KR101938021B1 - 집합 및 집합의 이용방법 - Google Patents
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Abstract
본원은 부분적으로는, 개발 가능성과 관련된 기능적 특성들에 대해 미리 선택된 생식세포 단백질 서열을 포함하는, 가변 중쇄 및 가변 경쇄 쌍의 집합을 가능하게 하며, 이때 집합은 예를 들어, 파지 디스플레이를 이용한, 임의의 항원에 대한 선택에 이용될 수 있다.
Description
본 발명은 집합 및 집합의 이용방법에 관한 것이다.<상호 참조>
본 출원은 2011년 6월 8일 출원된 미국 가출원 일련번호 제61/494,452호 및 2010년 11월 19일 출원된 미국 가출원 일련번호 제61/415,367호의 이익을 주장하며, 상기 문헌들은 전체가 참조로 통합된다.
<서열목록>
본 출원은 EFS-웹을 통해 ASCII 형식으로 제출된 서열목록을 포함하며, 본원에 전체가 참조로 통합된다. 2011년 2월 15일 생성된 상기 ASCII 사본의 이름은 MS130US.txt이고, 크기가 229,568바이트이다.
제약 개발, 특히 치료용 항체 분야의 발전은 많은 질병의 치료를 신속히 가능하게 하고/하거나 개선하게 한다. 이러한 발전은 신규한 목표 장소에 도달하여
신규한 작용 메커니즘을 제공함으로써, 심지어 가장 심각하고 힘든 질병을 앓는 환자의 삶의 질을 점차 개선한다. 일반적으로 그리고 특히 환자의 건강 관리 시스템의 문제점은 이러한 제약 발전에 의해 가능하게 된 새로운 약물에 드는 비용도 급격히 증가한다는 점이다. 고 비용은 제약 개발에 필요한 투자의 결과로서, 특히 항체의 경우, 시장에서 거래되는 제품당 투자 비용이 현재 10억 달러를 초과한다. 개발 실패의 높은 위험성과 매우 장시간의 개발 기간은 이러한 투자를 불가피하게 만든다. 잠재적인 치료용 항체의 동정 시부터 판매에 이르러 환자에 도움을 주기까지는 15년이 넘게 걸릴 수 있다. 동정에서부터, 임상 전 단계, 임상단계, 시장 진입까지의 개발의 각 단계는 난제와 위험으로 가득하다. 제약 회사들은 환자의 손 안에 가장 효과적인 약이 신속하게 도달하도록, 일정과 실패의 위험을 줄여 개발 비용을 줄이고자 끊임없이 노력하고 있다.
다음과 같은 개시 내용은 임의의 질병 치료를 위한 최적의 치료용 항체를 더욱 신속히 동정하도록 하는 가치 있는 발전을 제공한다. 치료용 항체 후보는 시장에 내놓기 위하여 장기적 안정성, 낮은 응집 경향 및 높은 발현 수율과 같은 여러 가지 개발 기준을 충족시켜야 한다. 개시된 발전은 시작부터 엄격한 개발 기준 전부를 만족할 수 있는 항체를 동정할 확률 및 속도를 높여준다. 이에 따른 항체는 생산 비용이 덜 들 것이고, 다양한 질병의 치료에서 효과적이고 안전할 것이다.
잘 알려진 치료용 항체 동정 방법은 파지 디스플레이(phage display) 기술을 이용하는 방법이다. 파지 디스플레이는 항체를 표면 제시(display)하기 위해 박테리아에서 성장되는 바이러스 유사 입자를 활용한다. 이 기술의 한 가지 이점은 이용된 라이브러리가 최대 1 x 1011개의 항체로 방대하여, 임의의 질병과 관련된 임의의 목표에 대한 결합 여부를 신속하게 시험할 수 있다는 점이다. 예를 들어, 본원에 전체가 참조로 통합된, Knappik 등, (2000), "Fully synthetic human combinatorial antibody libraries (HuCAL) based on modular consensus frameworks and CDRs randomized with trinucleotides," J. Mol . Biol . 11;296(1):57~86 및 미국 특허번호 제6,300,064호 참조. 이렇게 많은 수의 항체로 작업하는 것의 이점은 목표에 대한 스크리닝의 결과물로 치료적인 의미에서 적절할 수 있는, 치료 목표에 결합하는 수백 개의 항체를 얻을 수 있다는 점이다. 그럼에도, 문제는 흔히 이러한 항체들 중 겨우 소수만이 개발 가능하다는 것이며, 이는 항체들 중 소수만 시장 판매를 위해 요구되는 엄격한 기준을 전부 만족할 수 있음을 의미한다.
동정 일정을 단축하고 내재하는 위험성을 줄이기 위한 새로운 파지 디스플레이 라이브러리 집합을 위해서는, 집합이, 선별 및 임상 개발에 필요하며 환자에게 안전하고 효과적인 치료를 가져올 성질들을 가지고 있는 항체들을 포함하여야 한다. 이러한 성질들로는 1) 집합의 각각의 항체 모두를 관심 있는 목표에 대하여 시험할 수 있도록 하는, 높은 파지 디스플레이 비율; 2) 항체 또는 단편이 필요한 양으로 효율적으로 재생산될 수 있도록 하는, Fab 및 IgG1 포맷의 높은 발현 수준; 3) 환자에 도달된 분자의 구조적 및 기능적 온전함을 보장하는, Fab 및 IgG1 포맷의 높은 열 안정성; 4) 항체가 반감기 증가 및 활성 연장을 나타내도록 하는, Fab 및 IgG1 포맷의 높은 혈청 내 안정성; 5) Fab 및 IgG1 포맷의 높은 단량체 함량(단량체 %)은 낮은 응집 경향을 의미하므로, 크기 배제 크로마토그래피(SEC)로 확인한, Fab 및 IgG1 포맷의 높은 단량체 함량(단량체 %); 6) IgG1 포맷의 높은 등전점(pI); 7) 산(acid) 노출 전과 후의 Fab 및 IgG1 포맷의 높은 열 안정성; 8) 산 노출 전과 후의 Fab 및 IgG1 포맷의 낮은 혼탁도(turbidity); 9) 산 노출 전과 후의 안정적인 분자 반지름 및 다분산성 %; 10) 안정성을 증가시키기 위한, 낮은 면역원성 위험도 및/또는 11) 하나의 집합이 임의의 치료적 목표에 대하여 여러 가지 항체를 동정하는 데 이용될 수 있도록 하는, 높은 다양성을 포함한다.
필수적으로, 인간 면역계를 모방하는 집합은 매우 가치 있거나, 심지어는 최적의 해결책이어야 한다. 인간 면역계는 생식세포 유전자에 의해 암호화된 항체들로 이루어진다. 항체는 부분적으로는, 가변 중쇄 및 가변 경쇄로 이루어진다. 대략 50종의 가변 중쇄 생식세포 유전자 및 대략 50종의 가변 경쇄 생식세포 유전자가 있어서, 조합 시 약 2,500개의 상이한 가변 중쇄 및 경쇄 쌍 조합을 제공한다. 인간에서는, 이러한 2,500개의 조합 전부가 생산될 것으로 여겨진다. 그러나, 특정 가변 중쇄, 가변 경쇄 및/또는 가변 중쇄와 가변 경쇄의 조합(쌍)이 다른 것들보다 더 높은 수준으로 존재한다는 점이 밝혀졌다. 일부가 다른 것들보다 더 많이 존재하는 데에는 반드시 일정한 이유가 있으며, 만일 그러하다면, 많이 존재하는 생식세포 계열의 유전자가 유리한 기능적 특성을 가지고 있을 수 있다는 가설이 세워졌다. 그러므로, 유리한 기능적 특성을 가지고 있는 항체의 집합을 제공하는 한 가지 방법은 인간 면역 레퍼토리(repertoire)에 존재하는, 풍부한 가변 중쇄, 가변 경쇄, 및/또는 가변 중쇄와 가변 중쇄의 쌍을 포함하는 집합을 생성하는 것이다.
또한, 인간에 존재하는 생식세포 계열 유전자 서열은 명백한 이유로 매우 낮은 면역원성을 나타낸다고 여겨지며, 따라서 이러한 서열은 면역원성의 위험도를 낮추기 위하여 재조합 항체에 모방될 수 있다.
인간 면역 레퍼토리에 우세한 가변 중쇄 및 가변 경쇄의 생식세포 유전자 쌍을 평가하는 접근법이 착수된 바 있다. 전체가 본원에 참조로 통합된 de Wildt 등의 Analysis of heavy and light chain pairings indicates that receptor editing shapes the human antibody repertoire, J Mol Biol. 22;285(3):895-901 (January 1999) 참조. Wildt 등은 인간 공여자로부터 혈액 시료를 채취하여, 체세포 초돌연변이를 거친 IgG+ B 세포를 분류하고, cDNA를 PCR 증폭시키고, 각 cDNA를 시퀀싱하고, 알려진 인간 가변 도메인 생식세포 유전자에 대해 각 서열을 정렬하였다. Wildt 등은 소수의 생식세포 유전자만이 면역 레퍼토리에서 두드러지며, 자주 등장하는 중쇄 및 경쇄 유전자 분절이 종종 쌍을 이룬다는 점을 관찰했다.
각각의 B 세포의 중쇄 및 경쇄 가변 도메인 쌍을 유지하려는 시도 또한 이루어졌다. 예를 들어, 가변 도메인 "동족 쌍(cognate pair)" 라이브러리가 개시된 바 있다. 전체가 본원에 참조로 통합된, Meijer 등, Isolation of human antibody repertoires with preservation of the natural heavy and light chain pairing, J Mol Biol., 358(3):764-72 (May 5 2006); 및 제WO2005042774호 참조. Meijer 등의 문헌에 설명된 기술에 따른 라이브러리는 면역된 숙주의 각각의 B 세포로부터 발생되었다. 일반적으로, B 세포는 FACS에 의해 분류되어, 체세포 초돌연변이 세포를 나타내는 CD38HI B 세포가 선별되며, 그것들의 cDNA가 PCR 증폭되고, 항체 유전자 산물이 선별용 Fab 벡터 내로 삽입된다. 이러한 동족 쌍 라이브러리에는 제한이 있게 마련이다. 예를 들어, B 세포를 제공하는 숙주는 일반적으로 면역되고; 분류된 B 세포 집단은 초돌연변이 되었으므로, 이에 따른 라이브러리는 특정 면역원으로 치우치게 된다.
부가적으로, 집합 생성을 위하여 우세 가변 중쇄 또는 가변 경쇄를 활용하려는 시도가 이루어졌다. 예를 들면, 전체가 참조로서 본원에 통합된, Shi 등의 "De Novo Selection of High-Affinity Antibodies from Synthetic Fab Libraries Displayed on Phage as pIX Fusion Proteins; J Mol Biol., 397(2):385-96 (March 26, 2010) 및 각 특허 출원 제WO2009085462호; 및 제WO2006014498호. 여기서, 가변 중쇄 또는 가변 경쇄의 생식세포 단백질 서열은 인간 면역 레퍼토리에서 그것들의 이용 빈도를 기초로 하여 라이브러리 내에 포함되었다.
또한, 특정 생식세포 쌍을 집합 내에 포함하는 추가적인 시도가 이루어졌다. 예를 들어, 전체가 본원에 참조로 통합된 제WO1999020749호는 집합의 구성원이 인간 생식세포 중쇄 유전자 분절 DP-47(IGHV3-23)에 의해 암호화된 과가변 루프의 표준 구조(canonical structure) 및/또는 생식세포 유전자에 의해 암호화된 기본틀 영역(framework region)을 가지고 있는 중쇄, 및/또는 인간 생식세포 경쇄 유전자 분절 02/012(IGKV1-39/1D-39)에 의해 암호화된 과가변 루프의 표준 구조 및/또는 생식세포 유전자에 의해 암호화된 기본틀 영역을 가지고 있는 경쇄를 포함하는 집합을 기술하고 있다.
추가적인 접근법은 B 세포로부터 직접적으로 또는 B 세포로부터 유도된 라이브러리를 생성했다. 예를 들어, 본원에 전체가 참조로 통합된 것으로, 다양한 654개의 인간 공여자 면역 글로불린 M(IgM) 레퍼토리로부터 구축된 항체 집합을 설명하는, Glanville 등의 Precise Determination of the Diversity of a Combinatorial Antibody Library Gives Insight into the Human Immunoglobulin Repertoire, Proc Natl Acad Sci 1;106(48):20216-21 (December 2009). 구체적으로, 654명의 인간 공여자들의 중쇄 및 경쇄 V-유전자 cDNA를 각각 PCR 증폭시켰고(가변 중쇄 및 경쇄 쌍을 분리함), 그런 다음, 중쇄 및 경쇄 도메인을 무작위로 재결합시켰다. 본원에 전체가 참조로서 통합된 제WO2003052416호 또한, 미생물에 의한 감염 또는 백신 치료 중 어느 하나에 의해, 관심 있는 병원균에 대하여 현저한 반응을 나타내는 숙주로부터 B 세포를 분리하는 기술을 설명한다. 제WO 2003052416호에서는, 가변 영역 중 CDR3 영역을 암호화하는 cDNA를 시퀀싱하여, 우세한 CDR3를 포함하는 항체 단편을 설계하였다. 본원에 전체가 참조로 통합된 제WO2009100896호는 면역된 숙주로부터 B 세포를 분리하는 기술을 설명한 것으로, 가변 중쇄 및 가변 경쇄 영역을 암호화하는 cDNA를 시퀀싱하여, 짝을 이루지 못한 가변 중쇄 및 가변 경쇄 서열의 존재비를 확인하였다. 제WO2009100896호에서는, 무작위로 재조합된 가변 중쇄 및 가변 경쇄를 포함하는 라이브러리를 합성하였으며, 이 때 항체는 하나의 면역원에 대해 특이적이었다. 이러한 접근법 및 추가적인 접근법에 대한 개요는 본원에 전체가 참조로 통합된, Fuh 등의 Synthetic antibodies as therapeutics, Expert Opin Biol Ther.,7(1):73-87 (January 2007)]에 나타나 있다.
따라서, 인간 면역 레퍼토리에 존재하는, 개발과 관련하여 유리한 생물 물리학적 성질을 가지고 있는 가변 중쇄 및 가변 경쇄 유전자 쌍을 포함하는 동시에, 현실적으로 존재하지만 그러한 생물 물리학적 성질들을 가지고 있지 않은 쌍은 배제하는, 항체 또는 이의 단편의 집합이 매우 필요하다. 이러한 필요성 및 기타 요구는 본 발명에 의해 충족된다.
본 발명은 집합 및 집합의 이용방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
본원은 임의의 항원에 대하여, 개발할 수 있고 환자에게 안전하며 효과적인 항체 또는 항체 단편을 효율적으로 동정하는 문제에 대하여 가치 있는 해결책을 제공한다. 가장 일반적인 의미에서, 본 발명자들은 필수적인 방식으로 인간 면역계를 모방하는 항체 집합이 유리할 수 있다는 발상으로부터 시작하였다. 하나의 관점에서, 본 발명자들은 인간 면역 레퍼토리로부터의 최적의 생식세포 유전자 서열 또는 이의 일부분을 항체 내에 포함시킴으로써 인간 면역계를 모방하기로 했다. 그와 같이, 일부 구현예에서, 집합의 항체는 일부분, 예를 들어, 서열 내 생식세포 계열인 기본틀 영역을 포함한다. 생식세포 계열의 서열 이용 시, 환자에서 치료적 이용을 위한 재조합 항체의 면역원성 위험도를 현저하게 줄일 것이다.
또한, 본 발명자들은 인간 면역 레퍼토리에 풍부한 가변 중쇄 및 가변 경쇄 생식세포 유전자 쌍이 더 효율적인 임상 개발을 가져오며 환자에 있어서 그 결과로 얻어지는 항체의 안전성 및 효능을 증가시킬 유리한 생물 물리학적 성질을 나타낼 가능성이 높다는 가설로부터 연구를 하였다. 바탕으로, 각 B 세포는 하나의 항체를 암호화하고, 각 항체는 가변 중쇄 및 가변 경쇄를 포함한다. 항체의 각 가변 중쇄 및 가변 경쇄는 항체의 기원을 확인하기 위하여 생식세포 서열과 함께 정렬될 수 있으며, 이는 가변 중쇄 및 가변 경쇄가 어떤 생식세포 유전자로부터 암호화되는지를 나타낸다. 그러므로, 각 항체에 대하여, 가변 중쇄 및 가변 경쇄는 생식세포 유전자 또는 생식세포 단백질 쌍, 예를 들어 VK1-5와 쌍을 이룬 VH3-23을 포함한다.
우세한 생식세포 유전자 쌍이 유리한 생물 물리학적 성질을 가지고 있을 가능성이 높다는 가설을 증명하는 데 있어서, 첫 번째 단계는 인간 면역 레퍼토리에 우세한 가변 중쇄 및 가변 경쇄 생식세포 유전자 쌍을 확인하는 단계였다. 이는 공개적으로 입수 가능한 문헌을 광범위하게 검색하고, 인간 숙주로부터의 B 세포를 추출하여 이루어졌다. 다음 단계로, 이러한 데이터를 모아서 분석하고, 인간 면역 레퍼토리에 존재하는 가변 중쇄 및 가변 경쇄의 생식세포 쌍을 이들의 출현율에 따라 정렬시켰다. 이러한 데이터로부터 특정 가변 중쇄 및 가변 경쇄의 생식세포 유전자 쌍이 다른 것들보다 더 빈번하게 인간 면역 레퍼토리에 존재한다는 점이 명백해졌다.
다음 단계로, 인간 면역 레퍼토리에는 약 2500쌍이 존재하여 각각을 시험하는 것이 바람직하지 못하므로, 개발과 관련된 기능적 특성에 대해 어떠한 생식세포 단백질 쌍을 시험할 것인지를 결정해야 했다. 인간 면역 레퍼토리에서 가장 우세하게 발생하는 가변 중쇄 및 가변 경쇄 생식세포 단백질 쌍을 시험하는 것이 한 가지 방법이다. 예를 들어, 표 6 참조. 예를 들어, 시험을 위해 상위 400쌍을 선택하거나, 특정 임계 개수로 또는 그것을 초과하여 존재하는 가변 중쇄 및 가변 경쇄의 생식세포 유전자 쌍을 선택할 수 있다. 이러한 접근법을 위해서는 매우 많은 수의 가변 중쇄 및 가변 경쇄의 생식세포 단백질 쌍 서열을 합성하여 시험할 필요가 있으므로, 이러한 접근법은 매우 효율적이지 않을 수 있다.
대안적인 접근법으로, 본 발명자들은 인간 면역 레퍼토리의 우세한 쌍들 대부분을 대표하거나, 정확하게 재생산하거나, 이들을 아우르는 가변 중쇄 및 가변 경쇄의 생식세포 쌍들의 부분집합을 선별했다. 이러한 접근법은 부분적으로는 적은 수의 가변 중쇄, 가변 κ 경쇄 및 가변 λ 경쇄의 (쌍을 이루지 않은) 생식세포 유전자가 인간 면역 레퍼토리에서 우세하다는 관찰을 기초로 한 것이었다. Wildt 등은 895~896페이지에서 이러한 현상을 기술하고 있다. Wildt 등은 또한, 자주 등장하는 중쇄 및 경쇄 유전자 분절이 자주 쌍을 이루고 있으며, 추출된 쌍 중 절반은 겨우 다섯 개의 생식세포 쌍과 상응한다는 점을 관찰했다고 언급하고 있다. 따라서, 적은 수의 우세한 중쇄 및 경쇄의 (쌍을 이루지 않은) 생식세포 유전자를, 인간 면역 레퍼토리를 대표하는 중쇄 및 경쇄 쌍 집단을 생성하도록 조합할 수 있다.
이 접근법은 다음과 같은 방식으로 착수되었다. 인간 면역 레퍼토리에 우세한 가변 중쇄, 가변 κ 경쇄 및 가변 λ 경쇄의 (쌍을 이루지 않은) 생식세포 유전자를 확인하기 위하여, 결합된 VH/VL 쌍을 나타내는 데이터(예를 들어, 표 6 참조)와 결합되지 않은 VH 또는 VL 사슬의 존재를 확인하는 데이터(예를 들어, 실시예 3 및 표 5 참조)를 분석하였다.
다음 단계로, 개발과 관련된 생물 물리학적 성질을 확인하기 위하여, 우세한 가변 중쇄, 가변 κ 경쇄 및 가변 λ 경쇄의 (쌍을 이루지 않은) 생식세포 단백질 서열을 평가하였다. 실시예 4 참조. 다음과 같은 성질들을 대상으로 인실리코(in silico)에서 가변 중쇄, 가변 κ 경쇄 및 가변 λ 경쇄의 생식세포 단백질 서열을 평가하였다: (i) CDR 길이, (ii) 등전점(pI)(바람직한 등전점은 7.5 이상이며, 이는 중성 또는 약산성 제형 완충액에서 안정성을 제공하기 위함이다), (iii) 잠재적인 번역 후 변형 부위(PTM’s)(구체적으로, N-결합된 글리코실화 부위(NxS 또는 NxT) 또는 Asp 절단(흔히 DP 또는 DQ에서 발생)과 같은 화학적 변형)를 위한 잠재적인 부위, (iv) Asp 이성질화(DS, DG), (v) 생체 내(혈청 내)에서 발생할 수 있거나 제형 완충액에 저장 시, 항원 결합 손실을 초래할 수 있는 탈아미노화(NS, NG), (vi) CDR에서 메티오닌의 존재(용매에 노출될 때, 산화하기 쉬움), (vii) 쌍을 이루지 않은 시스테인의 존재(임의의 다른, 쌍을 이루지 않은 시스테인과 이황화 결합을 형성하여, 단백질의 가교결합 및/또는 낮은 발현 수준을 초래함), (viii) 생식세포로부터의 편차, (ix) 가능성 있는 T세포 에피토프의 존재 및 (x) 이론적 응집 경향.
다음 단계로, 유리한 인실리코 생물 물리학적 특성을 가지고 있는 가변 중쇄, 가변 κ 경쇄 및 가변 λ 경쇄의 생식세포 단백질 서열을 조합하여 가변 중쇄 및 가변 경쇄 쌍을 형성하였다. 표 5 및 도 2와 도 3에 도시된 바와 같이, 일반적으로, 상위 20개의 VH, 상위 8개의 Vλ 및 상위 12개의 Vκ를 합성, 조합 및 이후의 기능 분석을 위하여 선별하였다. 표 6에 나타낸 바와 같은 인간 면역 레퍼토리로부터 우세한 쌍들 대부분을 대표하거나 정확하게 재생산하거나 이들을 아우르는 400개의 생식세포 단백질 쌍(20VH X 20VL)을 생성하기 위하여, 생식세포 유전자 서열을 합성한 다음, 조합하였다. 이는 가변 중쇄 및 가변 경쇄의 생식세포 유전자를 합성하여, 그것들을 쌍으로 조합하고, 쌍을 단백질(생식세포 단백질 쌍)으로 발현시키고, 생물 물리학적 성질을 확인하고자 각각을 시험하여 이루어진다. 다음과 같은 성질들을 시험하였다: (i) Fab 포맷의 상대적인 파지 상 디스플레이 비율; (ii) 예컨대, 대장균에서, Fab 포맷의 상대적인 발현 수준; (iii) Fab 포맷의 열 안정성; (iv) Fab 포맷의 소 또는 마우스 혈청 내 안정성; (v) IgG1 포맷의 상대적인 발현 수준; 및 (vi) IgG1 포맷의 소 혈청 내 안정성.
400개의 생식세포 단백질 쌍을 대상으로 한 디스플레이, 발현, 열 안정성 및 혈청 안정성 시험은, 현실적으로 존재하지만 치료제 개발에 유리하리라고 생각했던 생물 물리학적 성질들은 가지고 있지 않은 생식세포 단백질 쌍을 제거하기 위한 예비적인 필터로써 작용했다. 유리한 개발 가능성 특성을 가지고 있지만, 동시에 집합이 임의의 항원에 대해 개발 가능한 후보를 동정하는 데 이용될 수 있도록 집합 내에서 높은 수준의 다양성을 유지하는 생식세포 단백질 쌍의 하위 집단을 선별하는 것이 목표였다. 표 12는 본원의 구현예의 임계치를 충족한, 약 60개의 굵은 활자체의 밑줄 친 생식세포 단백질 쌍을 나타낸다. 표 12는 전체가 참조로 통합된, 제61/182,350호와 제61/299,401호의 이익을 주장하는, 제WO2010/136598호(MorphoSys AG)에 이미 개시되어 있다.
시험한 400개의 생식세포 단백질 쌍(표 12에 결과 도시) 가운데, 95개를 추가적인 시험을 위해 선별하였다. 추가적인 시험을 위해 선별된 95개의 생식세포 단백질 쌍 가운데 일부가 이전의 기준을 충족하였고 그것들을 추가적으로 시험하는 것이 바람직하였으므로, 그것들을 선택하였다. 다른 것들은 특정 임계치를 충족하지 못하였지만 선택하여, 이러한 쌍들이 재평가될 수 있도록 하였다. 도 16 내지 도 24에 도시된 95개의 생식세포 단백질 쌍을 합성하고, 발현시키고, 정제한 다음, 다음과 같은 항목에 대해 Fab 및 IgG1 포맷으로 시험하였다: a) 정제된 Fab 발현 정도(mg/L), b) 정제된 Fab 단량체 함량(단량체 %), c) 정제된 Fab 열 안정성, d) 정제된 IgG1 발현 정도(mg/L), e) 정제된 IgG1 단량체 함량(단량체 %), f) 정제된 IgG1 열 안정성, g) IgG1 등전점 및 h) 시차 주사 형광분석(DSF), 흡광도, 동적 광산란 및 입자 염색을 포함한, 산 노출과 함께 하는 IgG1 응력 시험.
일 구현예에서, 다음과 같은 생식세포 단백질 쌍(54개)이 개발 가능성과 관련된 우수한 기능적 활성을 가지고 있는 것으로 확인되었다(도 16 내지 도 24에 데이터 표시): VH1-18 (SEQ ID NO: 204)/VK1-39 (SEQ ID NO: 236); VH1-18 (SEQ ID NO: 204)/VK3-15 (SEQ ID NO: 238); VH1-18 (SEQ ID NO: 204)/VK3-20 (SEQ ID NO: 239); VH1-46 (SEQ ID NO: 205)/VK3-15 (SEQ ID NO: 238); VH1-46 (SEQ ID NO: 205)/VL1-51 (SEQ ID NO: 252); VH1-46 (SEQ ID NO: 205)/VL3-21 (SEQ ID NO: 257); VH1-69*01 (SEQ ID NO: 206)/VL1-51 (SEQ ID NO: 252); VH3-07 (SEQ ID NO: 207)/VK1-12 (SEQ ID NO: 233); VH3-07 (SEQ ID NO: 207)/VK1-16 (SEQ ID NO: 234); VH3-07 (SEQ ID NO: 207)/VK1-27 (SEQ ID NO: 235); VH3-07 (SEQ ID NO: 207)/VK1-39 (SEQ ID NO: 236); VH3-07 (SEQ ID NO: 207)/VK3-15 (SEQ ID NO: 238); VH3-07 (SEQ ID NO: 207)/VL1-47 (SEQ ID NO: 251); VH3-07 (SEQ ID NO: 207)/VL1-51 (SEQ ID NO: 252); VH3-11 (SEQ ID NO: 208)/VK1-05 (SEQ ID NO: 230); VH3-11 (SEQ ID NO: 208)/VK1-39 (SEQ ID NO: 236); VH3-11 (SEQ ID NO: 208)/VK3-15 (SEQ ID NO: 238); VH3-11 (SEQ ID NO: 208)/VL1-40 (SEQ ID NO: 250); VH3-11 (SEQ ID NO: 208)/VL1-47 (SEQ ID NO: 251); VH3-11 (SEQ ID NO: 208)/VL1-51 (SEQ ID NO: 252); VH3-11 (SEQ ID NO: 208)/VL2-23 (SEQ ID NO: 255); VH3-15 (SEQ ID NO: 209)/VK1-05 (SEQ ID NO: 230); VH3-15 (SEQ ID NO: 209)/VK1-06 (SEQ ID NO: 231); VH3-15 (SEQ ID NO: 209)/VK1-12 (SEQ ID NO: 233); VH3-15 (SEQ ID NO: 209)/VK1-16 (SEQ ID NO: 234); VH3-15 (SEQ ID NO: 209)/VK1-27 (SEQ ID NO: 235); VH3-15 (SEQ ID NO: 209)/VK3-11 (SEQ ID NO: 237); VH3-15 (SEQ ID NO: 209)/VL1-40 (SEQ ID NO: 250); VH3-15 (SEQ ID NO: 209)/VL1-47 (SEQ ID NO: 251); VH3-15 (SEQ ID NO: 209)/VL1-51 (SEQ ID NO: 252); VH3-15 (SEQ ID NO: 209)/VL2-14 (SEQ ID NO: 254); VH3-21 (SEQ ID NO: 210)/VK1-12 (SEQ ID NO: 233); VH3-21 (SEQ ID NO: 210)/VK1-27 (SEQ ID NO: 235); VH3-21 (SEQ ID NO: 210)/VL2-11 (SEQ ID NO: 253); VH3-23 (SEQ ID NO: 211)/VK1-39 (SEQ ID NO: 236); VH3-23 (SEQ ID NO: 211)/VK3-15 (SEQ ID NO: 238); VH3-23 (SEQ ID NO: 211)/VL2-23 (SEQ ID NO: 255); VH3-23 (SEQ ID NO: 211)/VL3-1 (SEQ ID NO: 256); VH3-30 (SEQ ID NO: 212)/VK3-20 (SEQ ID NO: 239); VH3-53 (SEQ ID NO: 213)/VK3-15 (SEQ ID NO: 238); VH3-53 (SEQ ID NO: 213)/VL2-11 (SEQ ID NO: 253); VH3-74 (SEQ ID NO: 214)/VK1-05 (SEQ ID NO: 230); VH3-74 (SEQ ID NO: 214)/VK1-06 (SEQ ID NO: 231); VH3-74 (SEQ ID NO: 214)/VK1-12 (SEQ ID NO: 233); VH3-74 (SEQ ID NO: 214)/VK1-27 (SEQ ID NO: 235); VH3-74 (SEQ ID NO: 214)/VK3-20 (SEQ ID NO: 239); VH3-74 (SEQ ID NO: 214)/VL1-51 (SEQ ID NO: 252); VH5-51 (SEQ ID NO: 215)/VK1-39 (SEQ ID NO: 236); VH5-51 (SEQ ID NO: 215)/VL1-40 (SEQ ID NO: 250); VH5-51 (SEQ ID NO: 215)/VL1-51 (SEQ ID NO: 252); VH6-1 (SEQ ID NO: 216)/VK1-09 (SEQ ID NO: 232); VH6-1 (SEQ ID NO: 216)/VK3-15 (SEQ ID NO: 238); VH6-1 (SEQ ID NO: 216)/VK3-20 (SEQ ID NO: 239) 및 VH6-1 (SEQ ID NO: 216)/VL1-51 (SEQ ID NO: 252). 구체적으로, 이러한 구현예에서, 생식세포 단백질 쌍(54개)는 각 기준에 대해 다음과 같은 임계치 이상의 값을 나타내었다: a) 적어도 2.5mg/L의 (실시예 9.1.1에서 기술한 바와 같은) 정제된 Fab 발현 수율; b) 적어도 30.0mg/L의 (실시예 9.2.1에서 기술한 바와 같은) 정제된 IgG1 발현 수율; c) 적어도 70℃의 (실시예 9.1.2에서 기술한 바와 같은) 정제된 Fab의 열 안정성; d) 적어도 73℃의 (실시예 9.2.2에서 기술한 바와 같은) 정제된 IgG1의 열 안정성; e) 적어도 98%의 (실시예 9.1.3에서 기술한 바와 같은) 정제된 Fab의 단량체 함량; 및 f) 적어도 99%의 (실시예 9.2.3에서 기술한 바와 같은) 정제된 IgG1의 단량체 함량. 따라서, 이러한 가변 중쇄 및 가변 경쇄 쌍을 임의의 수만큼 포함하는 집합은 임의의 항원에 대하여 개발 가능한 항체 또는 이의 단편을 동정하는 데 이용될 수 있다.
제WO2010/136598호의 표 32와 비교할 때, 표 32는 특정한 서로 다른 기능적 특성을 가지고 있는 54개 쌍 중 21개만을 보여준다.
본원의 구현예는 개발 가능성과 관련된 우수한 기능적 활성을 가지고 있는 위와 같은 생식세포 단백질 쌍의 부분집합(54개 가운데 36개)을 포함하는 집합을 포함한다. 일 구현예에서, 집합은 합성 항체 또는 이의 기능적 단편을 포함하고, 이때, 항체 또는 기능적 단편은 가변 중쇄 및 가변 경쇄 쌍을 포함하고, 가변 중쇄 및 가변 경쇄 쌍의 기본틀 영역은 가변 중쇄와 가변 경쇄 쌍의 생식세포 단백질 서열 VH1-18 (SEQ ID NO: 204)/VK3-20 (SEQ ID NO: 239); VH1-46 (SEQ ID NO: 205)/VK3-15 (SEQ ID NO: 238); VH1-46 (SEQ ID NO: 205)/VL1-51 (SEQ ID NO: 252); VH1-69*01 (SEQ ID NO: 206)/VL1-51 (SEQ ID NO: 252); VH3-07 (SEQ ID NO: 207)/VK1-12 (SEQ ID NO: 233); VH3-07 (SEQ ID NO: 207)/VK1-27 (SEQ ID NO: 235); VH3-07 (SEQ ID NO: 207)/VK3-15 (SEQ ID NO: 238); VH3-07 (SEQ ID NO: 207)/VL1-47 (SEQ ID NO: 251); VH3-07 (SEQ ID NO: 207)/VL1-51 (SEQ ID NO: 252); VH3-11 (SEQ ID NO: 208)/VL1-40 (SEQ ID NO: 250); VH3-11 (SEQ ID NO: 208)/VL1-47 (SEQ ID NO: 251); VH3-11 (SEQ ID NO: 208)/VL1-51 (SEQ ID NO: 252); VH3-11 (SEQ ID NO: 208)/VL2-23 (SEQ ID NO: 255); VH3-15 (SEQ ID NO: 209)/VK1-05 (SEQ ID NO: 230); VH3-15 (SEQ ID NO: 209)/VK1-06 (SEQ ID NO: 231); VH3-15 (SEQ ID NO: 209)/VK1-12 (SEQ ID NO: 233); VH3-15 (SEQ ID NO: 209)/VK1-27 (SEQ ID NO: 235); VH3-15 (SEQ ID NO: 209)/VK3-11 (SEQ ID NO: 237); VH3-15 (SEQ ID NO: 209)/VL1-51 (SEQ ID NO: 252); VH3-21 (SEQ ID NO: 210)/VK1-12 (SEQ ID NO: 233); VH3-23 (SEQ ID NO: 211)/VK1-39 (SEQ ID NO: 236); VH3-23 (SEQ ID NO: 211)/VK3-15 (SEQ ID NO: 238); VH3-23 (SEQ ID NO: 211)/VL2-23 (SEQ ID NO: 255); VH3-23 (SEQ ID NO: 211)/VL3-1 (SEQ ID NO: 256); VH3-53 (SEQ ID NO: 213)/VK3-15 (SEQ ID NO: 238); VH3-53 (SEQ ID NO: 213)/VL2-11 (SEQ ID NO: 253); VH3-74 (SEQ ID NO: 214)/VK1-05 (SEQ ID NO: 230); VH3-74 (SEQ ID NO: 214)/VK1-06 (SEQ ID NO: 231); VH3-74 (SEQ ID NO: 214)/VK1-12 (SEQ ID NO: 233); VH3-74 (SEQ ID NO: 214)/VK3-20 (SEQ ID NO: 239); VH5-51 (SEQ ID NO: 215)/VK1-39 (SEQ ID NO: 236); VH5-51 (SEQ ID NO: 215)/VL1-40 (SEQ ID NO: 250); VH5-51 (SEQ ID NO: 215)/VL1-51 (SEQ ID NO: 252); VH6-1 (SEQ ID NO: 216)/VK1-09 (SEQ ID NO: 232); VH6-1 (SEQ ID NO: 216)/VK3-20 (SEQ ID NO: 239) 및 VH6-1 (SEQ ID NO: 216)/VL1-51 (SEQ ID NO: 252)을 포함한다. 이러한 구현예에서, 응력 시험 데이터를 기초로 하여 54개 생식세포 단백질 쌍으로부터 부분집합(36개)의 생식세포 단백질 쌍을 선별하였다. 응력 시험 데이터는 실시예 9.2.5(a~d)에서 설명한 방법, 도 19 내지 도 24에 나타낸 데이터, 실시예 9.2.6(a~d), 도 19 내지 도 54 에 나타낸 데이터 및 실시예 9.2.7, 도 55 내지 도 60에 나타낸 점수를 이용하여 확인하였다. 응력 시험은 산 노출과 유리 구슬 교반에 견디는 능력을 확인하기 위하여 IgG1 포맷에서 95개의 생식세포 단백질 쌍을 평가하였다. 바이러스 불활성화 단계는 화학, 제조 및 품질관리(Chemistry, Manufacturing and Control)의 하류 공정(DSP)에서 일반적인 단계이므로, 산 노출에 저항하는 항체의 능력은 점차 중요해지는 요인이다. 가공 도중 여과 단계를 피할 수 없고, 주사기 바늘 또는 플라스틱 관을 통한 투여 도중 전단력이 발생하므로, 전단력에 저항하는 항체 또는 항체 단편의 능력은 도움이 되는 기준이다.
위의 부분집합인 일 구현예의 (36개) 생식세포 단백질 쌍을 선별하였는데, 이는 그것들이 54개 중 다른 쌍들보다 산과 교반 응력에 대해 더 강한 저항성을 나타내어, 이들이 개발 가능성과 관련된 추가적인 우수한 기능적 특성을 가지고 있기 때문이다. 이러한 구현예에서 선별된 36개의 생식세포 단백질 쌍은 각 기준에 대해 다음과 같은 임계치 이상의 값을 나타내었다: a) 적어도 2.5mg/L의 (실시예 9.1.1에서 기술한 바와 같은) 정제된 Fab 발현 수율; b) 적어도 30.0mg/L의 (실시예 9.2.1에서 기술한 바와 같은) 정제된 IgG1 발현 수율; c) 적어도 70℃의 (실시예 9.1.2에서 기술한 바와 같은) 정제된 Fab의 열 안정성; d) 적어도 73℃의 (실시예 9.2.2에서 기술한 바와 같은) 정제된 IgG1의 열 안정성; e) 적어도 98%의 (실시예 9.1.3에서 기술한 바와 같은) 정제된 Fab의 단량체 함량; f) 적어도 99%의 (실시예 9.2.3에서 기술한 바와 같은) 정제된 IgG1의 단량체 함량 및 g) 적어도 1225의 (실시예 9.2.7에서 기술한 바와 같은) 응력 시험 누적 점수.
제WO2010/136598호의 표 32와 비교할 때, 표 32는 특정한 서로 다른 기능적 특성을 가지고 있는 36개 쌍 중 14개만을 보여준다. 추가적으로, 제WO2010/136598호는 36쌍의 구체적인 조합을 개시하지 않았다.
다른 구현예에서, 각 기준에 대한 임계치는 다음과 같이 선정되었다: a) 적어도 2.5mg/L의 (실시예 9.1.1에서 기술한 바와 같은) 정제된 Fab 발현 수율; b) 적어도 30.0mg/L의 (실시예 9.2.1에서 기술한 바와 같은) 정제된 IgG1 발현 수율; c) 적어도 70℃의 (실시예 9.1.2에서 기술한 바와 같은) 정제된 Fab의 열 안정성; d) 적어도 73℃의 (실시예 9.2.2에서 기술한 바와 같은) 정제된 IgG1의 열 안정성; e) 적어도 99%의 (실시예 9.1.3에서 기술한 바와 같은) 정제된 Fab의 단량체 함량; f) 적어도 99%의 (실시예 9.2.3에서 기술한 바와 같은) 정제된 IgG1의 단량체 함량; g) 적어도 8.3의 (실시예 9.2.4에서 기술한 바와 같은) 정제된 IgG1의 등전점; 및 h) 적어도 1225의 (실시예 9.2.7에서 기술한 바와 같은) 응력 시험 누적 점수. 이러한 구현예에서, 집합은 (33쌍) VH1-18 (SEQ ID NO: 204)/VK3-20 (SEQ ID NO: 239); VH1-46 (SEQ ID NO: 205)/VK3-15 (SEQ ID NO: 238); VH1-46 (SEQ ID NO: 205)/VL1-51 (SEQ ID NO: 252); VH1-69*01 (SEQ ID NO: 206)/VL1-51 (SEQ ID NO: 252); VH3-07 (SEQ ID NO: 207)/VK1-12 (SEQ ID NO: 233); VH3-07 (SEQ ID NO: 207)/VK1-27 (SEQ ID NO: 235); VH3-07 (SEQ ID NO: 207)/VK3-15 (SEQ ID NO: 238); VH3-07 (SEQ ID NO: 207)/VL1-47 (SEQ ID NO: 251); VH3-07 (SEQ ID NO: 207)/VL1-51 (SEQ ID NO: 252); VH3-11 (SEQ ID NO: 208)/VL1-40 (SEQ ID NO: 250); VH3-11 (SEQ ID NO: 208)/VL1-47 (SEQ ID NO: 251); VH3-11 (SEQ ID NO: 208)/VL1-51 (SEQ ID NO: 252); VH3-11 (SEQ ID NO: 208)/VL2-23 (SEQ ID NO: 255); VH3-15 (SEQ ID NO: 209)/VK1-05 (SEQ ID NO: 230); VH3-15 (SEQ ID NO: 209)/VK1-06 (SEQ ID NO: 231); VH3-15 (SEQ ID NO: 209)/VK1-12 (SEQ ID NO: 233); VH3-15 (SEQ ID NO: 209)/VK1-27 (SEQ ID NO: 235); VH3-15 (SEQ ID NO: 209)/VK3-11 (SEQ ID NO: 237); VH3-15 (SEQ ID NO: 209)/VL1-51 (SEQ ID NO: 252); VH3-21 (SEQ ID NO: 210)/VK1-12 (SEQ ID NO: 233); VH3-23 (SEQ ID NO: 211)/VK3-15 (SEQ ID NO: 238); VH3-53 (SEQ ID NO: 213)/VK3-15 (SEQ ID NO: 238); VH3-53 (SEQ ID NO: 213)/VL2-11 (SEQ ID NO: 253); VH3-74 (SEQ ID NO: 214)/VK1-05 (SEQ ID NO: 230); VH3-74 (SEQ ID NO: 214)/VK1-06 (SEQ ID NO: 231); VH3-74 (SEQ ID NO: 214)/VK1-12 (SEQ ID NO: 233); VH3-74 (SEQ ID NO: 214)/VK3-20 (SEQ ID NO: 239); VH5-51 (SEQ ID NO: 215)/VK1-39 (SEQ ID NO: 236); VH5-51 (SEQ ID NO: 215)/VL1-40 (SEQ ID NO: 250); VH5-51 (SEQ ID NO: 215)/VL1-51 (SEQ ID NO: 252); VH6-1 (SEQ ID NO: 216)/VK1-09 (SEQ ID NO: 232); VH6-1 (SEQ ID NO: 216)/VK3-20 (SEQ ID NO: 239) 및 VH6-1 (SEQ ID NO: 216)/VL1-51 (SEQ ID NO: 252)를 포함한다.
제WO2010/136598호의 표 32와 비교할 때, 표 32는 특정한 서로 다른 기능적 특성을 가지고 있는 33개 쌍 중 14개만을 보여준다. 추가적으로, 제WO2010/136598호는 33쌍의 구체적인 조합을 개시하지 않았다.
추가적인 구현예에서, 쌍 자체가 각 기준 내의 임계치 전부를 충족하지 못했다 하더라도, 쌍을 집합에 추가하였고, 다양성을 향상시키기 위하여 집합에 추가하였다. 일 구현예에서, 집합은 VH3-23 (SEQ ID NO: 211)/VK1-39 (SEQ ID NO: 236); VH3-23 (SEQ ID NO: 211)/VL2-23 (SEQ ID NO: 255); 및 VH3-23 (SEQ ID NO: 211)/VL3-1 (SEQ ID NO: 256)을 더 포함한다. 이러한 구현예에서, 집합은 (36개 쌍) VH1-18 (SEQ ID NO: 204)/VK3-20 (SEQ ID NO: 239); VH1-46 (SEQ ID NO: 205)/VK3-15 (SEQ ID NO: 238); VH1-46 (SEQ ID NO: 205)/VL1-51 (SEQ ID NO: 252); VH1-69*01 (SEQ ID NO: 206)/VL1-51 (SEQ ID NO: 252); VH3-07 (SEQ ID NO: 207)/VK1-12 (SEQ ID NO: 233); VH3-07 (SEQ ID NO: 207)/VK1-27 (SEQ ID NO: 235); VH3-07 (SEQ ID NO: 207)/VK3-15 (SEQ ID NO: 238); VH3-07 (SEQ ID NO: 207)/VL1-47 (SEQ ID NO: 251); VH3-07 (SEQ ID NO: 207)/VL1-51 (SEQ ID NO: 252); VH3-11 (SEQ ID NO: 208)/VL1-40 (SEQ ID NO: 250); VH3-11 (SEQ ID NO: 208)/VL1-47 (SEQ ID NO: 251); VH3-11 (SEQ ID NO: 208)/VL1-51 (SEQ ID NO: 252); VH3-11 (SEQ ID NO: 208)/VL2-23 (SEQ ID NO: 255); VH3-15 (SEQ ID NO: 209)/VK1-05 (SEQ ID NO: 230); VH3-15 (SEQ ID NO: 209)/VK1-06 (SEQ ID NO: 231); VH3-15 (SEQ ID NO: 209)/VK1-12 (SEQ ID NO: 233); VH3-15 (SEQ ID NO: 209)/VK1-27 (SEQ ID NO: 235); VH3-15 (SEQ ID NO: 209)/VK3-11 (SEQ ID NO: 237); VH3-15 (SEQ ID NO: 209)/VL1-51 (SEQ ID NO: 252); VH3-21 (SEQ ID NO: 210)/VK1-12 (SEQ ID NO: 233); VH3-23 (SEQ ID NO: 211)/VK1-39 (SEQ ID NO: 236); VH3-23 (SEQ ID NO: 211)/VK3-15 (SEQ ID NO: 238); VH3-23 (SEQ ID NO: 211)/VL2-23 (SEQ ID NO: 255); VH3-23 (SEQ ID NO: 211)/VL3-1 (SEQ ID NO: 256); VH3-53 (SEQ ID NO: 213)/VK3-15 (SEQ ID NO: 238); VH3-53 (SEQ ID NO: 213)/VL2-11 (SEQ ID NO: 253); VH3-74 (SEQ ID NO: 214)/VK1-05 (SEQ ID NO: 230); VH3-74 (SEQ ID NO: 214)/VK1-06 (SEQ ID NO: 231); VH3-74 (SEQ ID NO: 214)/VK1-12 (SEQ ID NO: 233); VH3-74 (SEQ ID NO: 214)/VK3-20 (SEQ ID NO: 239); VH5-51 (SEQ ID NO: 215)/VK1-39 (SEQ ID NO: 236); VH5-51 (SEQ ID NO: 215)/VL1-40 (SEQ ID NO: 250); VH5-51 (SEQ ID NO: 215)/VL1-51 (SEQ ID NO: 252); VH6-1 (SEQ ID NO: 216)/VK1-09 (SEQ ID NO: 232); VH6-1 (SEQ ID NO: 216)/VK3-20 (SEQ ID NO: 239) 및 VH6-1 (SEQ ID NO: 216)/VL1-51 (SEQ ID NO: 252)을 포함한다.
이러한 집합은 선행 기술의 여러 가지 문제점을 극복한다. 예를 들어, B 세포로부터 유래된 집합은 유리한 생물 물리학적 성질들을 가지고 있지 않은 VH/VL 쌍을 포함하는데, 그러한 집합 내에 존재하는 VH 및 VL 쌍이 B 세포의 시료 내에 존재하는 쌍과 동일하기 때문이다. 충분히 많은 B 세포 시료가 채취된다면, 대략 50개의 VH와 50개의 VL류의 쌍 조합(2500개) 각각이 존재할 것이다. 본원의 VH 및 VL 쌍을 대상으로 한 광범위한 시험 결과, 현실적으로 존재하는, 많은 VH 및 VL의 생식세포 유전자 쌍(생식세포 단백질 쌍)은 임상에서 개발 가능성을 허락하는 성질들을 가지지 못한 것으로 나타났다. 따라서, 그러한 B 세포 라이브러리는 개발 가능성이 낮은 많은 VH 및 VL 쌍들을 포함한다. 그러므로, 유익한 기능적 특성을 가지고 있는 VH 및 VL 쌍을 포함하는 폭넓은 다양성을 나타내는 라이브러리를 생성하는 것이 바람직할 수 있으나, B 세포 집합 접근법으로는 이것은 불가능하다.
예를 들어, 본원의 일 양태는 개발 가능성을 향상시키는 유익한 성질들을 가지고 있는 가변 중쇄 및 경쇄 생식세포 단백질 쌍은 포함하나, 그러한 성질들을 가지고 있지 않은 가변 중쇄 및 경쇄 생식세포 유전자 쌍은 인간 면역 레퍼토리에 우세하게 발현되더라도 배제하는, 항체 또는 기능적 단편의 집합이다. 이런 식으로, 집합은 유익한 기능적 특성을 나타내지 못하는, (2500쌍 가운데) 현실적으로 발생하는 가변 중쇄 및 경쇄의 조합 또는 쌍을 배제하도록 설계되었다. 예를 들어, VH4-34는 표 5에 나타낸 바와 같이 인간 면역 레퍼토리에 흔히 등장하지만, 이러한 중쇄 생식세포 유전자로부터 유래된 항체는 B 세포에 세포독성을 나타낼 수 있다고도 알려져 있으므로, 이러한 유전자로부터 유래된 항체들은 집합 설계에서 배제될 수 있다. Bhat 등, Rapid cytotoxicity of human B lymphocytes induced by VH4-34 (VH4.21) gene-encoded monoclonal antibodies, Clin Exp Immunol.,105(1):183-90 (July 1996) 참조.
도 1은 실시예 1에 상세히 설명한 바와 같이, phoA와 ompA 대장균 신호 서열의 C 말단으로 도입하기 위해 선별된 제한부위를 나타내며, CDR 3 주변의 제한부위와 각각의 방향을 포함한다. 이 도면은 대장균의 신호 서열을 나타내면서, 또한 실시예 1에서 구체적으로 기술한 바와 같이, IgG1 발현에 이용하기 위한 인간 중쇄 및 카파 쇄 선도 서열에 도입하고자 선별된 C 말단 제한 부위를 나타낸다.
도 2는 실시예 4에 상세히 설명한 바와 같이, 합성, 조합 및 기능적 특성 평가를 위해 선택된 20개의 VH 생식세포 유전자를 나타낸다. 이 도면은 또한 각 생식세포 유전자의 인실리코 분석 결과를 나타내며, 이때 pI는 등전점을 나타내고, PTM은 본원에서 기술한 바와 같이, 상보성 결정 영역 내의 잠재적인 번역 후 변형 부위이며, NxS/T는 N 결합 글리코실화 부위이고, CDR 내의 Met는 메티오닌이다.
도 3은 실시예 4에 상세히 설명한 바와 같이, 합성, 조합 및 기능적 특성 평가를 위해 선택된 8개의 Vλ 및 12개의 Vκ 생식세포 유전자를 나타낸다. 이 도면은 또한 각 생식세포 유전자의 인실리코 분석 결과를 나타내며, 이때 pI는 등전점을 나타내고, PTM은 본원에서 기술한 바와 같이, 상보성 결정 영역 내의 잠재적인 번역 후 변형 부위이며, NxS/T는 N 결합 글리코실화 부위이고, CDR 내의 Met는 메티오닌이다. 여기서, VL은 Vλ를 의미한다.
도 4는 실시예 2.1 및 실시예 2.2에서 모은 데이터 중 VH/Vκ 쌍을 나타낸다. 수치 항목은 모은 데이터에서 확인된 개개의 B 세포로부터 유래된 각 VH/Vκ 생식세포 유전자 쌍의 수를 나타낸다. Y축은 모은 데이터에서 발현 빈도에 따라 위쪽의 (가장 우세한) VH3-23부터 아래쪽의 (덜 우세한) VH3-20로 순서대로 정렬시킨 VH의 생식세포 유전자를 나타낸다. X축은 모은 데이터에서 발현 빈도에 따라 좌측의 (가장 우세한) IGKV3-20부터 우측의 (덜 우세한) IGKV1D-17로 순서대로 정렬시킨 Vκ의 생식세포 유전자를 나타낸다. 숫자 1358은 추출된 B 세포의 수이다.
도 5는 실시예 2.1 및 실시예 2.2에서 모은 데이터 중 VH/Vλ 쌍을 나타낸다. 수치 항목은 모은 데이터에서 확인된 개개의 B 세포로부터 유래된 각 VH/ Vλ 생식세포 유전자 쌍의 수를 나타낸다. Y축은 모은 데이터에서 발현 빈도에 따라 위쪽의 (가장 우세한) VH3-23부터 아래쪽의 (덜 우세한) VH3-20로 순서대로 정렬시킨 VH의 생식세포 유전자를 나타낸다. X축은 모은 데이터에서 발현 빈도에 따라 좌측의 (가장 우세한) IGLV2-14부터 우측의 (덜 우세한) IGLV4-60으로 순서대로 정렬시킨 Vλ의 생식세포 유전자를 나타낸다. 숫자 779는 추출된 B 세포의 수이다.
도 6a 내지 도 6c는 Tomlinson 등(1992), "The Repertoire of Human Germline Vh Sequences Reveals about Fifty Groups of Vh Segments with Different Hypervariable Loop" J. Mol. Biol. 227, 776-798; Matsuda 등(1998), "The complete nucleotide sequence of the human immunoglobulin heavy chain variable region locus" J Exp Med 188(11):2151-62; 및 LeFranc MP(2001) "Nomenclature of the human immunoglobulin heavy (IGH) genes." Exp Clin Immunogenet. 18(2):100-16에 기술된 바와 같이, VH의 생식세포 유전자로 암호화된 아미노산 서열을 나타낸다(각각 출현 순으로, SEQ ID NO: 63~118).
도 7a 내지 도 7c는 Schable와 Zachau(1993), “The variable genes of the human immunoglobulin kappa locus,” Biol. Chem Hoppe Seyler. 374(11):1001-22; Brensing-Kuppers 등(1997), “The human immunoglobulin kappa locus on yeast artificial chromosomes (YACs)” Gene. 191(2):173-81; Kawasaki 등(2001), “Evolutionary dynamics of the human immunoglobulin kappa locus and the germline repertoire of the Vkappa genes” Eur J Immunol 31(4):1017-28; 및 Lefranc MP(2001) "Nomenclature of the human immunoglobulin kappa (IGK) genes" Exp Clin Immunogenet., 18, 161-174에 기술된 바와 같이, Vκ의 생식세포 유전자로 암호화된 아미노산 서열을 나타낸다(각각 출현 순으로, SEQ ID NO: 119~164).
도 8a 및 도 8b는 Kawasaki 등(1997) “One-Megabase Sequence Analysis of the Human immunoglobulin lambda Gene Locus” Genome Research 7(3):250-61; Frippiat 등(1995) "Organization of the human immunoglobulin lambda light-chain locus on chromosome 22q11.2" Hum. Mol. Genet., 4, 983-991; 및 LeFranc MP(2001) "Nomenclature of the human immunoglobulin lambda (IGL) genes. Exp Clin Immunogenet.;18:242-254에 기술된 바와 같이, Vλ의 생식세포 유전자로 암호화된 아미노산 서열을 나타낸다(각각 출현 순으로, SEQ ID NO: 165~202).
도 9는 pJPd1 Fab 트리시스트로닉(tricistronic) 파지 디스플레이 벡터를 나타낸다.
도 10은 pJPx1 Fab 발현 벡터를 나타낸다.
도 11은 pMx11 (pMORPHX11) Fab 발현 벡터를 나타낸다.
도 12는 pMORPH30 Fab 디스플레이 벡터를 나타낸다.
도 13은 pJP_h_IgG1f 가변 중쇄 IgG1 발현 벡터를 나타낸다.
도 14는 pJP_h_Ig_카파 가변 κ 경쇄 IgG 발현 벡터를 나타낸다.
도 15는 pJP_h_Ig_람다2 가변 λ 경쇄 IgG 발현 벡터를 나타낸다.
도 16은 실시예 9에서 기술한 바와 같이 추가로 시험한 95개의 생식세포 단백질 쌍에 대한 것으로, 이 도면은 정제된 Fab 발현 수율(mg/L, 배양물), 정제된 Fab 단량체 함량(단량체 %), 정제된 Fab 열 안정성(℃), 정제된 IgG1 발현 수율(mg/L, 세포 배양물), 정제된 IgG1 단량체 함량(단량체 %), 정제된 IgG1 열 안정성(℃)(도시된 염기 전이는 가변 도메인의 염기 전이로, Fc 도메인의 염기 전이는 미도시) 및 시험한 생식세포 단백질 쌍 1~32번의 IgG1 등전점을 나타낸다. 실시예 9.1.1~9.1.3 그리고 9.2.1~9.2.4에서 기술한 방법을 이용하여 데이터를 확인하였다. 여기서, VL은 Vλ를 의미한다.
도 17은 실시예 9에서 기술한 바와 같이 추가로 시험한 95개의 생식세포 단백질 쌍에 대한 것으로, 이 도면은 정제된 Fab 발현 수율(mg/L, 배양물), 정제된 Fab 단량체 함량(단량체 %), 정제된 Fab 열 안정성(℃), 정제된 IgG1 발현 수율(mg/L, 세포 배양물), 정제된 IgG1 단량체 함량(단량체 %), 정제된 IgG1 열 안정성(℃)(도시된 염기 전이는 가변 도메인의 염기 전이로, Fc 도메인의 염기 전이는 미도시) 및 시험한 생식세포 단백질 쌍 33~64번의 IgG1 등전점을 나타낸다. 실시예 9.1.1~9.1.3 그리고 9.2.1~9.2.4에서 기술한 방법을 이용하여 데이터를 확인하였다. 여기서, VL은 Vλ를 의미한다.
도 18은 실시예 9에서 기술한 바와 같이 추가로 시험한 95개의 생식세포 단백질 쌍에 대한 것으로, 이 도면은 정제된 Fab 발현 수율[mg(정제된 Fab)/L(배양물)], 정제된 Fab 단량체 함량(단량체 %), 정제된 Fab 열 안정성(℃), 정제된 IgG1 발현 수율[mg(정제된 IgG1)/L(세포 배양물)], 정제된 IgG1 단량체 함량(단량체 %), 정제된 IgG1 열 안정성(℃)(도시된 염기 전이는 가변 도메인의 염기 전이로, Fc 도메인의 염기 전이는 미도시) 및 시험한 생식세포 단백질 쌍 65~95번의 IgG1 등전점을 나타낸다. 실시예 9.1.1~9.1.3 그리고 9.2.1~9.2.4에서 기술한 방법을 이용하여 데이터를 확인하였다. 여기서, VL은 Vλ를 의미한다.
도 19는 실시예 9에서 기술한 바와 같이 추가로 시험한 95개의 생식세포 단백질 쌍에 대한 것으로, 이 도면은 실시예 9.2.5(a)에 기술한 바와 같이 시차 주사 형광 분석법을 이용하여 확인한, 산 노출 전과 후의 열 안정성(℃)(겉보기 Tm)(해당 겉보기 Tm은 가변 도메인의 중첩 풀림에 해당하며, Fc 도메인의 중첩 풀림 중간점은 미도시), 실시예 9.2.5(b)에 기술한 바와 같이 산 노출 전 및 산 노출 중, 그리고 중화 후의 UV 흡광도를 기초로 한 혼탁도의 상대적인 변화를 나타낸다. 도시된 데이터는 시험한 생식세포 단백질 쌍 1~32번의 데이터이다. 여기서, VL은 Vλ를 의미한다.
도 20은 실시예 9에서 기술한 바와 같이 추가로 시험한 95개의 생식세포 단백질 쌍에 대한 것으로, 이 도면은 실시예 9.2.5(c)에 기술한 바와 같이 산 노출 전과 후의 입자 반지름(nm)과 산 노출 전과 후의 다분산성, 실시예 9.2.5(d)에 기술한 바와 같이 산 노출 전과 후의 입자 염색 및 실시예 9.2.7에 기술한 바와 같은 누적 점수를 나타낸다. 도시된 데이터는 시험한 생식세포 단백질 쌍 1~32번의 데이터이다. 여기서, VL은 Vλ를 의미한다.
도 21은 실시예 9에서 기술한 바와 같이 추가로 시험한 95개의 생식세포 단백질 쌍에 대한 것으로, 이 도면은 실시예 9.2.5(a)에 기술한 바와 같이 시차 주사 형광 분석법을 이용하여 확인한, 산 노출 전과 후의 열 안정성(℃)(겉보기 Tm)(해당 겉보기 Tm은 가변 도메인의 중첩 풀림에 해당하며, Fc 도메인의 중첩 풀림 중간점은 미도시), 실시예 9.2.5(b)에 기술한 바와 같이 산 노출 전 및 산 노출 중, 그리고 중화 후의 UV 흡광도를 기초로 한 혼탁도의 상대적인 변화를 나타낸다. 도시된 데이터는 시험한 생식세포 단백질 쌍 33~64번의 데이터이다. 여기서, VL은 Vλ를 의미한다.
도 22는 실시예 9에서 기술한 바와 같이 추가로 시험한 95개의 생식세포 단백질 쌍에 대한 것으로, 이 도면은 실시예 9.2.5(c)에 기술한 바와 같이 산 노출 전과 후의 입자 반지름(nm)과 산 노출 전과 후의 다분산성, 실시예 9.2.5(d)에 기술한 바와 같이 산 노출 전과 후의 입자 염색 및 실시예 9.2.7에 기술한 바와 같은 누적 점수를 나타낸다. 도시된 데이터는 시험한 생식세포 단백질 쌍 33~64번의 데이터이다. 여기서, VL은 Vλ를 의미한다.
도 23은 실시예 9에서 기술한 바와 같이 추가로 시험한 95개의 생식세포 단백질 쌍에 대한 것으로, 이 도면은 실시예 9.2.5(a)에 기술한 바와 같이 시차 주사 형광 분석법을 이용하여 확인한, 산 노출 전과 후의 열 안정성(℃)(겉보기 Tm)(해당 겉보기 Tm은 가변 도메인의 중첩 풀림에 해당하며, Fc 도메인의 중첩 풀림 중간점은 미도시), 실시예 9.2.5(b)에 기술한 바와 같이 산 노출 전 및 산 노출 중, 그리고 중화 후의 UV 흡광도를 기초로 한 혼탁도의 상대적인 변화를 나타낸다. 도시된 데이터는 시험한 생식세포 단백질 쌍 65~95번의 데이터이다. 여기서, VL은 Vλ를 의미한다.
도 24는 실시예 9에서 기술한 바와 같이 추가로 시험한 95개의 생식세포 단백질 쌍에 대한 것으로, 이 도면은 실시예 9.2.5(c)에 기술한 바와 같이 산 노출 전과 후의 입자 반지름(nm)과 산 노출 전과 후의 다분산성, 실시예 9.2.5(d)에 기술한 바와 같이 산 노출 전과 후의 입자 염색 및 실시예 9.2.7에 기술한 바와 같은 누적 점수를 나타낸다. 도시된 데이터는 시험한 생식세포 단백질 쌍 65~95번의 데이터이다. 여기서, VL은 Vλ를 의미한다.
도 25는 VH 생식세포 단백질(각각 출현 순으로 SEQ ID NO: 204~216)과 특정 가변 중쇄의 기본틀 1 영역과 HCDR1 영역의 DNA 서열(각각 출현 순으로 SEQ ID NO: 217~229)을 나타낸다. 아미노산 서열은 본원에서 정의한 바와 같은 생식세포 단백질 서열이다. DNA 서열은 대장균 발현을 막는 희귀한 인간 코돈에 대하여 GeneArt로 코돈 최적화되었다. 도시된 생식세포 유전자는 도 6에 도시된 유전자들과 동일하지만, 집합의 구현예를 위하여 선택된 VH 생식세포 유전자만을 포함한다.
