KR101998029B1 - Mic-1 단백질에 특이적으로 결합하는 항체 및 이의 용도 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 MIC-1(macrophage inhibitory cytokine 1) 단백질에 특이적으로 결합하는 항체 및 이의 용도에 관한 것이다.
Description
본 발명은 MIC-1(macrophage inhibitory cytokine 1) 단백질에 특이적으로 결합하는 항체 및 이의 용도에 관한 것으로, 구체적으로 서열번호 1의 중쇄 CDR1, 서열번호 2의 중쇄 CDR2, 및 서열번호 3의 중쇄 CDR3을 포함하는 중쇄 가변영역; 및 서열번호 4의 경쇄 CDR1, 서열번호 5의 경쇄 CDR2, 및 서열번호 6의 경쇄 CDR3을 포함하는 경쇄 가변영역을 포함하는, MIC-1 단백질에 결합하는 항체, 상기 항체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터, 상기 발현 벡터가 도입된 형질전환체, 상기 항체를 포함하는 암의 예방 또는 치료용 약학 조성물, 상기 항체를 이용하는 암의 예방 또는 치료 방법, 상기 항체를 포함하는 암 진단용 조성물, 상기 조성물을 포함하는 암 진단용 키트, 상기 항체를 이용하는 암 진단을 위한 정보의 제공 방법, 및 상기 항체를 이용하는 암의 예방 또는 치료 물질의 스크리닝 방법에 관한 것이다.
유전자재조합 의약품(단백질 의약품), 항체, 백신, 세포 치료제 및 유전자 치료제 등으로 구성된 바이오 의약품은 화학합성 의약품보다 부작용이 적고 특정 질환에 대한 효과가 뛰어나다는 장점을 가지고 있다. 이에, 관련 시장 규모는 급격히 팽창하고 있으며, 특히 치료용 단일클론항체 시장은 연평균 성장률이 15.5% 정도로서 빠른 성장단계에 있다. 또한, 단일클론항체는 기술혁신에 의해 약물의 안정성 및 유효성이 많이 개선되고 있고, 새로운 타겟 분자의 발굴로 적응증(indication)이 확장되고 있으며, 기존 약물이 특정 질환에 대해 저항성을 가져 치료하지 못했던 부분을 보완할 가능성이 높아 시장 규모가 지속적으로 증가할 것으로 예상된다.
이 중에서도, 종양(암)을 치료 대상으로 한 시장은 2007년 기준 52.1%(65.7억 달러)를 차지할 정도로 매출규모가 가장 크며, 연평균 성장률이 약 15%에 이를 정도로 전체 치료용 항체 시장에서 가장 우위를 점하고 있다. 특히, 혈관신생을 억제하여 치료 효과를 나타내는 단일클론항체를 개발하기 위한 연구가 많이 수행되고 있다. 그 예로, Anexelekto에 결합하는 단일클론항체로서 혈관 신생 억제작용 및 항암 작용을 갖는 항체가 개발된바 있고(한국 공개특허공보 제10-2010-0097688호), Genentech 사, Novartis 사 등에서는 각각 항-VEGF 인간화 단일클론항체인 아바스틴(Avastin), 루센티스(Lucentis) 등을 개발한 바 있다. 그러나, 아바스틴은 매우 고가이고 위장관 출혈이라는 부작용을 가지고 있으며, 일반적으로 혈관신생 억제를 타켓으로 한 암 치료제는 효과를 나타내는 암의 종류가 제한적인바, 다양한 종류의 암에 대하여 현저한 치료 및 진단 효과를 갖는 항체의 개발이 여전히 필요한 실정이다.
한편, MIC-1(Macrophage inhibitory cytokine-1) 단백질은 대부분의 조직에서 발현되고 있지만, 조직 손상이나 염증과 같은 병리적인 조건에서는 발현 수준이 급격히 상승한다. 특히, MIC-1 단백질은 유방암, 대장암, 전립선암, 췌장암, 위암 등과 같은 다양한 암에서 과다 발현되고 있으며, 암조직뿐만 아니라 암환자의 혈액에서도 정상인보다 유의성 있게 높은 수준으로 검출됨이 보고되어, 암 진단의 바이오마커로서 관심이 증대되고 있다(Brown DA, Clin. Cancer Res., 2003, 9:2642-50; Koopmann J, Clin. Cancer Res. 2006, 12:442-6).
이러한 배경하에, 본 발명자들은 MIC-1 단백질에 특이적으로 결합하며, 암의 성장 및 발달에 필수적인 혈관신생을 억제하여 다양한 암에 대해 우수한 치료 및 진단 효과를 나타낼 수 있는 항체를 개발하고자 예의 노력연구한 결과, 항-MIC-1 단일클론항체를 개발하였고, 이들은 혈관신생억제 활성을 나타내며, 피부암, 대장암, 유방암, 전립선암 등 다양한 암에 대해 우수한 항암 효과를 나타냄을 확인하여, 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 하나의 목적은 서열번호 1의 중쇄 CDR1, 서열번호 2의 중쇄 CDR2, 및 서열번호 3의 중쇄 CDR3을 포함하는 중쇄 가변영역; 및 서열번호 4의 경쇄 CDR1, 서열번호 5의 경쇄 CDR2, 및 서열번호 6의 경쇄 CDR3을 포함하는 경쇄 가변영역을 포함하는, MIC-1(macrophage inhibitory cytokine 1) 단백질에 결합하는 항체를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 하나의 목적은 상기 항체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 하나의 목적은 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 하나의 목적은 상기 발현 벡터가 도입된 형질전환체를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 하나의 목적은 상기 항체를 포함하는 조성물, 구체적으로 암의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 하나의 목적은 상기 항체를 포함하는 조성물, 구체적으로 혈관신생 억제용 약학 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 하나의 목적은 상기 항체를 인간을 제외한 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 암의 예방 또는 치료 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 하나의 목적은 상기 항체를 포함하는, 암 진단용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 하나의 목적은 상기 조성물을 포함하는, 암 진단용 키트를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 하나의 목적은 상기 항체를 이용하여, 암이 의심되는 개체의 분리된 생물학적 시료에서 MIC-1 단백질을 항원-항체 반응을 통하여 검출하는 단계를 포함하는, 암 진단을 위한 정보의 제공 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 하나의 목적은 (a) 분리된 암세포에 암의 예방 또는 치료 후보물질을 처리하는 단계; (b) 상기 후보물질이 처리된 암세포에서 상기 항체를 이용하여, MIC-1 단백질의 수준을 측정하는 단계; 및 (c) 상기 단계 (b)의 MIC-1 단백질 수준이 후보물질을 처리하지 않은 암세포의 것보다 감소하는 경우, 상기 (a) 단계에서 처리한 후보물질을 암의 예방 또는 치료 물질로 판단하는 단계를 포함하는, 암의 예방 또는 치료 물질의 스크리닝 방법을 제공하는 것이다.
이하에서는, 본 발명을 더욱 상세히 설명한다.
한편, 본원에서 개시되는 각각의 설명 및 실시형태는 각각의 다른 설명 및 실시 형태에도 적용될 수 있다. 즉, 본원에서 개시된 다양한 요소들의 모든 조합이 본 발명의 범주에 속한다. 또한, 하기 기술되는 구체적인 서술에 의하여 본 발명의 범주가 제한된다고 할 수 없다.
또한, 당해 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 통상의 실험만을 사용하여 본 출원에 기재된 본 발명의 특정 양태에 대한 다수의 등가물을 인지하거나 확인할 수 있다. 또한, 이러한 등가물은 본 발명에 포함되는 것으로 의도된다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명의 하나의 양태는 서열번호 1의 중쇄 CDR1, 서열번호 2의 중쇄 CDR2, 및 서열번호 3의 중쇄 CDR3을 포함하는 중쇄 가변영역; 및 서열번호 4의 경쇄 CDR1, 서열번호 5의 경쇄 CDR2, 및 서열번호 6의 경쇄 CDR3을 포함하는 경쇄 가변영역을 포함하는, MIC-1(macrophage inhibitory cytokine 1) 단백질에 결합하는 항체를 제공한다.
본 발명의 용어, "MIC-1(macrophage inhibitory cytokine 1) 단백질"은 GDF-15, PTGF-β, PLAB, PDF, NAG-1, PL74 등으로 명명되는 단백질로서, 조직의 손상이나 질병의 발생 중 염증 및 세포사멸 등을 조절하는 TGF-β 슈퍼패밀리(superfamily)에 속하는 단백질을 의미한다. 조직 손상이나 염증과 같은 병리적인 조건에서는 발현 수준이 급격히 상승하고, 특히 유방암, 대장암, 전립선암, 췌장암, 위암 등과 같은 다양한 암에서 과다 발현되며, 암 조직뿐만 아니라 암환자의 혈액에서도 정상인보다 유의성 있게 높은 수준으로 검출되는 것이 특징이다. 이에 따라, MIC-1 단백질은 암의 진단, 치료 등의 표적이 될 수 있음이 보고되고 있다(Brown DA, Clin. Cancer Res., 2003, 9:2642-50; Koopmann J, Clin. Cancer Res. 2006, 12:442-6). 구체적으로, 상기 MIC-1 단백질은 인간 유래인 것일 수 있으며, 이의 아미노산 서열 등은 NCBI 등의 데이터베이스에 공지되어 있다(Accession number: NP_004855 등).
본 발명에서는, MIC-1 단백질에 특이적으로 결합하는 마우스 항체 및 인간화 항체를 개발하였고, 이들은 MIC-1 단백질에 의해 증가한 혈관신생을 억제할 뿐만 아니라, 피부암, 대장암, 유방암, 전립선암 등 다양한 암세포의 성장 및 발달을 억제할 수 있음을 확인하였다.
본 발명의 용어, "항체"는 면역학적으로 특정 항원과 반응성을 갖는 면역글로불린 분자를 포함하는, 항원을 특이적으로 인식하는 수용체 역할을 하는 단백질 분자를 의미한다. 본 발명의 항체는 다클론항체, 단일클론항체, 전체(whole) 항체 및 항체 단편을 모두 포함하고, 또한 키메라 항체 및 이가(bivalent) 또는 이중특이성 분자(예를 들어, 이중특이성 항체), 디아바디, 트리아바디 및 테트라바디를 포함한다. 아울러, FcRn(neonatal Fc receptor)에 대한 결합 기능을 보유한 단쇄 항체, 스캡, 항체 불변영역의 유도체 및 단백질 스캐폴드에 기초한 인공 항체를 포함한다.
상기 전체 항체는 2개의 전체 길이의 경쇄 및 2개의 전체 길이의 중쇄를 갖는 구조로서, 각각의 경쇄는 중쇄와 이황화 결합(disulfide bond)으로 연결되어 있다. 상기 전체 항체는 IgA, IgD, IgE, IgM 및 IgG를 포함하며, IgG는 아형(subtype)으로, IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4를 포함한다.
상기 항체 단편은 항원결합 기능을 보유하고 있는 단편을 의미하며, Fc, Fd, Fab, Fab', Fv 및 F(ab')2 등을 포함한다. 상기 Fc는 Fc 수용체라 불리는 세포 표면 수용체와 상호작용 하는 항체의 꼬리 부분을 의미한다. 상기 Fd는 Fab 단편에 포함되어 있는 중쇄 부분을 의미하며, F(ab')2는 Fd, Fab, Fab' 및 Fv를 포함하는 단편을 의미한다. 상기 Fab는 경쇄 및 중쇄의 가변영역과 경쇄의 불변 영역 및 중쇄의 첫 번째 불변 영역(CH1 도메인)을 가지는 구조로 1개의 항원 결합 부위를 가진다. Fab'는 중쇄 CH1 도메인의 C 말단에 하나 이상의 시스테인 잔기를 포함하는 힌지 영역(hinge region)을 가진다는 점에서 Fab와 차이가 있다. F(ab')2 항체는 Fab'의 힌지 영역의 시스테인 잔기가 디설파이드 결합을 이루면서 생성된다. Fv(variable fragment)는 중쇄 가변부위 및 경쇄 가변부위만을 가지고 있는 최소의 항체조각을 의미한다. 이중디설파이드Fv(dsFv)는 디설파이드 결합으로 중쇄 가변부위와 경쇄 가변부위가 연결되어 있고 단쇄 Fv(scFv)는 일반적으로 펩타이드 링커를 통하여 중쇄의 가변 영역과 경쇄의 가변 영역이 공유 결합으로 연결되어 있다. 이러한 항체 단편은 단백질 가수분해 효소를 이용해서 얻을 수 있고(예를 들어, 전체 항체를 파파인으로 제한 절단하며 Fab를 얻을 수 있고 펩신으로 절단하면 F(ab')2 단편을 얻을 수 있다), 바람직하게는 유전자 재조합 기술을 통하여 제작할 수 있다.
일반적으로, 면역글로불린은 중쇄(heavy chain) 및 경쇄(light chain)를 가지며 각각의 중쇄 및 경쇄는 불변 영역(constant region) 및 가변 영역(variable region)을 포함한다. 경쇄 및 중쇄의 가변 영역은, 상보성 결정 영역으로 불리는 3개의 다변가능한 영역(complementarity-determining region, 이하 "CDR"로 명명) 및 4개의 구조 영역(framework region, 이하 "FR"로 명명)을 포함한다. 각 사슬의 CDR은 주로 항원의 에피토프(epitope)에 결합하는 역할을 하며, 전형적으로 N-말단으로부터 시작하여 순차적으로 CDR1, CDR2, CDR3로 명명된다. 또한, 각 사슬의 FR은 N-말단으로부터 시작하여 순차적으로 FR1, FR2, FR3, FR4로 명명될 수 있다.
