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KR102005237B1 - 에쿠올 유도체를 생산하는 재조합 대장균 및 이를 이용한 에쿠올 유도체 합성 방법 - Google Patents

에쿠올 유도체를 생산하는 재조합 대장균 및 이를 이용한 에쿠올 유도체 합성 방법 Download PDF

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KR102005237B1
KR102005237B1 KR1020170026774A KR20170026774A KR102005237B1 KR 102005237 B1 KR102005237 B1 KR 102005237B1 KR 1020170026774 A KR1020170026774 A KR 1020170026774A KR 20170026774 A KR20170026774 A KR 20170026774A KR 102005237 B1 KR102005237 B1 KR 102005237B1
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Abstract

본 발명은 슬래키아 이소플라보니컨버턴스 (Slackia isoflavoniconvertens) 유래의 효소 (daidzein reductase, dihydrodaidzein racemase, dihydrodaidzein reductase, tetrahydrodaidzein reductase)를 발현시킨 재조합 대장균을 이용하여 다이드제인 또는 제니스테인 (genistein)으로부터 에쿠올, 디하이드로에쿠올, 5-하이드록시-에쿠올(5-hydroxy-equol) 및 5-하이드록시-디하이드로에쿠올(5-hydroxy-dehydroequol)을 선택적 및 효율적으로 합성하는 방법에 관한 것이다.
또한, 상기 미생물 균주와 5-하이드록시-에쿠올 또는 5-하이드록시-디하이드로에쿠올을 발현하는 생변환 조성물은 항산화제, 항암제 등으로 사용할 수 있으며, 갱년기 질환의 예방 또는 치료에 사용할 수 있다.

Description

에쿠올 유도체를 생산하는 재조합 대장균 및 이를 이용한 에쿠올 유도체 합성 방법{RECOMBINANT E．COLI PRODUCING EQUOL DERIVATIVES AND METHOD FOR PRODUCING EQUOL DERIVATIVES USING THEREOF}
본 발명은 에쿠올 유도체를 생산하는 재조합 대장균 및 이를 이용한 에쿠올 유도체 합성 방법에 관한 것이다.
사람의 장내 미생물 중 일부 혐기성 미생물은 사람이 콩과 식물을 통해 섭취한 이소플라본을 대사하여 에쿠올로 생변환하는 것이 알려져 있다. 지금까지 발견된 에쿠올 합성 미생물은 전부 박테리아이며, 대표적으로 슬래키아 속 (Slackia sp.), 에그게르텔라 속 (Eggerthella sp.), 애들러크루찌아 속 (Adlercreutizia sp.)과 같이 대부분이 코리오박테리아속에 속해 있으며, 예외적으로 락토코커스 (Lactococcus) 유래도 존재한다.
위와 같은 장내 미생물의 효소 반응으로 만들어진 에쿠올은 S 구조의 광학이성질체만 합성되며, 이는 사람의 인체에 흡수되어 식물성 에스트로겐 (phytoestrogen) 효과를 보임이 알려져 있다. 따라서 에쿠올을 꾸준히 섭취할 경우, 유방암 유발과 같은 종래의 갱년기증상 치료제의 부작용없이 여성의 갱년기 증상, 특히 골다공증의 발병 및 증상이 완화됨이 증명되었다. 이와 같은 효과는 에쿠올의 분자 구조가 사람의 에스트로겐과 유사성을 가지며, 에스트로겐 수용체 α와 β 중 α 에 선택성이 높기 때문이다. 이 뿐만 아니라 (S)-에쿠올은 심혈관계 질환을 예방하며 전립선암을 완화시키는 효능도 밝혀져 있다(비특허문헌 1). 에쿠올의 유사체인 5-하이드록시-에쿠올은 이소플라본인 제니스테인(genistein)으로부터 유래된 물질로서 에쿠올에 비해 밝혀진 생물학적 효능은 상대적으로 적지만 에쿠올보다 뛰어난 항산화성을 보이는 식물성 에스트로겐임이 보고되었다(비특허문헌 2). 또한, 디하이드로에쿠올(dehydroequol)은 전립선암과 난소암 세포의 성장을 억제한다는 보고가 있으며, 임상 2기 시험 결과 화학 항암제에 내성이 생긴 난소암의 억제에 효과가 있음이 보고되었다(비특허문헌 3).
그러나, 장내 미생물을 이용하는 에쿠올 합성을 위한 다양한 노력과 연구와는 달리 5-하이드록시-에쿠올에 대한 합성 노력은 제한적이었다. 단지 에쿠올을 생합성하는 몇몇 장내 미생물이 5-하이드록시-에쿠올을 합성할 수 있음이 이하와 같이 보고되었다. 쥐의 장에서 동정한 코리오박테리아 Strain Mt1B8과 사람의 대변에서 동정한 슬래키아 이소플라보니컨버턴스를 이용하여 제니스테인이 다이하이드로제니스테인을 거쳐 5-하이드록시-에쿠올로 생합성 됨이 밝혀졌다(비특허문헌 4). 하지만 이러한 균주를 이용한 5-하이드록시 에쿠올 생산은 미생물을 혐기 조건에서 생장시키는 것에 대한 제한점이 있고, 미생물 접종 후부터 최소 15시간 이후부터 5-하이드록시 에쿠올이 생산되며 생산성이 낮고, 표준 물질의 부재로 인한 정확한 최종 수율 예측이 어렵다는 한계점이 존재한다.
이소플라본 중 하나인 제니스테인(genistein)은 미생물 Coriobacteriacae Strain Mt1B8(16), 슬래키아 이소플라보니컨버턴스(Slackia isoflavoniconvertens)(17), strain AUH-JLC159 에 의해서 5-하이드록시-에쿠올로 생전환됨이 보고된 적이 있으나 반응 및 배양 시간이 2~3일로 길며, 혐기성 반응 조건을 요구하고, 기질인 제니스테인의 양이 0.6 mmol/L 이상일 경우 전환율이 80% 이하로 떨어지는 문제점이 존재한다(특허문헌 1).
합성된 5-하이드록시-에쿠올은 DPPH 라디칼 포착 효과가 (S)-에쿠올의 20배이며, 예쁜꼬마선충(Caenorhabditis elegans)의 수명과 스트레스 저항성을 증가시킴이 증명되었다(비특허문헌 5). 그러나 5-하이드록시-에쿠올의 그 외의 생리적 활성은 밝혀진 바가 없다.
근래에 락토코커스 및 슬래키아 속의 박테리아에서 이소플라본 다이드제인 (daidzein)을 에쿠올로 변환시키는 역할을 하는 4개의 효소가 2013년 Annett Braune 그룹에 의해 처음으로 동정되었다(비특허문헌 6). 상기 효소는 3개의 환원효소와 1개의 이성질화 효소로 구성되어 있으며, 다이드제인 환원효소(daidzein reductase), 다이하이드로다이드제인 라세미화효소(dihydrodaidzein racemase), 다이하이드로다이드제인 환원효소(dihydrodaidzein reductase), 테트라하이드로다이드제인 환원효소(tetrahydrodaidzein reductase)이다.
중국 특허공보 제 103275884 호
Nutrition Reviews, 69(8), 432-448, 2011 J. Chin. Pharm. Sci., 23(6), 378-384, 2014 Int. J. Gynecol. Cancer, 21(4), 633-639, 2011 Applied and Environmental Microbiology, 74, 4847 (2008)/ Applied and Environmental Microbiology, 75, 1740 (2009) Conghui Zhang et al., J. Chin. Pharm. Sci., 23(6):378-384, 2014 Appl. Environ. Microbiol., 79(11), 3494, 2013
본 발명의 목적은 슬래키아 이소플라보니컨버턴스 유래의 효소 4개를 발현하는 재조합 대장균을 제공하는 것이다.