도 26은 VH 생식세포 단백질(각각 출현 순으로 SEQ ID NO: 204~216(계속))과 특정 가변 중쇄의 기본틀 2 영역과 HCDR2 영역의 DNA 서열(각각 출현 순으로 SEQ ID NO: 217~229(계속))을 나타낸다. 아미노산 서열은 본원에서 정의한 바와 같은 생식세포 단백질 서열이다. DNA 서열은 대장균 발현을 막는 희귀한 인간 코돈에 대하여 GeneArt로 코돈 최적화되었다. 도시된 생식세포 유전자는 도 6에 도시된 유전자들과 동일하지만, 집합의 구현예를 위하여 선택된 VH 생식세포 유전자만을 포함한다.
도 27은 VH 생식세포 단백질(각각 출현 순으로 SEQ ID NO: 204~216(계속))과 특정 가변 중쇄의 기본틀 3 영역의 DNA 서열(각각 출현 순으로 SEQ ID NO: 217~229(계속))을 나타낸다. 아미노산 서열은 본원에서 정의한 바와 같은 생식세포 단백질 서열이다. DNA 서열은 대장균 발현을 막는 희귀한 인간 코돈에 대하여 GeneArt로 코돈 최적화되었다. 도시된 생식세포 유전자는 도 6에 도시된 유전자들과 동일하지만, 집합의 구현예를 위하여 선택된 VH 생식세포 유전자만을 포함한다.
도 28은 Vκ 생식세포 단백질(각각 출현 순으로 SEQ ID NO: 230~239)과 특정 가변 경쇄의 기본틀 1 영역과 LCDR1 영역의 DNA 서열(각각 출현 순으로 SEQ ID NO: 240~249)을 나타낸다. 아미노산 서열은 본원에서 정의한 바와 같은 생식세포 단백질 서열이다. DNA 서열은 대장균 발현을 막는 희귀한 인간 코돈에 대하여 GeneArt로 코돈 최적화되었다. 도시된 생식세포 유전자는 도 7에 도시된 유전자들과 동일하지만, 집합의 구현예를 위하여 선택된 Vκ 생식세포 유전자만을 포함한다.
도 29는 Vκ 생식세포 단백질(각각 출현 순으로 SEQ ID NO: 230~239(계속))과 특정 가변 경쇄의 기본틀 2 영역과 LCDR2 영역의 DNA 서열(각각 출현 순으로 SEQ ID NO: 240~249(계속))을 나타낸다. 아미노산 서열은 본원에서 정의한 바와 같은 생식세포 단백질 서열이다. DNA 서열은 대장균 발현을 막는 희귀한 인간 코돈에 대하여 GeneArt로 코돈 최적화되었다. 도시된 생식세포 유전자는 도 7에 도시된 유전자들과 동일하지만, 집합의 구현예를 위하여 선택된 Vκ 생식세포 유전자만을 포함한다.
도 30은 Vκ 생식세포 단백질(각각 출현 순으로 SEQ ID NO: 230~239(계속))과 특정 가변 경쇄의 기본틀 3 영역의 DNA 서열(각각 출현 순으로 SEQ ID NO: 240~249(계속))을 나타낸다. 아미노산 서열은 본원에서 정의한 바와 같은 생식세포 단백질 서열이다. DNA 서열은 대장균 발현을 막는 희귀한 인간 코돈에 대하여 GeneArt로 코돈 최적화되었다. 도시된 생식세포 유전자는 도 7에 도시된 유전자들과 동일하지만, 집합의 구현예를 위하여 선택된 Vκ 생식세포 유전자만을 포함한다.
도 31은 Vλ 생식세포 단백질(각각 출현 순으로 SEQ ID NO: 250~257)과 특정 가변 경쇄의 기본틀 1 영역과 LCDR1 영역의 DNA 서열(각각 출현 순으로 SEQ ID NO: 258~265)을 나타낸다. 아미노산 서열은 본원에서 정의한 바와 같은 생식세포 단백질 서열이다. DNA 서열은 대장균 발현을 막는 희귀한 인간 코돈에 대하여 GeneArt로 코돈 최적화되었다. 도시된 생식세포 유전자는 도 8에 도시된 유전자들과 동일하지만, 집합의 구현예를 위하여 선택된 Vλ 생식세포 유전자만을 포함한다. 여기서, VL은 Vλ를 의미한다.
도 32는 Vλ 생식세포 단백질(각각 출현 순으로 SEQ ID NO: 250~257(계속))과 특정 가변 경쇄의 기본틀 2 영역과 LCDR2 영역의 DNA 서열(각각 출현 순으로 SEQ ID NO: 258~265(계속))을 나타낸다. 아미노산 서열은 본원에서 정의한 바와 같은 생식세포 단백질 서열이다. DNA 서열은 대장균 발현을 막는 희귀한 인간 코돈에 대하여 GeneArt로 코돈 최적화되었다. 도시된 생식세포 유전자는 도 8에 도시된 유전자들과 동일하지만, 집합의 구현예를 위하여 선택된 Vλ 생식세포 유전자만을 포함한다. 여기서, VL은 Vλ를 의미한다.
도 33은 Vλ 생식세포 단백질(각각 출현 순으로 SEQ ID NO: 250~257(계속))과 특정 가변 경쇄의 기본틀 3 영역의 DNA 서열(각각 출현 순으로 SEQ ID NO: 258~265(계속))을 나타낸다. 아미노산 서열은 본원에서 정의한 바와 같은 생식세포 단백질 서열이다. DNA 서열은 대장균 발현을 막는 희귀한 인간 코돈에 대하여 GeneArt로 코돈 최적화되었다. 도시된 생식세포 유전자는 도 8에 도시된 유전자들과 동일하지만, 집합의 구현예를 위하여 선택된 Vλ 생식세포 유전자만을 포함한다. 여기서, VL은 Vλ를 의미한다.
도 34는 VH 생식세포 단백질(각각 출현 순으로 SEQ ID NO: 266~278)과 특정 가변 중쇄의 기본틀 1 영역과 HCDR1 영역의 DNA 서열(각각 출현 순으로 SEQ ID NO: 279~291)을 나타낸다. 아미노산 서열은 HCDR1 내에서 변형되어 잠재적인 번역 후 변형 부위(PTM)가 제거되었다. DNA 서열은 대장균 발현을 막는 희귀한 인간 코돈에 대하여 GeneArt로 코돈 최적화되었다. HCDR1에서 변형된 아미노산은 밑줄을 그었고, 각 위치를 암호화하는 해당 DNA는 굵은 활자체로 표시하고 밑줄을 그었다.
도 35는 VH 생식세포 단백질(각각 출현 순으로 SEQ ID NO: 266~278(계속))과 특정 가변 중쇄의 기본틀 2 영역과 HCDR2 영역의 DNA 서열(각각 출현 순으로 SEQ ID NO: 279~291(계속))을 나타낸다. 아미노산 서열은 HCDR2 내에서 변형되어 잠재적인 번역 후 변형 부위(PTM)가 제거되었다. DNA 서열은 대장균 발현을 막는 희귀한 인간 코돈에 대하여 GeneArt로 코돈 최적화되었다. HCDR2에서 변형된 아미노산은 밑줄을 그었고, 각 위치를 암호화하는 해당 DNA는 굵은 활자체로 표시하고 밑줄을 그었다.
도 36은 VH 생식세포 단백질(각각 출현 순으로 SEQ ID NO: 266~278(계속))과 특정 가변 중쇄의 기본틀 3 영역의 DNA 서열(각각 출현 순으로 SEQ ID NO: 279~291(계속))을 나타낸다. 잠재적인 번역 후 변형 부위가 기본틀 영역 내에서 제거되지 않았으므로, 아미노산 서열은 생식세포 계열이다. DNA 서열은 대장균 발현을 막는 희귀한 인간 코돈에 대하여 GeneArt로 코돈 최적화되었다. 또한, VH1-69*01과 VH3-23은 94번 위치에서 뉴클레오티드 CGT를 가지고 있을 수 있다.
도 37은 실시예 11에서 기술한 바와 같이, 하위 집합 VH3-23/VK1-39와 VH3-23/VL3-1로부터 확인된, Dkk3에 대해 특이적인 대표 항체 또는 항체 단편을 나타낸다. 이 도면은 각 항체 또는 단편이 확인된 하위 집합, 항원, CDR-H3 및 CDR-L3의 길이, Fab 열 안정성 및 친화도, IgG1 pI, 발현 수율(mg/L), 열 안정성 및 SEC로 확인한 단량체 함량(단량체 %)을 나타낸다. 여기서, VL은 Vλ를 의미한다.
도 38은 실시예 11에서 기술한 바와 같이, 하위 집합 VH3-23/VK1-39와 VH3-23/VL3-1로부터 확인된, ErbB4/Her4_Fc에 대해 특이적인 대표 항체 또는 항체 단편을 나타낸다. 이 도면은 각 항체 또는 단편이 확인된 하위 집합, 항원, CDR-H3 및 CDR-L3의 길이, Fab 열 안정성 및 친화도, IgG1 pI, 발현 수율(mg/L), 열 안정성 및 SEC로 확인한 단량체 함량(단량체 %)을 나타낸다. 여기서, VL은 Vλ를 의미한다.
도 39는 실시예 9.1.2에서 기술한 바와 같이, 시차 주사 형광 분석법(DSF)으로 확인한, 선택된 Fab의 겉보기 온도 녹는점을 나타낸다. 각 점은 하나의 고유한 Fab를 나타낸다. 정사각형은 실시예 9에서 기술한 바와 같은 대조군 Fab를 나타낸다. 바(bar)는 중앙값을 나타낸다. 대조군은 실시예 9에서 기능적 특성을 시험한, 각각의 생식세포 단백질 쌍의 생식세포 FR 영역 및 CDR1 및 2, 그리고 Ewert 등에서의 CDR3를 포함하는 항체를 나타낸다. 선택된 Fab들은 실시예 11에서 생성되었으며, 대조군 항체와는 CDR3에서만 서열에 차이가 있다. 여기서의 근접 클러스터링은 DKK3 또는 ErbB4/Her4_Fc 항원에 대해 선택된 항체 또는 단편을 의미하는 집합의 결과물이 집합 설계 구성원들의 우수한 기능적 특성들을 유지함을 보여준다.
도 40은 본 발명 집합의 FR4 영역을 암호화하는 아미노산 서열(각각 출현 순으로 SEQ ID NO: 293, 295, 297 및 301)과 코돈 최적화된 핵산 서열(각각 출현 순으로 SEQ ID NO: 292, 294, 296, 298, 299, 300, 302 및 303)을 나타낸다.
도 41a 및 도 41b는 본 발명 집합의 IgG1f 중쇄 불변 도메인을 암호화하는 아미노산 서열(SEQ ID NO: 305)과 코돈 최적화된 핵산 서열(SEQ ID NO: 304)을 나타낸다. 도시된 핵산 서열은 코돈 최적화되었다.
도 42는 본 발명 집합의 Fab 중쇄 불변 도메인을 암호화하는 아미노산 서열(SEQ ID NO: 307)과 코돈 최적화된 핵산 서열(SEQ ID NO: 306)을 나타낸다.
도 43은 본 발명 집합의 IgG1f 및 Fab 카파 경쇄 불변 도메인을 암호화하는 아미노산 서열(각각 출현 순으로 SEQ ID NO: 309 및 311)과 코돈 최적화된 핵산 서열(각각 출현 순으로 SEQ ID NO: 308 및 310)을 나타낸다. 도시된 핵산 서열은 코돈 최적화되었다.
도 44는 본 발명 집합의 IgG1f 및 Fab 람다 경쇄 불변 도메인을 암호화하는 아미노산 서열(각각 출현 순으로 SEQ ID NO: 313 및 315)과 코돈 최적화된 핵산 서열(각각 출현 순으로 SEQ ID NO: 312 및 314)을 나타낸다.
도 45는 실시예 9.2.4에서 기술한 바와 같은 선택된 IgG들의 등전점(pI) 값을 나타낸다. 각 점은 하나의 고유한 IgG를 나타낸다. 정사각형은 실시예 9에서 기술한 바와 같은 대조군 IgG들을 나타낸다. 바는 중앙값을 나타낸다. 대조군은 실시예 9에서 기능적 특성을 시험한, 각각의 생식세포 단백질 쌍의 생식세포 FR 영역 및 CDR1 및 2, 그리고 Ewert 등에서의 CDR3를 포함하는 항체를 나타낸다. 선택된 IgG들은 실시예 11에서 생성되었으며, 대조군 항체와는 CDR3에서만 서열에 차이가 있다. 여기서의 근접 클러스터링은 DKK3 또는 ErbB4/Her4_Fc 항원에 대해 선택된 항체 또는 단편을 의미하는 집합의 결과물이 집합 설계 구성원들의 우수한 기능적 특성들을 유지함을 보여준다.
도 46은 실시예 9.2.2에서 기술한 바와 같이, 시차 주사 형광 분석법(DSF)으로 확인한, 선택된 IgG들의 겉보기 중첩 풀림 중간점을 나타낸다. 각 점은 하나의 고유한 IgG를 나타낸다. 정사각형은 실시예 9에서 기술한 바와 같은 대조군 IgG들을 나타낸다. 바는 중앙값을 나타낸다. 대조군은 실시예 9에서 기능적 특성을 시험한, 각각의 생식세포 단백질 쌍의 생식세포 FR 영역 및 CDR1 및 2, 그리고 Ewert 등에서의 CDR3를 포함하는 항체를 나타낸다. 선택된 IgG들은 실시예 11에서 생성되었으며, 대조군 항체와는 CDR3에서만 서열에 차이가 있다. 여기서의 근접 클러스터링은 DKK3 또는 ErbB4/Her4_Fc 항원에 대해 선택된 항체 또는 단편을 의미하는 집합의 결과물이 집합 설계 구성원들의 우수한 기능적 특성들을 유지함을 보여준다.
도 47은 실시예 9.2.1에서 기술한 바와 같이, UV 분광측정법으로 확인한, 선택된 IgG들의 발현 수율을 나타낸다. 각 점은 하나의 고유한 IgG를 나타낸다. 정사각형은 실시예 9에서 기술한 바와 같은 대조군 IgG들을 나타낸다. 바는 중앙값을 나타낸다. 대조군은 실시예 9에서 기능적 특성을 시험한, 각각의 생식세포 단백질 쌍의 생식세포 FR 영역 및 CDR1 및 2, 그리고 Ewert 등에서의 CDR3를 포함하는 항체를 나타낸다. 선택된 IgG들은 실시예 11에서 생성되었으며, 대조군 항체와는 CDR3에서만 서열에 차이가 있다. 여기서의 근접 클러스터링은 DKK3 또는 ErbB4/Her4_Fc 항원에 대해 선택된 항체 또는 단편을 의미하는 집합의 결과물이 집합 설계 구성원들의 우수한 기능적 특성들을 유지함을 보여준다.
도 48은 실시예 9.2.3에서 기술한 바와 같이, 크기 배제 크로마토그래피(SEC)로 확인한, 선택된 IgG들의 단량체 함량을 나타낸다. 각 점은 하나의 고유한 IgG를 나타낸다. 정사각형은 실시예 9에서 기술한 바와 같은 대조군 IgG들을 나타낸다. 바는 중앙값을 나타낸다. 대조군은 실시예 9에서 기능적 특성을 시험한, 각각의 생식세포 단백질 쌍의 생식세포 FR 영역 및 CDR1 및 2, 그리고 Ewert 등에서의 CDR3를 포함하는 항체를 나타낸다. 선택된 IgG들은 실시예 11에서 생성되었으며, 대조군 항체와는 CDR3에서만 서열에 차이가 있다. 여기서의 근접 클러스터링은 DKK3 또는 ErbB4/Her4_Fc 항원에 대해 선택된 항체 또는 단편을 의미하는 집합의 결과물이 집합 설계 구성원들의 우수한 기능적 특성들을 유지함을 보여준다. 여기서 VL은 Vλ를 의미한다.
도 49는 실시예 9에서 기술한 바와 같이, 추가로 시험한 95개의 생식세포 단백질 쌍에 대한 것으로, 이 도면은 실시예 9.2.6(a)에 기술한 바와 같이 유리 구슬로 교반하기 전과 교반하는 동안의 UV 흡광도를 기초로 한 상대적인 혼탁도 변화를 나타낸다. 도시된 데이터는 시험한 생식세포 단백질 쌍 1~32번의 데이터이다. 여기서, VL은 Vλ를 의미한다.
도 50은 실시예 9에서 기술한 바와 같이, 추가로 시험한 95개의 생식세포 단백질 쌍에 대한 것으로, 이 도면은 실시예 9.2.6(b)에 기술한 바와 같이 시차 주사 형광 분석법을 이용하여 확인한, 유리 구슬로 교반한 후의 열 안정성(℃)(겉보기 Tm)(해당 겉보기 Tm은 가변 도메인의 중첩 풀림에 해당하며, Fc 도메인의 중첩 풀림 중간점은 미도시), 유리 구슬로 교반한 후의 입자 반지름(nm), 실시예 9.2.6(c)에 기술한 바와 같이 유리 구슬로 교반한 후의 다분산성 및 9.2.6(d)에 기술한 바와 같이 유리 구슬로 교반하기 전과 후의 입자 염색을 나타낸다. 도시된 데이터는 시험한 생식세포 단백질 쌍 1~32번의 데이터이다. 여기서, VL은 Vλ를 의미한다.
도 51은 실시예 9에서 기술한 바와 같이, 추가로 시험한 95개의 생식세포 단백질 쌍에 대한 것으로, 이 도면은 실시예 9.2.6(a)에 기술한 바와 같이 응력 시험 전과 응력 시험 중의 UV 흡광도를 기초로 한 상대적인 혼탁도 변화를 나타낸다. 도시된 데이터는 시험한 생식세포 단백질 쌍 33~64번의 데이터이다. 여기서, VL은 Vλ를 의미한다.
도 52는 실시예 9에서 기술한 바와 같이, 추가로 시험한 95개의 생식세포 단백질 쌍에 대한 것으로, 이 도면은 실시예 9.2.6(b)에 기술한 바와 같이 시차 주사 형광 분석법을 이용하여 확인한, 유리 구슬로 교반한 후의 열 안정성(℃)(겉보기 Tm)(해당 겉보기 Tm은 가변 도메인의 중첩 풀림에 해당하며, Fc 도메인의 중첩 풀림 중간점은 미도시), 유리 구슬로 교반한 후의 입자 반지름(nm), 실시예 9.2.6(c)에 기술한 바와 같이 유리 구슬로 교반한 후의 다분산성 및 9.2.6(d)에 기술한 바와 같이 유리 구슬로 교반하기 전과 후의 입자 염색을 나타낸다. 도시된 데이터는 시험한 생식세포 단백질 쌍 33~64번의 데이터이다. 여기서, VL은 Vλ를 의미한다.
도 53은 실시예 9에서 기술한 바와 같이, 추가로 시험한 95개의 생식세포 단백질 쌍에 대한 것으로, 이 도면은 실시예 9.2.6(a)에 기술한 바와 같이 응력 시험 전과 응력 시험 중의 UV 흡광도를 기초로 한 상대적인 혼탁도 변화를 나타낸다. 도시된 데이터는 시험한 생식세포 단백질 쌍 65~95번의 데이터이다. 여기서, VL은 Vλ를 의미한다.
도 54는 실시예 9에서 기술한 바와 같이, 추가로 시험한 95개의 생식세포 단백질 쌍에 대한 것으로, 이 도면은 실시예 9.2.6(b)에 기술한 바와 같이 시차 주사 형광 분석법을 이용하여 확인한, 유리 구슬로 교반한 후의 열 안정성(℃)(겉보기 Tm)(해당 겉보기 Tm은 가변 도메인의 중첩 풀림에 해당하며, Fc 도메인의 중첩 풀림 중간점은 미도시), 유리 구슬로 교반한 후의 입자 반지름(nm), 실시예 9.2.6(c)에 기술한 바와 같이 유리 구슬로 교반한 후의 다분산성 및 9.2.6(d)에 기술한 바와 같이 유리 구슬로 교반하기 전과 후의 입자 염색을 나타낸다. 도시된 데이터는 시험한 생식세포 단백질 쌍 65~95번의 데이터이다. 여기서, VL은 Vλ를 의미한다.
도 55는 실시예 9.2.5~9.2.6에서 이루어진 각각의 응력 시험 실험에 대해 실시예 9.2.7에서 기술한 바와 같이 정확한 값을 확인하여, 각각의 정확한 값에 대해, 상응하는 점수를 부여한 것이다. 이 도면은 실시예 9.2.5에서 완료된 실험인 산 시험에 대해 각 값에 부여한, 0, 25, 75, 또는 100의 점수를 나타낸다. 도시된 점수는 시험한 생식세포 단백질 쌍 1~32번의 점수이다. 여기서, VL은 Vλ를 의미한다.
도 56은 실시예 9.2.5~9.2.6에서 이루어진 각각의 응력 시험 실험에 대해 실시예 9.2.7에서 기술한 바와 같이 정확한 값을 확인하여, 각각의 정확한 값에 대해, 상응하는 점수를 부여한 것이다. 이 도면은 실시예 9.2.6에서 완료된 실험인 유리 구슬에 의한 교반에 대해 각 값에 부여한, 0, 25, 75, 또는 100의 점수를 나타낸다. 또한, 이 도면은 실시예 9.2.5~9.2.6에서 이루어진 시험으로부터의 점수들을 합계하여 계산된 누적 점수를 나타낸다. 도시된 점수는 시험한 생식세포 단백질 쌍 1~32번의 점수이다. 여기서, VL은 Vλ를 의미한다.
도 57은 실시예 9.2.5~9.2.6에서 이루어진 각각의 응력 시험 실험에 대해 실시예 9.2.7에서 기술한 바와 같이 정확한 값을 확인하여, 각각의 정확한 값에 대해, 상응하는 점수를 부여한 것이다. 이 도면은 실시예 9.2.5에서 완료된 실험인 산 시험에 대해 각 값에 부여한, 0, 25, 75, 또는 100의 점수를 나타낸다. 도시된 점수는 시험한 생식세포 단백질 쌍 33~64번의 점수이다. 여기서, VL은 Vλ를 의미한다.
도 58은 실시예 9.2.5~9.2.6에서 이루어진 각각의 응력 시험 실험에 대해 실시예 9.2.7에서 기술한 바와 같이 정확한 값을 확인하여, 각각의 정확한 값에 대해, 상응하는 점수를 부여한 것이다. 이 도면은 실시예 9.2.6에서 완료된 실험인 유리 구슬에 의한 교반에 대해 각 값에 부여한, 0, 25, 75, 또는 100의 점수를 나타낸다. 또한, 이 도면은 실시예 9.2.5~9.2.6에서 이루어진 시험으로부터의 점수들을 합계하여 계산된 누적 점수를 나타낸다. 도시된 점수는 시험한 생식세포 단백질 쌍 33~64번의 점수이다. 여기서, VL은 Vλ를 의미한다.
도 59는 실시예 9.2.5~9.2.6에서 이루어진 각각의 응력 시험 실험에 대해 실시예 9.2.7에서 기술한 바와 같이 정확한 값을 확인하여, 각각의 정확한 값에 대해, 상응하는 점수를 부여한 것이다. 이 도면은 실시예 9.2.5에서 완료된 실험인 산 시험에 대해 각 값에 부여한, 0, 25, 75, 또는 100의 점수를 나타낸다. 도시된 점수는 시험한 생식세포 단백질 쌍 65~95번의 점수이다. 여기서, VL은 Vλ를 의미한다.
도 60은 실시예 9.2.5~9.2.6에서 이루어진 각각의 응력 시험 실험에 대해 실시예 9.2.7에서 기술한 바와 같이 정확한 값을 확인하여, 각각의 정확한 값에 대해, 상응하는 점수를 부여한 것이다. 이 도면은 실시예 9.2.6에서 완료된 실험인 유리 구슬에 의한 교반에 대해 각 값에 부여한, 0, 25, 75, 또는 100의 점수를 나타낸다. 또한, 이 도면은 실시예 9.2.5~9.2.6에서 이루어진 시험으로부터의 점수들을 합계하여 계산된 누적 점수를 나타낸다. 도시된 점수는 시험한 생식세포 단백질 쌍 65~95번의 점수이다. 여기서, VL은 Vλ를 의미한다.
도 61a 내지 도 61d는 본 발명 구현예의 생식세포 단백질 쌍이 파지 상에 디스플레이되어, Frizzled-4 Fc, GFP 또는 erbB4/Her4_Fc 융합에 대해 선택된 것을 나타낸다. 이 도면은 이용된 하위 집합, 선택 항원, 스크리닝된 클론의 수, ELISA 양성 적중, 고유한 항체의 수를 나타낸다. 여기서, VL은 Vλ를 의미한다.
도 62a 내지 도 62c는 실시예 11에서 기술한 바와 같이, rhErbB4/Her4_Fc 융합, rhFZD-4 Fc 융합 및 eGFP에 대해 선택된 하위 집합으로부터의 IgG들을 나타낸다. 이 도면은 각 항체가 확인된 하위 집합, 항원, CDR-H3 및 CDR-L3의 길이, IgG1 pI, IgG1 발현 수율(mg/L), IgG1 열 안정성 및 SEC로 확인한 단량체 함량(단량체 %)을 나타낸다. 여기서, VL은 Vλ를 의미한다.
도 2는 실시예 4에 상세히 설명한 바와 같이, 합성, 조합 및 기능적 특성 평가를 위해 선택된 20개의 VH 생식세포 유전자를 나타낸다. 이 도면은 또한 각 생식세포 유전자의 인실리코 분석 결과를 나타내며, 이때 pI는 등전점을 나타내고, PTM은 본원에서 기술한 바와 같이, 상보성 결정 영역 내의 잠재적인 번역 후 변형 부위이며, NxS/T는 N 결합 글리코실화 부위이고, CDR 내의 Met는 메티오닌이다.
도 3은 실시예 4에 상세히 설명한 바와 같이, 합성, 조합 및 기능적 특성 평가를 위해 선택된 8개의 Vλ 및 12개의 Vκ 생식세포 유전자를 나타낸다. 이 도면은 또한 각 생식세포 유전자의 인실리코 분석 결과를 나타내며, 이때 pI는 등전점을 나타내고, PTM은 본원에서 기술한 바와 같이, 상보성 결정 영역 내의 잠재적인 번역 후 변형 부위이며, NxS/T는 N 결합 글리코실화 부위이고, CDR 내의 Met는 메티오닌이다. 여기서, VL은 Vλ를 의미한다.
도 4는 실시예 2.1 및 실시예 2.2에서 모은 데이터 중 VH/Vκ 쌍을 나타낸다. 수치 항목은 모은 데이터에서 확인된 개개의 B 세포로부터 유래된 각 VH/Vκ 생식세포 유전자 쌍의 수를 나타낸다. Y축은 모은 데이터에서 발현 빈도에 따라 위쪽의 (가장 우세한) VH3-23부터 아래쪽의 (덜 우세한) VH3-20로 순서대로 정렬시킨 VH의 생식세포 유전자를 나타낸다. X축은 모은 데이터에서 발현 빈도에 따라 좌측의 (가장 우세한) IGKV3-20부터 우측의 (덜 우세한) IGKV1D-17로 순서대로 정렬시킨 Vκ의 생식세포 유전자를 나타낸다. 숫자 1358은 추출된 B 세포의 수이다.
도 5는 실시예 2.1 및 실시예 2.2에서 모은 데이터 중 VH/Vλ 쌍을 나타낸다. 수치 항목은 모은 데이터에서 확인된 개개의 B 세포로부터 유래된 각 VH/ Vλ 생식세포 유전자 쌍의 수를 나타낸다. Y축은 모은 데이터에서 발현 빈도에 따라 위쪽의 (가장 우세한) VH3-23부터 아래쪽의 (덜 우세한) VH3-20로 순서대로 정렬시킨 VH의 생식세포 유전자를 나타낸다. X축은 모은 데이터에서 발현 빈도에 따라 좌측의 (가장 우세한) IGLV2-14부터 우측의 (덜 우세한) IGLV4-60으로 순서대로 정렬시킨 Vλ의 생식세포 유전자를 나타낸다. 숫자 779는 추출된 B 세포의 수이다.
도 6a 내지 도 6c는 Tomlinson 등(1992), "The Repertoire of Human Germline Vh Sequences Reveals about Fifty Groups of Vh Segments with Different Hypervariable Loop" J. Mol. Biol. 227, 776-798; Matsuda 등(1998), "The complete nucleotide sequence of the human immunoglobulin heavy chain variable region locus" J Exp Med 188(11):2151-62; 및 LeFranc MP(2001) "Nomenclature of the human immunoglobulin heavy (IGH) genes." Exp Clin Immunogenet. 18(2):100-16에 기술된 바와 같이, VH의 생식세포 유전자로 암호화된 아미노산 서열을 나타낸다(각각 출현 순으로, SEQ ID NO: 63~118).
도 7a 내지 도 7c는 Schable와 Zachau(1993), “The variable genes of the human immunoglobulin kappa locus,” Biol. Chem Hoppe Seyler. 374(11):1001-22; Brensing-Kuppers 등(1997), “The human immunoglobulin kappa locus on yeast artificial chromosomes (YACs)” Gene. 191(2):173-81; Kawasaki 등(2001), “Evolutionary dynamics of the human immunoglobulin kappa locus and the germline repertoire of the Vkappa genes” Eur J Immunol 31(4):1017-28; 및 Lefranc MP(2001) "Nomenclature of the human immunoglobulin kappa (IGK) genes" Exp Clin Immunogenet., 18, 161-174에 기술된 바와 같이, Vκ의 생식세포 유전자로 암호화된 아미노산 서열을 나타낸다(각각 출현 순으로, SEQ ID NO: 119~164).
도 8a 및 도 8b는 Kawasaki 등(1997) “One-Megabase Sequence Analysis of the Human immunoglobulin lambda Gene Locus” Genome Research 7(3):250-61; Frippiat 등(1995) "Organization of the human immunoglobulin lambda light-chain locus on chromosome 22q11.2" Hum. Mol. Genet., 4, 983-991; 및 LeFranc MP(2001) "Nomenclature of the human immunoglobulin lambda (IGL) genes. Exp Clin Immunogenet.;18:242-254에 기술된 바와 같이, Vλ의 생식세포 유전자로 암호화된 아미노산 서열을 나타낸다(각각 출현 순으로, SEQ ID NO: 165~202).
도 9는 pJPd1 Fab 트리시스트로닉(tricistronic) 파지 디스플레이 벡터를 나타낸다.
도 10은 pJPx1 Fab 발현 벡터를 나타낸다.
도 11은 pMx11 (pMORPHX11) Fab 발현 벡터를 나타낸다.
도 12는 pMORPH30 Fab 디스플레이 벡터를 나타낸다.
도 13은 pJP_h_IgG1f 가변 중쇄 IgG1 발현 벡터를 나타낸다.
도 14는 pJP_h_Ig_카파 가변 κ 경쇄 IgG 발현 벡터를 나타낸다.
도 15는 pJP_h_Ig_람다2 가변 λ 경쇄 IgG 발현 벡터를 나타낸다.
도 16은 실시예 9에서 기술한 바와 같이 추가로 시험한 95개의 생식세포 단백질 쌍에 대한 것으로, 이 도면은 정제된 Fab 발현 수율(mg/L, 배양물), 정제된 Fab 단량체 함량(단량체 %), 정제된 Fab 열 안정성(℃), 정제된 IgG1 발현 수율(mg/L, 세포 배양물), 정제된 IgG1 단량체 함량(단량체 %), 정제된 IgG1 열 안정성(℃)(도시된 염기 전이는 가변 도메인의 염기 전이로, Fc 도메인의 염기 전이는 미도시) 및 시험한 생식세포 단백질 쌍 1~32번의 IgG1 등전점을 나타낸다. 실시예 9.1.1~9.1.3 그리고 9.2.1~9.2.4에서 기술한 방법을 이용하여 데이터를 확인하였다. 여기서, VL은 Vλ를 의미한다.
도 17은 실시예 9에서 기술한 바와 같이 추가로 시험한 95개의 생식세포 단백질 쌍에 대한 것으로, 이 도면은 정제된 Fab 발현 수율(mg/L, 배양물), 정제된 Fab 단량체 함량(단량체 %), 정제된 Fab 열 안정성(℃), 정제된 IgG1 발현 수율(mg/L, 세포 배양물), 정제된 IgG1 단량체 함량(단량체 %), 정제된 IgG1 열 안정성(℃)(도시된 염기 전이는 가변 도메인의 염기 전이로, Fc 도메인의 염기 전이는 미도시) 및 시험한 생식세포 단백질 쌍 33~64번의 IgG1 등전점을 나타낸다. 실시예 9.1.1~9.1.3 그리고 9.2.1~9.2.4에서 기술한 방법을 이용하여 데이터를 확인하였다. 여기서, VL은 Vλ를 의미한다.
도 18은 실시예 9에서 기술한 바와 같이 추가로 시험한 95개의 생식세포 단백질 쌍에 대한 것으로, 이 도면은 정제된 Fab 발현 수율[mg(정제된 Fab)/L(배양물)], 정제된 Fab 단량체 함량(단량체 %), 정제된 Fab 열 안정성(℃), 정제된 IgG1 발현 수율[mg(정제된 IgG1)/L(세포 배양물)], 정제된 IgG1 단량체 함량(단량체 %), 정제된 IgG1 열 안정성(℃)(도시된 염기 전이는 가변 도메인의 염기 전이로, Fc 도메인의 염기 전이는 미도시) 및 시험한 생식세포 단백질 쌍 65~95번의 IgG1 등전점을 나타낸다. 실시예 9.1.1~9.1.3 그리고 9.2.1~9.2.4에서 기술한 방법을 이용하여 데이터를 확인하였다. 여기서, VL은 Vλ를 의미한다.
도 19는 실시예 9에서 기술한 바와 같이 추가로 시험한 95개의 생식세포 단백질 쌍에 대한 것으로, 이 도면은 실시예 9.2.5(a)에 기술한 바와 같이 시차 주사 형광 분석법을 이용하여 확인한, 산 노출 전과 후의 열 안정성(℃)(겉보기 Tm)(해당 겉보기 Tm은 가변 도메인의 중첩 풀림에 해당하며, Fc 도메인의 중첩 풀림 중간점은 미도시), 실시예 9.2.5(b)에 기술한 바와 같이 산 노출 전 및 산 노출 중, 그리고 중화 후의 UV 흡광도를 기초로 한 혼탁도의 상대적인 변화를 나타낸다. 도시된 데이터는 시험한 생식세포 단백질 쌍 1~32번의 데이터이다. 여기서, VL은 Vλ를 의미한다.
도 20은 실시예 9에서 기술한 바와 같이 추가로 시험한 95개의 생식세포 단백질 쌍에 대한 것으로, 이 도면은 실시예 9.2.5(c)에 기술한 바와 같이 산 노출 전과 후의 입자 반지름(nm)과 산 노출 전과 후의 다분산성, 실시예 9.2.5(d)에 기술한 바와 같이 산 노출 전과 후의 입자 염색 및 실시예 9.2.7에 기술한 바와 같은 누적 점수를 나타낸다. 도시된 데이터는 시험한 생식세포 단백질 쌍 1~32번의 데이터이다. 여기서, VL은 Vλ를 의미한다.
도 21은 실시예 9에서 기술한 바와 같이 추가로 시험한 95개의 생식세포 단백질 쌍에 대한 것으로, 이 도면은 실시예 9.2.5(a)에 기술한 바와 같이 시차 주사 형광 분석법을 이용하여 확인한, 산 노출 전과 후의 열 안정성(℃)(겉보기 Tm)(해당 겉보기 Tm은 가변 도메인의 중첩 풀림에 해당하며, Fc 도메인의 중첩 풀림 중간점은 미도시), 실시예 9.2.5(b)에 기술한 바와 같이 산 노출 전 및 산 노출 중, 그리고 중화 후의 UV 흡광도를 기초로 한 혼탁도의 상대적인 변화를 나타낸다. 도시된 데이터는 시험한 생식세포 단백질 쌍 33~64번의 데이터이다. 여기서, VL은 Vλ를 의미한다.
도 22는 실시예 9에서 기술한 바와 같이 추가로 시험한 95개의 생식세포 단백질 쌍에 대한 것으로, 이 도면은 실시예 9.2.5(c)에 기술한 바와 같이 산 노출 전과 후의 입자 반지름(nm)과 산 노출 전과 후의 다분산성, 실시예 9.2.5(d)에 기술한 바와 같이 산 노출 전과 후의 입자 염색 및 실시예 9.2.7에 기술한 바와 같은 누적 점수를 나타낸다. 도시된 데이터는 시험한 생식세포 단백질 쌍 33~64번의 데이터이다. 여기서, VL은 Vλ를 의미한다.
도 23은 실시예 9에서 기술한 바와 같이 추가로 시험한 95개의 생식세포 단백질 쌍에 대한 것으로, 이 도면은 실시예 9.2.5(a)에 기술한 바와 같이 시차 주사 형광 분석법을 이용하여 확인한, 산 노출 전과 후의 열 안정성(℃)(겉보기 Tm)(해당 겉보기 Tm은 가변 도메인의 중첩 풀림에 해당하며, Fc 도메인의 중첩 풀림 중간점은 미도시), 실시예 9.2.5(b)에 기술한 바와 같이 산 노출 전 및 산 노출 중, 그리고 중화 후의 UV 흡광도를 기초로 한 혼탁도의 상대적인 변화를 나타낸다. 도시된 데이터는 시험한 생식세포 단백질 쌍 65~95번의 데이터이다. 여기서, VL은 Vλ를 의미한다.
도 24는 실시예 9에서 기술한 바와 같이 추가로 시험한 95개의 생식세포 단백질 쌍에 대한 것으로, 이 도면은 실시예 9.2.5(c)에 기술한 바와 같이 산 노출 전과 후의 입자 반지름(nm)과 산 노출 전과 후의 다분산성, 실시예 9.2.5(d)에 기술한 바와 같이 산 노출 전과 후의 입자 염색 및 실시예 9.2.7에 기술한 바와 같은 누적 점수를 나타낸다. 도시된 데이터는 시험한 생식세포 단백질 쌍 65~95번의 데이터이다. 여기서, VL은 Vλ를 의미한다.
도 25는 VH 생식세포 단백질(각각 출현 순으로 SEQ ID NO: 204~216)과 특정 가변 중쇄의 기본틀 1 영역과 HCDR1 영역의 DNA 서열(각각 출현 순으로 SEQ ID NO: 217~229)을 나타낸다. 아미노산 서열은 본원에서 정의한 바와 같은 생식세포 단백질 서열이다. DNA 서열은 대장균 발현을 막는 희귀한 인간 코돈에 대하여 GeneArt로 코돈 최적화되었다. 도시된 생식세포 유전자는 도 6에 도시된 유전자들과 동일하지만, 집합의 구현예를 위하여 선택된 VH 생식세포 유전자만을 포함한다.
도 26은 VH 생식세포 단백질(각각 출현 순으로 SEQ ID NO: 204~216(계속))과 특정 가변 중쇄의 기본틀 2 영역과 HCDR2 영역의 DNA 서열(각각 출현 순으로 SEQ ID NO: 217~229(계속))을 나타낸다. 아미노산 서열은 본원에서 정의한 바와 같은 생식세포 단백질 서열이다. DNA 서열은 대장균 발현을 막는 희귀한 인간 코돈에 대하여 GeneArt로 코돈 최적화되었다. 도시된 생식세포 유전자는 도 6에 도시된 유전자들과 동일하지만, 집합의 구현예를 위하여 선택된 VH 생식세포 유전자만을 포함한다.
도 27은 VH 생식세포 단백질(각각 출현 순으로 SEQ ID NO: 204~216(계속))과 특정 가변 중쇄의 기본틀 3 영역의 DNA 서열(각각 출현 순으로 SEQ ID NO: 217~229(계속))을 나타낸다. 아미노산 서열은 본원에서 정의한 바와 같은 생식세포 단백질 서열이다. DNA 서열은 대장균 발현을 막는 희귀한 인간 코돈에 대하여 GeneArt로 코돈 최적화되었다. 도시된 생식세포 유전자는 도 6에 도시된 유전자들과 동일하지만, 집합의 구현예를 위하여 선택된 VH 생식세포 유전자만을 포함한다.
도 28은 Vκ 생식세포 단백질(각각 출현 순으로 SEQ ID NO: 230~239)과 특정 가변 경쇄의 기본틀 1 영역과 LCDR1 영역의 DNA 서열(각각 출현 순으로 SEQ ID NO: 240~249)을 나타낸다. 아미노산 서열은 본원에서 정의한 바와 같은 생식세포 단백질 서열이다. DNA 서열은 대장균 발현을 막는 희귀한 인간 코돈에 대하여 GeneArt로 코돈 최적화되었다. 도시된 생식세포 유전자는 도 7에 도시된 유전자들과 동일하지만, 집합의 구현예를 위하여 선택된 Vκ 생식세포 유전자만을 포함한다.
도 29는 Vκ 생식세포 단백질(각각 출현 순으로 SEQ ID NO: 230~239(계속))과 특정 가변 경쇄의 기본틀 2 영역과 LCDR2 영역의 DNA 서열(각각 출현 순으로 SEQ ID NO: 240~249(계속))을 나타낸다. 아미노산 서열은 본원에서 정의한 바와 같은 생식세포 단백질 서열이다. DNA 서열은 대장균 발현을 막는 희귀한 인간 코돈에 대하여 GeneArt로 코돈 최적화되었다. 도시된 생식세포 유전자는 도 7에 도시된 유전자들과 동일하지만, 집합의 구현예를 위하여 선택된 Vκ 생식세포 유전자만을 포함한다.
도 30은 Vκ 생식세포 단백질(각각 출현 순으로 SEQ ID NO: 230~239(계속))과 특정 가변 경쇄의 기본틀 3 영역의 DNA 서열(각각 출현 순으로 SEQ ID NO: 240~249(계속))을 나타낸다. 아미노산 서열은 본원에서 정의한 바와 같은 생식세포 단백질 서열이다. DNA 서열은 대장균 발현을 막는 희귀한 인간 코돈에 대하여 GeneArt로 코돈 최적화되었다. 도시된 생식세포 유전자는 도 7에 도시된 유전자들과 동일하지만, 집합의 구현예를 위하여 선택된 Vκ 생식세포 유전자만을 포함한다.
도 31은 Vλ 생식세포 단백질(각각 출현 순으로 SEQ ID NO: 250~257)과 특정 가변 경쇄의 기본틀 1 영역과 LCDR1 영역의 DNA 서열(각각 출현 순으로 SEQ ID NO: 258~265)을 나타낸다. 아미노산 서열은 본원에서 정의한 바와 같은 생식세포 단백질 서열이다. DNA 서열은 대장균 발현을 막는 희귀한 인간 코돈에 대하여 GeneArt로 코돈 최적화되었다. 도시된 생식세포 유전자는 도 8에 도시된 유전자들과 동일하지만, 집합의 구현예를 위하여 선택된 Vλ 생식세포 유전자만을 포함한다. 여기서, VL은 Vλ를 의미한다.
도 32는 Vλ 생식세포 단백질(각각 출현 순으로 SEQ ID NO: 250~257(계속))과 특정 가변 경쇄의 기본틀 2 영역과 LCDR2 영역의 DNA 서열(각각 출현 순으로 SEQ ID NO: 258~265(계속))을 나타낸다. 아미노산 서열은 본원에서 정의한 바와 같은 생식세포 단백질 서열이다. DNA 서열은 대장균 발현을 막는 희귀한 인간 코돈에 대하여 GeneArt로 코돈 최적화되었다. 도시된 생식세포 유전자는 도 8에 도시된 유전자들과 동일하지만, 집합의 구현예를 위하여 선택된 Vλ 생식세포 유전자만을 포함한다. 여기서, VL은 Vλ를 의미한다.
도 33은 Vλ 생식세포 단백질(각각 출현 순으로 SEQ ID NO: 250~257(계속))과 특정 가변 경쇄의 기본틀 3 영역의 DNA 서열(각각 출현 순으로 SEQ ID NO: 258~265(계속))을 나타낸다. 아미노산 서열은 본원에서 정의한 바와 같은 생식세포 단백질 서열이다. DNA 서열은 대장균 발현을 막는 희귀한 인간 코돈에 대하여 GeneArt로 코돈 최적화되었다. 도시된 생식세포 유전자는 도 8에 도시된 유전자들과 동일하지만, 집합의 구현예를 위하여 선택된 Vλ 생식세포 유전자만을 포함한다. 여기서, VL은 Vλ를 의미한다.
도 34는 VH 생식세포 단백질(각각 출현 순으로 SEQ ID NO: 266~278)과 특정 가변 중쇄의 기본틀 1 영역과 HCDR1 영역의 DNA 서열(각각 출현 순으로 SEQ ID NO: 279~291)을 나타낸다. 아미노산 서열은 HCDR1 내에서 변형되어 잠재적인 번역 후 변형 부위(PTM)가 제거되었다. DNA 서열은 대장균 발현을 막는 희귀한 인간 코돈에 대하여 GeneArt로 코돈 최적화되었다. HCDR1에서 변형된 아미노산은 밑줄을 그었고, 각 위치를 암호화하는 해당 DNA는 굵은 활자체로 표시하고 밑줄을 그었다.
도 35는 VH 생식세포 단백질(각각 출현 순으로 SEQ ID NO: 266~278(계속))과 특정 가변 중쇄의 기본틀 2 영역과 HCDR2 영역의 DNA 서열(각각 출현 순으로 SEQ ID NO: 279~291(계속))을 나타낸다. 아미노산 서열은 HCDR2 내에서 변형되어 잠재적인 번역 후 변형 부위(PTM)가 제거되었다. DNA 서열은 대장균 발현을 막는 희귀한 인간 코돈에 대하여 GeneArt로 코돈 최적화되었다. HCDR2에서 변형된 아미노산은 밑줄을 그었고, 각 위치를 암호화하는 해당 DNA는 굵은 활자체로 표시하고 밑줄을 그었다.
도 36은 VH 생식세포 단백질(각각 출현 순으로 SEQ ID NO: 266~278(계속))과 특정 가변 중쇄의 기본틀 3 영역의 DNA 서열(각각 출현 순으로 SEQ ID NO: 279~291(계속))을 나타낸다. 잠재적인 번역 후 변형 부위가 기본틀 영역 내에서 제거되지 않았으므로, 아미노산 서열은 생식세포 계열이다. DNA 서열은 대장균 발현을 막는 희귀한 인간 코돈에 대하여 GeneArt로 코돈 최적화되었다. 또한, VH1-69*01과 VH3-23은 94번 위치에서 뉴클레오티드 CGT를 가지고 있을 수 있다.
도 37은 실시예 11에서 기술한 바와 같이, 하위 집합 VH3-23/VK1-39와 VH3-23/VL3-1로부터 확인된, Dkk3에 대해 특이적인 대표 항체 또는 항체 단편을 나타낸다. 이 도면은 각 항체 또는 단편이 확인된 하위 집합, 항원, CDR-H3 및 CDR-L3의 길이, Fab 열 안정성 및 친화도, IgG1 pI, 발현 수율(mg/L), 열 안정성 및 SEC로 확인한 단량체 함량(단량체 %)을 나타낸다. 여기서, VL은 Vλ를 의미한다.
도 38은 실시예 11에서 기술한 바와 같이, 하위 집합 VH3-23/VK1-39와 VH3-23/VL3-1로부터 확인된, ErbB4/Her4_Fc에 대해 특이적인 대표 항체 또는 항체 단편을 나타낸다. 이 도면은 각 항체 또는 단편이 확인된 하위 집합, 항원, CDR-H3 및 CDR-L3의 길이, Fab 열 안정성 및 친화도, IgG1 pI, 발현 수율(mg/L), 열 안정성 및 SEC로 확인한 단량체 함량(단량체 %)을 나타낸다. 여기서, VL은 Vλ를 의미한다.
도 39는 실시예 9.1.2에서 기술한 바와 같이, 시차 주사 형광 분석법(DSF)으로 확인한, 선택된 Fab의 겉보기 온도 녹는점을 나타낸다. 각 점은 하나의 고유한 Fab를 나타낸다. 정사각형은 실시예 9에서 기술한 바와 같은 대조군 Fab를 나타낸다. 바(bar)는 중앙값을 나타낸다. 대조군은 실시예 9에서 기능적 특성을 시험한, 각각의 생식세포 단백질 쌍의 생식세포 FR 영역 및 CDR1 및 2, 그리고 Ewert 등에서의 CDR3를 포함하는 항체를 나타낸다. 선택된 Fab들은 실시예 11에서 생성되었으며, 대조군 항체와는 CDR3에서만 서열에 차이가 있다. 여기서의 근접 클러스터링은 DKK3 또는 ErbB4/Her4_Fc 항원에 대해 선택된 항체 또는 단편을 의미하는 집합의 결과물이 집합 설계 구성원들의 우수한 기능적 특성들을 유지함을 보여준다.
도 40은 본 발명 집합의 FR4 영역을 암호화하는 아미노산 서열(각각 출현 순으로 SEQ ID NO: 293, 295, 297 및 301)과 코돈 최적화된 핵산 서열(각각 출현 순으로 SEQ ID NO: 292, 294, 296, 298, 299, 300, 302 및 303)을 나타낸다.
도 41a 및 도 41b는 본 발명 집합의 IgG1f 중쇄 불변 도메인을 암호화하는 아미노산 서열(SEQ ID NO: 305)과 코돈 최적화된 핵산 서열(SEQ ID NO: 304)을 나타낸다. 도시된 핵산 서열은 코돈 최적화되었다.
도 42는 본 발명 집합의 Fab 중쇄 불변 도메인을 암호화하는 아미노산 서열(SEQ ID NO: 307)과 코돈 최적화된 핵산 서열(SEQ ID NO: 306)을 나타낸다.
도 43은 본 발명 집합의 IgG1f 및 Fab 카파 경쇄 불변 도메인을 암호화하는 아미노산 서열(각각 출현 순으로 SEQ ID NO: 309 및 311)과 코돈 최적화된 핵산 서열(각각 출현 순으로 SEQ ID NO: 308 및 310)을 나타낸다. 도시된 핵산 서열은 코돈 최적화되었다.
도 44는 본 발명 집합의 IgG1f 및 Fab 람다 경쇄 불변 도메인을 암호화하는 아미노산 서열(각각 출현 순으로 SEQ ID NO: 313 및 315)과 코돈 최적화된 핵산 서열(각각 출현 순으로 SEQ ID NO: 312 및 314)을 나타낸다.
도 45는 실시예 9.2.4에서 기술한 바와 같은 선택된 IgG들의 등전점(pI) 값을 나타낸다. 각 점은 하나의 고유한 IgG를 나타낸다. 정사각형은 실시예 9에서 기술한 바와 같은 대조군 IgG들을 나타낸다. 바는 중앙값을 나타낸다. 대조군은 실시예 9에서 기능적 특성을 시험한, 각각의 생식세포 단백질 쌍의 생식세포 FR 영역 및 CDR1 및 2, 그리고 Ewert 등에서의 CDR3를 포함하는 항체를 나타낸다. 선택된 IgG들은 실시예 11에서 생성되었으며, 대조군 항체와는 CDR3에서만 서열에 차이가 있다. 여기서의 근접 클러스터링은 DKK3 또는 ErbB4/Her4_Fc 항원에 대해 선택된 항체 또는 단편을 의미하는 집합의 결과물이 집합 설계 구성원들의 우수한 기능적 특성들을 유지함을 보여준다.
도 46은 실시예 9.2.2에서 기술한 바와 같이, 시차 주사 형광 분석법(DSF)으로 확인한, 선택된 IgG들의 겉보기 중첩 풀림 중간점을 나타낸다. 각 점은 하나의 고유한 IgG를 나타낸다. 정사각형은 실시예 9에서 기술한 바와 같은 대조군 IgG들을 나타낸다. 바는 중앙값을 나타낸다. 대조군은 실시예 9에서 기능적 특성을 시험한, 각각의 생식세포 단백질 쌍의 생식세포 FR 영역 및 CDR1 및 2, 그리고 Ewert 등에서의 CDR3를 포함하는 항체를 나타낸다. 선택된 IgG들은 실시예 11에서 생성되었으며, 대조군 항체와는 CDR3에서만 서열에 차이가 있다. 여기서의 근접 클러스터링은 DKK3 또는 ErbB4/Her4_Fc 항원에 대해 선택된 항체 또는 단편을 의미하는 집합의 결과물이 집합 설계 구성원들의 우수한 기능적 특성들을 유지함을 보여준다.
도 47은 실시예 9.2.1에서 기술한 바와 같이, UV 분광측정법으로 확인한, 선택된 IgG들의 발현 수율을 나타낸다. 각 점은 하나의 고유한 IgG를 나타낸다. 정사각형은 실시예 9에서 기술한 바와 같은 대조군 IgG들을 나타낸다. 바는 중앙값을 나타낸다. 대조군은 실시예 9에서 기능적 특성을 시험한, 각각의 생식세포 단백질 쌍의 생식세포 FR 영역 및 CDR1 및 2, 그리고 Ewert 등에서의 CDR3를 포함하는 항체를 나타낸다. 선택된 IgG들은 실시예 11에서 생성되었으며, 대조군 항체와는 CDR3에서만 서열에 차이가 있다. 여기서의 근접 클러스터링은 DKK3 또는 ErbB4/Her4_Fc 항원에 대해 선택된 항체 또는 단편을 의미하는 집합의 결과물이 집합 설계 구성원들의 우수한 기능적 특성들을 유지함을 보여준다.
도 48은 실시예 9.2.3에서 기술한 바와 같이, 크기 배제 크로마토그래피(SEC)로 확인한, 선택된 IgG들의 단량체 함량을 나타낸다. 각 점은 하나의 고유한 IgG를 나타낸다. 정사각형은 실시예 9에서 기술한 바와 같은 대조군 IgG들을 나타낸다. 바는 중앙값을 나타낸다. 대조군은 실시예 9에서 기능적 특성을 시험한, 각각의 생식세포 단백질 쌍의 생식세포 FR 영역 및 CDR1 및 2, 그리고 Ewert 등에서의 CDR3를 포함하는 항체를 나타낸다. 선택된 IgG들은 실시예 11에서 생성되었으며, 대조군 항체와는 CDR3에서만 서열에 차이가 있다. 여기서의 근접 클러스터링은 DKK3 또는 ErbB4/Her4_Fc 항원에 대해 선택된 항체 또는 단편을 의미하는 집합의 결과물이 집합 설계 구성원들의 우수한 기능적 특성들을 유지함을 보여준다. 여기서 VL은 Vλ를 의미한다.
도 49는 실시예 9에서 기술한 바와 같이, 추가로 시험한 95개의 생식세포 단백질 쌍에 대한 것으로, 이 도면은 실시예 9.2.6(a)에 기술한 바와 같이 유리 구슬로 교반하기 전과 교반하는 동안의 UV 흡광도를 기초로 한 상대적인 혼탁도 변화를 나타낸다. 도시된 데이터는 시험한 생식세포 단백질 쌍 1~32번의 데이터이다. 여기서, VL은 Vλ를 의미한다.
도 50은 실시예 9에서 기술한 바와 같이, 추가로 시험한 95개의 생식세포 단백질 쌍에 대한 것으로, 이 도면은 실시예 9.2.6(b)에 기술한 바와 같이 시차 주사 형광 분석법을 이용하여 확인한, 유리 구슬로 교반한 후의 열 안정성(℃)(겉보기 Tm)(해당 겉보기 Tm은 가변 도메인의 중첩 풀림에 해당하며, Fc 도메인의 중첩 풀림 중간점은 미도시), 유리 구슬로 교반한 후의 입자 반지름(nm), 실시예 9.2.6(c)에 기술한 바와 같이 유리 구슬로 교반한 후의 다분산성 및 9.2.6(d)에 기술한 바와 같이 유리 구슬로 교반하기 전과 후의 입자 염색을 나타낸다. 도시된 데이터는 시험한 생식세포 단백질 쌍 1~32번의 데이터이다. 여기서, VL은 Vλ를 의미한다.
도 51은 실시예 9에서 기술한 바와 같이, 추가로 시험한 95개의 생식세포 단백질 쌍에 대한 것으로, 이 도면은 실시예 9.2.6(a)에 기술한 바와 같이 응력 시험 전과 응력 시험 중의 UV 흡광도를 기초로 한 상대적인 혼탁도 변화를 나타낸다. 도시된 데이터는 시험한 생식세포 단백질 쌍 33~64번의 데이터이다. 여기서, VL은 Vλ를 의미한다.
도 52는 실시예 9에서 기술한 바와 같이, 추가로 시험한 95개의 생식세포 단백질 쌍에 대한 것으로, 이 도면은 실시예 9.2.6(b)에 기술한 바와 같이 시차 주사 형광 분석법을 이용하여 확인한, 유리 구슬로 교반한 후의 열 안정성(℃)(겉보기 Tm)(해당 겉보기 Tm은 가변 도메인의 중첩 풀림에 해당하며, Fc 도메인의 중첩 풀림 중간점은 미도시), 유리 구슬로 교반한 후의 입자 반지름(nm), 실시예 9.2.6(c)에 기술한 바와 같이 유리 구슬로 교반한 후의 다분산성 및 9.2.6(d)에 기술한 바와 같이 유리 구슬로 교반하기 전과 후의 입자 염색을 나타낸다. 도시된 데이터는 시험한 생식세포 단백질 쌍 33~64번의 데이터이다. 여기서, VL은 Vλ를 의미한다.
도 53은 실시예 9에서 기술한 바와 같이, 추가로 시험한 95개의 생식세포 단백질 쌍에 대한 것으로, 이 도면은 실시예 9.2.6(a)에 기술한 바와 같이 응력 시험 전과 응력 시험 중의 UV 흡광도를 기초로 한 상대적인 혼탁도 변화를 나타낸다. 도시된 데이터는 시험한 생식세포 단백질 쌍 65~95번의 데이터이다. 여기서, VL은 Vλ를 의미한다.
도 54는 실시예 9에서 기술한 바와 같이, 추가로 시험한 95개의 생식세포 단백질 쌍에 대한 것으로, 이 도면은 실시예 9.2.6(b)에 기술한 바와 같이 시차 주사 형광 분석법을 이용하여 확인한, 유리 구슬로 교반한 후의 열 안정성(℃)(겉보기 Tm)(해당 겉보기 Tm은 가변 도메인의 중첩 풀림에 해당하며, Fc 도메인의 중첩 풀림 중간점은 미도시), 유리 구슬로 교반한 후의 입자 반지름(nm), 실시예 9.2.6(c)에 기술한 바와 같이 유리 구슬로 교반한 후의 다분산성 및 9.2.6(d)에 기술한 바와 같이 유리 구슬로 교반하기 전과 후의 입자 염색을 나타낸다. 도시된 데이터는 시험한 생식세포 단백질 쌍 65~95번의 데이터이다. 여기서, VL은 Vλ를 의미한다.
도 55는 실시예 9.2.5~9.2.6에서 이루어진 각각의 응력 시험 실험에 대해 실시예 9.2.7에서 기술한 바와 같이 정확한 값을 확인하여, 각각의 정확한 값에 대해, 상응하는 점수를 부여한 것이다. 이 도면은 실시예 9.2.5에서 완료된 실험인 산 시험에 대해 각 값에 부여한, 0, 25, 75, 또는 100의 점수를 나타낸다. 도시된 점수는 시험한 생식세포 단백질 쌍 1~32번의 점수이다. 여기서, VL은 Vλ를 의미한다.
도 56은 실시예 9.2.5~9.2.6에서 이루어진 각각의 응력 시험 실험에 대해 실시예 9.2.7에서 기술한 바와 같이 정확한 값을 확인하여, 각각의 정확한 값에 대해, 상응하는 점수를 부여한 것이다. 이 도면은 실시예 9.2.6에서 완료된 실험인 유리 구슬에 의한 교반에 대해 각 값에 부여한, 0, 25, 75, 또는 100의 점수를 나타낸다. 또한, 이 도면은 실시예 9.2.5~9.2.6에서 이루어진 시험으로부터의 점수들을 합계하여 계산된 누적 점수를 나타낸다. 도시된 점수는 시험한 생식세포 단백질 쌍 1~32번의 점수이다. 여기서, VL은 Vλ를 의미한다.
도 57은 실시예 9.2.5~9.2.6에서 이루어진 각각의 응력 시험 실험에 대해 실시예 9.2.7에서 기술한 바와 같이 정확한 값을 확인하여, 각각의 정확한 값에 대해, 상응하는 점수를 부여한 것이다. 이 도면은 실시예 9.2.5에서 완료된 실험인 산 시험에 대해 각 값에 부여한, 0, 25, 75, 또는 100의 점수를 나타낸다. 도시된 점수는 시험한 생식세포 단백질 쌍 33~64번의 점수이다. 여기서, VL은 Vλ를 의미한다.
도 58은 실시예 9.2.5~9.2.6에서 이루어진 각각의 응력 시험 실험에 대해 실시예 9.2.7에서 기술한 바와 같이 정확한 값을 확인하여, 각각의 정확한 값에 대해, 상응하는 점수를 부여한 것이다. 이 도면은 실시예 9.2.6에서 완료된 실험인 유리 구슬에 의한 교반에 대해 각 값에 부여한, 0, 25, 75, 또는 100의 점수를 나타낸다. 또한, 이 도면은 실시예 9.2.5~9.2.6에서 이루어진 시험으로부터의 점수들을 합계하여 계산된 누적 점수를 나타낸다. 도시된 점수는 시험한 생식세포 단백질 쌍 33~64번의 점수이다. 여기서, VL은 Vλ를 의미한다.
도 59는 실시예 9.2.5~9.2.6에서 이루어진 각각의 응력 시험 실험에 대해 실시예 9.2.7에서 기술한 바와 같이 정확한 값을 확인하여, 각각의 정확한 값에 대해, 상응하는 점수를 부여한 것이다. 이 도면은 실시예 9.2.5에서 완료된 실험인 산 시험에 대해 각 값에 부여한, 0, 25, 75, 또는 100의 점수를 나타낸다. 도시된 점수는 시험한 생식세포 단백질 쌍 65~95번의 점수이다. 여기서, VL은 Vλ를 의미한다.
도 60은 실시예 9.2.5~9.2.6에서 이루어진 각각의 응력 시험 실험에 대해 실시예 9.2.7에서 기술한 바와 같이 정확한 값을 확인하여, 각각의 정확한 값에 대해, 상응하는 점수를 부여한 것이다. 이 도면은 실시예 9.2.6에서 완료된 실험인 유리 구슬에 의한 교반에 대해 각 값에 부여한, 0, 25, 75, 또는 100의 점수를 나타낸다. 또한, 이 도면은 실시예 9.2.5~9.2.6에서 이루어진 시험으로부터의 점수들을 합계하여 계산된 누적 점수를 나타낸다. 도시된 점수는 시험한 생식세포 단백질 쌍 65~95번의 점수이다. 여기서, VL은 Vλ를 의미한다.
도 61a 내지 도 61d는 본 발명 구현예의 생식세포 단백질 쌍이 파지 상에 디스플레이되어, Frizzled-4 Fc, GFP 또는 erbB4/Her4_Fc 융합에 대해 선택된 것을 나타낸다. 이 도면은 이용된 하위 집합, 선택 항원, 스크리닝된 클론의 수, ELISA 양성 적중, 고유한 항체의 수를 나타낸다. 여기서, VL은 Vλ를 의미한다.
도 62a 내지 도 62c는 실시예 11에서 기술한 바와 같이, rhErbB4/Her4_Fc 융합, rhFZD-4 Fc 융합 및 eGFP에 대해 선택된 하위 집합으로부터의 IgG들을 나타낸다. 이 도면은 각 항체가 확인된 하위 집합, 항원, CDR-H3 및 CDR-L3의 길이, IgG1 pI, IgG1 발현 수율(mg/L), IgG1 열 안정성 및 SEC로 확인한 단량체 함량(단량체 %)을 나타낸다. 여기서, VL은 Vλ를 의미한다.
정의
본 발명의 이해를 촉진하기 위하여, 다음과 같은 정의 및 예시가 제공된다.
본원에 사용된 “데이터베이스 또는 판독 가능한 매체”는 서열 데이터와데이터베이스 파일, 룩업 테이블, 엑셀 시트 등과 같은 임의의 정보 집합을 저장하기 위한 임의의 포맷을 지칭한다. 특정 구현예에서, 데이터베이스는 컴퓨터가 판독할 수 있는 메모리 장치와 같은 전자식 형태로 저장된다. 이것은 서버, 클라이언트, 하드디스크, CD, DVD, 팜 파일럿(Palm Pilot)과 같은 개인용 디지털 보조장치, 테이프, 집디스크(zip disk), 컴퓨터의 내부 롬(ROM)(읽기 전용 기억 장치) 또는 인터넷 또는 월드와이드웹과 같은 매체를 포함한다. 기타 컴퓨터가 접근할 수 있는 파일의 저장용 매체는 당해 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 자명할 것이다.