본 발명에서, 중쇄의 가변영역은 'VH', 경쇄의 가변영역은 'LH'로 명명될 수 있으며, 중쇄의 CDR은 각각 'VH-CDR1', 'VH-CDR2', 'VH-CDR3'으로, 경쇄의 CDR은 각각 'VL-CDR1', 'VL-CDR2', 'VL-CDR3'으로, 중쇄의 FR은 각각 'VH-FR1', 'VH-FR2', 'VH-FR3', 'VH-FR4'로, 경쇄의 FR은 'VL-FR1', 'VL-FR2', 'VL-FR3', 'VL-FR4'로 명명될 수 있다.
본 발명의 용어, "MIC-1(macrophage inhibitory cytokine 1) 단백질에 특이적으로 결합하는 항체"는 MIC-1 단백질에 결합하여 MIC-1 단백질의 활성을 저해할 수 있는 항체를 의미한다.
구체적으로, 상기 MIC-1 단백질에 특이적으로 결합하는 항체는 마우스 항체 또는 인간화 항체일 수 있다.
상기 용어, '마우스 항체'는 마우스 면역글로불린으로부터 유래하는 분자로서, 항체를 구성하는 모든 아미노산 서열 전체가 마우스 유래의 아미노산 서열로 구성되어 있는 것을 의미한다.
상기 용어, '인간화 항체'는 마우스 및 인간 면역글로불린으로부터 유래하는 분자로서, CDR은 마우스 유래, 이를 제외한 영역은 인간 유래의 아미노산 서열로 구성되어 있는 것을 의미한다.
더욱 구체적으로, 상기 항체는 서열번호 1의 중쇄 CDR1, 서열번호 2의 중쇄 CDR2, 및 서열번호 3의 중쇄 CDR3을 포함하는 중쇄 가변영역; 및 서열번호 4의 경쇄 CDR1, 서열번호 5의 경쇄 CDR2, 및 서열번호 6의 경쇄 CDR3을 포함하는 경쇄 가변영역을 포함할 수 있다.
또한, 상기 항체의 중쇄 가변영역은 서열번호 7 또는 17의 중쇄 FR1, 서열번호 8 또는 18의 중쇄 FR2, 서열번호 9 또는 19의 중쇄 FR3 및 서열번호 10 또는 20의 중쇄 FR4를 포함하고; 및 상기 항체의 경쇄 가변영역은 서열번호 11 또는 21의 경쇄 FR1, 서열번호 12 또는 22의 경쇄 FR2, 서열번호 13 또는 23의 경쇄 FR3 및 서열번호 14 또는 24의 경쇄 FR4를 포함하는 것일 수 있다.
본 발명에서, (ⅰ) 상기 항체의 중쇄 가변영역은 서열번호 7의 중쇄 FR1, 서열번호 8의 중쇄 FR2, 서열번호 9의 중쇄 FR3 및 서열번호 10의 중쇄 FR4를 포함하고; 및 상기 항체의 경쇄 가변영역은 서열번호 11의 경쇄 FR1, 서열번호 12의 경쇄 FR2, 서열번호 13의 경쇄 FR3 및 서열번호 14의 경쇄 FR4를 포함하는 것일 수 있고,
또는, (ⅱ) 상기 항체의 중쇄 가변영역은 서열번호 17의 중쇄 FR1, 서열번호 18의 중쇄 FR2, 서열번호 19의 중쇄 FR3 및 서열번호 20의 중쇄 FR4를 포함하고; 및 상기 항체의 경쇄 가변영역은 서열번호 21의 경쇄 FR1, 서열번호 22의 경쇄 FR2, 서열번호 23의 경쇄 FR3 및 서열번호 24의 경쇄 FR4를 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 상기 중쇄 가변영역은 서열번호 15 또는 25의 아미노산 서열로 이루어지고; 및 상기 경쇄 가변영역은 서열번호 16 또는 26의 아미노산 서열로 이루어진 것일 수 있다.
본 발명에서, (ⅰ) 상기 중쇄 가변영역은 서열번호 15의 아미노산 서열로 이루어지고; 및 상기 경쇄 가변영역은 서열번호 16의 아미노산 서열로 이루어진 것일 수 있고,
또는, (ⅱ) 상기 중쇄 가변영역은 서열번호 25의 아미노산 서열로 이루어지고; 및 상기 경쇄 가변영역은 서열번호 26의 아미노산 서열로 이루어진 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
가장 구체적으로, (ⅰ) 상기 항체는 서열번호 1의 중쇄 CDR1, 서열번호 2의 중쇄 CDR2, 및 서열번호 3의 중쇄 CDR3을 포함하는 중쇄 가변영역; 및 서열번호 4의 경쇄 CDR1, 서열번호 5의 경쇄 CDR2, 및 서열번호 6의 경쇄 CDR3을 포함하는 경쇄 가변영역을 포함하고, 상기 항체의 중쇄 가변영역은 서열번호 7의 중쇄 FR1, 서열번호 8의 중쇄 FR2, 서열번호 9의 중쇄 FR3 및 서열번호 10의 중쇄 FR4를 포함하고; 및 상기 항체의 경쇄 가변영역은 서열번호 11의 경쇄 FR1, 서열번호 12의 경쇄 FR2, 서열번호 13의 경쇄 FR3 및 서열번호 14의 경쇄 FR4를 포함하고, 상기 중쇄 가변영역은 서열번호 15의 아미노산 서열로 이루어지고; 및 상기 경쇄 가변영역은 서열번호 16의 아미노산 서열로 이루어진 것일 수 있으며,
또는, (ⅱ) 상기 항체는 서열번호 1의 중쇄 CDR1, 서열번호 2의 중쇄 CDR2, 및 서열번호 3의 중쇄 CDR3을 포함하는 중쇄 가변영역; 및 서열번호 4의 경쇄 CDR1, 서열번호 5의 경쇄 CDR2, 및 서열번호 6의 경쇄 CDR3을 포함하는 경쇄 가변영역을 포함하고, 상기 항체의 중쇄 가변영역은 서열번호 17의 중쇄 FR1, 서열번호 18의 중쇄 FR2, 서열번호 19의 중쇄 FR3 및 서열번호 20의 중쇄 FR4를 포함하고; 및 상기 항체의 경쇄 가변영역은 서열번호 21의 경쇄 FR1, 서열번호 22의 경쇄 FR2, 서열번호 23의 경쇄 FR3 및 서열번호 24의 경쇄 FR4를 포함하고, 상기 중쇄 가변영역은 서열번호 25의 아미노산 서열로 이루어지고; 및 상기 경쇄 가변영역은 서열번호 26의 아미노산 서열로 이루어진 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 이용되는 서열은, 생물학적으로 균등 활성을 갖는 변이를 고려한다면, 서열목록에 기재된 서열과 실질적인 동일성(substantial identity)을 나타내는 서열도 포함하는 것으로 해석된다. 상기 용어, '실질적인 동일성'은 본 발명의 서열과 임의의 다른 서열을 최대한 대응되도록 얼라인(align)하고, 당업계에서 통상적으로 이용되는 알고리즘을 이용하여 얼라인된 서열을 분석한 경우에, 최소 80%의 상동성, 가장 구체적으로 90%의 상동성을 나타내는 서열을 의미한다.
따라서, 본 발명에서 구체적으로 제시하고 있는 항체와 생물학적으로 균등한 활성을 나타낸다면, 상기 서열번호 1 내지 26로 표시되는 서열과 높은 상동성을 갖는 아미노산 서열, 예를 들면 그 상동성이 80% 이상, 더욱 구체적으로 90% 이상의 높은 상동성을 갖는 아미노산 서열도 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.
본 발명의 구체적인 일 실시예에서는, MIC-1 단백질에 결합하는 항-MIC-1 마우스 IgG 단일클론항체는 MIC-1 단백질에 의해 생성된 내피세포의 신생 혈관을 유의하게 감소시키고(도 1), 피부암, 대장암, 유방암 또는 전립선암의 성장을 억제하며, 이들 조직 내부 또는 외부의 혈관신생을 억제함을 확인하였다(도 2 내지 5). 또한, MIC-1 단백질에 높은 특이도로 결합하는 항-MIC-1 인간화 IgG 단일클론항체를 제조하였고(도 6 및 7), 상기 인간화 항체는 MIC-1 단백질에 의해 생성된 내피세포의 신생 혈관을 유의하게 감소시키고(도 8 내지 11), 대장암 또는 전립선암의 성장을 억제하며, 이들 조직 내부 또는 외부의 혈관신생을 억제함을 확인하였다(도 12 및 24).
이는, 본 발명의 MIC-1 단백질에 결합하는 항체는 MIC-1 단백질이 과발현된 질환, 예를 들어 암의 진단 또는 치료 등에 유용하게 사용될 수 있음을 시사하는 것이다.
다른 하나의 양태는 상기 항체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터 및 상기 발현 벡터가 도입된 형질전환체를 제공한다.
이때, 상기 항체의 설명에 대해서는 전술한 바와 같다.
본 발명에서, 상기 항체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현벡터는 특별히 이에 제한되지 않으나, 포유류 세포(예를 들어, 사람, 원숭이, 토끼, 래트, 햄스터, 마우스 세포 등), 식물 세포, 효모 세포, 곤충 세포 또는 박테리아 세포(예를 들어, 대장균 등)를 포함하는 진핵 또는 원핵세포에서 상기 폴리뉴클레오티드를 복제 및/또는 발현할 수 있는 벡터가 될 수 있고, 바람직하게는 숙주세포에서 상기 뉴클레오티드가 발현될 수 있도록 적절한 프로모터에 작동가능하도록 연결되며, 적어도 하나의 선별마커를 포함하는 벡터가 될 수 있다. 그 예로 파아지, 플라스미드, 코스미드, 미니-염색체, 바이러스 또는 레트로바이러스벡터 등에 상기 폴리뉴클레오티드가 도입된 형태가 될 수 있다.
상기 항체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현벡터는, 상기 항체의 중쇄 또는 경쇄를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 각각 포함하는 발현벡터 또는 중쇄 또는 경쇄를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 모두 포함하는 발현벡터일 수 있다.
본 발명에서, 상기 발현 벡터가 도입된 형질전환체는 특별히 이에 제한되지 않으나, 상기 발현벡터가 도입되어 형질전환된 대장균, 스트렙토미세스, 살모넬라 티피뮤리움 등의 박테리아 세포; 효모 세포; 피치아 파스토리스 등의 균류세포; 드로조필라, 스포도프테라 Sf9 세포 등의 곤충 세포; CHO(중국 햄스터 난소 세포, chinese hamster ovary cells), SP2/0(마우스 골수종), 인간 림프아구(human lymphoblastoid), COS, NSO(마우스 골수종), 293T, 보우 멜라노마 세포, HT-1080, BHK(베이비 햄스터 신장세포, baby hamster kidney cells), HEK(인간 배아신장 세포, human embryonic kidney cells), PERC.6(인간망막세포) 등의 동물 세포; 또는 식물 세포가 될 수 있다.
본 발명의 용어, "도입"은 상기 항체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 숙주세포에 전달하는 방법을 의미한다. 이와 같은 도입은 칼슘 포스페이트-DNA 공침전법, DEAE-덱스트란-매개 트랜스펙션법, 폴리브렌-매개 형질감염법, 전기충격법, 미세주사법, 리포좀 융합법, 리포펙타민 및 원형질체 융합법 등의 당 분야에 공지된 여러 방법에 의해 수행될 수 있다. 또한, 형질도입은 감염(infection)을 수단으로 하여 바이러스 입자를 사용하여 목적물을 세포 내로 전달시키는 것을 의미한다. 아울러, 유전자 밤바드먼트(bombardment) 등에 의해 벡터를 숙주세포 내로 도입할 수 있다. 본 발명에서 도입은 형질전환 또는 형질주입과 혼용되어 사용될 수 있다.
또 다른 하나의 양태는 상기 항체를 포함하는 조성물을 제공한다. 구체적으로, 상기 항체를 포함하는 암의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.
상기 항체는 암에서 과발현되는 MIC-1 단백질에 매우 높은 특이도를 나타내며, MIC-1 단백질에 의해 생성된 내피세포의 신생 혈관을 유의하게 감소시키고, 피부암, 대장암, 유방암 또는 전립선암의 성장을 억제하며, 이들 조직 내부 또는 외부의 혈관신생을 억제할 수 있으므로, MIC-1 단백질이 과발현된 질환, 예를 들어 암의 예방 또는 치료 효과를 나타낼 수 있다. 이때, 상기 항체의 설명에 대해서는 전술한 바와 같다.
본 발명의 용어, "암"은 신체 조직의 자율적인 과잉 성장에 의해 비정상적으로 자라난 덩어리로서, 본 발명의 항체에 의해 예방 또는 치료될 수 있는 암이라면 그 종류에 제한 없이 포함하나, 구체적인 예로 피부암 (구체적으로 피부흑색종), 대장암, 유방암, 전립선암, 췌장암, 위암, 담도암, 식도암, 직장암, 구강암, 인두암, 후두암, 폐암, 결장암, 난소암, 자궁경부암, 자궁내막암, 고환암, 방광암, 신장암, 간암, 골암, 결합 조직암, 뇌암, 갑상선암, 백혈병, 호지킨(Hodgkin) 질환, 림프종 및 다발성 골수종 혈액암일 수 있다.