또한, 본 발명의 다른 목적은 신규한 화합물인 5-하이드록시-디하이드로에쿠올을 제공하는 것이며, 이에 대한 합성 방법은 전무하였다.
이에, 본 발명의 다른 목적은 상기 재조합 대장균을 이용하여 다이드제인 또는 제니스테인으로부터 에쿠올, 디하이드로에쿠올, 5-하이드록시-에쿠올 또는 5-하이드록시-디하이드로에쿠올을 합성하는 방법을 제공하는 것이다.
또한, 본 발명의 다른 목적은 슬래키아 이소플라보니컨버턴스 유래의 효소 4 개 중 2 개 또는 3 개의 효소를 조합하여 발현하는 재조합 대장균을 이용하여 5-하이드록시-에쿠올, 디하이드로에쿠올 및 5-하이드록시-디하이드로에쿠올을 선택적 및 효율적으로 합성하는 방법을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명자들은 사람의 장내 미생물인 슬래키아 이소플라보니컨버턴스(Slackia isoflavoniconvertens)유래의 다이드제인 환원효소(daidzein reductase), 다이하이드로다이드제인 라세미화효소(dihydrodaidzein racemase), 다이하이드로다이드제인 환원효소(dihydrodaidzein reductase), 테트라하이드로다이드제인 환원효소(tetrahydrodaidzein reductase)를 발현하는 재조합 대장균 및 상기 4 개의 효소 중 2 개 또는 3 개의 효소를 조합하여 발현하는 재조합 대장균을 제조하였다.
또한, 본 발명의 재조합 대장균은 다이드제인(daidzein)으로부터 에쿠올(equol) 또는 디하이드로에쿠올(dehydroequol)을 생변환하는 전세포 촉매(whole cell biocatalyst)로 이용될 수 있으며, 제니스테인을 5-하이드록시-에쿠올 또는 5-하이드록시-디하이드로에쿠올로 선택적으로 생전환하는 전세포 촉매로 이용될 수 있다.
본 발명은 호기성 조건에서 기질의 농도 약 0.2 내지 약 1 mmol/L 에서 95 % 기질 전환율로 에쿠올, 디하이드로에쿠올, 5-하이드록시-에쿠올 또는 5-하이드록시-디하이드로에쿠올을 생합성할 수 있다.
또한, 본 발명은 5-하이드록시-에쿠올, 디하이드로에쿠올 또는 5-하이드록시-디하이드로에쿠올을 선택적으로 합성할 수 있다.
또한, 본 발명은 5-하이드록시-에쿠올, 디하이드로에쿠올 및 5-하이드록시-디하이드로에쿠올의 선택적 합성을 호기성 조건에서 수 시간 단위로 수행 가능하므로, 생산 비용 절감 및 생산물로 인한 고부가가치 획득이 가능하며, 효율적인 대량생산을 통해 식품, 의약품 등의 다양한 응용처에 활용이 가능하다.
또한, 본 발명의 재조합 대장균을 전세포 촉매로 이용하는 반응계에 추가적인 산화환원효소에 적용할 경우, 다양한 하이드록시-이소플라보노이드를 합성할 수 있어 연구적으로 가치가 높다.
또한, 본 발명에 의해 합성된 화합물은 갱년기 질환 예방 및 치료에 사용될 수 있으며, 전립선암, 난소암 치료를 위한 항암제로 쓰일 수 있다. 또한, 화장품 또는 식품첨가물 형태로 항산화제로 사용될 수 있다.
도 1 은 초기 다이드제인의 농도에 따른 (S)-에쿠올의 수율을 나타낸 도표이다.
도 2 는 4 개 효소를 모두 발현하는 재조합 대장균을 이용한 에쿠올(equol), 디하이드로에쿠올(dehydroequol), 5-하이드록시-에쿠올(5-hydroxy-equol) 및 5-하이드록시-디하이드로에쿠올(5-hydroxy-dehydroequol) 합성 반응의 도식도이다.
도 3 은 도 2 의 합성 반응에 있어서, 반응 시간에 따른 제니스테인(genistein, GSN), 다이하이드로제니스테인 (dihydrogenistein, DHG), 5-하이드록시-에쿠올(5-hydroxy-equol, 5OH-EQ), 5-하이드록시-디하이드로에쿠올(5-hydroxy-dehydroequol, 5-OH-DEQ)의 반응계 내 농도 (μM)를 나타낸다.
도 4 는 2 개의 효소를 발현하는 재조합 대장균 1 및 2 를 이용하여 구획화된 합성 반응의 도식도이다.
도 5 는 도 4 의 합성 반응에 있어서, 반응 시간에 따른 제니스테인(genistein, GSN), 다이하이드로제니스테인(dihydrogenistein, DHG), 5-하이드록시-에쿠올(5-hydroxy-equol, 5OH-EQ), 5-하이드록시-디하이드로에쿠올(5-hydroxy-dehydroequol, 5-OH-DEQ)의 반응계 내 농도 (μM)를 나타낸다.
도 6 는 도 2 및 4 에서 언급한 재조합 대장균의 세포 추출물에서 단백질의 양을 SDS-PAGE로 나타낸 것이다.
도 7 은 210~320 nm 파장 범위에서 원이색성 분산계를 이용하여 타원율을 측정한 도표이다.
도 8는 2개 또는 3개의 효소를 발현하는 재조합 대장균을 이용하여 반응 시간에 따른 디하이드로에쿠올(dehydroequol)의 반응계 내 농도(μM)를 나타낸다.
도 9 은 초기 제니스테인의 농도에 따른 기질 전환율 및 5-하이드록시-디하이드로에쿠올의 수율을 나타낸 도표이다.
도 10 의 (가)는 5-하이드록시-에쿠올의 EI-MS로 분석한 질량 스펙트럼과 분자구조이고, (나)는 5-하이드록시-디하이드로에쿠올의 질량 스펙트럼과 분자구조이다.
도 11 은 수용성 고분자인 폴리에틸렌글리콜(polyethylene glycol, 이하 PEG) 또는 폴리비닐피롤리돈(polyvinyl pyrrolidone, 이하 PVP)을 첨가한 반응액에서의 (S)-에쿠올의 반응계 내 농도를 시간에 따라 나타낸 도표이다.
본 발명에서 사용되는 용어는 당 업계에서 통상적으로 사용되는 것으로 당업자라면 그 의미를 누구나 이해할 수 있을 것이나, 본 명세서에서 간략히 설명하면 다음과 같다:
(1) 발현: 재조합 유전자를 포함하는 벡터를 포함하는 미생물에서 재조합 단백질을 생산하는 것을 의미한다.
(2) 벡터 - 단일가닥, 이중가닥, 원형 또는 초나선 DNA 또는 RNA로 이루어진 폴리뉴클레오티드를 의미한다. 벡터는 재조합 단백질을 생산할 수 있도록 적절한 거리에 작동적으로 연결되어 있는 복제 오리진, 프로모터, 리보솜 결합부위, 핵산 카세트, 종결 등으로 구성되어 있다. 발현할 재조합 단백질에 코딩하는 유전자를 핵산 카세트 위치에 삽입한다.
(3) 세포 추출물 - 재조합 단백질이 발현된 미생물을 파쇄한 후, 원심분리기로 고형 세포 찌꺼기를 제거한 후의 상등액을 의미한다. 본 발명에서는 다이드제인 환원효소, 다이하이드로다이드제인 라세미화효소, 다이하이드로다이드제인 환원효소, 테트라하이드로다이드제인 환원효소 중 일부 또는 전부가 발현된 미생물 추출물을 의미한다.
