량을 실시간으로 볼 수도 있고, 최종 결과에 따라 식품 유해물질이나 사람, 동물들의 감염성 질환등을 분석할 수 있다.
본 발명에 따른 유해물질 측정용 통합 분석 장치는 샘플을 농축 및 추출하는 전처리 과정과 유전자의 증폭과정 및 분석과정을 통합함으로써 식품 유해물질, 질병등을 검사하게 된다.
이하, 본 발명을 첨부된 도면을 참조하여 보다 상세하게 설명하기로 한다.
도 1 은 본 발명에 따른 통합 유전자 분석 장치를 개략적으로 도시한 구성도이다.
도면을 참조하면, 본 발명의 통합 유전자 분석 장치는,
마그네틱 비드와 혼합되어 마이크로 유체 칩(11)을 통해 흐르는 시료를 농축시킬 수 있는 자석(12) 및, 상기 농축된 시료로부터 유전자를 추출할 수 있도록 상기 시료를 가열할 수 있는 히터(13)를 구비한, 시료의 농축 및 추출부(10);
상기 추출된 유전자의 정제를 위한 시약 및 유전자의 PCR 증폭을 위한 시약을 수용하는 하나 이상의 튜브(T, T')들과, 상기 튜브들 각각에 추출된 유전자, 시약 또는 유전자 및 시약의 혼합물을 포함하는 유체를 주입하거나, 상기 튜브들 각각으로부터 상기 유체를 흡입하는 피펫(31)과, 상기 피펫(31)을 수평 왕복이동 및 승강 이동시키는 X-Z 스테이지를 구비하는, 유전자의 정제부;
상기 유전자의 정제부에서 정제된 유전자를 상기 피펫과 상기 X-Y 스테이지를 이용하여 주입받고, 열원을 이용하여 유전자를 증폭하는 유전자 증폭부(30); 및,
상기 증폭된 유전자가 담긴 튜브(T')에 인접하게 설치되어 유전자 증폭량을 검출하는 광학계(50);를 구비한다. ,
도 2 는 마이크로 유체 칩의 구성을 나타내는 개략적인 사시도이다.
도면을 참조하면, 마이크로 유체 칩(11)에는 시료를 주입하기 위한 유입구(11a)와, 상기 시료가 통과하는 채널(11c)과, 상기 시료가 배출될 수 있는 유출구(11b)가 구비된다. 시료, 물 또는 버퍼 용액과 같은 유체는 시린지 펌프(미도시)등에 의하여 유입구(11b)로 주입될 수 있다. 위에 설명된 바와 같이 본 발명에서는 시료가 마그네틱 비드(magnetic bead)와 혼합되어 마이크로 유체 칩(11) 안에 주입된다.
도 3a 는 자석을 도시하고, 도 3b 는 자석이 브래킷에 고정된 상태를 나타낸다.
자석(33)은 전체적으로 얇은 두께를 가지는 사각형 평판의 형상을 가진다. 자석은 플레이트에 소형 자석을 여러개 결합하여 구성될 수 있거나, 또는 판 형태의 자석으로서 구성될 수 있다. 자석(33)은 브래킷(33)의 일측에 고정된다. 자석(33)은 마그네틱 비드와 혼합된 시료를 자성을 이용하여 농축하는 작용을 수행한다.
도 4 는 자석과 마이크로 유체 칩의 결합 상태를 개략적으로 도시한다. 도면을 참조하면, 고정부(46)의 일측에는 구동 모터(M)가 설치되고, 상기 구동 모터(M)에 의하여 이동부(45)는 왕복 이동할 수 있다. 이동부(45)에는 도 3b 를 통해 설명된 자석 고정용 브래킷(32)이 설치된다. 자석 고정용 브래킷(32)에는 자석(33)이 고정되어 있다. 따라서, 구동 모터(M)의 구동에 의하여, 자석(33) 및 브래킷(32)은 왕복 이동할 수 있다. 한편, 마이크로 유체 칩(11)은 도시되지 않은 다른 고정부에 고정되어 있다.
따라서, 자석(33)은 고정된 마이크로 유체 칩(11)에 인접한 위치로 이동하거나, 또는 마이크로 유체 칩(11)으로부터 이격된 위치로 이동할 수 있다. 도 4 에 도시된 것은 자석(33)이 마이크로 유체 칩(11)에 인접한 상태이며, 이때 자석(33)과 마이크로 유체 칩(11)은 겹쳐진 상태가 된다. 따라서, 마이크로 유체 칩(11)의 채널(11c)을 통해 유동하는 시료에 검출에 필요한 성분은 마그네틱 비드와 결합되어 있으므로, 자력에 의하여 마이크로 유체 칩(11)의 내표면에 부착됨으로써 농축이 이루어질 수 있다. 마그네틱 비드와 결합되지 않은 불순물등의 성분은 물이나 버퍼등을 이용하여 마이크로 유체 칩(11)의 유출구(11b)를 통해 외부로 배출시킬 수 있다.