본 발명의 용어, "암의 예방"은 상기 조성물의 투여에 의해 암의 발병을 억제하거나 지연시키는 모든 행위를 의미한다.
본 발명의 용어, "암의 치료"는 상기 조성물의 투여에 의해 암의 증세가 호전되거나 이롭게 변경되는 모든 행위를 의미한다.
또 다른 하나의 양태는 상기 항체를 포함하는 조성물을 제공한다. 구체적으로, 상기 항체를 포함하는 혈관 신생 억제용 약학 조성물을 제공한다.
본 발명의 조성물에 의해 예방 또는 치료될 수 있는 질병, 질환 또는 상태는 혈관신생과 관련된 다양한 질환을 포함한다. 구체적으로, 암, 아테롬성 동맥경화, 다발성골수종 뼈질환(multiple myeloma bone disease), 근위축증(muscle atrophy) 또는 당뇨병 합병증이다. 상술한 질환들에서는 MIC-1 단백질이 과발현되어 있을 수 있고, 또한 상기 MIC-1 단백질의 발현수준을 감소시키면 질환의 치료가 달성될 수 있다.
상기 약학 조성물은 약학적으로 허용가능한 담체를 추가로 포함할 수 있고, 상기 담체는 비자연적 담체(non-naturally occuring carrier)를 포함할 수 있다.
본 발명의 용어, "약학적으로 허용가능한 담체"는 생물체를 자극하지 않고 투여 화합물의 생물학적 활성 및 특성을 저해하지 않는 담체 또는 희석제를 의미한다. 액상 용액으로 제제화되는 조성물에 허용되는 약학적 담체로는, 멸균 및 생체에 적합한 것으로서, 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 알부민 주사용액, 덱스트로즈 용액, 말토 덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올 및 이들 성분 중 하나 이상의 성분을 혼합하여 사용할 수 있으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액, 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다. 또한, 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제를 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형, 환약, 캡슐, 과립 또는 정제로 제제화할 수 있다.
상기 약학적 조성물은 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제, 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제, 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제 및 좌제으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 제형을 가질 수 있고, 경구 또는 비경구의 여러 가지 제형일 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 하나 이상의 화합물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 탄산칼슘, 수크로오스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 스테아린산 마그네슘, 탈크 등과 같은 윤활제들도 사용된다. 경구투여를 위한 액상제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁용제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테로 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로젤라틴 등이 사용될 수 있다.
또한, 상기 약학적 조성물은 약학적으로 유효한 양으로 투여될 수 있다.
본 발명에서 용어, "약학적으로 유효한 양"은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 유효 용량 수준은 개체 종류 및 중증도, 연령, 성별, 암의 종류, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 본 발명의 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고 종래의 치료제와는 순차적 또는 동시에 투여될 수 있다. 그리고 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기 요소를 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.
본 발명의 구체적인 일 실시예에서는, MIC-1 단백질에 높은 특이도로 결합하는 항-MIC-1 마우스/인간화 IgG 단일클론항체는 MIC-1 단백질에 의해 생성된 내피세포의 신생 혈관을 유의하게 감소시키며, 피부암, 대장암, 유방암, 전립선암 췌장암, 간암 또는 위암의 성장을 억제하며, 이들 조직 내부/외부의 혈관신생을 억제함을 확인하였다(도 1 내지 5, 및 도 8 내지 24).
이는, 본 발명의 MIC-1 단백질에 결합하는 항체는 암의 예방 또는 치료 용도, 또한 혈관 신생 억제 용도로서 유용하게 사용될 수 있음을 시사하는 것이다.
또 다른 하나의 양태는 상기 항체를 인간을 제외한 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 암의 예방 또는 치료 방법을 제공한다.
이때, 상기 항체 및 암의 설명에 대해서는 전술한 바와 같다.
본 발명의 용어, "개체"는 암이 발병될 가능성이 있거나 또는 발병된 쥐, 소, 돼지, 양, 닭, 개, 인간 등을 포함하는 포유동물, 조류 등을 포함하며, 본 발명의 약학 조성물의 투여에 의해 암이 치료되는 개체는 제한 없이 포함한다.
본 발명의 암의 예방 또는 치료 방법에서, 상기 조성물을 투여하는 투여 경로 및 투여 방식은 특별히 제한되지 않으며, 목적하는 해당 부위에 상기 조성물이 도달할 수 있는 한, 임의의 투여 경로 및 투여 방식에 따를 수 있다.
구체적으로, 상기 조성물은 경구 또는 비경구의 다양한 경로를 통하여 투여될 수 있으며, 그 투여 경로의 비제한적인 예로는, 구강, 직장, 국소, 정맥내, 복강내, 근육내, 동맥내, 경피, 비측내 또는 흡입 등을 통하여 투여되는 것을 들 수 있다. 또한, 상기 조성물은 활성 물질이 표적 세포로 이동할 수 있는 임의의 장치에 의해 투여될 수 있다.
또 다른 하나의 양태는 상기 항체를 포함하는, 암 진단용 조성물을 제공한다.
이때, 상기 항체 및 암의 설명에 대해서는 전술한 바와 같다.
본 발명의 암 진단용 조성물은 다양한 종류의 암세포에서 과발현되는 MIC-1 단백질에 특이적으로 결합하는 항체들을 포함하므로, MIC-1 단백질의 발현 여부나 발현 정도와 관련된 질환, 예컨대 암의 진단에 유용하게 사용될 수 있다.
또 다른 하나의 양태는 상기 조성물을 포함하는, 암 진단용 키트를 제공한다.
이때, 상기 조성물 및 암의 설명에 대해서는 전술한 바와 같다.
본 발명의 암 진단용 키트는 분석방법에 적합한 한 종류 또는 그 이상의 다른 구성성분을 가진 조성물, 용액 또는 장치를 더 포함하여 구성될 수 있다.
또 다른 하나의 양태는 상기 항체를 이용하여, 암이 의심되는 개체의 분리된 생물학적 시료에서 MIC-1(macrophage inhibitory cytokine 1) 단백질을 항원-항체 반응을 통하여 검출하는 단계를 포함하는, 암 진단을 위한 정보의 제공 방법을 제공한다.
또한, 이 방법은 암을 진단하는 방법일 수 있으며, 상기 항체, 개체, MIC-1 단백질 및 암의 설명에 대해서는 전술한 바와 같다.
MIC-1 단백질은 다양한 종류의 암세포에서 과발현된다고 알려져 있으므로, MIC-1 단백질에 높은 특이도로 결합하는 본 발명의 항체는 MIC-1 단백질의 발현 여부나 발현 정도와 관련된 질환, 예컨대 암의 진단에 유용하게 사용될 수 있다.
상기 암 진단을 위한 정보의 제공방법은, 본 발명의 MIC-1에 특이적인 항체를 암이 의심되는 개체의 분리된 생물학적 시료와 반응시키고 항원-항체 복합체 형성을 검출함으로써 MIC-1 단백질을 검출할 수 있으며, 이를 통해 암 진단을 위한 정보의 제공을 할 수 있다.
구체적으로, (a) 분리된 상기 항체를 암이 의심되는 개체의 분리된 생물학적 시료에 처리하여 MIC-1 단백질을 항원-항체 반응을 통하여 검출하는 단계; (b) 상기 (a)에서 검출된 MIC-1 단백질의 수준을 대조군과 비교하여, 대조군에 비하여 MIC-1 단백질 수준이 높으면 암 환자로 판정하는 단계를 포함하는, 암 진단을 위한 정보의 제공방법 또는 암 진단 방법일 수 있다.
본 발명의 용어, "생물학적 시료"는 조직, 세포, 전혈, 혈청, 혈장, 조직 부검 시료(뇌, 피부, 림프절, 척수 등), 세포 배양 상등액, 파열된 진핵세포 및 세균 발현계 등을 들 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 이들 생물학적 시료를 조작하거나 조작하지 않은 상태로 본 발명의 항체와 반응시켜 MIC-1 단백질의 존재 또는 암의 유무를 확인할 수 있다.
본 발명의 용어, "항원-항체 복합체"는 시료 중의 MIC-1 단백질 항원과 이를 인지하는 본 발명의 항체의 결합물을 의미하며, 이러한 항원-항체 복합체의 형성은 비색법(colormetric method), 전기화학법(electrochemical method), 형광법(fluorimetric method), 발광법(luminometry), 입자계수법(particle counting method), 육안측정법(visual assessment) 또는 섬광계수법(scintillation counting method) 등의 임의의 방법으로 검출할 수 있다. 그러나 반드시 이들로만 제한되지 않고 다양한 응용과 적용이 가능하다.
상기 항원-항체 복합체를 검출하기 위하여 여러 가지 표지체를 사용할 수 있다. 구체적인 예로, 효소, 형광물, 리간드, 발광물, 미소입자 또는 방사성 동위원소 등을 사용할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 이때, 검출 표지체로서 사용되는 효소로는 아세틸콜린에스테라제, 알칼라인 포스파타제, β-D-갈락토시다제, 호스래디쉬 퍼옥시다제, β-라타마제 등을 포함하며, 형광물로는 플루오레세인, Eu3+, Eu3+ 킬레이트 또는 크립테이트 등을 들 포함하며, 리간드로는 바이오틴 유도체 등을 포함하며, 발광물로는 아크리디늄 에스테르, 이소루미놀 유도체 등을 포함하며, 미소입자로는 콜로이드 금, 착색된 라텍스 등을 포함하며, 방사성 동위원소로는 57Co, 3H, 125I, 125I-볼톤(Bonton) 헌터(Hunter) 시약 등을 포함한다.
또 다른 하나의 양태는 (a) 암세포에 암의 예방 또는 치료 후보물질을 처리하는 단계; (b) 상기 후보물질이 처리된 암세포에서 상기 항체를 이용하여, MIC-1(macrophage inhibitory cytokine 1) 단백질의 수준을 측정하는 단계; 및 (c) 상기 단계 (b)의 MIC-1 단백질 수준이 후보물질을 처리하지 않은 암세포의 것보다 감소하는 경우, 상기 (a)단계에서 처리한 후보물질을 암의 예방 또는 치료 물질로 판단하는 단계를 포함하는, 암의 예방 또는 치료 물질의 스크리닝 방법을 제공한다.
이때, 상기 항체, MIC-1 단백질 및 암의 설명에 대해서는 전술한 바와 같다.
본 발명의 용어, "암의 예방 또는 치료 후보물질"은 암을 치료할 수 있을 것으로 예상되는 물질로서, 직접 또는 간접적으로 암을 호전 또는 개선 시킬 수 있을 것으로 예상되는 물질이면 제한 없이 사용 가능하며, 화합물, 유전자 또는 단백질 등의 치료가능 예상물질을 모두 포함한다.
본 발명에서, 암세포에 암의 예방 또는 치료 후보물질을 처리하는 상기 (a) 단계는 당업계에 공지된 방법을 사용하여 수행될 수 있다. 구체적인 예로, 암세포에 상기 후보물질을 처리하여 함께 배양하거나, 또는 암세포를 포함하는 생체 내에 투여함으로써 상기 후보물질을 처리할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니며, 당업자라면 본 발명의 목적에 맞는 방법을 사용할 수 있을 것이다.
또한, MIC-1 단백질의 수준을 측정하는 상기 (b) 단계는 당업자에게 알려진 어떠한 방법이든 사용 가능하다. 구체적인 예로, 웨스턴블롯(Western blot), 공동-면역침전 어세이(Co-Immunoprecipitation assay), ELISA(Enzyme Linked Immunosorbent Assay), 조직 면역염색(immunostaining) 및 FACS(Fluorescence activated cell sorter) 등이 사용될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니며, 당업자라면 본 발명의 목적에 맞는 방법을 사용할 수 있을 것이다.
마지막으로, 상기 (c) 단계는 상기 후보물질을 암의 예방 또는 치료 물질로서 사용할 수 있는지 판단하는 단계로서, MIC-1 단백질은 암세포에서 과발현되며, 혈관신생을 촉진하고, 암세포의 성장 및 발달을 촉진하므로, MIC-1 단백질의 수준을 감소시키는 후보물질은 암의 예방 또는 치료 물질로서 사용될 수 있다.
본 발명의 항체는 MIC-1 단백질에 높은 특이도를 가지고 결합하며, 내피세포의 혈관신생을 억제하고, 생체 내 암세포의 성장 및 발달을 억제할 뿐만 아니라 암 조직 내부/외부의 혈관신생을 억제하므로, MIC-1 단백질이 과발현되어 있는 암과 같은 질환의 진단 및 치료 분야에 있어 유용하게 사용될 수 있다.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따라 제조한, 항-MIC-1 마우스 IgG 단일클론항체(이하, "항-MIC-1 마우스 항체"로 명명)의 혈관신생(angiogenesis) 억제 활성을 보여주는 이미지 및 그래프로서, A는 튜브 형성 어세이(tube formation assay), 및 B는 대동맥 고리 가지형성 어세이(aorta ring sprouting assay) 결과에 관한 것이다. 이때, mAb는 항-MIC-1 마우스 항체를 의미한다.