(4) 전세포 반응 - 특정 효소를 포함하는 세포를 파쇄하여 세포추출물을 이용하거나 또는 효소를 분리정제하지 않고 온전한 세포 전체를 이용한 반응을 의미한다.
본 발명은 다이드제인 환원효소(daidzein reductase), 다이하이드로다이드제인 라세미화효소(dihydrodaidzein racemase), 다이하이드로다이드제인 환원효소(dihydrodaidzein reductase) 및 테트라하이드로다이드제인 환원효소(tetrahydrodaidzein reductase)를 발현하는 재조합 대장균에 관한 것이다.
본 발명에서는 슬래키아 이소플라보니컨버턴스(Slackia isoflavoniconvertens) 유래의 다이드제인 환원효소, 다이하이드로다이드제인 라세미화효소, 다이하이드로다이드제인 환원효소, 테트라하이드로다이드제인 환원효소에 해당하는 DNA서열을 중합효소연쇄반응(polymerase chain reaction, PCR)을 통해 증폭 시킨 후, pRSFDuet 또는 pCDFDuet 벡터에 각각 넣고 이를 E. coli에서 his-tag(6 histidine)과 같이 발현하였다.
상기 재조합 대장균은 기질인 다이드제인으로부터 에쿠올 또는 디하이드로에쿠올을 합성하는데 이용될 수 있다.
또한, 상기 재조합 대장균은 기질인 제니스테인으로부터 5-하이드록시-에쿠올 또는 5-하이드록시-디하이드로에쿠올을 합성하는데 이용될 수 있다.
상기 에쿠올 또는 5-하이드록시-에쿠올 합성 방법은 (S)-에쿠올 또는 5-하이드록시-(S)-에쿠올을 합성하는데 이용될 수 있다.
보다 구체적으로, 상기 재조합 대장균은 다이드제인(daidzein)으로부터 에쿠올(equol) 및 디하이드로에쿠올(dehydroequol)을 생변환하는 전세포 촉매(whole cell biocatalyst)로 이용될 수 있으며, 또한, 제니스테인을 5-하이드록시-에쿠올(5-hydroxy-equol) 및 5-하이드록시-디하이드로에쿠올(5-hydroxy-dehyroequol)로 생전환하는 전세포 촉매로 이용될 수 있다.
본 발명의 재조합 대장균을 전세포 촉매로 이용하는 에쿠올 합성 반응에는, 환원제를 첨가하여 생성물의 산화를 억제하며, 환원제로서, NAD(P)H, L-아스코빅산, 글루타티온(glutathione), 다이타이오트레이톨(dithiothreitol), 시스테인(cysteine) 등을 사용할 수 있다. 첨가한 환원제의 농도는 초기 기질 농도의 약 10 내지 약 100 배가 바람직하다. 반응액에는 pH 완충작용을 위해 인산칼륨 완충액이 포함되며, 인산칼륨의 농도는 약 50 내지 약 400 mM가 바람직하다. 반응 온도는 약 18 내지 약 37 ℃ 가 바람직하며, 약 25 내지 약 30 ℃ 가 더 바람직하다. 반응액의 pH는 약 5 내지 약 10이 바람직하며, 약 6 내지 약 9 가 더 바람직하고, 약 7 내지 약 8이 더욱 바람직하다. 반응기의 교반 속도는 약 50 내지 약 400 rpm이 바람직하며 약 80 내지 약 250 rpm이 더 바람직하고, 약 100 내지 약 200 rpm이 더욱 바람직하다.
상기 에쿠올 합성 반응기 내 탄소 공급원으로는 글루코오스 및 글리세롤을 사용할 수 있고, 글루코오스 또는 글리세롤의 농도는 약 1 내지 약 5 (w/v)%가 바람직하고, 약 1.5 내지 약 4 (w/v)%가 더 바람직하며, 약 2 내지 약 3 (w/v)%가 더욱 바람직하다. 본 발명의 재조합 미생물의 농도는 광학 밀도(Optical Density, 이하 O.D.) 약 1 내지 100 이 바람직하며, 약 5 내지 약 50이 더 바람직하고, 약 10 내지 약 30이 더욱 바람직하다.
상기 에쿠올 합성 반응계의 기질로는 합성하고자 하는 이소플라반(isoflavan) 또는 이소플라빈(isoflavene)의 종류에 따라 제니스테인(genistein), 글리시틴(glycitein), 다이드제인(daidzein), 오르토-하이드록시-다이드제인(ortho-hydroxy-daidzein), 오르토-하이드록시-제니스테인(ortho-hydroxy-genistein) 등을 사용할 수 있다.
상기 기질의 반응액에 대한 용해도를 향상시키기 위해 폴리에틸렌글리콜(polyethylene glycol), 폴리비닐피롤리돈(polyvinyl pyrrolidone), 폴리비닐알콜(polyvinyl alcohol) 및 베타 사이클로덱스트린(β-cyclodextrin), 메틸 베타 사이클로덱스트린(methyl-β-cyclodextrin), 2-하이드록시프로필 베타 사이클로덱스트린(2-(Hydroxypropyl)-β-cyclodextrin) 등을 이용할 수 있다.
도 1은 초기 다이드제인(daidzein)의 농도에 따른 (S)-에쿠올의 수율을 나타낸 도표이며, 도 1 에 나타난 바와 같이, 초기 다이드제인의 농도가 증가할수록 (S)-에쿠올의 수율(%)은 감소하지만, 생산되는 (S)-에쿠올(mM)은 증가하는 경향을 보인다.
도 2 는 다이드제인 및 제니스테인으로부터 다이드제인 환원효소(daidzein reductase: DZNR), 다이하이드로다이드제인 라세미화효소(dihydrodaidzein racemase: DDRC), 다이하이드로다이드제인 환원효소(dihydrodaidzein reductase: DHDR), 테트라하이드로다이드제인 환원효소(tetrahydrodaidzein reductase: THDR)를 발현하는 재조합 대장균을 이용한 에쿠올, 디하이드로에쿠올, 5-하이드록시-에쿠올 및 5-하이드록시-디하이드로에쿠올 합성 반응의 도식도이다.
상기 도 2 에 나타난 바와 같이, 다이드제인(daidzein)은 다이드제인 환원효소(DZNR)에 의해 (R)-다이하이드로다이드제인으로 전환되고, 이는 다이하이드로다이드제인 라세미화효소(DDRC)에 의해 (S)-다이하이드로다이드제인으로 전환된다. (S)-다이하이드로다이드제인 은 다이하이드로다이드제인 환원효소(DHDR)에 의해 (3S,4R)-트랜스-테트라하이드로다이드제인으로 전환되고, 이는 테트라하이드로다이드제인 환원효소(THDR)에 의해 에쿠올로 전환되거나, 탈수에 의해 디하이드로에쿠올로 전환된다.
또한, 상기 도 2 에 나타난 바와 같이, 제니스테인(genistein)은 다이드제인 환원효소(DZNR)에 의해 (R)-다이하이드로제니스테인으로 전환되고, 이는 다이하이드로다이드제인 라세미화효소(DDRC)에 의해 (S)-다이하이드로제니스테인으로 전환된다. (S)-다이하이드로제니스테인은 다이하이드로다이드제인 환원효소(DHDR)에 의해 (3S,4R)-트랜스-테트라하이드로제니스테인으로 전환되고, 이는 테트라하이드로다이드제인 환원효소(THDR)에 의해 5-하이드록시-에쿠올로 전환되거나, 탈수에 의해 5-하이드록시-디하이드로에쿠올로 전환된다.