“인실리코(In silico)”는 컴퓨터 상에서 수행된 조작, 분석 및 설계를 지칭하지만, 이는 종이 위에서 또는 마음 속으로도 비슷하게 수행될 수 있다.
본원에 사용된 용어 “항체”는 온전한 항체를 포함한다. 항체는 다클론성, 친화도-정제 다클론성, 단일클론성, 인간, 쥐 또는 설치류, 키메라, 카멜리드 또는 인간화 항체일 수 있다. 항체는 IgG, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA(인간 하위 부류 IgA1 및 IgA2를 포함), IgD, IgE, 또는 IgM과 같은 항체류 중 임의의 부류에 속할 수 있다. “항체”는 이황화 결합으로 서로 연결된 적어도 2개의 중(H)쇄 및 2개의 경(L)쇄를 포함하는 단백질이다.
본원에 사용된 용어 항체 “단편” 또는 “기능적 단편”은 Fab, F(ab')2, Fab’, Fv, scFv, Fc 부분을 포함하는 단일 사슬, 나노바디 및 가변 기본틀 영역 이외의 스캐폴드를 가지고 있는 기타 항체 유사 구조물과 같은 임의의 항원 결합 단편을 포함한다. 용어 “기능적 단편”은 관심 있는 항원에 결합하는 능력을 보유하는 항체의 임의의 부분을 포함하나 이에 한정되지 않는다.
본원에 사용된 용어 “친화도”는 항원 부위에서 항체와 항원 사이의 상호 작용 강도를 지칭한다. 각 항원 부위 내에서, 항체의 가변 영역은 다양한 부위에서 비-공유적 힘을 통해 항원과 상호 작용하고, 상호 작용이 많을수록 친화도가 강하다. 본원에서 사용된 용어 IgG 항체와 같은 항체 또는 항체의 기능적 단편에 대한 “고 친화도”는 목표 항원에 대하여 10-8M 이하, 10-9M 이하, 10-10M 이하, 또는 10-11M 이하, 또는 10-12M 이하의 KD를 나타내는 항체를 지칭한다. 그러나 “고 친화도” 결합은 다른 항체 이소형(isotype)에 따라 달라질 수 있다. 예를 들어, IgM 이소형에 대한 “고 친화도” 결합은 10-7M 이하 또는 10-8M 이하를 나타내는 항체를 지칭한다.
본원에 사용된 용어 “Kassoc” 또는 “Ka”는 특정 항체-항원 상호 작용의 결합 속도 상수를 지칭하고자 의도한 것이고, 본원에 사용된 용어 “Kdis” 또는 “Kd”는 특정 항체-항원 상호 작용의 해리 속도 상수를 지칭하고자 의도한 것이다. 본원에 사용된 용어 “KD”는 Kd 대 Ka의 비(즉, Kd/Ka)로부터 얻어지고, 몰농도(M)로 표현되는, 평형 해리 상수를 지칭하고자 의도한 것이다. 항체에 대한 KD 값은 당해 분야에 잘 알려진 방법을 이용하여 확인할 수 있다. 항체의 KD를 확인하는 방법은 표면 플라스몬 공명을 이용하거나, Biacore® 시스템과 같은 바이오센서 시스템을 이용하는 것이다.
용어 “키메라 항체”는 항체 분자의 불변 영역 또는 이의 일부분이 변형, 대체 또는 교체되어 항원 결합 부위(가변 영역)가 상이하거나 변형된 부류, 효과인자 기능 및/또는 종의 불변 영역에 결합되는, 항체 분자이다.
용어 “이소형”은 중쇄 불변 영역 유전자에 의해 제공되는 항체류(예컨대, IgM, IgE, 예를 들어, IgG1, IgG2 또는 IgG4와 같은 IgG)를 지칭한다. 또한, 이소형은 이러한 부류 중 하나의 변형된 버전을 포함하며, 여기서 Fc 기능을 변형하도록, 예를 들어 효과 인자 기능 또는 Fc 수용체에 대한 결합을 향상시키거나 감소시키도록 변형이 이루어진다.
용어 “생식세포”는 어버이로부터 자손에 전해지는 항체 또는 이의 기능적 단편을 암호화하는 핵산 서열을 의미한다.
용어 “생식세포 단백질 서열” 또는 “생식세포 아미노산 서열”은 a) 생식세포 유전자에 의해 암호화된 항체 또는 이의 기능적 단편의 가변 영역의 아미노산 서열, b) 생식세포 유전자에 의해 암호화된 항체 또는 이의 기능적 단편 중 가변 영역과 동일한 아미노산 서열을 가지고 있는 항체 또는 이의 기능적 단편 중 가변 영역을 암호화하는 변형된 핵산 서열에 의해 암호화된 아미노산 서열로서, 여기서 핵산 서열은 예를 들어, 코돈 최적화, 원하는 제한 부위의 첨가, 최적화된 GC 함량, 원치 않는 mRNA 스플라이스 부위의 제거 또는 mRNA 불안정성 모티프의 제거에 의해 변형되는, 아미노산 서열, 또는 c) 생식세포 유전자에 의해 암호화되지만, 원치 않는 시스테인을 제거하기 위해, 또는 원하는 제한 부위, 예컨대, BbsI을 첨가하기 위한 목적으로 아미노산 서열에 최소한의 돌연변이를 발생시켰거나, 합성, 증폭 또는 복제에서 발생한 오류로부터 유발되는, 아미노산 서열에 최소한의 돌연변이가 있는, 아미노산 서열을 의미한다. “생식세포 단백질 서열” 또는 “생식세포 아미노산 서열”의 예는 도 6 내지 도 8, 그리고 도 25 내지 도 33에 나타나 있다. 추가적으로, “생식세포 단백질 서열” 또는 “생식세포 아미노산 서열”은 실시예 5에서 제조하는 구조체를 포함하며, 이때 구조체는
a) VH: 선도서열(표 1에 나타낸 바와 같이 NheI RE 부위를 포함하는 변형된 phoA); 생식세포 FR1, CDR1, FR2, CDR2 및 FR3(도 1에 도시된 바와 같이 BssHII RE 부위(GCGCGC)를 포함); Ewert S. 등, J. Mol. Biol. (2003) 325, 531-553에서 사용된 바와 같은 4D5 항체 중 CDR-H3(WGGDGFYAMDY)(SEQ ID NO: 1); 및 JH4 FR4(도 1에 도시된 바와 같이 XhoI RE 부위(CTCGAG)를 포함);
b) Vκ: 선도서열(표 2에 나타낸 바와 같이 NdeI RE 부위를 포함하는 ompA); 생식세포 FR1, CDR1, FR2, CDR2 및 FR3(도 1에 도시된 바와 같이 BbsI RE 부위(GAAGAC)를 포함), Ewert S. 등, J. Mol. Biol. (2003) 325, 531-553에 따른 κ-유사 CDR-L3(QQHYTTPPT)(SEQ ID NO: 2); 및 Jk1 FR4 (도 1에 도시된 바와 같이 KpnI/Acc65I RE 부위(GGTACC)를 포함); 및
c) Vλ: 선도서열(표 2에 나타낸 바와 같이 NdeI RE 부위를 포함하는 ompA); 생식세포 FR1, CDR1, FR2, CDR2 및 FR3(도 1에 도시된 바와 같이 BbsI RE 부위(GAAGAC)를 포함), Ewert S. 등, J. Mol. Biol. (2003) 325, 531-553에 따른 λ-유사 CDR-L3(QSYDSSLSGVV)(SEQ ID NO: 3); 및 JI2/3 FR4(도 1에 도시된 바와 같이 KpnI/Acc65I RE 부위(GGTACC)를 포함)를 포함한다.
생식세포 유전자에 의해 암호화된 항체의 “생식세포 단백질 서열” 또는 “생식세포 아미노산 서열”은 다음과 같은 출판물에 개시되어 있다. VH의 경우, Tomlinson 등, (1992), “The Repertoire of Human Germline Vh Sequences Reveals about Fifty Groups of Vh Segments with Different Hypervariable Loop” J. Mol. Biol. 227, 776-798; Matsuda 등(1998), “The complete nucleotide sequence of the human immunoglobulin heavy chain variable region locus” J Exp Med 188(11):2151-62; 및 LeFranc MP (2001) “Nomenclature of the human immunoglobulin heavy (IGH) genes.” Exp Clin Immunogenet. 18(2):100-16; Vλ의 경우, Kawasaki 등, (1997) “One-Megabase Sequence Analysis of the Human immunoglobulin lambda Gene Locus” Genome Research 7(3):250-61; Frippiat 등, (1995) "Organization of the human immunoglobulin lambda light-chain locus on chromosome 22q11.2" Hum. Mol. Genet., 4, 983-991; 및 LeFranc MP (2001) "Nomenclature of the human immunoglobulin lambda (IGL) genes. Exp Clin Immunogenet.;18:242-254; 및 Vκ의 경우, Schable와 Zachau (1993), “The variable genes of the human immunoglobulin kappa locus,” Biol. Chem Hoppe Seyler. 374(11):1001-22; Brensing-Kuppers 등(1997), “The human immunoglobulin kappa locus on yeast artificial chromosomes (YACs)” Gene. 191(2):173-81; Kawasaki 등(2001), “Evolutionary dynamics of the human immunoglobulin kappa locus and the germline repertoire of the Vkappa genes” Eur J Immunol 31(4):1017-28; 및 Lefranc MP (2001) "Nomenclature of the human immunoglobulin kappa (IGK) genes" Exp Clin Immunogenet., 18, 161-174으로, 이들 전부는 전체가 참조로 본원에 통합된다.
본 명세서의 일부분에서, 예컨대, 도 5에서, 본 출원 내에 이용된 가변 도메인 생식세포 유전자의 명명은 이전 단락에서 인용된 LeFranc 등의 출판물에 기술된 바와 같이 IMGT를 따랐다. 명명법과 관련하여, “VH”와 “IGHV”는 중쇄 가변 도메인을 의미하고, 여기서 유전자의 번호 부여는 IMGT를 따랐다. “VL”, “Vλ” 및 “IGLV”는 람다 경쇄 가변 도메인을 의미하고, 여기서 유전자의 번호 부여는 IMGT를 따랐다. “Vκ,” “VK” 및 “IGKV”는 카파 경쇄 가변 도메인을 의미하고, 여기서 유전자의 번호 부여는 IMGT를 따랐다. 대안적으로, “VL”은 Vκ와 Vλ를 포함하는 가변 경쇄를 의미하는 데 이용될 수 있다.
용어 “생식세포 유전자 서열”은 a) 항체 또는 이의 기능적 단편 중 가변 영역을 암호화하는 생식세포 유전자의 핵산 서열, 또는 b) 생식세포 유전자에 의해 암호화된 항체의 가변 영역과 동일한 아미노산 서열을 가지고 있는 항체 또는 이의 기능적 단편 중 가변 영역을 암호화하는 변형된 핵산 서열로서, 여기서 핵산 서열은 예를 들어, 코돈 최적화, 원하는 제한 부위의 첨가, 최적화된 GC 함량, 원치 않는 스플라이스 부위의 제거 또는 mRNA 불안정성 모티프의 제거에 의해 변형된, 핵산 서열을 의미한다.
용어 “생식세포 유전자 쌍(들)”은 핵산 서열의 쌍 및 이에 대응되는 생식세포 유전자 쌍으로서, 항체 또는 이의 기능적 단편의 가변 중쇄 및 가변 경쇄를 암호화하는 생식세포 유전자 쌍을 의미한다. 예를 들어, 생식세포 유전자 쌍은 VH3-23/Vκ1-5일 수 있으며, VH3-23/Vκ1-5에 의해 암호화된 항체는 생식세포 유전자 VH3-23에 의해 암호화된 가변 중쇄 또는 이의 일부분 및, 생식세포 유전자 Vκ1-5에 의해 암호화된 가변 경쇄 또는 이의 일부분을 포함한다.
용어 "생식세포 단백질 쌍"은 항체 또는 이의 기능적 단편을 의미하며, 이 때 가변 중쇄 또는 이의 일부분 및 가변 경쇄 또는 이의 일부분은 a) 특정 생식세포 유전자에 의해 각각 암호화되거나, b) 특정 생식세포 유전자에 의해 암호화된 항체 중 가변 영역과 동일한 아미노산 서열을 가지고 있는 항체 또는 이의 기능적 단편 중 가변 영역을 암호화하는 변형된 핵산 서열에 의해 각각 암호화되거며, 이때 핵산 서열은 예를 들어, 코돈 최적화, 원하는 제한 부위의 첨가, 최적화된 GC 함량, 원치 않는 mRNA 스플라이스 부위의 제거 또는 mRNA 불안정성 모티프의 제거에 의해 변형되는, 핵산 서열에 의해 각각 암호화되거나, c) 생식세포 유전자에 의해 암호화되지만, 원치 않는 시스테인을 제거하기 위해, 또는 원하는 제한 부위, 예컨대, BbsI을 첨가하기 위해, 또는 합성, 증폭 또는 복제에서의 오류로부터 유발되는, 아미노산 서열의 점돌연변이가 있는 아미노산 서열을 각각 포함한다. 예를 들어, 생식세포 단백질 쌍은 VH3-23/Vκ1-5에 의해 암호화된 항체 또는 기능적 단편일 수 있으며, 여기서 항체는 생식세포 유전자 VH3-23에 의해 암호화된 가변 중쇄 또는 이의 일부분 및 생식세포 유전자 Vκ1-5에 의해 암호화된 가변 경쇄 또는 이의 일부분을 포함한다. “생식세포 단백질 쌍”은 실시예 5에 따라 제조된 구조체를 포함하며, 상기 구조체는
a) VH: 선도서열(표 1에 나타낸 바와 같이 NheI RE 부위를 포함하는 변형된 phoA); 생식세포 FR1, CDR1, FR2, CDR2 및 FR3(도 1에 도시된 바와 같이 BssHII RE 부위(GCGCGC)를 포함); Ewert S. 등, J. Mol. Biol. (2003) 325, 531-553에서 사용된 바와 같은 4D5 항체 중 CDR-H3(WGGDGFYAMDY)(SEQ ID NO: 1); 및 JH4 FR4(도 1에 도시된 바와 같이 XhoI RE 부위(CTCGAG)를 포함);
b) Vκ: 선도서열(표 2에 나타낸 바와 같이 NdeI RE 부위를 포함하는 ompA); 생식세포 FR1, CDR1, FR2, CDR2 및 FR3(도 1에 도시된 바와 같이 BbsI RE 부위(GAAGAC)를 포함), Ewert S. 등, J. Mol. Biol. (2003) 325, 531-553에 따른 κ-유사 CDR-L3(QQHYTTPPT)(SEQ ID NO: 2); 및 Jk1 FR4 (도 1에 도시된 바와 같이 KpnI/Acc65I RE 부위(GGTACC)를 포함); 및
c) Vλ: 선도서열(표 2에 나타낸 바와 같이 NdeI RE 부위를 포함하는 ompA); 생식세포 FR1, CDR1, FR2, CDR2 및 FR3(도 1에 도시된 바와 같이 BbsI RE 부위(GAAGAC)를 포함), Ewert S. 등, J. Mol. Biol. (2003) 325, 531-553에 따른 λ-유사 CDR-L3(QSYDSSLSGVV)(SEQ ID NO: 3); 및 JI2/3 FR4(도 1에 도시된 바와 같이 KpnI/Acc65I RE 부위(GGTACC)를 포함)를 포함한다.
용어 “가변 중쇄 및 가변 경쇄 쌍” 또는 “VH/VL 쌍”은 하나의 가변 중쇄와 하나의 가변 경쇄의 조합을 의미한다. 항체와 기능적 단편, 예컨대, Fab는 가변 경쇄에 결합된 적어도 하나의 가변 중쇄를 포함하고, 이들은 항원 결합 부위를 형성한다. 가변 중쇄 및 가변 경쇄 쌍의 한 예는 VH3-23/Vκ1-5로부터의 생식세포 아미노산 서열을 포함하는 항체 또는 기능적 단편, 또는 이의 일부분, 또는 생식세포 유전자 VH3-23/Vκ1-5에 의해 암호화된 항체 또는 기능적 단편, 또는 이의 일부분으로, 여기서 항체는 VH3-23으로부터의 생식세포 아미노산 서열 또는 생식세포 유전자 VH3-23에 의해 암호화된 생식세포 아미노산 서열을 포함하는 가변 중쇄 또는 이의 일부분 및 Vκ1-5로부터의 생식세포 아미노산 서열 또는 생식세포 유전자 Vκ1-5에 의해 암호화된 생식세포 아미노산 서열을 포함하는 가변 경쇄 또는 이의 일부분을 포함한다.
용어 “실질적으로 모두”는 적어도 90%를 의미한다. 예를 들어, 항체 또는 기능적 단편들 중 실질적으로 모두는 특정 성질들을 가지고 있는 생식세포 단백질 쌍의 생식세포 아미노산 서열을 포함하는 가변 중쇄 및 가변 경쇄 기본틀 영역을 포함하며, 이는 항체 또는 단편들 중 적어도 90%가 그러한 특성들을 가지고 있는 생식세포 단백질 쌍의 생식세포 아미노산 서열을 포함하는 가변 중쇄 및 가변 경쇄 기본틀 영역을 포함함을 의미한다.
가변 중쇄에 대한 JH4 서열, 가변 κ 경쇄에 대한 Jκ1, 및 가변 λ 경쇄 영역들에 대한 Jλ2/3은 다음과 같은 출판물에 기술되어 있다: Scaviner 등, (1999), " Protein displays of the human immunoglobulin heavy, kappa and lambda variable and joining regions" Exp Clin Immunogenet. 16(4):234-40; for JH: Ravetch 등, (1981), “Structure of the human immunoglobulin mu locus: characterization of embryonic and rearranged J and D genes.” Cell 27 (3 pt 2): 583-91; JK의 경우, Hieter 등(1982), “Evolution of human immunoglobulin kappa J region genes.” J Biol Chem 257(3):1516-22; JL의 경우, Kawasaki 등, (1997) “One-Megabase Sequence Analysis of the Human immunoglobulin lambda Gene Locus” Genome Research 7(3):250-61으로, 이들은 모두 전체가 참조로 본원에 통합된다. JH4 아미노산 서열은 (YFDYWGQGTLVTVSS)(SEQ ID NO: 4)이고, Jκ1 아미노산 서열은 (WTFGQGTKVEIK)(SEQ ID NO: 5)이며, Jλ2/3 아미노산 서열은 (VVFGGGTKLTVL)(SEQ ID NO: 6)이다.
용어 “가변 도메인/영역/(VH 또는 VL)”은 각각 경쇄(κ 및 λ를 포함) 및 중쇄의 면역 글로불린 유전적 좌위를 형성하는 VL(Vκ 및 Vλ를 포함), VH, JL(Jκ 및 Jλ를 포함) 및 JH 핵산 중 임의의 것에 의해 실질적으로 암호화된 하나 이상의 Ig 도메인을 포함하는 면역 글로불린의 영역을 의미한다. 경쇄 또는 중쇄 가변 영역(VL 및 VH)은 “상보성 결정 영역” 또는 “CDR”로 지칭된 3개의 과가변 영역이 사이사이에 있는 “기본틀” 또는 “FR” 영역으로 이루어진다. 기본틀 영역 및 CDR들의 범위는 적어도 다음과 같은 규칙을 이용하여 정의되었다: Kabat, 1991, J. Immunol., 147, 915-920; Chothia & Lesk, 1987, J. Mol . Biol . 196: 901-917; Chothia 등, 1989, Nature 342: 877-883; Al-Lazikani 등, 1997, J. Mol . Biol . 273: 927-948) 참조; 또한, http://www.bioc.uzh.ch/antibody/Numbering/NumFrame.html(잘 알려진 항체 아미노산의 번호 부여 규칙 및 CDR과 기본틀 영역의 위치를 나타냄) 및 도 25 내지 36에 이용된 사항 참조.
용어 “기본틀 영역”은 항원 결합 루프를 위한 스캐폴드 역할을 하는 가변 도메인의 일부분을 의미한다. 기본틀 영역의 예로는 가변 중쇄 또는 가변 경쇄 중 어느 하나의 FR1, FR2, FR3 및 FR4를 포함한다.
용어 “상보성 결정 영역” 또는 “CDR”은 항체의 항원 결합 루프를 의미한다. 항체 Fv 단편의 두 가변 도메인 각각은 3개의 CDR을 함유한다. 상보적 결정 영역은 가변 중쇄 또는 가변 경쇄 중 어느 하나의 CDR1, CDR2 및 CDR3를 포함한다.
용어 “인간 면역 레퍼토리”는 인간의 면역 시스템의 B 세포로부터 분리된 핵산들의 레퍼토리를 의미한다. 레퍼토리는 개체 또는 집단의 것일 수 있고, 비감작 B 세포(naive B cell) 및/또는 항원을 경험한 B 세포로부터 유래할 수 있다. 충분한 B 세포가 얻어진다면, 본 발명은 한 개체로부터의 면역 레퍼토리를 확인하기에 좋다. 바람직하게는, 면역 레퍼토리는 표본 선택의 편향을 피하기 위해 다수의 개체로부터 얻어진다. 인간 면역 레퍼토리의 예는 실시예 2와 실시예 3에 기술하였다.
“항원” 및 “면역원”은 항체가 특이적으로 결합되는 임의의 분자로 정의된다.
용어 “항원/면역원에 대해 특이적”은 항체와 상응하는 분자 사이의 특이적인 결합을 의미한다. 특이성은 ELISA 및/또는 Biacore와 같이, 실시예 11에 기술된 방법에 의해 확인할 수 있다.
“CDR 다양화” 또는 “다양화된 CDR”은 CDR 내의 아미노산 조성을 다양화하여 얻어진다. 다양화된 CDR은, 하나 이상의 동일한 기본틀 영역, 예컨대, 생식세포 기본틀 영역을 가지고 있으며 상이한 아미노산 서열을 포함하는 CDR3를 가지고 있는 항체 또는 단편의 집합에서 볼 수 있다. 다양화된 CDR은 다음에 의해 기술된 방법을 포함한, 당업자에게 알려진 임의의 방법에 의해 달성될 수 있다: 제WO9708320호, 전체가 참조로 통합된, 미국 특허번호 제6,300,064호; 제WO2008053275호, 전체가 참조로 통합된, 제US 12/158,181호; 제WO07056441호, 전체가 참조로 통합된, 제US60/806,602호; 제WO2009036379호, 전체가 참조로 통합된, 제US60/993,785호; 제WO2009114815호, 전체가 참조로 통합된, 제12/922,153호; 제WO020617071호, 전체가 참조로 통합된, 제US12/762,051호. CDR은 일반적으로 면역원 결합 영역으로 알려져 있으며, 따라서 CDR 내에 큰 다양성을 나타내는 구성원을 포함하는 집합을 가지고 있으며, 특히 CDR3은 집합이 임의의 면역원에 대하여 특이성 및 최적의 특성을 가지고 있는 항체 또는 이의 단편을 포함할 가능성을 증가시킨다.
용어 “변이형”은 다른 항체 또는 단편과 상이한 아미노산 서열을 가지고 있는 항체 또는 단편을 의미한다. 용어 “변이형”은 기본틀 영역의 서열은 필수적으로 동일하지만, CDR 영역, 예컨대, CDR3에는 상이한 아미노산 서열을 가지고 있는 항체 또는 단편을 포함한다. 가변 중쇄 및 가변 경쇄 쌍의 변이형은 필수적으로 기본틀 영역 내에 동일한 아미노산 서열을 가지고 있지만, CDR3 영역 내에는 상이한 아미노산 서열을 가지고 있다.
용어 “합성(synthesis)” 또는 “합성된(synthesized)”은 유전자 합성을 의미하며, 여기서 핵산 서열은 폴리뉴클레오티드를 포함하는 물리적 DNA로 합성된다. 표준 DNA 합성은 단일 뉴클레오티드 합성을 포함하며, 여기서 단일 가닥 올리고뉴클레오티드를 제조한 다음, PCR-유사 어셈블리(assembly)를 이용하여 중첩 올리고뉴클레오티드를 연결시킨다. Sloning(독일 푸크하임), Geneart(독일 레겐스부르크), DNA2.0(미국 캘리포니아 주 멘로 파크), Entelechon(독일 레겐스부르크) 및 Genscript(미국 뉴저지 주 피츠카타웨이)와 같은 업체들이 유전자 합성 기술을 제공한다. 예를 들어, Sloning은 미리 제조된 이중 가닥의 세 개 뉴클레오티드 세트를 이용한다.
용어 “합성, 합성형, 합성한(synthetic)”은 합성에 의해 인체 밖에서 만들어지거나 합성된 분자, 예컨대, DNA를 설명한다. 용어 “합성, 합성형, 합성한(synthetic)”은 또한, 합성 DNA 분자로부터 번역된 단백질, 예컨대, 항체 또는 단편을 설명한다.
용어 “집합” 또는 “라이브러리”는 적어도 2개의 구성원을 의미한다. 용어 "구성원"은 항체 또는 이의 단편을 암호화하는 핵산 또는 항체 또는 이의 단편 자체를 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
용어 “핵산”은 본원에서 용어 “폴리뉴클레오티드” 또는 “DNA”와 상호 교환적으로 사용되고, 디옥시리보뉴클레오티드 또는 리보뉴클레오티드 및 단일 가닥 또는 이중 가닥 형태로 된 이들의 폴리머를 지칭한다. 용어는 합성형, 자연 발생형 및 비자연 발생형이고, 기준 핵산과 유사한 결합 특성을 가지고 있는, 알려진 뉴클레오티드 유사체 또는 변형된 백본(backbone) 잔기 또는 연결부를 함유하는 핵산들을 포함한다. 이러한 유사체의 예로는 포스포로티오에이트, 포스포아미데이트, 메틸 포스포네이트, 키랄-메틸 포스포네이트, 2-O-메틸 리보뉴클레오티드 및 펩티드-핵산(PNA)을 제한 없이 포함한다.
달리 명시되지 않는 한, 특정 핵산 서열은 또한, 명백히 명시된 서열뿐만 아니라, 이의 보전적으로 변형된 변이체(예컨대, 퇴화된 코돈(degenerate codon) 치환체) 및 상보적 서열을 암묵적으로 포괄한다. 구체적으로, 아래에서 상술한 바와 같이, 퇴화된 코돈 치환체는 하나 이상의 선택된 (또는 모든) 코돈의 세 번째 자리가 혼합 염기 및/또는 디옥시이노신 잔기로 치환된 서열을 생성함으로써 달성될 수 있다(Batzer 등, Nucleic Acid Res . 19:5081, 1991; Ohtsuka 등, J. Biol . Chem . 260:2605-2608, 1985; 및 Rossolini 등, Mol . Cell . Probes 8:91-98, 1994).
본원에 사용된 용어 “코돈 최적화된” 또는 “코돈 최적화”는 뉴클레오티드 서열이 변경되어, 특정 생산 시스템, 예컨대, 세포 또는 유기체에서 선호되는 코돈을 포함함을 의미한다. 최적화된 뉴클레오티드 서열은 본래 시작 뉴클레오티드 서열에 의해 암호화된 아미노산 서열을 보유하도록 가공된다. 또한, 뉴클레오티드 서열은 억제 모티프, mRNA 스플라이스 부위, mRNA 불안정 모티프 및 원치 않는 제한 부위가 완전히 없거나 또는 가능한 한 없도록 설계될 수 있다. 또한, 그것은 GC 함량, 원하는 제한 부위 및 기타 매개변수에 대해 최적화될 수 있다. 서열은 세균 세포 또는 진핵 세포를 포함한 다른 숙주, 구체적으로 포유류 세포에서의 발현을 위해 최적화될 수 있다. 또한, 최적화된 뉴클레오티드 서열에 의해 암호화된 아미노산 서열은 최적화되었다고 지칭될 수 있다.
용어 "아미노산"은 자연 발생형 및 합성형 아미노산 뿐만 아니라, 자연 발생형 아미노산과 유사한 방식으로 기능하는 아미노산 유사체 및 아미노산 모사체도 지칭한다. 자연 발생형 아미노산은 유전 암호에 의해 암호화된 것들 뿐만 아니라, 나중에 변형된 아미노산들, 예컨대, 히드록시프롤린, γ-카복시글루타메이트 및 O-포스포세린이다. 아미노산 유사체는 자연 발생형 아미노산과 동일한 기본 화학 구조, 즉, 수소, 카르복실기, 아미노기 및 R기, 예컨대, 호모세린, 노르류신, 메티오닌 설폭시드, 메티오닌 메틸 설포늄에 결합된 알파 탄소를 가지고 있는 화합물을 지칭한다. 이러한 유사체는 변형된 R기(예컨대, 노르류신) 또는 변형된 펩티드 백본을 가지고 있지만, 자연 발생형 아미노산과 동일한 기본 화학 구조를 보유한다. 아미노산 모사체는 아미노산의 일반적인 화학적 구조와 상이한 구조를 가지고 있지만, 자연 발생형 아미노산과 유사한 방식으로 기능하는 화학적 화합물을 지칭한다.
용어 “폴리펩티드” 및 “단백질”은 아미노산 잔기로 이루어진 폴리머를 지칭하도록 본원에서 상호 교환적으로 사용된다.
둘 이상의 핵산 또는 폴리펩티드 서열의 맥락에서 용어 “동일한(identical)”은 서로 같은 둘 이상의 서열 또는 하위서열(subsequence)을 지칭힌다.
용어 “벡터”는 연결되어 있는 폴리뉴클레오티드를 수송할 수 있는 또 다른 폴리뉴클레오티드 분자를 지칭한다. 바람직한 벡터는 자가 복제 및/또는 벡터에 연결된 핵산을 발현시킬 수 있는 벡터이다. 작동 가능하게 연결된 핵산의 발현을 유도할 수 있는 벡터들은 본원에서 “발현 벡터”라 지칭된다. 벡터의 한 유형은 “플라스미드”로, 이는 부가적인 DNA 조각이 연결될 수 있는 원형의 이중 가닥 DNA 루프를 지칭한다. 벡터의 또 다른 유형은 바이러스 벡터로, 부가적인 DNA 조각이 바이러스 게놈 내로 연결될 수 있다. 특정 벡터들은 그것들이 도입되는 숙주 세포 내에서 자가 복제할 수 있다(예컨대, 세균의 복제 개시점 및 포유류 벡터를 가지고 있는 세균 벡터). 다른 벡터들은 숙주 세포 내로 도입될 때 숙주 세포의 게놈 내로 통합될 수 있고, 이에 의하여 숙주 게놈을 따라 복제된다. 나아가, 특정 벡터들은 그것들이 작동 가능하게 연결되는 유전자의 발현을 유도할 수 있다. 이러한 벡터들은 본원에서 “재조합 발현 벡터”(또는 간단히 “발현 벡터”)로 지칭된다. 일반적으로, 재조합 DNA 기법에서 유용한 발현 벡터는 흔히 플라스미드의 형태이다. 벡터들은 원핵세포 또는 진핵세포와 적합할 수 있다. 본 명세서에서, 플라스미드는 가장 흔히 사용되는 벡터 형태이므로, “플라스미드” 및 “벡터”는 상호 교환적으로 사용될 수 있다. 그러나, 본 발명은 동등한 기능을 제공하는 바이러스 벡터(예컨대, 복제 결함 레트로바이러스, 아데노바이러스 및 아데노-연관 바이러스)와 같은 기타 형태의 발현 벡터를 포함하도록 의도된 것이다.
벡터들은 전형적으로 형질전환된 대장균과 같이, 세균 숙주 세포에서 VH 암호화 및/또는 VL 암호화 동족체의 발현(전사 및 번역)을 유도할 수 있는 원핵생물 프로모터를 포함할 수 있는, 원핵생물 레플리콘(replicon)을 포함한다. 추가적으로, 벡터들은 포유류 세포에서 이용하기 위한 IgG 발현 벡터(예컨대, 도 13 내지 도 15 참조)를 포함한다. 프로모터는 RNA 중합효소의 결합을 허용하여 전사가 일어나게 하는 DNA 서열에 의해 형성된 발현 조절 요소이다. 세균 숙주에 적합한 프로모터 서열은 전형적으로 DNA 조각의 삽입에 편리한 제한 부위를 함유하는 플라스미드 벡터 내에 제공된다. 이러한 벡터 플라스미드의 예로는 구입할 수 있는 pUC8, pUC9, pBR322 및 pBR329, pPL 및 pKK223을 포함한다.
“디스플레이 벡터”는 형질전환된 세균 숙주 세포와 같이, 숙주 세포에서 추가적인 염색체로 형질전환된 재조합 DNA 분자의 복제 및 유지를 유도할 수 있는 능력을 가지고 있는 DNA 서열을 포함한다. 이러한 DNA 서열은 당해 분야에서 잘 알려져 있다. 디스플레이 벡터들은 예를 들어, fd, M13 또는 fl 사상 박테리오파지 부류로부터 유래되는 파지 벡터 또는 파지플라스미드 복합체 벡터일 수 있다. 이러한 벡터들은 사상 박테리오파지 표면 상에 예를 들어, 결합 단백질 또는 이의 단편을 포함하는 단백질의 표면 제시(디스플레이)를 촉진할 수 있다. 또한, 파지, 리보솜, DNA, 세균 세포 또는 진핵 세포, 예를 들어 효모 또는 포유류 세포 상에 표면 제시하기에 적합한 디스플레이 벡터들은 당해 분야에 잘 알려져 있고, 예를 들면, 바이러스 벡터 또는 키메라 단백질을 암호화하는 벡터들이다.
용어 “재조합 숙주 세포”(또는 간단히 “숙주 세포”)는 재조합 발현 벡터가 도입된 세포를 지칭한다. 이러한 용어는 특정 대상 세포를 지칭하는 것뿐만 아니라 이러한 세포의 자손도 지칭하도록 의도된 것이라고 이해되어야 한다. 돌연변이 또는 환경적 영향에 의하여 특정 변형이 세대를 거치면서 발생할 수 있기 때문에, 이러한 자손은 실제로는 모세포와 동일하지 않을 수 있지만, 본원에서 사용된 용어 “숙주 세포”의 범위 내에 여전히 포함된다. 전형적인 숙주 세포는 원핵생물(예컨대, 대장균을 포함하지만 이에 한정되지 않는 세균) 또는 진핵생물(효모, 포유류 세포 등을 포함)이다. 세균 세포는 바람직한 원핵생물 숙주 세포이고, 전형적으로는 예를 들어, 미국 매릴랜드 주 베데스다 Bethesda Research Laboratories, Inc.에서 구입할 수 있는 대장균 DH5균주와 같은, 대장균 균주이다. 바람직한 진핵생물 숙주 세포로는 효모 및 쥐와 설치류를 포함하는 포유류 세포를 포함하며, 바람직하게는 마우스, 래트, 원숭이에서 얻은 세포 또는 인간 세포주, 예를 들어, HKB11 세포, PERC.6 세포, 또는 CHO 세포와 같은 척추동물 세포이다.
벡터의 숙주 세포 내 도입은 인산 칼슘 침전법, 전기천공법, 미세주입법, 리포솜 융합법, RBC 고스트 융합법(ghost fusion), 원형질체 융합법, 바이러스 감염법 등을 포함한 당업자에게 알려진 다수의 형질전환 또는 형질감염 방법에 의해 달성될 수 있다. 단일클론성 전체 길이 항체, Fab 단편, Fv 단편 및 scFv 단편의 생산법은 잘 알려져 있다.
적절한 세포 숙주를 재조합 DNA 분자로 형질전환하는 것은 사용된 벡터와 세포의 유형에 전형적으로 의존하는 방법에 의해 달성된다. 원핵생물 숙주 세포의 형질전환과 관련하여, 예를 들어, Cohen 등, Proceedings National Academy of Science, USA, Vol. 69, P.2110 (1972); 및 Maniatis 등, Molecular Cloning, a Laboratory Manual, Cold spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y. (1982) 참조. 척추동물 세포를 rDNA를 함유하는 레트로바이러스 벡터로 형질전환하는 것과 관련하여, 예를 들어, Sorge 등, Mol. Cell. Biol., 4:1730-1737 (1984); Graham 등, Virol., 52:456 (1973); 및 Wigler 등, Proceedings National Academy of Sciences, USA, Vol. 76, P.1373-1376 (1979) 참조.
eGFP(강화된 녹색 형광 단백질)은 다음과 같은 아미노산 서열을 가지고 있다:
MSGSHHHHHHGTMVSKGEELFTGVVPILVELDGDVNGHKFSVSGEGEGDATYGKLTLKFICTTGKLPVPWPTLVTTLTYGVQCFSRYPDHMKQHDFFKSAMPEGYVQERTIFFKDDGNYKTRAEVKFEGDTLVNRIELKGIDFKEDGNILGHKLEYNYNSHNVYIMADKQKNGIKVNFKIRHNIEDGSVQLADHYQQNTPIGDGPVLLPDNHYLSTQSALSKDPNEKRDHMVLLEFVTAAGITLGMDELYKDI. 밑줄 친 이탤릭체의 아미노산은 히스티딘 태그를 나타내고, 밑줄만 그은 아미노산은 제한효소 인식 서열 첨가를 나타낸다.
항체 또는 항체 단편의 집합
본원은 임의의 목표에 대한 치료적 항체의 동정에 이용될 수 있는 항체 또는 이의 기능적 단편 및 그러한 항체 또는 단편을 암호화하는 핵산의 집합을 가능하게 하며, 이때 항체 또는 단편은 임상적으로 개발할 수 있고, 환자에게 안전하며 효과적이다. 배경으로, 본 발명자들은 (VH3-23/VK1-5와 같이) 인간 면역 레퍼토리에 풍부한 가변 중쇄 및 가변 경쇄 생식세포 유전자 쌍이 더 효율적인 개발을 가져오며 환자에 있어서 그 결과로 얻어지는 항체의 안전성 및 효능을 증가시킬 유리한 생물 물리학적 성질을 나타낼 가능성이 높다고 가정하였다. 그러한 유리한 생물 물리학적 성질은 a) Fab 포맷의 높은 상대적인 디스플레이 비율; b) 높은 상대적 Fab 발현 수준; c) Fab 포맷 및 IgG 포맷의 온도 안정성; d) Fab 포맷 및 IgG 포맷의 소/마우스 혈청 안정성; e) 높은 IgG1 발현 수율; e) Fab 포맷 및 IgG 포맷의 SEC 단량체 함량(단량체 %); 및/또는 f) 높은 IgG1 등전점(pI)를 포함할 수 있다.
각 B 세포는 하나의 항체를 암호화하고, 각 항체는 가변 중쇄 및 가변 경쇄를 포함한다. 항체의 각 가변 중쇄 및 가변 경쇄는 항체의 기원을 확인하기 위하여 생식세포 유전자 서열(또는 생식세포 단백질 서열)과 함께 정렬될 수 있으며, 이는 가변 중쇄 및 가변 경쇄가 어떤 생식세포 유전자로부터 유래되었는지를 의미한다. 그러므로, 각 항체에 대하여, 가변 중쇄 및 가변 경쇄는 생식세포 유전자 쌍 또는 생식세포 단백질 쌍, 예를 들어 VK1-5와 쌍을 이룬 VH3-23을 포함한다고 말할 수 있다.
인간 면역 레퍼토리에 풍부한 생식세포 단백질 쌍이 유리한 생물 물리학적 성질을 가지고 있을 가능성이 높다는 가설을 증명하기 위하여, 첫 번째 단계는 인간 면역 레퍼토리에 존재하는 가변 중쇄 및 가변 경쇄 생식세포 유전자 쌍(생식세포 단백질 쌍)을 확인하는 단계였다. 일부 양태에서, 데이터는 공개적으로 입수 가능한 문헌 또는 데이터베이스로부터, 그리고 B 세포 표본 추출로부터 얻어진다.
다음과 같은 기사가 확인되었으며, 상세히 분석되었다: Wardemann H. 등 (2003) Science 301, 1374-1377 및 임의의 뒷받침하는 표; Yurasov S. 등 (2005) J. Exp. Med. 201, 703-712 및 임의의 뒷받침하는 표; Tsuiji M. 등 (2006) J. Exp. Med. 203, 393-401 및 임의의 뒷받침하는 표; Yurasov S. 등 (2006) J. Exp. Med. 203, 2255-2262 및 임의의 뒷받침하는 표; Tiller T. 등 (2007) Immunity 26, 205-213 및 임의의 뒷받침하는 표; 및 Mietzner B. 등 (2008) PNAS 105, 9727-9732 및 임의의 뒷받침하는 표. 이들 전부는 전체가 참조로 통합된다.
대안적으로, NCBI와 같은 데이터베이스는 Ig-Blast를 이용하여 검색될 수 있다. 2005년 현재, 데이터베이스는 적어도 25,000개의 재정렬된 인간 항체 서열을 FASTA 포맷으로 함유했다. 22,500개 중 13,235개는 VH 서열을 나타냈고, 1,506개는 Vκ를 나타냈으며, 2,259개는 Vλ를 나타냈다.
일반적으로, 관련된 공개적으로 입수가능한 문헌 및 데이터베이스에서, 다음과 같은 방법이 이어졌다: 인간 공여자로부터 B 세포를 분리하고, 발달 단계 또는 분화 단계를 확인하기 위하여 B 세포를 분류하고, cDNA들을 생성하여 각 B 세포로부터의 항체를 암호화하는 DNA를 증폭하고, cDNA를 시퀀싱하고, 가변 중쇄 및 가변 경쇄를 암호화하는 cDNA를 알려진 생식세포 유전자 서열에 대하여 정렬시키고, 각 B 세포로부터의 생식세포 유전자 쌍을 확인하였다.
일부 구현예에서, 문헌에서 사용된 것과 유사한 방법을 포함한, 인간 B 세포의 표본 추출 및 분리로부터 데이터를 얻었다. 이러한 양태에서, 합성 항체 또는 이의 기능적 단편의 집합을 생산하는 방법은 인간 면역 레퍼토리에 존재하는 가변 중쇄 및 가변 경쇄의 생식세포 유전자 쌍을 포함하는 데이터 획득 단계를 포함하며; 여기서, 획득 단계는 aa) 시료로부터 인간 B 세포를 분리하는 단계; ab) B 세포로부터 cDNA를 생성하는 단계; ac) B 세포로부터의 cDNA를 PCR 증폭시키는 단계; ad) PCR 산물을 시퀀싱하는 단계; 및 ae) PCR 산물 중 생식세포 유전자를 확인하는 단계를 더 포함한다. 양 데이터 세트는 인간 면역 레퍼토리에 존재하는 가변 중쇄 및 가변 경쇄의 생식세포 유전자 쌍들을 제공했다.
항체 서열 데이터를 이용하여, 당업자는 생식세포 패밀리 및/또는 각각의 VH, Vκ 및 Vλ 가변 도메인의 유전자를 확인할 수 있다. 이러한 접근법을 이용하여, 당업자는 각각의 VH 및 VL 생식세포 패밀리 및/또는 유전자, 및/또는 생식세포 패밀리 및/또는 각각의 VH 및 VL 도메인 쌍의 유전자의 중요성 여부를 용이하게 결정할 수 있다.
문헌 및 B 세포로부터 얻어진 기초 데이터를 모아서 분석하였으며, 인간 면역 레퍼토리에 존재하는 가변 중쇄 및 가변 경쇄 생식세포 유전자 쌍을 각각의 수에 따라 정렬시켰다. 이러한 데이터로부터 특정 가변 중쇄 및 가변 경쇄의 생식세포 유전자 쌍이 다른 것들보다 더 빈번하게 인간 면역 레퍼토리에 존재한다는 점이 명백해졌다. 이렇게 현저한 쌍들이 우수한 생물 물리학적 특성들을 가지고 있을 것으로 예측되었다.
다음 단계로, 인간 면역 레퍼토리에는 약 2500쌍이 존재하므로, 개발가능성과 관련된 기능적 특성에 대해 어떠한 생식세포 단백질 쌍을 시험할 것인지를 결정해야 했다. 한 가지 방법은 인간 면역 레퍼토리에서 가장 우세하게 발생하는 가변 중쇄 및 가변 경쇄 생식세포 단백질 쌍을 시험하는 것이다. 예를 들어, 표 6 참조. 예를 들어, 시험을 위해 상위 400쌍을 선택하거나, 특정 임계 개수를 초과하여 존재하는 가변 중쇄 및 가변 경쇄의 생식세포 단백질 쌍을 선택할 수 있다. 그러나 이러한 접근법을 위해서는 매우 많은 수의 가변 중쇄 및 가변 경쇄의 생식세포 단백질 쌍 서열을 합성하여 시험할 필요가 있으므로, 이러한 접근법은 매우 효율적이지 않다.
대안적인 접근법으로, 본 발명자들은 인간 면역 레퍼토리의 우세한 쌍들 대부분을 대표하거나, 정확하게 재생산하거나, 이들을 아우르는 가변 중쇄 및 가변 경쇄의 생식세포 쌍들의 부분집합을 선별했다. 이러한 접근법은 부분적으로는 적은 수의 가변 중쇄, 가변 κ 경쇄 및 가변 λ 경쇄의 생식세포 유전자가 인간 면역 레퍼토리에서 우세하다는 관찰을 기초로 한 것이었다. Wildt 등은 895~896페이지에서 이러한 현상을 기술하고 있다. Wildt 등은 또한, 자주 발현되는 중쇄 및 경쇄 유전자 분절이 자주 쌍을 이루고 있으며, 추출된 쌍 중 절반은 겨우 다섯 개의 생식세포 쌍과 상응한다는 점을 관찰했다고 언급하고 있다. 따라서, 적은 수의 우세한 중쇄 및 경쇄의 (쌍을 이루지 않은) 생식세포 유전자를 인간 면역 레퍼토리를 대표하는 쌍 집단을 생성하도록 조합할 수 있다.
따라서, 기초 데이터를 분석하여 인간 면역 레퍼토리에 우세한 가변 중쇄, 가변 κ 경쇄 및 가변 λ 경쇄의 (쌍을 이루지 않은) 생식세포 유전자를 확인하였다. 그런 다음, 중요한 가변 중쇄, 가변 κ 경쇄 및 가변 λ 경쇄의 생식세포 단백질 서열을 평가하여, 개발과 관련된 생물 물리학적 특성을 확인하였다. 다음과 같은 성질들을 대상으로, 인실리코에서 가변 중쇄, 가변 κ 경쇄 및 가변 λ 경쇄의 생식세포 단백질 서열을 평가하였다: CDR 길이, 등전점(pI)(바람직한 등전점은 7.5 이상이며, 이는 표준 pH 5.5 내지 pH 7의 제형 완충액에 안정성을 제공하기 위함이다), 상보성 결정 영역 내의 잠재적인 번역 후 변형 부위(PTM’s)(구체적으로, N-결합된 글리코실화 부위(NxS 또는 NxT) 또는 Asp 절단(흔히 DP에서 발생), Asp 이성질화(DS, DG), 생체 내(혈청 내)에서 발생할 수 있거나 제형 완충액에 저장 시, 항체 결합 손실을 초래할 수 있는 탈아미노화(NS, NG)와 같은 화학적 변형, CDR에서 메티오닌의 존재(용매에 노출될 때, 산화될 수 있음), 쌍을 이루지 않은 시스테인의 존재(임의의 다른, 쌍을 이루지 않은 시스테인과 이황화 결합을 형성하여, 단백질의 가교결합 및/또는 낮은 발현 수준을 초래함), 생식세포로부터의 편차, 가능성 있는 T 세포 에피토프의 존재 및 이론적 응집 경향.
표 5 및 도 2와 도 3에 도시된 바와 같이, 일반적으로, 상위 20개의 VH, 상위 8개의 Vλ 및 상위 12개의 Vκ를 합성, 조합 및 이후의 기능 분석을 위하여 선별하였다. 각 가변 영역이 인실리코에서 확인한 유리한 생물 물리학적 특성을 가지고 있는, 인간 면역 레퍼토리에서 발견된 생식세포 유전자 쌍을 대표하는 400개의 생식세포 단백질 쌍을 생성하기 위하여, 생식세포 유전자 서열을 합성한 다음, 조합하였다. 400개의 VH/VL 생식세포 단백질 쌍을 다음과 같은 특성에 대해 시험하였다: a) Fab 포맷에서 파지 생산 및 파지 ELISA 후의 상대적인 디스플레이; b) 대장균에서 Fab 생산, 대장균 세포 용해 및 생산된 Fab의 ELISA 검출 후 상대적인 Fab 발현 수율; c) 대장균에서 Fab 생산, 대장균 세포 용해, 증가된 온도에서 배양한 후 비변성 Fab의 ELISA 검출 후 Fab의 온도 안정성; d) 소/마우스 혈청 내 배양 후, 비변성 Fab의 ELISA 검출에 의한 대장균 용해물로부터의 Fab의 소/마우스 혈청 내 안정성; e) 포유류 세포에서의 IgG1 생산 및 세포 배양물 상층액으로부터 분비된 IgG1의 ELISA 검출 후의 상대적인 인간 IgG1 발현 수율; 및 f) 소/마우스 혈청 내 배양 후, 비변성 Fab의 ELISA 검출에 의한 인간 IgG1의 소 혈청 내 안정성.
시험한 400개의 생식세포 단백질 쌍(표 12에 결과 도시) 가운데, 95개를 추가적인 시험을 위해 선별하였다. 합성, 발현 및 정제 후, 도 16 내지 도 24에 도시된 95개의 생식세포 단백질 쌍을 다음의 a) 정제된 Fab 발현 수율(mg/L), b) 정제된 Fab 단량체 함량(단량체 %), c) 정제된 Fab 열 안정성, d) 정제된 IgG1 발현 수율(mg/L), e) 정제된 IgG1 단량체 함량(단량체 %), f) 정제된 IgG1 열 안정성, g) IgG1 등전점 및 h) 시차 주사 형광분석(DSF), 흡광도, 동적 광산란 및 입자 염색을 포함한, 산 노출과 함께 하는 IgG1 응력 시험에 대해 Fab 및 IgG1 포맷으로 시험하였다. 결과는 도 16 내지 도 24에 도시하였다.
일 구현예에서, 다음과 같은 임계치가 설정되었다: i) 적어도 2.5mg/L의 Fab 포맷의 발현 수율; ii) Fab 포맷의 70℃ 이상의 열 안정성; iii) SEC로 확인한, 적어도 98%의 Fab 포맷의 단량체 함량(단량체 %); iv) 적어도 30mg/L의 IgG1 포맷의 발현 수율; v) IgG1 포맷의 73℃ 이상의 열 안정성; 및 vii) SEC로 확인한, 적어도 99%의 IgG1 포맷의 단량체 함량(단량체 %). 따라서, 일 구현예에서, 집합은, 생식세포 단백질 쌍의 생식세포 단백질 서열을 포함하는 가변 중쇄 및 가변 경쇄 기본틀 영역을 포함하는, 합성 항체 또는 이의 기능적 단편 또는 그러한 항체 또는 기능적 단편을 암호화하는 합성 핵산을 포함하며, 상기 생식세포 단백질 쌍은 다음과 같은 성질을 포함한다:
i) 적어도 2.5mg/L의 Fab 포맷의 발현 수율;
ii) Fab 포맷의 70℃ 이상의 열 안정성;
iii) SEC로 확인한, 적어도 98%의 Fab 포맷의 단량체 함량(단량체 %);
iv) 적어도 30mg/L의 IgG1 포맷의 발현 수율;
v) IgG1 포맷의 73℃ 이상의 열 안정성; 및
vi) SEC로 확인한, 적어도 99%의 IgG1 포맷의 단량체 함량(단량체 %).
추가적인 구현예에서, 집합은, 합성 항체 또는 이의 기능적 단편 또는 그러한 항체 또는 기능적 단편을 암호화하는 합성 핵산을 포함하며, 이때, 항체 또는 기능적 단편의 실질적으로 모두, 또는 적어도 50%, 또는 적어도 60%, 또는 적어도 70%, 또는 적어도 80%, 또는 적어도 90%, 또는 적어도 95%, 또는 각각은 생식세포 단백질 쌍의 생식세포 단백질 서열을 포함하는 가변 중쇄 및 가변 경쇄 기본틀 영역을 포함하고, 이때, 상기 생식세포 단백질 쌍은 다음과 같은 성질을 포함한다:
i) 적어도 2.5mg/L의 Fab 포맷의 발현 수율;
ii) Fab 포맷의 70℃ 이상의 열 안정성;
iii) SEC로 확인한, 적어도 98%의 Fab 포맷의 단량체 함량(단량체 %);
iv) 적어도 30mg/L의 IgG1 포맷의 발현 수율;
v) IgG1 포맷의 73℃ 이상의 열 안정성; 및
vi) SEC로 확인한, 적어도 99%의 IgG1 포맷의 단량체 함량(단량체 %).
추가적인 구현예에서, 집합은, 합성 항체 또는 이의 기능적 단편 또는 그러한 항체 또는 기능적 단편을 암호화하는 합성 핵산을 포함하며, 이때, 항체 또는 기능적 단편은 생식세포 단백질 쌍의 생식세포 단백질 서열을 포함하는 가변 중쇄 및 가변 경쇄 기본틀 영역으로 이루어지거나, 필수적으로 생식세포 단백질 쌍의 생식세포 단백질 서열을 포함하는 가변 중쇄 및 가변 경쇄 기본틀 영역으로 이루어지고, 이때, 상기 생식세포 단백질 쌍은 다음과 같은 성질을 포함한다:
i) 적어도 2.5mg/L의 Fab 포맷의 발현 수율;
ii) Fab 포맷의 70℃ 이상의 열 안정성;
iii) SEC로 확인한, 적어도 98%의 Fab 포맷의 단량체 함량(단량체 %);
iv) 적어도 30mg/L의 IgG1 포맷의 발현 수율;
v) IgG1 포맷의 73℃ 이상의 열 안정성; 및
vi) SEC로 확인한, 적어도 99%의 IgG1 포맷의 단량체 함량(단량체 %).
특정 구현예에서,
i) Fab 포맷의 발현 수율은 1.538mL/mg의 흡광계수를 이용하고, 280nm에서 흡광도를 측정하는 UV 분광측정법으로 확인하였다.
특정 구현예에서,
ii) Fab 포맷의 열 안정성은 PBS 완충액을 이용한 시차 주사 형광 분석법으로 확인하였다.
특정 구현예에서,
iii) Fab 포맷의 단량체 함량(단량체 %)은 Superdex75 HR10/30 컬럼과 pH 7.4의 Gibco D-PBS 완충액을 이용한 크기 배제 크로마토그래피로 확인하였다.
특정 구현예에서,
iv) IgG1 포맷의 발현 수율은 1.369mL/mg의 흡광계수를 이용하고, 280nm에서 흡광도를 측정하는 UV 분광측정법으로 확인하였다.
특정 구현예에서,
v) IgG1 포맷의 열 안정성은 PBS 완충액을 이용한 시차 주사 형광 분석법으로 확인하였다.
특정 구현예에서,
vi) IgG1 포맷의 단량체 함량(단량체 %)은 Tosoh TSK-Gel G3000SWxl 컬럼과 pH 7.4의 Gibco D-PBS 완충액을 이용한 크기 배제 크로마토그래피로 확인하였다.
UV 분광측정법은 Nanadrop 시스템(peqlab, Erlangen, 독일)을 이용하여 이루어질 수 있다. 시차 주사 형광 분석법은 iCycler iQ5 Thermal Cycler(Biorad)를 이용하여 이루어질 수 있다. 시차 주사 형광 분석법은 Gibco D-PBS, pH 7.4(Invitrogen, Paisley, 미국)를 이용하여 이루어질 수 있다. 크기 배제 크로마토그래피는 AKTA 정제기 시스템(GE Healthcare)을 이용하여 이루어질 수 있다.
다음과 같은 생식세포 단백질 쌍(54개): VH1-18 (SEQ ID NO: 204)/VK1-39 (SEQ ID NO: 236); VH1-18 (SEQ ID NO: 204)/VK3-15 (SEQ ID NO: 238); VH1-18 (SEQ ID NO: 204)/VK3-20 (SEQ ID NO: 239); VH1-46 (SEQ ID NO: 205)/VK3-15 (SEQ ID NO: 238); VH1-46 (SEQ ID NO: 205)/VL1-51 (SEQ ID NO: 252); VH1-46 (SEQ ID NO: 205)/VL3-21 (SEQ ID NO: 257); VH1-69*01 (SEQ ID NO: 206)/VL1-51 (SEQ ID NO: 252); VH3-07 (SEQ ID NO: 207)/VK1-12 (SEQ ID NO: 233); VH3-07 (SEQ ID NO: 207)/VK1-16 (SEQ ID NO: 234); VH3-07 (SEQ ID NO: 207)/VK1-27 (SEQ ID NO: 235); VH3-07 (SEQ ID NO: 207)/VK1-39 (SEQ ID NO: 236); VH3-07 (SEQ ID NO: 207)/VK3-15 (SEQ ID NO: 238); VH3-07 (SEQ ID NO: 207)/VL1-47 (SEQ ID NO: 251); VH3-07 (SEQ ID NO: 207)/VL1-51 (SEQ ID NO: 252); VH3-11 (SEQ ID NO: 208)/VK1-05 (SEQ ID NO: 230); VH3-11 (SEQ ID NO: 208)/VK1-39 (SEQ ID NO: 236); VH3-11 (SEQ ID NO: 208)/VK3-15 (SEQ ID NO: 238); VH3-11 (SEQ ID NO: 208)/VL1-40 (SEQ ID NO: 250); VH3-11 (SEQ ID NO: 208)/VL1-47 (SEQ ID NO: 251); VH3-11 (SEQ ID NO: 208)/VL1-51 (SEQ ID NO: 252); VH3-11 (SEQ ID NO: 208)/VL2-23 (SEQ ID NO: 255); VH3-15 (SEQ ID NO: 209)/VK1-05 (SEQ ID NO: 230); VH3-15 (SEQ ID NO: 209)/VK1-06 (SEQ ID NO: 231); VH3-15 (SEQ ID NO: 209)/VK1-12 (SEQ ID NO: 233); VH3-15 (SEQ ID NO: 209)/VK1-16 (SEQ ID NO: 234); VH3-15 (SEQ ID NO: 209)/VK1-27 (SEQ ID NO: 235); VH3-15 (SEQ ID NO: 209)/VK3-11 (SEQ ID NO: 237); VH3-15 (SEQ ID NO: 209)/VL1-40 (SEQ ID NO: 250); VH3-15 (SEQ ID NO: 209)/VL1-47 (SEQ ID NO: 251); VH3-15 (SEQ ID NO: 209)/VL1-51 (SEQ ID NO: 252); VH3-15 (SEQ ID NO: 209)/VL2-14 (SEQ ID NO: 254); VH3-21 (SEQ ID NO: 210)/VK1-12 (SEQ ID NO: 233); VH3-21 (SEQ ID NO: 210)/VK1-27 (SEQ ID NO: 235); VH3-21 (SEQ ID NO: 210)/VL2-11 (SEQ ID NO: 253); VH3-23 (SEQ ID NO: 211)/VK1-39 (SEQ ID NO: 236); VH3-23 (SEQ ID NO: 211)/VK3-15 (SEQ ID NO: 238); VH3-23 (SEQ ID NO: 211)/VL2-23 (SEQ ID NO: 255); VH3-23 (SEQ ID NO: 211)/VL3-1 (SEQ ID NO: 256); VH3-30 (SEQ ID NO: 212)/VK3-20 (SEQ ID NO: 239); VH3-53 (SEQ ID NO: 213)/VK3-15 (SEQ ID NO: 238); VH3-53 (SEQ ID NO: 213)/VL2-11 (SEQ ID NO: 253); VH3-74 (SEQ ID NO: 214)/VK1-05 (SEQ ID NO: 230); VH3-74 (SEQ ID NO: 214)/VK1-06 (SEQ ID NO: 231); VH3-74 (SEQ ID NO: 214)/VK1-12 (SEQ ID NO: 233); VH3-74 (SEQ ID NO: 214)/VK1-27 (SEQ ID NO: 235); VH3-74 (SEQ ID NO: 214)/VK3-20 (SEQ ID NO: 239); VH3-74 (SEQ ID NO: 214)/VL1-51 (SEQ ID NO: 252); VH5-51 (SEQ ID NO: 215)/VK1-39 (SEQ ID NO: 236); VH5-51 (SEQ ID NO: 215)/VL1-40 (SEQ ID NO: 250); VH5-51 (SEQ ID NO: 215)/VL1-51 (SEQ ID NO: 252); VH6-1 (SEQ ID NO: 216)/VK1-09 (SEQ ID NO: 232); VH6-1 (SEQ ID NO: 216)/VK3-15 (SEQ ID NO: 238); VH6-1 (SEQ ID NO: 216)/VK3-20 (SEQ ID NO: 239) 및 VH6-1 (SEQ ID NO: 216)/VL1-51 (SEQ ID NO: 252)이 위에서 기술한 방법을 이용한 다음과 같은 임계치 이상이어서, 개발 가능성과 관련된 우수한 기능적 활성을 나타낸다(도 16 내지 도 24에 데이터 도시): i) 적어도 2.5mg/L의 Fab 포맷의 발현 수율; ii) Fab 포맷의 70℃ 이상의 열 안정성; iii) SEC로 확인한, 적어도 98%의 Fab 포맷의 단량체 함량(단량체 %); iv) 적어도 30mg/L의 IgG1 포맷의 발현 수율; v) IgG1 포맷의 73℃ 이상의 열 안정성; 및 vi) SEC로 확인한, 적어도 99%의 IgG1 포맷의 단량체 함량(단량체 %). 따라서, 이러한 생식세포 단백질 쌍을 임의의 수만큼 포함하는 집합은 임의의 항원에 대해 개발 가능한 항체 또는 이의 단편들을 확인하는 데 이용될 수 있다.
일 양태에서, 집합은 합성 항체 또는 이의 기능적 단편 또는 그러한 항체 또는 기능적 단편을 암호화하는 합성 핵산을 포함하며, 이때 항체 또는 기능적 단편은 가변 중쇄 및 가변 경쇄 쌍을 포함하며, 이때 가변 중쇄 및 가변 경쇄 쌍의 기본틀 영역은 특이적인 가변 중쇄 및 가변 경쇄 쌍의 생식세포 단백질 서열, 예를 들어, VH1-18/VK1-39을 포함한다. 이는 집합이, 항체 또는 단편의 기본틀 영역이 VH1-18/VK1-39의 생식세포 단백질 서열을 포함하는, 항체 또는 단편을 포함하며, 이때 가변 중쇄 기본틀 영역은 VH1-18의 생식세포 단백질 서열을 포함하고, 가변 경쇄 기본틀 영역은 VK1-39의 생식세포 단백질 서열을 포함함을 의미한다. 개발과 관련된 기능적 특성들에 대해, 많은 수의 생식세포 단백질 쌍을 (실시예 5 및 실시예 9에서 설명한 바와 같이) 구조체로서 시험하였다. 시험했던 다수의 구조체가 개발 가능성과 관련된 우수한 기능적 특성을 나타냈다. 본 발명자들은 시험했던 기능적 특성과 관련하여, 투입물(항원에 대한 선별에 이용된 항체 집합)과 결과물(집합으로부터 항원에 대해 특이적이라고 확인된 항체) 사이에 높은 관련성이 있다고 믿는다. 따라서, 본 발명의 집합은, 부분적으로는, 시험했던 구조체와 동일한 아미노산 서열, 예를 들어, 기본틀 영역 및/또는 상보성 결정 영역을 포함하는 항체 또는 단편을 포함한다. 일 양태에서, 집합은 시험했던 구조체의 아미노산 서열, 또는 그것들을 암호화하는 핵산들을 포함하므로, 집합이, 시험했던 구조체와 동일한, 개발 가능성과 관련된 우수한 기능적 특성을 가지고 있는 항체 또는 단편을 포함한다고 여겨진다. 따라서, 항원에 대해, 집합으로부터 나중에 선택된 항체 또는 단편은 또한 동일한, 개발 가능성과 관련된 우수한 기능적 특성을 가지리라고 예측된다. 이러한 가설은 실시예 11에 기술한 실험 및 데이터에 의해 뒷받침된다. 도 37 내지 도 39, 도 45 내지 도 48, 및 도 62 참조.