도 2는 상기 항-MIC-1 마우스 항체의 피부암(melanoma)에 대한 성장 억제 활성을 보여주는 이미지 및 그래프이다. A는 마우스 생체 내에 존재하는 피부암 종양의 모습, B는 마우스 생체로부터 분리한 피부암 종양의 모습, C는 상기 항체의 투여에 따른 피부암 종양의 부피 변화, D는 상기 항체의 투여에 따른 피부암 종양의 무게 변화, 및 E는 피부암 종양 조직 절편에 대한 항-CD31 항체의 면역형광염색 결과에 관한 것이다. 이때, mAb는 항-MIC-1 마우스 항체를 의미한다.
도 3은 상기 항-MIC-1 마우스 항체의 대장암에 대한 성장 억제 활성을 보여주는 이미지 및 그래프이다. A는 마우스 생체 내에 존재하는 대장암 종양의 모습, B는 마우스 생체로부터 분리한 대장암 종양의 모습, C는 상기 항체의 투여에 따른 대장암 종양의 부피 변화, D는 상기 항체의 투여에 따른 대장암 종양의 무게 변화, 및 E는 대장암 종양 조직 절편에 대한 항-CD31 항체의 면역형광염색 결과에 관한 것이다. 이때, mAb는 항-MIC-1 마우스 항체를 의미한다.
도 4는 상기 항-MIC-1 마우스 항체의 유방암에 대한 성장 억제 활성을 보여주는 이미지 및 그래프이다. A는 마우스 생체로부터 분리한 유방암 종양의 모습, B는 상기 항체의 투여에 따른 유방암 종양의 부피 변화, C는 상기 항체의 투여에 따른 유방암 종양의 무게 변화, 및 D는 유방암 종양 조직 외부 및 내부 절편에 대한 항-IB4(Isolectin/IB4) 항체의 면역형광염색 결과에 관한 것이다. 이때, mAb #4는 항-MIC-1 마우스 항체를 의미한다.
도 5는 상기 항-MIC-1 마우스 항체의 전립선암에 대한 성장 억제 활성을 보여주는 이미지 및 그래프이다. A는 마우스 생체로부터 분리한 전립선암 종양의 모습, B는 상기 항체의 투여에 따른 전립선암 종양의 부피 변화, C는 상기 항체의 투여에 따른 전립선암 종양의 무게 변화, 및 D는 유방암 종양 절편에 대한 항-IB4(Isolectin/IB4) 항체의 면역형광염색 결과에 관한 것이다. 이때, mAb #4는 항-MIC-1 마우스 항체를 의미한다.
도 6은 본 발명의 일 실시예에 따라 제조한, 항-MIC-1 인간화 IgG 단일클론항체(이하, "항-MIC-1 인간화 항체"로 명명)를 발현하는 1 내지 59개의 클론(clone)들의 항체 발현 정도를 보여주는 그래프 및 이미지로서, ELISA 및 웨스턴블롯(Western blot) 결과에 관한 것이다.
도 7은 상기 항-MIC-1 인간화 항체의 순도 및 MIC-1 단백질에 대한 결합인지도를 보여주는 이미지 및 그래프로서, 쿠마지 블루(Coomasie blue) 염색, ELISA 및 웨스턴블롯 결과에 관한 것이다.
도 8은 상기 항-MIC-1 인간화 항체의 혈관신생 억제 활성을 보여주는 이미지 및 그래프로서, 내피세포를 이용한 튜브 형성 어세이 결과에 관한 것이다. A는 MIC-1 단백질, 및 B는 A549 폐암세포, HCT116 대장암세포 또는 LNCaP 전립선암세포 배양 상층액 처리에 의해 증가한 혈관신생 감소 효과를 보여준다. 이때, HuAb는 항-MIC-1 인간화 항체를 의미한다.
도 9는 여러 유형의 항-MIC-1 항체의 혈관신생 억제 활성을 보여주는 이미지 및 그래프로서, 내피세포를 이용한 튜브 형성 어세이 결과에 관한 것이다. 이때, mAb는 마우스 전체항체, HuAb는 인간화 전체항체, 및 scFV는 단편 항체를 의미한다.
도 10은 상기 항-MIC-1 인간화 항체의 혈관신생 억제 활성을 보여주는 이미지 및 그래프로서, 대동맥 고리 가지형성(aorta ring sprouting) 어세이 결과에 관한 것이다. A는 항-MIC-1 인간화 항체, 및 B는 여러 유형의 항-MIC-1 항체 처리에 의해 증가한 혈관신생 감소 효과를 보여준다. 이때, mAb는 마우스 전체항체, HuAb는 인간화 전체항체, 및 scFV는 단편 항체를 의미한다.
도 11은 상기 항-MIC-1 인간화 항체의 혈관신생 억제 활성을 보여주는 이미지 및 그래프로서, CAM(chick chorioallantoic membrane)을 이용한 생체 내 혈관신생 어세이(in vivo angiogenesis assay) 결과에 관한 것이다. 이때, HuAb는 항-MIC-1 인간화 항체를 의미한다.
도 12는 상기 항-MIC-1 인간화 항체의 피부흑색종에 대한 성장 억제 활성을 보여주는 이미지 및 그래프이다. A는 마우스 생체 내에 존재하는 피부흑색종 종양의 모습, B는 마우스 생체로부터 분리한 피부흑색종 종양의 모습, C는 상기 항체의 투여에 따른 피부흑색종 종양의 부피 변화, D는 상기 항체의 투여에 따른 피부흑색종 종양의 무게 변화, E는 피부흑색종 종양 조직 절편에 대한 항-CD31 항체의 면역형광염색 결과, 및 F는 피부흑색종 종양 조직 절편에 대한 항-IB4 항체의 면역형광염색 결과에 관한 것이다. 이때, HuAb는 항-MIC-1 인간화 항체를 의미한다.
도 13은 항-MIC-1 인간화 항체의 피부흑색종에 대한 성장 억제 활성을 보여주는 그래프로서, A는 상기 항체의 투여에 따른 혈장 MIC-1 단백질의 농도를 보여주는 그래프, 및 B는 종양 크기와 혈장 MIC-1 단백질 농도의 연관성을 보여주는 그래프이다.
도 14는 상기 항-MIC-1 인간화 항체의 대장암에 대한 성장 억제 활성을 보여주는 이미지 및 그래프이다. A는 마우스 생체 내에 존재하는 대장암 종양의 모습, B는 마우스 생체로부터 분리한 대장암 종양의 모습, C는 상기 항체의 투여에 따른 대장암 종양의 부피 변화, D는 상기 항체의 투여에 따른 대장암 종양의 무게 변화, E는 대장암 종양 조직 절편에 대한 항-CD31 항체의 면역형광염색 결과, 및 F는 대장암 종양 조직 절편에 대한 항-IB4 항체의 면역형광염색 결과에 관한 것이다. 이때, HuAb는 항-MIC-1 인간화 항체를 의미한다.
도 15는 항-MIC-1 인간화 항체의 대장암에 대한 저산소 상태 유도 및 세포 증식 억제 활성을 보여주는 이미지 및 그래프이다. A는 대장암 종양 조직 절편에서 검출된 피모니다졸(Pimonidazole)의 수준, B는 대장암 종양 조직 절편에 대한 항-Ki67 항체의 면역형광염색 결과, 및 C는 CoCl2 처리된 대장암 세포에서 발현된 MIC-1 단백질의 양에 관한 것이다. 이때, HuAb는 항-MIC-1 인간화 항체를 의미한다.
도 16은 항-MIC-1 인간화 항체의 대장암에 대한 성장 억제 활성을 보여주는 그래프로서, A는 상기 항체의 투여에 따른 혈장 MIC-1 단백질의 농도를 보여주는 그래프, 및 B는 종양 크기와 혈장 MIC-1 단백질 농도의 연관성을 보여주는 그래프이다.
도 17은 상기 항-MIC-1 인간화 항체의 유방암에 대한 성장 억제 활성을 보여주는 이미지 및 그래프이다. A는 마우스 생체 내에 존재하는 유방암 종양의 모습, B는 마우스 생체로부터 분리한 유방암 종양의 모습, C는 상기 항체의 투여에 따른 유방암 종양의 부피 변화, D는 상기 항체의 투여에 따른 유방암 종양의 무게 변화, E는 유방암 종양 조직 절편에 대한 항-CD31 항체의 면역형광염색 결과, 및 F는 유방암 종양 조직 절편에 대한 항-IB4 항체의 면역형광염색 결과에 관한 것이다. 이때, HuAb는 항-MIC-1 인간화 항체를 의미한다.
도 18은 항-MIC-1 인간화 항체의 유방암에 대한 세포 증식 억제 활성을 보여주는 이미지 및 그래프이다. 유방암 종양 조직 절편에 대한 항-Ki67 항체의 면역형광염색 결과에 관한 것이다. 이때, HuAb는 항-MIC-1 인간화 항체를 의미한다.
도 19는 상기 항-MIC-1 인간화 항체의 전립선암에 대한 성장 억제 활성을 보여주는 이미지 및 그래프이다. A는 마우스 생체 내에 존재하는 전립선암 종양의 모습, B는 마우스 생체로부터 분리한 전립선암 종양의 모습, C는 상기 항체의 투여에 따른 전립선암 종양의 부피 변화, D는 전립선암 종양 조직 절편에 대한 항-CD31 항체의 면역형광염색 결과, 및 E는 전립선암 종양 조직 절편에 대한 항-IB4(Isolectin/IB4) 항체의 면역형광염색 결과에 관한 것이다. 이때, HuAb는 항-MIC-1 인간화 항체를 의미한다.
도 20은 항-MIC-1 인간화 항체의 전립선암에 대한 저산소 상태 유도 및 세포 증식 억제 활성을 보여주는 이미지 및 그래프이다. A는 전립선암 종양 조직 절편에서 검출된 피모니다졸의 수준, B는 전립선암 종양 조직 절편에 대한 항-Ki67 항체의 면역형광염색 결과, 및 C는 CoCl2 처리된 전립선암 세포에서 발현된 MIC-1 단백질의 양에 관한 것이다. 이때, HuAb는 항-MIC-1 인간화 항체를 의미한다.
도 21은 상기 항-MIC-1 인간화 항체의 췌장암에 대한 성장 억제 활성을 보여주는 이미지 및 그래프이다. A는 마우스 생체 내에 존재하는 췌장암 종양의 모습, B는 마우스 생체로부터 분리한 췌장암 종양의 모습, C는 상기 항체의 투여에 따른 췌장암 종양의 부피 변화, D는 췌장암 종양 조직 절편에 대한 항-CD31 항체의 면역형광염색 결과, 및 E는 췌장암 종양 조직 절편에 대한 항-IB4(Isolectin/IB4) 항체의 면역형광염색 결과에 관한 것이다. 이때, HuAb는 항-MIC-1 인간화 항체를 의미한다.
도 22는 항-MIC-1 인간화 항체의 췌장암에 대한 저산소 상태 유도 및 세포 증식 억제 활성을 보여주는 이미지 및 그래프이다. 췌장암 종양 조직 절편에 대한 항-Ki67 항체의 면역형광염색 결과에 관한 것이다. 이때, HuAb는 항-MIC-1 인간화 항체를 의미한다.
도 23은 상기 항-MIC-1 인간화 항체의 간암에 대한 성장 억제 활성을 보여주는 그래프로서, 상기 항체의 투여에 따른 간암 종양의 부피 변화에 관한 것이다. 이때, HuAb는 항-MIC-1 인간화 항체를 의미한다.
도 24는 상기 항-MIC-1 인간화 항체의 위암에 대한 성장 억제 활성을 보여주는 그래프로서, 상기 항체의 투여에 따른 위암 종양의 부피 변화에 관한 것이다. 이때, HuAb는 항-MIC-1 인간화 항체를 의미한다.
도 2는 상기 항-MIC-1 마우스 항체의 피부암(melanoma)에 대한 성장 억제 활성을 보여주는 이미지 및 그래프이다. A는 마우스 생체 내에 존재하는 피부암 종양의 모습, B는 마우스 생체로부터 분리한 피부암 종양의 모습, C는 상기 항체의 투여에 따른 피부암 종양의 부피 변화, D는 상기 항체의 투여에 따른 피부암 종양의 무게 변화, 및 E는 피부암 종양 조직 절편에 대한 항-CD31 항체의 면역형광염색 결과에 관한 것이다. 이때, mAb는 항-MIC-1 마우스 항체를 의미한다.
도 3은 상기 항-MIC-1 마우스 항체의 대장암에 대한 성장 억제 활성을 보여주는 이미지 및 그래프이다. A는 마우스 생체 내에 존재하는 대장암 종양의 모습, B는 마우스 생체로부터 분리한 대장암 종양의 모습, C는 상기 항체의 투여에 따른 대장암 종양의 부피 변화, D는 상기 항체의 투여에 따른 대장암 종양의 무게 변화, 및 E는 대장암 종양 조직 절편에 대한 항-CD31 항체의 면역형광염색 결과에 관한 것이다. 이때, mAb는 항-MIC-1 마우스 항체를 의미한다.