본 발명은 다이드제인 환원효소(daidzein reductase), 다이하이드로다이드제인 라세미화효소(dihydrodaidzein racemase), 다이하이드로다이드제인 환원효소(dihydrodaidzein reductase) 및 테트라하이드로다이드제인 환원효소(tetrahydrodaidzein reductase)를 발현하고, 상기 4 개의 효소 중 테트라하이드로다이드제인 환원효소(tetrahydrodaidzein reductase)가 나머지 3 개의 효소에 비해 5 배 이상 과발현된 재조합 대장균을 이용하여 기질인 제니스테인으로부터 5-하이드록시-에쿠올을 선택적으로 합성하는 방법에 관한 것이다.
구체적으로, 테트라하이드로다이드제인 환원효소가 나머지 3 개의 효소에 비해 5 배 이상, 바람직하게는 10 배 이상 과발현된 재조합 대장균을 이용하면 5-하이드록시-에쿠올을 선택적으로 합성할 수 있다.
이는, 도 2 에 나타난 바와 같이, 테트라하이드로다이드제인 환원효소의 발현량을 증가시키면, 테트라하이드로제니스테인으로부터 5-하이드록시-에쿠올을 합성하는 속도가 증가되어, 5-하이드록시-디하이드로에쿠올의 생성이 경쟁적으로 저해되기 때문이다.
상기 재조합 대장균의 발현 방법 및 이를 이용한 5-하이드록시-에쿠올 합성 방법은, 상기 서술한, 슬래키아 이소플라보니컨버턴스 유래 효소 4 개를 모두 발현하는 재조합 대장균의 제조 방법 및 이를 이용한 에쿠올 합성 방법과 동일하다.
도 6 은 도 2 및 도 4에서 언급한 재조합 대장균의 세포 추출물에서 단백질의 양을 SDS-PAGE로 나타낸 것이며, 4개 효소의 발현량에 있어서, 4개의 재조합 효소를 하나의 대장균에서 발현했을 때보다, 다이드제인 환원효소와 다이하이드로다이드제인 라세미화효소를 하나의 벡터로 발현하는 재조합 대장균 및 다이하이드로다이드제인 환원효소와 테트라하이드로다이드제인 환원효소를 하나의 벡터로 발현하는 재조합 대장균에서 효소의 발현량이 증가하였다. 도 6에서 1: DDDT는 도2에서 언급한 4개의 재조합 효소를 하나의 대장균에서 발현했을 때의 경우이며, 2: DD는 도4에서 다이드제인 환원효소와 다이하이드로다이드제인 라세미화효소를 하나의 벡터로 발현하는 재조합 대장균의 세포 추출물에 해당하고, 3: DT는 도4에서 다이하이드로다이드제인 환원효소와 테트라하이드로다이드제인 환원효소를 하나의 벡터로 발현하는 재조합 대장균의 세포 추출물에 해당한다.
도 5는 반응 시간에 따른 제니스테인, 다이하이드로제니스테인 (dihydrogenistein), 5-하이드록시-에쿠올의 반응계 내 농도 (μM)를 나타내며, 테트라하이드로다이드제인 환원효소의 발현량이 나머지 3 개의 효소에 비해 5배 이상 증가한 재조합 대장균을 발현한 시스템(도 6 의 2 및 3)을 이용하면, 4 개의 효소를 모두 발현한 재조합 대장균에 관한 도 2 에 비해 5-하이드록시-에쿠올의 수율 및 생산성과 5-하이드록시-디하이드로에쿠올 대비 5-하이드록시-에쿠올에 대한 선택성이 증대될 수 있음을 나타낸다.
또한, 본 발명은 다이드제인 환원효소(daidzein reductase) 및 다이하이드로다이드제인 라세미화효소(dihydrodaidzein racemase)를 발현하는 재조합 대장균 1 과 테트라하이드로다이드제인 환원효소(tetrahydrodaidzein reductase) 및 테트라하이드로다이드제인 환원효소(tetrahydrodaidzein reductase)를 발현하는 재조합 대장균 2 를 이용하여 기질인 제니스테인으로부터 5-하이드록시-에쿠올을 선택적으로 합성하는 방법에 관한 것이다.
상기 재조합 대장균 1 및 2 를 전세포 촉매로 혼합하는 생전환 반응계에 의해 제니스테인으로부터 5-하이드록시-에쿠올을 선택적으로 합성할 수 있다.
본 발명의 재조합 대장균 1 및 2 의 발현 방법 및 이를 이용한 5-하이드록시-에쿠올 합성 방법은, 상기 서술한, 슬래키아 이소플라보니컨버턴스 유래 효소 4 개를 모두 발현하는 재조합 효소의 발현 방법 및 이를 이용한 에쿠올 합성 방법과 동일하다.
상기 재조합 대장균 1 및 2 의 혼합 반응계는 5-하이드록시-에쿠올의 선택적 생산뿐만 아니라 에쿠올, 6-메톡시-에쿠올(6-Methoxy-equol) 및 다양한 하이드록시-에쿠올(Hydroxy-equol) 등의 생산에 적용할 수 있다.
도 4 는 다이드제인 환원효소(daidzein reductase: DZNR), 다이하이드로다이드제인 라세미화효소(dihydrodaidzein racemase: DDRC)를 하나의 벡터로 발현하는 재조합 대장균과 다이하이드로다이드제인 환원효소(dihydrodaidzein reductase: DHDR), 테트라하이드로다이드제인 환원효소(tetrahydrodaidzein reductase: THDR)를 하나의 벡터로 발현하는 다른 재조합 대장균으로 반응이 구획화된 전세포 반응계를 나타낸다.
상기 도 4 에 의하면, 상기 재조합 대장균 1 에 의해 제니스테인이 (S)-다이하이드로제니스테인으로 전환되고, (S)-다이하이드로제니스테인은 상기 재조합 대장균 2 에 의해 5-하이드록시-(S)-에쿠올로 전환되므로, 재조합 대장균 1 및 2 에 의해 제니스테인으로부터 5-하이드록시-에쿠올을 선택적으로 합성할 수 있음을 나타낸다.
상이한 재조합 대장균으로 반응이 구획화된 전세포 반응계는 5-하이드록시-(S)-에쿠올의 생산성 및 최종 수율이 향상되는 점에서 유리하고, 부산물인 5-하이드록시-디하이드로에쿠올의 생성을 줄임으로써 5-하이드록시-(S)-에쿠올에 대한 선택성이 증가하는 점에서 우수하다.
상기 5-하이드록시-에쿠올을 선택적으로 합성하는 방법은 5-하이드록시-(S)-에쿠올을 선택적으로 합성할 수 있다.
구체적으로, 테트라하이드로다이드제인 환원효소(tetrahydrodaidzein reductase)가 5 배 이상 과발현된 재조합 대장균, 또는 상기 재조합 대장균 1 및 2 를 이용하여 5-하이드록시-(S)-에쿠올을 선택적으로 합성할 수 있다.
이와 관련하여, 도 7은 상기 재조합 대장균을 이용하여 합성한 5-하이드록시-에쿠올의 광학 구조를 알기 위해 210~320 nm 파장 범위에서 원이색성 분산계를 이용하여 타원율을 측정한 도표이고, 본 발명의 재조합 대장균에 의해 생합성된 5-하이드록시-에쿠올은 3번 탄소에서 S-형태를 가짐을 확인할 수 있다.
나아가, 본 발명은 다이드제인 환원효소(daidzein reductase), 다이하이드로다이드제인 라세미화효소(dihydrodaidzein racemase) 및 다이하이드로다이드제인 환원효소(dihydrodaidzein reductase)를 발현하고, 테트라하이드로다이드제인 환원효소(tetrahydrodaidzein reductase)를 발현하지 않는 재조합 대장균을 이용하여 기질인 다이드제인으로부터 디하이드로에쿠올을 선택적으로 합성하는 방법에 관한 것이다.