일부 구현예에서, 집합은 합성 항체 또는 이의 기능적 단편 또는 그러한 항체 또는 기능적 단편을 암호화하는 합성 핵산을 포함하며, 이때 항체 또는 기능적 단편은 가변 중쇄 및 가변 경쇄 쌍을 포함하며, 이때 가변 중쇄 및 가변 경쇄 쌍의 기본틀 영역은 VH1-18 (SEQ ID NO: 204)/VK1-39 (SEQ ID NO: 236); VH1-18 (SEQ ID NO: 204)/VK3-15 (SEQ ID NO: 238); VH1-18 (SEQ ID NO: 204)/VK3-20 (SEQ ID NO: 239); VH1-46 (SEQ ID NO: 205)/VK3-15 (SEQ ID NO: 238); VH1-46 (SEQ ID NO: 205)/VL1-51 (SEQ ID NO: 252); VH1-46 (SEQ ID NO: 205)/VL3-21 (SEQ ID NO: 257); VH1-69*01 (SEQ ID NO: 206)/VL1-51 (SEQ ID NO: 252); VH3-07 (SEQ ID NO: 207)/VK1-12 (SEQ ID NO: 233); VH3-07 (SEQ ID NO: 207)/VK1-16 (SEQ ID NO: 234); VH3-07 (SEQ ID NO: 207)/VK1-27 (SEQ ID NO: 235); VH3-07 (SEQ ID NO: 207)/VK1-39 (SEQ ID NO: 236); VH3-07 (SEQ ID NO: 207)/VK3-15 (SEQ ID NO: 238); VH3-07 (SEQ ID NO: 207)/VL1-47 (SEQ ID NO: 251); VH3-07 (SEQ ID NO: 207)/VL1-51 (SEQ ID NO: 252); VH3-11 (SEQ ID NO: 208)/VK1-05 (SEQ ID NO: 230); VH3-11 (SEQ ID NO: 208)/VK1-39 (SEQ ID NO: 236); VH3-11 (SEQ ID NO: 208)/VK3-15 (SEQ ID NO: 238); VH3-11 (SEQ ID NO: 208)/VL1-40 (SEQ ID NO: 250); VH3-11 (SEQ ID NO: 208)/VL1-47 (SEQ ID NO: 251); VH3-11 (SEQ ID NO: 208)/VL1-51 (SEQ ID NO: 252); VH3-11 (SEQ ID NO: 208)/VL2-23 (SEQ ID NO: 255); VH3-15 (SEQ ID NO: 209)/VK1-05 (SEQ ID NO: 230); VH3-15 (SEQ ID NO: 209)/VK1-06 (SEQ ID NO: 231); VH3-15 (SEQ ID NO: 209)/VK1-12 (SEQ ID NO: 233); VH3-15 (SEQ ID NO: 209)/VK1-16 (SEQ ID NO: 234); VH3-15 (SEQ ID NO: 209)/VK1-27 (SEQ ID NO: 235); VH3-15 (SEQ ID NO: 209)/VK3-11 (SEQ ID NO: 237); VH3-15 (SEQ ID NO: 209)/VL1-40 (SEQ ID NO: 250); VH3-15 (SEQ ID NO: 209)/VL1-47 (SEQ ID NO: 251); VH3-15 (SEQ ID NO: 209)/VL1-51 (SEQ ID NO: 252); VH3-15 (SEQ ID NO: 209)/VL2-14 (SEQ ID NO: 254); VH3-21 (SEQ ID NO: 210)/VK1-12 (SEQ ID NO: 233); VH3-21 (SEQ ID NO: 210)/VK1-27 (SEQ ID NO: 235); VH3-21 (SEQ ID NO: 210)/VL2-11 (SEQ ID NO: 253); VH3-23 (SEQ ID NO: 211)/VK1-39 (SEQ ID NO: 236); VH3-23 (SEQ ID NO: 211)/VK3-15 (SEQ ID NO: 238); VH3-23 (SEQ ID NO: 211)/VL2-23 (SEQ ID NO: 255); VH3-23 (SEQ ID NO: 211)/VL3-1 (SEQ ID NO: 256); VH3-30 (SEQ ID NO: 212)/VK3-20 (SEQ ID NO: 239); VH3-53 (SEQ ID NO: 213)/VK3-15 (SEQ ID NO: 238); VH3-53 (SEQ ID NO: 213)/VL2-11 (SEQ ID NO: 253); VH3-74 (SEQ ID NO: 214)/VK1-05 (SEQ ID NO: 230); VH3-74 (SEQ ID NO: 214)/VK1-06 (SEQ ID NO: 231); VH3-74 (SEQ ID NO: 214)/VK1-12 (SEQ ID NO: 233); VH3-74 (SEQ ID NO: 214)/VK1-27 (SEQ ID NO: 235); VH3-74 (SEQ ID NO: 214)/VK3-20 (SEQ ID NO: 239); VH3-74 (SEQ ID NO: 214)/VL1-51 (SEQ ID NO: 252); VH5-51 (SEQ ID NO: 215)/VK1-39 (SEQ ID NO: 236); VH5-51 (SEQ ID NO: 215)/VL1-40 (SEQ ID NO: 250); VH5-51 (SEQ ID NO: 215)/VL1-51 (SEQ ID NO: 252); VH6-1 (SEQ ID NO: 216)/VK1-09 (SEQ ID NO: 232); VH6-1 (SEQ ID NO: 216)/VK3-15 (SEQ ID NO: 238); VH6-1 (SEQ ID NO: 216)/VK3-20 (SEQ ID NO: 239) 및 VH6-1 (SEQ ID NO: 216)/VL1-51 (SEQ ID NO: 252) 중 두 개 이상, 세 개 이상, 네 개 이상, 다섯 개 이상, 여섯 개 이상, 일곱 개 이상, 여덟 개 이상, 아홉 개 이상, 열 개 이상, 열 한 개 이상, 열 두 개 이상, 열 세 개 이상, 열 네 개 이상, 열 다섯 개 이상, 열 여섯 개 이상, 열 일곱 개 이상, 열 여덟 개 이상, 열 아홉 개 이상, 스무 개 이상, 스물 한 개 이상, 스물 두 개 이상, 스물 세 개 이상, 스물 네 개 이상, 스물 다섯 개 이상, 스물 여섯 개 이상, 스물 일곱 개 이상, 스물 여덟 개 이상, 스물 아홉 개 이상, 서른 개 이상, 서른 한 개 이상, 서른 두 개 이상, 서른 세 개 이상, 서른 네 개 이상, 서른 다섯 개 이상, 서른 여섯 개 이상, 서른 일곱 개 이상, 서른 여덟 개 이상, 서른 아홉 개 이상, 마흔 개 이상, 마흔 한 개 이상, 또는 마흔 두 개 이상, 또는 마흔 세 개 이상, 또는 마흔 네 개 이상, 또는 마흔 다섯 개 이상, 또는 마흔 여섯 개 이상, 또는 마흔 일곱 개 이상, 또는 마흔 여덟 개 이상, 또는 마흔 아홉 개 이상, 또는 쉰 개 이상, 또는 쉰 한 개 이상, 또는 쉰 두 개 이상, 또는 쉰 세 개 이상, 또는 쉰 네 개의 가변 중쇄 및 가변 경쇄 쌍으로부터 선택된 생식세포 단백질 서열을 포함한다.
일 구현예에서, 집합은 합성 항체 또는 이의 기능적 단편 또는 그러한 항체 또는 기능적 단편을 암호화하는 합성 핵산을 포함하며, 이때 항체 또는 기능적 단편의 실질적으로 모두, 또는 적어도 50%, 또는 적어도 60%, 또는 적어도 70%, 또는 적어도 80%, 또는 적어도 90%, 또는 적어도 95%, 또는 각각은 가변 중쇄 및 가변 경쇄 쌍을 포함하고, 이때 가변 중쇄 및 가변 경쇄 쌍의 기본틀 영역은 가변 중쇄 및 가변 중쇄 쌍 VH1-18 (SEQ ID NO: 204)/VK1-39 (SEQ ID NO: 236); VH1-18 (SEQ ID NO: 204)/VK3-15 (SEQ ID NO: 238); VH1-18 (SEQ ID NO: 204)/VK3-20 (SEQ ID NO: 239); VH1-46 (SEQ ID NO: 205)/VK3-15 (SEQ ID NO: 238); VH1-46 (SEQ ID NO: 205)/VL1-51 (SEQ ID NO: 252); VH1-46 (SEQ ID NO: 205)/VL3-21 (SEQ ID NO: 257); VH1-69*01 (SEQ ID NO: 206)/VL1-51 (SEQ ID NO: 252); VH3-07 (SEQ ID NO: 207)/VK1-12 (SEQ ID NO: 233); VH3-07 (SEQ ID NO: 207)/VK1-16 (SEQ ID NO: 234); VH3-07 (SEQ ID NO: 207)/VK1-27 (SEQ ID NO: 235); VH3-07 (SEQ ID NO: 207)/VK1-39 (SEQ ID NO: 236); VH3-07 (SEQ ID NO: 207)/VK3-15 (SEQ ID NO: 238); VH3-07 (SEQ ID NO: 207)/VL1-47 (SEQ ID NO: 251); VH3-07 (SEQ ID NO: 207)/VL1-51 (SEQ ID NO: 252); VH3-11 (SEQ ID NO: 208)/VK1-05 (SEQ ID NO: 230); VH3-11 (SEQ ID NO: 208)/VK1-39 (SEQ ID NO: 236); VH3-11 (SEQ ID NO: 208)/VK3-15 (SEQ ID NO: 238); VH3-11 (SEQ ID NO: 208)/VL1-40 (SEQ ID NO: 250); VH3-11 (SEQ ID NO: 208)/VL1-47 (SEQ ID NO: 251); VH3-11 (SEQ ID NO: 208)/VL1-51 (SEQ ID NO: 252); VH3-11 (SEQ ID NO: 208)/VL2-23 (SEQ ID NO: 255); VH3-15 (SEQ ID NO: 209)/VK1-05 (SEQ ID NO: 230); VH3-15 (SEQ ID NO: 209)/VK1-06 (SEQ ID NO: 231); VH3-15 (SEQ ID NO: 209)/VK1-12 (SEQ ID NO: 233); VH3-15 (SEQ ID NO: 209)/VK1-16 (SEQ ID NO: 234); VH3-15 (SEQ ID NO: 209)/VK1-27 (SEQ ID NO: 235); VH3-15 (SEQ ID NO: 209)/VK3-11 (SEQ ID NO: 237); VH3-15 (SEQ ID NO: 209)/VL1-40 (SEQ ID NO:
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일 구현예는 합성 항체 또는 이의 기능적 단편 또는 그러한 항체 또는 기능적 단편을 암호화하는 합성 핵산의 집합을 포함하며, 이때 항체 또는 기능적 단편은 가변 중쇄 및 가변 경쇄 쌍을 포함하며, 이때 가변 중쇄 및 가변 경쇄 쌍의 기본틀 영역은 가변 중쇄 및 가변 경쇄 쌍 VH1-18 (SEQ ID NO: 204)/VK1-39 (SEQ ID NO: 236); VH1-18 (SEQ ID NO: 204)/VK3-15 (SEQ ID NO: 238); VH1-18 (SEQ ID NO: 204)/VK3-20 (SEQ ID NO: 239); VH1-46 (SEQ ID NO: 205)/VK3-15 (SEQ ID NO: 238); VH1-46 (SEQ ID NO: 205)/VL1-51 (SEQ ID NO: 252); VH1-46 (SEQ ID NO: 205)/VL3-21 (SEQ ID NO: 257); VH1-69*01 (SEQ ID NO: 206)/VL1-51 (SEQ ID NO: 252); VH3-07 (SEQ ID NO: 207)/VK1-12 (SEQ ID NO: 233); VH3-07 (SEQ ID NO: 207)/VK1-16 (SEQ ID NO: 234); VH3-07 (SEQ ID NO: 207)/VK1-27 (SEQ ID NO: 235); VH3-07 (SEQ ID NO: 207)/VK1-39 (SEQ ID NO: 236); VH3-07 (SEQ ID NO: 207)/VK3-15 (SEQ ID NO: 238); VH3-07 (SEQ ID NO: 207)/VL1-47 (SEQ ID NO: 251); VH3-07 (SEQ ID NO: 207)/VL1-51 (SEQ ID NO: 252); VH3-11 (SEQ ID NO: 208)/VK1-05 (SEQ ID NO: 230); VH3-11 (SEQ ID NO: 208)/VK1-39 (SEQ ID NO: 236); VH3-11 (SEQ ID NO: 208)/VK3-15 (SEQ ID NO: 238); VH3-11 (SEQ ID NO: 208)/VL1-40 (SEQ ID NO: 250); VH3-11 (SEQ ID NO: 208)/VL1-47 (SEQ ID NO: 251); VH3-11 (SEQ ID NO: 208)/VL1-51 (SEQ ID NO: 252); VH3-11 (SEQ ID NO: 208)/VL2-23 (SEQ ID NO: 255); VH3-15 (SEQ ID NO: 209)/VK1-05 (SEQ ID NO: 230); VH3-15 (SEQ ID NO: 209)/VK1-06 (SEQ ID NO: 231); VH3-15 (SEQ ID NO: 209)/VK1-12 (SEQ ID NO: 233); VH3-15 (SEQ ID NO: 209)/VK1-16 (SEQ ID NO: 234); VH3-15 (SEQ ID NO: 209)/VK1-27 (SEQ ID NO: 235); VH3-15 (SEQ ID NO: 209)/VK3-11 (SEQ ID NO: 237); VH3-15 (SEQ ID NO: 209)/VL1-40 (SEQ ID NO: 250); VH3-15 (SEQ ID NO: 209)/VL1-47 (SEQ ID NO: 251); VH3-15 (SEQ ID NO: 209)/VL1-51 (SEQ ID NO: 252); VH3-15 (SEQ ID NO: 209)/VL2-14 (SEQ ID NO: 254); VH3-21 (SEQ ID NO: 210)/VK1-12 (SEQ ID NO: 233); VH3-21 (SEQ ID NO: 210)/VK1-27 (SEQ ID NO: 235); VH3-21 (SEQ ID NO: 210)/VL2-11 (SEQ ID NO: 253); VH3-23 (SEQ ID NO: 211)/VK1-39 (SEQ ID NO: 236); VH3-23 (SEQ ID NO: 211)/VK3-15 (SEQ ID NO: 238); VH3-23 (SEQ ID NO: 211)/VL2-23 (SEQ ID NO: 255); VH3-23 (SEQ ID NO: 211)/VL3-1 (SEQ ID NO: 256); VH3-30 (SEQ ID NO: 212)/VK3-20 (SEQ ID NO: 239); VH3-53 (SEQ ID NO: 213)/VK3-15 (SEQ ID NO: 238); VH3-53 (SEQ ID NO: 213)/VL2-11 (SEQ ID NO: 253); VH3-74 (SEQ ID NO: 214)/VK1-05 (SEQ ID NO: 230); VH3-74 (SEQ ID NO: 214)/VK1-06 (SEQ ID NO: 231); VH3-74 (SEQ ID NO: 214)/VK1-12 (SEQ ID NO: 233); VH3-74 (SEQ ID NO: 214)/VK1-27 (SEQ ID NO: 235); VH3-74 (SEQ ID NO: 214)/VK3-20 (SEQ ID NO: 239); VH3-74 (SEQ ID NO: 214)/VL1-51 (SEQ ID NO: 252); VH5-51 (SEQ ID NO: 215)/VK1-39 (SEQ ID NO: 236); VH5-51 (SEQ ID NO: 215)/VL1-40 (SEQ ID NO: 250); VH5-51 (SEQ ID NO: 215)/VL1-51 (SEQ ID NO: 252); VH6-1 (SEQ ID NO: 216)/VK1-09 (SEQ ID NO: 232); VH6-1 (SEQ ID NO: 216)/VK3-15 (SEQ ID NO: 238); VH6-1 (SEQ ID NO: 216)/VK3-20 (SEQ ID NO: 239) 및 VH6-1 (SEQ ID NO: 216)/VL1-51 (SEQ ID NO: 252)로 이루어지거나, 필수적으로 이러한 가변 중쇄 및 가변 경쇄 쌍으로 이루어진 생식세포 단백질 서열을 포함한다.
54개 쌍 또는 이의 부분집합을 포함하는 구현예에서, 추가적인 쌍이 집합에 추가되도록 선택될 수 있으며, 이때 추가된 각 생식세포 단백질 쌍은 다음과 같은 성질을 포함한다:
i) 1.538mL/mg의 흡광계수를 이용하고, 280nm에서 흡광도를 측정하는 UV 분광측정법으로 확인한, 적어도 2.5mg/L의 Fab 포맷의 발현 수율,
ii) PBS 완충액을 이용한 시차 주사 형광 분석법으로 확인한, 70℃ 이상에서의 Fab 포맷의 열 안정성,
iii) Superdex75 HR10/30 컬럼과 pH 7.4의 Gibco D-PBS 완충액을 이용한 크기 배제 크로마토그래피로 확인한, 적어도 98%의 Fab 포맷의 단량체 함량(단량체 %),
iv) 1.369mL/mg의 흡광계수를 이용하고, 280nm에서 흡광도를 측정하는 UV 분광측정법으로 확인한, 적어도 30mg/L의 IgG1 포맷의 발현 수율,
v) PBS 완충액을 이용한 시차 주사 형광 분석법으로 확인한, 73℃ 이상에서의 IgG1 포맷의 열 안정성, 및
vi) Tosoh TSK-Gel G3000SWxl 컬럼 및 pH 7.4의 Gibco D-PBS 완충액을 이용한 크기 배제 크로마토그래피로 확인한, 적어도 99%의 IgG1 포맷의 단량체 함량(단량체 %).
UV 분광측정법은 Nanadrop 시스템(peqlab, Erlangen, 독일)을 이용하여 이루어질 수 있다. 시차 주사 형광 분석법은 iCycler iQ5 Thermal Cycler(Biorad)를 이용하여 이루어질 수 있다. 시차 주사 형광 분석법은 Gibco D-PBS, pH 7.4(Invitrogen, Paisley, 미국)를 이용하여 이루어질 수 있다. 크기 배제 크로마토그래피는 AKTA 정제기 시스템(GE Healthcare)을 이용하여 이루어질 수 있다.
본원의 구현예는 개발 가능성과 관련된 우수한 기능적 활성을 가지고 있는 위의 생식세포 단백질 쌍(54개)의 부분집합을 포함한다. 일 구현예에서, 실시예 9.2.5(a~d)에 기술된 방법, 도 19 내지 도 24에 개시된 데이터, 실시예 9.2.6(a~d), 도 49 내지 도 54에 도시된 데이터 및 실시예 9.2.7, 도 55 내지 도 60에 도시된 점수를 이용하여 확인된 응력 시험 데이터를 비교한 결과를 기초로 하여, 생식세포 단백질 쌍의 부분집합(54개 중 36개)을 선별하였다. 산 노출 및 유리 구슬 교반을 견디는 능력을 확인하기 위하여, 응력 시험 방법은 IgG1 포맷의 95개 생식세포 단백질 쌍을 평가하였다. 일 구현예의 36개 생식세포 단백질 쌍은 산 및 교반 응력에 대해 강력한 저항을 나타내었으므로, 개발 가능성과 관련된 추가적인 우수한 기능적 특성을 가지고 있어서 선택되었다. 일 구현예에서 선택된 36개의 생식세포 단백질 쌍은 54개의 임계치의 기능적 활성 모두를 충족하였고, 또한, 다음과 같은 특성에 따라 생식세포 단백질 쌍의 점수를 매긴 응력 시험 누적 점수(실시예 9.2.7에 기술된 바와 같이)에서 1225점 이상을 기록했다: 산 노출 전과 후의 320nm에서의 흡광도, 산 노출 전과 후의 반지름 및 다분산성 %, 산 노출 전과 후의 입자 염색, 유리 구슬 교반 전과 후의 320nm에서의 흡광도, 유리 구슬 교반 후의 반지름 및 다분산성 %, 및 유리 구슬 교반 후 입자 염색. 이러한 구현예에서 선택된 36개의 생식세포 단백질 쌍은 각 기준에 대해 다음과 같은 임계치 이상의 수치를 나타냈다: a) 적어도 2.5mg/L의 (실시예 9.1.1에서 기술한 바와 같은) 정제된 Fab 발현 수율; b) 적어도 30.0mg/L의 (실시예 9.2.1에서 기술한 바와 같은) 정제된 IgG1 발현 수율; c) 적어도 70℃의 (실시예 9.1.2에서 기술한 바와 같은) 정제된 Fab의 열 안정성; d) 적어도 73℃의 (실시예 9.2.2에서 기술한 바와 같은) 정제된 IgG1의 열 안정성; e) 적어도 98%의 (실시예 9.1.3에서 기술한 바와 같은) 정제된 Fab의 단량체 함량; f) 적어도 99%의 (실시예 9.2.3에서 기술한 바와 같은) 정제된 IgG1의 단량체 함량 및 g) 적어도 1225의 (실시예 9.2.7에서 기술한 바와 같은) 응력 시험 누적 점수.
따라서, 일 구현예에서, 집합은 합성 항체 또는 이의 기능적 단편 또는 그러한 항체 또는 기능적 단편을 암호화하는 합성 핵산을 포함하며, 이때 항체 또는 기능적 단편은 가변 중쇄 및 가변 경쇄 쌍을 포함하며, 이때 가변 중쇄 및 가변 경쇄 쌍의 기본틀 영역은 가변 중쇄 및 가변 경쇄 쌍 VH1-18 (SEQ ID NO: 204)/VK3-20 (SEQ ID NO: 239); VH1-46 (SEQ ID NO: 205)/VK3-15 (SEQ ID NO: 238); VH1-46 (SEQ ID NO: 205)/VL1-51 (SEQ ID NO: 252); VH1-69*01 (SEQ ID NO: 206)/VL1-51 (SEQ ID NO: 252); VH3-07 (SEQ ID NO: 207)/VK1-12 (SEQ ID NO: 233); VH3-07 (SEQ ID NO: 207)/VK1-27 (SEQ ID NO: 235); VH3-07 (SEQ ID NO: 207)/VK3-15 (SEQ ID NO: 238); VH3-07 (SEQ ID NO: 207)/VL1-47 (SEQ ID NO: 251); VH3-07 (SEQ ID NO: 207)/VL1-51 (SEQ ID NO: 252); VH3-11 (SEQ ID NO: 208)/VL1-40 (SEQ ID NO: 250); VH3-11 (SEQ ID NO: 208)/VL1-47 (SEQ ID NO: 251); VH3-11 (SEQ ID NO: 208)/VL1-51 (SEQ ID NO: 252); VH3-11 (SEQ ID NO: 208)/VL2-23 (SEQ ID NO: 255); VH3-15 (SEQ ID NO: 209)/VK1-05 (SEQ ID NO: 230); VH3-15 (SEQ ID NO: 209)/VK1-06 (SEQ ID NO: 231); VH3-15 (SEQ ID NO: 209)/VK1-12 (SEQ ID NO: 233); VH3-15 (SEQ ID NO: 209)/VK1-27 (SEQ ID NO: 235); VH3-15 (SEQ ID NO: 209)/VK3-11 (SEQ ID NO: 237); VH3-15 (SEQ ID NO: 209)/VL1-51 (SEQ ID NO: 252); VH3-21 (SEQ ID NO: 210)/VK1-12 (SEQ ID NO: 233); VH3-23 (SEQ ID NO: 211)/VK1-39 (SEQ ID NO: 236); VH3-23 (SEQ ID NO: 211)/VK3-15 (SEQ ID NO: 238); VH3-23 (SEQ ID NO: 211)/VL2-23 (SEQ ID NO: 255); VH3-23 (SEQ ID NO: 211)/VL3-1 (SEQ ID NO: 256); VH3-53 (SEQ ID NO: 213)/VK3-15 (SEQ ID NO: 238); VH3-53 (SEQ ID NO: 213)/VL2-11 (SEQ ID NO: 253); VH3-74 (SEQ ID NO: 214)/VK1-05 (SEQ ID NO: 230); VH3-74 (SEQ ID NO: 214)/VK1-06 (SEQ ID NO: 231); VH3-74 (SEQ ID NO: 214)/VK1-12 (SEQ ID NO: 233); VH3-74 (SEQ ID NO: 214)/VK3-20 (SEQ ID NO: 239); VH5-51 (SEQ ID NO: 215)/VK1-39 (SEQ ID NO: 236); VH5-51 (SEQ ID NO: 215)/VL1-40 (SEQ ID NO: 250); VH5-51 (SEQ ID NO: 215)/VL1-51 (SEQ ID NO: 252); VH6-1 (SEQ ID NO: 216)/VK1-09 (SEQ ID NO: 232); VH6-1 (SEQ ID NO: 216)/VK3-20 (SEQ ID NO: 239) 및 VH6-1 (SEQ ID NO: 216)/VL1-51 (SEQ ID NO: 252)의 생식세포 단백질 서열을 포함한다.
36개 쌍 또는 이의 부분집합을 포함하는 구현예에서, 추가적인 쌍이 집합에 추가되도록 선택될 수 있으며, 이때 추가된 각 생식세포 단백질 쌍은 다음과 같은 성질을 포함한다:
i) 1.538mL/mg의 흡광계수를 이용하고, 280nm에서 흡광도를 측정하는 UV 분광측정법으로 확인한, 적어도 2.5mg/L의 Fab 포맷의 발현 수율,
ii) PBS 완충액을 이용한 시차 주사 형광 분석법으로 확인한, 70℃ 이상에서의 Fab 포맷의 열 안정성,
iii) Superdex75 HR10/30 컬럼과 pH 7.4의 Gibco D-PBS 완충액을 이용한 크기 배제 크로마토그래피로 확인한, 적어도 98%의 Fab 포맷의 단량체 함량(단량체 %),
iv) 1.369mL/mg의 흡광계수를 이용하고, 280nm에서 흡광도를 측정하는 UV 분광측정법으로 확인한, 적어도 30mg/L의 IgG1 포맷의 발현 수율,
v) PBS 완충액을 이용한 시차 주사 형광 분석법으로 확인한, 73℃ 이상에서의 IgG1 포맷의 열 안정성, 및
vi) Tosoh TSK-Gel G3000SWxl 컬럼 및 pH 7.4의 Gibco D-PBS 완충액을 이용한 크기 배제 크로마토그래피로 확인한, 적어도 99%의 IgG1 포맷의 단량체 함량(단량체 %).
UV 분광측정법은 Nanadrop 시스템(peqlab, Erlangen, 독일)을 이용하여 이루어질 수 있다. 시차 주사 형광 분석법은 iCycler iQ5 Thermal Cycler(Biorad)를 이용하여 이루어질 수 있다. 시차 주사 형광 분석법은 Gibco D-PBS, pH 7.4(Invitrogen, Paisley, 미국)를 이용하여 이루어질 수 있다. 크기 배제 크로마토그래피는 AKTA 정제기 시스템(GE Healthcare)을 이용하여 이루어질 수 있다.
구현예에서, 합성 항체 또는 이의 기능적 단편 또는 그러한 항체 또는 기능적 단편을 암호화하는 합성 핵산의 집합은, 이때 항체 또는 기능적 단편의 실질적으로 모두, 또는 적어도 50%, 또는 적어도 60%, 또는 적어도 70%, 또는 적어도 80%, 또는 적어도 90%, 또는 적어도 95%, 또는 각각은가변 중쇄 및 가변 경쇄 쌍을 포함하고, 이때 가변 중쇄 및 가변 경쇄 쌍의 기본틀 영역은 가변 중쇄 및 가변 경쇄 쌍 VH1-18 (SEQ ID NO: 204)/VK3-20 (SEQ ID NO: 239); VH1-46 (SEQ ID NO: 205)/VK3-15 (SEQ ID NO: 238); VH1-46 (SEQ ID NO: 205)/VL1-51 (SEQ ID NO: 252); VH1-69*01 (SEQ ID NO: 206)/VL1-51 (SEQ ID NO: 252); VH3-07 (SEQ ID NO: 207)/VK1-12 (SEQ ID NO: 233); VH3-07 (SEQ ID NO: 207)/VK1-27 (SEQ ID NO: 235); VH3-07 (SEQ ID NO: 207)/VK3-15 (SEQ ID NO: 238); VH3-07 (SEQ ID NO: 207)/VL1-47 (SEQ ID NO: 251); VH3-07 (SEQ ID NO: 207)/VL1-51 (SEQ ID NO: 252); VH3-11 (SEQ ID NO: 208)/VL1-40 (SEQ ID NO: 250); VH3-11 (SEQ ID NO: 208)/VL1-47 (SEQ ID NO: 251); VH3-11 (SEQ ID NO: 208)/VL1-51 (SEQ ID NO: 252); VH3-11 (SEQ ID NO: 208)/VL2-23 (SEQ ID NO: 255); VH3-15 (SEQ ID NO: 209)/VK1-05 (SEQ ID NO: 230); VH3-15 (SEQ ID NO: 209)/VK1-06 (SEQ ID NO: 231); VH3-15 (SEQ ID NO: 209)/VK1-12 (SEQ ID NO: 233); VH3-15 (SEQ ID NO: 209)/VK1-27 (SEQ ID NO: 235); VH3-15 (SEQ ID NO: 209)/VK3-11 (SEQ ID NO: 237); VH3-15 (SEQ ID NO: 209)/VL1-51 (SEQ ID NO: 252); VH3-21 (SEQ ID NO: 210)/VK1-12 (SEQ ID NO: 233); VH3-23 (SEQ ID NO: 211)/VK1-39 (SEQ ID NO: 236); VH3-23 (SEQ ID NO: 211)/VK3-15 (SEQ ID NO: 238); VH3-23 (SEQ ID NO: 211)/VL2-23 (SEQ ID NO: 255); VH3-23 (SEQ ID NO: 211)/VL3-1 (SEQ ID NO: 256); VH3-53 (SEQ ID NO: 213)/VK3-15 (SEQ ID NO: 238); VH3-53 (SEQ ID NO: 213)/VL2-11 (SEQ ID NO: 253); VH3-74 (SEQ ID NO: 214)/VK1-05 (SEQ ID NO: 230); VH3-74 (SEQ ID NO: 214)/VK1-06 (SEQ ID NO: 231); VH3-74 (SEQ ID NO: 214)/VK1-12 (SEQ ID NO: 233); VH3-74 (SEQ ID NO: 214)/VK3-20 (SEQ ID NO: 239); VH5-51 (SEQ ID NO: 215)/VK1-39 (SEQ ID NO: 236); VH5-51 (SEQ ID NO: 215)/VL1-40 (SEQ ID NO: 250); VH5-51 (SEQ ID NO: 215)/VL1-51 (SEQ ID NO: 252); VH6-1 (SEQ ID NO: 216)/VK1-09 (SEQ ID NO: 232); VH6-1 (SEQ ID NO: 216)/VK3-20 (SEQ ID NO: 239) 및 VH6-1 (SEQ ID NO: 216)/VL1-51 (SEQ ID NO: 252)로부터 선택된 생식세포 단백질 서열을 포함한다.
다른 구현예에서, 집합은 합성 항체 또는 이의 기능적 단편 또는 그러한 항체 또는 기능적 단편을 암호화하는 합성 핵산을 포함하며, 이때 항체 또는 기능적 단편은 가변 중쇄 및 가변 경쇄 쌍을 포함하며, 이때 가변 중쇄 및 가변 경쇄 쌍의 기본틀 영역은 다음과 같은 가변 중쇄 및 가변 경쇄 쌍 VH1-18 (SEQ ID NO: 204)/VK3-20 (SEQ ID NO: 239); VH1-46 (SEQ ID NO: 205)/VK3-15 (SEQ ID NO: 238); VH1-46 (SEQ ID NO: 205)/VL1-51 (SEQ ID NO: 252); VH1-69*01 (SEQ ID NO: 206)/VL1-51 (SEQ ID NO: 252); VH3-07 (SEQ ID NO: 207)/VK1-12 (SEQ ID NO: 233); VH3-07 (SEQ ID NO: 207)/VK1-27 (SEQ ID NO: 235); VH3-07 (SEQ ID NO: 207)/VK3-15 (SEQ ID NO: 238); VH3-07 (SEQ ID NO: 207)/VL1-47 (SEQ ID NO: 251); VH3-07 (SEQ ID NO: 207)/VL1-51 (SEQ ID NO: 252); VH3-11 (SEQ ID NO: 208)/VL1-40 (SEQ ID NO: 250); VH3-11 (SEQ ID NO: 208)/VL1-47 (SEQ ID NO: 251); VH3-11 (SEQ ID NO: 208)/VL1-51 (SEQ ID NO: 252); VH3-11 (SEQ ID NO: 208)/VL2-23 (SEQ ID NO: 255); VH3-15 (SEQ ID NO: 209)/VK1-05 (SEQ ID NO: 230); VH3-15 (SEQ ID NO: 209)/VK1-06 (SEQ ID NO: 231); VH3-15 (SEQ ID NO: 209)/VK1-12 (SEQ ID NO: 233); VH3-15 (SEQ ID NO: 209)/VK1-27 (SEQ ID NO: 235); VH3-15 (SEQ ID NO: 209)/VK3-11 (SEQ ID NO: 237); VH3-15 (SEQ ID NO: 209)/VL1-51 (SEQ ID NO: 252); VH3-21 (SEQ ID NO: 210)/VK1-12 (SEQ ID NO: 233); VH3-23 (SEQ ID NO: 211)/VK1-39 (SEQ ID NO: 236); VH3-23 (SEQ ID NO: 211)/VK3-15 (SEQ ID NO: 238); VH3-23 (SEQ ID NO: 211)/VL2-23 (SEQ ID NO: 255); VH3-23 (SEQ ID NO: 211)/VL3-1 (SEQ ID NO: 256); VH3-53 (SEQ ID NO: 213)/VK3-15 (SEQ ID NO: 238); VH3-53 (SEQ ID NO: 213)/VL2-11 (SEQ ID NO: 253); VH3-74 (SEQ ID NO: 214)/VK1-05 (SEQ ID NO: 230); VH3-74 (SEQ ID NO: 214)/VK1-06 (SEQ ID NO: 231); VH3-74 (SEQ ID NO: 214)/VK1-12 (SEQ ID NO: 233); VH3-74 (SEQ ID NO: 214)/VK3-20 (SEQ ID NO: 239); VH5-51 (SEQ ID NO: 215)/VK1-39 (SEQ ID NO: 236); VH5-51 (SEQ ID NO: 215)/VL1-40 (SEQ ID NO: 250); VH5-51 (SEQ ID NO: 215)/VL1-51 (SEQ ID NO: 252); VH6-1 (SEQ ID NO: 216)/VK1-09 (SEQ ID NO: 232); VH6-1 (SEQ ID NO: 216)/VK3-20 (SEQ ID NO: 239) 및 VH6-1 (SEQ ID NO: 216)/VL1-51 (SEQ ID NO: 252) 가운데 두 개 이상, 세 개 이상, 네 개 이상, 다섯 개 이상, 여섯 개 이상, 일곱 개 이상, 여덟 개 이상, 아홉 개 이상, 열 개 이상, 열 한 개 이상, 열 두 개 이상, 열 세 개 이상, 열 네 개 이상, 열 다섯 개 이상, 열 여섯 개 이상, 열 일곱 개 이상, 열 여덟 개 이상, 열 아홉 개 이상, 스무 개 이상, 스물 한 개 이상, 스물 두 개 이상, 스물 세 개 이상, 스물 네 개 이상, 스물 다섯 개 이상, 스물 여섯 개 이상, 스물 일곱 개 이상, 스물 여덟 개 이상, 스물 아홉 개 이상, 서른 개 이상, 서른 한 개 이상, 서른 두 개 이상, 서른 세 개 이상, 서른 네 개 이상, 서른 다섯 개 이상, 또는 서른 여섯 개로부터 선택된 생식세포 단백질 서열을 포함한다.
일 구현예에서, 집합은 합성 항체 또는 이의 기능적 단편 또는 그러한 항체 또는 기능적 단편을 암호화하는 합성 핵산을 포함하며, 이때 항체 또는 기능적 단편은 가변 중쇄 및 가변 경쇄 쌍을 포함하며, 이때 가변 중쇄 및 가변 경쇄 쌍의 기본틀 영역은 다음과 같은 가변 중쇄 및 가변 경쇄 쌍 VH1-18 (SEQ ID NO: 204)/VK3-20 (SEQ ID NO: 239); VH1-46 (SEQ ID NO: 205)/VK3-15 (SEQ ID NO: 238); VH1-46 (SEQ ID NO: 205)/VL1-51 (SEQ ID NO: 252); VH1-69*01 (SEQ ID NO: 206)/VL1-51 (SEQ ID NO: 252); VH3-07 (SEQ ID NO: 207)/VK1-12 (SEQ ID NO: 233); VH3-07 (SEQ ID NO: 207)/VK1-27 (SEQ ID NO: 235); VH3-07 (SEQ ID NO: 207)/VK3-15 (SEQ ID NO: 238); VH3-07 (SEQ ID NO: 207)/VL1-47 (SEQ ID NO: 251); VH3-07 (SEQ ID NO: 207)/VL1-51 (SEQ ID NO: 252); VH3-11 (SEQ ID NO: 208)/VL1-40 (SEQ ID NO: 250); VH3-11 (SEQ ID NO: 208)/VL1-47 (SEQ ID NO: 251); VH3-11 (SEQ ID NO: 208)/VL1-51 (SEQ ID NO: 252); VH3-11 (SEQ ID NO: 208)/VL2-23 (SEQ ID NO: 255); VH3-15 (SEQ ID NO: 209)/VK1-05 (SEQ ID NO: 230); VH3-15 (SEQ ID NO: 209)/VK1-06 (SEQ ID NO: 231); VH3-15 (SEQ ID NO: 209)/VK1-12 (SEQ ID NO: 233); VH3-15 (SEQ ID NO: 209)/VK1-27 (SEQ ID NO: 235); VH3-15 (SEQ ID NO: 209)/VK3-11 (SEQ ID NO: 237); VH3-15 (SEQ ID NO: 209)/VL1-51 (SEQ ID NO: 252); VH3-21 (SEQ ID NO: 210)/VK1-12 (SEQ ID NO: 233); VH3-23 (SEQ ID NO: 211)/VK1-39 (SEQ ID NO: 236); VH3-23 (SEQ ID NO: 211)/VK3-15 (SEQ ID NO: 238); VH3-23 (SEQ ID NO: 211)/VL2-23 (SEQ ID NO: 255); VH3-23 (SEQ ID NO: 211)/VL3-1 (SEQ ID NO: 256); VH3-53 (SEQ ID NO: 213)/VK3-15 (SEQ ID NO: 238); VH3-53 (SEQ ID NO: 213)/VL2-11 (SEQ ID NO: 253); VH3-74 (SEQ ID NO: 214)/VK1-05 (SEQ ID NO: 230); VH3-74 (SEQ ID NO: 214)/VK1-06 (SEQ ID NO: 231); VH3-74 (SEQ ID NO: 214)/VK1-12 (SEQ ID NO: 233); VH3-74 (SEQ ID NO: 214)/VK3-20 (SEQ ID NO: 239); VH5-51 (SEQ ID NO: 215)/VK1-39 (SEQ ID NO: 236); VH5-51 (SEQ ID NO: 215)/VL1-40 (SEQ ID NO: 250); VH5-51 (SEQ ID NO: 215)/VL1-51 (SEQ ID NO: 252); VH6-1 (SEQ ID NO: 216)/VK1-09 (SEQ ID NO: 232); VH6-1 (SEQ ID NO: 216)/VK3-20 (SEQ ID NO: 239) 및 VH6-1 (SEQ ID NO: 216)/VL1-51 (SEQ ID NO: 252)으로 이루어지거나, 필수적으로 이러한 가변 중쇄 및 가변 경쇄 쌍으로 이루어진 생식세포 단백질 서열을 포함한다.
다른 구현예에서, 각 기준에 대한 임계치는 다음과 같이 선택되었다: a) 적어도 2.5mg/L의 (실시예 9.1.1에서 기술한 바와 같은) 정제된 Fab 발현 수율; b) 적어도 30.0mg/L의 (실시예 9.2.1에서 기술한 바와 같은) 정제된 IgG1 발현 수율; c) 적어도 70℃의 (실시예 9.1.2에서 기술한 바와 같은) 정제된 Fab의 열 안정성; d) 적어도 73℃의 (실시예 9.2.2에서 기술한 바와 같은) 정제된 IgG1의 열 안정성; e) 적어도 99%의 (실시예 9.1.3에서 기술한 바와 같은) 정제된 Fab의 단량체 함량; f) 적어도 99%의 (실시예 9.2.3에서 기술한 바와 같은) 정제된 IgG1의 단량체 함량; g) 적어도 8.3의 (실시예 9.2.4에서 기술한 바와 같은) 정제된 IgG1의 등전점; 및 h) 적어도 1225의 (실시예 9.2.7에서 기술한 바와 같은) 응력 시험 누적 점수.
따라서, 일 구현예에서, 집합은 합성 항체 또는 이의 기능적 단편 또는 그러한 항체 또는 기능적 단편을 암호화하는 합성 핵산을 포함하며, 이때 항체 또는 기능적 단편은 생식세포 단백질 쌍의 생식세포 단백질 서열을 포함하는 가변 중쇄 및 가변 경쇄 기본틀 영역을 포함하며, 상기 생식세포 단백질 쌍은 다음과 같은 성질을 포함한다:
i) 적어도 2.5mg/L의 Fab 포맷의 발현 수율;
ii) Fab 포맷의 70℃ 이상의 열 안정성;
iii) SEC로 확인한, 적어도 99%의 Fab 포맷의 단량체 함량(단량체 %);
iv) 적어도 30mg/L의 IgG1 포맷의 발현 수율;
v) IgG1 포맷의 73℃ 이상의 열 안정성;
vi) SEC로 확인한, 적어도 99%의 IgG1 포맷의 단량체 함량(단량체 %); 및
vii) 적어도 8.3의 IgG1 포맷의 등전점.
특정 구현예에서,
i) Fab 포맷의 발현 수율은 1.538mL/mg의 흡광계수를 이용하고, 280nm에서 흡광도를 측정하는 UV 분광측정법으로 확인하였다.
특정 구현예에서,
ii) Fab 포맷의 열 안정성은 PBS 완충액을 이용한 시차 주사 형광 분석법으로 확인하였다.
특정 구현예에서,
iii) Fab 포맷의 단량체 함량(단량체 %)은 Superdex75 HR10/30 컬럼과 pH 7.4의 Gibco D-PBS 완충액을 이용한 크기 배제 크로마토그래피로 확인하였다.
특정 구현예에서,
iv) IgG1 포맷의 발현 수율은 1.369mL/mg의 흡광계수를 이용하고, 280nm에서 흡광도를 측정하는 UV 분광측정법으로 확인하였다.
특정 구현예에서,
v) IgG1 포맷의 열 안정성은 PBS 완충액을 이용한 시차 주사 형광 분석법으로 확인하였다.
특정 구현예에서,
vi) IgG1 포맷의 단량체 함량(단량체 %)은 Tosoh TSK-Gel G3000SWxl 컬럼과 pH 7.4의 Gibco D-PBS 완충액을 이용한 크기 배제 크로마토그래피로 확인하였다.
UV 분광측정법은 Nanadrop 시스템(peqlab, Erlangen, 독일)을 이용하여 이루어질 수 있다. 시차 주사 형광 분석법은 iCycler iQ5 Thermal Cycler(Biorad)를 이용하여 이루어질 수 있다. 시차 주사 형광 분석법은 Gibco D-PBS, pH 7.4(Invitrogen, Paisley, 미국)를 이용하여 이루어질 수 있다. 크기 배제 크로마토그래피는 AKTA 정제기 시스템(GE Healthcare)을 이용하여 이루어질 수 있다.
추가적인 구현예에서, 집합은 합성 항체 또는 이의 기능적 단편 또는 그러한 항체 또는 기능적 단편을 암호화하는 합성 핵산을 포함하며, 이때 항체 또는 기능적 단편의 실질적으로 모두, 또는 적어도 50%, 또는 적어도 60%, 또는 적어도 70%, 또는 적어도 80%, 또는 적어도 90%, 또는 적어도 95%, 또는 각각은 생식세포 단백질 쌍의 생식세포 단백질 서열을 포함하는 가변 중쇄 및 가변 경쇄 기본틀 영역을 포함하고, 이때, 상기 생식세포 단백질 쌍은 다음과 같은 성질을 포함한다:
i) 적어도 2.5mg/L의 Fab 포맷의 발현 수율;
ii) Fab 포맷의 70℃ 이상의 열 안정성;
iii) SEC로 확인한, 적어도 99%의 Fab 포맷의 단량체 함량(단량체 %);
iv) 적어도 30mg/L의 IgG1 포맷의 발현 수율;
v) IgG1 포맷의 73℃ 이상의 열 안정성;
vi) SEC로 확인한, 적어도 99%의 IgG1 포맷의 단량체 함량(단량체 %); 및
vii) 적어도 8.3의 IgG1 포맷의 등전점.
추가적인 구현예에서, 집합은 합성 항체 또는 이의 기능적 단편 또는 그러한 항체 또는 기능적 단편을 암호화하는 합성 핵산을 포함하며, 이때 항체 또는 기능적 단편은 생식세포 단백질 쌍의 생식세포 단백질 서열을 포함하는 가변 중쇄 및 가변 경쇄 기본틀 영역으로 이루어지거나, 필수적으로 이러한 가변 중쇄 및 가변 경쇄 기본틀 영역으로 이루어지며, 이때 상기 생식세포 단백질 쌍은 다음과 같은 성질을 포함한다:
i) 적어도 2.5mg/L의 Fab 포맷의 발현 수율;
ii) Fab 포맷의 70℃ 이상의 열 안정성;
iii) SEC로 확인한, 적어도 99%의 Fab 포맷의 단량체 함량(단량체 %);
iv) 적어도 30mg/L의 IgG1 포맷의 발현 수율;
v) IgG1 포맷의 73℃ 이상의 열 안정성;
vi) SEC로 확인한, 적어도 99%의 IgG1 포맷의 단량체 함량(단량체 %); 및
vii) 적어도 8.3의 IgG1 포맷의 등전점.
다음과 같은 생식세포 단백질 쌍(33개): VH1-18 (SEQ ID NO: 204)/VK3-20 (SEQ ID NO: 239); VH1-46 (SEQ ID NO: 205)/VK3-15 (SEQ ID NO: 238); VH1-46 (SEQ ID NO: 205)/VL1-51 (SEQ ID NO: 252); VH1-69*01 (SEQ ID NO: 206)/VL1-51 (SEQ ID NO: 252); VH3-07 (SEQ ID NO: 207)/VK1-12 (SEQ ID NO: 233); VH3-07 (SEQ ID NO: 207)/VK1-27 (SEQ ID NO: 235); VH3-07 (SEQ ID NO: 207)/VK3-15 (SEQ ID NO: 238); VH3-07 (SEQ ID NO: 207)/VL1-47 (SEQ ID NO: 251); VH3-07 (SEQ ID NO: 207)/VL1-51 (SEQ ID NO: 252); VH3-11 (SEQ ID NO: 208)/VL1-40 (SEQ ID NO: 250); VH3-11 (SEQ ID NO: 208)/VL1-47 (SEQ ID NO: 251); VH3-11 (SEQ ID NO: 208)/VL1-51 (SEQ ID NO: 252); VH3-11 (SEQ ID NO: 208)/VL2-23 (SEQ ID NO: 255); VH3-15 (SEQ ID NO: 209)/VK1-05 (SEQ ID NO: 230); VH3-15 (SEQ ID NO: 209)/VK1-06 (SEQ ID NO: 231); VH3-15 (SEQ ID NO: 209)/VK1-12 (SEQ ID NO: 233); VH3-15 (SEQ ID NO: 209)/VK1-27 (SEQ ID NO: 235); VH3-15 (SEQ ID NO: 209)/VK3-11 (SEQ ID NO: 237); VH3-15 (SEQ ID NO: 209)/VL1-51 (SEQ ID NO: 252); VH3-21 (SEQ ID NO: 210)/VK1-12 (SEQ ID NO: 233); VH3-23 (SEQ ID NO: 211)/VK3-15 (SEQ ID NO: 238); VH3-53 (SEQ ID NO: 213)/VK3-15 (SEQ ID NO: 238); VH3-53 (SEQ ID NO: 213)/VL2-11 (SEQ ID NO: 253); VH3-74 (SEQ ID NO: 214)/VK1-05 (SEQ ID NO: 230); VH3-74 (SEQ ID NO: 214)/VK1-06 (SEQ ID NO: 231); VH3-74 (SEQ ID NO: 214)/VK1-12 (SEQ ID NO: 233); VH3-74 (SEQ ID NO: 214)/VK3-20 (SEQ ID NO: 239); VH5-51 (SEQ ID NO: 215)/VK1-39 (SEQ ID NO: 236); VH5-51 (SEQ ID NO: 215)/VL1-40 (SEQ ID NO: 250); VH5-51 (SEQ ID NO: 215)/VL1-51 (SEQ ID NO: 252); VH6-1 (SEQ ID NO: 216)/VK1-09 (SEQ ID NO: 232); VH6-1 (SEQ ID NO: 216)/VK3-20 (SEQ ID NO: 239) 및 VH6-1 (SEQ ID NO: 216)/VL1-51 (SEQ ID NO: 252)이 다음과 같은 임계치 이상이어서, 개발 가능성과 관련된 우수한 기능적 활성을 나타낸다: a) 적어도 2.5mg/L의 (실시예 9.1.1에서 기술한 바와 같은) 정제된 Fab 발현 수율; b) 적어도 30.0mg/L의 (실시예 9.2.1에서 기술한 바와 같은) 정제된 IgG1 발현 수율; c) 적어도 70℃의 (실시예 9.1.2에서 기술한 바와 같은) 정제된 Fab의 열 안정성; d) 적어도 73℃의 (실시예 9.2.2에서 기술한 바와 같은) 정제된 IgG1의 열 안정성; e) 적어도 99%의 (실시예 9.1.3에서 기술한 바와 같은) 정제된 Fab의 단량체 함량; f) 적어도 99%의 (실시예 9.2.3에서 기술한 바와 같은) 정제된 IgG1의 단량체 함량; g) 적어도 8.3의 (실시예 9.2.4에서 기술한 바와 같은) 정제된 IgG1의 등전점; 및 적어도 1225의 (실시예 9.2.7에서 기술한 바와 같은) 응력 시험 누적 점수.
따라서, 일 구현예에서, 집합은 합성 항체 또는 이의 기능적 단편 또는 그러한 항체 또는 기능적 단편을 암호화하는 합성 핵산을 포함하며, 이때 항체 또는 기능적 단편은 가변 중쇄 및 가변 경쇄 쌍을 포함하며, 가변 중쇄 및 가변 경쇄 쌍의 기본틀 영역은 가변 중쇄 및 가변 경쇄 쌍 VH1-18 (SEQ ID NO: 204)/VK3-20 (SEQ ID NO: 239); VH1-46 (SEQ ID NO: 205)/VK3-15 (SEQ ID NO: 238); VH1-46 (SEQ ID NO: 205)/VL1-51 (SEQ ID NO: 252); VH1-69*01 (SEQ ID NO: 206)/VL1-51 (SEQ ID NO: 252); VH3-07 (SEQ ID NO: 207)/VK1-12 (SEQ ID NO: 233); VH3-07 (SEQ ID NO: 207)/VK1-27 (SEQ ID NO: 235); VH3-07 (SEQ ID NO: 207)/VK3-15 (SEQ ID NO: 238); VH3-07 (SEQ ID NO: 207)/VL1-47 (SEQ ID NO: 251); VH3-07 (SEQ ID NO: 207)/VL1-51 (SEQ ID NO: 252); VH3-11 (SEQ ID NO: 208)/VL1-40 (SEQ ID NO: 250); VH3-11 (SEQ ID NO: 208)/VL1-47 (SEQ ID NO: 251); VH3-11 (SEQ ID NO: 208)/VL1-51 (SEQ ID NO: 252); VH3-11 (SEQ ID NO: 208)/VL2-23 (SEQ ID NO: 255); VH3-15 (SEQ ID NO: 209)/VK1-05 (SEQ ID NO: 230); VH3-15 (SEQ ID NO: 209)/VK1-06 (SEQ ID NO: 231); VH3-15 (SEQ ID NO: 209)/VK1-12 (SEQ ID NO: 233); VH3-15 (SEQ ID NO: 209)/VK1-27 (SEQ ID NO: 235); VH3-15 (SEQ ID NO: 209)/VK3-11 (SEQ ID NO: 237); VH3-15 (SEQ ID NO: 209)/VL1-51 (SEQ ID NO: 252); VH3-21 (SEQ ID NO: 210)/VK1-12 (SEQ ID NO: 233); VH3-23 (SEQ ID NO: 211)/VK3-15 (SEQ ID NO: 238); VH3-53 (SEQ ID NO: 213)/VK3-15 (SEQ ID NO: 238); VH3-53 (SEQ ID NO: 213)/VL2-11 (SEQ ID NO: 253); VH3-74 (SEQ ID NO: 214)/VK1-05 (SEQ ID NO: 230); VH3-74 (SEQ ID NO: 214)/VK1-06 (SEQ ID NO: 231); VH3-74 (SEQ ID NO: 214)/VK1-12 (SEQ ID NO: 233); VH3-74 (SEQ ID NO: 214)/VK3-20 (SEQ ID NO: 239); VH5-51 (SEQ ID NO: 215)/VK1-39 (SEQ ID NO: 236); VH5-51 (SEQ ID NO: 215)/VL1-40 (SEQ ID NO: 250); VH5-51 (SEQ ID NO: 215)/VL1-51 (SEQ ID NO: 252); VH6-1 (SEQ ID NO: 216)/VK1-09 (SEQ ID NO: 232); VH6-1 (SEQ ID NO: 216)/VK3-20 (SEQ ID NO: 239) 및 VH6-1 (SEQ ID NO: 216)/VL1-51 (SEQ ID NO: 252)의 생식세포 단백질 서열을 포함한다.
33개 쌍 또는 이의 부분집합을 포함하는 구현예에서, 추가적인 쌍이 집합에 추가되도록 선택될 수 있으며, 이때 추가된 각 생식세포 단백질 쌍은 다음과 같은 성질을 포함한다:
i) 1.538mL/mg의 흡광계수를 이용하고, 280nm에서 흡광도를 측정하는 UV 분광측정법으로 확인한, 적어도 2.5mg/L의 Fab 포맷의 발현 수율,
ii) PBS 완충액을 이용한 시차 주사 형광 분석법으로 확인한, 70℃ 이상에서의 Fab 포맷의 열 안정성,
iii) Superdex75 HR10/30 컬럼과 pH 7.4의 Gibco D-PBS 완충액을 이용한 크기 배제 크로마토그래피로 확인한, 적어도 99%의 Fab 포맷의 단량체 함량(단량체 %),
iv) 1.369mL/mg의 흡광계수를 이용하고, 280nm에서 흡광도를 측정하는 UV 분광측정법으로 확인한, 적어도 30mg/L의 IgG1 포맷의 발현 수율,
v) PBS 완충액을 이용한 시차 주사 형광 분석법으로 확인한, 73℃ 이상에서의 IgG1 포맷의 열 안정성, 및
vi) Tosoh TSK-Gel G3000SWxl 컬럼 및 pH 7.4의 Gibco D-PBS 완충액을 이용한 크기 배제 크로마토그래피로 확인한, 적어도 99%의 IgG1 포맷의 단량체 함량(단량체 %).
UV 분광측정법은 Nanadrop 시스템(peqlab, Erlangen, 독일)을 이용하여 이루어질 수 있다. 시차 주사 형광 분석법은 iCycler iQ5 Thermal Cycler(Biorad)를 이용하여 이루어질 수 있다. 시차 주사 형광 분석법은 Gibco D-PBS, pH 7.4(Invitrogen, Paisley, 미국)를 이용하여 이루어질 수 있다. 크기 배제 크로마토그래피는 AKTA 정제기 시스템(GE Healthcare)을 이용하여 이루어질 수 있다.
33개 쌍 또는 이의 부분집합을 포함하는 구현예에서, 추가적인 쌍이 집합에 추가되도록 선택될 수 있으며, 이때 추가된 각 생식세포 단백질 쌍은 다음과 같은 성질을 더 포함한다:
vii) 적어도 8.3의 IgG1 포맷의 등전점.
추가적인 구현예에서, 쌍 자체가 각 기준 내의 임계치 전부를 충족하지 못했다 하더라도 쌍을 집합에 추가하고, 다양성을 향상시키기 위하여 쌍을 집합에 추가하였다. 일 구현예에서, 33개의 생식세포 단백질 쌍의 집합은 VH3-23 (SEQ ID NO: 211)/VK1-39 (SEQ ID NO: 236); VH3-23 (SEQ ID NO: 211)/VL2-23 (SEQ ID NO: 255); 및 VH3-23 (SEQ ID NO: 211)/VL3-1 (SEQ ID NO: 256)을 더 포함한다. 이러한 실시예에서, 집합은 (36개 쌍) VH1-18 (SEQ ID NO: 204)/VK3-20 (SEQ ID NO: 239); VH1-46 (SEQ ID NO: 205)/VK3-15 (SEQ ID NO: 238); VH1-46 (SEQ ID NO: 205)/VL1-51 (SEQ ID NO: 252); VH1-69*01 (SEQ ID NO: 206)/VL1-51 (SEQ ID NO: 252); VH3-07 (SEQ ID NO: 207)/VK1-12 (SEQ ID NO: 233); VH3-07 (SEQ ID NO: 207)/VK1-27 (SEQ ID NO: 235); VH3-07 (SEQ ID NO: 207)/VK3-15 (SEQ ID NO: 238); VH3-07 (SEQ ID NO: 207)/VL1-47 (SEQ ID NO: 251); VH3-07 (SEQ ID NO: 207)/VL1-51 (SEQ ID NO: 252); VH3-11 (SEQ ID NO: 208)/VL1-40 (SEQ ID NO: 250); VH3-11 (SEQ ID NO: 208)/VL1-47 (SEQ ID NO: 251); VH3-11 (SEQ ID NO: 208)/VL1-51 (SEQ ID NO: 252); VH3-11 (SEQ ID NO: 208)/VL2-23 (SEQ ID NO: 255); VH3-15 (SEQ ID NO: 209)/VK1-05 (SEQ ID NO: 230); VH3-15 (SEQ ID NO: 209)/VK1-06 (SEQ ID NO: 231); VH3-15 (SEQ ID NO: 209)/VK1-12 (SEQ ID NO: 233); VH3-15 (SEQ ID NO: 209)/VK1-27 (SEQ ID NO: 235); VH3-15 (SEQ ID NO: 209)/VK3-11 (SEQ ID NO: 237); VH3-15 (SEQ ID NO: 209)/VL1-51 (SEQ ID NO: 252); VH3-21 (SEQ ID NO: 210)/VK1-12 (SEQ ID NO: 233); VH3-23 (SEQ ID NO: 211)/VK1-39 (SEQ ID NO: 236); VH3-23 (SEQ ID NO: 211)/VK3-15 (SEQ ID NO: 238); VH3-23 (SEQ ID NO: 211)/VL2-23 (SEQ ID NO: 255); VH3-23 (SEQ ID NO: 211)/VL3-1 (SEQ ID NO: 256); VH3-53 (SEQ ID NO: 213)/VK3-15 (SEQ ID NO: 238); VH3-53 (SEQ ID NO: 213)/VL2-11 (SEQ ID NO: 253); VH3-74 (SEQ ID NO: 214)/VK1-05 (SEQ ID NO: 230); VH3-74 (SEQ ID NO: 214)/VK1-06 (SEQ ID NO: 231); VH3-74 (SEQ ID NO: 214)/VK1-12 (SEQ ID NO: 233); VH3-74 (SEQ ID NO: 214)/VK3-20 (SEQ ID NO: 239); VH5-51 (SEQ ID NO: 215)/VK1-39 (SEQ ID NO: 236); VH5-51 (SEQ ID NO: 215)/VL1-40 (SEQ ID NO: 250); VH5-51 (SEQ ID NO: 215)/VL1-51 (SEQ ID NO: 252); VH6-1 (SEQ ID NO: 216)/VK1-09 (SEQ ID NO: 232); VH6-1 (SEQ ID NO: 216)/VK3-20 (SEQ ID NO: 239) 및 VH6-1 (SEQ ID NO: 216)/VL1-51 (SEQ ID NO: 252)을 포함한다.
구현예에서, 이들 생식세포 단백질 쌍 또는 그러한 항체 또는 기능적 단편을 암호화하는 합성 핵산을 임의의 수로 포함하는 집합은 임의의 항원에 대한 개발 가능한 항체 또는 이의 단편을 확인하는 데 이용될 수 있다.
일부 구현예에서, 집합은 합성 항체 또는 이의 기능적 단편 또는 그러한 항체 또는 기능적 단편을 암호화하는 합성 핵산을 포함하며, 이때 항체 또는 기능적 단편은 가변 중쇄 및 가변 경쇄 쌍을 포함하며, 가변 중쇄 및 가변 경쇄 쌍의 기본틀 영역은 VH1-18 (SEQ ID NO: 204)/VK3-20 (SEQ ID NO: 239); VH1-46 (SEQ ID NO: 205)/VK3-15 (SEQ ID NO: 238); VH1-46 (SEQ ID NO: 205)/VL1-51 (SEQ ID NO: 252); VH1-69*01 (SEQ ID NO: 206)/VL1-51 (SEQ ID NO: 252); VH3-07 (SEQ ID NO: 207)/VK1-12 (SEQ ID NO: 233); VH3-07 (SEQ ID NO: 207)/VK1-27 (SEQ ID NO: 235); VH3-07 (SEQ ID NO: 207)/VK3-15 (SEQ ID NO: 238); VH3-07 (SEQ ID NO: 207)/VL1-47 (SEQ ID NO: 251); VH3-07 (SEQ ID NO: 207)/VL1-51 (SEQ ID NO: 252); VH3-11 (SEQ ID NO: 208)/VL1-40 (SEQ ID NO: 250); VH3-11 (SEQ ID NO: 208)/VL1-47 (SEQ ID NO: 251); VH3-11 (SEQ ID NO: 208)/VL1-51 (SEQ ID NO: 252); VH3-11 (SEQ ID NO: 208)/VL2-23 (SEQ ID NO: 255); VH3-15 (SEQ ID NO: 209)/VK1-05 (SEQ ID NO: 230); VH3-15 (SEQ ID NO: 209)/VK1-06 (SEQ ID NO: 231); VH3-15 (SEQ ID NO: 209)/VK1-12 (SEQ ID NO: 233); VH3-15 (SEQ ID NO: 209)/VK1-27 (SEQ ID NO: 235); VH3-15 (SEQ ID NO: 209)/VK3-11 (SEQ ID NO: 237); VH3-15 (SEQ ID NO: 209)/VL1-51 (SEQ ID NO: 252); VH3-21 (SEQ ID NO: 210)/VK1-12 (SEQ ID NO: 233); VH3-23 (SEQ ID NO: 211)/VK3-15 (SEQ ID NO: 238); VH3-53 (SEQ ID NO: 213)/VK3-15 (SEQ ID NO: 238); VH3-53 (SEQ ID NO: 213)/VL2-11 (SEQ ID NO: 253); VH3-74 (SEQ ID NO: 214)/VK1-05 (SEQ ID NO: 230); VH3-74 (SEQ ID NO: 214)/VK1-06 (SEQ ID NO: 231); VH3-74 (SEQ ID NO: 214)/VK1-12 (SEQ ID NO: 233); VH3-74 (SEQ ID NO: 214)/VK3-20 (SEQ ID NO: 239); VH5-51 (SEQ ID NO: 215)/VK1-39 (SEQ ID NO: 236); VH5-51 (SEQ ID NO: 215)/VL1-40 (SEQ ID NO: 250); VH5-51 (SEQ ID NO: 215)/VL1-51 (SEQ ID NO: 252); VH6-1 (SEQ ID NO: 216)/VK1-09 (SEQ ID NO: 232); VH6-1 (SEQ ID NO: 216)/VK3-20 (SEQ ID NO: 239) 및 VH6-1 (SEQ ID NO: 216)/VL1-51 (SEQ ID NO: 252)으로 이루어진 군으로부터 선택된 두 개 이상, 세 개 이상, 네 개 이상, 다섯 개 이상, 여섯 개 이상, 일곱 개 이상, 여덟 개 이상, 아홉 개 이상, 열 개 이상, 열 한 개 이상, 열 두 개 이상, 열 세 개 이상, 열 네 개 이상, 열 다섯 개 이상, 열 여섯 개 이상, 열 일곱 개 이상, 열 여덟 개 이상, 열 아홉 개 이상, 스무 개 이상, 스물 한 개 이상, 스물 두 개 이상, 스물 세 개 이상, 스물 네 개, 스물 다섯 개 이상, 스물 여섯 개 이상, 스물 일곱 개 이상, 스물 여덟 개 이상, 스물 아홉 개 이상, 서른 개 이상, 서른 한 개 이상, 서른 두 개 이상, 서른 세 개 이상의 가변 중쇄 및 가변 경쇄 쌍으로부터 선택된 생식세포 단백질 서열을 포함한다.