도 4는 상기 항-MIC-1 마우스 항체의 유방암에 대한 성장 억제 활성을 보여주는 이미지 및 그래프이다. A는 마우스 생체로부터 분리한 유방암 종양의 모습, B는 상기 항체의 투여에 따른 유방암 종양의 부피 변화, C는 상기 항체의 투여에 따른 유방암 종양의 무게 변화, 및 D는 유방암 종양 조직 외부 및 내부 절편에 대한 항-IB4(Isolectin/IB4) 항체의 면역형광염색 결과에 관한 것이다. 이때, mAb #4는 항-MIC-1 마우스 항체를 의미한다.
도 5는 상기 항-MIC-1 마우스 항체의 전립선암에 대한 성장 억제 활성을 보여주는 이미지 및 그래프이다. A는 마우스 생체로부터 분리한 전립선암 종양의 모습, B는 상기 항체의 투여에 따른 전립선암 종양의 부피 변화, C는 상기 항체의 투여에 따른 전립선암 종양의 무게 변화, 및 D는 유방암 종양 절편에 대한 항-IB4(Isolectin/IB4) 항체의 면역형광염색 결과에 관한 것이다. 이때, mAb #4는 항-MIC-1 마우스 항체를 의미한다.
도 6은 본 발명의 일 실시예에 따라 제조한, 항-MIC-1 인간화 IgG 단일클론항체(이하, "항-MIC-1 인간화 항체"로 명명)를 발현하는 1 내지 59개의 클론(clone)들의 항체 발현 정도를 보여주는 그래프 및 이미지로서, ELISA 및 웨스턴블롯(Western blot) 결과에 관한 것이다.
도 7은 상기 항-MIC-1 인간화 항체의 순도 및 MIC-1 단백질에 대한 결합인지도를 보여주는 이미지 및 그래프로서, 쿠마지 블루(Coomasie blue) 염색, ELISA 및 웨스턴블롯 결과에 관한 것이다.
도 8은 상기 항-MIC-1 인간화 항체의 혈관신생 억제 활성을 보여주는 이미지 및 그래프로서, 내피세포를 이용한 튜브 형성 어세이 결과에 관한 것이다. A는 MIC-1 단백질, 및 B는 A549 폐암세포, HCT116 대장암세포 또는 LNCaP 전립선암세포 배양 상층액 처리에 의해 증가한 혈관신생 감소 효과를 보여준다. 이때, HuAb는 항-MIC-1 인간화 항체를 의미한다.
도 9는 여러 유형의 항-MIC-1 항체의 혈관신생 억제 활성을 보여주는 이미지 및 그래프로서, 내피세포를 이용한 튜브 형성 어세이 결과에 관한 것이다. 이때, mAb는 마우스 전체항체, HuAb는 인간화 전체항체, 및 scFV는 단편 항체를 의미한다.
도 10은 상기 항-MIC-1 인간화 항체의 혈관신생 억제 활성을 보여주는 이미지 및 그래프로서, 대동맥 고리 가지형성(aorta ring sprouting) 어세이 결과에 관한 것이다. A는 항-MIC-1 인간화 항체, 및 B는 여러 유형의 항-MIC-1 항체 처리에 의해 증가한 혈관신생 감소 효과를 보여준다. 이때, mAb는 마우스 전체항체, HuAb는 인간화 전체항체, 및 scFV는 단편 항체를 의미한다.
도 11은 상기 항-MIC-1 인간화 항체의 혈관신생 억제 활성을 보여주는 이미지 및 그래프로서, CAM(chick chorioallantoic membrane)을 이용한 생체 내 혈관신생 어세이(in vivo angiogenesis assay) 결과에 관한 것이다. 이때, HuAb는 항-MIC-1 인간화 항체를 의미한다.
도 12는 상기 항-MIC-1 인간화 항체의 피부흑색종에 대한 성장 억제 활성을 보여주는 이미지 및 그래프이다. A는 마우스 생체 내에 존재하는 피부흑색종 종양의 모습, B는 마우스 생체로부터 분리한 피부흑색종 종양의 모습, C는 상기 항체의 투여에 따른 피부흑색종 종양의 부피 변화, D는 상기 항체의 투여에 따른 피부흑색종 종양의 무게 변화, E는 피부흑색종 종양 조직 절편에 대한 항-CD31 항체의 면역형광염색 결과, 및 F는 피부흑색종 종양 조직 절편에 대한 항-IB4 항체의 면역형광염색 결과에 관한 것이다. 이때, HuAb는 항-MIC-1 인간화 항체를 의미한다.
도 13은 항-MIC-1 인간화 항체의 피부흑색종에 대한 성장 억제 활성을 보여주는 그래프로서, A는 상기 항체의 투여에 따른 혈장 MIC-1 단백질의 농도를 보여주는 그래프, 및 B는 종양 크기와 혈장 MIC-1 단백질 농도의 연관성을 보여주는 그래프이다.
도 14는 상기 항-MIC-1 인간화 항체의 대장암에 대한 성장 억제 활성을 보여주는 이미지 및 그래프이다. A는 마우스 생체 내에 존재하는 대장암 종양의 모습, B는 마우스 생체로부터 분리한 대장암 종양의 모습, C는 상기 항체의 투여에 따른 대장암 종양의 부피 변화, D는 상기 항체의 투여에 따른 대장암 종양의 무게 변화, E는 대장암 종양 조직 절편에 대한 항-CD31 항체의 면역형광염색 결과, 및 F는 대장암 종양 조직 절편에 대한 항-IB4 항체의 면역형광염색 결과에 관한 것이다. 이때, HuAb는 항-MIC-1 인간화 항체를 의미한다.
도 15는 항-MIC-1 인간화 항체의 대장암에 대한 저산소 상태 유도 및 세포 증식 억제 활성을 보여주는 이미지 및 그래프이다. A는 대장암 종양 조직 절편에서 검출된 피모니다졸(Pimonidazole)의 수준, B는 대장암 종양 조직 절편에 대한 항-Ki67 항체의 면역형광염색 결과, 및 C는 CoCl2 처리된 대장암 세포에서 발현된 MIC-1 단백질의 양에 관한 것이다. 이때, HuAb는 항-MIC-1 인간화 항체를 의미한다.
도 16은 항-MIC-1 인간화 항체의 대장암에 대한 성장 억제 활성을 보여주는 그래프로서, A는 상기 항체의 투여에 따른 혈장 MIC-1 단백질의 농도를 보여주는 그래프, 및 B는 종양 크기와 혈장 MIC-1 단백질 농도의 연관성을 보여주는 그래프이다.
도 17은 상기 항-MIC-1 인간화 항체의 유방암에 대한 성장 억제 활성을 보여주는 이미지 및 그래프이다. A는 마우스 생체 내에 존재하는 유방암 종양의 모습, B는 마우스 생체로부터 분리한 유방암 종양의 모습, C는 상기 항체의 투여에 따른 유방암 종양의 부피 변화, D는 상기 항체의 투여에 따른 유방암 종양의 무게 변화, E는 유방암 종양 조직 절편에 대한 항-CD31 항체의 면역형광염색 결과, 및 F는 유방암 종양 조직 절편에 대한 항-IB4 항체의 면역형광염색 결과에 관한 것이다. 이때, HuAb는 항-MIC-1 인간화 항체를 의미한다.
도 18은 항-MIC-1 인간화 항체의 유방암에 대한 세포 증식 억제 활성을 보여주는 이미지 및 그래프이다. 유방암 종양 조직 절편에 대한 항-Ki67 항체의 면역형광염색 결과에 관한 것이다. 이때, HuAb는 항-MIC-1 인간화 항체를 의미한다.
도 19는 상기 항-MIC-1 인간화 항체의 전립선암에 대한 성장 억제 활성을 보여주는 이미지 및 그래프이다. A는 마우스 생체 내에 존재하는 전립선암 종양의 모습, B는 마우스 생체로부터 분리한 전립선암 종양의 모습, C는 상기 항체의 투여에 따른 전립선암 종양의 부피 변화, D는 전립선암 종양 조직 절편에 대한 항-CD31 항체의 면역형광염색 결과, 및 E는 전립선암 종양 조직 절편에 대한 항-IB4(Isolectin/IB4) 항체의 면역형광염색 결과에 관한 것이다. 이때, HuAb는 항-MIC-1 인간화 항체를 의미한다.
도 20은 항-MIC-1 인간화 항체의 전립선암에 대한 저산소 상태 유도 및 세포 증식 억제 활성을 보여주는 이미지 및 그래프이다. A는 전립선암 종양 조직 절편에서 검출된 피모니다졸의 수준, B는 전립선암 종양 조직 절편에 대한 항-Ki67 항체의 면역형광염색 결과, 및 C는 CoCl2 처리된 전립선암 세포에서 발현된 MIC-1 단백질의 양에 관한 것이다. 이때, HuAb는 항-MIC-1 인간화 항체를 의미한다.
도 21은 상기 항-MIC-1 인간화 항체의 췌장암에 대한 성장 억제 활성을 보여주는 이미지 및 그래프이다. A는 마우스 생체 내에 존재하는 췌장암 종양의 모습, B는 마우스 생체로부터 분리한 췌장암 종양의 모습, C는 상기 항체의 투여에 따른 췌장암 종양의 부피 변화, D는 췌장암 종양 조직 절편에 대한 항-CD31 항체의 면역형광염색 결과, 및 E는 췌장암 종양 조직 절편에 대한 항-IB4(Isolectin/IB4) 항체의 면역형광염색 결과에 관한 것이다. 이때, HuAb는 항-MIC-1 인간화 항체를 의미한다.
도 22는 항-MIC-1 인간화 항체의 췌장암에 대한 저산소 상태 유도 및 세포 증식 억제 활성을 보여주는 이미지 및 그래프이다. 췌장암 종양 조직 절편에 대한 항-Ki67 항체의 면역형광염색 결과에 관한 것이다. 이때, HuAb는 항-MIC-1 인간화 항체를 의미한다.
도 23은 상기 항-MIC-1 인간화 항체의 간암에 대한 성장 억제 활성을 보여주는 그래프로서, 상기 항체의 투여에 따른 간암 종양의 부피 변화에 관한 것이다. 이때, HuAb는 항-MIC-1 인간화 항체를 의미한다.
도 24는 상기 항-MIC-1 인간화 항체의 위암에 대한 성장 억제 활성을 보여주는 그래프로서, 상기 항체의 투여에 따른 위암 종양의 부피 변화에 관한 것이다. 이때, HuAb는 항-MIC-1 인간화 항체를 의미한다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명하기로 한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 예시하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는다.
실시예 1. 항-인간 MIC-1 마우스 IgG 단일클론항체의 활성 확인
실시예 1-1. 항-인간 MIC-1 마우스 IgG 단일클론항체의 구축
먼저, 인간 MIC-1 단백질을 Balb/c 마우스에 주입하여 항-인간-MIC-1 항체를 생산하는 마우스를 제조하였다. 상기 마우스로부터 지라세포(splenocyte)를 획득한 후, 이를 골수종(myeloma) 세포와 융합시켜서 혼성세포(hybridoma)를 제조하였고, HAT 배지를 이용하여 혼성세포만을 선택 배양하였다. 상기 혼성세포로부터 산출된 항체에 대해 ELISA를 수행함으로써 항-인간 MIC-1 항체를 생산하는 혼성세포 단일클론을 선별하였고, 상기 혼성세포 단일클론의 배양액에 존재하는 항체를 단백질-G 크로마토그래피(Protein G-agarose column chromatography)를 이용하여 정제함으로써 항-인간 MIC-1 마우스 IgG 단일클론항체를 수득하였다.
실시예 1-2. 혈관신생(angiogenesis) 억제 활성 확인
항-인간 MIC-1 마우스 IgG 단일클론항체(이하, "항-MIC-1 마우스 항체"로 명명)의 항암제로서의 활성을 확인하기 위하여, 먼저 혈관신생(angiogenesis) 억제 활성을 확인하였다. 이때, 상기 항-MIC-1 마우스 항체의 중쇄 및 경쇄 가변영역, CDR, 및 FR 서열은 하기 표 1에 기재하였다.
| 항체명 | 구분 | 서열 | 서열번호 |
| 항-MIC-1 마우스 항체 | 중쇄가변영역 (Heavy chain variable region; VH) |
EVQLQQSGAELVRPGALVKLSCKASGFNIKDYYMHWVRQRPEQGLEWIGWIDPENGNTIYDPKFQGKASITTDTSSNTAYMQLSSLTCEDTAVYYCAVPDSWGQGTTLTVSSAKTTPP | 15 |
| VH-CDR1 | GFNIKDYY | 1 | |
| VH-CDR2 | IDPENGNT | 2 | |
| VH-CDR3 | AVPDS | 3 | |
| VH-FR1 | EVQLQQSGAELVRPGALVKLSCKAS | 7 | |
| VH-FR2 | MHWVRQRPEQGLEWIGW | 8 | |
| VH-FR3 | IYDPKFQGKASITTDTSSNTAYMQLSSLTCEDTAVYYC | 9 | |
| VH-FR4 | WGQGTTLTVSSAKTTPP | 10 | |
| 경쇄가변영역 (Light chain variable region; VL) |
DIVMTQAAPSVPVTPGESVSISCRSSKSLLHSNGNTYLYWFLQRPDQSPQLLIYRMSNLASGVPDRFSGSGSGTAFTLRISRVEAEDVGVYYCMQHLEYPFTFGSGTKLEIK | 16 | |
| VL-CDR1 | KSLLHSNGNTY | 4 | |
| VL-CDR2 | RMS | 5 | |
| VL-CDR3 | MQHLEYPFT | 6 | |
| VL-FR1 | DIVMTQAAPSVPVTPGESVSISCRSS | 11 | |
| VL-FR2 | LYWFLQRPDQSPQLLIY | 12 | |
| VL-FR3 | NLASGVPDRFSGSGSGTAFTLRISRVEAEDVGVYYC | 13 | |
| VL-FR4 | FGSGTKLEIK | 14 |
구체적으로, 튜브 형성 어세이(tube formation assay) 및 대동맥 고리 가지형성 어세이(aorta ring sprouting assay)를 수행하였다.