상기 농축이 이루어진 시료는 히터(13, 도 1)를 이용하여 가열함으로써 추출이 이루어진다. 즉, 시료에 열을 가함으로써 세포가 파괴되고, 세포 내부의 유전자가 노출된다. 이후에 자석(33)을 마이크로 유체 칩(11)으로부터 이격되게 이동시킴으로써 자력을 해제시키고, 물이나 버퍼 용액을 이용하여 마이크로 유체 칩(11)의 외부로 배출시킨다.
도 5 는 유전자의 정제 및 증폭부의 구성을 개략적으로 도시한다. 도면을 참조하면, 유전자의 정제 및 PCR 증폭을 위한 시약들이 담긴 튜브들이 다수 구비된다. 또한 상기 튜브들에 대한 유전자, 시약, 또는 유전자와 시약의 혼합물의 주입 및 흡입을 위한 피펫(31)을 수평 방향 이동 및 승강 이동을 위하여 X 축 스테이지 및 Z 축 스테이지가 구비된다. 도면에 도시된 예에서, 제 1 튜브(41)에는 농축 및 추출부(10, 도 1)에서 추출된 유전자가 주입된다. 즉, 상기 마이크로 유체 칩(11)으로부터 추출된 유전자를 포함하는 유체가 제 1 튜브(41)에 주입될 수 있다.
제 1 튜브(41)에는 세정 버퍼(washing buffer)가 주입되어 있어서 상기 추출된 유전자를 세정할 수 있다. 다음에 제 2 튜브(42)에는 이류션 버퍼(Elution buffer) 용액이 미리 담겨 있고, 제 3 튜브(43)에는 마스터 믹스(master mix) 시약이 미리 담겨 있고, 제 4 튜브(44)에는 프라이머(primer) 시약이 미리 담겨 있다. T' 로 표시된 튜브는 PCR 증폭이 이루어지는 튜브이다.
피펫(31)은 세정 버퍼가 주입된 제 1 튜브(41)에 모인 유전자를 흡입한 후 다시 상승하는 과정을 통해 유전자를 세정한다. 이후, 이류션 버퍼 용액이 담긴 제 2 튜브(42)에 시료를 주입함으로써 유전자의 정제가 이루어진다. 이후에 다시 정제된 시료중 정해진 양을 흡입하여 PCR 튜브(T')로 옮기고, 제 3 튜브의 마스터 믹스(master mix), 제 4 튜브의 프라이머(primer) 등 PCR 에 필요한 시약들을 흡입하여 PCR 튜브(T')로 옮긴다.
도 6 은 도 5 에 도시된 유전자의 정제 및 증폭부의 구성을 구현한 예를 도시하는 사시도이다.
도면을 참조하면, X 축 스테이지는 구동 모터(63)와, 상기 구동 모터(63)의 회전축에 연결된 풀리에 걸쳐 있는 벨트(65)에 의해 이루어진다. 또한 Z 축 스테이지는 구동 모터(62)와 수직 승강부(61)에 의해 이루어진다. 수직 승강부(61)는 다양한 방식으로 구현될 수 있으며, 예를 들어 볼 스크류, 캠 및 캠 종동부등에 의해 구현될 수 있다. Z 축 스테이지의 구동 모터(63)가 고정되어 있는 이동부는 LM 가이드(64)를 따라서 수평 방향으로 이동할 수 있다. 또한 수직 승강부(61)에 설치된 피펫(31)은 구동 모터(62)의 작용에 의하여 승강될 수 있다. 따라서 다수의 튜브(T, T')들에 대한 주입 및 흡입이 이루어질 수 있다. 튜브(T, T')들이 도면에 도시된 바와 같이 2 열로 이루어진 경우에, 튜브(T,T')들이 놓이는 지지대를 Y 축 방향으로 구동할 수 있도록 Y 축 스테이지(미도시)가 더 구비될 수 있다는 점이 이해될 것이다.
도 7 은 도 4 및 도 6 을 참조하여 설명된 개별 구성을 통합시킨 통합 유전자 분석 장치의 전체적인 사시도이다.