일 구현예에서, 집합은 합성 항체 또는 이의 기능적 단편 또는 그러한 항체 또는 기능적 단편을 암호화하는 합성 핵산을 포함하며, 이때 항체 또는 기능적 단편의 실질적으로 모두, 또는 적어도 50%, 또는 적어도 60%, 또는 적어도 70%, 또는 적어도 80%, 또는 적어도 90%, 또는 적어도 95%, 또는 각각은 가변 중쇄 및 가변 경쇄 쌍을 포함하며, 이때 가변 중쇄 및 가변 경쇄 쌍의 기본틀 영역은 가변 중쇄 및 가변 경쇄 쌍 VH1-18 (SEQ ID NO: 204)/VK3-20 (SEQ ID NO: 239); VH1-46 (SEQ ID NO: 205)/VK3-15 (SEQ ID NO: 238); VH1-46 (SEQ ID NO: 205)/VL1-51 (SEQ ID NO: 252); VH1-69*01 (SEQ ID NO: 206)/VL1-51 (SEQ ID NO: 252); VH3-07 (SEQ ID NO: 207)/VK1-12 (SEQ ID NO: 233); VH3-07 (SEQ ID NO: 207)/VK1-27 (SEQ ID NO: 235); VH3-07 (SEQ ID NO: 207)/VK3-15 (SEQ ID NO: 238); VH3-07 (SEQ ID NO: 207)/VL1-47 (SEQ ID NO: 251); VH3-07 (SEQ ID NO: 207)/VL1-51 (SEQ ID NO: 252); VH3-11 (SEQ ID NO: 208)/VL1-40 (SEQ ID NO: 250); VH3-11 (SEQ ID NO: 208)/VL1-47 (SEQ ID NO: 251); VH3-11 (SEQ ID NO: 208)/VL1-51 (SEQ ID NO: 252); VH3-11 (SEQ ID NO: 208)/VL2-23 (SEQ ID NO: 255); VH3-15 (SEQ ID NO: 209)/VK1-05 (SEQ ID NO: 230); VH3-15 (SEQ ID NO: 209)/VK1-06 (SEQ ID NO: 231); VH3-15 (SEQ ID NO: 209)/VK1-12 (SEQ ID NO: 233); VH3-15 (SEQ ID NO: 209)/VK1-27 (SEQ ID NO: 235); VH3-15 (SEQ ID NO: 209)/VK3-11 (SEQ ID NO: 237); VH3-15 (SEQ ID NO: 209)/VL1-51 (SEQ ID NO: 252); VH3-21 (SEQ ID NO: 210)/VK1-12 (SEQ ID NO: 233); VH3-23 (SEQ ID NO: 211)/VK3-15 (SEQ ID NO: 238); VH3-53 (SEQ ID NO: 213)/VK3-15 (SEQ ID NO: 238); VH3-53 (SEQ ID NO: 213)/VL2-11 (SEQ ID NO: 253); VH3-74 (SEQ ID NO: 214)/VK1-05 (SEQ ID NO: 230); VH3-74 (SEQ ID NO: 214)/VK1-06 (SEQ ID NO: 231); VH3-74 (SEQ ID NO: 214)/VK1-12 (SEQ ID NO: 233); VH3-74 (SEQ ID NO: 214)/VK3-20 (SEQ ID NO: 239); VH5-51 (SEQ ID NO: 215)/VK1-39 (SEQ ID NO: 236); VH5-51 (SEQ ID NO: 215)/VL1-40 (SEQ ID NO: 250); VH5-51 (SEQ ID NO: 215)/VL1-51 (SEQ ID NO: 252); VH6-1 (SEQ ID NO: 216)/VK1-09 (SEQ ID NO: 232); VH6-1 (SEQ ID NO: 216)/VK3-20 (SEQ ID NO: 239) 및 VH6-1 (SEQ ID NO: 216)/VL1-51 (SEQ ID NO: 252)으로부터 선택된 생식세포 단백질 서열을 포함한다.
일 구현예는 합성 항체 또는 이의 기능적 단편 또는 그러한 항체 또는 기능적 단편을 암호화하는 합성 핵산의 집합을 포함하며, 이때 항체 또는 기능적 단편은 가변 중쇄 및 가변 경쇄 쌍을 포함하며, 이때 가변 중쇄 및 가변 경쇄 쌍의 기본틀 영역은 가변 중쇄 및 가변 경쇄 쌍 VH1-18 (SEQ ID NO: 204)/VK3-20 (SEQ ID NO: 239); VH1-46 (SEQ ID NO: 205)/VK3-15 (SEQ ID NO: 238); VH1-46 (SEQ ID NO: 205)/VL1-51 (SEQ ID NO: 252); VH1-69*01 (SEQ ID NO: 206)/VL1-51 (SEQ ID NO: 252); VH3-07 (SEQ ID NO: 207)/VK1-12 (SEQ ID NO: 233); VH3-07 (SEQ ID NO: 207)/VK1-27 (SEQ ID NO: 235); VH3-07 (SEQ ID NO: 207)/VK3-15 (SEQ ID NO: 238); VH3-07 (SEQ ID NO: 207)/VL1-47 (SEQ ID NO: 251); VH3-07 (SEQ ID NO: 207)/VL1-51 (SEQ ID NO: 252); VH3-11 (SEQ ID NO: 208)/VL1-40 (SEQ ID NO: 250); VH3-11 (SEQ ID NO: 208)/VL1-47 (SEQ ID NO: 251); VH3-11 (SEQ ID NO: 208)/VL1-51 (SEQ ID NO: 252); VH3-11 (SEQ ID NO: 208)/VL2-23 (SEQ ID NO: 255); VH3-15 (SEQ ID NO: 209)/VK1-05 (SEQ ID NO: 230); VH3-15 (SEQ ID NO: 209)/VK1-06 (SEQ ID NO: 231); VH3-15 (SEQ ID NO: 209)/VK1-12 (SEQ ID NO: 233); VH3-15 (SEQ ID NO: 209)/VK1-27 (SEQ ID NO: 235); VH3-15 (SEQ ID NO: 209)/VK3-11 (SEQ ID NO: 237); VH3-15 (SEQ ID NO: 209)/VL1-51 (SEQ ID NO: 252); VH3-21 (SEQ ID NO: 210)/VK1-12 (SEQ ID NO: 233); VH3-23 (SEQ ID NO: 211)/VK3-15 (SEQ ID NO: 238); VH3-53 (SEQ ID NO: 213)/VK3-15 (SEQ ID NO: 238); VH3-53 (SEQ ID NO: 213)/VL2-11 (SEQ ID NO: 253); VH3-74 (SEQ ID NO: 214)/VK1-05 (SEQ ID NO: 230); VH3-74 (SEQ ID NO: 214)/VK1-06 (SEQ ID NO: 231); VH3-74 (SEQ ID NO: 214)/VK1-12 (SEQ ID NO: 233); VH3-74 (SEQ ID NO: 214)/VK3-20 (SEQ ID NO: 239); VH5-51 (SEQ ID NO: 215)/VK1-39 (SEQ ID NO: 236); VH5-51 (SEQ ID NO: 215)/VL1-40 (SEQ ID NO: 250); VH5-51 (SEQ ID NO: 215)/VL1-51 (SEQ ID NO: 252); VH6-1 (SEQ ID NO: 216)/VK1-09 (SEQ ID NO: 232); VH6-1 (SEQ ID NO: 216)/VK3-20 (SEQ ID NO: 239) 및 VH6-1 (SEQ ID NO: 216)/VL1-51 (SEQ ID NO: 252)으로 이루어지거나, 필수적으로 이러한 가변 중쇄 및 가변 경쇄 쌍으로 이루어진 생식세포 단백질 서열을 포함한다.
본 발명의 추가적인 양태는 임의의 면역원에 대한 항체 또는 이의 기능적 단편을 확인하는 데 유용한 집합의 능력이다. 따라서, 일부 구현예에서, 집합은 적어도 2개의 상이한 생식세포 단백질 쌍; 적어도 3개의 상이한 생식세포 단백질 쌍; 적어도 4개의 상이한 생식세포 단백질 쌍; 적어도 5개의 상이한 생식세포 단백질 쌍; 적어도 6개의 상이한 생식세포 단백질 쌍; 적어도 7개의 상이한 생식세포 단백질 쌍; 적어도 8개의 상이한 생식세포 단백질 쌍; 적어도 9개의 상이한 생식세포 단백질 쌍; 적어도 10개의 상이한 생식세포 단백질 쌍; 적어도 11개의 상이한 생식세포 단백질 쌍; 적어도 12개의 상이한 생식세포 단백질 쌍; 적어도 13개의 상이한 생식세포 단백질 쌍; 적어도 14개의 상이한 생식세포 단백질 쌍; 적어도 15개의 상이한 생식세포 단백질 쌍; 적어도 16개의 상이한 생식세포 단백질 쌍; 적어도 17개의 상이한 생식세포 단백질 쌍; 적어도 18개의 상이한 생식세포 단백질 쌍; 적어도 19개의 상이한 생식세포 단백질 쌍; 적어도 20개의 상이한 생식세포 단백질 쌍; 적어도 21개의 상이한 생식세포 단백질 쌍; 적어도 22개의 상이한 생식세포 단백질 쌍; 적어도 23개의 상이한 생식세포 단백질 쌍; 적어도 24개의 상이한 생식세포 단백질 쌍; 적어도 25개의 상이한 생식세포 단백질 쌍; 적어도 26개의 상이한 생식세포 단백질 쌍; 적어도 27개의 상이한 생식세포 단백질 쌍; 적어도 28개의 상이한 가변 중쇄 생식세포 단백질; 적어도 29개의 상이한 생식세포 단백질 쌍 서열; 적어도 30개의 상이한 생식세포 단백질 쌍; 적어도 31개의 상이한 생식세포 단백질 쌍; 적어도 32개의 상이한 생식세포 단백질 쌍; 적어도 33개의 상이한 생식세포 단백질 쌍; 적어도 34개의 상이한 생식세포 단백질 쌍; 적어도 35개의 상이한 생식세포 단백질 쌍; 적어도 36개의 상이한 생식세포 단백질 쌍; 적어도 37개의 상이한 생식세포 단백질 쌍; 적어도 38개의 상이한 생식세포 단백질 쌍; 적어도 39개의 상이한 생식세포 단백질 쌍; 적어도 40개의 상이한 생식세포 단백질 쌍; 적어도 41개의 상이한 생식세포 단백질 쌍; 적어도 42개의 상이한 생식세포 단백질 쌍; 적어도 43개의 상이한 생식세포 단백질 쌍; 적어도 44개의 상이한 생식세포 단백질 쌍; 적어도 45개의 상이한 생식세포 단백질 쌍; 적어도 46개의 상이한 생식세포 단백질 쌍; 적어도 47개의 상이한 생식세포 단백질 쌍; 적어도 48개의 상이한 생식세포 단백질 쌍; 적어도 49개의 상이한 생식세포 단백질 쌍; 적어도 50개의 상이한 생식세포 단백질 쌍; 적어도 51개의 상이한 생식세포 단백질 쌍; 적어도 52개의 상이한 생식세포 단백질 쌍; 적어도 53개의 상이한 생식세포 단백질 쌍; 적어도 54개의 상이한 생식세포 단백질 쌍의 생식세포 단백질 서열을 포함하는 가변 중쇄 기본틀 영역 및 가변 경쇄 기본틀 영역을 포함한다.
인간에서 낮은 면역원성 가능성은 치료적 항체의 목표이므로, 일 양태에서, 집합은 생식세포 단백질 서열을 포함하는 기본틀 영역 또는 그것들을 암호화하는 핵산을 포함한다. 또한, 낮은 면역원성의 위험도를 유지하기 위하여, 생식세포 단백질 서열을 포함하는 상보성 결정 영역이 이용될 수 있다. 일 구현예에서, 집합은, 각각의 가변 중쇄 및 가변 경쇄 쌍으로부터의 생식세포 단백질 서열을 포함하는 하나 이상의 상보성 결정 영역을 포함하는, 합성 항체 또는 이의 기능적 단편 또는 그러한 항체 또는 기능적 단편을 암호화하는 합성 핵산을 포함하며, 이때 가변 중쇄 및 가변 경쇄의 상보성 결정 영역의 아미노산 및 핵산 서열은 도 25 내지 도 33에 도시되어 있다. 더욱 구체적으로는, 일 구현예에서, 집합은, 각각의 가변 중쇄 및/또는 가변 경쇄 쌍으로부터 생식세포 단백질 서열을 포함하는 CDR1 영역을 포함하는, 항체 또는 이의 기능적 단편 또는 그러한 항체 또는 기능적 단편을 암호화하는 합성 핵산을 포함하며, 이때 가변 중쇄 및 가변 경쇄의 CDR1 영역의 아미노산 및 핵산 서열은 도 25, 도 28 및 도 31, 및 상응하는 SEQ ID NO: 204~265에 도시되어 있다. 일 구현예에서, 집합은, 각각의 가변 중쇄 및 가변 경쇄 쌍으로부터 생식세포 단백질 서열을 포함하는 HCDR1 영역을 포함하는, 항체 또는 이의 기능적 단편 또는 그러한 항체 또는 기능적 단편을 암호화하는 합성 핵산을 포함하며, 이때 가변 중쇄 및 가변 경쇄의 HCDR1 영역의 아미노산 및 핵산 서열은 도 25 및 상응하는 SEQ ID NO: 204~229에 도시되어 있다. 일 구현예에서, 집합은, 각각의 가변 중쇄 및 가변 경쇄 쌍으로부터 생식세포 단백질 서열을 포함하는 LCDR1 영역을 포함하는, 항체 또는 이의 기능적 단편 또는 그러한 항체 또는 기능적 단편을 암호화하는 합성 핵산을 포함하며, 이때 가변 중쇄 및 가변 경쇄의 LCDR1 영역의 아미노산 및 핵산 서열은 도 28과 도 31 및 상응하는 SEQ ID NO: 230~265에 도시되어 있다. 추가적인 구현예에서, 집합은, 각각의 가변 중쇄 및 가변 경쇄 쌍으로부터 생식세포 단백질 서열을 포함하는 CDR2 영역을 포함하는 항체 또는 이의 기능적 단편 또는 그러한 항체 또는 기능적 단편을 암호화하는 합성 핵산을 포함하며, 이때 가변 중쇄 및 가변 경쇄의 CDR2 영역의 아미노산 및 핵산 서열은 도 26, 도 29 및 도 32, 그리고 상응하는 SEQ ID NO: 204~265에 도시되어 있다. 추가적인 구현예에서, 집합은, 각각의 가변 중쇄 및 가변 경쇄 쌍으로부터 생식세포 단백질 서열을 포함하는 HCDR2 영역을 포함하는 항체 또는 이의 기능적 단편 또는 그러한 항체 또는 기능적 단편을 암호화하는 합성 핵산을 포함하며, 이때 가변 중쇄 및 가변 경쇄의 HCDR2 영역의 아미노산 및 핵산 서열은 도 26 및 상응하는 SEQ ID NO: 204~229에 도시되어 있다. 추가적인 구현예에서, 집합은, 각각의 가변 중쇄 및 가변 경쇄 쌍으로부터 생식세포 단백질 서열을 포함하는 LCDR2 영역을 포함하는 항체 또는 이의 기능적 단편 또는 그러한 항체 또는 기능적 단편을 암호화하는 합성 핵산을 포함하며, 이때 가변 중쇄 및 가변 경쇄의 LCDR2 영역의 아미노산 및 핵산 서열은 도 29 및 도 32, 그리고 상응하는 SEQ ID NO: 230~265에 도시되어 있다.
본원의 일 양태는 잠재적인 번역 후 변형 부위(PTM)를 제거하기 위하여 생식세포 상보성 결정 영역을 변형하는 것을 포함한다. PTM을 제거하고자 변형된 가변 중쇄 상보성 결정 영역의 예는 도 34 내지 도 36에 도시되어 있다. 일 양태에서, 집합은, 잠재적 번역 후 변형 부위를 제거하는 아미노산 변형을 포함하는 하나 이상의 상보성 결정 영역을 포함하는 항체 또는 이의 기능적 단편 또는 그러한 항체 또는 기능적 단편을 암호화하는 합성 핵산을 포함한다. 일 구현예에서, 집합은, 상보성 결정 영역 서열 또는 각각의 가변 중쇄로부터 도 34 내지 도 36에 도시된 것과 동일한 것을 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 하나 이상의 상보성 결정 영역을 포함하는 항체 또는 이의 기능적 단편 또는 그러한 항체 또는 기능적 단편을 암호화하는 합성 핵산을 포함한다. 추가적인 구현예에서, 집합은, HCDR1 또는 각각의 가변 중쇄로부터 도 34 내지 도 36에 도시된 것과 동일한 것을 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 HCDR1 영역을 포함하는 항체 또는 이의 기능적 단편 또는 그러한 항체 또는 기능적 단편을 암호화하는 합성 핵산을 포함한다. 낮은 PTM HCDR1의 아미노산 서열은 SEQ ID NO: 266~278에 도시되어 있다. 낮은 PTM HCDR1의 핵산 서열은 SEQ ID NO: 279~291에 도시되어 있다. 추가적인 구현예에서, 집합은, HCDR2 영역 또는 각각의 가변 중쇄로부터 도 34 내지 도 36에 도시된 것과 동일한 것을 암호화하는 핵산을 포함하는 HCDR2 영역을 포함하는 항체 또는 이의 기능적 단편 또는 그러한 항체 또는 기능적 단편을 암호화하는 합성 핵산을 포함한다. 낮은 PTM HCDR2의 아미노산 서열은 SEQ ID NO: 266~278에 도시되어 있다. 낮은 PTM HCDR2의 핵산 서열은 SEQ ID NO: 279~291에 도시되어 있다.
본원의 일 양태는 집합 내의 생식세포 FR4 서열을 활용하는 것을 포함한다. 일 구현예에서, 집합은 JH4 (SEQ ID NO:293), Jκ1 (SEQ ID NO:297) 및 Jλ2/3 (SEQ ID NO:301)로 이루어진 군으로부터 선택된 FR4 영역을 포함하는 항체 또는 이의 기능적 단편 또는 그러한 항체 또는 기능적 단편을 암호화하는 합성 핵산을 포함한다. 일 구현예에서, 집합은 생식세포 JH4 FR4 영역을 포함하는 항체 또는 이의 기능적 단편 또는 그러한 항체 또는 기능적 단편을 암호화하는 합성 핵산을 포함하며, 그 아미노산 또는 핵산 서열은 도 40에 도시되어 있다. JH4 FR4 아미노산 서열은 (SEQ ID NO:293) 및 (SEQ ID NO:295)에 도시되어 있다. JH4 FR4 핵산 서열은 (SEQ ID NO:292) 및 (SEQ ID NO:294)에 도시되어 있다. 일 구현예에서, 집합은 생식세포 Jk1 FR4 영역을 포함하는 항체 또는 이의 기능적 단편 또는 그러한 항체 또는 기능적 단편을 암호화하는 합성 핵산을 포함하며, 그 아미노산 또는 핵산 서열은 도 40에 도시되어 있다. Jk1 FR4 아미노산 서열은 (SEQ ID NO:297)에 도시되어 있다. Jk1 FR4 핵산 서열은 (SEQ ID NO:296), (SEQ ID NO:298) 및 (SEQ ID NO:299)에 도시되어 있다. 일 구현예에서, 집합은 생식세포 Jλ2/3 FR4 영역을 포함하는 항체 또는 이의 기능적 단편 또는 그러한 항체 또는 기능적 단편을 암호화하는 합성 핵산을 포함하며, 그 아미노산 또는 핵산 서열은 도 40에 도시되어 있다. Jλ2/3 FR4 아미노산 서열은 (SEQ ID NO:301)에 도시되어 있다. Jλ2/3 FR4 핵산 서열은 (SEQ ID NO:300), (SEQ ID NO:302) 및 (SEQ ID NO:303)에 도시되어 있다.
일 양태에서, 임의의 항원에 대한 항체 또는 이의 단편을 확인하는 능력을 향상시키기 위하여, 집합은, 다양화된 CDR3 영역을 포함한다. 일 구현예에서, 집합은, 다양화된 HCDR3 영역을 포함하는 항체 또는 이의 기능적 단편 또는 그러한 항체 또는 기능적 단편을 암호화하는 합성 핵산을 포함한다. 일 구현예에서, 집합은 다양화된 LCDR3 영역을 포함하는 항체 또는 이의 기능적 단편 또는 그러한 항체 또는 기능적 단편을 암호화하는 합성 핵산을 포함한다.
다른 양태에서, 임의의 항원에 대한 항체 또는 이의 단편을 확인하는 능력을 향상시키기 위하여, 집합은 적어도 1 X 104개의 항체 또는 이의 기능적 단편 또는 그러한 항체 또는 기능적 단편을 암호화하는 합성 핵산, 적어도 1 X 105개의 항체 또는 이의 기능적 단편 또는 그러한 항체 또는 기능적 단편을 암호화하는 합성 핵산, 적어도 1 X 106개의 항체 또는 이의 기능적 단편 또는 그러한 항체 또는 기능적 단편을 암호화하는 합성 핵산, 적어도 1 X 107개의 항체 또는 이의 기능적 단편 또는 그러한 항체 또는 기능적 단편을 암호화하는 합성 핵산, 적어도 1 X 108개의 항체 또는 이의 기능적 단편 또는 그러한 항체 또는 기능적 단편을 암호화하는 합성 핵산, 적어도 1 X 109개의 항체 또는 이의 기능적 단편 또는 그러한 항체 또는 기능적 단편을 암호화하는 합성 핵산, 적어도 1 X 1010개의 항체 또는 이의 기능적 단편 또는 그러한 항체 또는 기능적 단편을 암호화하는 합성 핵산, 또는 적어도 1 X 1011개의 항체 또는 이의 기능적 단편 또는 그러한 항체 또는 기능적 단편을 암호화하는 합성 핵산을 포함한다.
일 구현예에서, 집합은 인간 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA, IgE, IgM 및 IgD로 이루어지는 군으로부터 선택된 항체 또는 그러한 항체를 암호화하는 합성 핵산을 포함한다. 일 구현예에서, 집합은 Fab, F(ab')2, Fab’, Fv 및 scFv로 이루어지는 군으로부터 선택된 항체 단편 또는 그러한 단편을 암호화하는 합성 핵산을 포함한다.
일 구현예에서, 집합의 항체의 IgG 중쇄 불변 도메인은 도 41a 내지 도 41b(SEQ ID NO: 305)에 도시된 아미노산 서열을 포함한다. 다른 구현예에서, 집합의 항체의 IgG 중쇄 불변 도메인을 암호화하는 핵산은 도 41a 내지 도 41b(SEQ ID NO: 304)에 도시된 핵산 서열을 포함한다. 구현예에서, 집합의 항체 단편의 Fab 중쇄 불변 도메인은 도 42(SEQ ID NO: 307)에 도시된 아미노산 서열을 포함한다. 다른 구현예에서, 집합의 항체의 Fab 중쇄 불변 도메인을 암호화하는 핵산은 도 42(SEQ ID NO: 306)에 도시된 핵산 서열을 포함한다. 구현예에서, 집합의 항체 또는 항체 단편의 IgG(SEQ ID NO: 309) 및/또는 Fab(SEQ ID NO: 311) 카파 경쇄 불변 도메인은 도 43에 도시된 아미노산 서열을 포함한다. 다른 구현예에서, 집합의 항체 또는 항체 단편의 IgG(SEQ ID NO: 308) 및/또는 Fab(SEQ ID NO: 310) 카파 경쇄 불변 도메인을 암호화하는 핵산은 도 43에 도시된 핵산 서열을 포함한다. 구현예에서, 집합의 항체 또는 항체 단편의 IgG(SEQ ID NO: 313) 및/또는 Fab(SEQ ID NO: 315) 람다 경쇄 불변 도메인은 도 44에 도시된 아미노산 서열을 포함한다. 다른 구현예에서, 집합의 항체 또는 항체 단편의 IgG(SEQ ID NO: 312) 및/또는 Fab(SEQ ID NO: 314) 람다 경쇄 불변 도메인을 암호화하는 핵산은 도 44에 도시된 핵산 서열을 포함한다.
일 양태는 본원에 기술된 핵산의 집합을 포함하는 벡터를 포함한다. 일 구현예에서, 벡터는 디스플레이 벡터를 포함한다. 일 구현예에서, 벡터는 파지플라스미드 복합체 벡터, 효모 디스플레이 벡터 또는 포유류 디스플레이 벡터를 포함한다. 일 양태는 본원에 기술된 핵산 또는 본원에 기술된 벡터를 포함하는 재조합 숙주 세포이다. 일 구현예에서, 재조합 숙주는 원핵생물 또는 진핵생물이다. 구현예에서, 재조합 숙주 세포는 대장균, 포유류 또는 효모이다.
제조방법
일 양태는 본원에 기술된 집합의 생산 방법을 포함한다.
일 양태는
a) 인간 면역 레퍼토리에 존재하는 가변 중쇄 및 가변 경쇄 생식세포 유전자 쌍을 확인하는 단계;
b) a) 단계에서 확인된 가변 중쇄 및 가변 경쇄 생식세포 단백질 쌍을 다음과 같은 성질에 대해 시험하는 단계:
i) 적어도 2.5mg/L의 Fab 포맷의 발현 수율;
ii) Fab 포맷의 70℃ 이상의 열 안정성;
iii) SEC로 확인한, 적어도 98%의 Fab 포맷의 단량체 함량(단량체 %);
iv) 적어도 30mg/L의 IgG1 포맷의 발현 수율;
v) IgG1 포맷의 73℃ 이상의 열 안정성; 및
vii) SEC로 확인한, 적어도 99%의 IgG1 포맷의 단량체 함량(단량체 %); 및
c) 집합을 생성하는 단계, 이때 항체 또는 이의 기능적 단편의 실질적으로 모두, 또는 적어도 50%, 또는 적어도 60%, 또는 적어도 70%, 또는 적어도 80%, 또는 적어도 90%, 또는 적어도 95%, 또는 각각은 가변 중쇄 및 가변 경쇄 쌍을 포함하며, 이때 가변 중쇄 및 가변 경쇄 쌍의 기본틀 영역은 b) 단계의 성질을 충족하는 생식세포 단백질 쌍의 생식세포 단백질 서열을 포함하는, 집합을 생성하는 단계를 포함하는, 합성 항체 또는 이의 기능적 단편 또는 그러한 항체 또는 기능적 단편을 암호화하는 합성 핵산의 집합의 생산 방법을 포함한다.
방법의 특정 구현예에서,
i) Fab 포맷의 발현 수율은 1.538mL/mg의 흡광계수를 이용하고, 280nm에서 흡광도를 측정하는 UV 분광측정법으로 확인하였다.
특정 구현예에서,
ii) Fab 포맷의 열 안정성은 PBS 완충액을 이용한 시차 주사 형광 분석법으로 확인하였다.
특정 구현예에서,
iii) Fab 포맷의 단량체 함량(단량체 %)은 Superdex75 HR10/30 컬럼과 pH 7.4의 Gibco D-PBS 완충액을 이용한 크기 배제 크로마토그래피로 확인하였다.
특정 구현예에서,
iv) IgG1 포맷의 발현 수율은 1.369mL/mg의 흡광계수를 이용하고, 280nm에서 흡광도를 측정하는 UV 분광측정법으로 확인하였다.
특정 구현예에서,
v) IgG1 포맷의 열 안정성은 PBS 완충액을 이용한 시차 주사 형광 분석법으로 확인하였다.
특정 구현예에서,
vi) IgG1 포맷의 단량체 함량(단량체 %)은 Tosoh TSK-Gel G3000SWxl 컬럼과 pH 7.4의 Gibco D-PBS 완충액을 이용한 크기 배제 크로마토그래피로 확인하였다.
UV 분광측정법은 Nanadrop 시스템(peqlab, Erlangen, 독일)을 이용하여 이루어질 수 있다. 시차 주사 형광 분석법은 iCycler iQ5 Thermal Cycler(Biorad)를 이용하여 이루어질 수 있다. 시차 주사 형광 분석법은 Gibco D-PBS, pH 7.4(Invitrogen, Paisley, 미국)를 이용하여 이루어질 수 있다. 크기 배제 크로마토그래피는 AKTA 정제기 시스템(GE Healthcare)을 이용하여 이루어질 수 있다.
일 구현예에서, a) 단계는
aa) 시료로부터 인간 B 세포를 분리하는 단계;
ab) B 세포로부터 cDNA를 생성하는 단계;
ac) B 세포로부터 cDNA를 PCR 증폭시키는 단계;
ad) PCR 산물을 시퀀싱하는 단계;
ae) 각 PCR 산물의 생식세포 유전자를 확인하는 단계를 더 포함한다.
각 B 세포로부터 항체 및 이의 단편을 암호화하는 DNA를 분리하여, 증폭시켰고, 예컨대, 중쇄 및 경쇄를 PCR 반응에서 물리적으로 분리하였다. DNA는 바람직하게는 시퀀싱된다. 시퀀싱된 DNA는 B 세포 mRNA로부터 생성된 cDNA일 수 있다. B 세포와 같은 진핵생물 세포로부터 mRNA 추출은 잘 알려진 기술적 과정이다. 여러 가지 프로토콜이 존재하며, 상업적 키트를 구입할 수 있다. 예를 들어, PolyATtract® mRNA 분리 시스템(Promega, 미국 위스콘신 주 매디슨) 또는 다양한 RNeasy 및 Oligotex DirectmRNA 키트(두 제품 모두 Qiagen(독일 힐덴)). 이러한 기법들 중 대부분은 예컨대, 올리고 (dT) 셀룰로오스와 같은 올리고 (dT) 매트릭스에 대한 친화도 정제를 통하여 진핵생물 mRNA의 폴리아데닌(polyA) 꼬리를 이용한다.
cDNA는 특정 프라이머를 이용한 역전사를 통해 분리된 mRNA로부터 선택적으로 증폭될 수 있으며, 종래의 PCR이 이어진다. 특정 프라이머는 가변 중쇄 및 경쇄 도메인 핵산을 증폭하는 데 이용된다. Cancer Surv. 1997;30:21-44, J Clin. Pathol. 1994;47:493-6, J. Clin. Pathol. 1990;43:888-90 또는 Mol. Pathol. 2002 April; 55(2): 98-101 참조. 하나의 B 세포로부터 가변 중쇄 및 경쇄 도메인 양자를 코딩하는 DNA는 함께 유지되어, 가변 도메인 중쇄 및 가변 경쇄 부류 쌍이 확인될 수 있다. 개별적인 B 세포로부터의 가변 도메인 쌍을 암호화하는 핵산 분리 기술은 당해 분야에 잘 알려져 있다. 예를 들어, 제WO01/92291호; 제WO92/15678호; 제WO93/03151호, 제WO2005/042774호; Mullinax RL 등, 1992 Biotechniques 12:6 864-868; Chapal, N. 등, 1997 Biotechniques 23, 518-524, Embleton MJ 등, 1992 Nucleic Acids Res. 20:15, 3831-3837; Coronella, J.A. 등, 2000 Nucleic Acids Res. 28:20, E85; Thirion S 등, 1996 European Journal of Cancer Prevention 5:6 507-511; 및 Wang, X 등, 2000 J. Immunol. Methods 20, 217-225 참조.
바람직하게, 각각의 B 세포로부터의 DNA는 시퀀싱된다. Helicos Biosciences Corporation(미국 매사추세츠 주 캠브리지)과 같은, 전체 게놈을 시퀀싱할 수 있는 다양한 기업들이 존재한다. True Single Molecule SequencingTM 기술로, Helicos는 DNA 또는 RNA의 단일 분자를 높은 속도와 효율로 직접적으로 시퀀싱할 수 있다. 유사한 시퀀싱 시도를 수행할 수 있는 다른 기업들로는 Illumina(미국 캘리포니아 주 샌디에고; Solexa 시스템) 및 Roche(Basel, CH; 454 시스템)을 포함한다. 시퀀싱 이전에 클로닝 단계는 필요하지 않다.
또 다른 양태에서, 본원은 또 다른 양태에서, 본원은 면역 레퍼토리에 존재하는 중쇄 및 경쇄 가변 도메인 쌍의 생식세포 패밀리를 확인하는 방법을 가능하게 한다. 모든 항체 또는 이의 단편은 당업자에게 알려진 방법을 이용하여 그 기원을 생식세포 패밀리까지 확인할 수 있다. 항체 또는 이의 단편을 암호화하는 핵산의 서열을 분석함으로써, VH 및 VL 양자의 생식세포 패밀리는 당업자에게 알려진 방법으로 확인할 수 있다. 예를 들어, Wildt 등(1999)은 3명의 환자로부터 B 세포를 표본 추출했고, 365개의 VH 및 VL 부류 쌍을 동정했다. B 세포 각각으로부터의 RNA는 cDNA 합성을 위해 이용되었고, VH 및 VL 영역을 암호화하는 cDNA는 PCR 증폭되고, 시퀀싱되었다. Wildt의 도 1에 도시된 바와 같이, 특정 VH 및 VL 부류는 예를 들어, Vκ3-1, Vκ3-19, Vκ4-1, VA2-3, 또는 Vλ1-2와 VH3-8, 그리고 Vκ3-1, Vκ3-3 또는 Vλ1-5와 VH3-9는, 다른 것들보다 더 자주 쌍을 이루었다.
일 구현예에서, b) 단계는
ba) 인간 면역 레퍼토리에 존재하는 쌍을 대표하는 가변 중쇄 및 가변 경쇄 생식세포 단백질 쌍을 포함하는 항체 또는 이의 기능적 단편을 암호화하는 DNA를 합성하는 단계;
bb) ba) 단계에서 합성된 생식세포 단백질 쌍을 발현시키는 단계; 및
bc) bb) 단계의 생식세포 단백질 쌍을 성질 각각에 대해 시험하는 단계를 더 포함한다.
방법의 일 양태에서, 본 발명의 항체 또는 이의 단편의 집합을 암호화하는 핵산은 합성되어 항원에 대해 선별을 위해 이용될 수 있는 집합에서 발현된다. 이러한 구현예에서, 방법은 c) 단계를 포함하며, 이때, c) 단계는 ca) 항체 또는 이의 기능적 단편을 암호화하는 핵산을 합성하는 단계; cb) 핵산을 벡터 내로 클로닝하는 단계; cc) 항체 또는 이의 기능적 단편을 발현시키는 단계를 포함한다.
방법의 또 다른 구현예에서, 항체 또는 기능적 단편은 가변 중쇄 및 가변 경쇄 쌍을 포함하며, 이때 가변 중쇄 및 가변 경쇄 쌍의 기본틀 영역은 VH1-18 (SEQ ID NO: 204)/VK3-20 (SEQ ID NO: 239); VH1-46 (SEQ ID NO: 205)/VK3-15 (SEQ ID NO: 238); VH1-46 (SEQ ID NO: 205)/VL1-51 (SEQ ID NO: 252); VH1-69*01 (SEQ ID NO: 206)/VL1-51 (SEQ ID NO: 252); VH3-07 (SEQ ID NO: 207)/VK1-12 (SEQ ID NO: 233); VH3-07 (SEQ ID NO: 207)/VK1-27 (SEQ ID NO: 235); VH3-07 (SEQ ID NO: 207)/VK3-15 (SEQ ID NO: 238); VH3-07 (SEQ ID NO: 207)/VL1-47 (SEQ ID NO: 251); VH3-07 (SEQ ID NO: 207)/VL1-51 (SEQ ID NO: 252); VH3-11 (SEQ ID NO: 208)/VL1-40 (SEQ ID NO: 250); VH3-11 (SEQ ID NO: 208)/VL1-47 (SEQ ID NO: 251); VH3-11 (SEQ ID NO: 208)/VL1-51 (SEQ ID NO: 252); VH3-11 (SEQ ID NO: 208)/VL2-23 (SEQ ID NO: 255); VH3-15 (SEQ ID NO: 209)/VK1-05 (SEQ ID NO: 230); VH3-15 (SEQ ID NO: 209)/VK1-06 (SEQ ID NO: 231); VH3-15 (SEQ ID NO: 209)/VK1-12 (SEQ ID NO: 233); VH3-15 (SEQ ID NO: 209)/VK1-27 (SEQ ID NO: 235); VH3-15 (SEQ ID NO: 209)/VK3-11 (SEQ ID NO: 237); VH3-15 (SEQ ID NO: 209)/VL1-51 (SEQ ID NO: 252); VH3-21 (SEQ ID NO: 210)/VK1-12 (SEQ ID NO: 233); VH3-23 (SEQ ID NO: 211)/VK1-39 (SEQ ID NO: 236); VH3-23 (SEQ ID NO: 211)/VK3-15 (SEQ ID NO: 238); VH3-23 (SEQ ID NO: 211)/VL2-23 (SEQ ID NO: 255); VH3-23 (SEQ ID NO: 211)/VL3-1 (SEQ ID NO: 256); VH3-53 (SEQ ID NO: 213)/VK3-15 (SEQ ID NO: 238); VH3-53 (SEQ ID NO: 213)/VL2-11 (SEQ ID NO: 253); VH3-74 (SEQ ID NO: 214)/VK1-05 (SEQ ID NO: 230); VH3-74 (SEQ ID NO: 214)/VK1-06 (SEQ ID NO: 231); VH3-74 (SEQ ID NO: 214)/VK1-12 (SEQ ID NO: 233); VH3-74 (SEQ ID NO: 214)/VK3-20 (SEQ ID NO: 239); VH5-51 (SEQ ID NO: 215)/VK1-39 (SEQ ID NO: 236); VH5-51 (SEQ ID NO: 215)/VL1-40 (SEQ ID NO: 250); VH5-51 (SEQ ID NO: 215)/VL1-51 (SEQ ID NO: 252); VH6-1 (SEQ ID NO: 216)/VK1-09 (SEQ ID NO: 232); VH6-1 (SEQ ID NO: 216)/VK3-20 (SEQ ID NO: 239) 및 VH6-1 (SEQ ID NO: 216)/VL1-51 (SEQ ID NO: 252)의 가변 중쇄 및 가변 경쇄 쌍으로부터의 생식세포 단백질 서열을 포함한다.
방법의 또 다른 구현예에서, 항체 또는 기능적 단편은 가변 중쇄 및 가변 경쇄 쌍을 포함하며, 이때 가변 중쇄 및 가변 경쇄 쌍의 기본틀 영역은 VH1-18 (SEQ ID NO: 204)/VK1-39 (SEQ ID NO: 236); VH1-18 (SEQ ID NO: 204)/VK3-15 (SEQ ID NO: 238); VH1-18 (SEQ ID NO: 204)/VK3-20 (SEQ ID NO: 239); VH1-46 (SEQ ID NO: 205)/VK3-15 (SEQ ID NO: 238); VH1-46 (SEQ ID NO: 205)/VL1-51 (SEQ ID NO: 252); VH1-46 (SEQ ID NO: 205)/VL3-21 (SEQ ID NO: 257); VH1-69*01 (SEQ ID NO: 206)/VL1-51 (SEQ ID NO: 252); VH3-07 (SEQ ID NO: 207)/VK1-12 (SEQ ID NO: 233); VH3-07 (SEQ ID NO: 207)/VK1-16 (SEQ ID NO: 234); VH3-07 (SEQ ID NO: 207)/VK1-27 (SEQ ID NO: 235); VH3-07 (SEQ ID NO: 207)/VK1-39 (SEQ ID NO: 236); VH3-07 (SEQ ID NO: 207)/VK3-15 (SEQ ID NO: 238); VH3-07 (SEQ ID NO: 207)/VL1-47 (SEQ ID NO: 251); VH3-07 (SEQ ID NO: 207)/VL1-51 (SEQ ID NO: 252); VH3-11 (SEQ ID NO: 208)/VK1-05 (SEQ ID NO: 230); VH3-11 (SEQ ID NO: 208)/VK1-39 (SEQ ID NO: 236); VH3-11 (SEQ ID NO: 208)/VK3-15 (SEQ ID NO: 238); VH3-11 (SEQ ID NO: 208)/VL1-40 (SEQ ID NO: 250); VH3-11 (SEQ ID NO: 208)/VL1-47 (SEQ ID NO: 251); VH3-11 (SEQ ID NO: 208)/VL1-51 (SEQ ID NO: 252); VH3-11 (SEQ ID NO: 208)/VL2-23 (SEQ ID NO: 255); VH3-15 (SEQ ID NO: 209)/VK1-05 (SEQ ID NO: 230); VH3-15 (SEQ ID NO: 209)/VK1-06 (SEQ ID NO: 231); VH3-15 (SEQ ID NO: 209)/VK1-12 (SEQ ID NO: 233); VH3-15 (SEQ ID NO: 209)/VK1-16 (SEQ ID NO: 234); VH3-15 (SEQ ID NO: 209)/VK1-27 (SEQ ID NO: 235); VH3-15 (SEQ ID NO: 209)/VK3-11 (SEQ ID NO: 237); VH3-15 (SEQ ID NO: 209)/VL1-40 (SEQ ID NO: 250); VH3-15 (SEQ ID NO: 209)/VL1-47 (SEQ ID NO: 251); VH3-15 (SEQ ID NO: 209)/VL1-51 (SEQ ID NO: 252); VH3-15 (SEQ ID NO: 209)/VL2-14 (SEQ ID NO: 254); VH3-21 (SEQ ID NO: 210)/VK1-12 (SEQ ID NO: 233); VH3-21 (SEQ ID NO: 210)/VK1-27 (SEQ ID NO: 235); VH3-21 (SEQ ID NO: 210)/VL2-11 (SEQ ID NO: 253); VH3-23 (SEQ ID NO: 211)/VK1-39 (SEQ ID NO: 236); VH3-23 (SEQ ID NO: 211)/VK3-15 (SEQ ID NO: 238); VH3-23 (SEQ ID NO: 211)/VL2-23 (SEQ ID NO: 255); VH3-23 (SEQ ID NO: 211)/VL3-1 (SEQ ID NO: 256); VH3-30 (SEQ ID NO: 212)/VK3-20 (SEQ ID NO: 239); VH3-53 (SEQ ID NO: 213)/VK3-15 (SEQ ID NO: 238); VH3-53 (SEQ ID NO: 213)/VL2-11 (SEQ ID NO: 253); VH3-74 (SEQ ID NO: 214)/VK1-05 (SEQ ID NO: 230); VH3-74 (SEQ ID NO: 214)/VK1-06 (SEQ ID NO: 231); VH3-74 (SEQ ID NO: 214)/VK1-12 (SEQ ID NO: 233); VH3-74 (SEQ ID NO: 214)/VK1-27 (SEQ ID NO: 235); VH3-74 (SEQ ID NO: 214)/VK3-20 (SEQ ID NO: 239); VH3-74 (SEQ ID NO: 214)/VL1-51 (SEQ ID NO: 252); VH5-51 (SEQ ID NO: 215)/VK1-39 (SEQ ID NO: 236); VH5-51 (SEQ ID NO: 215)/VL1-40 (SEQ ID NO: 250); VH5-51 (SEQ ID NO: 215)/VL1-51 (SEQ ID NO: 252); VH6-1 (SEQ ID NO: 216)/VK1-09 (SEQ ID NO: 232); VH6-1 (SEQ ID NO: 216)/VK3-15 (SEQ ID NO: 238); VH6-1 (SEQ ID NO: 216)/VK3-20 (SEQ ID NO: 239) 및 VH6-1 (SEQ ID NO: 216)/VL1-51 (SEQ ID NO: 252)로 이루어진 군으로부터 선택된 두 개 이상, 세 개 이상, 네 개 이상, 다섯 개 이상, 여섯 개 이상, 일곱 개 이상, 여덟 개 이상, 아홉 개 이상, 열 개 이상, 열 한 개 이상, 열 두 개 이상, 열 세 개 이상, 열 네 개 이상, 열 다섯 개 이상, 열 여섯 개 이상, 열 일곱 개 이상, 열 여덟 개 이상, 열 아홉 개 이상, 스무 개 이상, 스물 한 개 이상, 스물 두 개 이상, 스물 세 개 이상, 스물 네 개 이상, 스물 다섯 개 이상, 스물 여섯 개 이상, 스물 일곱 개 이상, 스물 여덟 개 이상, 스물 아홉 개 이상, 서른 개 이상, 서른 한 개 이상, 서른 두 개 이상, 서른 세 개 이상, 서른 네 개 이상, 서른 다섯 개 이상, 서른 여섯 개 이상, 서른 일곱 개 이상, 서른 여덟 개 이상, 서른 아홉 개 이상, 마흔 개 이상, 마흔 한 개 이상, 또는 마흔 두 개 이상, 또는 마흔 세 개 이상, 또는 마흔 네 개 이상, 또는 마흔 다섯 개 이상, 또는 마흔 여섯 개 이상, 또는 마흔 일곱 개 이상, 또는 마흔 여덟 개 이상, 또는 마흔 아홉 개 이상, 또는 쉰 개 이상, 또는 쉰 한 개 이상, 또는 쉰 두 개 이상, 또는 쉰 세 개 이상, 또는 쉰 네 개의 가변 중쇄 및 가변 경쇄 쌍을 포함하는 생식세포 단백질 서열을 포함한다.
방법의 추가적인 구현예에서, 항체 또는 기능적 단편의 실질적으로 모두, 또는 적어도 50%, 또는 적어도 60%, 또는 적어도 70%, 또는 적어도 80%, 또는 적어도 90%, 또는 적어도 95%, 또는 각각은 생식세포 단백질 쌍의 생식세포 단백질 서열을 포함하는 가변 중쇄 및 가변 경쇄 기본틀 영역을 포함하고, 이때, 상기 생식세포 단백질 쌍은 다음과 같은 성질을 포함한다:
i) 적어도 2.5mg/L의 Fab 포맷의 발현 수율;
ii) Fab 포맷의 70℃ 이상의 열 안정성;
iii) SEC로 확인한, 적어도 99%의 Fab 포맷의 단량체 함량(단량체 %);
iv) 적어도 30mg/L의 IgG1 포맷의 발현 수율;
v) IgG1 포맷의 73℃ 이상의 열 안정성; 및
vii) SEC로 확인한, 적어도 99%의 IgG1 포맷의 단량체 함량(단량체 %)
viii) 적어도 8.3의 IgG1 포맷의 등전점.
방법의 이러한 구현예에서, 항체 또는 기능적 단편은 가변 중쇄 및 가변 경쇄 쌍을 포함하며, 이때 가변 중쇄 및 가변 경쇄 쌍의 기본틀 영역은 VH1-18 (SEQ ID NO: 204)/VK3-20 (SEQ ID NO: 239); VH1-46 (SEQ ID NO: 205)/VK3-15 (SEQ ID NO: 238); VH1-46 (SEQ ID NO: 205)/VL1-51 (SEQ ID NO: 252); VH1-69*01 (SEQ ID NO: 206)/VL1-51 (SEQ ID NO: 252); VH3-07 (SEQ ID NO: 207)/VK1-12 (SEQ ID NO: 233); VH3-07 (SEQ ID NO: 207)/VK1-27 (SEQ ID NO: 235); VH3-07 (SEQ ID NO: 207)/VK3-15 (SEQ ID NO: 238); VH3-07 (SEQ ID NO: 207)/VL1-47 (SEQ ID NO: 251); VH3-07 (SEQ ID NO: 207)/VL1-51 (SEQ ID NO: 252); VH3-11 (SEQ ID NO: 208)/VL1-40 (SEQ ID NO: 250); VH3-11 (SEQ ID NO: 208)/VL1-47 (SEQ ID NO: 251); VH3-11 (SEQ ID NO: 208)/VL1-51 (SEQ ID NO: 252); VH3-11 (SEQ ID NO: 208)/VL2-23 (SEQ ID NO: 255); VH3-15 (SEQ ID NO: 209)/VK1-05 (SEQ ID NO: 230); VH3-15 (SEQ ID NO: 209)/VK1-06 (SEQ ID NO: 231); VH3-15 (SEQ ID NO: 209)/VK1-12 (SEQ ID NO: 233); VH3-15 (SEQ ID NO: 209)/VK1-27 (SEQ ID NO: 235); VH3-15 (SEQ ID NO: 209)/VK3-11 (SEQ ID NO: 237); VH3-15 (SEQ ID NO: 209)/VL1-51 (SEQ ID NO: 252); VH3-21 (SEQ ID NO: 210)/VK1-12 (SEQ ID NO: 233); VH3-23 (SEQ ID NO: 211)/VK3-15 (SEQ ID NO: 238); VH3-53 (SEQ ID NO: 213)/VK3-15 (SEQ ID NO: 238); VH3-53 (SEQ ID NO: 213)/VL2-11 (SEQ ID NO: 253); VH3-74 (SEQ ID NO: 214)/VK1-05 (SEQ ID NO: 230); VH3-74 (SEQ ID NO: 214)/VK1-06 (SEQ ID NO: 231); VH3-74 (SEQ ID NO: 214)/VK1-12 (SEQ ID NO: 233); VH3-74 (SEQ ID NO: 214)/VK3-20 (SEQ ID NO: 239); VH5-51 (SEQ ID NO: 215)/VK1-39 (SEQ ID NO: 236); VH5-51 (SEQ ID NO: 215)/VL1-40 (SEQ ID NO: 250); VH5-51 (SEQ ID NO: 215)/VL1-51 (SEQ ID NO: 252); VH6-1 (SEQ ID NO: 216)/VK1-09 (SEQ ID NO: 232); VH6-1 (SEQ ID NO: 216)/VK3-20 (SEQ ID NO: 239) 및 VH6-1 (SEQ ID NO: 216)/VL1-51 (SEQ ID NO: 252)의 가변 중쇄 및 가변 경쇄 쌍으로부터 생식세포 단백질 서열을 포함한다.
방법의 추가적인 구현예에서, 항체 또는 기능적 단편은 가변 중쇄 및 가변 경쇄 쌍을 포함하며, 이때 가변 중쇄 및 가변 경쇄 쌍의 기본틀 영역은 VH3-23 (SEQ ID NO: 211)/VK1-39 (SEQ ID NO: 236); VH3-23 (SEQ ID NO: 211)/VL2-23 (SEQ ID NO: 255); 및 VH3-23 (SEQ ID NO: 211)/VL3-1 (SEQ ID NO: 256)의 가변 중쇄 및 가변 경쇄 쌍으로부터의 생식세포 단백질 서열을 더 포함한다. 방법의 이 구현예에서, 집합은 (36개 쌍) VH1-18 (SEQ ID NO: 204)/VK3-20 (SEQ ID NO: 239); VH1-46 (SEQ ID NO: 205)/VK3-15 (SEQ ID NO: 238); VH1-46 (SEQ ID NO: 205)/VL1-51 (SEQ ID NO: 252); VH1-69*01 (SEQ ID NO: 206)/VL1-51 (SEQ ID NO: 252); VH3-07 (SEQ ID NO: 207)/VK1-12 (SEQ ID NO: 233); VH3-07 (SEQ ID NO: 207)/VK1-27 (SEQ ID NO: 235); VH3-07 (SEQ ID NO: 207)/VK3-15 (SEQ ID NO: 238); VH3-07 (SEQ ID NO: 207)/VL1-47 (SEQ ID NO: 251); VH3-07 (SEQ ID NO: 207)/VL1-51 (SEQ ID NO: 252); VH3-11 (SEQ ID NO: 208)/VL1-40 (SEQ ID NO: 250); VH3-11 (SEQ ID NO: 208)/VL1-47 (SEQ ID NO: 251); VH3-11 (SEQ ID NO: 208)/VL1-51 (SEQ ID NO: 252); VH3-11 (SEQ ID NO: 208)/VL2-23 (SEQ ID NO: 255); VH3-15 (SEQ ID NO: 209)/VK1-05 (SEQ ID NO: 230); VH3-15 (SEQ ID NO: 209)/VK1-06 (SEQ ID NO: 231); VH3-15 (SEQ ID NO: 209)/VK1-12 (SEQ ID NO: 233); VH3-15 (SEQ ID NO: 209)/VK1-27 (SEQ ID NO: 235); VH3-15 (SEQ ID NO: 209)/VK3-11 (SEQ ID NO: 237); VH3-15 (SEQ ID NO: 209)/VL1-51 (SEQ ID NO: 252); VH3-21 (SEQ ID NO: 210)/VK1-12 (SEQ ID NO: 233); VH3-23 (SEQ ID NO: 211)/VK1-39 (SEQ ID NO: 236); VH3-23 (SEQ ID NO: 211)/VK3-15 (SEQ ID NO: 238); VH3-23 (SEQ ID NO: 211)/VL2-23 (SEQ ID NO: 255); VH3-23 (SEQ ID NO: 211)/VL3-1 (SEQ ID NO: 256); VH3-53 (SEQ ID NO: 213)/VK3-15 (SEQ ID NO: 238); VH3-53 (SEQ ID NO: 213)/VL2-11 (SEQ ID NO: 253); VH3-74 (SEQ ID NO: 214)/VK1-05 (SEQ ID NO: 230); VH3-74 (SEQ ID NO: 214)/VK1-06 (SEQ ID NO: 231); VH3-74 (SEQ ID NO: 214)/VK1-12 (SEQ ID NO: 233); VH3-74 (SEQ ID NO: 214)/VK3-20 (SEQ ID NO: 239); VH5-51 (SEQ ID NO: 215)/VK1-39 (SEQ ID NO: 236); VH5-51 (SEQ ID NO: 215)/VL1-40 (SEQ ID NO: 250); VH5-51 (SEQ ID NO: 215)/VL1-51 (SEQ ID NO: 252); VH6-1 (SEQ ID NO: 216)/VK1-09 (SEQ ID NO: 232); VH6-1 (SEQ ID NO: 216)/VK3-20 (SEQ ID NO: 239) 및 VH6-1 (SEQ ID NO: 216)/VL1-51 (SEQ ID NO: 252)을 포함한다.
이용방법
일 양태는 항원에 대해 특이적인 항체 또는 단편을 확인하고자 본원에 기술된 집합을 이용하는 방법을 포함한다.
본원의 일 양태는
(a) 항원을 항체 또는 이의 기능적 단편의 집합과 접촉시키는 단계, 이때 집합의 항체 또는 기능적 단편의 실질적으로 모두, 또는 적어도 50%, 또는 적어도 60%, 또는 적어도 70%, 또는 적어도 80%, 또는 적어도 90%, 또는 적어도 95%, 또는 각각은 가변 중쇄 및 가변 경쇄 쌍을 포함하며, 이때 가변 중쇄 및 가변 경쇄 쌍의 기본틀 영역은 다음과 같은 성질을 포함하는 생식세포 단백질 쌍의 생식세포 단백질 서열을 포함한다:
i) 적어도 2.5mg/L의 Fab 포맷의 발현 수율;
ii) Fab 포맷의 70℃ 이상의 열 안정성;
iii) SEC로 확인한, 적어도 98%의 Fab 포맷의 단량체 함량(단량체 %);
iv) 적어도 30mg/L의 IgG1 포맷의 발현 수율;
v) IgG1 포맷의 73℃ 이상의 열 안정성; 및
vii) SEC로 확인한, 적어도 99%의 IgG1 포맷의 단량체 함량(단량체 %); 및
(b) 상기 항원에 결합하는 하나 이상의 항체 또는 항체 단편을 선택하는 단계를 포함하는, 항원에 대해 특이적인 항체 또는 항체 단편을 확인하는 방법을 포함한다.
특정 구현예에서,
i) Fab 포맷의 발현 수율은 1.538mL/mg의 흡광계수를 이용하고, 280nm에서 흡광도를 측정하는 UV 분광측정법으로 확인하였다.
특정 구현예에서,
ii) Fab 포맷의 열 안정성은 PBS 완충액을 이용한 시차 주사 형광 분석법으로 확인하였다.
특정 구현예에서,
iii) Fab 포맷의 단량체 함량(단량체 %)은 Superdex75 HR10/30 컬럼과 pH 7.4의 Gibco D-PBS 완충액을 이용한 크기 배제 크로마토그래피로 확인하였다.
특정 구현예에서,
iv) IgG1 포맷의 발현 수율은 1.369mL/mg의 흡광계수를 이용하고, 280nm에서 흡광도를 측정하는 UV 분광측정법으로 확인하였다.
특정 구현예에서,
v) IgG1 포맷의 열 안정성은 PBS 완충액을 이용한 시차 주사 형광 분석법으로 확인하였다.
특정 구현예에서,
vii) IgG1 포맷의 단량체 함량(단량체 %)은 Tosoh TSK-Gel G3000SWxl 컬럼과 pH 7.4의 Gibco D-PBS 완충액을 이용한 크기 배제 크로마토그래피로 확인하였다.
UV 분광측정법은 Nanadrop 시스템(peqlab, Erlangen, 독일)을 이용하여 이루어질 수 있다. 시차 주사 형광 분석법은 iCycler iQ5 Thermal Cycler(Biorad)를 이용하여 이루어질 수 있다. 시차 주사 형광 분석법은 Gibco D-PBS, pH 7.4(Invitrogen, Paisley, 미국)를 이용하여 이루어질 수 있다. 크기 배제 크로마토그래피는 AKTA 정제기 시스템(GE Healthcare)을 이용하여 이루어질 수 있다.
방법의 일 구현예에서, 가변 중쇄 및 가변 경쇄 쌍의 기본틀 영역은 VH1-18 (SEQ ID NO: 204)/VK3-20 (SEQ ID NO: 239); VH1-46 (SEQ ID NO: 205)/VK3-15 (SEQ ID NO: 238); VH1-46 (SEQ ID NO: 205)/VL1-51 (SEQ ID NO: 252); VH1-69*01 (SEQ ID NO: 206)/VL1-51 (SEQ ID NO: 252); VH3-07 (SEQ ID NO: 207)/VK1-12 (SEQ ID NO: 233); VH3-07 (SEQ ID NO: 207)/VK1-27 (SEQ ID NO: 235); VH3-07 (SEQ ID NO: 207)/VK3-15 (SEQ ID NO: 238); VH3-07 (SEQ ID NO: 207)/VL1-47 (SEQ ID NO: 251); VH3-07 (SEQ ID NO: 207)/VL1-51 (SEQ ID NO: 252); VH3-11 (SEQ ID NO: 208)/VL1-40 (SEQ ID NO: 250); VH3-11 (SEQ ID NO: 208)/VL1-47 (SEQ ID NO: 251); VH3-11 (SEQ ID NO: 208)/VL1-51 (SEQ ID NO: 252); VH3-11 (SEQ ID NO: 208)/VL2-23 (SEQ ID NO: 255); VH3-15 (SEQ ID NO: 209)/VK1-05 (SEQ ID NO: 230); VH3-15 (SEQ ID NO: 209)/VK1-06 (SEQ ID NO: 231); VH3-15 (SEQ ID NO: 209)/VK1-12 (SEQ ID NO: 233); VH3-15 (SEQ ID NO: 209)/VK1-27 (SEQ ID NO: 235); VH3-15 (SEQ ID NO: 209)/VK3-11 (SEQ ID NO: 237); VH3-15 (SEQ ID NO: 209)/VL1-51 (SEQ ID NO: 252); VH3-21 (SEQ ID NO: 210)/VK1-12 (SEQ ID NO: 233); VH3-23 (SEQ ID NO: 211)/VK1-39 (SEQ ID NO: 236); VH3-23 (SEQ ID NO: 211)/VK3-15 (SEQ ID NO: 238); VH3-23 (SEQ ID NO: 211)/VL2-23 (SEQ ID NO: 255); VH3-23 (SEQ ID NO: 211)/VL3-1 (SEQ ID NO: 256); VH3-53 (SEQ ID NO: 213)/VK3-15 (SEQ ID NO: 238); VH3-53 (SEQ ID NO: 213)/VL2-11 (SEQ ID NO: 253); VH3-74 (SEQ ID NO: 214)/VK1-05 (SEQ ID NO: 230); VH3-74 (SEQ ID NO: 214)/VK1-06 (SEQ ID NO: 231); VH3-74 (SEQ ID NO: 214)/VK1-12 (SEQ ID NO: 233); VH3-74 (SEQ ID NO: 214)/VK3-20 (SEQ ID NO: 239); VH5-51 (SEQ ID NO: 215)/VK1-39 (SEQ ID NO: 236); VH5-51 (SEQ ID NO: 215)/VL1-40 (SEQ ID NO: 250); VH5-51 (SEQ ID NO: 215)/VL1-51 (SEQ ID NO: 252); VH6-1 (SEQ ID NO: 216)/VK1-09 (SEQ ID NO: 232); VH6-1 (SEQ ID NO: 216)/VK3-20 (SEQ ID NO: 239) 및 VH6-1 (SEQ ID NO: 216)/VL1-51 (SEQ ID NO: 252)로부터의 생식세포 단백질 서열을 포함한다.
방법의 일 구현예에서, 항체 또는 이의 기능적 단편은 VH1-18 (SEQ ID NO: 204)/VK1-39 (SEQ ID NO: 236); VH1-18 (SEQ ID NO: 204)/VK3-15 (SEQ ID NO: 238); VH1-18 (SEQ ID NO: 204)/VK3-20 (SEQ ID NO: 239); VH1-46 (SEQ ID NO: 205)/VK3-15 (SEQ ID NO: 238); VH1-46 (SEQ ID NO: 205)/VL1-51 (SEQ ID NO: 252); VH1-46 (SEQ ID NO: 205)/VL3-21 (SEQ ID NO: 257); VH1-69*01 (SEQ ID NO: 206)/VL1-51 (SEQ ID NO: 252); VH3-07 (SEQ ID NO: 207)/VK1-12 (SEQ ID NO: 233); VH3-07 (SEQ ID NO: 207)/VK1-16 (SEQ ID NO: 234); VH3-07 (SEQ ID NO: 207)/VK1-27 (SEQ ID NO: 235); VH3-07 (SEQ ID NO: 207)/VK1-39 (SEQ ID NO: 236); VH3-07 (SEQ ID NO: 207)/VK3-15 (SEQ ID NO: 238); VH3-07 (SEQ ID NO: 207)/VL1-47 (SEQ ID NO: 251); VH3-07 (SEQ ID NO: 207)/VL1-51 (SEQ ID NO: 252); VH3-11 (SEQ ID NO: 208)/VK1-05 (SEQ ID NO: 230); VH3-11 (SEQ ID NO: 208)/VK1-39 (SEQ ID NO: 236); VH3-11 (SEQ ID NO: 208)/VK3-15 (SEQ ID NO: 238); VH3-11 (SEQ ID NO: 208)/VL1-40 (SEQ ID NO: 250); VH3-11 (SEQ ID NO: 208)/VL1-47 (SEQ ID NO: 251); VH3-11 (SEQ ID NO: 208)/VL1-51 (SEQ ID NO: 252); VH3-11 (SEQ ID NO: 208)/VL2-23 (SEQ ID NO: 255); VH3-15 (SEQ ID NO: 209)/VK1-05 (SEQ ID NO: 230); VH3-15 (SEQ ID NO: 209)/VK1-06 (SEQ ID NO: 231); VH3-15 (SEQ ID NO: 209)/VK1-12 (SEQ ID NO: 233); VH3-15 (SEQ ID NO: 209)/VK1-16 (SEQ ID NO: 234); VH3-15 (SEQ ID NO: 209)/VK1-27 (SEQ ID NO: 235); VH3-15 (SEQ ID NO: 209)/VK3-11 (SEQ ID NO: 237); VH3-15 (SEQ ID NO: 209)/VL1-40 (SEQ ID NO: 250); VH3-15 (SEQ ID NO: 209)/VL1-47 (SEQ ID NO: 251); VH3-15 (SEQ ID NO: 209)/VL1-51 (SEQ ID NO: 252); VH3-15 (SEQ ID NO: 209)/VL2-14 (SEQ ID NO: 254); VH3-21 (SEQ ID NO: 210)/VK1-12 (SEQ ID NO: 233); VH3-21 (SEQ ID NO: 210)/VK1-27 (SEQ ID NO: 235); VH3-21 (SEQ ID NO: 210)/VL2-11 (SEQ ID NO: 253); VH3-23 (SEQ ID NO: 211)/VK1-39 (SEQ ID NO: 236); VH3-23 (SEQ ID NO: 211)/VK3-15 (SEQ ID NO: 238); VH3-23 (SEQ ID NO: 211)/VL2-23 (SEQ ID NO: 255); VH3-23 (SEQ ID NO: 211)/VL3-1 (SEQ ID NO: 256); VH3-30 (SEQ ID NO: 212)/VK3-20 (SEQ ID NO: 239); VH3-53 (SEQ ID NO: 213)/VK3-15 (SEQ ID NO: 238); VH3-53 (SEQ ID NO: 213)/VL2-11 (SEQ ID NO: 253); VH3-74 (SEQ ID NO: 214)/VK1-05 (SEQ ID NO: 230); VH3-74 (SEQ ID NO: 214)/VK1-06 (SEQ ID NO: 231); VH3-74 (SEQ ID NO: 214)/VK1-12 (SEQ ID NO: 233); VH3-74 (SEQ ID NO: 214)/VK1-27 (SEQ ID NO: 235); VH3-74 (SEQ ID NO: 214)/VK3-20 (SEQ ID NO: 239); VH3-74 (SEQ ID NO: 214)/VL1-51 (SEQ ID NO: 252); VH5-51 (SEQ ID NO: 215)/VK1-39 (SEQ ID NO: 236); VH5-51 (SEQ ID NO: 215)/VL1-40 (SEQ ID NO: 250); VH5-51 (SEQ ID NO: 215)/VL1-51 (SEQ ID NO: 252); VH6-1 (SEQ ID NO: 216)/VK1-09 (SEQ ID NO: 232); VH6-1 (SEQ ID NO: 216)/VK3-15 (SEQ ID NO: 238); VH6-1 (SEQ ID NO: 216)/VK3-20 (SEQ ID NO: 239) 및 VH6-1 (SEQ ID NO: 216)/VL1-51 (SEQ ID NO: 252)로부터 선택된 가변 중쇄 및 가변 경쇄 쌍으로 이루어진 군으로부터 선택된 두 개 이상, 세 개 이상, 네 개 이상, 다섯 개 이상, 여섯 개 이상, 일곱 개 이상, 여덟 개 이상, 아홉 개 이상, 열 개 이상, 열 한 개 이상, 열 두 개 이상, 열 세 개 이상, 열 네 개 이상, 열 다섯 개 이상, 열 여섯 개 이상, 열 일곱 개 이상, 열 여덟 개 이상, 열 아홉 개 이상, 스무 개 이상, 스물 한 개 이상, 스물 두 개 이상, 스물 세 개 이상, 스물 네 개 이상, 스물 다섯 개 이상, 스물 여섯 개 이상, 스물 일곱 개 이상, 스물 여덟 개 이상, 스물 아홉 개 이상, 서른 개 이상, 서른 한 개 이상, 서른 두 개 이상, 서른 세 개 이상, 서른 네 개 이상, 서른 다섯 개 이상, 서른 여섯 개 이상, 서른 일곱 개 이상, 서른 여덟 개 이상, 서른 아홉 개 이상, 마흔 개 이상, 마흔 한 개 이상, 또는 마흔 두 개 이상, 또는 마흔 세 개 이상, 또는 마흔 네 개 이상, 또는 마흔 다섯 개 이상, 또는 마흔 여섯 개 이상, 또는 마흔 일곱 개 이상, 또는 마흔 여덟 개 이상, 또는 마흔 아홉 개 이상, 또는 쉰 개 이상, 또는 쉰 한 개 이상, 또는 쉰 두 개 이상, 또는 쉰 세 개 이상, 또는 쉰 네 개의 가변 중쇄 및 가변 경쇄 쌍을 포함한다.