튜브 형성 어세이를 수행하기 위하여, 먼저 사람의 탯줄내피세포(HUVEC)를 마트리겔(matrigel)이 코팅되어 있는 배양용기에 분주한 후, 배양액 포함된 MIC-1 단백질을 정상 IgG 또는 항-MIC-1 단일클론항체와 혼합하여 첨가하였다. 이를 37℃, 5% CO2 조건에서 16시간 동안 배양한 후, 튜브 형성 정도를 관찰하고 이의 길이(tube length)를 측정하였다.
대동맥 고리 가지형성 어세이를 수행하기 위하여, 먼저 SD-랫(rat)으로부터 분리한 대동맥을 일정 두께로 절단하여 얻은 대동맥 절편을 마트리겔로 둘러싼(embedding) 후, 정상 IgG 또는 항-MIC-1 단일클론항체와 혼합된 MIC-1이 첨가된 배양액에 담갔다. 이를 37℃, 5% CO2 조건에서 16시간 동안 배양한 후, 대동맥 절편으로부터 뻗어져 나온 내피세포의 가지(branch) 형성 정도(sprouting)를 측정하였다.
그 결과, 도 1의 A 및 B에서 볼 수 있듯이, 상기 항-MIC-1 마우스 항체는 MIC-1 단백질 처리에 의해 생성된 신생 혈관을 유의하게 감소시키며, 그 감소 정도는 MIC-1 단백질을 처리하지 않은 대조군과 유사함을 확인하였다.
상기 결과를 통해, 항-MIC-1 마우스 항체는 혈관신생을 억제하므로, 암의 예방 또는 치료 물질로 유용하게 사용될 수 있음을 알 수 있었다.
실시예 1-3. 피부암(melanoma)의 성장 억제 활성 확인
상기 항-MIC-1 마우스 항체의 항암 효과를 확인하기 위하여, 피부암(melanoma)에 대한 성장 억제 활성을 확인하였다.
구체적으로, B16F1 마우스 흑색종 피부암(melanoma) 세포주를 배양한 후, 배양된 세포를 마트리겔(50%)과 혼합하여 C57BL/6 마우스의 등쪽 피하에 접종(1 X 106 세포)함으로써 B16F1 피부암 세포주를 포함하는 이종이식(xenograft) 암 동물모델을 제작하였다. 이후, 생성된 종양의 크기가 100 ~ 150 mm3 정도일 때, 종양의 크기가 비슷한 마우스를 2개 그룹을 나누고, 한 그룹에는 정상 IgG를, 다른 그룹에는 항-MIC-1 단일클론항체를 3일 간격으로 꼬리정맥에 투여(100 ㎍/마리)하였다.
그 결과, 도 2의 A 내지 D에서 볼 수 있듯이, 정상 IgG 항체를 투여한 대조군에 비하여, 상기 항-MIC-1 마우스 항체를 투여하는 경우에는 피부암의 성장 속도가 감소하며, 종양의 크기 및 무게가 유의하게 감소하는 것을 확인하였다.
또한, 도 2의 E에서 볼 수 있듯이, B16F1 종양 조직 절편을 항-CD31 항체로 면역형광 염색한 결과, 혈관 내피세포 마커인 CD31의 발현이 현저하게 감소하는 것을 확인하였다.
상기 결과를 통해, 항-MIC-1 마우스 항체는 피부암의 성장 및 이의 혈관신생을 억제하므로, 암의 예방 또는 치료 물질로 유용하게 사용될 수 있음을 알 수 있었다.
실시예 1-4. 대장암의 성장 억제 활성 확인
상기 항-MIC-1 마우스 항체의 항암 효과를 확인하기 위하여, 대장암에 대한 성장 억제 활성을 확인하였다.
구체적으로, HCT-116 대장암 세포주를 누드마우스(athymic nu/nu mouse)의 피하 부위에 각각 접종(1 X 106 세포)하여 대장암 이종이식 암 동물모델을 제작하였고, 종양이 일정 크기로 성장하면 종양의 크기가 비슷한 마우스를 2개 그룹을 나누고, 한 그룹에는 정상 IgG를, 다른 그룹에는 항-MIC-1 단일클론항체를 3일 간격으로 꼬리정맥에 투여(100 ㎍/마리)하였다.
그 결과, 도 3의 A 내지 D에서 볼 수 있듯이, 상기 항-MIC-1 마우스 항체를 투여하는 경우에는 대장암의 성장 속도가 감소하며, 종양의 크기 및 무게가 유의하게 감소하는 것을 확인하였다.
또한, 도 3의 E에서 볼 수 있듯이, HCT-116 종양 조직 절편을 항-CD31 항체로 면역형광 염색한 결과, 혈관 내피세포 마커인 CD31의 발현이 현저하게 감소하는 것을 확인하였다.
상기 결과를 통해, 항-MIC-1 마우스 항체는 대장암의 성장 및 이의 혈관신생을 억제하므로, 암의 예방 또는 치료 물질로 유용하게 사용될 수 있음을 알 수 있었다.
실시예 1-5. 유방암의 성장 억제 활성 확인
상기 항-MIC-1 마우스 항체의 항암 효과를 확인하기 위하여, 유방암에 대한 성장 억제 활성을 확인하였다.
구체적으로, MDA-MB-231 인간 유방암 세포주를 마트리겔(50%)과 혼합하여 누드마우스(athymic nu/nu mouse)의 등쪽 피하에 접종(1 X 106 세포)함으로써 유방암 이종이식 암 동물모델을 제작하였다. 이후, 종양이 일정 크기로 성장하면, 종양의 크기가 비슷한 마우스를 2개 그룹을 나누고, 한 그룹에는 정상 IgG를, 다른 그룹에는 항-MIC-1 단일클론항체를 3일 간격으로 꼬리정맥에 투여(100 ㎍/마리)하였다.
그 결과, 도 4의 A 내지 C에서 볼 수 있듯이, 상기 항-MIC-1 마우스 항체를 투여하는 경우에는 유방암의 성장 속도가 감소하며, 종양의 크기 및 무게가 유의하게 감소하는 것을 확인하였다.
또한, 도 4의 D에서 볼 수 있듯이, MDA-MB-231 종양 조직 외부 및 내부 절편을 항-IB4(Isolectin/IB4) 항체로 면역형광 염색한 결과, 종양 외부에는 혈관 내피세포 마커인 IB4의 발현이 현저하게 감소하며, 종양 내부에는 IB4의 발현에 변화가 없는 것을 확인하였다.
상기 결과를 통해, 항-MIC-1 마우스 항체는 유방암의 성장을 억제하고, 유방암 외부의 혈관신생 억제하므로, 암의 예방 또는 치료 물질로 유용하게 사용될 수 있음을 알 수 있었다.
실시예 1-6. 전립선암의 성장 억제 활성 확인
상기 항-MIC-1 마우스 항체의 항암 효과를 확인하기 위하여, 전립선암에 대한 성장 억제 활성을 확인하였다.
구체적으로, PC3 인간 전립선암 세포주를 마트리겔(50%)과 혼합하여 누드마우스(athymic nu/nu mouse)의 등쪽 피하에 접종(2 X 106 세포)함으로써 전립선암 이종이식 암 동물모델을 제작하였다. 이후, 종양이 약 100 mm3 정도의 일정 크기로 성장하면, 종양의 크기가 비슷한 마우스를 2개 그룹을 나누고, 한 그룹에는 정상 IgG를, 다른 그룹에는 항-MIC-1 단일클론항체를 3일 간격으로 꼬리정맥에 투여(100 ㎍/마리)하였다.
그 결과, 도 5의 A 내지 D에서 볼 수 있듯이, 상기 항-MIC-1 마우스 항체를 투여하는 경우에는 전립선암의 성장 속도가 감소하며, 종양의 크기 및 무게가 유의하게 감소하는 것을 확인하였다.
또한, 도 5의 E에서 볼 수 있듯이, PC3 종양 조직 절편을 항-IB4(Isolectin/IB4) 항체로 면역형광 염색한 결과, 혈관 내피세포 마커인 IB4의 발현이 현저하게 감소하는 것을 확인하였다.
상기 결과를 통해, 항-MIC-1 마우스 항체는 전립선암의 성장 및 이의 혈관신생을 억제하므로, 암의 예방 또는 치료 물질로 유용하게 사용될 것임을 알 수 있었다.
상기 실시예 1의 결과들을 종합해 볼 때, 항-MIC-1 마우스 IgG 단일클론항체는 우수한 혈관신생 억제 효과를 나타내며, 피부암, 대장암, 유방암, 전립선암 등 다양한 종류의 암의 성장을 억제하고, 상기 암의 내부 또는 외부에서 혈관신생을 억제함으로써 항암 효과를 나타냄을 알 수 있었다.
실시예 2. 항-MIC-1 인간화 IgG 단일클론항체의 활성 확인
실시예 2-1. 항-MIC-1 인간화 IgG 단일클론항체의 제조
상기 실시예 1을 통해 항-MIC-1 마우스 IgG 단일클론항체는 혈관신생을 억제하며, 다양한 종류의 암에 대하여 성장 억제 효과를 나타냄을 확인함에 따라, 상기 마우스 항체의 항암 활성은 그대로 가지면서 거부반응이 최소화된 인간화 항체를 제조하고자 하였다.
구체적으로, 상기 마우스 항체를 분비하는 하이브리도마(hydridoma) 세포로부터 mRNA를 추출하고 cDNA로 전환한 후, 마우스 IgG의 중쇄 및 경쇄 가변영역(VL 및 VH)을 PCR로 증폭하고, pComb3XSS 벡터의 Sfi I 위치에 서브클로닝(subcloning)한 다음, 염기서열을 분석하였다. 분석이 완료된 상기 증폭산물을 사람의 항체 가변영역 아미노산 서열과 정렬하였고, CDR-1, 2, 3에 해당되는 부위는 마우스의 서열을 그대로 사용하고, 그 외 지역은 마우스 항체 가변영역과 상동성이 가장 높은 사람의 항체 가변영역의 아미노산으로 치환하는 방식으로 인간화 항체(humanized antibody)의 VL 및 VH 지역에 대한 아미노산 서열을 확정하였다. 코돈 최적화를 수행한 후, 이에 대한 올리고뉴클레오티드를 합성하여 동물세포에서 인간 IgG1를 발현하는 벡터인 pdCMV-dhfrC 벡터에 서브클로닝하였다. 이때, HindIII & BsiWI 위치에는 경쇄 암호화 올리고뉴클레오티드를, EcoRI & ApaI 위치에는 중쇄 암호화 올리고뉴클레오티드를 각각 서브클로닝하였다.
이후, 상기 인간화 IgG1 발현 벡터를 HEK293 세포에 형질주입하고 24시간 동안 배양한 후, 이의 배양 상층액을 재조합 MIC-1 단백질을 항원으로 코팅한 플레이트에 넣어 반응시킨 후 ELISA를 수행한 결과, 대조군 벡터(pdCMV-dhfrC 공벡터)를 형질주입한 대조군 세포의 배양 상층액에 대해서는 양성 반응이 거의 없었으나, 상기 인간화 항-MIC-1 IgG1 발현 벡터를 형질주입한 세포의 배양 상층액에 대해서는 높은 양성 반응을 보임을 확인하였다.
상기 결과를 통해, 제조한 인간화 항체의 발현벡터는 효과적으로 인간화 항-MIC-1 IgG1 항체를 발현할 수 있음을 알 수 있었다.
아울러, 제조한 인간화 항-MIC-1 IgG1 단일클론항체(이하, "항-MIC-1 인간화 항체"로 명명)의 생산 효율을 높이기 위하여, 상기 발현벡터를 DHFR(dihydrofolate reductase)이 결핍된 CHO 세포에 형질주입하고, 항생제(neomycin G418)와 DHFR이 함유된 배지에서 배양하여 안정된 형질전환체 클론들을 수득하고, 각 클론들을 분리 배양하였다. 상기 클론들의 배양 상층액에 대하여 전술한 바와 같이 MIC-1 단백질을 항원으로 하는 ELISA를 수행하였다.
그 결과, 도 6에서 볼 수 있듯이, 안정된 형질전환체 클론들 중 29번(#29) 클론에서 항-MIC-1 인간화 IgG1 항체가 가장 많이 발현되는 것을 확인하였다.