도면을 참조하면, 마이크로 유체 칩(11)과 자석(33)은 서로 인접하게 배치되어 겹쳐진 상태로 표시되어 있다. 시린지 펌프(73)가 구비됨으로써 상기 마이크로 유체 칩(11)에 대한 시료 및 버퍼 용액의 주입을 수행할 수 있다. 시약 튜브(T,T)들에 유전자 및 시약등을 주입 또는 흡입하기 위한 피펫(31)은 Z 축 스테이지에 의해 승강된다. 한편, PCR 증폭 튜브(T')에 담긴 유전자의 증폭을 검출하기 위하여, 광학계(50)가 설치된다. 또한 PCR 증폭을 위하여 상기 튜브(T')를 가열하기 위한 히터(71) 및 방열판(72)등이 구비될 수 있다.
상시 튜브(T')에 주입된, 정제된 유전자, PCR용 마스터 믹스(Master mix), 프라이머(Primer)가 포함된 유체는 온도의 상승 및 하강 과정중에 증발현상이 발생하기 때문에 이를 방지하기 위해 튜브의 개방된 상단을 자동으로 폐쇄해야 하는데, 이를 위해서는 튜브(T')에 원통형 막대에 감겨있는 필름을 상기 튜브 상단에 위치시키고, 별도의 기구물로 적절한 열을 일정한 시간(수십초이내)동안 가해서 필름이 튜브의 상단을 밀폐시킨후 PCR과정을 수행하는 것이 바람직스럽다.
10. 농축 및 추출부 30. 정제 및 증폭부
11. 마이크로 유체 칩 31. 피펫
13. 히터 50. 광학계
11. 마이크로 유체 칩 31. 피펫
13. 히터 50. 광학계
Claims (8)
- 마그네틱 비드와 혼합되어 마이크로 유체 칩(11)을 통해 흐르는 시료를 농축시킬 수 있는 자석(33)으로서, 상기 자석(33)은 상기 마이크로 유체 칩(11)에 대하여 인접한 위치와 상기 마이크로 유체 칩(11)으로부터 이격된 위치 사이에서 이동할 수 있으며, 상기 자석(33)이 마이크로 유체 칩(11)에 인접한 위치에서는 마그네틱 비드와 결합된 시료가 마이크로 유체 칩(11)의 내측 표면에 부착됨으로써 시료의 농축이 이루어질 수 있게 하는 자석(33) 및, 상기 농축된 시료로부터 유전자를 추출할 수 있도록 상기 시료를 가열할 수 있는 히터(13)를 구비한, 시료의 농축 및 추출부(10);
상기 시료의 농축 및 추출부(10)의 유전자를 피펫과 X-Y 스테이지를 이용하여 주입받고, 시약을 혼합한 후 열원을 이용하여 유전자를 증폭하는 유전자 증폭부(30); 및,
상기 증폭된 유전자가 담긴 튜브(T')에 인접하게 설치되어 유전자 증폭량을 검출하는 광학계(50);를 구비하는, 통합 유전자 분석 장치. - 삭제
- 삭제
- 제 1 항에 있어서,
상기 마이크로 유체 칩(11)은 유입구(11a), 유출구(11b) 및 상기 유입구와 유출구를 연결하는 채널(11c)을 구비하고, 상기 유입구(11a)에 연결된 시린지 펌프에 의하여 유체가 주입되고, 상기 유출구(11b)로부터 배출된 유체는 상기 피펫(31)에 의하여 흡입되는 것을 특징으로 하는, 통합 유전자 분석 장치. - 제 1 항에 있어서,
상기 자석(33)이 마이크로 유체 칩(11)에 인접한 위치에서, 상기 마이크로 유체 칩(11)에 물 또는 세정용 버퍼를 주입함으로써 마그네틱 비드와 결합되지 않은 불순물을 마이크로 유체 칩체 칩(11)의 외부로 배출할 수 있는 것을 특징으로 하는, 통합 유전자 분석 장치. - 제 1 항에 있어서,
상기 튜브(T')의 개방된 상단을 폐쇄시키기 위한 튜브 커버 부착부를 포함한 것을 특징으로 하는, 통합 유전자 분석 장치. - 제 6 항에 있어서,
상기 튜브커버 부착부는 내열필름과 열압착부를 이용하여 튜브(T')의 개방된 상단을 밀폐할 수 있는 것을 특징으로 하는, 통합 유전자 분석 장치. - 제 1 항에 있어서,
상기 추출된 유전자의 정제를 위한 시약 및 유전자의 PCR 증폭을 위한 시약을 수용하는 하나 이상의 튜브(T, T')들과, 상기 튜브들 각각에 추출된 유전자, 시약 또는 유전자 및 시약의 혼합물을 포함하는 유체를 주입하거나, 상기 튜브들 각각으로부터 상기 유체를 흡입하는 피펫(31)과, 상기 피펫(31)을 수평 왕복이동 및 승강 이동시키는 X-Z 스테이지를 구비하는, 유전자의 정제부;를 더 포함하는 것을 특징으로 하는, 통합 유전자 분석 장치.
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