방법의 구현예에서, 항체 또는 기능적 단편의 실질적으로 모두, 또는 적어도 50%, 또는 적어도 60%, 또는 적어도 70%, 또는 적어도 80%, 또는 적어도 90%, 또는 적어도 95%, 또는 각각은 생식세포 단백질 쌍의 생식세포 단백질 서열을 포함하는 가변 중쇄 및 가변 경쇄 기본틀 영역을 포함하고, 이때, 상기 생식세포 단백질 쌍은 다음과 같은 성질을 포함한다:
i) 적어도 2.5mg/L의 Fab 포맷의 발현 수율;
ii) Fab 포맷의 70℃ 이상의 열 안정성;
iii) SEC로 확인한, 적어도 99%의 Fab 포맷의 단량체 함량(단량체 %);
iv) 적어도 30mg/L의 IgG1 포맷의 발현 수율;
v) IgG1 포맷의 73℃ 이상의 열 안정성;
vii) SEC로 확인한, 적어도 99%의 IgG1 포맷의 단량체 함량(단량체 %); 및
viii) 적어도 8.3의 IgG1 포맷의 등전점.
방법의 이러한 구현예에서, 가변 중쇄 및 가변 경쇄 쌍의 기본틀 영역은 VH1-18 (SEQ ID NO: 204)/VK3-20 (SEQ ID NO: 239); VH1-46 (SEQ ID NO: 205)/VK3-15 (SEQ ID NO: 238); VH1-46 (SEQ ID NO: 205)/VL1-51 (SEQ ID NO: 252); VH1-69*01 (SEQ ID NO: 206)/VL1-51 (SEQ ID NO: 252); VH3-07 (SEQ ID NO: 207)/VK1-12 (SEQ ID NO: 233); VH3-07 (SEQ ID NO: 207)/VK1-27 (SEQ ID NO: 235); VH3-07 (SEQ ID NO: 207)/VK3-15 (SEQ ID NO: 238); VH3-07 (SEQ ID NO: 207)/VL1-47 (SEQ ID NO: 251); VH3-07 (SEQ ID NO: 207)/VL1-51 (SEQ ID NO: 252); VH3-11 (SEQ ID NO: 208)/VL1-40 (SEQ ID NO: 250); VH3-11 (SEQ ID NO: 208)/VL1-47 (SEQ ID NO: 251); VH3-11 (SEQ ID NO: 208)/VL1-51 (SEQ ID NO: 252); VH3-11 (SEQ ID NO: 208)/VL2-23 (SEQ ID NO: 255); VH3-15 (SEQ ID NO: 209)/VK1-05 (SEQ ID NO: 230); VH3-15 (SEQ ID NO: 209)/VK1-06 (SEQ ID NO: 231); VH3-15 (SEQ ID NO: 209)/VK1-12 (SEQ ID NO: 233); VH3-15 (SEQ ID NO: 209)/VK1-27 (SEQ ID NO: 235); VH3-15 (SEQ ID NO: 209)/VK3-11 (SEQ ID NO: 237); VH3-15 (SEQ ID NO: 209)/VL1-51 (SEQ ID NO: 252); VH3-21 (SEQ ID NO: 210)/VK1-12 (SEQ ID NO: 233); VH3-23 (SEQ ID NO: 211)/VK3-15 (SEQ ID NO: 238); VH3-53 (SEQ ID NO: 213)/VK3-15 (SEQ ID NO: 238); VH3-53 (SEQ ID NO: 213)/VL2-11 (SEQ ID NO: 253); VH3-74 (SEQ ID NO: 214)/VK1-05 (SEQ ID NO: 230); VH3-74 (SEQ ID NO: 214)/VK1-06 (SEQ ID NO: 231); VH3-74 (SEQ ID NO: 214)/VK1-12 (SEQ ID NO: 233); VH3-74 (SEQ ID NO: 214)/VK3-20 (SEQ ID NO: 239); VH5-51 (SEQ ID NO: 215)/VK1-39 (SEQ ID NO: 236); VH5-51 (SEQ ID NO: 215)/VL1-40 (SEQ ID NO: 250); VH5-51 (SEQ ID NO: 215)/VL1-51 (SEQ ID NO: 252); VH6-1 (SEQ ID NO: 216)/VK1-09 (SEQ ID NO: 232); VH6-1 (SEQ ID NO: 216)/VK3-20 (SEQ ID NO: 239) 및 VH6-1 (SEQ ID NO: 216)/VL1-51 (SEQ ID NO: 252)로부터 생식세포 단백질 서열을 포함한다.
방법의 추가적인 구현예에서, 가변 중쇄 및 가변 경쇄 쌍의 기본틀 영역은 가변 중쇄 및 가변 경쇄 쌍 VH3-23 (SEQ ID NO: 211)/VK1-39 (SEQ ID NO: 236); VH3-23 (SEQ ID NO: 211)/VL2-23 (SEQ ID NO: 255); 및 VH3-23 (SEQ ID NO: 211)/VL3-1 (SEQ ID NO: 256)으로부터 선택된 생식세포 단백질 서열을 더 포함한다. 이러한 구현예에서, 집합은 (36개 쌍) VH1-18 (SEQ ID NO: 204)/VK3-20 (SEQ ID NO: 239); VH1-46 (SEQ ID NO: 205)/VK3-15 (SEQ ID NO: 238); VH1-46 (SEQ ID NO: 205)/VL1-51 (SEQ ID NO: 252); VH1-69*01 (SEQ ID NO: 206)/VL1-51 (SEQ ID NO: 252); VH3-07 (SEQ ID NO: 207)/VK1-12 (SEQ ID NO: 233); VH3-07 (SEQ ID NO: 207)/VK1-27 (SEQ ID NO: 235); VH3-07 (SEQ ID NO: 207)/VK3-15 (SEQ ID NO: 238); VH3-07 (SEQ ID NO: 207)/VL1-47 (SEQ ID NO: 251); VH3-07 (SEQ ID NO: 207)/VL1-51 (SEQ ID NO: 252); VH3-11 (SEQ ID NO: 208)/VL1-40 (SEQ ID NO: 250); VH3-11 (SEQ ID NO: 208)/VL1-47 (SEQ ID NO: 251); VH3-11 (SEQ ID NO: 208)/VL1-51 (SEQ ID NO: 252); VH3-11 (SEQ ID NO: 208)/VL2-23 (SEQ ID NO: 255); VH3-15 (SEQ ID NO: 209)/VK1-05 (SEQ ID NO: 230); VH3-15 (SEQ ID NO: 209)/VK1-06 (SEQ ID NO: 231); VH3-15 (SEQ ID NO: 209)/VK1-12 (SEQ ID NO: 233); VH3-15 (SEQ ID NO: 209)/VK1-27 (SEQ ID NO: 235); VH3-15 (SEQ ID NO: 209)/VK3-11 (SEQ ID NO: 237); VH3-15 (SEQ ID NO: 209)/VL1-51 (SEQ ID NO: 252); VH3-21 (SEQ ID NO: 210)/VK1-12 (SEQ ID NO: 233); VH3-23 (SEQ ID NO: 211)/VK1-39 (SEQ ID NO: 236); VH3-23 (SEQ ID NO: 211)/VK3-15 (SEQ ID NO: 238); VH3-23 (SEQ ID NO: 211)/VL2-23 (SEQ ID NO: 255); VH3-23 (SEQ ID NO: 211)/VL3-1 (SEQ ID NO: 256); VH3-53 (SEQ ID NO: 213)/VK3-15 (SEQ ID NO: 238); VH3-53 (SEQ ID NO: 213)/VL2-11 (SEQ ID NO: 253); VH3-74 (SEQ ID NO: 214)/VK1-05 (SEQ ID NO: 230); VH3-74 (SEQ ID NO: 214)/VK1-06 (SEQ ID NO: 231); VH3-74 (SEQ ID NO: 214)/VK1-12 (SEQ ID NO: 233); VH3-74 (SEQ ID NO: 214)/VK3-20 (SEQ ID NO: 239); VH5-51 (SEQ ID NO: 215)/VK1-39 (SEQ ID NO: 236); VH5-51 (SEQ ID NO: 215)/VL1-40 (SEQ ID NO: 250); VH5-51 (SEQ ID NO: 215)/VL1-51 (SEQ ID NO: 252); VH6-1 (SEQ ID NO: 216)/VK1-09 (SEQ ID NO: 232); VH6-1 (SEQ ID NO: 216)/VK3-20 (SEQ ID NO: 239) 및 VH6-1 (SEQ ID NO: 216)/VL1-51 (SEQ ID NO: 252)을 포함한다.
방법의 양태
본원에 개시된 방법의 추가적인 양태에서, 집합은, 각각의 가변 중쇄 및 가변 경쇄 쌍으로부터 생식세포 단백질 서열을 포함하는 하나 이상의 상보성 결정 영역을 포함하는 합성 항체 또는 이의 기능적 단편 또는 그러한 항체 또는 기능적 단편을 암호화하는 합성 핵산을 포함하며, 가변 중쇄 및 가변 경쇄 쌍의 상보성 결정 영역의 아미노산 서열은 도 25 내지 도 33에 도시되어 있다. 더욱 구체적으로는, 방법의 일 구현예에서, 집합은, 각각의 가변 중쇄 및/또는 가변 경쇄 쌍으로부터 생식세포 단백질 서열을 포함하는 CDR1 영역을 포함하는, 항체 또는 이의 기능적 단편 또는 그러한 항체 또는 기능적 단편을 암호화하는 합성 핵산을 포함하며, 이때 가변 중쇄 및 가변 경쇄의 CDR1 영역의 아미노산 및 핵산 서열은 도 25, 도 28 및 도 31, 그리고 상응하는 SEQ ID NO: 204~265에 도시되어 있다. 방법의 일 구현예에서, 집합은, 각각의 가변 중쇄 및 가변 경쇄 쌍으로부터 생식세포 단백질 서열을 포함하는 HCDR1 영역을 포함하는, 항체 또는 이의 기능적 단편 또는 그러한 항체 또는 기능적 단편을 암호화하는 합성 핵산을 포함하며, 이때 가변 중쇄 및 가변 경쇄의 HCDR1 영역의 아미노산 및 핵산 서열은 도 25 및 상응하는 SEQ ID NO: 204~229에 도시되어 있다. 방법의 일 구현예에서, 집합은, 각각의 가변 중쇄 및 가변 경쇄 쌍으로부터 생식세포 단백질 서열을 포함하는 LCDR1 영역을 포함하는, 항체 또는 이의 기능적 단편 또는 그러한 항체 또는 기능적 단편을 암호화하는 합성 핵산을 포함하며, 이때 가변 중쇄 및 가변 경쇄의 LCDR1 영역의 아미노산 및 핵산 서열은 도 28과 도 31 및 상응하는 SEQ ID NO: 230~265에 도시되어 있다. 추가적인 방법의 구현예에서, 집합은, 각각의 가변 중쇄 및 가변 경쇄 쌍으로부터 생식세포 단백질 서열을 포함하는 CDR2 영역을 포함하는 항체 또는 이의 기능적 단편 또는 그러한 항체 또는 기능적 단편을 암호화하는 합성 핵산을 포함하며, 이때 가변 중쇄 및 가변 경쇄의 CDR2 영역의 아미노산 및 핵산 서열은 도 26, 도 29 및 도 32, 그리고 상응하는 SEQ ID NO: 204~265에 도시되어 있다. 방법의 추가적인 구현예에서, 집합은, 각각의 가변 중쇄 및 가변 경쇄 쌍으로부터 생식세포 단백질 서열을 포함하는 HCDR2 영역을 포함하는 항체 또는 이의 기능적 단편 또는 그러한 항체 또는 기능적 단편을 암호화하는 합성 핵산을 포함하며, 이때 가변 중쇄 및 가변 경쇄의 HCDR2 영역의 아미노산 및 핵산 서열은 도 26 및 상응하는 SEQ ID NO: 204~229에 도시되어 있다. 방법의 추가적인 구현예에서, 집합은, 각각의 가변 중쇄 및 가변 경쇄 쌍으로부터 생식세포 단백질 서열을 포함하는 LCDR2 영역을 포함하는 항체 또는 이의 기능적 단편 또는 그러한 항체 또는 기능적 단편을 암호화하는 합성 핵산을 포함하며, 이때 가변 중쇄 및 가변 경쇄의 LCDR2 영역의 아미노산 및 핵산 서열은 도 29 및 도 32, 그리고 상응하는 SEQ ID NO: 230~265에 도시되어 있다.
본 방법의 구현예에서, 집합은 잠재적인 번역 후 변형 부위를 제거하는 아미노산 변형을 포함하는 하나 이상의 상보성 결정 영역을 포함하는 항체 또는 이의 기능적 단편 또는 그러한 항체 또는 기능적 단편을 암호화하는 합성 핵산을 포함한다. 방법의 일 구현예에서, 집합은, 상보성 결정 영역 서열 또는 각각의 가변 중쇄로부터 도 34 내지 도 36에 도시된 것과 동일한 것을 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 하나 이상의 상보성 결정 영역을 포함하는 항체 또는 이의 기능적 단편 또는 그러한 항체 또는 기능적 단편을 암호화하는 합성 핵산을 포함한다. 방법의 추가적인 구현예에서, 집합은, HCDR1 또는 각각의 가변 중쇄로부터 도 34 내지 도 36에 도시된 것과 동일한 것을 암호화하는 핵산을 포함하는 HCDR1 영역을 포함하는 항체 또는 이의 기능적 단편 또는 그러한 항체 또는 기능적 단편을 암호화하는 합성 핵산을 포함한다. 낮은 PTM HCDR1의 아미노산 서열은 SEQ ID NO: 266~278에 도시되어 있다. 낮은 PTM HCDR1의 핵산 서열은 SEQ ID NO: 279~291에 도시되어 있다. 방법의 추가적인 구현예에서, 집합은, HCDR2 영역 또는 각각의 가변 중쇄로부터 도 34 내지 도 36에 도시된 것과 동일한 것을 암호화하는 핵산을 포함하는 HCDR2 영역을 포함하는 항체 또는 이의 기능적 단편 또는 그러한 항체 또는 기능적 단편을 암호화하는 합성 핵산을 포함한다. 낮은 PTM HCDR2의 아미노산 서열은 SEQ ID NO: 266~278에 도시되어 있다. 낮은 PTM HCDR2의 핵산 서열은 SEQ ID NO: 279~291에 도시되어 있다.
방법의 일 구현예에서, 집합은 JH4 (SEQ ID NO:293), Jκ1 (SEQ ID NO:297) 및 Jλ2/3 (SEQ ID NO:301)로 이루어진 군으로부터 선택된 FR4 영역을 포함하는 항체 또는 이의 기능적 단편 또는 그러한 항체 또는 기능적 단편을 암호화하는 합성 핵산을 포함한다. 방법의 일 구현예에서, 집합은 생식세포 JH4 FR4 영역을 포함하는 항체 또는 이의 기능적 단편 또는 그러한 항체 또는 기능적 단편을 암호화하는 합성 핵산을 포함하며, 그 아미노산 또는 핵산 서열은 도 40에 도시되어 있다. JH4 FR4 아미노산 서열은 (SEQ ID NO:293) 및 (SEQ ID NO:295)에 도시되어 있다. JH4 FR4 핵산 서열은 (SEQ ID NO:292) 및 (SEQ ID NO:294)에 도시되어 있다. 방법의 일 구현예에서, 집합은 생식세포 Jk1 FR4 영역을 포함하는 항체 또는 이의 기능적 단편 또는 그러한 항체 또는 기능적 단편을 암호화하는 합성 핵산을 포함하며, 그 아미노산 또는 핵산 서열은 도 40에 도시되어 있다. Jk1 FR4 아미노산 서열은 (SEQ ID NO:297)에 도시되어 있다. Jk1 FR4 핵산 서열은 (SEQ ID NO:296), (SEQ ID NO:298) 및 (SEQ ID NO:299)에 도시되어 있다. 방법의 일 구현예에서, 집합은 생식세포 Jλ2/3 FR4 영역을 포함하는 항체 또는 이의 기능적 단편 또는 그러한 항체 또는 기능적 단편을 암호화하는 합성 핵산을 포함하며, 그 아미노산 또는 핵산 서열은 도 40에 도시되어 있다. Jλ2/3 FR4 아미노산 서열은 (SEQ ID NO:301)에 도시되어 있다. Jλ2/3 FR4 핵산 서열은 (SEQ ID NO:300), (SEQ ID NO:302) 및 (SEQ ID NO:303)에 도시되어 있다.
일 양태에서, 임의의 항원에 대한 항체 또는 이의 단편을 확인하는 능력을 향상시키기 위하여, 집합은, 다양화된 CDR3 영역을 포함한다. 방법의 일 구현예에서, 집합은, 다양화된 HCDR3 영역을 포함하는 항체 또는 이의 기능적 단편 또는 그러한 항체 또는 기능적 단편을 암호화하는 합성 핵산을 포함한다. 방법의 일 구현예에서, 집합은 다양화된 LCDR3 영역을 포함하는 항체 또는 이의 기능적 단편 또는 그러한 항체 또는 기능적 단편을 암호화하는 합성 핵산을 포함한다.
다른 양태에서, 임의의 항원에 대한 항체 또는 이의 단편을 확인하는 능력을 향상시키기 위하여, 방법의 집합은 적어도 1 X 104개의 항체 또는 이의 기능적 단편 또는 그러한 항체 또는 기능적 단편을 암호화하는 합성 핵산, 적어도 1 X 105개의 항체 또는 이의 기능적 단편 또는 그러한 항체 또는 기능적 단편을 암호화하는 합성 핵산, 적어도 1 X 106개의 항체 또는 이의 기능적 단편 또는 그러한 항체 또는 기능적 단편을 암호화하는 합성 핵산, 적어도 1 X 107개의 항체 또는 이의 기능적 단편 또는 그러한 항체 또는 기능적 단편을 암호화하는 합성 핵산, 적어도 1 X 108개의 항체 또는 이의 기능적 단편 또는 그러한 항체 또는 기능적 단편을 암호화하는 합성 핵산, 적어도 1 X 109개의 항체 또는 이의 기능적 단편 또는 그러한 항체 또는 기능적 단편을 암호화하는 합성 핵산, 적어도 1 X 1010개의 항체 또는 이의 기능적 단편 또는 그러한 항체 또는 기능적 단편을 암호화하는 합성 핵산, 또는 적어도 1 X 1011개의 항체 또는 이의 기능적 단편 또는 그러한 항체 또는 기능적 단편을 암호화하는 합성 핵산을 포함한다.
방법의 일 구현예에서, 집합은 인간 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA, IgE, IgM 및 IgD로 이루어지는 군으로부터 선택된 항체 또는 그러한 항체를 암호화하는 합성 핵산을 포함한다. 방법의 일 구현예에서, 집합은 Fab, F(ab')2, Fab’, Fv 및 scFv로 이루어지는 군으로부터 선택된 항체 단편 또는 그러한 단편을 암호화하는 합성 핵산을 포함한다.
방법의 일 구현예에서, 집합의 항체의 IgG 중쇄 불변 도메인은 도 41a 내지 도 41b(SEQ ID NO: 305)에 도시된 아미노산 서열을 포함한다. 방법의 다른 구현예에서, 집합의 항체의 IgG 중쇄 불변 도메인을 암호화하는 핵산은 도 41a 내지 도 41b(SEQ ID NO: 304)에 도시된 핵산 서열을 포함한다. 구현예에서, 집합의 항체 단편의 Fab 중쇄 불변 도메인은 도 42(SEQ ID NO: 307)에 도시된 아미노산 서열을 포함한다. 방법의 다른 구현예에서, 집합의 항체의 Fab 중쇄 불변 도메인을 암호화하는 핵산은 도 42(SEQ ID NO: 306)에 도시된 핵산 서열을 포함한다. 방법의 구현예에서, 집합의 항체 또는 항체 단편의 IgG(SEQ ID NO: 309) 및/또는 Fab(SEQ ID NO: 311) 카파 경쇄 불변 도메인은 도 43에 도시된 아미노산 서열을 포함한다. 방법의 다른 구현예에서, 집합의 항체 또는 항체 단편의 IgG(SEQ ID NO: 308) 및/또는 Fab(SEQ ID NO: 310) 카파 경쇄 불변 도메인을 암호화하는 핵산은 도 43에 도시된 핵산 서열을 포함한다. 방법의 구현예에서, 집합의 항체 또는 항체 단편의 IgG(SEQ ID NO: 313) 및/또는 Fab(SEQ ID NO: 315) 람다 경쇄 불변 도메인은 도 44에 도시된 아미노산 서열을 포함한다. 방법의 다른 구현예에서, 집합의 항체 또는 항체 단편의 IgG(SEQ ID NO: 312) 및/또는 Fab(SEQ ID NO: 314) 람다 경쇄 불변 도메인을 암호화하는 핵산은 도 44에 도시된 핵산 서열을 포함한다.
본 발명의 항체
또 다른 양태에서, 본원은 합성 항체 또는 이의 기능적 단편 또는 그러한 항체 또는 기능적 단편을 암호화하는 합성 핵산을 제공하며, 이때 항체 또는 기능적 단편은 가변 중쇄 및 가변 경쇄 쌍을 포함하며, 이때 가변 중쇄 및 가변 경쇄 쌍의 기본틀 영역은 가변 중쇄 및 가변 경쇄 쌍 VH1-18 (SEQ ID NO: 204)/VK1-39 (SEQ ID NO: 236); VH1-18 (SEQ ID NO: 204)/VK3-15 (SEQ ID NO: 238); VH1-18 (SEQ ID NO: 204)/VK3-20 (SEQ ID NO: 239); VH1-46 (SEQ ID NO: 205)/VK3-15 (SEQ ID NO: 238); VH1-46 (SEQ ID NO: 205)/VL1-51 (SEQ ID NO: 252); VH1-46 (SEQ ID NO: 205)/VL3-21 (SEQ ID NO: 257); VH1-69*01 (SEQ ID NO: 206)/VL1-51 (SEQ ID NO: 252); VH3-07 (SEQ ID NO: 207)/VK1-12 (SEQ ID NO: 233); VH3-07 (SEQ ID NO: 207)/VK1-16 (SEQ ID NO: 234); VH3-07 (SEQ ID NO: 207)/VK1-27 (SEQ ID NO: 235); VH3-07 (SEQ ID NO: 207)/VK1-39 (SEQ ID NO: 236); VH3-07 (SEQ ID NO: 207)/VK3-15 (SEQ ID NO: 238); VH3-07 (SEQ ID NO: 207)/VL1-47 (SEQ ID NO: 251); VH3-07 (SEQ ID NO: 207)/VL1-51 (SEQ ID NO: 252); VH3-11 (SEQ ID NO: 208)/VK1-05 (SEQ ID NO: 230); VH3-11 (SEQ ID NO: 208)/VK1-39 (SEQ ID NO: 236); VH3-11 (SEQ ID NO: 208)/VK3-15 (SEQ ID NO: 238); VH3-11 (SEQ ID NO: 208)/VL1-40 (SEQ ID NO: 250); VH3-11 (SEQ ID NO: 208)/VL1-47 (SEQ ID NO: 251); VH3-11 (SEQ ID NO: 208)/VL1-51 (SEQ ID NO: 252); VH3-11 (SEQ ID NO: 208)/VL2-23 (SEQ ID NO: 255); VH3-15 (SEQ ID NO: 209)/VK1-05 (SEQ ID NO: 230); VH3-15 (SEQ ID NO: 209)/VK1-06 (SEQ ID NO: 231); VH3-15 (SEQ ID NO: 209)/VK1-12 (SEQ ID NO: 233); VH3-15 (SEQ ID NO: 209)/VK1-16 (SEQ ID NO: 234); VH3-15 (SEQ ID NO: 209)/VK1-27 (SEQ ID NO: 235); VH3-15 (SEQ ID NO: 209)/VK3-11 (SEQ ID NO: 237); VH3-15 (SEQ ID NO: 209)/VL1-40 (SEQ ID NO: 250); VH3-15 (SEQ ID NO: 209)/VL1-47 (SEQ ID NO: 251); VH3-15 (SEQ ID NO: 209)/VL1-51 (SEQ ID NO: 252); VH3-15 (SEQ ID NO: 209)/VL2-14 (SEQ ID NO: 254); VH3-21 (SEQ ID NO: 210)/VK1-12 (SEQ ID NO: 233); VH3-21 (SEQ ID NO: 210)/VK1-27 (SEQ ID NO: 235); VH3-21 (SEQ ID NO: 210)/VL2-11 (SEQ ID NO: 253); VH3-23 (SEQ ID NO: 211)/VK1-39 (SEQ ID NO: 236); VH3-23 (SEQ ID NO: 211)/VK3-15 (SEQ ID NO: 238); VH3-23 (SEQ ID NO: 211)/VL2-23 (SEQ ID NO: 255); VH3-23 (SEQ ID NO: 211)/VL3-1 (SEQ ID NO: 256); VH3-30 (SEQ ID NO: 212)/VK3-20 (SEQ ID NO: 239); VH3-53 (SEQ ID NO: 213)/VK3-15 (SEQ ID NO: 238); VH3-53 (SEQ ID NO: 213)/VL2-11 (SEQ ID NO: 253); VH3-74 (SEQ ID NO: 214)/VK1-05 (SEQ ID NO: 230); VH3-74 (SEQ ID NO: 214)/VK1-06 (SEQ ID NO: 231); VH3-74 (SEQ ID NO: 214)/VK1-12 (SEQ ID NO: 233); VH3-74 (SEQ ID NO: 214)/VK1-27 (SEQ ID NO: 235); VH3-74 (SEQ ID NO: 214)/VK3-20 (SEQ ID NO: 239); VH3-74 (SEQ ID NO: 214)/VL1-51 (SEQ ID NO: 252); VH5-51 (SEQ ID NO: 215)/VK1-39 (SEQ ID NO: 236); VH5-51 (SEQ ID NO: 215)/VL1-40 (SEQ ID NO: 250); VH5-51 (SEQ ID NO: 215)/VL1-51 (SEQ ID NO: 252); VH6-1 (SEQ ID NO: 216)/VK1-09 (SEQ ID NO: 232); VH6-1 (SEQ ID NO: 216)/VK3-15 (SEQ ID NO: 238); VH6-1 (SEQ ID NO: 216)/VK3-20 (SEQ ID NO: 239) 및 VH6-1 (SEQ ID NO: 216)/VL1-51 (SEQ ID NO: 252)으로부터 선택된 생식세포 단백질 서열을 포함한다.
일 구현예에서, 합성 항체 또는 이의 기능적 단편 또는 그러한 항체 또는 기능적 단편을 암호화하는 합성 핵산은 각각의 가변 중쇄 및 가변 경쇄 쌍으로부터 생식세포 단백질 서열을 포함하는 하나 이상의 상보성 결정 영역을 포함하며, 이때 가변 중쇄 및 가변 경쇄의 상보성 결정 영역의 아미노산 서열은 도 25 내지 도 33에 도시되어 있다. 더욱 구체적으로는, 일 구현예에서, 합성 항체 또는 이의 기능적 단편 또는 그러한 항체 또는 기능적 단편을 암호화하는 합성 핵산은, 각각의 가변 중쇄 및/또는 가변 경쇄 쌍으로부터 생식세포 단백질 서열을 포함하는 CDR1 영역을 포함하며, 이때 가변 중쇄 및 가변 경쇄의 CDR1 영역의 아미노산 서열은 도 25, 도 28 및 도 31, 그리고 상응하는 SEQ ID NO: 204~265에 도시되어 있다. 일 구현예에서, 합성 항체 또는 이의 기능적 단편 또는 그러한 항체 또는 기능적 단편을 암호화하는 합성 핵산은, 각각의 가변 중쇄 및 가변 경쇄 쌍으로부터 생식세포 단백질 서열을 포함하는 HCDR1 영역을 포함하며, 이때 가변 중쇄 및 가변 경쇄의 HCDR1 영역의 아미노산 서열은 도 25 및 상응하는 SEQ ID NO: 204~229에 도시되어 있다. 일 구현예에서, 합성 항체 또는 이의 기능적 단편 또는 그러한 항체 또는 기능적 단편을 암호화하는 합성 핵산은, 각각의 가변 중쇄 및 가변 경쇄 쌍으로부터 생식세포 단백질 서열을 포함하는 LCDR1 영역을 포함하며, 이때 가변 중쇄 및 가변 경쇄의 LCDR1 영역의 아미노산 서열은 도 28과 도 31 및 상응하는 SEQ ID NO: 230~265에 도시되어 있다. 추가적인 구현예에서, 합성 항체 또는 이의 기능적 단편 또는 그러한 항체 또는 기능적 단편을 암호화하는 합성 핵산은, 각각의 가변 중쇄 및 가변 경쇄 쌍으로부터 생식세포 단백질 서열을 포함하는 CDR2 영역을 포함하며, 이때 가변 중쇄 및 가변 경쇄의 CDR2 영역의 아미노산 서열은 도 26, 도 29 및 도 32, 그리고 상응하는 SEQ ID NO: 204~265에 도시되어 있다. 추가적인 구현예에서, 합성 항체 또는 이의 기능적 단편 또는 그러한 항체 또는 기능적 단편을 암호화하는 합성 핵산은, 각각의 가변 중쇄 및 가변 경쇄 쌍으로부터 생식세포 단백질 서열을 포함하는 HCDR2 영역을 포함하며, 이때 가변 중쇄 및 가변 경쇄의 HCDR2 영역의 아미노산 서열은 도 26 및 상응하는 SEQ ID NO: 204~229에 도시되어 있다. 추가적인 구현예에서, 합성 항체 또는 이의 기능적 단편 또는 그러한 항체 또는 기능적 단편을 암호화하는 합성 핵산은, 각각의 가변 중쇄 및 가변 경쇄 쌍으로부터 생식세포 단백질 서열을 포함하는 LCDR2 영역을 포함하며, 이때 가변 중쇄 및 가변 경쇄의 LCDR2 영역의 아미노산 서열은 도 29 및 도 32, 그리고 상응하는 SEQ ID NO: 230~265에 도시되어 있다.
본원의 일 양태는 잠재적인 번역 후 변형 부위(PTM)를 제거하기 위하여 생식세포 상보성 결정 영역을 변형하는 것을 포함한다. PTM을 제거하고자 변형된 가변 중쇄 상보성 결정 영역의 예는 도 34 내지 도 36에 도시되어 있다. 일 양태에서, 합성 항체 또는 이의 기능적 단편 또는 그러한 항체 또는 기능적 단편을 암호화하는 합성 핵산은, 잠재적 번역 후 변형 부위를 제거하는 아미노산 변형을 포함하는 하나 이상의 상보성 결정 영역을 포함한다. 일 구현예에서, 합성 항체 또는 이의 기능적 단편 또는 그러한 항체 또는 기능적 단편을 암호화하는 합성 핵산은, 상보성 결정 영역 서열 또는 각각의 가변 중쇄로부터 도 34 내지 도 36에 도시된 것과 동일한 것을 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 하나 이상의 상보성 결정 영역을 포함한다. 추가적인 구현예에서, 합성 항체 또는 이의 기능적 단편 또는 그러한 항체 또는 기능적 단편을 암호화하는 합성 핵산은, HCDR1 또는 각각의 가변 중쇄로부터 도 34 내지 도 36에 도시된 것과 동일한 것을 암호화하는 핵산을 포함하는 HCDR1 영역을 포함한다. 낮은 PTM HCDR1의 아미노산 서열은 SEQ ID NO: 266~278에 도시되어 있다. 낮은 PTM HCDR1의 핵산 서열은 SEQ ID NO: 279~291에 도시되어 있다. 추가적인 구현예에서, 합성 항체 또는 이의 기능적 단편 또는 그러한 항체 또는 기능적 단편을 암호화하는 합성 핵산은, HCDR2 영역 또는 각각의 가변 중쇄로부터 도 34 내지 도 36에 도시된 것과 동일한 것을 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 HCDR2 영역을 포함한다. 낮은 PTM HCDR2의 아미노산 서열은 SEQ ID NO: 266~278에 도시되어 있다. 낮은 PTM HCDR2의 핵산 서열은 SEQ ID NO: 279~291에 도시되어 있다.
본원의 일 양태는 생식세포 FR4 서열을 활용하는 것을 포함한다. 일 구현예에서, 합성 항체 또는 이의 기능적 단편 또는 그러한 항체 또는 기능적 단편을 암호화하는 합성 핵산은, JH4 (SEQ ID NO:293), Jκ1 (SEQ ID NO:297) 및 Jλ2/3 (SEQ ID NO:301)로 이루어진 군으로부터 선택된 FR4 영역을 포함한다. 일 구현예에서, 합성 항체 또는 이의 기능적 단편 또는 그러한 항체 또는 기능적 단편을 암호화하는 합성 핵산은, 생식세포 JH4 FR4 영역을 포함하며, 그 아미노산 또는 핵산 서열은 도 40에 도시되어 있다. JH4 FR4 아미노산 서열은 (SEQ ID NO:293) 및 (SEQ ID NO:295)에 도시되어 있다. JH4 FR4 핵산 서열은 (SEQ ID NO:292) 및 (SEQ ID NO:294)에 도시되어 있다. 일 구현예에서, 합성 항체 또는 이의 기능적 단편 또는 그러한 항체 또는 기능적 단편을 암호화하는 합성 핵산은, 생식세포 Jk1 FR4 영역을 포함하며, 그 아미노산 또는 핵산 서열은 도 40에 도시되어 있다. Jk1 FR4 아미노산 서열은 (SEQ ID NO:297)에 도시되어 있다. Jk1 FR4 핵산 서열은 (SEQ ID NO:296), (SEQ ID NO:298) 및 (SEQ ID NO:299)에 도시되어 있다. 일 구현예에서, 합성 항체 또는 이의 기능적 단편 또는 그러한 항체 또는 기능적 단편을 암호화하는 합성 핵산은, 생식세포 Jλ2/3 FR4 영역을 포함하며, 그 아미노산 또는 핵산 서열은 도 40에 도시되어 있다. Jλ2/3 FR4 아미노산 서열은 (SEQ ID NO:301)에 도시되어 있다. Jλ2/3 FR4 핵산 서열은 (SEQ ID NO:300), (SEQ ID NO:302) 및 (SEQ ID NO:303)에 도시되어 있다.
일 구현예에서, 합성 항체 또는 그러한 항체를 암호화하는 합성 핵산은 인간 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA, IgE, IgM 및 IgD로 이루어지는 군으로부터 선택된다. 일 구현예에서, 합성 항체 단편 또는 그러한 항체 단편을 암호화하는 합성 핵산은 Fab, F(ab')2, Fab’, Fv 및 scFv로 이루어지는 군으로부터 선택된다.
일 구현예에서, 항체의 IgG 중쇄 불변 도메인은 도 41a 내지 도 41b(SEQ ID NO: 305)에 도시된 아미노산 서열을 포함한다. 다른 구현예에서, 항체의 IgG 중쇄 불변 도메인을 암호화하는 핵산은 도 41a 내지 도 41b(SEQ ID NO: 304)에 도시된 핵산 서열을 포함한다. 구현예에서, 항체 단편의 Fab 중쇄 불변 도메인은 도 42(SEQ ID NO: 307)에 도시된 아미노산 서열을 포함한다. 다른 구현예에서, 항체 단편의 Fab 중쇄 불변 도메인을 암호화하는 핵산은 도 42(SEQ ID NO: 306)에 도시된 핵산 서열을 포함한다. 구현예에서, 항체 또는 항체 단편의 IgG(SEQ ID NO: 309) 및/또는 Fab(SEQ ID NO: 311) 카파 경쇄 불변 도메인은 도 43에 도시된 아미노산 서열을 포함한다. 다른 구현예에서, 항체 또는 항체 단편의 IgG(SEQ ID NO: 308) 및/또는 Fab(SEQ ID NO: 310) 카파 경쇄 불변 도메인을 암호화하는 핵산은 도 43에 도시된 핵산 서열을 포함한다. 구현예에서, 항체 또는 항체 단편의 IgG(SEQ ID NO: 313) 및/또는 Fab(SEQ ID NO: 315) 람다 경쇄 불변 도메인은 도 44에 도시된 아미노산 서열을 포함한다. 다른 구현예에서, 항체 또는 항체 단편의 IgG(SEQ ID NO: 312) 및/또는 Fab(SEQ ID NO: 314) 람다 경쇄 불변 도메인을 암호화하는 핵산은 도 44에 도시된 핵산 서열을 포함한다.
실시예
실시예
1: 원핵생물 신호 서열 및 인간 선도 서열의 C 말단에 제한부위를 생성하여 완전한 생식세포 계열의
FR1
영역 제공
일 양태에서, 본원은 생식세포 단백질 서열, 구체적으로는 FR1을 포함하는 기본틀 영역을 포함하는 항체 또는 이의 단편의 집합을 기술한다. 생식세포 서열의 보유는 인간에 투여 시 항체의 면역원성 위험도를 낮출 것으로 예상된다. 그러나, 항체의 집합을 암호화하는 핵산을 디스플레이 및/또는 발현 벡터 내로 표준 클로닝 할 수 있도록 하여, 면역원에 대한 항체가 스크리닝될 수 있도록 하기 위해서는 적합한 제한 부위를 이용해야 한다. 과거에는, 클로닝에 이용된 제한 부위가 흔히 기본틀 영역 내에 종종 위치되어서, 생식세포에 없는 핵산 및/또는 아미노산 서열을 변형했다. 본원의 각 항체에서 적어도 기본틀 1(FR1) 영역은 생식세포 단백질 서열을 유지하도록 하기 위하여, 생식세포 아미노산 서열로부터 벗어나게 하는 임의의 제한 부위가 FR1 내에는 없어야 한다. 그러므로, 본원의 일 양태는 원핵생물 신호 서열 및 인간의 선도 서열의 C 말단 내에, 구체적으로는 3개의 C 말단 잔기 내에, 동일하거나 적어도 적합한 제한 부위를 도입하는 것이다. 부가적으로, 동일하거나 적합한 제한 부위를 포함하는 원핵생물 신호 서열 및 인간 선도 서열은 원핵생물 및 포유류 발현 시스템 모두에서 기능적이어야 하고, 항체 또는 이의 단편이 우수한 디스플레이 및 발현 수율을 나타낼 수 있게 하여야 한다.
도 1은 선택된 제한 부위와 그것들의 상응하는 위치를 나타낸다. NheI (VLA) 제한 부위는 원핵생물 중쇄 신호 서열(phoA)로의 도입을 위해 선택하였다. 야생형 phoA 신호 서열 및 NheI (VLA) phoA 신호 서열의 핵산 및 아미노산 서열을 표 1에 나타내었다.
표 1:
야생형 대장균 phoA 신호 서열 (-3번에서 -1번 위치까지 C 말단 아미노산 서열은 제한 부위가 없는 TKA이다):
M K Q S T I A L A L L P L L F T P V T K A
ATGAAACAGAGCACCATTGCCCTGGCCCTGCTGCCGCTGCTGTTTACCCCAGTGACCAAAGCC
(각각 출현 순으로 SEQ ID NO: 8 및 SEQ ID NO: 7)
PhoA 야생형 C 말단 T K A
ACC AAA GCC
C 말단 VLA 및 NheI 제한 부위(= GCTAGC)가 있는, 변형된 대장균 phoA 신호 서열:
M K Q S T I A L A L L P L L F T P V V L A
ATGAAACAGAGCACCATTGCCCTGGCCCTGCTGCCGCTGCTGTTTACCCCAGTGGT GCTAGC C
(각각 출현 순으로 SEQ ID NO: 10과 SEQ ID NO: 9)
NdeI (AYA) 제한 부위는 원핵생물 카파 및 람다 신호 서열(ompA)로의 도입을 위해 선택하였다. 야생형 ompA 신호서열 및 변형된 NdeI (AYA) ompA 신호 서열의 핵산 및 아미노산 서열을 표 2에 나타내었다.
표 2:
야생형 대장균 ompA 신호 서열 (-3번에서 -1번 위치까지 C 말단 아미노산 서열은 제한 부위가 없는 AQA이다):
M K K T A I A I A V A L A G F A T V A Q A
ATGAAAAAAACCGCCATTGCCATTGCCGTGGCCCTGGCAGGCTTTGCCACCGTGGCGCAGGCC
(각각 출현 순으로 SEQ ID NO: 12 및 SEQ ID NO: 11)
OmpA 야생형 C 말단 A Q A
GCG CAG GCC
C 말단 AYA 및 NdeI 제한 부위(= CATATG)가 있는, 변형된 대장균 ompA 신호 서열:
M K K T A I A I A V A L A G F A T V A Y A
ATGAAAAAAACCGCCATTGCCATTGCCGTGGCCCTGGCAGGCTTTGCCACCGTGG CATATG CC
대안적으로 DNA 서열은 다음을 포함한다:
ATGAAAAAAACCGCCATTGCCATTGCCGTGGCCCTGGCAGGCTTTGCCACCGTGG CATATG CG
(각각 출현 순으로 SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 13 및 SEQ ID NO: 15)
대장균 발현 Fab 포맷으로부터 포유류 발현 IgG 포맷으로 용이하게 전환되도록 하기 위하여, IgG 경쇄(인간 카파 선도) 및 IgG 중쇄(인간 중쇄 선도)에 대한 인간 선도 서열을 ompA(NdeI (AYA)) 및 phoA (NdeI (VLA)) 신호 서열의 C 말단과 동일한 제한 부위를 함유하도록 생성하였다. 야생형 및 변형된 인간 중쇄 선도 및 인간 카파 선도 서열을 표 3에 나타내었다.
표 3
중쇄
선도
A)
야생형 인간 중쇄 선도 (-3번에서 -1번 위치까지 C 말단 아미노산 서열은 제한 부위가 없는 VLS이다):
M K H L W F F L L L V A A P R W V L S
ATGAAACACCTGTGGTTCTTCCTCCTGCTGGTGGCAGCTCCCAGATGGGTCCTGTCC
(각각 출현 순으로 SEQ ID NO: 17 및 SEQ ID NO: 16)
야생형 중쇄 선도 C 말단 V L S
GTC CTG TCC
B)
C 말단 VLA 및 NheI 제한 부위(= GCTAGC)가 있는, 변형된 인간 중쇄 선도:
M K H L W F F L L L V A A P R W V L A
ATGAAGCACCTGTGGTTCTTTCTGCTGCTGGTGGCCGCTCCCCGGTGGGT GCTAGC C
(각각 출현 순으로 SEQ ID NO: 19 및 SEQ ID NO: 18)
C)
야생형 인간 카파 선도 (-3번에서 -1번 위치까지 C 말단 아미노산 서열은 제한 부위가 없는 AYG이다):
M V L Q T Q V F I S L L L W I S G A Y G
ATGGTGTTGCAGACCCAGGTCTTCATTTCTCTGTTGCTCTGGATCTCTGGTGCCTACGGG
(각각 출현 순으로 SEQ ID NO: 21 및 SEQ ID NO: 20)
카파 선도 C 말단 A Y G
GCC TAC GGG
D)
C 말단 AYA 및 NdeI 제한 부위(= CATATG)가 있는 변형된 인간 카파 선도:
M V L Q T Q V F I S L L L W I S G A Y A
ATGGTGCTCCAGACCCAGGTGTTCATCAGCCTGCTGCTGTGGATCAGCGGCG CATATG CG
(각각 출현 순으로 SEQ ID NO: 23 및 SEQ ID NO: 22)
선택된 변형 원핵생물 신호 서열 및 인간 선도 서열은 (a) 이용된 벡터 시스템에 따라 Fab와 IgG 단백질의 높은 수율을 가져오고, (b) 원핵생물 및 포유류 시스템 사이에서 항체 포맷, 벡터 및 발현 시스템을 전환하는 데 있어 완전한 적합성을 제공하며, (c) 신호/선도 서열 내에 위치하여, FR1의 완전한 생식세포 서열을 유지한다.
실시예
2: 인간 레퍼토리에서 가장 풍부한
VH
/
VL
쌍 확인
가장 일반적인 의미에서, 본 발명자들은 본질적인 방식으로 인간 면역 시스템을 모방하는 항체 집합이 유리할 수 있다는 발상에서 출발하였다. 본 발명자들은 인간 면역 레퍼토리에 풍부하게 발현되는 가변 중쇄 및 가변 경쇄 생식세포 유전자 쌍이 더 효율적인 임상 개발을 가져오며 환자에 있어서 그 결과로 얻어지는 항체의 안전성 및 효능을 증가시킬 유리한 생물 물리학적 성질을 나타낼 가능성이 높다는 가설로부터 연구를 하였다. 이러한 가설을 증명하기 위하여, 첫 번째 단계는 인간 면역 레퍼토리에서 두드러지게 발현된 가변 중쇄 및 가변 경쇄 생식세포 유전자 쌍을 확인하는 단계였다.
실시예
2.1:
VH
/
VL
쌍 생식세포 유전자 이용 확인
인간 면역 레퍼토리에서 두드러지게 발현된 VH/VL 생식세포 유전자 쌍을 확인하기 위하여, 공개적으로 입수 가능한 데이터를 분석하고 인간 B 세포를 표본 추출하였다. 첫 번째 단계로, 공개적으로 입수 가능한 데이터를 검토하여 인간 B 세포로부터 분리된 VH/VL 생식세포 유전자 쌍을 기술하고 있는 기사를 확인하였다. 언급한 바와 같이, 여러 공개적으로 입수 가능한 데이터베이스가 항체 서열을 제공하지만, 대부분은 가변 도메인 VH 또는 VL 중 어느 하나의 서열만을 제공하고, VH/VL 생식세포 유전자 쌍을 연결한 것을 거의 제공하지 않는다. 다음과 같은 기사가 확인되었고, 상세히 분석되었다: Wardemann H. 등 (2003) Science 301, 1374-1377 및 임의의 뒷받침하는 표; Yurasov S. 등 (2005) J. Exp. Med. 201, 703-712 및 임의의 뒷받침하는 표; Tsuiji M. 등 (2006) J. Exp. Med. 203, 393-401 및 임의의 뒷받침하는 표; Yurasov S. 등 (2006) J. Exp. Med. 203, 2255-2262 및 임의의 뒷받침하는 표; Tiller T. 등 (2007) Immunity 26, 205-213 및 임의의 뒷받침하는 표; 및 Mietzner B. 등 (2008) PNAS 105, 9727-9732 및 임의의 뒷받침하는 표. 이들 전부는 전체가 참조로 통합된다. 추가적인 VH/VL 쌍 데이터는 아래에서 기술하는 바와 같이, 인간 B 세포 시료로부터 확인되었다.
실시예
2.2: 인간 시료로부터
VH
/
VL
쌍 유전자 이용 확인
추가적인 VH/VL 생식세포 유전자 쌍 이용 데이터를 얻기 위하여, PBMC를 인간 숙주로부터 분리하였다. PBMC를 분류하고, B 세포의 cDNA를 PCR을 이용하여 증폭시켰으며, B 세포로부터의 DNA를 시퀀싱한 다음, 서열을 IgBLAST(NCBI)로 블라스트(blast)하여 각각의 B세포로부터 VH/VL 생식세포 유전자 쌍을 확인하였다.
정맥혈로부터 인간 PBMC를, 골수로부터 단핵 세포를 분리하고 분류하는 일반적인 방법은 Tiller 등, J Immunol Methods, 2008 Jan 1;329(1-2):112-24에 기술되어 있으며, 이는 전체가 참조로 통합된다. PBMC를 분리한 다음, 관심 있는 표현형의 세포 표면 표지에 따라 단일 분류하였다. 그런 다음, VH/VL 생식세포 유전자 쌍 확인을 위해 단일 분류된 성숙한 비감작(mature naive, mn) B 세포와 항체 분비 세포(asc)의 Ig 유전자 전사물을 PCR 증폭시켰다. B 세포의 cDNA와 동일한 목적에 유용한 프라이머를 PCR 증폭시키는 일반적인 방법은 Tiller 등 2008 (위에서 인용)에서도 기술되어 있다. 이용된 구체적인 프라이머는 표 4에 나타내었다.
표 4 (각각 출현 순으로
SEQ
ID
NO
: 24~60):
μ 또는 γ 중쇄 PCR:
단일 분류된 성숙한 비감작(mn) B 세포 및 항체 분비 세포(asc)의 cDNA를 합성하였다. 네스티드 PCR을 수행하였으며, 여기서 인간 IgH, Igk 및 IgL V 유전자 전사물을 독립적으로 PCR 증폭시켰다. 시퀀싱 결과를 IgBLAST(NCBI)로 블라스트하여, 각각의 VH, VK 및 VL 생식세포 유전자를 확인하였다.
실시예
2.3 인간 면역 레퍼토리에서 확인된
VH
/
VL
생식세포 유전자 쌍
실시예 2.1에 기술한 바와 같이 공개적으로 입수 가능한 문헌으로부터 확인된 VH/VL 생식세포 유전자 쌍 데이터를 실시예 2.2에 기술한 바와 같은 인간 시료로부터 확인된 데이터와 함께 모았다. 모은 데이터를 분석하여, 표 6의 순위 즉, 인간 면역 레퍼토리에서 확인된 VH/VL 생식세포 유전자 쌍의 퍼센트/비율(%)의 순위로 나타내었다.
실시예
3:
VH
및
VL
생식세포 유전자 이용 확인
표 6의 검토 결과, 생식세포 유전자의 전체 수와 비교하여, 소수의 VH/VL 쌍이 인간 면역 레퍼토리에 우세한 것으로 나타났다. Wildt 등이 895~896페이지에서 이러한 현상을 기술하였다. Wildt 등은 또한 빈번하게 발현되는 중쇄 및 경쇄 유전자 분절이 종종 쌍을 이룬다는 점을 기술하였으며, 표본 추출된 쌍의 절반이 겨우 다섯 개의 VH/VL 생식세포 유전자 쌍에 대응된다는 점을 관찰했다.
추가적으로, 모은 데이터와 추가적인 참고문헌을 평가하여 인간 면역 레퍼토리에 독립적으로 발현된(쌍으로 발현되지 않은) VH, Vκ 및 Vλ 생식세포 유전자를 확인하였다. 쌍을 이루지 않은 VH 및/또는 VL 생식세포 유전자 발현을 포함하는, 추가적인 참고문헌은 Brezinschek H.P. 등 (1997) J. Clin. Invest. 99, 2488, Demaison C. 등 (1995) Immunogenetics 42, 342, 및 Foster S.J. 등 (1997) J. Clin. Invest. 99, 1614으로, 이는 전체가 참조로 통합된다. 실시예 2.1과 실시예 2.2, 그리고 추가적인 참고문헌의 데이터를 모으고 순위를 매겨, 인간 면역 레퍼토리에 가장 현저하게 발현된 VH, Vκ 및 Vλ 생식세포 유전자를 결정하였다. 순위를 표 5에 도시하였다.
인간 면역 레퍼토리에서의 연결되지 않은 VH, Vλ 및 Vκ 생식세포 유전자 출현율을 나타내는 표 5와 인간 면역 레퍼토리 내의 연결된 VH/VL 쌍 생식세포 유전자 출현율을 나타내는 표 6을 비교하자, 연결 또는 쌍과는 관계 없이 평가할 때 높게 나타난 VH, Vλ 및 Vκ 생식세포 유전자 대부분이 VH/VL 쌍에서도 높게 나타남이 명백했다.
이러한 관찰 내용은 도 4 내지 도 5에 도시된, 인간 면역 레퍼토리의 VH/VL 생식세포 유전자 쌍을 나타내는 도표에 의해 확인된다. 도면은 모은 데이터로부터 확인하여, 행렬 상에 도표화한, VH/VL 생식세포 유전자 쌍 각각의 실제 갯수를 보여주며, 여기서 Y 축은 VH 생식세포 유전자의 순위를 포함하고, X 축은 VL 생식세포 유전자의 순위를 포함한다.
실시예
4: 추가적인 생물 물리학적 특성 평가를 위한
VH
/
VL
생식세포 유전자 쌍 선별
다음 단계로, 인간 면역 레퍼토리에는 약 2500쌍이 존재하므로, 어떠한 생식세포 단백질 쌍을 시험할 것인지를 결정해야 했고, 본 발명자들의 목표는 생식세포 단백질 쌍 가운데 어느 것이 선별 및 개발에 도움이 되는 유리한 생물 물리학적 특성을 포함하는지를 확인하는 것이었다. 한 가지 방법은 인간 면역 레퍼토리에서 매우 우세하게 발생하는 가변 중쇄 및 가변 경쇄 생식세포 단백질 쌍을 시험하는 것이다. 예를 들어, 표 6 참조. 예를 들어, 시험을 위해 상위 400쌍을 선택하거나, 특정 임계 개수를 초과하여 존재하는 가변 중쇄 및 가변 경쇄의 생식세포 유전자 쌍을 선택할 수 있다. 이러한 접근법을 위해서는 매우 많은 수의 상이한 가변 중쇄 및 가변 경쇄의 생식세포 단백질 쌍 서열을 합성하여 시험할 필요가 있으므로, 이러한 접근법은 매우 효율적이지 않을 수 있다.
대안적인 접근법으로, 본 발명자들은 인간 면역 레퍼토리의 우세한 쌍들 대부분을 대표하거나, 정확하게 재생산하거나, 이들을 아우르는 가변 중쇄 및 가변 경쇄의 생식세포 쌍들의 부분집합을 선별했다. 이러한 접근법은 부분적으로는 적은 수의 가변 중쇄, 가변 κ 경쇄 및 가변 λ 경쇄의 (쌍을 이루지 않은) 생식세포 유전자가 인간 면역 레퍼토리에서 우세하다는 관찰을 기초로 한 것이었다. 따라서, 적은 수의 우세한 중쇄 및 경쇄의 (쌍을 이루지 않은) 생식세포 유전자 중를 인간 면역 레퍼토리를 대표하는 일 군의 VH/VL 쌍을 생성하도록 조합할 수 있다.
이 접근법은 다음과 같은 방식으로 착수되었다. 실시예 3에서, 가변 중쇄, 가변 κ 경쇄 및 가변 λ 경쇄 생식세포 유전자 발현을 확인하였다. 다음 단계로, 현저한 VH, Vλ 및 Vκ 생식세포 유전자의 인실리코 분석을 완료하였으며, 여기서 적어도 다음과 같은 요인들을 평가하였다: CDR 길이, 등전점(pI)(바람직한 등전점은 7.5 이상이며, 이는 표준 pH 5.5 내지 pH 7의 제형 완충액에서 안정성을 제공하기 위함이다), 잠재적인 번역 후 변형 부위(PTM’s)(구체적으로, N-결합된 글리코실화 부위(NxS 또는 NxT) 또는 Asp 절단(흔히 DP 또는 DQ에서 발생), Asp 이성질화(DS, DG), 생체 내(혈청 내)에서 발생할 수 있거나 제형 완충액에 저장 시, 항체 결합 손실을 초래할 수 있는 탈아미노화(NS, NG)와 같은 화학적 변형), CDR에서 메티오닌의 존재(용매에 노출될 때, 산화하기 쉬움), 쌍을 이루지 않은 시스테인의 존재(임의의 다른, 쌍을 이루지 않은 시스테인과 이황화 결합을 형성하여, 단백질의 가교결합 및/또는 낮은 발현 수준을 초래함), 생식세포로부터의 편차, 가능성 있는 T 세포 에피토프의 존재 및 이론적 응집 경향. 인실리코 분석으로부터 선택된 데이터를 도 2 내지 도 3에 도시하였다.
가장 현저한 VH, Vλ 및 Vκ 생식세포 유전자의 인실리코 분석을 기초로 하여, 이들의 부분집합을 합성, 조합 및 이후의 기능성 시험을 위하여 선별하였다. 이 부분집합을 도 2 내지 도 3에 도시하였다. 표 5와 도 2 내지 도 3을 비교할 때, 가장 두드러진 VH, Vλ 및 Vκ 생식세포 유전자 전부가 추가적인 시험을 위해 선택되지 않았음이 명백하다. 표 5에 나타낸 가장 두드러진 VH 생식세포 유전자 가운데, IGHV4-34, IGHV4-59 및 IGHV3-9는 선택하지 않았다. 대신, 도 2 내지 도 3에 도시된 바와 같이, IGHV3-74, IGHV3-73, 및 IGHV6-1을 선택하였다. 총 20개의 VH 생식세포 유전자가 선택되었다. 표 5에 도시된, 가장 두드러진 Vκ 생식세포 유전자 가운데, IGKV4-1, IGKV2-28/2D-28, IGKV1-33/1D-33 및 IGKV1-8는 선택하지 않았다. 총 12개의 Vκ 생식세포 유전자가 선택되었다. 표 5에 도시된, 가장 두드러진 Vλ 생식세포 유전자 가운데, IGLV1-44는 선택하지 않았다. 총 8개의 Vλ 생식세포 유전자가 선택되었다.
표 5는 인간 면역 레퍼토리로부터의 VH, Vκ 및 Vλ 생식세포 유전자 이용 순위를 보여주며, 추가적인 기능성 시험을 위해 선택된 생식세포 유전자는 굵은 활자체 및 밑줄로 표시하였다.
표 5
실시예
4.1: 인간 면역 레퍼토리에서 가장 두드러진
VH
/
VL
쌍 대표를 얻기 위한, 풍부한
VH
, Vκ 및 Vλ 생식세포 유전자의 재조합
다음 단계로, 20개의 VH, 12개의 Vκ 및 8개의 Vλ의 선택된 VH, Vκ 및 Vλ 생식세포 유전자를 합성하고, 조합하여 400개의 VH/VL 생식세포 유전자 쌍을 생성하도록 하였으며, 이 쌍을 대상으로 이후에 생물 물리학적 특성을 시험하였다. 표 6은 기능성 시험을 위해 생성된 400개의 VH/VL 생식세포 유전자 쌍이 실제로 인간 면역 레퍼토리에서 현저한 VH/VL 생식세포 유전자 쌍의 대다수를 정확하게 재생산하거나 아우른다는 점을 보여준다. 표 6은 인간 면역 레퍼토리에서 발현된 VH/VL 쌍의 순위를 보여주며, 이때 시험한 400개의 VH/VL 쌍은 굵은 활자체와 밑줄을 그어 나타냈다.
표 6: 기능적으로 시험한 400개의
VH
/
VL
생식세포 유전자 쌍은 인간 면역 레퍼토리에서 확인된
VH
/
VL
생식세포 유전자 쌍의 대표이다
“pos”: 모은 총 데이터에서 각각의 VH/VL 쌍 퍼센트(%)로 확인한, VH/VL 쌍의 상대적인 순위를 나타낸다.
N= 2137개 B 세포
실시예
5: 기능 분석을 위한 생식세포 유전자 생성
다음 단계로, 표 5에 도시된 바와 같은, 조합 및 이후의 시험을 위해 선택된 VH, Vλ 및 Vκ 생식세포 유전자를 대장균 발현(희귀한 인간 코돈이 없는, 포유류 발현에 대해 중성), 잠재적인 억제 또는 스플라이스 모티프 제거를 위한 유전자 최적화 및 합성 각각에 대하여 코돈 최적화를 위해 Geneart(레겐스부르크, 독일)로 보냈다.
VH, Vλ 및 Vκ 생식세포 유전자 각각의 생식세포 단백질 서열을 도 6 내지 도 8에 도시하였다. 각각의 생식세포 유전자 서열은 다음과 같이 합성되었다:
a) VH: 선도서열(표 1에 나타낸 바와 같이 NheI 제한 부위를 포함하는 변형된 phoA 신호 서열); 생식세포 FR1, CDR1, FR2, CDR2 및 FR3(도 1에 도시된 바와 같이 BssHII 제한 부위(GCGCGC)를 포함); Ewert S. 등, J. Mol. Biol. (2003) 325, 531-553에서 사용된 바와 같은 4D5 항체 중 CDR-H3(WGGDGFYAMDY)(SEQ ID NO: 1); 및 JH4 FR4(도 1에 도시된 바와 같이 XhoI (CTCGAG) 제한 부위를 포함);
b) Vκ: 선도서열(표 2에 나타낸 바와 같이 NdeI 제한 부위를 포함하는 변형된 ompA 신호 서열); 생식세포 FR1, CDR1, FR2, CDR2 및 FR3(도 1에 도시된 바와 같이 BbsI 제한 부위(GAAGAC)를 포함), Ewert S. 등, J. Mol. Biol. (2003) 325, 531-553에 따른 카파-유사 CDR-L3(QQHYTTPPT)(SEQ ID NO: 2); 및 Jk1 FR4 (도 1에 도시된 바와 같이 KpnI/Acc65I RE 부위(GGTACC)를 포함);
c) Vλ: 선도서열(표 2에 나타낸 바와 같이 NdeI 제한 부위를 포함하는 변형된 ompA 신호 서열); 생식세포 FR1, CDR1, FR2, CDR2 및 FR3(도 1에 도시된 바와 같이 BbsI 제한 부위(GAAGAC)를 포함), Ewert S. 등, J. Mol. Biol. (2003) 325, 531-553에 따른 람다-유사 CDR-L3(QSYDSSLSGVV)(SEQ ID NO: 3); 및 JI2/3 FR4(도 1에 도시된 바와 같이 KpnI/Acc65I RE 부위(GGTACC)를 포함).
실시예
6: 인간 면역 레퍼토리를 대표하는 생식세포 단백질 쌍의 기능성 시험
그런 다음, 400개의 생식세포 단백질 쌍을 Fab 또는 인간 IgG1 포맷 중 어느 하나로, 파지 디스플레이, 대장균 및 포유류 발현 벡터 내로 삽입한 다음, 다음과 같은 특성에 대하여 시험하였다: a) Fab 포맷에서 파지 생산 및 파지 ELISA 후의 상대적인 디스플레이; b) 대장균에서 Fab 생산, 대장균 세포 용해 및 생산된 Fab의 ELISA 검출 후 상대적인 Fab 발현 수율; c) 대장균에서 Fab 생산, 대장균 세포 용해, 증가된 온도에서 배양한 후 비변성 Fab의 ELISA 검출 후 Fab의 온도 안정성; d) 소/마우스 혈청 내 배양 후, 비변성 Fab의 ELISA 검출에 의한 대장균 용해물로부터의 Fab의 소/마우스 혈청 내 안정성; e) 포유류 세포에서의 IgG1 생산 및 세포 배양물 상층액으로부터 분비된 IgG1의 ELISA 검출 후의 상대적인 인간 IgG1 발현 수율; 및 f) 소/마우스 혈청 내 배양 후, 비변성 IgG의 ELISA 검출에 의한 인간 IgG1의 소 혈청 내 안정성.