이후, 선발한 #29 CHO 세포 클론에 메토트렉세이트(methotrexate)를 처리하여 발현벡터 유전자를 증폭시킨 후, 대용량으로 세포를 배양하여 얻은 배양 상층액에 대하여 단백질-G 친화 크로마토그래피(protein-G affinity chromatography)를 통해 항-MIC-1 인간화 IgG 항체를 순수 정제하였다. 상기 항-MIC-1 인간화 IgG 항체의 순도는 쿠마지 블루 염색을 통해 확인하였고, MIC-1 단백질에 대한 결합인지도는 ELISA 및 웨스턴블롯팅(Western blotting)을 통해 확인하였다.
그 결과, 도 7에서 볼 수 있듯이, 항-MIC-1 인간화 IgG 항체는 높은 순도를 가지며, MIC-1 단백질에 대해서도 높은 특이도로 결합함을 확인하였다.
이와 같이 제조한 상기 항-MIC-1 인간화 항체의 중쇄 및 경쇄 가변영역, CDR, 및 FR 서열은 하기 표 2에 기재하였다.
| 항체명 | 구분 | 서열 | 서열 번호 |
| 항-MIC-1 인간화 항체 |
중쇄가변영역 (Heavy chain variable region; VH) |
EVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGFNIKDYYMHWVRQAPGQGLEWMGWIDPENGNTIYAQKFQGRVTMTRDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCAVPDSWGQGTLVTVSS | 25 |
| VH-CDR1 | GFNIKDYY | 1 | |
| VH-CDR2 | IDPENGNT | 2 | |
| VH-CDR3 | AVPDS | 3 | |
| VH-FR1 | EVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKAS | 17 | |
| VH-FR2 | MHWVRQAPGQGLEWMGW | 18 | |
| VH-FR3 | IYAQKFQGRVTMTRDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYC | 19 | |
| VH-FR4 | WGQGTLVTVSS | 20 | |
| 경쇄가변영역(Light chain variable region; VL) | DIVMTQTPLSLPVTPGEPASISCRSSKSLLHSNGNTYLYWYLQKPGQSPQLLIYRMSNLASGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCMQHLEYPFTFGQGTKVEIK | 26 | |
| VL-CDR1 | KSLLHSNGNTY | 4 | |
| VL-CDR2 | RMS | 5 | |
| VL-CDR3 | MQHLEYPFT | 6 | |
| VL-FR1 | DIVMTQTPLSLPVTPGEPASISCRSS | 21 | |
| VL-FR2 | LYWYLQKPGQSPQLLIY | 22 | |
| VL-FR3 | NLASGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYC | 23 | |
| VL-FR4 | FGQGTKVEIK | 24 |
실시예 2-2. 혈관신생 억제 활성 확인
실시예 2-2-1. 내피세포의 튜브 형성 억제 활성 확인
상기 실시예 1에서 제조한 항-MIC-1 인간화 항체의 항암제로서의 활성을 확인하기 위하여, 먼저 혈관신생 억제 활성을 상기 실시예 1-2에 따른 튜브 형성 어세이(Tube formation assay)를 통해 확인하였다.
그 결과, 도 8의 A에서 볼 수 있듯이, 상기 항-MIC-1 인간화 항체는 MIC-1 단백질 처리에 의해 증가한 내피세포의 튜브 형성, 즉 신생 혈관을 유의하게 감소시키며, 그 감소 정도는 MIC-1 단백질을 처리하지 않은 대조군과 유사함을 확인하였다.
한편, 종양 발달 중 일어나는 혈관신생은 종양 세포로부터 분비된 혈관신생 촉진인자의 작용에 의해 유도된다. 따라서, 상기 항체의 혈관신생 억제 활성을 더욱 정확히 확인하기 위하여 암세포로부터 분비된 혈관신생 촉진인자들을 포함하는 암세포 배양 상층액을 내피세포에 처리하였고, 이후 상기 항-MIC-1 인간화 항체를 처리하여 튜브 형성 억제 정도를 확인하였다.
그 결과, 도 8의 B에서 볼 수 있듯이, A549 폐암 세포주, HCT-116 대장암 세포주 또는 LNCaP 전립선암 세포주의 배양 상층액은 내피세포의 튜브 형성 정도를 증가시켰지만, 항-MIC-1 인간화 항체는 상기 암세포의 배양 상층액에 의해 증가한 튜브 형성을 유의하게 감소시키는 것을 확인하였다. 특히, 그 억제 정도는 배양 상층액을 처리하지 않은 대조군과 비슷하거나 더욱 우수함을 확인하였다.
아울러, 항-MIC-1 단일클론 항체 중에서도, 어느 유형의 항-MIC-1 단일클론 항체가 MIC-1에 의한 혈관신생을 효과적으로 억제하는지 확인하고자 하였다.
구체적으로, 마우스 IgG 전체 항체, 인간화 IgG 전체 항체 및 scFv 단편을 처리하여 튜브 형성 정도를 비교하였다.
그 결과, 도 9에서 볼 수 있듯이, 인간화 IgG 전체 항체가 가장 우수한 혈관신생 억제 활성을 나타냄을 확인하였고, 특히 그 억제 정도는 MIC-1을 처리하지 않은 대조군과 유사함을 확인하였다.
상기 결과를 통해, 항-MIC-1 인간화 항체는 내피세포의 혈관신생을 억제하며, 암세포에 의해 촉진되는 혈관신생도 우수한 정도로 억제하므로, 암의 예방 또는 치료 물질로 유용하게 사용될 수 있음을 알 수 있었다.
실시예 2-2-2. 대동맥 고리 가지형성(aorta ring sprouting) 억제 활성
상기 항-MIC-1 인간화 항체의 신생혈관 억제 활성을 더욱 정확히 확인하기 위하여, 랫트(rat)의 동맥절편의 가지 형성 정도를 비교하는 대동맥 고리 가지형성 어세이를 상기 실시예 1-2에 따른 방법으로 수행하였다.
그 결과, 도 10의 A에서 볼 수 있듯이, 항-MIC-1 인간화 항체는 MIC-1 처리에 의해 증가한 가지 형성을 유의하게 감소시키는 것을 확인하였다. 특히, 그 억제 정도는 MIC-1을 처리하지 않은 대조군과 비슷함을 확인하였다.
또한, 도 10의 B에서 볼 수 있듯이, 항-MIC-1 단일클론 항체 중에서도, 인간화 IgG 전체 항체가 가장 우수한 혈관신생 억제 활성을 나타냄을 확인하였고, 특히 그 억제 정도는 MIC-1을 처리하지 않은 대조군과 유사함을 확인하였다.
상기 결과를 통해, 항-MIC-1 인간화 항체는 랫트 동맥절편의 가지 형성, 즉 혈관신생을 우수한 정도로 억제하므로, 암의 예방 또는 치료 물질로 유용하게 사용될 수 있음을 알 수 있었다.
실시예 2-2-3. 생체 내 혈관신생 어세이(
in vivo
angiogenesis assay)
상기 항-MIC-1 인간화 항체의 신생혈관 억제 활성을 더욱 정확히 확인하기 위하여, CAM(chick chorioallantoic membrane)을 이용한 생체 내 혈관신생 어세이(in vivo angiogenesis assay)를 수행하였다.
구체적으로, 닭의 수정란을 37℃에서 3일간 배양한 후, 공기낭(air sac)이 형성된 부위의 껍질 부분을 제거하였다. 공기낭 제거로 나출된 상기 수정란의 장요막(chorioallantoic membrane) 위에 MIC-1 단백질을 정상 IgG 또는 항-MIC-1 단일클론항체와 혼합하여 흡수시킨 3M 종이필터를 얹었고, 이를 37℃에서 4일간 배양함으로써 수정란의 장요막에 생성된 혈관을 관찰하였다.
그 결과, 도 11에서 볼 수 있듯이, 항-MIC-1 인간화 항체는 MIC-1 처리에 의해 증가한 혈관 형성을 유의하게 감소시키는 것을 확인하였다. 특히, 그 억제 정도는 MIC-1을 처리하지 않은 대조군과 비슷하거나 더 감소함을 확인하였다.
상기 결과를 통해, 항-MIC-1 인간화 항체는 생체 내 혈관신생을 우수한 정도로 억제하므로, 암의 예방 또는 치료 물질로 유용하게 사용될 수 있음을 알 수 있었다.
실시예 2-3. 피부흑색종의 성장 억제 활성 확인
상기 항-MIC-1 인간화 항체의 항암 효과를 확인하기 위하여, 피부흑색종에 대한 성장 억제 활성을 확인하였다.
구체적으로, 상기 실시예 1-3에 따른 방법으로 C8161 인간 피부흑색종 세포주를 포함하는 이종이식 암 동물모델을 제작한 후, 상기 항체를 투여하였다.
그 결과, 도 12의 A 내지 D에서 볼 수 있듯이, 상기 항-MIC-1 인간화 항체를 투여하는 경우에는 피부흑색종의 성장 속도가 감소하며, 종양의 크기 및 무게가 유의하게 감소하는 것을 확인하였다. 특히, 상기 항체의 농도가 높아질수록, 항암 효과는 더욱 우수해짐을 확인하였다.
또한, 도 12의 E 및 F에서 볼 수 있듯이, C8161 종양 조직 절편을 항-CD31 항체 및 항-IB4 항체로 면역형광 염색한 결과, 항-MIC-1 인간화 항체 투여에 의해 혈관 내피세포 마커인 CD31 및 IB4의 발현이 현저하게 감소하는 것을 확인하였다.
상기 결과를 통해, 항-MIC-1 인간화 항체는 피부흑색종의 성장 및 혈관신생을 억제하므로, 암의 예방 또는 치료 물질로 유용하게 사용될 수 있음을 알 수 있었다.
나아가, 도 13의 A에서 볼 수 있듯이, 피부흑색종 동물모델에 항-MIC-1 인간화 항체를 투여하는 경우 혈장 내 MIC-1 단백질의 양이 감소하며, 상기의 감소 효과는 농도 의존적으로 나타남을 확인하였다.
상기 결과를 통해, 종양의 크기가 작아질수록 혈장 MIC-1 단백질의 농도가 감소함을 고려할 때(도 13의 B), 항-MIC-1 인간화 항체는 피부흑색종의 성장을 현저하게 억제할 수 있음을 알 수 있었고, 따라서 암의 예방 또는 치료 물질로 유용하게 사용될 수 있음을 알 수 있었다.
실시예 2-4. 대장암의 성장 억제 활성 확인
상기 항-MIC-1 인간화 항체의 항암 효과를 확인하기 위하여, 대장암에 대한 성장 억제 활성을 확인하였다.
구체적으로, 상기 실시예 1-4에 따른 방법으로, HCT-116 대장암 세포주를 포함하는 이종이식 암 동물모델을 제작한 후, 상기 항체를 투여하였다.
그 결과, 도 14의 A 내지 D에서 볼 수 있듯이, 상기 항-MIC-1 인간화 항체를 투여하는 경우에는 대장암의 성장 속도가 감소하며, 종양의 크기 및 무게가 유의하게 감소하는 것을 확인하였다. 특히, 상기 항체의 농도가 높아질수록, 항암 효과는 더욱 우수해짐을 확인하였다.
또한, 도 14의 E 및 F에서 볼 수 있듯이, HCT-116 종양 조직 절편을 항-CD31 항체 및 항-IB4 항체로 면역형광 염색한 결과, 혈관 내피세포 마커인 CD31 및 IB4의 발현이 현저하게 감소하는 것을 확인하였다.
상기 결과를 통해, 항-MIC-1 인간화 항체는 대장암의 성장 및 혈관신생을 억제하므로, 암의 예방 또는 치료 물질로 유용하게 사용될 수 있음을 알 수 있었다.
또한, 도 15의 A에서 볼 수 있듯이, HCT-116 종양 조직을 항-IB4 항체 및 피모니다졸(Pimonidazole)을 이용하여 분석한 결과, 항-MIC-1 인간화 항체 투여에 의해 혈관 내피세포 마커인 IB4의 수준은 현저하게 감소하였으나, 저산소증 마커인 피모니다졸의 수준은 현저하게 증가하는 것을 확인하였다.
또한, 도 15의 B에서 볼 수 있듯이, HCT-116 종양 조직을 항-Ki67 항체를 이용하여 분석한 결과, 항-MIC-1 인간화 항체 투여에 의해 증식/분열 중인 세포의 핵에서만 발견되는 단백질인 Ki67의 수준이 유의하게 감소하는 것을 확인하였다.
한편, 도 15의 C에서 볼 수 있듯이, 저산소 상태를 야기하는 CoCl2를 HCT-116 세포에 처리한 결과, MIC-1 단백질의 발현이 증가하는 것을 확인하였다.
상기 결과를 통해, 항-MIC-1 인간화 항체는 대장암 조직 내에서 혈관신생을 억제하여 저산소 지역을 확대하면서 산소 및 영양분의 공급을 차단하여 대장암 세포의 증식 및 분열을 억제함으로써 대장암의 발달을 저해함을 확인하였다.
즉, 종양이 커지면서 대장암 세포가 저산소 상태에 처하게 되면 상기 항체의 타겟 단백질인 MIC-1의 발현이 증가되지만 상기 항체는 대장암 세포로부터 분비된 MIC-1 단백질을 중화시키므로, 상기 항체는 MIC-1의 발현 증가가 종양 내 혈관신생으로 이어지는 것을 차단하여 대장암의 성장을 억제하는 효과를 발휘할 수 있음을 알 수 있었다.