구체적으로, 상기 재조합 대장균을 전세포 촉매로 이용하여 다이드제인으로부터 디하이드로에쿠올을 선택적으로 합성할 수 있다,
상기 디하이드로에쿠올을 합성하는 반응액에 붕산을 첨가하면, (3S,4R)-트랜스-테트라하이드로다이드제인의 탈수 반응을 촉진하므로, 디하이드로에쿠올을 높은 수율로 합성할 수 있다. 첨가되는 붕산의 양은 약 50 mM 내지 약 200 mM 이 바람직하다.
또한, 본 발명은 다이드제인 환원효소(daidzein reductase), 다이하이드로다이드제인 라세미화효소(dihydrodaidzein racemase) 및 다이하이드로다이드제인 환원효소(dihydrodaidzein reductase)를 발현하고, 테트라하이드로다이드제인 환원효소(tetrahydrodaidzein reductase)를 발현하지 않는 재조합 대장균을 이용하여 기질인 제니스테인으로부터 5-하이드록시-디하이드로에쿠올을 선택적으로 합성하는 방법에 관한 것이다.
구체적으로, 상기 재조합 대장균을 전세포 촉매로 이용하여 제니스테인으로부터 5-하이드록시-디하이드로에쿠올을 선택적으로 합성할 수 있다.
상기 발명의 재조합 대장균의 발현 방법 및 이를 이용한 디하이드로에쿠올 또는 5-하이드록시-디하이드로에쿠올 합성 방법은, 상기 서술한, 슬래키아 이소플라보니컨버턴스 유래 효소 4 개를 모두 발현하는 재조합 효소의 발현 방법 및 이를 이용한 에쿠올 합성 방법과 동일하다.
도 8은 다이드제인 환원효소(daidzein reductase, DZNR), 다이하이드로다이드제인 환원효소(dihydrodaidzein reductase, DHDR)를 발현하는 재조합 대장균(DZNR+DHDR)과 다이드제인 환원효소(daidzein reductase, DZNR), 다이하이드로다이드제인 라세미화효소(dihydrodaidzein racemase, DDRC), 다이하이드로다이드제인 환원효소(dihydrodaidzein reductase, DHDR)를 발현하는 재조합 대장균(DZNR+DRDR+DHDR)를 이용하여 다이드제인에 대하여 전세포 반응을 했을 때, 반응 시간에 따른 디하이드로에쿠올의 반응계 내의 농도를 나타낸 도표이다. 도 8에 나타난 바와 같이, 상기 재조합 대장균을 이용하여 다이드제인으로부터 디하이드로에쿠올을 에쿠올 생성없이 선택적으로 합성할 수 있으며, 3 개의 효소를 발현하는 재조합 대장균(DZNR+DRDR+DHDR)을 이용하였을 경우, 2 개의 효소를 발현하는 재조합 대장균(DZNR+DHDR)보다 생성되는 디하이드로에쿠올의 농도가 높다.
도 9은 다이드제인 환원효소, 다이하이드로다이드제인 라세미화효소, 다이하이드로다이드제인 환원효소를 발현하는 재조합 대장균을 이용하여 제니스테인에 대하여 전세포 반응을 했을 때, 초기 제니스테인의 농도에 따른 기질 전환율 및 5-하이드록시-디하이드로에쿠올의 수율을 나타낸 도표이며, 도 9에 나타난 바와 같이, 상기 재조합 대장균을 이용하여 제니스테인으로부터 5-하이드록시-디하이드로에쿠올을 선택적으로 합성할 수 있다.
본 발명의 재조합 대장균은 전세포 촉매로 이용될 수 있다. 전세포 촉매는 많은 생촉매 반응에 이용되고 있으며, 상온 상압의 온화한 조건에서 반응을 진행시키고, 반응특이성이 우수하다는 장점이 있다. 조효소가 꼭 필요하거나 여러 단계의 반응을 수반하는 공정 혹은 정제 시 효소의 활성이 현저히 감소하는 경우 등에서는 전세포를 이용하여 생촉매 공정을 수행하는 것이 더 유리하다. 또한, 반응 종료 후 생성물의 정제 시에도 전세포로 이용된 재조합 대장균을 원심분리기를 이용하여 선택적으로 분리할 수 있기 때문에 유리하다.
상기 합성된 에쿠올, 디하이드로에쿠올, 5-하이드록시-에쿠올 또는 5-하이드록시-디하이드로에쿠올 합성 방법은 호기성 조건에서 진행될 수 있으므로, 혐기성 조건에서 에쿠올을 합성하는 종래 기술에 비하여 온화한 조건에서 에쿠올을 합성할 수 있다. 따라서, 본 발명의 합성 방법은 종래 기술에서 혐기성 조건을 제공하기 위한 사용한 장치나 기술이 필요하지 않다.
상기 합성된 에쿠올, 디하이드로에쿠올, 5-하이드록시-에쿠올 또는 5-하이드록시-디하이드로에쿠올 합성 방법은 약 0.2 내지 약 5 mmol/L 의 기질을 사용할 수 있다.
기질인 다이드제인 또는 제니스테인의 농도가 0.2 mmol/L 미만일 경우에는 합성되는 에쿠올, 디하이드로에쿠올, 5-하이드록시-에쿠올 및 5-하이드록시-디하이드로에쿠올의 양이 충분하지 않거나 정제 비용도 높아질 수 있으며, 5 mmol/L 를 초과할 경우에는 기질의 전환율이 감소하여 추가 정제 비용이 발생할 수 있다.
바람직하게는, 기질의 농도가 약 0.2 내지 1 mmol/L 이고, 보다 바람직하게는, 기질의 농도가 약 0.8 내지 약 1 mmol/L 이다.
다만, 반응계에 수용성 고분자를 추가로 포함한 경우에는, 기질의 농도가 1 mmol/L 를 초과하여도 에쿠올, 디하이드로에쿠올, 5-하이드록시-에쿠올 또는 5-하이드록시-디하이드로에쿠올을 높은 수율로 합성할 수 있으므로, 기질의 농도는 약 3 내지 5 mmol/L 가 바람직하다.
상기 에쿠올 또는 디하이드로에쿠올 합성 방법은 다이드제인의 전환율이 95 % 이상이고, 상기 5-하이드록시-에쿠올 또는 5-하이드록시-디하이드로에쿠올 합성 방법은 제니스테인의 전환율이 95 % 이상이다.
상기 전환율은 (감소한 기질의 농도/초기 기질의 농도) X 100(%) 를 나타낸다.
또한, 본 발명의 합성 방법은 기질의 농도가 0.6 mmol/L 이상에서도 기질의 전환율이 95 % 이상일 수 있다.
도 3 및 도 5 는 반응 시간에 따른 제니스테인(genistein, GSN), 다이하이드로제니스테인(dihydrogenistein, DHG), 5-하이드록시-에쿠올(5OH-EQ)의 반응계 내 농도 (μM)를 나타내며, 반응시간 10 시간만에 기질의 전환율은 95 % 이상임이 나타나 있다.
상기 에쿠올, 디하이드로에쿠올, 5-하이드록시-에쿠올 또는 5-하이드록시-디하이드로에쿠올 합성 방법은 반응계에 수용성 고분자를 추가로 포함할 수 있다. 또한, 상기 수용성 고분자는 식품첨가용 수용성 고분자를 사용할 수 있다.