실시예
6.1: 기능적 특징 분석을 위한 파지 상 디스플레이된
Fab
풀(
pool
)의 생성
표 5에 도시된, 실시예 5에서 합성된 항체 또는 항체 단편은 기능을 시험하기 위하여, 트리시스트로닉 Fab 디스플레이 벡터 pJPd1(도 9) 내에 클로닝하였다. 마스터 유전자 각각의 조합을 함유한 Fab 풀이 생성되었으며, 20개의 VH는 8개의 Vλ 및 12개의 Vκ와 조합되어 표 6에 도시된 400개의 조합을 만들어냈다.
위의 유전자 쌍을 포함하는 파지를 96 웰 플레이트를 이용하여 소규모로 생산하였다. 각 웰을 2xYT/CAM/TET/Gluc 배지로 채우고, 400개의 VH/VL 조합으로부터의 클론을 접종하여 마스터 플레이트를 제조했으며, 여기서 pMORPH30_Vκ3-11_AQA/VH3-23_TKA 또는 pMORPH30_Vκ3-11_AYA/VH3-23_VLA(pMORPH30는 도 12에 도시됨)을 대조군으로 이용하였다. 플레이트를 밤새도록 37℃에서 진탕하며 배양하였다. 마스터 플레이트를 최종 농도 15%의 글리세롤에 저장하였고, -80℃에서 냉동하였다.
추가적인 96웰 플레이트를 파지 생산을 위해, 2xYT/CAM/TET/Gluc를 배지로 이용하여 준비하고, 위에서 기술한 마스터 플레이트로부터의 클론을 접종하였다. 플레이트를 400rpm으로 진탕하면서 약 0.5의 OD600nm가 될 때까지 37℃에서 약 2~4시간 동안 배양하였다.
플레이트를 웰당 5㎕ 보조 파지로 감염시켰다(하이퍼파지; PROGEN; 1 x 1012pfu/mL). 플레이트를 진탕하지 않고 37℃에서 45분간 배양한 다음, 400rpm으로 진탕하면서 60분 동안 배양하였다. 세균을 2200g, 4℃에서 5분 동안 원심분리하였다.
상층액을 함유하는 보조 파지를 제거하였고, 감염된 대장균 펠릿을 글루코오스가 없는 2xYT/Cam/TET/Kan/IPTG로 재현탁시켰다. 재현탁된 펠릿을 2xYT/Cm/TET/Kan/IPTG가 미리 채워진 새로운 96 깊은 웰 플레이트로 옮겼다. 플레이트를 진탕하며 22℃에서 밤새도록 배양하였다. 원심분리하고, 대장균 세포 및 잔유물을 제거하여, 상층액을 함유하는 파지를 채취하였다.
실시예
6.2:
ELISA
를 이용한
Fab
파지 디스플레이 순위 평가
실시예 6.1에 기술한 바와 같이 제조된 파지 상층액을 파지 ELISA에서의 Fab 파지 디스플레이 순위 결정에 이용하였다. 두 가지 상이한 포획 항체를 이용한 파지 ELISA에서 Fab 단편의 디스플레이를 평가하였다:
(1) 주 코팅 단백질 g8p를 통해 파지 입자를 포획하기 위하여, 항-M13 항체(Amersham #27-9420-01)를 사용했으며, 따라서, 파지 역가를 결정할 수 있다.
(2) 항-Fd 항체(결합 부위 #PC075)가 이용되었고, 이는 디스플레이된 Fab에 결합한다. 따라서, 마스터 유전자를 포함하는 파지 디스플레이 Fab만이 포획된다.
항-M13 항체에 대하여 7.5㎍/㎖의 농도로, 그리고 항-Fd 항체에 대하여 1.0㎍/㎖의 농도로, 100㎕ 항체 용액을 각각의 웰에 분주하고, 적층 호일(laminated foil)로 플레이트를 밀봉하고, 4℃에서 밤새 배양하여, 각각의 포획 항체를 블랙 96웰 MaxisorpTM 플레이트 상에 고정시켰다. 다음 날, 플레이트를 TBST로 2회 세척하고, 각 웰을 실온에서 1시간 동안 300㎕의 CTBST로 블로킹하였다.
파지 상층액 및 기준 시료 양자를 다음과 같이 검출을 위해 옮겼다. 블로킹된 ELISA 플레이트를 TBST로 2회 세척하였다. CTBST에 적절히 희석된 파지 상층액 100㎕를 희석 플레이트로부터 코팅된 ELISA 플레이트로 옮겨, 실온에서 1~2시간 배양하고, TBST로 5회 세척하였다. CTBST에 1:5000으로 희석된 100㎕/웰의 항-M13 페록시다아제 콘쥬게이트(Amersham)를 첨가하여, 실온에서 1~2시간 동안 배양하였다. 과산화물 용액 1부분(예컨대, 0.5mL)과 기질 용액 9부분(예컨대, 4.5mL)을 혼합하고, 적어도 30분간 실온까지 평형을 이루게 하여 Quanta Blu(Pierce) 실험 용액(working solution)을 제조했다. ELISA 플레이트를 TBST로 5회 세척하고, 100㎕/웰의 Quanta Blu 실험 용액을 첨가하였다. 약 2분의 배양시간 경과 후, 형광을 측정하였고(여기: 320 nm, 방출: 430nm), 그 후 5분 간격으로 형광을 측정했다.
ELISA 데이터의 평가를 다음과 같이 완료하였다: HuCAL GOLD 기준 파지 제조물(VH3 κ+λ)을 이용하여 검정 곡선을 생성하고, 파지 상층액 및 대조군의 역가를 계산했다. 각각의 시료에 대하여, 항-Fd 상의 역가를 항-M13(항-pVIII) 상의 역가로 나누었으며, 그 결과로 얻어지는 비율이 상대적인 디스플레이 비율이다. 표 12는 400개 생식세포 단백질 쌍 대부분에 대한 상대적인 디스플레이 비율을 보여준다.
실시예 6.3: 대장균 용해물에서 Fab 발현 수율을 확인하기 위한, 400개의 VH/VL 조합의 스크리닝 ELISA
Fab 발현 벡터 pJPx1(도 10에 도시) 내의 VH/VL 조합의 풀로 형질 전환된 클론을 선택하여, 마스터 플레이트(MP)를 웰마다 2YT/Cam/1%Gluc 배지 내로 접종하였다. 이러한 플레이트를 진탕하며 밤새 37℃에서 배양하였다. 발현 플레이트(EP)를 MP로부터의 배양물 2.5㎕로 웰마다 2YT/Cam/0.1%글루코오스 내로 접종하였다. 글리세롤 스톡(glycerol stock)은 대조군(표 8 참조)에 접종하였다. 이러한 플레이트를 37℃에서 6시간 동안 배양하고, 진탕한 후에, IPTG를 첨가하여 Fab 발현을 유도하고, 진탕하며 22℃에서 밤새 배양하였다. 붕산/EDTA/리소자임-완충액을 EP에 첨가(22℃에서 1시간 배양, 진탕)하여 대장균 세포 용해물을 제조하고, 이후에 세균 용해물을 12.5% MPBST로 블로킹하였고, 실온에서 적어도 30분 동안 진탕시켰다. 발현 플레이트로부터의 대장균 용해물을 0.5% MPBS로 적절히 희석하고, 다음과 같은 분석에 이용하였다.
표 7은 이용되었던, 라벨 미부착 코팅 항체 및 AP가 붙어 있는 검출 항체를 나타낸다.
표 7:
표 8은 이용된 대조군을 기술하고 있다.
표 8:
스크리닝 ELISA는 다음과 같은 단계를 포함하였다: PBS로 희석된 항-인간 IgG Fd 특이적 항체로 MaxiSorp 플레이트의 384개 웰을 코팅하고, 4℃에서 밤새 배양하는 단계. 다음 날, 플레이트를 PBST로 2회 세척하고, 각각의 웰에 PBS 중의 5% 밀크파우더를 첨가하여 블로킹하고, 진탕하며 실온에서 1~2시간 배양하였다. 그런 다음, 플레이트를 다시 PBST로 세척하고, 0.5% MPBS로 희석된, 미리 블로킹된 대장균 용해물을 첨가하여, 진탕하며 실온에서 1시간 동안 배양하였다. 또한, 대조군 #3 및 #5를 첨가하였다. 그런 다음, 플레이트를 PBST로 세척하고, AP가 부착된 검출 항체를 0.5% MPBS에 희석시켰다. 희석된 검출 항체를 첨가한 후에, 약하게 진탕하며 실온에서 1시간 동안 배양하였다. 신호를 다음에 의해 확인하였다: TBST로 웰을 세척하는 단계, 20㎕의 AttoPhos(ddH2O에서 1:5로 희석됨)를 첨가하는 단계, 및 Tecan(infiniTe F200), 프로그램 PrimeScreen을 이용하여 5분 및 7~8분에 신호를 읽는 단계.
각각의 VH/VL 쌍의 ELISA 신호를 기준 Fab pMx11_FH VH1-69 VLA_VI1-40 AYA의 ELISA 신호로 나누어서 상대적 Fab 발현 수율을 계산했다. 이에 의하여, 동일하게 높은 ELISA 신호는 1의 상대적 Fab 발현 수율을 나타낸다. 기준 Fab는 a) C 말단 NheI 제한 부위를 포함하는 변형된 phoA 중쇄 신호 서열; b) C 말단 NdeI 제한 부위를 포함하는 변형된 ompA 경쇄 신호 서열; c) 도 6a에 도시된 바와 같은, VH1-69*01 생식세포 유전자의 가변 중쇄 생식세포 단백질 서열; d) 도 8a에 도시된 바와 같은, IGLV1-40 생식세포 유전자의 가변 경쇄 생식세포 단백질 서열; e) hu4D5-8 항체의 CDR-H3(WGGDGFYAMDY)(SEQ ID NO: 1)을 포함하며, 중쇄 FR4에 대하여 JH4 생식세포 단백질 서열; f) CDR-L3 영역(QSYDSSLSGVV)(SEQ ID NO: 3)을 포함하며, 경쇄 FR4에 대하여 Jl2/3 생식세포 단백질 서열을 포함하는, pMORPHX11 플라스미드(도 11에 도시)에서 발현된다. hu4D5-8은 Carter P. 등 (1992) “Humanization of an anti-p185Her2 antibody for human cancer therapy” Proc.Natl. Acad. Sci. USA 89, 4285-4289 및 Ewert S. 등, J. Mol. Biol. (2003) 325, 531-553에 기술되어 있다. 모든 유전자는 Geneart(레겐스부르크, 독일)에서 생성되었다. 결과를 표 12에 나타내었다.
실시예
6.4:
BEL
용해물에서
Fab
의 온도 안정성을 확인하기 위한, 400개의 VH/VL 조합의 스크리닝
ELISA
발현 플레이트를 실시예 6.3에 따라 생성하였다. 발현 플레이트로부터의 희석된 대장균 용해물을 상이한 온도에서 45분 동안 배양하였고, 다음과 같은 분석에 이용하였다. 표 9는 이용했던, 라벨 미부착 코팅 항체 및 AP가 부착된 검출 항체를 나타낸다.
표 9:
스크리닝 ELISA는 다음과 같은 단계를 포함했다: MaxiSorp 플레이트의 384웰을 PBS에 희석시킨 코팅 항체(위의 표 참조)로 코팅하였다. 플레이트를 밤새 4℃에서 배양했다. 다음 날, 플레이트를 PBST로 세척하고, 각각의 웰에 5% MPBS를 첨가하여 블로킹하였고, 진탕하며 실온에서 1~2시간 배양하였다. 다음으로, 발현 플레이트로부터 희석된 대장균 용해물을 네 개의 96웰 PCR 플레이트(각각 약 40㎕) 내에 분배하였고, PCR 순환기(Cycler)에서 45분 동안 다양한 온도(4℃(얼음 위), 60℃, 70℃, 80℃, 이후에 다시 얼음 위)에 노출시켰다. 블로킹된 384웰 플레이트를 PBST로 세척한 후에, 미리 배양시킨 Fab 용해물을 플레이트에 첨가하였다. 다음으로, 플레이트를 진탕하며 실온에서 1시간 동안 배양하였다. 플레이트를 PBST로 세척하고, AP가 부착된 검출 항체를 0.5% MPBS로 희석했다. 20㎕/웰의 희석된 검출 항체를 첨가하여, 약하게 진탕하며 실온에서 1시간 동안 배양하였다. 신호를 다음에 의하여 확인하였다: 웰을 TBST로 세척하는 단계 및 AttoPhos(ddH2O로 1:5 희석됨)를 모든 웰에 첨가하는 단계. Tecan(infiniTe F200), 프로그램 PimeScreen을 이용하여 다양한 시점(5분 내지 10분)에서 신호를 읽었다. 결과를 표 12에 나타내었다.
실시예
6.5: 대장균
용해물에서
Fab
의 혈청 내 안정성을 확인하기 위한, 400개의
VH
/
VL
조합의 스크리닝
ELISA
실시예 6.3과 같이 발현 플레이트를 생성하였다. 대장균 용해물을 함유하는 Fab를 희석하고, 다음과 같은 단계를 이용하여 소 및 마우스 혈청에서 배양하였다: 발현 플레이트로부터의 대장균 용해물을 50% 혈청(총 부피 100㎕)에 희석하고, 세균의 성장을 방지하기 위하여 1:1000 Cam을 첨가한 뒤, 용해물을 2개의 96웰 플레이트에 나눈 뒤, 2개의 플레이트를 모두 냉동시켰다. 첫 번째 플레이트를 해동하고 12~13일 동안 37℃에서 배양하였다. 두 번째 플레이트는 ELISA를 수행할 때까지 -80℃에 저장하였다(37℃에서 0일차 배양).
표 10은 이용되었던, 라벨 미부착 코팅 항체 및 AP 부착 검출 항체를 나타낸다.
표 10:
11일 또는 12일차에, MaxiSorp 플레이트의 384개 웰을 PBS에 희석된 코팅 항체 20㎕로 코팅하였다. 플레이트를 밤새 4℃에서 배양하였다. 다음날에, 플레이트를 PBST로 세척하고, 각각의 웰에 5% MPBS를 첨가하여 블로킹하고, 진탕하며 실온에서 1~2시간 동안 배양하였다. 다음으로, 블로킹된 384웰 플레이트를 PBST로 세척하였다. -80℃ 및 37℃ 시료로부터 혈청 중의 대장균 용해물을 코팅된 ELISA 플레이트로 옮겼고, 진탕하며 실온에서 1시간 동안 배양하였다. 플레이트를 PBST로 세척하고, AP가 부착된 검출 항체를 0.5% MPBS로 희석했다. AP가 부착된 검출 항체를 첨가한 뒤 진탕하며 플레이트를 실온에서 1시간 동안 배양하였다. 신호를 다음에 의하여 확인하였다: 웰을 TBST로 세척하는 단계 및 AttoPhos(ddH2O로 1:5 희석됨)를 모든 웰에 첨가하는 단계. Tecan(infiniTe F200), 프로그램 PimeScreen을 이용하여 다양한 시점(5분 내지 10분)에서 신호를 읽었다. 소 혈청 안정성 시험 결과를 도 19에 나타내었다. 마우스 혈청 안정성 시험 결과는 표 12에 나타내었다.
실시예
7: 생물 물리학적 특성 평가를 위한 인간
IgG1
생성
400개의 IgG1 생식세포 단백질 쌍 생성을 위해, 20개의 가변 영역 중쇄 유전자를 도 13에 도시된 인간 IgG1 발현 벡터 pJP_hIgG1f 내로 서브클로닝 하였다. 동시에, 12개의 가변 영역 κ 유전자를 도 14에 도시된 포유류의 κ 경쇄 발현 벡터 pJP_hIgκ 내로 서브클로닝 하고, 8개의 가변 영역 λ 유전자를 도 15에 도시된 포유류의 λ 경쇄 발현 벡터 pJP_hIgλ2 내로 서브클로닝 하였다.
각각의 공동 형질감염에 의해, 40개의 발현 구조체를 클로닝하는 것만으로도 모든 400개의 VH/VL 쌍에 대한 중쇄 및 경쇄 발현 플라스미드가 별도로 생산될 수 있다. 따라서, HEK.EBNA 세포를 모든 20개의 중쇄 구조체와 모든 20개의 경쇄 발현 구조체로 공동 형질감염시켰다. 형질감염 후 며칠이 경과하여 세포 배양물 상층액으로부터 인간 IgG1을 채취하거나 검출하였다.
실시예
7.1:
IgG1
발현 순위
집합에 포함될 VH/VL 쌍을 선택하는 하나의 기준은 IgG1 포맷에서 400개의 서로 다른 VH/VL 쌍의 발현 수준이다. 인간 IgG1 포맷의 VH/VL 쌍 각각의 발현 수준을 샌드위치 ELISA로 평가했다. 따라서, HEK.EBNA 세포를 인간 IgG1 포맷의 모든 400개의 VH/VL 조합으로 형질감염시키고, 소규모로 발현시켰다. 며칠 뒤 세포 배양물 상층액을 채취하여, IgG 수준을 평가하였다.
다음과 같은 과정을 수행했다. 384웰 MaxiSorpTM 플레이트를 PBS 중의 Fcγ-pan R10Z8E9 마우스 항-인간 IgG으로 2.5㎍/㎖로 코팅하였다. 플레이트를 밤새 4℃에서 배양하였다. 플레이트를 PBST로 세척했다. 플레이트를 PBST 중의 5% BSA 또는 1x Chemiblocker로 블로킹하였고, 진탕하며 실온에서 1시간 동안 배양한 뒤, 다시 PBST로 세척했다. IgG 발현 상층액을 2.5% BSA-PBST로 희석하였고, 희석된 시료를 블로킹한 뒤 세척한 ELISA 플레이트에 첨가하였다. 다음의 대조군을 이용하였다: 빈 상층액 및 저 발현 항체, 중간 발현 항체 및 고 발현 항체가 있는 상층액. 플레이트를 진탕하며 실온에서 2시간 동안 배양하였다. 다음으로, 플레이트를 TBST로 세척했다. 1% BSA-TBST 내에 적절하게 희석된 Fcγ-pan R10Z8E9 마우스 항-인간 IgG 바이오틴 콘쥬게이트를 첨가하였다. 플레이트를 실온에서 1시간 동안 배양했다. 플레이트를 TBST로 세척했다. 0.5% BSA-TBST에 1:2000배 희석된 스트렙트아비딘-AP를 첨가하였고, 플레이트를 진탕하며 실온에서 1시간 동안 배양했다. 플레이트를 TBST로 세척했다. 사용 직전에 TBST에 희석시킨 AttoPhosTM 형광 기질(제조사의 지침에 따라 제조됨)을 첨가하였다. 5분 및 10분 후, 형광을 Tecan 마이크로플레이트 리더를 통해 측정했다.
각각의 VH/VL 쌍의 ELISA 신호를 기준 IgG1 MOR03080의 ELISA 신호(표 11에 도시)로 나누어서 상대적인 IgG1 발현 수율을 계산하였다. 이에 의하여, 동일하게 높은 ELISA 신호는 1의 상대적 IgG1 발현 수준을 가져온다.
표 11
MOR03080의 아미노산 서열은 다음과 같다:
03080 가변 중쇄(CDR을 굵은 활자체로 나타냄):
(1) QVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYGMHWVRQAPGKGLEWVSN
(51) IYSDGSNTFY ADSVKGRFTI SRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARNM
(101) YRWPFHYFFDYWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 61)
03080 가변 경쇄(CDR을 굵은 활자체로 나타냄)
(1) DIELTQPPSV SVAPGQTARI SCSGDNIGNKYVSWYQQKPGQAPVVVIYGD
(51) NNRPSGIPERFSGSNSGNTATLTISGTQAEDEADYYCSSYDSSYFVFGGG
(101) TKLTVLGQ (SEQ ID NO: 62)
결과를 표 12에 나타내었다. Fc 부분의 서열은 도 48, 도 50 및 도 51에 나타내었다.
실시예
7.2:
IgG1
혈청 내 안정성 순위
집합에 포함될 가변 중쇄 및 가변 경쇄 쌍을 선택하는 하나의 기준은 IgG 포맷에서 400개의 서로 다른 가변 중쇄 및 가변 경쇄 쌍의 혈청 내 안정성이다. 14일 동안 50% 마우스 혈청에서 배양하고, 이후에 마우스 항-인간 IgG(CH2) 클론 R10Z8E9로 샌드위치 ELISA를 수행하여 IgG 항체 상층액 각각의 혈청 내 안정성을 평가하였다. 또, 인간 IgG1 포맷의 모든 400개의 VH/VL 조합을 HEK.EBNA 세포 내로 형질감염시켜, 소규모로 발현시켰다. 며칠 뒤, 세포 배양물 상층액을 채취하고, 혈청 안정성에 대하여 상층액 내 IgG를 측정했다.
다음과 같은 과정을 수행했다. 384웰 MaxiSorpTM 플레이트를 PBS 중의 Fcγ-pan R10Z8E9 마우스 항-인간 IgG으로 2.5㎍/㎖로 코팅하였다. 플레이트를 밤새 4℃에서 배양하였다. 플레이트를 PBST로 세척한 다음, 5% BSA-PBST 또는 1x Chemiblocker로 교반하며 실온에서 1시간 동안 블로킹하였다. 플레이트를 PBST로 세척하였다. IgG1을 함유하는 세포 배양물 상층액을 a) 2.5% BSA-PBST에, 그리고 b) 50% 마우스 혈청에 희석하고, 적어도 14일 동안 37℃에서 배양하고, 이들 시료를 블로킹한 뒤 세척한 ELISA 플레이트에 첨가하였다. 다음의 대조군을 이용하였다: 빈 상층액 및 저 발현 항체, 중간 발현 항체 및 고 발현 항체가 있는 상층액. 플레이트를 교반하며 실온에서 2시간 동안 배양하였다. 플레이트를 TBST로 세척했다. 1% BSA-TBST 내에 0.8 ㎍/㎖까지 희석시킨 Fcγ-pan R10Z8E9 마우스 항-인간 IgG 바이오틴 콘쥬게이트를 첨가하였다. 플레이트를 실온에서 1시간 동안 배양했다. 플레이트를 TBST로 세척했다. 0.5% BSA-TBST에 1:2000배 희석된 스트렙트아비딘-AP를 첨가하였다. 플레이트를 교반하며 실온에서 1시간 동안 배양했다. 플레이트를 TBST로 세척했다. 사용 직전에 TBST에 1:5배 희석시킨 AttoPhosTM 형광 기질(제조사의 지침에 따라 제조됨)을 첨가하였다. 5분 및 10분 후, 형광을 Tecan 마이크로플레이트 리더를 통해 측정했다. 결과를 표 12에 나타내었다.
실시예
8: 집합 내 포함을 위한 유리한 생물 물리학적 특성을 나타내는 VH/VL 쌍의 선별
일단, 다음과 같은 특성에 대해 400개의 생식세포 단백질 쌍을 시험하였다: a) Fab 포맷에서 파지 생산 및 파지 ELISA 후의 상대적인 디스플레이; b) 대장균에서 Fab 생산, 대장균 세포 용해 및 생산된 Fab의 ELISA 검출 후 상대적인 Fab 발현 수율; c) 대장균에서 Fab 생산, 대장균 세포 용해, 증가된 온도에서 배양한 후 비변성 Fab의 ELISA 검출 후 Fab의 온도 안정성; d) 소/마우스 혈청 내 배양 후, 비변성 Fab의 ELISA 검출에 의한 대장균 용해물로부터의 Fab의 소/마우스 혈청 내 안정성; e) 포유류 세포에서의 IgG1 생산 및 세포 배양물 상층액으로부터 분비된 IgG1의 ELISA 검출 후의 상대적인 인간 IgG1 발현 수율; 및 f) 소/마우스 혈청 내 배양 후, 비변성 IgG1의 ELISA 검출에 의한 인간 IgG1의 소 혈청 내 안정성. 그 다음 단계는 어떤 VH/VL 생식세포 쌍이 집합 내로 포함될 수 있을지를 선택하는 것이었다. 각 VH/VL 생식세포 단백질 쌍에 대한 기능성 시험 결과를 도 12에 나타내었다.
표 12: 400개의 생식세포 단백질 쌍 각각에 대한 기능성 데이터 모음
표 12 설명:
상대적인 Fab 디스플레이, 상대적인 Fab 발현 및 상대적인 IgG1 발현의 경우, 수치는 대조군과 비교한 수준을 나타낸다. 수가 클수록 수준이 높음을 나타낸다.
Fab 열 안정성의 경우, 숫자 60과 70은 시험 조건에서 60℃ 또는 70℃에서 45분 동안 안정적인 VH/VL 쌍을 나타낸다. 숫자 4는 온도에 불안정한 쌍을 나타내며, bg(배경, background)는 낮은 발현 수준을 나타낸다.
마우스 혈청 내 Fab 안정성, 소 혈청 내 Fab 안정성 및 소 혈청 내 IgG1 안정성의 경우, 시험 조건에서 S는 안정함, U는 불안정함, bg는 배경을 나타낸다.
이전의 실시예들에 기술한 바와 같이, 현저한 VH 및 VL 생식세포 유전자 및 현저한 VH/VL 생식세포 유전자 쌍을 인간 면역 레퍼토리로부터 확인했으며, 그런 다음, 유리한 생물 물리학적 특성을 가지고 있는 가변 중쇄 및 가변 경쇄 생식세포 단백질 서열을 확인하고 선택하기 위하여, 현저한 VH 및 VL 생식세포 단백질 서열을 인실리코에서 분석하였다. 표 5 및 도 2 내지 도 3에 도시된 바와 같이, 합성, 조합 및 이후의 기능성 분석을 위해, 일반적으로 상위 20개의 VH, 상위 8개의 Vλ 및 상위 12개의 Vκ를 선택하였다. 생식세포 유전자 서열을 합성한 다음, 인간 면역 레퍼토리에서 발현된 풍부한 생식세포 유전자 쌍을 대표하는 400개의 생식세포 단백질 쌍을 생성하기 위하여 이들을 조합하였다. 400개의 VH/VL 생식세포 단백질 쌍을 다음과 같은 특성에 대해 시험하였다: a) Fab 포맷에서 파지 생산 및 파지 ELISA 후의 상대적인 디스플레이; b) 대장균에서 Fab 생산, 대장균 세포 용해 및 생산된 Fab의 ELISA 검출 후 상대적인 Fab 발현 수율; c) 대장균에서 Fab 생산, 대장균 세포 용해, 증가된 온도에서 배양한 후 비변성 Fab의 ELISA 검출 후 Fab의 온도 안정성; d) 소/마우스 혈청 내 배양 후, 비변성 Fab의 ELISA 검출에 의한 대장균 용해물로부터의 Fab의 소/마우스 혈청 내 안정성; e) 포유류 세포에서의 IgG1 생산 및 세포 배양물 상층액으로부터 분비된 IgG1의 ELISA 검출 후의 상대적인 인간 IgG1 발현 수율; 및 f) 소/마우스 혈청 내 배양 후, 비변성 Fab의 ELISA 검출에 의한 인간 IgG1의 소 혈청 내 안정성.
표 12에 제공된 데이터를 이용하면, 당업자는 유리한 생물 물리학적 특성을 가지고 있는 생식세포 단백질 쌍을 용이하게 확인할 수 있다.
일반적으로, 집합에 포함시키기 위하여 각각의 기능적 특성에서 임계치를 나타내는 생식세포 단백질 쌍을 선별하였다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 다음과 같은 특성 전부를 포함하는 생식세포 단백질 쌍을 집합에 포함시키기 위하여 선별하였다: i) 표본 추출된 Fab 중 상위 75% 이내의 값을 포함하는 Fab 포맷의 상대적 디스플레이 비율; ii) Fab VH1-69 VLA_Vl1-40 AYA과 비교할 때, 적어도 0.4의 Fab 포맷의 발현 수율; iii) 적어도 45분 동안 60℃ 이상에서 Fab 포맷의 열 안정성; iv) 37℃에서 열흘을 초과하는 기간 동안 Fab 포맷의 소 또는 마우스 혈청 내 안정성; v) MOR03080과 비교할 때, 적어도 0.4의 IgG 포맷의 발현 수율; 및 vi) 37℃에서 14일 동안 IgG 포맷의 혈청 내 안정성. 표 32는 이러한 기능적 특성 모두를 포함하는 생식세포 단백질 쌍을 굵은 활자체와 밑줄로 표시하였다.
그러나 위에서 기술한 바와 같이, 하나 이상의 기술적 특성을 가지고 있는 생식세포 단백질 쌍이 집합 내에 포함되도록 선택될 수 있다. 여기서, 시험한 400개의 생식세포 단백질 쌍의 합계 순위를 만들어서, 각각의 생식세포 단백질 을 시험한 기능적 특성 각각에 대한 기타 가중치에 대하여 순위를 매길 수 있었다. 덕분에, 본 발명자들은 하나 이상의 또는 모든 나열된 기능적 특성을 보유하는 하나 이상의 생식세포 단백질 쌍을 선택할 수 있었다. 일부 구현예에서, 집합은 위의 특징들을 나타내는 생식세포 단백질 쌍 모두를 포함한다. 일부 구현예에서, 집합은 시험한 400개 쌍 중 가장 높은 합계 점수를 보유하는 생식세포 단백질 쌍을 포함한다. 일부 구현예에서, 시험한 400개의 쌍 중 상위 10%, 상위 20% 또는 상위 30% 이내의 합계 점수를 보유하는 생식세포 단백질 쌍을 집합 내에 포함되도록 선별하였다.
실시예
9: 약 100개의
VH
/
VL
쌍의 추가적인 시험
위에서 시험한 400개의 생식세포 단백질 쌍 가운데(결과는 도 12에 도시함), 95개를 추가적인 시험을 위해 선택하였다. 400개의 생식세포 단백질 쌍의 디스플레이, 발현 수율, 열 및 혈청 안정성에 대한 이전의 시험은, 치료제 개발에 유리하리라고 생각했던 특징을 가지고 있지 않은 생식세포 단백질 쌍을 제거하는 예비적인 필터로써 작용했다. 유리한 개발 가능성 특징을 가지고 있지만, 동시에 집합이 임의의 항원에 대해 개발 가능한 후보를 동정하는 데 이용될 수 있도록 집합 내에서 높은 수준의 다양성을 유지하는, 생식세포 단백질 쌍의 하위 집단을 선별하는 것이 목표였다.
표 12는 본원의 일 구현예의 임계치를 충족한, 약 60개의 굵은 활자체의 밑줄 친 생식세포 단백질 쌍을 보여준다. 추가적인 시험을 위해 선별된 95개의 생식세포 단백질 쌍 가운데, 일부가 이전의 기준을 충족하였고 그것들을 추가적으로 시험하는 것이 바람직하였으므로, 그것들을 선택하였다. 다른 것들은 특정 임계치를 충족하지 못하였지만 선택하여, 이러한 쌍들이 재평가될 수 있도록 하였다. 다시, 본원의 목표 가운데 하나는 임의의 항원에 대한 항체 또는 단편을 동정하는 데 이용될 수 있는 다양한 집합을 제공하는 것이다.
도 16 내지 도 24에 도시된 95개의 생식세포 단백질 쌍을 실시예 5에 기술된 바와 같이 합성하였다. Fab 및 IgG1 포맷의 합성 및 발현 후, 95개의 생식세포 단백질 쌍을 Fab 포맷과 IgG1 포맷으로 다음과 같은 a) 정제된 Fab 발현 수율(mg/L)(발현 배양물), b) 정제된 Fab 단량체 함량(단량체 %), c) 정제된 Fab 열 안정성(℃), d) 정제된 IgG1 발현 수율(mg/L)(세포 배양물), e) 정제된 IgG1 단량체 함량(단량체 %), f) 정제된 IgG1 열 안정성(℃), g) IgG1 등전점 및 h) 시차 주사 형광분석(DSF), 흡광도, 동적 광산란 및 입자 염색을 포함한, 산 노출과 함께 하는 IgG 응력 시험에 대해, 추가로 시험하였다.
실시예
9.1 정제된
Fab
시험
추가적인 시험을 위해 선택된 95개 생식세포 단백질 쌍 각각을 대표하는 Fab 단편들을 대장균에서 발현시켜 정제하였다. 대장균 TG-1 F 세포에서의 Fab 단편의 발현은 0.1% 글루코스와 클로르암페니콜이 첨가된 2xYT 배지의 500mL 배양물에서 이루어졌다. 배양물은 OD600nm가 0.5에 이를 때까지 진탕하였다. IPTG(이소프로필-베타-D-티오갈락토피라노사이드)의 첨가 및 추가적인 밤새 배양에 의해 Fab 발현이 유도되었다. 세포를 채취하여, 리소자임을 이용하여 파괴하였다. IMAC(Bio-Rad, 독일 뮌헨)을 통해 히스티딘6이 부착된 (SEQ ID NO: 203) Fab 단편을 분리하여, 이미다졸을 이용하여 용리시켰다. PD10 컬럼(GE Healthcare, 독일 뮌헨)을 이용하여 1x Dulbecco´s PBS(pH 7.2, Invitrogen, 독일 다름슈타트)로의 완충액 교환을 수행하였다. 시료를 멸균 여과시켰다(0.2μm).
실시예
9.1.1 정제된
Fab
발현 수율 확인
95개 생식세포 단백질 쌍 각각을 대표하는 정제된 Fab 단편들의 단백질 농도를 UV 분광분석법(Nanodrop, peqlab, 독일 에를랑겐)으로 확인하였다. 이용된 흡광계수는 1.538 mL/mg이었고, 280nm에서 흡광도를 측정하였다. 결과를 도 16 내지 도 18에 도시하였다.
실시예
9.1.2 정제된
Fab
열 안정성 확인
95개 생식세포 단백질 쌍 각각을 대표하는 정제된 Fab 단편들의 열 안정성을 시차 주사 형광 분석법(DSF)으로 확인하였다. 시차 주사 형광 분석법(DSF)는 관심 있는 단백질의 열적 중첩 풀림(녹는점)을 추적 관찰하는 형광 염료 기반의 기법이다. 중첩 풀림 단백질의 소수성 아미노산 측쇄와 상호 작용하는 소수성 염료의 형광도 변화를 온도 경사에 대해 추적 관찰하였다.
다음과 같은 재료가 이용되었다: 사이프로(Sypro) 오렌지색 형광 염료(Sigma, #S5692); 96웰 iCycler iQ PCR 플레이트(Biorad, #2239441); 마이크로씰(Microseal) B 접착성 씰러(Sealer)(Biorad #MSB-1001); 96웰 광학 패드(Biorad, #ADR3296); iCycler iQ5 열 순환기(thermal cycler)(Biorad) 및 Gibco D-PBS, pH 7.4 (Invitrogen, 미국 페이즐리).
희석시킨 사이프로 오렌지를 96웰 iCycler iQ PCR 플레이트의 각 웰에 첨가하였고, 시료를 적어도 0.1mg/mL의 최종 농도에서 시험하였다. iCycler iQ5 열 순환기(Biorad)를 시험에 이용하였다. 60℃/h의 가열 속도로 20℃부터 95℃까지 온도를 스캔하였고, 형광 전이의 중간점을 분석하여 중첩 풀림 온도를 계산하였다. 결과를 도 16 내지 도 18의 정제된 Fab 열 형광(Thermafluor)란에 나타내었다.
실시예
9.1.3 크기 배제 크로마토그래피에 의한 정제된
Fab
분리
95개 생식세포 단백질 쌍 각각을 대표하는 정제된 Fab 단편들의 단량체 함량(단량체 %)을 크기 배제 크로마토그래피(SEC)로 확인하였다. SEC는 AKTA 정제기 시스템(GE Healthcare Europe GmbH, 독일 프라이부르크) 상에서 수행하였다. 분리에 Superdex75 HR 10/30 컬럼(GE Healthcare Europe GmbH, 독일 프라이부르크)이 이용되었다. 각 시료별로, 10㎕의 단백질을 컬럼에 로딩하였고, 0.05ml/min의 유속으로 분리를 수행하였으며, 260nm와 280nm에서 UV 흡광도를 분석하여 기록하였다. 전개 완충액은 pH 7.4의 Gibco D-PBS(Invitrogen, 미국 페이즐리)로 이루어졌다. 결과를 도 16 내지 도 18에 도시하였다.
실시예
9.2
IgG1
발현 및 정제
추가 시험을 위해 선택된 95개 생식세포 단백질 쌍 각각을 대표하는 IgG1을 HKB11 세포에서 발현시켰다. 진핵생물 HKB11 세포를 1:1 비율의 IgG 중쇄 및 경쇄 발현 벡터 DNA로 형질감염시켰다. 세포 배양물 상층액을 형질감염 후 3 내지 4일째에 채취하여, 단백질 A 친화도 크로마토그래피(MabSelect SURE, GE Healthcare, 독일 뮌헨)를 수행하였다. 1x Dulbcecco´s PBS(pH 7.2, Invitrogen, 독일 다름슈타트)로 완충액 교환을 하고, 시료를 멸균 여과시켰다(세공 크기 0.2μm).
실시예
9.2.1 정제된
IgG1
발현 수율 확인
95개 생식세포 단백질 쌍 각각을 대표하는 정제된 IgG1의 단백질 농도를 UV 분광분석법(Nanodrop, peqlab, 독일 에를랑겐)으로 확인하였다. 이용된 흡광계수는 1.369mL/mg이었고, 280nm에서 흡광도를 측정하였다. 결과를 도 16 내지 도 18에 도시하였다.
실시예
9.2.2 정제된
IgG1
열 안정성 확인
정제된 IgG1의 IgG1 열 안정성을 실시예 9.1.2에 기술된 바와 같이, 시차 주사 형광 분석법(DSF)으로 확인하였다. 각 IgG에 대해 나타낸 값은 IgG의 가변 영역 내에서 일어나는 중첩 풀림 사건을 나타낸다. Fc 부분의 중첩 풀림을 나타내는 값은 각 인간 IgG1에 대해 일반적으로 동일하므로, 도시하지 않았다. 결과를 도 16 내지 도 18에 도시하였다.
실시예
9.2.3 크기 배제 크로마토그래피에 의한 정제된
IgG1
분리
95개 생식세포 단백질 쌍 각각을 대표하는 정제된 IgG1의 단량체 함량(단량체 %)을 크기 배제 크로마토그래피(SEC)로 확인하였다. Dionex UltiMate 3000 티타늄 HPLC 시스템(Dionex Corporation, 독일 게르메링)을 Wyatt miniDAWN Treos 및 Wyatt Optilab rEX(Wyatt Technology Europe, 독일 던바크)와 조합하여 HP-SEC를 수행하였다. Tosoh TSK-Gel G3000SWxl 컬럼(Tosoh Bioscience, 독일 슈투르가르트)을 분리에 이용하였다. 각 시료별로, 15μg의 단백질을 컬럼에 로딩하였고, 0.5ml/min의 유속으로 분리를 수행하였으며, 280nm에서 UV 흡광도를 분석하여 기록하였다. 전개 완충액은 pH 7.4의 Gibco D-PBS(Invitrogen, 미국 페이즐리)로 이루어졌다. 결과를 도 16 내지 도 18에 도시하였다.
실시예
9.2.4 정제된
IgG1
등전점
(
pI
) 계산
IgG1 포맷의 각 생식세포 단백질 쌍의 등전점을 계산하였다. 단백질의 pI를 결정하는 방법은 당업자에게 알려져 있다. 예를 들어, 다음과 같은 도구가 이용될 수 있다; http://www.expasy.org/tools/pi_tool.html; NTI 벡터(Invitrogen, 미국 캘리포니아 칼즈배드). 결과를 도 16 내지 도 18에 도시하였다.
실시예
9.2.5 정제된
IgG1
의 산 노출 응력 시험
바이러스 불활성화 단계는 화학, 제조 및 품질관리(CMC)의 하류 공정(DSP)에서 표준 단계이므로, pH를 낮추고, IgG1 각각에 대한 응집 민감성 데이터를 기록하여 95개 생식세포 단백질 쌍의 산에 견디는 능력을 시험하였다. 생식세포 단백질 쌍 각각을 2mg/mL 농도의 96 딥웰 플레이트 포맷으로 만들었다. 150μL씩을 96웰 플레이트로 옮겼다. 흡광도, 동적 광산란(DLS), 시차 주사 형광 분석법(DSF) 측정 및 입자 염색에 의해 초기 특성분석을 하였다. 1.8μL의 pH 2.3의 1M 시트레이트를 이용하여 시료를 산성으로 만들었다. pH 9.0의 1M Tris를 이용하여, 시료를 2.5시간 후 중화시켰다.
실시예
9.2.5 (a) 정제된
IgG1
시차 주사 형광 분석법
추가 시험을 위해 선택된 95개 생식세포 단백질 쌍 각각을 대표하는 IgG1의 산 노출 전과 후의 열 안정성을 평가하기 위하여, 실시예 9.1.2에 기술한 바와 같이 시차 주사 형광 분석법(DSF)을 수행하였다. 각 IgG에 대해 나타낸 값은 IgG의 가변 영역 내에서 일어나는 중첩 풀림 사건을 나타낸다. Fc 부분의 중첩 풀림을 나타내는 값은 각 IgG에 대해 일반적으로 동일하므로, 도시하지 않았다. 산 노출 전과 후의 Tm(겉보기 녹는점) 값이 같을 경우, 항체의 분자 구조가 산에 의해 영향을 받지 않았거나, 노출 후 효율적으로 다시 접을 수 있었다. 결과를 도 19, 도 21 및 도 23에 도시하였다.
실시예
9.2.5 (b) 정제된
IgG1
UV
/
Vis
흡광도
응집하는 시료를 확인하기 위하여, 320nm에서 혼탁도를 기록하였다. 추가 시험을 위해 선택된 95개 생식세포 단백질 쌍 각각을 대표하는 IgG 용액의 혼탁도를 산 노출 전과 후에 평가하였다. 결과를 도 19, 도 21 및 도 23에 도시하였다. 기선 흡광도는 맑은 용액의 경우에 예상되는 0.035 흡광단위였다. 흡광도 증가는 광 산란에 의해 야기되며, 이는 증가하는 흡광도를 초래한다. 0.039를 초과하는 값은 응집체를 함유할 가능성이 높다. 0.045를 초과하는 값은 응집체가 명백히 존재함을 나타낸다. 0.06을 초과하는 값은 강력하게 불리한 안정성을 나타내는 분자들의 경우에 발견되는 임계 응집 수준을 나타낸다.
실시예
9.2.5 (c) 정제된
IgG1
동적
광산란
또한, 선택된 95개의 생식세포 단백질 쌍을 대표하는 각 IgG1 상에 동적 광산란(DLS)을 수행하였다. 동적 광산란(DLS)은 용액 내 입자의 유체 역학적 반경을 평가하는 분광학적 방법이다. 모든 DLS 실험은 DynaPro 타이탄 큐벳 시스템(Wyatt Technology Europe, 독일 던바크)을 이용하여 수행하였다.
응력 시험 후 가시적인 입자 오염의 경우, 큰 응집체를 제거하기 위하여 IgG를 원심분리하였다. 도 20, 도 22 및 도 24는 산 처리 전과 후, 제조물에서 발견된 단량체 IgG1에 해당하는 겉보기 입자 반경 및 다분산성을 나타낸다. 누적 분석의 계산된 반경에 따라, 데이터를 평가하였다. 유체 역학적 반경 이외에도, 제조물의 다분산성 %를 평가하였다. 다분산성 증가(> 15 %)는 불균일한 입자 크기 분포를 가져오는, IgG 분자의 잠재적인 응집을 나타낸다. IgG와 명백하게 구별 가능한 고분자량(HMW)의 입자(반경 > 3배)는 표에 나열하지 않았다. 모든 DLS 결과를 도 20, 도 22 및 도 24에 도시하였다.
실시예
9.2.5 (d) 정제된
IgG1
입자 염색
가시적인 응집체의 양과 형태를 평가하기 위하여, 선택된 95개의 생식세포 단백질 쌍을 대표하는 각 IgG1 상의 입자 염색을 산 노출 전과 후에 수행하였다. IgG 제조물 내의 입자를 여과하고 염색하는 데 다음과 같은 시약이 이용되었다: Ultrafree-CL 0.22μm 멸균 필터(Millipore, #UFC40GV0S); AP가 콘쥬게이트된 항-인간 람다 경쇄(Sigma #A-2904); AP 콘쥬게이트, 빠른 BCIP/NBT에 대한 현상액(Sigma #B-5655); Roti®-ImmunoBlock(Roth #T144.1); 알칼리 포스파타아제 정지용액(Sigma #A5852-100ML); TBS: 0.05 M Tris; 0.15 M NaCl; 0.1% Tween 20이 있는 TBS; 및 5 M NaCl 용액.
단백질 용액을 0.22μm 필터로 여과하고, 이후에 마우스 항인간 Fab2 알칼리 포스파타아제가 콘쥬게이트된 항체와 웨스턴 블롯 현상액을 이용하여 나머지 항체 응집체를 염색하였다. 제조사의 설명서에 따라 분석을 하였다. 이후에 시료를 외관검사하여 1~4의 범위로 분류하였다. 카테고리 1은 매우 낮은 입자 함량을 나타내고, 카테고리 4는 제조물의 높은 입자 부하량을 나타낸다. 모든 입자 염색 결과를 도 20, 도 22 및 도 24에 도시하였다.
실시예
9.2.6 정제된
IgG1
의
교반
응력 시험
가공 도중 여과 단계를 피할 수 없으므로, 전단력에 저항하는 항체 또는 항체 단편의 능력은 도움이 되는 기준이다. 따라서, 딥웰 플레이트 내 550rpm의 회전 진탕기 위의 96웰 플레이트 내에서 가속된 유리 진주를 이용하여 95개의 생식세포 단백질 쌍을 IgG1 포맷으로 시험하였다. 각 IgG 350㎕에 이러한 처리를 하였다. 150㎕씩을 96웰 플레이트에 옮겼다. 흡광도, 동적 광산란(DLS), 시차 주사 형광 분석법(DSF) 측정 및 입자 염색에 의해 초기 특징 분석을 수행하였다.
실시예
9.2.6 (a) 정제된
IgG1
UV
/
Vis
흡광도
응집하는 시료를 확인하기 위하여, 320nm에서 혼탁도를 기록하였다. 추가 시험을 위해 선택된 95개 생식세포 단백질 쌍 각각을 대표하는 IgG 용액의 혼탁도를 응력 노출 전과 후에 평가하였다. 결과를 도 49, 도 51 및 도 53에 도시하였다. 기선 흡광도는 맑은 용액의 경우에 예상되는 0.035 흡광단위였다. 흡광도 증가는 광 산란에 의해 야기되며, 이는 증가하는 흡광도를 초래한다. 0.039를 초과하는 값은 응집체를 함유할 가능성이 높다. 0.045를 초과하는 값은 응집체가 명백히 존재함을 나타낸다. 0.06을 초과하는 값은 강력하게 불리한 안정성을 나타내는 분자들의 경우에 발견되는 임계 응집 수준을 나타낸다.
실시예
9.2.6 (b) 정제된
IgG1
시차 주사 형광 분석법
추가 시험을 위해 선택된 95개 생식세포 단백질 쌍 각각을 대표하는 IgG1의 산 노출 전과 후의 열 안정성을 평가하기 위하여, 실시예 9.1.2에 기술한 바와 같이 시차 주사 형광 분석법(DSF)을 수행하였다. 각 IgG에 대해 나타낸 값은 IgG의 가변 영역 내에서 일어나는 중첩 풀림 사건을 나타낸다. Fc 부분의 중첩 풀림을 나타내는 값은 각 인간 IgG1에 대해 일반적으로 동일하므로, 도시하지 않았다. 결과를 도 50, 도 52 및 도 54에 도시하였다.
실시예
9.2.6 (c) 정제된
IgG1
동적
광산란
또한, 선택된 95개의 생식세포 단백질 쌍을 대표하는 각 IgG1 상에 동적 광산란(DLS)을 수행하였다. 동적 광산란(DLS)은 용액 내 입자의 유체 역학적 반경을 평가하는 분광학적 방법이다. 모든 DLS 실험은 DynaPro 타이탄 큐벳 시스템(Wyatt Technology Europe, 독일 던바크)을 이용하여 수행하였다.
응력 시험 후 가시적인 입자 오염의 경우, 큰 응집체를 제거하기 위하여 IgG를 원심분리하였다. 도 50, 도 52 및 도 54는 응력 처리 후, 제조물에서 발견된 단량체 IgG1에 해당하는 겉보기 입자 반경 및 다분산성을 나타낸다. 누적 분석의 계산된 반경에 따라, 데이터를 평가하였다. 유체 역학적 반경 이외에도, 제조물의 다분산성 %를 평가하였다. 다분산성 증가(> 15 %)는 불균일한 입자 크기 분포를 가져오는, IgG 분자의 잠재적인 응집을 나타낸다. IgG와 명백하게 구별 가능한 고분자량(HMW)의 입자(반경 > 3배)는 표에 나열하지 않았다. 모든 DLS 결과를 도 50, 도 52 및 도 54에 도시하였다.
실시예
9.2.6 (d) 정제된
IgG1
입자 염색
가시적인 응집체의 양과 형태를 평가하기 위하여, 선택된 95개의 생식세포 단백질 쌍을 대표하는 각 IgG1 상의 입자 염색을 응력 노출 전과 후에 수행하였다. IgG 제조물 내의 입자를 여과하고 염색하는 데 다음과 같은 시약이 이용되었다: Ultrafree-CL 0.22μm 멸균 필터(Millipore, #UFC40GV0S); AP가 콘쥬게이트된 항-인간 람다 경쇄(Sigma #A-2904); AP 콘쥬게이트, 빠른 BCIP/NBT에 대한 현상액(Sigma #B-5655); Roti®-ImmunoBlock(Roth #T144.1); 알칼리 포스파타아제 정지용액(Sigma #A5852-100ML); TBS: 0.05 M Tris; 0.15 M NaCl; 0.1% Tween 20이 있는 TBS; 및 5 M NaCl 용액.
단백질 용액을 0.22μm 필터로 여과하고, 이후에 마우스 항인간 Fab2 알칼리 포스파타아제가 콘쥬게이트된 항체와 웨스턴 블롯 현상액을 이용하여 나머지 항체 응집체를 염색하였다. 제조사의 설명서에 따라 분석을 하였다. 이후에 시료를 외관검사하여 1~4의 범위로 분류하였다. 카테고리 1은 매우 낮은 입자 함량을 나타내고, 카테고리 4는 제조물의 높은 입자 부하량을 나타낸다. 모든 입자 염색 결과를 도 50, 도 52 및 도 54에 도시하였다.
실시예
9.2.7
IgG
응력 시험 누적 점수
산 노출 및 유리 구슬 교반의 응력 시험 결과를 평가하는 데 도움을 주기 위하여, 생식세포 단백질 쌍이 비교될 수 있는 점수 시스템이 만들어졌다. 실시예 9.2.5(a~d), 도 19 내지 도 24에 도시된 결과 및 실시예 9.2.6(a~d), 도 49 내지 도 54에 도시된 결과에서 얻어진 각각의 데이터 지점은 0~100 범위의 점수(0, 25, 75 또는 100)을 부여받았으며, 점수를 합산하여 누적 점수를 생성하였다. 실시예 9.2.5(a) 및 9.2.6(b)에서 확인된 열 안정성 값에는 점수를 부여하지 않았다.
도 55 및 도 56은 실시예 9.2.5 내지 실시예 9.2.6의 생식세포 단백질 쌍 1~32에 대한 응력 시험 점수를 보여준다. 각 점수는 도 19, 도 20, 도 49 및 도 50에 도시된 기초 데이터 지점을 대표한다. 도 19 및 도 20은 산 노출에 대한 반응을 보여주고, 도 49 및 도 50은 유리 구슬 교반에 대한 반응을 보여준다. 도 56은 도 55 및 도 56에 도시된 점수 각각을 합계한 누적 점수를 나타낸다.
도 57 및 도 58은 실시예 9.2.5 내지 실시예 9.2.6의 생식세포 단백질 쌍 33~64에 대한 응력 시험 점수를 보여준다. 각 점수는 도 21, 도 22, 도 51 및 도 52에 도시된 기초 데이터 지점을 대표한다. 도 21 및 도 22는 산 노출에 대한 반응을 보여주고, 도 51 및 도 52는 유리 구슬 교반에 대한 반응을 보여준다. 도 58은 도 57 및 도 58에 도시된 점수 각각을 합계한 누적 점수를 나타낸다.
도 59 및 도 60은 실시예 9.2.5 내지 실시예 9.2.6의 생식세포 단백질 쌍65~95에 대한 응력 시험 점수를 보여준다. 각 점수는 도 23, 도 24, 도 53 및 도 54에 도시된 기초 데이터 지점을 대표한다. 도 23 및 도 24는 산 노출에 대한 반응을 보여주고, 도 53 및 도 54는 유리 구슬 교반에 대한 반응을 보여준다. 도 60은 도 59 및 도 60에 도시된 점수 각각을 합계한 누적 점수를 나타낸다.
실시예
10: 집합 조성물의 선택
요컨대, 실시예 4에 기술된 바와 같이, 400개의 생식세포 단백질 쌍이 선택되었다. 이들 400개는 인간 면역 레퍼토리에 존재하는 다양한 생식세포 단백질 쌍을 대표한다. 400개의 생식세포 단백질 쌍을 실시예 6 및 실시예 7에 기술된 바와 같이 시험하였다. 400개 가운데, 95개를 실시예 9에 기술한 바와 같이 추가로 시험하였다.
95개 생식세포 단백질 쌍을 다음과 같은 요소들을 고려하여 비교하였다: a) Fab 디스플레이 비율; b) Fab 발현 수율; c) Fab 열 안정성; d) Fab 혈청 내 안정성; e) Fab SEC 단량체 함량(단량체 %); f) IgG1 발현 수율; g) IgG1 열 안정성; h) IgG1 혈청 내 안정성; i) IgG1 SEC 단량체 함량(단량체 %); 및 j) IgG1 등전점(pI). 이러한 요소들 각각에 대한 데이터를 도 16 내지 도 18에 도시하였다. 이러한 요소들은 치료적 항체의 개발 가능성과 철저히 관련이 있다.
Fab 디스플레이 비율은 항원에 대한 항체 또는 단편의 선택에서 중요한 요소이다. 높은 비율로 디스플레이하는 Fab는 선택 시 항원에 대해 노출될 가능성이 더 높다. 다양한 Fab 각각의 높은 디스플레이 비율은 선택 시 다양한 집합의 전체가 항원에 노출됨을 확실히 해준다. Fab 디스플레이 비율은 실시예 6.2에서 확인하였으며, 이때 기준은 내부 표준(HuCAL GOLD 기준 파지 제조물(VH3 카파 + 람다))이었다. HuCAL GOLD VH3 제조물은 높은 디스플레이를 나타내는 제조물이다. Fab 디스플레이 비율은 중요한 요소로서, 400개의 쌍을 추가 시험을 위해 95개로 좁히는 데 유용하였지만, 일부 구현예에서는 집합에 포함시키기 위한 생식세포 단백질 쌍의 선택에 결정적인 요소로 고려되지 않았다.
항원에 대해 선택된 항체 또는 단편은 흔히 시험관 내(in vitro) 또는 생체 내(in vivo)에서 기능적 활성을 확인하기 위하여 우선적으로 시험해야 하고, 그 다음, 유독한 종에서, 그리고 최종적으로는 임상 시험을 위해 인간에서 시험해야 하므로, Fab 및 IgG1의 발현 수율은 중요하다. 항원에 대해 선택된 항체 또는 단편이 치료제 개발 및 임상 시험의 공급과 판매에 필요한 다양한 시험 전부를 뒷받침하기에 충분히 많은 양으로 효과적으로 발현될 수 있음은 매우 중요하다. 정제된 Fab의 발현 수율(정제된 Fab의 mg/발현 배양물의 L)은 실시예 9.1.1에서 확인하였으며(도 16 내지 도 18에 결과 도시), 본원의 일 구현예에서, 적어도 2.5mg/L의 임계치가 선택되었다. 다른 구현예에서는, 다른 임계치가 선택되었다. 정제된 IgG1의 발현 수율(정제된 IgG1의 mg/세포 배양물의 L)은 실시예 9.2.1에서 확인하였으며(도 16 내지 도 18에 결과 도시), 본원의 일 구현예에서, 적어도 30.0mg/L의 임계치가 선택되었다. 다른 구현예에서는, 다른 임계치가 선택되었다.
항체와 같은 단백질은 고온에 취약하고, 따라서 치료제를 전 세계적으로 배급하고, 오랜 유통기한을 가지기 위해 요구되는 저장 및 수송과 관련된 요구사항을 견딜 수 있는 항체가 필수적이므로, 열 안정성은 중요한 요소이다. 정제된 Fab의 열 안정성은 실시예 9.1.2에서 확인하였으며(도 16 내지 도 18에 결과 도시), 본원의 일 구현예에서, 적어도 70℃의 임계치가 선택되었다. 다른 구현예에서는, 다른 임계치가 선택되었다. 정제된 IgG1의 열 안정성은 실시예 9.2.2에서 확인하였으며(도 16 내지 도 18에 결과 도시), 나열된 값은 가변 도메인의 불안정화를 나타내며, 일 구현예에서, 적어도 73℃의 임계치가 선택되었다. 다른 구현예에서는, 다른 임계치가 선택되었다.
치료적 단백질은 인간 혈청 내에 존재하는 혈청 단백질 분해효소에 노출되더라도 효능 및 기능적 구조를 유지해야 하므로, 혈청 내 안정성은 치료적 항체에 중요한 요소이다. 생식세포 단백질 쌍의 혈청 내 안정성은 실시예 6.5 및 실시예 7.2에 기술된 방법에 의해 확인하였다. 혈청 내 안정성은 중요하지만, 분석법이 소수의 사례에서 허위 음성 결과를 도출하는 경향이 있었기에, 생식세포 단백질 쌍의 선택에서 결정적인 요소로 고려되지 않았다.
크기 배제 크로마토그래피(SEC)로 확인한 단량체 함량(단량체 %)은 응집 경향과 매우 관련이 있기 때문에, 중요한 요소이다. 응집은 치료적 단백질 개발에서 흔한 문제로, 단백질 치료제의 불활성화, 불균질성 및 생산 손실을 가져온다. 정제된 Fab 및 정제된 IgG1 포맷 모두에서 크기 배제 크로마토그래피(SEC)로 확인한 단량체 함량(단량체 %)을 실시예 9.1.3 및 실시예 9.2.3에 기술된 방법에 의해 확인하였다(도 16 내지 도 18에 결과 도시). 정제된 Fab의 단량체 함량(단량체 %)은 실시예 9.1.3에서 확인하였으며, 일 구현예에서, 적어도 98%의 임계치가 선택되었다. 다른 구현예에서는, 다른 임계치가 선택되었다. 정제된 IgG1의 단량체 함량(단량체 %)은 실시예 9.2.3에서 확인하였으며, 일 구현예에서, 적어도 99%의 임계치가 선택되었다. 다른 구현예에서는, 다른 임계치가 선택되었다.
등전점(pI)은 특정 pH에서의 용해도를 예측한다. 용액의 pH가 주어진 단백질의 pI와 상당히 다를 때, 단백질이 녹는다. 등전점은 중요하지만, 일부 구현예에서는, 생식세포 단백질 쌍의 선별에 결정적인 요소로 고려되지 않았다.
본원의 일 구현예에서, 각 기준에 대한 임계치는 다음과 같이 선택되었다: a) 적어도 2.5mg/L의 (실시예 9.1.1에서 기술한 바와 같은) 정제된 Fab 발현 수율; b) 적어도 30.0mg/L의 (실시예 9.2.1에서 기술한 바와 같은) 정제된 IgG1 발현 수율; c) 적어도 70℃의 (실시예 9.1.2에서 기술한 바와 같은) 정제된 Fab의 열 안정성; d) 적어도 73℃의 (실시예 9.2.2에서 기술한 바와 같은) 정제된 IgG1의 열 안정성; e) 적어도 98%의 (실시예 9.1.3에서 기술한 바와 같은) 정제된 Fab의 단량체 함량; 및 f) 적어도 99%의 (실시예 9.2.3에서 기술한 바와 같은) 정제된 IgG1의 단량체 함량. 다음과 같은 생식세포 단백질 쌍(54개)은 각각 이러한 임계치와 동일하거나 우수한 값을 나타내었으므로(도 16 내지 도 24에 데이터 도시), 개발 가능성과 관련된 우수한 기능적 활성을 나타내는 것으로 확인되었다: VH1-18 (SEQ ID NO: 204)/VK1-39 (SEQ ID NO: 236); VH1-18 (SEQ ID NO: 204)/VK3-15 (SEQ ID NO: 238); VH1-18 (SEQ ID NO: 204)/VK3-20 (SEQ ID NO: 239); VH1-46 (SEQ ID NO: 205)/VK3-15 (SEQ ID NO: 238); VH1-46 (SEQ ID NO: 205)/VL1-51 (SEQ ID NO: 252); VH1-46 (SEQ ID NO: 205)/VL3-21 (SEQ ID NO: 257); VH1-69*01 (SEQ ID NO: 206)/VL1-51 (SEQ ID NO: 252); VH3-07 (SEQ ID NO: 207)/VK1-12 (SEQ ID NO: 233); VH3-07 (SEQ ID NO: 207)/VK1-16 (SEQ ID NO: 234); VH3-07 (SEQ ID NO: 207)/VK1-27 (SEQ ID NO: 235); VH3-07 (SEQ ID NO: 207)/VK1-39 (SEQ ID NO: 236); VH3-07 (SEQ ID NO: 207)/VK3-15 (SEQ ID NO: 238); VH3-07 (SEQ ID NO: 207)/VL1-47 (SEQ ID NO: 251); VH3-07 (SEQ ID NO: 207)/VL1-51 (SEQ ID NO: 252); VH3-11 (SEQ ID NO: 208)/VK1-05 (SEQ ID NO: 230); VH3-11 (SEQ ID NO: 208)/VK1-39 (SEQ ID NO: 236); VH3-11 (SEQ ID NO: 208)/VK3-15 (SEQ ID NO: 238); VH3-11 (SEQ ID NO: 208)/VL1-40 (SEQ ID NO: 250); VH3-11 (SEQ ID NO: 208)/VL1-47 (SEQ ID NO: 251); VH3-11 (SEQ ID NO: 208)/VL1-51 (SEQ ID NO: 252); VH3-11 (SEQ ID NO: 208)/VL2-23 (SEQ ID NO: 255); VH3-15 (SEQ ID NO: 209)/VK1-05 (SEQ ID NO: 230); VH3-15 (SEQ ID NO: 209)/VK1-06 (SEQ ID NO: 231); VH3-15 (SEQ ID NO: 209)/VK1-12 (SEQ ID NO: 233); VH3-15 (SEQ ID NO: 209)/VK1-16 (SEQ ID NO: 234); VH3-15 (SEQ ID NO: 209)/VK1-27 (SEQ ID NO: 235); VH3-15 (SEQ ID NO: 209)/VK3-11 (SEQ ID NO: 237); VH3-15 (SEQ ID NO: 209)/VL1-40 (SEQ ID NO: 250); VH3-15 (SEQ ID NO: 209)/VL1-47 (SEQ ID NO: 251); VH3-15 (SEQ ID NO: 209)/VL1-51 (SEQ ID NO: 252); VH3-15 (SEQ ID NO: 209)/VL2-14 (SEQ ID NO: 254); VH3-21 (SEQ ID NO: 210)/VK1-12 (SEQ ID NO: 233); VH3-21 (SEQ ID NO: 210)/VK1-27 (SEQ ID NO: 235); VH3-21 (SEQ ID NO: 210)/VL2-11 (SEQ ID NO: 253); VH3-23 (SEQ ID NO: 211)/VK1-39 (SEQ ID NO: 236); VH3-23 (SEQ ID NO: 211)/VK3-15 (SEQ ID NO: 238); VH3-23 (SEQ ID NO: 211)/VL2-23 (SEQ ID NO: 255); VH3-23 (SEQ ID NO: 211)/VL3-1 (SEQ ID NO: 256); VH3-30 (SEQ ID NO: 212)/VK3-20 (SEQ ID NO: 239); VH3-53 (SEQ ID NO: 213)/VK3-15 (SEQ ID NO: 238); VH3-53 (SEQ ID NO: 213)/VL2-11 (SEQ ID NO: 253); VH3-74 (SEQ ID NO: 214)/VK1-05 (SEQ ID NO: 230); VH3-74 (SEQ ID NO: 214)/VK1-06 (SEQ ID NO: 231); VH3-74 (SEQ ID NO: 214)/VK1-12 (SEQ ID NO: 233); VH3-74 (SEQ ID NO: 214)/VK1-27 (SEQ ID NO: 235); VH3-74 (SEQ ID NO: 214)/VK3-20 (SEQ ID NO: 239); VH3-74 (SEQ ID NO: 214)/VL1-51 (SEQ ID NO: 252); VH5-51 (SEQ ID NO: 215)/VK1-39 (SEQ ID NO: 236); VH5-51 (SEQ ID NO: 215)/VL1-40 (SEQ ID NO: 250); VH5-51 (SEQ ID NO: 215)/VL1-51 (SEQ ID NO: 252); VH6-1 (SEQ ID NO: 216)/VK1-09 (SEQ ID NO: 232); VH6-1 (SEQ ID NO: 216)/VK3-15 (SEQ ID NO: 238); VH6-1 (SEQ ID NO: 216)/VK3-20 (SEQ ID NO: 239) 및 VH6-1 (SEQ ID NO: 216)/VL1-51 (SEQ ID NO: 252). 따라서, 이들 생식세포 단백질 쌍을 임의의 수만큼 포함하는 집합은 임의의 항원에 대한 개발 가능한 항체 또는 이의 단편을 동정하는 데 이용될 수 있다.