실제로, 도 16의 A에서 볼 수 있듯이, 항-MIC-1 인간화 항체를 투여하는 경우 혈장 내 MIC-1 단백질의 양이 감소하며, 상기의 감소 효과는 농도 의존적으로 나타남을 확인하였다.
상기 결과를 통해, 종양의 크기가 작아질수록 혈장 MIC-1 단백질의 농도가 감소함을 고려할 때(도 16의 B), 항-MIC-1 인간화 항체는 대장암의 성장을 현저하게 억제할 수 있음을 알 수 있었고, 따라서 암의 예방 또는 치료 물질로 유용하게 사용될 수 있음을 알 수 있었다.
실시예 2-5. 유방암의 성장 억제 활성 확인
상기 항-MIC-1 인간화 항체의 항암 효과를 확인하기 위하여, 유방암에 대한 성장 억제 활성을 확인하였다.
구체적으로, 상기 실시예 1-5에 따른 방법으로 MDA-MB-453 인간 유방암 세포주를 포함하는 이종이식 암 동물모델을 제작한 후, 상기 항체를 투여하였다.
그 결과, 도 17의 A 내지 D에서 볼 수 있듯이, 상기 항-MIC-1 인간화 항체를 투여하는 경우에는 유방암의 성장 속도가 감소하며, 종양의 크기가 유의하게 감소하는 것을 확인하였다. 특히, 상기 항체의 농도가 높아질수록, 항암 효과는 더욱 우수해짐을 확인하였다.
또한, 도 17의 E 및 F에서 볼 수 있듯이, MDA-MB-453 종양 조직 절편을 항-CD31 항체 및 항-IB4 항체로 면역형광 염색한 결과, 항-MIC-1 인간화 항체 투여에 의해 혈관 내피세포 마커인 CD31 및 IB4의 발현이 현저하게 감소하는 것을 확인하였다.
나아가, 도 18에서 볼 수 있듯이, MDA-MB-453 종양 조직을 항-Ki67 항체를 이용하여 분석한 결과, 항-MIC-1 인간화 항체 투여에 의해 증식/분열 중인 세포의 핵에서만 발견되는 단백질인 Ki67의 수준이 유의하게 감소하는 것을 확인하였다.
상기 결과를 통해, 항-MIC-1 인간화 항체는 유방암의 성장 및 혈관신생을 억제하고, 유방암 세포의 증식 및 분열을 억제하므로, 암의 예방 또는 치료 물질로 유용하게 사용될 수 있음을 알 수 있었다.
실시예 2-6. 전립선암의 성장 억제 활성 확인
상기 항-MIC-1 인간화 항체의 항암 효과를 확인하기 위하여, 전립선암에 대한 성장 억제 활성을 확인하였다.
구체적으로, 상기 실시예 1-6에 따른 방법으로 PC3 전립선암 세포주를 포함하는 이종이식 암 동물모델을 제작한 후, 상기 항체를 투여하였다.
그 결과, 도 19의 A 내지 C에서 볼 수 있듯이, 상기 항-MIC-1 인간화 항체를 투여하는 경우에는 전립선암의 성장 속도가 감소하며, 종양의 크기가 유의하게 감소하는 것을 확인하였다. 특히, 상기 항체의 농도가 높아질수록, 항암 효과는 더욱 우수해짐을 확인하였다.
또한, 도 19의 D 및 E에서 볼 수 있듯이, PC3 종양 조직 절편을 항-CD31 항체 및 항-IB4 항체로 면역형광 염색한 결과, 혈관 내피세포 마커인 CD31 및 IB4의 발현이 현저하게 감소하는 것을 확인하였다.
상기 결과를 통해, 항-MIC-1 마우스 항체는 전립선암의 성장 및 혈관신생을 억제하므로, 암의 예방 또는 치료 물질로 유용하게 사용될 수 있음을 알 수 있었다.
또한, 도 20의 A에서 볼 수 있듯이, PC3 종양 조직을 항-IB4 항체 및 피모니다졸을 이용하여 분석한 결과, 혈관 내피세포 마커인 IB4의 수준은 현저하게 감소하였으나, 저산소증 마커인 피모니다졸의 수준은 현저하게 증가하는 것을 확인하였다.
또한, 도 20의 B에서 볼 수 있듯이, PC3 종양 조직을 항-Ki67 항체를 이용하여 분석한 결과, 항-MIC-1 인간화 항체 투여에 의해 증식/분열 중인 세포의 핵에서만 발견되는 단백질인 Ki67의 수준이 유의하게 감소하는 것을 확인하였다.
한편, 도 20의 C에서 볼 수 있듯이, 저산소 상태를 야기하는 CoCl2를 PC3 세포에 처리한 결과, MIC-1 단백질의 발현이 증가하는 것을 확인하였다.
상기 결과를 통해, 항-MIC-1 인간화 항체는 전립선암 조직 내에서 혈관신생을 억제하여 저산소 지역을 확대하면서, 산소 및 영양분의 공급을 차단하여 전립선암 세포의 증식 및 분열을 억제함으로써 전립선암의 발달을 저해함을 확인하였다.
즉, 종양이 커지면서 전립선암 세포가 저산소 상태에 처하게 되면 상기 항체의 타겟 단백질인 MIC-1의 발현이 증가되지만 상기 항체는 전립선암 세포로부터 분비된 MIC-1 단백질을 중화시키므로, 상기 항체는 MIC-1의 발현 증가가 종양 내 혈관신생으로 이어지는 것을 차단하여 전립선암의 성장을 억제하는 효과를 발휘할 수 있음을 알 수 있었다.
실시예 2-7. 췌장암의 성장 억제 활성 확인
상기 항-MIC-1 인간화 항체의 항암 효과를 확인하기 위하여, 췌장암에 대한 성장 억제 활성을 확인하였다.
구체적으로, PANC-1 인간 췌장암 세포주를 마트리겔(50%)과 혼합하여 누드마우스(athymic nu/nu mouse)의 등쪽 피하에 접종(1 X 106 세포)함으로써 췌장암 이종이식 암 동물모델을 제작하였다. 이후, 종양이 일정 크기로 성장하면, 종양의 크기가 비슷한 마우스를 2개 그룹을 나누고, 한 그룹에는 정상 IgG를, 다른 그룹에는 항-MIC-1 단일클론 인간화 항체를 3일 간격으로 꼬리정맥에 투여(100 ㎍/마리)하였다.
그 결과, 도 21의 A 내지 D에서 볼 수 있듯이, 상기 항-MIC-1 인간화 항체를 투여하는 경우에는 췌장암의 성장 속도가 감소하며, 종양의 크기가 유의하게 감소하는 것을 확인하였다. 특히, 상기 항체의 농도가 높아질수록, 항암 효과는 더욱 우수해짐을 확인하였다.
또한, 도 21의 E 및 F에서 볼 수 있듯이, PANC-1 종양 조직 절편을 항-CD31 항체 및 항-IB4 항체로 면역형광 염색한 결과, 항-MIC-1 인간화 항체 투여에 의해 혈관 내피세포 마커인 CD31 및 IB4의 발현이 현저하게 감소하는 것을 확인하였다.
나아가, 도 22에서 볼 수 있듯이, PANC-1 종양 조직을 항-Ki67 항체를 이용하여 분석한 결과, 항-MIC-1 인간화 항체 투여에 의해 증식/분열 중인 세포의 핵에서만 발견되는 단백질인 Ki67의 수준이 유의하게 감소하는 것을 확인하였다.
상기 결과를 통해, 항-MIC-1 인간화 항체는 췌장암의 성장 및 혈관신생을 억제하고, 췌장암 세포의 증식 및 분열을 억제하므로, 암의 예방 또는 치료 물질로 유용하게 사용될 수 있음을 알 수 있었다.
실시예 2-8. 간암의 성장 억제 활성 확인
상기 항-MIC-1 인간화 항체의 항암 효과를 확인하기 위하여, 간암에 대한 성장 억제 활성을 확인하였다.
구체적으로, HepG2 인간 간암 세포주를 마트리겔(50%)과 혼합하여 누드마우스(athymic nu/nu mouse)의 등쪽 피하에 접종(1 X 106 세포)함으로써 간암 이종이식 암 동물모델을 제작하였다. 이후, 종양이 일정 크기로 성장하면, 종양의 크기가 비슷한 마우스를 2개 그룹을 나누고, 한 그룹에는 정상 IgG를, 다른 그룹에는 항-MIC-1 단일클론 인간화 항체를 3일 간격으로 꼬리정맥에 투여(100 ㎍/마리)하였다.
그 결과, 도 23에서 볼 수 있듯이, 상기 항-MIC-1 인간화 항체를 투여하는 경우에는 간암 종양의 크기가 유의하게 감소하는 것을 확인하였다. 특히, 상기 항체의 농도가 높아질수록, 항암 효과는 더욱 우수해짐을 확인하였다.
상기 결과를 통해, 항-MIC-1 인간화 항체는 간암의 성장을 현저히 억제하므로, 암의 예방 또는 치료 물질로 유용하게 사용될 수 있음을 알 수 있었다.
실시예 2-9. 위암의 성장 억제 활성 확인
상기 항-MIC-1 인간화 항체의 항암 효과를 확인하기 위하여, 위암에 대한 성장 억제 활성을 확인하였다.
구체적으로, AGS 인간 위암 세포주를 마트리겔(50%)과 혼합하여 누드마우스(athymic nu/nu mouse)의 등쪽 피하에 접종(1 X 106 세포)함으로써 위암 이종이식 암 동물모델을 제작하였다. 이후, 종양이 일정 크기로 성장하면, 종양의 크기가 비슷한 마우스를 2개 그룹을 나누고, 한 그룹에는 정상 IgG를, 다른 그룹에는 항-MIC-1 단일클론 인간화 항체를 3일 간격으로 꼬리정맥에 투여(100 ㎍/마리)하였다.
그 결과, 도 24에서 볼 수 있듯이, 상기 항-MIC-1 인간화 항체를 투여하는 경우에는 위암 종양의 크기가 유의하게 감소하는 것을 확인하였다. 특히, 상기 항체의 농도가 높아질수록, 항암 효과는 더욱 우수해짐을 확인하였다.
상기 결과를 통해, 항-MIC-1 인간화 항체는 위암의 성장을 현저히 억제하므로, 암의 예방 또는 치료 물질로 유용하게 사용될 수 있음을 알 수 있었다.
이상의 설명으로부터, 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시 예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로서 이해해야만 한다. 본 발명의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.
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Claims (14)
- 서열번호 1의 중쇄 CDR1, 서열번호 2의 중쇄 CDR2, 및 서열번호 3의 중쇄 CDR3을 포함하는 중쇄 가변영역; 및
서열번호 4의 경쇄 CDR1, 서열번호 5의 경쇄 CDR2, 및 서열번호 6의 경쇄 CDR3을 포함하는 경쇄 가변영역을 포함하는, MIC-1(macrophage inhibitory cytokine 1) 단백질에 결합하는 항체.
- 제1항에 있어서, 상기 항체의 중쇄 가변영역은 서열번호 7 또는 17의 중쇄 FR1, 서열번호 8 또는 18의 중쇄 FR2, 서열번호 9 또는 19의 중쇄 FR3 및 서열번호 10 또는 20의 중쇄 FR4를 포함하고; 및
상기 항체의 경쇄 가변영역은 서열번호 11 또는 21의 경쇄 FR1, 서열번호 12 또는 22의 경쇄 FR2, 서열번호 13 또는 23의 경쇄 FR3 및 서열번호 14 또는 24의 경쇄 FR4를 포함하는 것인, 항체.
- 제1항에 있어서, 상기 중쇄 가변영역은 서열번호 15 또는 25의 아미노산 서열로 이루어지고; 및
상기 경쇄 가변영역은 서열번호 16 또는 26의 아미노산 서열로 이루어진 것인, 항체.
- 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 항체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드.
- 제4항의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터.
- 제5항의 발현 벡터가 도입된, 인간을 제외한 형질전환체.
- 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 항체를 포함하는, 암의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
- 제7항에 있어서, 상기 암은 피부암, 대장암, 유방암, 전립선암, 췌장암, 간암 또는 위암인 것인, 암의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
- 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 항체를 포함하는, 혈관신생 억제용 약학 조성물.
- 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 항체를 인간을 제외한 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 암의 예방 또는 치료 방법.
- 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 항체를 포함하는, 암 진단용 조성물.
- 제11항의 조성물을 포함하는, 암 진단용 키트.
- 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 항체를 이용하여, 암이 의심되는 개체의 분리된 생물학적 시료에서 MIC-1(macrophage inhibitory cytokine 1) 단백질을 항원-항체 반응을 통하여 검출하는 단계를 포함하는, 암 진단을 위한 정보의 제공 방법.
- (a) 분리된 암세포에 암의 예방 또는 치료 후보물질을 처리하는 단계;
(b) 상기 후보물질이 처리된 암세포에서 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 항체를 이용하여, MIC-1(macrophage inhibitory cytokine 1) 단백질의 수준을 측정하는 단계; 및
(c) 상기 단계 (b)의 MIC-1 단백질 수준이 후보물질을 처리하지 않은 암세포의 것보다 감소하는 경우, 상기 (a) 단계에서 처리한 후보물질을 암의 예방 또는 치료 물질로 판단하는 단계를 포함하는, 암의 예방 또는 치료 물질의 스크리닝 방법.
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