수용성 고분자로서, 예를 들어, 폴리에틸렌글리콜(polyethylene glycol), 폴리비닐피롤리돈(polyvinyl pyrrolidone), 폴리비닐알콜(polyvinyl alcohol) 및 베타 사이클로덱스트린(β-cyclodextrin), 메틸 베타 사이클로덱스트린(methyl-β-cyclodextrin), 2-하이드록시프로필 베타 사이클로덱스트린(2-(Hydroxypropyl)-β-cyclodextrin) 등을 이용할 수 있다. 바람직하게는, 폴리에틸렌글리콜, 폴리비닐알콜 또는 폴리비닐피롤리돈을 이용할 수 있다.
반응계에 수용성 고분자를 추가로 포함함으로써, 반응계 내 기질의 용해도가 증가하므로, 제조되는 에쿠올, 디하이드로에쿠올, 5-하이드록시-에쿠올 또는 5-하이드록시-디하이드로에쿠올의 최종 수율이 증가될 수 있다.
도 11 은 실시예 1 의 반응액에, 수용성 고분자인 폴리에틸렌글리콜 또는 폴리비닐피롤리돈을 추가로 첨가한 반응액에서의 (S)-에쿠올의 반응계 내 농도를 시간에 따라 나타낸 도표이다. 도 11 에 나타난 바와 같이, 반응액에 폴리에틸렌글리콜(PEG) 또는 폴리비닐피롤리돈(PVP) 를 추가로 포함한 경우에는 5 mmol/L 의 기질을 사용하여도 에쿠올을 높은 수율로 합성할 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 언급한 본 발명의 합성 방법으로 제조되는 에쿠올, 디하이드로에쿠올, 5-하이드록시-에쿠올 또는 5-하이드록시-디하이드로에쿠올에 관한 것이다.
특히, 본 발명의 합성 방법으로 제조되는 5-하이드록시-디하이드로에쿠올은 종래 알려지지 않은 신규한 화합물로서, 하기 화학식으로 나타낼 수 있다.
Figure 112018016077970-pat00012
본 발명은 호기성 조건에서 기질의 높은 전환율로 (S)-에쿠올을 합성할 수 있고, 합성된 에쿠올은 에스트로겐과 유사한 분자 구조를 가지므로 유방암 유발과 같은 종래의 갱년기증상 치료제의 부작용없이 여성의 갱년기 증상, 특히 골다공증의 발병 및 증상을 완화시킬 수 있고, 심혈관계 질환을 예방하며 전립선암을 완화시킬 수 있다.
또한, 본 발명에서 합성된 디하이드로에쿠올은 전립선암, 난소암 치료를 위한 항암제로 쓰일 수 있다.
또한, 본 발명은 5-하이드록시-에쿠올, 디하이드로에쿠올 및 5-하이드록시-디하이드로에쿠올의 선택적 합성을 호기성 조건에서 수 시간 단위로 수행 가능하므로, 생산 비용 절감 및 생산물로 인한 고부가가치 획득이 가능하며, 효율적인 대량생산을 통해 식품, 의약품 등의 다양한 응용처에 활용이 가능하다.
또한, 본 발명의 재조합 대장균을 전세포 촉매로 이용하는 반응계에 추가적인 산화환원효소를 적용할 경우, 다양한 하이드록시-이소플라보노이드를 합성할 수 있어 연구적으로 가치가 높다.
구체적으로, 산화환원효소로서 티로시나아제, 사이토크롬 P450 또는 플라빈 모노옥시게나아제 등을 사용할 수 있으며, 3'-하이드록시-에쿠올, 6-하이드록시-에쿠올, 8-하이드록시-에쿠올, 6,3'-다이하이드록시-에쿠올과 같은 하이드록시-이소플라보노이드를 합성할 수 있다.
또한, 본 발명에 의해 합성된 5-하이드록시-에쿠올 또는 5-하이드록시-디하이드로에쿠올은 갱년기 질환 예방 및 치료에 사용될 수 있으며, 전립선암, 난소암 치료를 위한 항암제로 쓰일 수 있다. 또한, 화장품 또는 식품첨가물 형태로 항산화제로 사용될 수 있다.
이하, 본 발명의 구체적인 방법을 실시예로서 상세히 설명하나, 본 발명의 기술적 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
재조합 대장균의 제조 방법
다이드제인 환원효소(daidzein reductase: DZNR), 다이하이드로다이드제인 라세미화효소(dihydrodaidzein racemase: DDRC), 다이하이드로다이드제인 환원효소(dihydrodaidzein reductase: DHDR), 테트라하이드로다이드제인 환원효소(tetrahydrodaidzein reductase: THDR)에 해당하는 DNA서열을 PCR을 통해 증폭 시킨 후, pRSFDuet 또는 pCDFDuet 벡터에 각각 넣고 이를 E. coli에서 his-tag(6 histidine)과 같이 발현하였다.
구체적으로, 상기 효소의 염기 서열이 삽입된 plasmid를 BL21 competent cell에 형질전환 후 각각 plasmid에 맞는 항생제를 포함한 LB고체 배지에서 37°C 배양기에서 12시간 배양하였다. 하나의 콜로니를 항생제를 포함한 3 mL LB 액체 배지에 접종하고 12 시간 동안 37°C 배양기에서 200 rpm 속도로 배양하였다. 이 배양액의 2 v%(1mL)를 50 mL의 항생제를 포함한 새로운 LB 액체 배지에 접종하였다. 배양액의 O.D. (600nm)가 0.6~0.8에 도달하면, 0.1 mM IPTG와 0.1 mM MnSO4를 넣고 18°C 배양기에서 200 rpm으로 18시간 단백질 발현을 유도 하였다. 18시간 후 세포는 4000 rpm 으로 원심 분리 하고, 25 mL PBS로 세척하여 준비하였다.
본 발명의 재조합 대장균을 이용한 전세포 반응계에서의 에쿠올의 생산 방법 (반응법 1)
반응기로 10~1000 ml 유리 초자를 이용하며, 반응기에 하기한 농도의 재조합 대장균 및 기질을 공급한다.
반응에는 환원제로서 L-아스코르빅산을 초기 기질 농도 10배로 첨가하고, 반응액에는 pH 완충작용을 위해 농도 200 mmol/L의 인산칼륨 완충액이 포함되며, 반응 온도는 30℃ 이다. 반응액의 pH는 8이고, 반응기의 교반 속도는 150 rpm이다. 본 발명의 반응기 내 탄소 공급원으로는 글루코오스 또는 글리세롤을 이용했으며, 글루코오스 또는 글리세롤의 농도는 2(w/v)%이며, 재조합 미생물의 농도는 O.D. 10 또는 O.D. 20이다.
[실시예]
[실시예 1]: 에쿠올 변환에 관여하는 4 개의 효소를 모두 발현하는 재조합 대장균을 이용하여 다이드제인으로부터 (S)-에쿠올 합성.
0.2 ~ 5 mM 의 다이드제인을 O.D. 10의 상기 4 개 효소를 발현하는 재조합 대장균을 이용하여 반응법 1과 같이 반응을 진행하였다. 기질, 중간체, 생성물은 4 배수 이상의 에틸 아세테이트(ethyl acetate, 이하 EA)로 추출하였고, 원심감압기를 이용해 용매를 제거한 후, 일정량의 메탄올을 재용해하여 고성능-액체크로마토그래피로 물질의 반응성과 농도를 확인하였다. 도 1 에 나타난 (S)-에쿠올 수율과 같이 0.2 mM에서는 95% 이상, 0.4, 0.6 mM에서는 80% 이상, 2 mM에서는 50% 이상, 5 mM에서는 20% 이상의 수율을 확인할 수 있었다.
[실시예 2]: 에쿠올 변환에 관여하는 4개의 효소를 모두 발현하는 재조합 대장균을 이용하여 제니스테인으로부터 5-하이드록시-에쿠올 또는 5-하이드록시-디하이드로에쿠올 합성.
500 μM 의 제니스테인 (도 2. genistein)을 O.D. 10의 상기 4 개의 효소를 발현하는 재조합 대장균을 이용하여 반응법 1과 같이 반응을 진행하였다. 기질, 중간체, 생성물은 4 배수 이상의 에틸 아세테이트(EA)로 추출하였고, 원심감압기를 이용해 용매를 제거한 후, 일정량의 메탄올에 재용해하여 고성능-액체크로마토그래피로 물질의 반응성과 농도를 확인하였다. 반응 6시간에 500 μM의 제니스테인은 99% 이상 전환되었으며, 5-하이드록시-에쿠올 97 mg/L, 5-하이드록시-디하이드로에쿠올 22mg/L이 생성됨을 확인하였다.
위와 같은 조성을 통해 1 mM 의 제니스테인을 반응법 1을 통한 반응을 진행하였으며, 도 3에서 확인할 수 있듯이 반응시간 10시간 만에 기질의 전환율은 95% 이상, 5-하이드록시-에쿠올 199 mg/L, 5-하이드록시-디하이드로에쿠올 63 mg/L를 생산할 수 있었다.
[실시예 3]: 구획화된 반응계를 이용한 5-하이드록시-에쿠올의 선택적 합성
도 4의 모식도와 같이 다이드제인 환원효소와 다이하이드로다이드제인 라세미화 효소를 발현하는 재조합 대장균 1 과 다이하이드로다이드제인 환원효소 및 테트라하이드로다이드제인 환원효소를 발현하는 재조합 대장균 2 를 전세포 촉매로 혼합하는 생전환 반응계를 구축하였다. 1 mM 의 제니스테인을 반응법 1을 따라 반응을 진행하였을 때, 도 5와 같이 반응시간에 따른 기질, 생성물의 농도를 액체크로마토그래피로 확인하였다. 본 반응계는 반응시간 6시간 만에 기질의 전환율은 99% 이상, 5-하이드록시-에쿠올 231 mg/L, 5-하이드록시-디하이드로에쿠올 12 mg/L를 생산하였다. 생산 결과를 실시예 1의 결과와 비교했을 때, 5-하이드록시-에쿠올의 생산성은 1.6배 증가하였으며, 5-하이드록시에쿠올 농도/5-하이드록시-디하이드로에쿠올의 농도로 정의되는 5-하이드록시-에쿠올에 대한 선택성은 5배 증가하였다.
또한, 4 개 효소의 발현량을 비교하기 위하여 실시예 2 에서의 재조합 대장균 및 실시예 3 에서의 재조합 대장균 1 및 2 의 세포 추출물을 초음파 처리로 파쇄하여 준비하고, 세포 추출물은 30분 동안 13000 rpm으로 4°C에서 원심 분리한 후, 상등액을 얻어 도 6와 같이 SDS-PAGE로 분석하였다.
분석 결과, 4개 효소의 발현량에 있어서 실시예 2에서 사용한 대장균보다 실시예 3에서 사용한 두 재조합 대장균에서 모두 증가하였다. 그 중, 테트라하이드로다이드제인 환원효소의 발현량이 두드러지게 증가하였으며, 실시예 1의 대장균 파쇄액 대비 20배 이상 증가하고, 나머지 3 개 효소의 발현량에 비해 5 배 이상 과발현되었다.
[실시예 4]: 5-하이드록시-에쿠올의 광학 이성질체 분석
본 발명의 재조합 대장균으로 합성한 5-하이드록시-에쿠올의 광학 구조를 결정하기 위해 원이색성 분산 스펙트럼 분석을 진행하였다. 측정 파장 범위는 210~320 nm였고, 원이색성 분산계 ChirascanTM plus CD spectrometer (Applied Photophysics, UK)를 이용하였다. 시료를 1.5 mg/ml의 농도로 순수한 메탄올에 녹인 후, 측정하였다.
측정 결과는 도 7에 그래프로 나타내었으며, 238 nm에서 높은 크기의 음성 코튼(cotton) 효과를 나타냈으며 270 nm에서 높은 크기의 양성 코튼 효과를 나타냈다. 따라서 본 발명의 재조합 대장균에 의해 생합성된 5-하이드록시 에쿠올은 3번 탄소에서 S-형태를 가짐을 확인할 수 있었다.
[실시예 5]: 디하이드로에쿠올 의 선택적 합성
디하이드로에쿠올을 생합성하기 위해서 실시예 1의 재조합 대장균에서 테트라하이드로다이드제인 환원효소가 결손되고, 다이하이드로다이드제인 라세미화효소를 포함하거나(DZNR+DDRC+DHDR, 이하 DDD 균주) 포함하지 않는 재조합 대장균(DZNR+DHDR, 이하 DD 균주)을 제작하였다. 상기한 대장균을 이용하여 반응법 1을 따라 다이드제인을 기질로 하는 반응을 진행하였으며, 추가적으로 반응액에 붕산 200 mM 를 첨가하였다. 그 결과, 에쿠올 생성 없이 디하이드로에쿠올만 생성되는 것을 확인하였으며(도 8), 구체적으로, 초기 다이드제인의 농도를 0.5 mM 로 생전환 반응을 시작하여 2 시간 반응하였을 때, DD 균주에서는 28 μM, DDD 균주에서는 60 μM의 디하이드로에쿠올이 합성되었다.
[실시예 6]: 5-하이드록시-디하이드로에쿠올의 선택적 합성
5-하이드록시-디하이드로에쿠올을 생합성하기 위해서 실시예 2의 재조합 대장균에서 테트라하이드로다이드제인 환원효소가 플라스미드에서 결손된 재조합 대장균을 제작하였다. 상기한 대장균을 이용하여 반응법 1을 따라 제니스테인을 기질로 하는 반응을 진행하였으며, 5-하이드록시-에쿠올 생성 없이 5-하이드록시-디하이드로에쿠올만 생성되는 것을 확인하였다(도 9). 초기 제니스테인의 농도를 0.2, 0.4, 0.6, 1.0 mM 로 생전환 반응을 시작하여 36 시간 반응하였을 때, 제니스테인의 전환율은 0.6 mM 이하에서는 99% 이상이었고, 1.0 mM 에서는 97%였다. 5-하이드록시-디하이드로에쿠올의 전환 수율은 각각 44, 35, 27, 39%였다.
[실시예 7]: 5-하이드록시-에쿠올 및 5-하이드록시-디하이드로에쿠올의 질량 분석
실시예 3와 6에서 합성한 5-하이드록시-에쿠올 및 5-하이드록시-디하이드로에쿠올을 가스크로마토그래피-질량분석기(GC-MS)를 통해 동정하였으며, 그 결과는 도 10에 명시하였다.
상기 재조합 미생물로 합성한 5-하이드록시-에쿠올 및 5-하이드록시-디하이드로-에쿠올을 EI-MS로 분석하였다. EI-MS는 Thermo 사의 TRACE GC Ultra gas chromatograph/ITQ1100 를 이용하였다. 양성모드에서 무극성 캐필러리 컬럼 (TR-5 ms)을 이용하였으며, 헬륨 가스 유속은 1 ml/min로 하였고, inlet, mass transfer line, ion source 온도는 각각 250, 275, 230°C로 하였다. 가스 크로마토그래프의 오븐 온도는 65°C에서 5분간 유지된 후, 3°C/min의 속도로 250°C까지 증가한다. 이온화 전압은 70 eV였으며, 측정 질량 범위는 50~600 amu였다.
EI-MS 분석 결과는 이전에 보고 된 DHD의 스펙트럼과 동일한 것으로 나타났다(Chang, Y. C., and M. G. Nair. J. Natr. Proc. 58:1892-1896, 1995; Wahala, K., A. Salakka, and H. Adlercreutz. Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 217:293-29, 1998). 합성된 화합물의 EI-MS는 예상한 바와 같이 m/z 256에서 C15H12O4 (DHD)와 일치하는 [M+H] +의 분자 이온 피크를 나타냈다. 합성된 화합물의 다른 이온 피크는 137(100), 120(52), 91(36), 65(16)이였다.
[실시예 8]: 수용성 고분자를 추가로 포함한 반응계에서 에쿠올의 합성
다이드제인의 반응액에 대한 용해도를 향상시키기 위해 다이메틸설폭사이드(dimethyl sulfoxide, 이하 DMSO)를 포함하고, 폴리에틸렌글리콜(PEG) 또는 폴리비닐피롤리돈(PVP)를 추가로 포함한 점 이외에는, 실시예 1 과 동일하게 반응을 진행하였다
구체적으로, 다이드제인 5 mM 에서의 에쿠올 수율을 증가시키기 위해 수용성 고분자 PEG 또는 PVP 5% (w/v)를 추가로 포함하는 반응기에서 반응을 진행하였으며, PVP를 첨가한 반응의 경우, 반응시간 12시간만에 5 mM의 에쿠올이 합성되었으며(수율 99% 이상, 1.16 g/L), PEG을 첨가한 반응의 경우, 반응시간 24시간만에 3.7 mM의 에쿠올이 합성되었다(수율 74% 이상, 0.9 g/L).
상기 실시예 1 및 2 에 따르면, 슬래키아 이소플라보니컨버턴스 유래의 효소 4 개를 발현하는 재조합 대장균에 의해, 호기성 조건에서 수 시간내에 높은 수율로 다이드제인으로부터 (S)-에쿠올을 합성하거나, 제니스테인으로부터 5-하이드록시-에쿠올 및 5-하이드록시-디하이드로에쿠올을 합성할 수 있었다.
상기 실시예 3, 5 및 6 에서는, 효소 4 개의 효소 중 2 개 또는 3 개의 효소를 조합한 재조합 대장균을 이용하여 5-하이드록시-에쿠올, 디하이드로에쿠올 또는 5-하이드록시-디하이드로에쿠올을 각각 선택적으로 합성할 수 있었다.
또한, 상기 실시예 4 및 7 을 통해서, 실시예 2, 3 및 6 에 따른 재조합 대장균이 5-하이드록시-(S)-에쿠올 또는 5-하이드록시-디하이드로에쿠올을 합성하는 것을 확인할 수 있었다.
또한, 상기 실시예 8 에서는, 반응계에 수용성 고분자를 추가로 포함함으로써, 수용성 고분자를 포함하지 않은 반응계(실시예 1)에 비하여 에쿠올의 수율이 우수함을 확인할 수 있었다.

Claims (16)

  1. 삭제
  2. 다이드제인 환원효소(daidzein reductase), 다이하이드로다이드제인 라세미화효소(dihydrodaidzein racemase), 다이하이드로다이드제인 환원효소(dihydrodaidzein reductase) 및 테트라하이드로다이드제인 환원효소(tetrahydrodaidzein reductase)를 발현하는 재조합 대장균을 이용하여 기질인 다이드제인으로부터 에쿠올을 합성하는 방법으로서,
    반응계에 수용성 고분자를 추가로 포함하고,
    상기 수용성 고분자가 식품첨가용 수용성 고분자로서, 폴리에틸렌글리콜 또는 폴리비닐피롤리돈인 것을 특징으로 하는 방법.
  3. 다이드제인 환원효소(daidzein reductase), 다이하이드로다이드제인 라세미화효소(dihydrodaidzein racemase), 다이하이드로다이드제인 환원효소(dihydrodaidzein reductase) 및 테트라하이드로다이드제인 환원효소(tetrahydrodaidzein reductase)를 발현하는 재조합 대장균을 이용하여 기질인 제니스테인으로부터 5-하이드록시-에쿠올 또는 5-하이드록시-디하이드로에쿠올을 합성하는 방법으로서,
    반응계에 수용성 고분자를 추가로 포함하고,
    상기 수용성 고분자가 식품첨가용 수용성 고분자로서, 폴리에틸렌글리콜 또는 폴리비닐피롤리돈인 것을 특징으로 하는 방법.
  4. 다이드제인 환원효소(daidzein reductase), 다이하이드로다이드제인 라세미화효소(dihydrodaidzein racemase), 다이하이드로다이드제인 환원효소(dihydrodaidzein reductase) 및 테트라하이드로다이드제인 환원효소(tetrahydrodaidzein reductase)를 발현하고, 상기 4 개의 효소 중 테트라하이드로다이드제인 환원효소(tetrahydrodaidzein reductase)를 나머지 3 개의 효소에 비해 5 배 이상 과발현하는 재조합 대장균을 이용하여 기질인 제니스테인으로부터 5-하이드록시-에쿠올을 선택적으로 합성하는 방법.
  5. 다이드제인 환원효소(daidzein reductase) 및 다이하이드로다이드제인 라세미화효소(dihydrodaidzein racemase)를 발현하는 재조합 대장균과 다이하이드로다이드제인 환원효소(dihydrodaidzein reductase) 및 테트라하이드로다이드제인 환원효소(tetrahydrodaidzein reductase)를 발현하는 재조합 대장균를 이용하여 기질인 제니스테인으로부터 5-하이드록시-에쿠올을 선택적으로 합성하는 방법.
  6. 다이드제인 환원효소(daidzein reductase), 다이하이드로다이드제인 라세미화효소(dihydrodaidzein racemase) 및 다이하이드로다이드제인 환원효소(dihydrodaidzein reductase)를 발현하고, 테트라하이드로다이드제인 환원효소(tetrahydrodaidzein reductase)를 발현하지 않는 재조합 대장균을 이용하여 기질인 다이드제인으로부터 디하이드로에쿠올을 선택적으로 합성하는 방법.
  7. 다이드제인 환원효소(daidzein reductase), 다이하이드로다이드제인 라세미화효소(dihydrodaidzein racemase) 및 다이하이드로다이드제인 환원효소(dihydrodaidzein reductase)를 발현하고, 테트라하이드로다이드제인 환원효소(tetrahydrodaidzein reductase)를 발현하지 않는 재조합 대장균을 이용하여 기질인 제니스테인으로부터 5-하이드록시-디하이드로에쿠올을 선택적으로 합성하는 방법.
  8. 제 4 항 또는 제 5 항에 있어서,
    상기 5-하이드록시-에쿠올은 5-하이드록시-(S)-에쿠올인 것을 특징으로 하는 방법.
  9. 제 2 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 재조합 대장균이 전세포 촉매로 이용되는 방법.
  10. 제 2 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항에 있어서,
    호기성 조건에서 진행되는 것을 특징으로 하는 방법.
  11. 제 2 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항에 있어서,
    0.2~1 mmol/L 의 기질을 사용하여 합성하는 방법.
  12. 제 2 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항에 있어서,
    기질의 전환율이 95 % 이상인 것을 특징으로 하는 방법.
  13. 제 4 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항에 있어서,
    반응계에 수용성 고분자를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  14. 제 13 항에 있어서,
    상기 수용성 고분자가 식품첨가용 수용성 고분자로서, 폴리에틸렌글리콜 또는 폴리비닐피롤리돈인 것을 특징으로 하는 방법.
  15. 삭제
  16. 삭제
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