추가적으로, 실시예 9.2.5(a~d)에서 설명한 방법, 도 19 내지 도 24에 나타낸 데이터, 실시예 9.2.6(a~d), 도 49 내지 도 54에 나타낸 데이터 및 실시예 9.2.7, 도 55 내지 도 60에 나타낸 점수를 이용하여 확인한 응력 시험 데이터를 비교한 것을 기초로 하여 생식세포 단백질 쌍의 부분집합을 선별하였다. 응력 시험 방법은 산 노출 및 유리 구슬 교반 노출을 견디는 능력을 확인하기 위하여, IgG1 포맷의 95개 생식세포 단백질 쌍을 평가하였다. 일 구현예의 36개 생식세포 단백질 쌍이 산과 교반 응력에 강력한 저항성을 나타내, 개발 가능성과 관련된 추가적인 우수한 기능적 특성을 나타내었으므로, 이들이 선택되었다. 바이러스 불활성화 단계는 화학, 제조 및 품질관리(Chemistry, Manufacturing and Control, CMC)의 하류 공정(DSP)에서 표준 단계이므로, 산 노출에 저항하는 항체의 능력은 점차 중요해지는 요인이다. 산 처리 단계는 바이러스가 감염을 위해 이용하는 바이러스 캡시드 단백질을 변성시킨다. 그러나, pH 저하는 모든 단백질에 불안정화 효과를 나타낸다. 불안정한 항체는 이러한 단계에서 변성되고, 천연 구조를 느슨하게 한다. 바이러스 활성화 단계에서, 정해진 시간 경과 후, 산 처리는 중화에 의해 완화되고, 바이러스 캡시드 단백질은 불활성 구조로 있는 동안, 가공된 항체는 이상적이게도 그 천연 구조를 보유한다. 가공 도중 여과 단계를 피할 수 없으므로, 항체 또는 항체 단편의 전단력에 저항하는 능력은 도움이 되는 기준이다. 일 구현예에서 선택된 이들 36개의 생식세포 단백질 쌍은 이전의 기능적 활성의 임계치 전부를 충족시켰으며, 또한, 응력 시험 누적 점수에서 1225점 이상을 기록하였다. 일 구현예에서, 각 기준에 대한 임계치는 다음과 같이 선택되었다: a) 적어도 2.5mg/L의 (실시예 9.1.1에서 기술한 바와 같은) 정제된 Fab 발현 수율; b) 적어도 30.0mg/L의 (실시예 9.2.1에서 기술한 바와 같은) 정제된 IgG1 발현 수율; c) 적어도 70℃의 (실시예 9.1.2에서 기술한 바와 같은) 정제된 Fab의 열 안정성; d) 적어도 73℃의 (실시예 9.2.2에서 기술한 바와 같은) 정제된 IgG1의 열 안정성; e) 적어도 98%의 (실시예 9.1.3에서 기술한 바와 같은) 정제된 Fab의 단량체 함량; f) 적어도 99%의 (실시예 9.2.3에서 기술한 바와 같은) 정제된 IgG1의 단량체 함량 및 g) 적어도 1225의 (실시예 9.2.7에서 기술한 바와 같은) 응력 시험 누적 점수. 따라서, 본원의 구현예는 완전히 기능적인 생식세포 단백질 쌍(54개 중 36개)의 부분집합을 포함하는 집합을 포함하며, 개발 가능성과 관련된 추가적인 우수한 기능적 특성을 나타낸다. 이러한 구현예에서, 집합은 VH1-18 (SEQ ID NO: 204)/VK3-20 (SEQ ID NO: 239); VH1-46 (SEQ ID NO: 205)/VK3-15 (SEQ ID NO: 238); VH1-46 (SEQ ID NO: 205)/VL1-51 (SEQ ID NO: 252); VH1-69*01 (SEQ ID NO: 206)/VL1-51 (SEQ ID NO: 252); VH3-07 (SEQ ID NO: 207)/VK1-12 (SEQ ID NO: 233); VH3-07 (SEQ ID NO: 207)/VK1-27 (SEQ ID NO: 235); VH3-07 (SEQ ID NO: 207)/VK3-15 (SEQ ID NO: 238); VH3-07 (SEQ ID NO: 207)/VL1-47 (SEQ ID NO: 251); VH3-07 (SEQ ID NO: 207)/VL1-51 (SEQ ID NO: 252); VH3-11 (SEQ ID NO: 208)/VL1-40 (SEQ ID NO: 250); VH3-11 (SEQ ID NO: 208)/VL1-47 (SEQ ID NO: 251); VH3-11 (SEQ ID NO: 208)/VL1-51 (SEQ ID NO: 252); VH3-11 (SEQ ID NO: 208)/VL2-23 (SEQ ID NO: 255); VH3-15 (SEQ ID NO: 209)/VK1-05 (SEQ ID NO: 230); VH3-15 (SEQ ID NO: 209)/VK1-06 (SEQ ID NO: 231); VH3-15 (SEQ ID NO: 209)/VK1-12 (SEQ ID NO: 233); VH3-15 (SEQ ID NO: 209)/VK1-27 (SEQ ID NO: 235); VH3-15 (SEQ ID NO: 209)/VK3-11 (SEQ ID NO: 237); VH3-15 (SEQ ID NO: 209)/VL1-51 (SEQ ID NO: 252); VH3-21 (SEQ ID NO: 210)/VK1-12 (SEQ ID NO: 233); VH3-23 (SEQ ID NO: 211)/VK1-39 (SEQ ID NO: 236); VH3-23 (SEQ ID NO: 211)/VK3-15 (SEQ ID NO: 238); VH3-23 (SEQ ID NO: 211)/VL2-23 (SEQ ID NO: 255); VH3-23 (SEQ ID NO: 211)/VL3-1 (SEQ ID NO: 256); VH3-53 (SEQ ID NO: 213)/VK3-15 (SEQ ID NO: 238); VH3-53 (SEQ ID NO: 213)/VL2-11 (SEQ ID NO: 253); VH3-74 (SEQ ID NO: 214)/VK1-05 (SEQ ID NO: 230); VH3-74 (SEQ ID NO: 214)/VK1-06 (SEQ ID NO: 231); VH3-74 (SEQ ID NO: 214)/VK1-12 (SEQ ID NO: 233); VH3-74 (SEQ ID NO: 214)/VK3-20 (SEQ ID NO: 239); VH5-51 (SEQ ID NO: 215)/VK1-39 (SEQ ID NO: 236); VH5-51 (SEQ ID NO: 215)/VL1-40 (SEQ ID NO: 250); VH5-51 (SEQ ID NO: 215)/VL1-51 (SEQ ID NO: 252); VH6-1 (SEQ ID NO: 216)/VK1-09 (SEQ ID NO: 232); VH6-1 (SEQ ID NO: 216)/VK3-20 (SEQ ID NO: 239) 및 VH6-1 (SEQ ID NO: 216)/VL1-51 (SEQ ID NO: 252)을 포함한다.
다른 구현예에서, 각 기준에 대한 임계값은 다음과 같이 선택되었다: a) 적어도 2.5mg/L의 (실시예 9.1.1에서 기술한 바와 같은) 정제된 Fab 발현 수율; b) 적어도 30.0mg/L의 (실시예 9.2.1에서 기술한 바와 같은) 정제된 IgG1 발현 수율; c) 적어도 70℃의 (실시예 9.1.2에서 기술한 바와 같은) 정제된 Fab의 열 안정성; d) 적어도 73℃의 (실시예 9.2.2에서 기술한 바와 같은) 정제된 IgG1의 열 안정성; e) 적어도 99%의 (실시예 9.1.3에서 기술한 바와 같은) 정제된 Fab의 단량체 함량; f) 적어도 99%의 (실시예 9.2.3에서 기술한 바와 같은) 정제된 IgG1의 단량체 함량; g) 적어도 8.3의 (실시예 9.2.4에서 기술한 바와 같은) 정제된 IgG1의 등전점; 및 h) 적어도 1225의 (실시예 9.2.7에서 기술한 바와 같은) 응력 시험 누적 점수. 이러한 구현예에서, 집합은 (33개 쌍) VH1-18 (SEQ ID NO: 204)/VK3-20 (SEQ ID NO: 239); VH1-46 (SEQ ID NO: 205)/VK3-15 (SEQ ID NO: 238); VH1-46 (SEQ ID NO: 205)/VL1-51 (SEQ ID NO: 252); VH1-69*01 (SEQ ID NO: 206)/VL1-51 (SEQ ID NO: 252); VH3-07 (SEQ ID NO: 207)/VK1-12 (SEQ ID NO: 233); VH3-07 (SEQ ID NO: 207)/VK1-27 (SEQ ID NO: 235); VH3-07 (SEQ ID NO: 207)/VK3-15 (SEQ ID NO: 238); VH3-07 (SEQ ID NO: 207)/VL1-47 (SEQ ID NO: 251); VH3-07 (SEQ ID NO: 207)/VL1-51 (SEQ ID NO: 252); VH3-11 (SEQ ID NO: 208)/VL1-40 (SEQ ID NO: 250); VH3-11 (SEQ ID NO: 208)/VL1-47 (SEQ ID NO: 251); VH3-11 (SEQ ID NO: 208)/VL1-51 (SEQ ID NO: 252); VH3-11 (SEQ ID NO: 208)/VL2-23 (SEQ ID NO: 255); VH3-15 (SEQ ID NO: 209)/VK1-05 (SEQ ID NO: 230); VH3-15 (SEQ ID NO: 209)/VK1-06 (SEQ ID NO: 231); VH3-15 (SEQ ID NO: 209)/VK1-12 (SEQ ID NO: 233); VH3-15 (SEQ ID NO: 209)/VK1-27 (SEQ ID NO: 235); VH3-15 (SEQ ID NO: 209)/VK3-11 (SEQ ID NO: 237); VH3-15 (SEQ ID NO: 209)/VL1-51 (SEQ ID NO: 252); VH3-21 (SEQ ID NO: 210)/VK1-12 (SEQ ID NO: 233); VH3-23 (SEQ ID NO: 211)/VK3-15 (SEQ ID NO: 238); VH3-53 (SEQ ID NO: 213)/VK3-15 (SEQ ID NO: 238); VH3-53 (SEQ ID NO: 213)/VL2-11 (SEQ ID NO: 253); VH3-74 (SEQ ID NO: 214)/VK1-05 (SEQ ID NO: 230); VH3-74 (SEQ ID NO: 214)/VK1-06 (SEQ ID NO: 231); VH3-74 (SEQ ID NO: 214)/VK1-12 (SEQ ID NO: 233); VH3-74 (SEQ ID NO: 214)/VK3-20 (SEQ ID NO: 239); VH5-51 (SEQ ID NO: 215)/VK1-39 (SEQ ID NO: 236); VH5-51 (SEQ ID NO: 215)/VL1-40 (SEQ ID NO: 250); VH5-51 (SEQ ID NO: 215)/VL1-51 (SEQ ID NO: 252); VH6-1 (SEQ ID NO: 216)/VK1-09 (SEQ ID NO: 232); VH6-1 (SEQ ID NO: 216)/VK3-20 (SEQ ID NO: 239) 및 VH6-1 (SEQ ID NO: 216)/VL1-51 (SEQ ID NO: 252)을 포함한다.
추가적인 구현예에서, 쌍 자체가 각 기준 내의 임계치 전부를 충족하지 못했다 하더라도, 쌍을 집합에 추가하였고, 다양성을 향상시키기 위하여 집합에 추가하였다. 일 구현예에서, 집합은 VH3-23 (SEQ ID NO: 211)/VK1-39 (SEQ ID NO: 236); VH3-23 (SEQ ID NO: 211)/VL2-23 (SEQ ID NO: 255); 및 VH3-23 (SEQ ID NO: 211)/VL3-1 (SEQ ID NO: 256)을 더 포함한다. 이러한 구현예에서, 집합은 (36개 쌍) VH1-18 (SEQ ID NO: 204)/VK3-20 (SEQ ID NO: 239); VH1-46 (SEQ ID NO: 205)/VK3-15 (SEQ ID NO: 238); VH1-46 (SEQ ID NO: 205)/VL1-51 (SEQ ID NO: 252); VH1-69*01 (SEQ ID NO: 206)/VL1-51 (SEQ ID NO: 252); VH3-07 (SEQ ID NO: 207)/VK1-12 (SEQ ID NO: 233); VH3-07 (SEQ ID NO: 207)/VK1-27 (SEQ ID NO: 235); VH3-07 (SEQ ID NO: 207)/VK3-15 (SEQ ID NO: 238); VH3-07 (SEQ ID NO: 207)/VL1-47 (SEQ ID NO: 251); VH3-07 (SEQ ID NO: 207)/VL1-51 (SEQ ID NO: 252); VH3-11 (SEQ ID NO: 208)/VL1-40 (SEQ ID NO: 250); VH3-11 (SEQ ID NO: 208)/VL1-47 (SEQ ID NO: 251); VH3-11 (SEQ ID NO: 208)/VL1-51 (SEQ ID NO: 252); VH3-11 (SEQ ID NO: 208)/VL2-23 (SEQ ID NO: 255); VH3-15 (SEQ ID NO: 209)/VK1-05 (SEQ ID NO: 230); VH3-15 (SEQ ID NO: 209)/VK1-06 (SEQ ID NO: 231); VH3-15 (SEQ ID NO: 209)/VK1-12 (SEQ ID NO: 233); VH3-15 (SEQ ID NO: 209)/VK1-27 (SEQ ID NO: 235); VH3-15 (SEQ ID NO: 209)/VK3-11 (SEQ ID NO: 237); VH3-15 (SEQ ID NO: 209)/VL1-51 (SEQ ID NO: 252); VH3-21 (SEQ ID NO: 210)/VK1-12 (SEQ ID NO: 233); VH3-23 (SEQ ID NO: 211)/VK1-39 (SEQ ID NO: 236); VH3-23 (SEQ ID NO: 211)/VK3-15 (SEQ ID NO: 238); VH3-23 (SEQ ID NO: 211)/VL2-23 (SEQ ID NO: 255); VH3-23 (SEQ ID NO: 211)/VL3-1 (SEQ ID NO: 256); VH3-53 (SEQ ID NO: 213)/VK3-15 (SEQ ID NO: 238); VH3-53 (SEQ ID NO: 213)/VL2-11 (SEQ ID NO: 253); VH3-74 (SEQ ID NO: 214)/VK1-05 (SEQ ID NO: 230); VH3-74 (SEQ ID NO: 214)/VK1-06 (SEQ ID NO: 231); VH3-74 (SEQ ID NO: 214)/VK1-12 (SEQ ID NO: 233); VH3-74 (SEQ ID NO: 214)/VK3-20 (SEQ ID NO: 239); VH5-51 (SEQ ID NO: 215)/VK1-39 (SEQ ID NO: 236); VH5-51 (SEQ ID NO: 215)/VL1-40 (SEQ ID NO: 250); VH5-51 (SEQ ID NO: 215)/VL1-51 (SEQ ID NO: 252); VH6-1 (SEQ ID NO: 216)/VK1-09 (SEQ ID NO: 232); VH6-1 (SEQ ID NO: 216)/VK3-20 (SEQ ID NO: 239) 및 VH6-1 (SEQ ID NO: 216)/VL1-51 (SEQ ID NO: 252)을 포함한다.
실시예
11: 집합의 베타 시험
집합 설계의 효율성을 확인하기 위하여, 하위 집합, 하나의 생식세포 단백질 쌍을 포함하는 각각, 또는 하위 집합의 풀(pool)을 생성하여, 항원에 대해 선별하였다. 그런 다음, Fab 포맷의 열 안정성, IgG1 포맷의 pI, Fab 및 IgG1 포맷의 발현 수율, IgG1 포맷의 열 안정성 및 SEC로 확인한 IgG1 포맷의 단량체 %와 같은 개발 가능성 특징들에 대해 Fab 및 IgG1 포맷에서 선택된 항체를 시험하였다. 또한, 일부 사례에서는, Fab 포맷의 항원에 대한 친화도를 확인하였다.
집합 생성
생식세포 단백질 쌍을 함유하는 하위 집합을 다음과 같이 합성하였다: 도 25 내지 도 33에 도시된 각각의 생식세포 단백질 서열로부터 FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3 영역을 GeneArt로 합성하였다(독일 레겐스부르크). VH는 NheI 및 SalI를 통해, VL은 NdeI 및 Acc65I를 통해 pJPd1 디스플레이 벡터 내로 클로닝하였다. 불변 FR4 영역을 포함하는 CDR-H3 카세트는 BssHII 및 XhoI를 통해, 5.5 x 105 내지 1.9 x 1019의 이론적 다양성으로 삽입되었다. CDR-H3 길이가 6~17개 아미노산인 CDR-H3 카세트를 Sloning(독일 마틴스리드)으로 합성하였다. 4.6 x 106 내지 2.5 x 109의 이론적 다양성을 나타내는, ELLA Biotech(독일 마틴스리드)로 합성된 카파 또는 람다 TRIM 카세트를 도입하여 CDR-L3 다양성을 달성하였다.
전형적으로 하위 집합의 0.25 내지 2μg의 pJPd1 파지플라스미드 복합체 DNA를 대장균 MC1061 F’전기활성화(electrocompetent) 세포 내에 형질전환시키고, 형질전환체를 TB 배지에 모아, 37℃에서 1시간 동안 진탕시켰다. 생장 배지 희석액을 LB/Cam/Gluc 상에 도포하였다. 라이브러리 증폭은 적당량의 LB/cam/1% Glu에서 o/n을 진탕하여 라이브러리를 증폭시켰다. 하위 집합의 라이브러리 크기는 4.6 x 108 내지 4.4 x 109의 범위였다. 모든 하위 집합을 합한 전체 라이브러리 크기는 대략 1.3 x 1011개의 구성원에 달한다. 조작된 하위 집합의 품질을 분석하기 위하여, 각 하위 집합에 대해 적어도 30개의 클론을 택하여, CDR-L3 영역과 CDR-H3 영역을 시퀀싱하여, 서열의 정확도와 독특성을 확인하였다. 대장균 글리세롤 배양물로서 라이브러리를 저장하였다.
Fab 포맷의 파지 디스플레이 하위 집합을 다음과 같이 준비하였다. 각각의 라이브러리 파지 제조물의 경우, 80mL의 2x YT/Cam/Glc 배지에 해당하는 라이브러리 글리세롤 스톡으로부터 세균을 접종하여, 0.2 ~ 0.3의 OD600nm가 되게 하였다. 0.45 ~ 0.55의 OD600nm이 될 때까지 배양물을 진탕하였다. 그런 다음, 보조 파지를 세균 배양물에 10의 감염다중도로 첨가한 후, 진탕하지 않고 37℃에서 45분 동안 배양한 다음, 120rpm으로 교반하면서 37℃에서 45분 동안 진탕하였다. 세균을 원심분리하고, 상층액을 함유하는 보조 파지를 제거하였다. 파지 감염된 세균을 400mL의 2x YT/CAM/KAN/IPTG 배지에 재현탁시키고, 120rpm으로 진탕하면서 22℃에서 밤새 배양하였다. 다음날, 밤새 배양한 배양물로부터 세균을 펠릿화하고, Fab 제시 파지를 함유하는 상층액을 수집하였다. 파지를 함유하는 상층액에 PEG/NaCl을 첨가하여 파지를 침전시켰다. 시료를 얼음 위에서 적어도 30분 동안 배양하였다. 침전시킨 파지를 원심분리하고, PBS에 재현탁시켰다. 시료를 천천히 회전시켜 균일한 현탁액을 얻고, 나머지 세균 잔유물을 펠릿화하여 제거하였다. 파지를 함유하는 상층액으로부터 PEG/NaCl를 이용하여 파지를 다시 침전시켰다. 마지막으로, 파지 펠릿을 PBS에 재현탁시키고, 멸균 튜브에 옮겨, 천천히 진탕하여 균일한 현탁액을 얻었다. 스팟 적정(spot titration), ELISA 및 OD268nm에서의 UV 흡광도(Nanodrop)에 의해 파지 역가를 확인하였다.
각각의 개별 파지 제조물에 대해 (전체가 참조로 통합된, 제WO01/05950호, 제US 6,753,136호에 기술된 바와 같이) 트리시스트로닉 디스플레이 벡터 pJPd1(도 9에 도시)에 의해 발현되고, CysDisplay®에 의해 파지 상에 제시된 Fab 단편의 파지 역가 및 디스플레이 수준을 ELISA에 의해 평가하였다.
두 가지 상이한 항체가 포획에 이용되었다:
(1) 항-M13 항체(Amersham #27-9420-01)가 주 코팅 단백질 g8p를 통해 파지 입자를 포획하므로 이를 이용하였으며, 따라서, 파지 역가를 결정할 수 있다.
(2) 항-Fd 항체(결합 부위 #PC075)가 이용되었고, 이는 디스플레이된 Fab에 결합한다. 따라서, 파지 디스플레이 Fab만이 포획된다.
(1) 및 (2)에 대해, 별도의 기준 곡선이 이용된다. HRP에 콘쥬게이트된 단일클론성 항-M13(M13 파지의 주 코팅 단백질인 g8p를 대상으로 함)을 검출 항체로 이용하였다.
항-M13 항체에 대하여, 그리고 항-Fd 항체에 대하여 항체 용액을 상이한 웰 내로 분주하고, 플레이트를 적층 호일로 밀봉하고, 밤새 배양하여, 각각의 포획 항체를 96웰 MaxisorpTM 플레이트 상에 고정시켰다. 다음날, 플레이트를 TBST로 세척하고, 각 웰을 CTBST로 블로킹하였다.
파지 상층액과 기준 시료(CS)의 출발 희석액을 마이크로티터 플레이트 내의 CTBST에 준비하였다. 항-M13 및 항-Fd 항체에 대한 파지 상층액의 출발 희석액을 준비하였다. 기준 시료, VH3-23 HuCAL Gold® l+k VCSM13 및 HuCAL PLATINUM 풀(pooled) 하이퍼파지 카파 및 람다의 출발 희석액을 준비하였다. 마이크로티터 플레이트를 CTBST로 미리 채우고, 파지를 첨가하고, 제2의 마이크로티터 플레이트를 CTBST로 미리 채우고, 파지를 첨가하여, 파지 상층액의 계열 희석액을 준비하였다. 기준 시료를 위해, 위에서 기술한 출발 희석액을 도포하고, 항-M13 및 항-Fd 항체 양자의 계열 희석액을 도포하였다.
파지 상층액과 기준 시료를 다음과 같이 검출을 위해 옮겼다. 블로킹된 ELISA 플레이트를 TBST로 세척하였다. 파지 상층액을 희석 플레이트로부터 코팅된 ELISA 플레이트로 옮기고, 실온에서 배양한 후, TBST로 세척하였다. CTBST에 희석시킨 항-M13 페록시다아제 콘쥬게이트(Amersham)를 첨가하여, 실온에서 1~2시간 동안 배양하였다. 과산화물 용액 1부분(예컨대, 0.5mL)과 기질 용액 9부분(예컨대, 4.5mL)을 혼합하여 Quanta Blu(Pierce) 실험 용액을 제조했다. ELISA 플레이트를 TBST로 세척하고, Quanta Blu 실험 용액을 첨가하였다. 약 2분의 배양시간 경과 후, 형광을 측정하였고(여기: 320 nm, 방출: 430nm), 5분 간격으로 형광을 측정했다. ELISA 데이터의 평가를 다음과 같이 완료하였다: 검정 곡선을 생성하고, 파지 상층액 및 대조군의 역가를 계산했다. 각각의 시료에 대하여, 항-Fd 상의 역가를 항-M13(항-pVIII) 상의 역가로 나누었으며, 그 결과로 얻어지는 비율이 상대적인 디스플레이 비율이다. 결과를 표 13에 나타내었다.
표 13
인간
DKK3
,
rhErbB4
/
Her4
_
Fc
융합,
rhFZD
-4
Fc
융합 및
eGFP
에 대한 파지 디스플레이 선별
원하는 생물 물리학적 특징이 있는 다양한 결합 항체를 동정할 가능성을 최대화하기 위하여, 개별 하위 집합 또는 하위 집합 풀(pool)을 이용한 병행 패닝(panning) 전략을 수행하였다. 인간 Dickkopf- 3(DKK3) (유전자 ID 27122), 재조합 인간 (rh)ErbB4/Her4 (유전자 ID 2066)_Fc 융합 단백질, rhFZD-4 (유전자 ID 8322) Fc 융합 및 eGFP(강화된 녹색 형광 단백질; 서열은 위에서 제공됨)를 집합의 타당성 검증을 위한 모델 항원으로 선택하였다. 집합 스크리닝은 아래에 기술한, 자기 Dynabeads(R)(Dynal/Invitrogen Prod. no. 140.11)에 공유적으로 결합된 각각의 항원을 이용한, M-450 에폭시 구슬을 기반으로 한 용액 패닝으로 이루어졌다.
DKK3
에 대한 구슬 기반의 용액
패닝
DKK3 및 대조군인 BSA 코팅된 카르복시 구슬(Dynal)을 미리 흡착된 파지와 함께 배양하기 전에 실온(RT)에서 MPBST로 블로킹하였다. 몇 차례 세척 단계 후, 결합된 파지를 용출시키고, 다음 선별 차례를 위해 TG1F+ 세포를 감염시켜 증폭시켰다. 세 차례의 선별 후, pJPd1(도 9에 도시) 파지플라스미드 복합체 DNA를 분리하고, Fab를 암호화하는 단편(변형된 ompA-VL과 변형된 phoA-Fd)을 XbaI와 EcoRI로 제한효소 분해시키고, 발현 벡터 pJPx1(도 10에 도시)에 연결하고, 대장균 TG1 F- 내로 형질전환시켰다. 그런 다음, 감염된 배양물을 대형 LB/Cam/Gluc 플레이트 상에 도포하고, 밤새 성장시켰다. 단일 클론을 분리하여, Fab 발현 수율과 항원 결합을 ELISA에 의해 시험하였다. Fab를 함유하는 세포 추출물을 양 항-인간 Fd(The Binding Site Cat. PC075)가 코팅된 ELISA 플레이트 상에 배양한 다음, 알칼리 포스파타아제(AP)가 콘쥬게이트된 특이적인 항체인 염소 항-인간 IgG F(ab')2 단편(Jackson Cat. 109 055 097)으로 검출하여, Fab 발현을 검출하였다. 항원 특이성은 Fab를 함유하는 세포 추출물을 DKK3가 결합된 카르복시 구슬 및 BSA가 결합된 카르복시 구슬(Dynal) 위에서 구슬 기반 분석법을 위한 형광분석 마이크로볼륨 분석 기술(FMAT®)(Applied Biosystems 8200 Cellular Detection System / PE Biosystems)로 스크리닝하여 시험하였다. 1차 적중은 200이라는 값으로 설정된 배경보다 적어도 다섯 배의 FMAT 평균 형광 신호를 가져오는 Fab로 정의된다. DKK3에 대한 특이성은 DKK3를 동족 항원으로, CD38_Fc를 음성 대조군 항원으로 한 2차 ELISA에서 확인하였다. DKK3 결합 항체의 서열 다양성을 추정하기 위하여, VH3-23/VK1-39, VH3-23/VL3-1 및 HuCAL Platinum® VH3-23/카파 하위 라이브러리에 대한 63개, 43개 및 44개 클론의 중쇄 및 경쇄 CDR3 영역을 시퀀싱을 위해 선택하였다. 선택된 바인더의 CDR-H3와 CDR-L3의 서열을 도 86에 도시하였다. 모두 합하여, VH3-23/VK1-39, VH3-23/VL3-1 및 HuCAL-Pt VH3-23/카파 하위 라이브러리에 대해 56개의 성공적인 서열 가운데 31개(55%), 35개 서열 가운데 20개(47%), 그리고 44개 서열 가운데 17개(39%)가 각각 상이했으며, 이는 구축된 라이브러리가 다양한 DKK3 바인더의 레퍼토리를 함유하였음을 보여준다. 결과를 표 14에 나타내었다.
표 14
I8은 VH3-23/VK1-39를 나타내고, I19는 VH3-23/VL3-1를 나타낸다.
rhErbB4
/
Her4
_
Fc
융합,
rhFZD
-4
Fc
융합 및
eGFP
에 대한 구슬 기반 용액
패닝
rhErbB4/Her4_Fc 융합, rhFZD-4 Fc 융합 또는 eGFP 및 대조군인 BSA 에폭시 M450-구슬(Dynal)을 미리 흡착된 파지와 함께 실온에서 2시간 배양하기 전에 실온(RT)에서 2시간 동안 Chemiblocker로 블로킹하였다. 몇 차례 세척 단계 후, 결합된 파지를 용출시키고, 다음 선별 차례를 위해 TG1F+ 세포를 감염시켜 증폭시켰다. 세 차례의 선별 후, pJPd1(도 9에 도시) 파지플라스미드 복합체 DNA를 분리하고, Fab를 암호화하는 단편(변형된 ompA-VL과 변형된 phoA-Fd)을 PCR로 증폭시키고, 정제하여, XbaI와 EcoRI로 제한효소 분해시키고, 발현 벡터 pJPx1(도 10에 도시)에 연결하고, 대장균 TG1 F- 내로 형질전환시켰다. 그런 다음, 감염된 배양물을 대형 LB/Cam/Gluc 플레이트 상에 도포하고, 밤새 성장시켰다. 단일 클론을 분리하여, Fab 발현 수율과 항원 결합을 ELISA에 의해 시험하였다. Fab를 함유하는 세포 추출물을 양 항-인간 Fd(The Binding Site Cat. PC075)가 코팅된 ELISA 플레이트 상에 배양한 다음, 알칼리 포스파타아제(AP)가 콘쥬게이트된 특이적인 항체인 염소 항-인간 IgG F(ab')2 단편(Jackson Cat. 109 055 097)으로 검출하여, Fab 발현을 검출하였다. MaxiSorp 플레이트 상에 직접적으로 코팅된 rhErbB4/Her4_Fc 항원, rhFZD-4_Fc 항원 또는 eGFP에 대하여 Fab를 함유하는 세포 추출물을 이용한 ELISA 스크리닝으로 항원 특이성을 시험하였다. 1차 적중은 배경보다 적어도 다섯 배의 ELISA 신호를 가져오는 Fab로 정의된다. 결과를 도 61a 내지 도 61d에 나타내었다.
ErbB4
/
Her4
_
Fc
에 대한
Fc
-포획
패닝
Maxisorp 플레이트(Nunc) 상의 염소 항 인간-IgG Fc 특이적 항체(Jackson; Cat. 109-005-098) 또는 마우스 항 인간-IgG Fc 특이적 항체(Jackson; Cat. 209-005-098)로 포획하여 고정시킨 인간 ErbB4/Her4 재조합 Fc-태그 단백질을 이용하여, 세 차례의 고체상 Fc-포획 패닝을 수행하였다. 각 선별 차례 전에, 파지를 MPBST/BSA에 용해시킨 0.1mg/mL의 인간, 염소 및 마우스 면역글로불린으로 블로킹하였다. 몇 차례 세척 단계 후, 결합된 파지를 용출시키고, 다음 선별 차례를 위해 TG1F+ 세포를 감염시켜 증폭시켰다. 3회차 선별 후, pJPd1(도 9에 도시) 파지플라스미드 복합체 DNA를 분리하고, Fab를 암호화하는 단편(변형된 ompA-VL과 변형된 phoA-Fd)을 XbaI와 EcoRI로 제한효소 분해시키고, 발현 벡터 pJPx1(도 10에 도시)에 연결하고, TG1 F- 내로 형질전환시켰다. 그런 다음, 감염된 배양물을 대형 LB/Cam/Gluc 플레이트 상에 도포하고, 밤새 성장시켰다. 단일 클론을 분리하여, Fab 발현 수율과 항원 결합을 ELISA에 의해 시험하였다. Fab를 함유하는 세포 추출물을 양 항-인간 Fd(The Binding Site Cat. PC075)가 코팅된 ELISA 플레이트 상에 배양한 다음, 알칼리 포스파타아제(AP)가 콘쥬게이트된 특이적인 항체인 염소 항-인간 IgG F(ab')2 단편(Jackson Cat. 109 055 097)으로 검출하여, Fab 발현을 검출하였다. MaxiSorp 플레이트 상에 코팅된 염소 항-인간 IgG 항체(Jackson; Cat. 109-005-098)를 통해 포획한 ErbB4/Her4_Fc 항원에 대하여 Fab를 함유하는 세포 추출물을 이용한 ELISA 스크리닝으로 항원 특이성을 시험하였다. 1차 적중은 배경보다 적어도 다섯 배의 ELISA 신호를 가져오는 Fab로 정의된다. ErbB4/Her4_Fc에 대한 특이성은 ErbB4/Her4_Fc를 동족 항원으로, CD38_Fc를 음성 대조군 항원으로 한 2차 Fc-포획 ELISA에서 확인하였다.
ErbB4/Her4_Fc 결합 항체의 서열 다양성을 추정하기 위하여, VH3-23/VK1-39, VH3-23/VL3-1 및 HuCAL Pt VH3-23/카파 하위 라이브러리에 대한 각각 112개, 61개 및 95개 클론의 중쇄 및 경쇄 CDR3 영역을 시퀀싱하였다. 모두 합하여, VH3-23/VK1-39, VH3-23/VL3-1 및 HuCAL-Pt VH3-23/카파 하위 라이브러리에 대해 106개의 성공적인 서열 가운데 31개(29%), 61개 서열 가운데 30개(49%), 그리고 91개 서열 가운데 14개(15%)가 상이했으며, 이는 구축된 라이브러리가 다양한 바인더 레퍼토리를 함유하였음을 보여준다. 서열 다양성 결과를 표 15에 나타내었다.
표 15
* 적중은 배경(Bg)보다 적어도 5배 활성을 나타내는 것으로 정의된다.
** 압축 플레이트(CP)의 경우, 배경(Bg)보다 오로지 2배 더 활성을 나타낸 소수의 클론을 선택하였다.
*** 분석 가능한 서열당 고유 서열.
I8은 VH3-23/VK1-39를 나타내고, I19는 VH3-23/VL3-1를 나타낸다.
Fab
포맷의 항원 포획 장치를 통한
Biacore
KD
(친화도) 확인
포획된 항원에 대한 단량체 Fab 분획의 결합(분석적 SEC에 의해 분석; Superdex75, Amersham Pharmacia)을 다음과 같이 분석하였다. EDC/NHS 화학을 이용하여, CM5 칩(Biacore/ GE Healthcare) 상에 적당한 항-항원 태그 포획 항체를 공유적으로 고정시켰다. 항원을 포획하고, 이어서 여섯 개의 상이한 농도의 Fab(2차 계단 희석)를 주입하여 운동(kinetic)을 측정하였다. 각 사이클 후, 센서 칩을 재생시켰다. 전개 완충액을 블랭크(blank) 주입한 것을 이중 참조에 이용하였다. kon 및 koff 속도 상수를 결정하기 위하여, BIA 평가 소프트웨어 3.2(Biacore/ GE Healthcare)를 이용하여 모든 센서그램을 맞추었으며, kon 및 koff 속도 상수는 KD를 계산하는 데 이용하였다.
Biacore KD는 다음과 같이 결정하였다. 전개 완충액은 PBST(인산 완충 식염수 pH 7.2 GIBCO + 0.05% Tween-20). 항-인간 Fc 항체(Biacore/ GE Healthcare)를 이용하여, Fc 융합 태그(로트# FYY0310041)가 있는 항원을 대략 400RU 포획하였다. 20㎕/min의 유속, 30초의 주입 시간 및 100초의 해리 시간과 함께, 15.6 내지 500nM 농도 범위의 Fab를 이용하였다. 표면은 3M MgCl2 시약을 15㎕씩 2회 주입하여 재생시켰다. 결과는 도 38에 도시하였다.
DKK3
,
rhErbB4
/
Her4
_
Fc
융합,
rhFZD
-4
Fc
융합 및
eGFP
에 대해 확인한 항체 및 항체 단편의 개발 가능성 시험
항원에 대해 특이적인 항체 또는 단편을 Fab 및 IgG1 포맷에서 Fab 포맷의 열 안정성, Fab 포맷의 친화도, IgG1 포맷의 pI, Fab 및 IgG 포맷의 발현 수율, IgG1 포맷의 열 안정성 및 SEC로 확인한 IgG1 포맷의 단량체 %와 같은 개발 가능성 특징에 대해 시험하였다. IgG1 포맷의 혈청 내 안정성은 실시예 7.2에서 기술한 바와 같이 시험하였다. Fab 및 IgG1 포맷의 열 안정성 시험은 실시예 9.1.2 및 실시예 9.2.2에 기술한 바와 같이 완료하였다. IgG1 포맷의 pI는 실시예 9.2.4에 기술한 바와 같이 완료하였다. IgG1 포맷의 발현 수율은 실시예 9.2.1에 기술한 바와 같이 완료하였다. SEC로 확인한 IgG1 포맷의 단량체 %는 실시예 9.2.3에 기술한 바와 같이 완료하였다. 결과를 도 37 내지 도 39, 도 45 내지 도 48 및 도 62에 도시하였다.
다시, 본 발명자들은 시험했던 기능적 특성과 관련하여, 투입물(항원에 대한 선별에 이용된 항체 집합)과 결과물(항원에 대해 특이적이라고 확인된 항체) 사이에 높은 관련성이 있다고 믿는다. 따라서, 본 발명의 집합은, 부분적으로는, 시험했던 구조체와 동일한 아미노산 서열, 예를 들어, 기본틀 영역 및/또는 상보성 결정 영역을 포함하는 항체 또는 단편을 포함한다. CDR3는 다양화된 것이다. 일 양태에서, 집합은 시험했던 구조체의 아미노산 서열, 또는 그것들을 암호화하는 핵산들을 포함하므로, 집합이, 실시예 9에서 시험했던 구조체와 동일한, 개발 가능성과 관련된 우수한 기능적 특성을 가지고 있는 항체 또는 단편을 포함한다고 여겨진다. 따라서, 항원에 대해, 이후에 선택된 여러 항체 또는 단편은 또한 개발 가능성과 관련된 동일한, 우수한 기능적 특성을 가지리라고 예측된다.
도 37 내지 도 39, 도 45 내지 도 48 및 도 62a 내지 도 62c에 도시된 데이터는 이러한 결론을 뒷받침한다. 도 39는 본 발명의 집합으로부터의 DKK3 또는 ErbB4/Her4_Fc 항원에 대해 선택된 Fab와 이들 Fab가 실시예 9에서 기술한 바와 같이, 본래 시험했던 구조체였던 대조군과 어떻게 비슷한 열 안정성을 나타내는지를 보여준다. 또한, 도 45 내지 도 48은 본 발명의 집합으로부터의 선택된, DKK3 또는 ErbB4/Her4_Fc 항원에 대해 특이적인 IgG와 이들 IgG가 실시예 9에서 기술한 바와 같이, 본래 시험했던 구조체였던 대조군과 어떻게 비슷한 등전점(pI), 열 안정성, 발현 수율 및 단량체 함량을 나타내는지를 보여준다. 도 62a 내지 도 62c는 rhErbB4/Her4_Fc 융합, rhFZD-4 Fc 융합 및 eGFP에 대해 선택된 IgG와 이들 IgG가 실시예 9에서 기술한 바와 같이, 본래 시험했던 구조체였던 대조군과 어떻게 비슷한 등전점(pI), 발현 수율, 열 안정성 및 단량체 함량을 나타내는지를 보여준다.
전반적으로, 이는 본 발명의 집합이 개발 가능성과 관련된 우수한 특성을 가지고 있는 항체 또는 단편을 함유함을 보여주고, 투입물이, 즉, 서열을 이용하는 집합, 예를 들어, 시험을 통해 우수한 기능적 특성을 가지고 있음을 보여준 생식세포 단백질 쌍으로부터의 기본틀 영역 및/또는 상보성 결정 영역과 같은 서열을 이용하는 집합이, 결과물, 즉, 임의의 항원에 대해 개발과 관련하여, 동일한 우수한 기능적 특성을 가지고 있는, 선택된 항체 또는 단편과 매우 관련성이 높다는 본 발명자들의 가설을 뒷받침한다.
발명의 상세한 설명, 구체적인 실시예 및 데이터는 예시적인 구현예를 나타내는 것으로, 본보기로 주어진 것이지 본 발명을 제한하고자 의도된 것이 아니라는 점을 이해해야 한다. 본 발명 내의 다양한 변화 및 변형은 본원에 포함된 논의, 개시 및 데이터로부터 당업자에게 자명할 것이며, 따라서 본 발명의 일부분으로 간주된다.
SEQUENCE LISTING
<110> MorphoSys AG
URLINGER, STEFANIE
TILLER, THOMAS
SHUSTER, INGRID
STARK, YVONNE
<120> A COLLECTION AND METHODS FOR ITS USE
<130> MS130
<150> US 61/415,367
<151> 2010-11-19
<150> EP 10191910.8
<151> 2010-11-19
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<151> 2011-06-08
<160> 315
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 11
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 1
Trp Gly Gly Asp Gly Phe Tyr Ala Met Asp Tyr
1 5 10
<210> 2
<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 2
Gln Gln His Tyr Thr Thr Pro Pro Thr
1 5
<210> 3
<211> 11
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 3
Gln Ser Tyr Asp Ser Ser Leu Ser Gly Val Val
1 5 10
<210> 4
<211> 15
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 4
Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
1 5 10 15
<210> 5
<211> 12
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 5
Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
1 5 10
<210> 6
<211> 12
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 6
Val Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
1 5 10
<210> 7
<211> 63
<212> DNA
<213> Escherichia coli
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(63)
<400> 7
atg aaa cag agc acc att gcc ctg gcc ctg ctg ccg ctg ctg ttt acc 48
Met Lys Gln Ser Thr Ile Ala Leu Ala Leu Leu Pro Leu Leu Phe Thr
1 5 10 15
cca gtg acc aaa gcc 63
Pro Val Thr Lys Ala
20
<210> 8
<211> 21
<212> PRT
<213> Escherichia coli
<400> 8
Met Lys Gln Ser Thr Ile Ala Leu Ala Leu Leu Pro Leu Leu Phe Thr
1 5 10 15
Pro Val Thr Lys Ala
20
<210> 9
<211> 63
<212> DNA
<213> Escherichia coli
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(63)
<400> 9
atg aaa cag agc acc att gcc ctg gcc ctg ctg ccg ctg ctg ttt acc 48
Met Lys Gln Ser Thr Ile Ala Leu Ala Leu Leu Pro Leu Leu Phe Thr
1 5 10 15
cca gtg gtg cta gcc 63
Pro Val Val Leu Ala
20
<210> 10
<211> 21
<212> PRT
<213> Escherichia coli
<400> 10
Met Lys Gln Ser Thr Ile Ala Leu Ala Leu Leu Pro Leu Leu Phe Thr
1 5 10 15
Pro Val Val Leu Ala
20
<210> 11
<211> 63
<212> DNA
<213> Escherichia coli
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(63)
<400> 11
atg aaa aaa acc gcc att gcc att gcc gtg gcc ctg gca ggc ttt gcc 48
Met Lys Lys Thr Ala Ile Ala Ile Ala Val Ala Leu Ala Gly Phe Ala
1 5 10 15
acc gtg gcg cag gcc 63
Thr Val Ala Gln Ala
20
<210> 12
<211> 21
<212> PRT
<213> Escherichia coli
<400> 12
Met Lys Lys Thr Ala Ile Ala Ile Ala Val Ala Leu Ala Gly Phe Ala
1 5 10 15
Thr Val Ala Gln Ala
20
<210> 13
<211> 63
<212> DNA
<213> Escherichia coli
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(63)
<400> 13
atg aaa aaa acc gcc att gcc att gcc gtg gcc ctg gca ggc ttt gcc 48
Met Lys Lys Thr Ala Ile Ala Ile Ala Val Ala Leu Ala Gly Phe Ala
1 5 10 15
acc gtg gca tat gcc 63
Thr Val Ala Tyr Ala
20
<210> 14
<211> 21
<212> PRT
<213> Escherichia coli
<400> 14
Met Lys Lys Thr Ala Ile Ala Ile Ala Val Ala Leu Ala Gly Phe Ala
1 5 10 15
Thr Val Ala Tyr Ala
20
<210> 15
<211> 63
<212> DNA
<213> Escherichia coli
<400> 15
atgaaaaaaa ccgccattgc cattgccgtg gccctggcag gctttgccac cgtggcatat 60
gcg 63
<210> 16
<211> 57
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(57)
<400> 16
atg aaa cac ctg tgg ttc ttc ctc ctg ctg gtg gca gct ccc aga tgg 48
Met Lys His Leu Trp Phe Phe Leu Leu Leu Val Ala Ala Pro Arg Trp
1 5 10 15
gtc ctg tcc 57
Val Leu Ser
<210> 17
<211> 19
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 17
Met Lys His Leu Trp Phe Phe Leu Leu Leu Val Ala Ala Pro Arg Trp
1 5 10 15
Val Leu Ser
<210> 18
<211> 57
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(57)
<400> 18
atg aag cac ctg tgg ttc ttt ctg ctg ctg gtg gcc gct ccc cgg tgg 48
Met Lys His Leu Trp Phe Phe Leu Leu Leu Val Ala Ala Pro Arg Trp
1 5 10 15
gtg cta gcc 57
Val Leu Ala
<210> 19
<211> 19
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 19
Met Lys His Leu Trp Phe Phe Leu Leu Leu Val Ala Ala Pro Arg Trp
1 5 10 15
Val Leu Ala
<210> 20
<211> 60
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(60)
<400> 20
atg gtg ttg cag acc cag gtc ttc att tct ctg ttg ctc tgg atc tct 48
Met Val Leu Gln Thr Gln Val Phe Ile Ser Leu Leu Leu Trp Ile Ser
1 5 10 15
ggt gcc tac ggg 60
Gly Ala Tyr Gly
20
<210> 21
<211> 20
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 21
Met Val Leu Gln Thr Gln Val Phe Ile Ser Leu Leu Leu Trp Ile Ser
1 5 10 15
Gly Ala Tyr Gly
20
<210> 22
<211> 60
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(60)
<400> 22
atg gtg ctc cag acc cag gtg ttc atc agc ctg ctg ctg tgg atc agc 48
Met Val Leu Gln Thr Gln Val Phe Ile Ser Leu Leu Leu Trp Ile Ser
1 5 10 15
ggc gca tat gcg 60
Gly Ala Tyr Ala
20
<210> 23
<211> 20
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 23
Met Val Leu Gln Thr Gln Val Phe Ile Ser Leu Leu Leu Trp Ile Ser
1 5 10 15
Gly Ala Tyr Ala
20
<210> 24
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
primer
<400> 24
acaggtgccc actcccaggt gcag 24
<210> 25
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
primer
<400> 25
aaggtgtcca gtgtgargtg cag 23
<210> 26
<211> 27
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
primer
<400> 26
cccagatggg tcctgtccca ggtgcag 27
<210> 27
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
primer
<400> 27
caaggagtct gttccgaggt gcag 24
<210> 28
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
primer
<400> 28
gggaattctc acaggagacg a 21
<210> 29
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
primer
<400> 29
ggaaggtgtg cacgccgctg gtc 23
<210> 30
<211> 38
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
primer
<400> 30
ctgcaaccgg tgtacattcc caggtgcagc tggtgcag 38
<210> 31
<211> 38
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
primer
<400> 31
ctgcaaccgg tgtacattcc gaggtgcagc tggtgcag 38
<210> 32
<211> 38
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
primer
<400> 32
ctgcaaccgg tgtacattct gaggtgcagc tggtggag 38
<210> 33
<211> 38
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
primer
<400> 33
ctgcaaccgg tgtacattct gaggtgcagc tgttggag 38
<210> 34
<211> 38
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
primer
<400> 34
ctgcaaccgg tgtacattcc caggtgcagc tgcaggag 38
<210> 35
<211> 40
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
primer
<400> 35
ctgcaaccgg tgtacattcc caggtgcagc tacagcagtg 40
<210> 36
<211> 32
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
primer
<400> 36
tgcgaagtcg acgctgagga gacggtgacc ag 32
<210> 37
<211> 34
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
primer
<400> 37
tgcgaagtcg acgctgaaga gacggtgacc attg 34
<210> 38
<211> 33
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
primer
<400> 38
tgcgaagtcg acgctgagga gacggtgacc gtg 33
<210> 39
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
primer
<400> 39
gttcggggaa gtagtccttg ac 22
<210> 40
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
primer
<400> 40
atgaggstcc cygctcagct gctgg 25
<210> 41
<211> 28
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
primer
<400> 41
ctcttcctcc tgctactctg gctcccag 28
<210> 42
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
primer
<400> 42
atttctctgt tgctctggat ctctg 25
<210> 43
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
primer
<400> 43
gtttctcgta gtctgctttg ctca 24
<210> 44
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
primer
<400> 44
atgacccagw ctccabycwc cctg 24
<210> 45
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
primer
<400> 45
gtgctgtcct tgctgtcctg ct 22
<210> 46
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
primer
<400> 46
ggtcctgggc ccagtctgtg ctg 23
<210> 47
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
primer
<400> 47
ggtcctgggc ccagtctgcc ctg 23
<210> 48
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
primer
<400> 48
gctctgtgac ctcctatgag ctg 23
<210> 49
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
primer
<400> 49
ggtctctctc scagcytgtg ctg 23
<210> 50
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
primer
<400> 50
gttcttgggc caattttatg ctg 23
<210> 51
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
primer
<400> 51
ggtccaattc ycaggctgtg gtg 23
<210> 52
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
primer
<400> 52
gagtggattc tcagactgtg gtg 23
<210> 53
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
primer
<400> 53
caccagtgtg gccttgttgg cttg 24
<210> 54
<211> 38
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
primer
<400> 54
ctgctaccgg ttcctgggcc cagtctgtgc tgackcag 38
<210> 55
<211> 38
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
primer
<400> 55
ctgctaccgg ttcctgggcc cagtctgccc tgactcag 38
<210> 56
<211> 38
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
primer
<400> 56
ctgctaccgg ttctgtgacc tcctatgagc tgacwcag 38
<210> 57
<211> 37
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
primer
<400> 57
ctgctaccgg ttctctctcs cagcytgtgc tgactca 37
<210> 58
<211> 38
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
primer
<400> 58
ctgctaccgg ttcttgggcc aattttatgc tgactcag 38
<210> 59
<211> 38
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
primer
<400> 59
ctgctaccgg ttccaattcy cagrctgtgg tgacycag 38
<210> 60
<211> 28
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
primer
<400> 60
ctcctcactc gagggyggga acagagtg 28
<210> 61
<211> 122
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 61
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Asn Ile Tyr Ser Asp Gly Ser Asn Thr Phe Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Asn Met Tyr Arg Trp Pro Phe His Tyr Phe Phe Asp Tyr Trp
100 105 110
Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 62
<211> 108
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 62
Asp Ile Glu Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ala Pro Gly Gln
1 5 10 15
Thr Ala Arg Ile Ser Cys Ser Gly Asp Asn Ile Gly Asn Lys Tyr Val
20 25 30
Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Val Val Ile Tyr
35 40 45
Gly Asp Asn Asn Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Gly Thr Gln Ala Glu
65 70 75 80
Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ser Ser Tyr Asp Ser Ser Tyr Phe Val
85 90 95
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gln
100 105
<210> 63
<211> 98
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 63
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Gly Tyr
20 25 30
Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Trp Ile Asn Pro Asn Ser Gly Gly Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg
<210> 64
<211> 98
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 64
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Arg Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Trp Ser Asn Ala Gly Asn Gly Asn Thr Lys Tyr Ser Gln Glu Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Arg Asp Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Met Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg
<210> 65
<211> 99
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 65
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Asp Ile Asn Trp Val Arg Gln Ala Thr Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Trp Met Asn Pro Asn Ser Gly Asn Thr Gly Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asn Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gly
<210> 66
<211> 98
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 66
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Gly Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Trp Ile Ser Ala Tyr Asn Gly Asn Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Leu
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Thr Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Arg Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg
<210> 67
<211> 98
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 67
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Val Ser Gly Tyr Thr Leu Thr Glu Leu
20 25 30
Ser Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Gly Phe Asp Pro Glu Asp Gly Glu Thr Ile Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Glu Asp Thr Ser Thr Asp Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Thr
<210> 68
<211> 98
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 68
Gln Met Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Thr Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Tyr Arg
20 25 30
Tyr Leu His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Ala Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Trp Ile Thr Pro Phe Asn Gly Asn Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Asp Arg Val Thr Ile Thr Arg Asp Arg Ser Met Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg
<210> 69
<211> 98
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 69
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Ile Ile Asn Pro Ser Gly Gly Ser Thr Ser Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg
<210> 70
<211> 98
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 70
Gln Met Gln Leu Val Gln Ser Gly Pro Glu Val Lys Lys Pro Gly Thr
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Phe Thr Phe Thr Ser Ser
20 25 30
Ala Met Gln Trp Val Arg Gln Ala Arg Gly Gln Arg Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Trp Ile Val Val Gly Ser Gly Asn Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Glu Arg Val Thr Ile Thr Arg Asp Met Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Ala
<210> 71
<211> 98
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 71
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Gly Ile Ile Pro Ile Phe Gly Thr Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg
<210> 72
<211> 98
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 72
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Gly Ile Ile Pro Ile Phe Gly Thr Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg
<210> 73
<211> 86
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 73
Lys Ser Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Ser Phe Ser Gly Phe Thr
1 5 10 15
Ile Thr Ser Tyr Gly Ile His Trp Val Gln Gln Ser Pro Gly Gln Gly
20 25 30
Leu Glu Trp Met Gly Trp Ile Asn Pro Gly Asn Gly Ser Pro Ser Tyr
35 40 45
Ala Lys Lys Phe Gln Gly Arg Phe Thr Met Thr Arg Asp Met Ser Thr
50 55 60
Thr Thr Ala Tyr Thr Asp Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Met Ala
65 70 75 80
Val Tyr Tyr Tyr Ala Arg
85
<210> 74
<211> 98
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 74
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Val Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr
20 25 30
Tyr Met His Trp Val Gln Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Leu Val Asp Pro Glu Asp Gly Glu Thr Ile Tyr Ala Glu Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Thr Asp Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Thr
<210> 75
<211> 100
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 75
Gln Ile Thr Leu Lys Glu Ser Gly Pro Thr Leu Val Lys Pro Thr Gln
1 5 10 15
Thr Leu Thr Leu Thr Cys Thr Phe Ser Gly Phe Ser Leu Ser Thr Ser
20 25 30
Gly Val Gly Val Gly Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Ala Leu Glu
35 40 45
Trp Leu Ala Leu Ile Tyr Trp Asn Asp Asp Lys Arg Tyr Ser Pro Ser
50 55 60
Leu Lys Ser Arg Leu Thr Ile Thr Lys Asp Thr Ser Lys Asn Gln Val
65 70 75 80
Val Leu Thr Met Thr Asn Met Asp Pro Val Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr
85 90 95
Cys Ala His Arg
100
<210> 76
<211> 100
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 76
Gln Val Thr Leu Lys Glu Ser Gly Pro Val Leu Val Lys Pro Thr Glu
1 5 10 15
Thr Leu Thr Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Ser Asn Ala
20 25 30
Arg Met Gly Val Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Ala Leu Glu
35 40 45
Trp Leu Ala His Ile Phe Ser Asn Asp Glu Lys Ser Tyr Ser Thr Ser
50 55 60
Leu Lys Ser Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser Lys Ser Gln Val
65 70 75 80
Val Leu Thr Met Thr Asn Met Asp Pro Val Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr
85 90 95
Cys Ala Arg Ile
100
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<211> 100
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 77
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1 5 10 15
Thr Leu Thr Leu Thr Cys Thr Phe Ser Gly Phe Ser Leu Ser Thr Ser
20 25 30
Gly Met Cys Val Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Ala Leu Glu
35 40 45
Trp Leu Ala Leu Ile Asp Trp Asp Asp Asp Lys Tyr Tyr Ser Thr Ser
50 55 60
Leu Lys Thr Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser Lys Asn Gln Val
65 70 75 80
Val Leu Thr Met Thr Asn Met Asp Pro Val Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr
85 90 95
Cys Ala Arg Ile
100
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<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 78
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Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Trp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
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50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg
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<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 79
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1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asp Asp Tyr
20 25 30
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35 40 45
Ser Gly Ile Ser Trp Asn Ser Gly Ser Ile Gly Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
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65 70 75 80
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85 90 95
Ala Lys Asp
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<211> 98
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 80
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly
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Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr
20 25 30
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Ser Tyr Ile Ser Ser Ser Gly Ser Thr Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
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65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg
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<211> 97
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<213> Homo sapiens
<400> 81
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35 40 45
Ser Ala Ile Gly Thr Ala Gly Asp Thr Tyr Tyr Pro Gly Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Glu Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Gly Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg
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<211> 100
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<213> Homo sapiens
<400> 82
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly
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20 25 30
Trp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
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Gly Arg Ile Lys Ser Lys Thr Asp Gly Gly Thr Thr Asp Tyr Ala Ala
50 55 60
Pro Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr
65 70 75 80
Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr
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Tyr Cys Thr Thr
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<213> Homo sapiens
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20 25 30
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Val Arg
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<213> Homo sapiens
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Ala Arg
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<213> Homo sapiens
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Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly
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Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
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Ser Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
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Ser Ser Ile Ser Ser Ser Ser Ser Tyr Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
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Ala Arg
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<213> Homo sapiens
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<213> Homo sapiens
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Ala Arg
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<213> Homo sapiens
<400> 88
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Ala Arg
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Ala Arg
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<213> Homo sapiens
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Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
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Val Arg
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<212> PRT
<213> Homo sapiens
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Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Val Ser Ser Asn
20 25 30
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50 55 60
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85 90 95
Tyr
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<213> Homo sapiens
<400> 93
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Val Val Val Gln Pro Gly Gly
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Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asp Asp Tyr
20 25 30
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<213> Homo sapiens
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<213> Homo sapiens
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100
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Arg
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<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 97
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Glu Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
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85 90 95
Ala Arg
<210> 98
<211> 97
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 98
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Ile Gln Pro Gly Gly
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Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Val Ser Ser Asn
20 25 30
Tyr Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
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Arg
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<211> 100
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 99
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
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Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp His
20 25 30
Tyr Met Asp Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
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100
<210> 100
<211> 100
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 100
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
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100
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<211> 98
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<213> Homo sapiens
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Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
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Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
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85 90 95
Ala Arg
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<211> 96
<212> PRT
<213> Homo sapiens
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Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Arg Gly Val Leu Val Gln Pro Gly Gly
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Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Val Ser Ser Asn
20 25 30
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<211> 97
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<213> Homo sapiens
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Arg
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<211> 98
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 104
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Asp
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Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Ser Gly Tyr Ser Ile Ser Ser Ser
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Ala Arg
<210> 105
<211> 99
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<213> Homo sapiens
<400> 105
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln
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Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile Ser Ser Gly
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Gly Tyr Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln His Pro Gly Lys Gly Leu Glu
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Trp Ile Gly Tyr Ile Tyr Tyr Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser
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Leu Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe
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Cys Ala Arg
<210> 106
<211> 99
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 106
Gln Leu Gln Leu Gln Glu Ser Gly Ser Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Ser Gly Gly Ser Ile Ser Ser Gly
20 25 30
Gly Tyr Ser Trp Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu
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Trp Ile Gly Tyr Ile Tyr His Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser
50 55 60
Leu Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Arg Ser Lys Asn Gln Phe
65 70 75 80
Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr
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Cys Ala Arg
<210> 107
<211> 99
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 107
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile Ser Ser Gly
20 25 30
Asp Tyr Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu
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Trp Ile Gly Tyr Ile Tyr Tyr Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser
50 55 60
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65 70 75 80
Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr
85 90 95
Cys Ala Arg
<210> 108
<211> 99
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 108
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile Ser Ser Gly
20 25 30
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50 55 60
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65 70 75 80
Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr
85 90 95
Cys Ala Arg
<210> 109
<211> 98
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 109
Gln Val Gln Leu Gln Gln Trp Gly Ala Gly Leu Leu Lys Pro Ser Glu
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Tyr Gly Gly Ser Phe Ser Gly Tyr
20 25 30
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50 55 60
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65 70 75 80
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85 90 95
Arg Gly
<210> 110
<211> 99
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 110
Gln Leu Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile Ser Ser Ser
20 25 30
Ser Tyr Tyr Trp Gly Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu
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Cys Ala Arg
<210> 111
<211> 97
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 111
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile Ser Ser Tyr
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Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
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65 70 75 80
Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg
<210> 112
<211> 99
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 112
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Val Ser Ser Gly
20 25 30
Gly Tyr Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu
35 40 45
Trp Ile Gly Tyr Ile Tyr Tyr Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Pro Ser
50 55 60
Leu Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe
65 70 75 80
Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr
85 90 95
Cys Ala Arg
<210> 113
<211> 98
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 113
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Ser Gly Tyr Ser Ile Ser Ser Gly
20 25 30
Tyr Tyr Trp Gly Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp
35 40 45
Ile Gly Ser Ile Tyr His Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser Leu
50 55 60
Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser
65 70 75 80
Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg
<210> 114
<211> 98
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 114
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu
1 5 10 15
Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Trp Ile Gly Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Ile Ile Tyr Pro Gly Asp Ser Asp Thr Arg Tyr Ser Pro Ser Phe
50 55 60
Gln Gly Gln Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg
<210> 115
<211> 98
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 115
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu
1 5 10 15
Ser Leu Arg Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Trp Ile Ser Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Arg Ile Asp Pro Ser Asp Ser Tyr Thr Asn Tyr Ser Pro Ser Phe
50 55 60
Gln Gly His Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg
<210> 116
<211> 101
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 116
Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Ile Ser Gly Asp Ser Val Ser Ser Asn
20 25 30
Ser Ala Ala Trp Asn Trp Ile Arg Gln Ser Pro Ser Arg Gly Leu Glu
35 40 45
Trp Leu Gly Arg Thr Tyr Tyr Arg Ser Lys Trp Tyr Asn Asp Tyr Ala
50 55 60
Val Ser Val Lys Ser Arg Ile Thr Ile Asn Pro Asp Thr Ser Lys Asn
65 70 75 80
Gln Phe Ser Leu Gln Leu Asn Ser Val Thr Pro Glu Asp Thr Ala Val
85 90 95
Tyr Tyr Cys Ala Arg
100
<210> 117
<211> 98
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 117
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ser Glu Leu Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Trp Ile Asn Thr Asn Thr Gly Asn Pro Thr Tyr Ala Gln Gly Phe
50 55 60
Thr Gly Arg Phe Val Phe Ser Leu Asp Thr Ser Val Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Ile Cys Ser Leu Lys Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg
<210> 118
<211> 98
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 118
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly His Glu Val Lys Gln Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Thr Tyr
20 25 30
Gly Met Asn Trp Val Pro Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Trp Phe Asn Thr Tyr Thr Gly Asn Pro Thr Tyr Ala Gln Gly Phe
50 55 60
Thr Gly Arg Phe Val Phe Ser Met Asp Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Ile Ser Ser Leu Lys Ala Glu Asp Met Ala Met Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg
<210> 119
<211> 95
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 119
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Trp
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Asp Ala Ser Ser Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Asp Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asn Ser Tyr Ser
85 90 95
<210> 120
<211> 95
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 120
Ala Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Arg Asn Asp
20 25 30
Leu Gly Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln Asp Tyr Asn Tyr Pro
85 90 95
<210> 121
<211> 95
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 121
Ala Ile Arg Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Phe Ser Ala Ser Thr Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser Tyr
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ala Ala Ser Thr Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Cys Leu Gln Ser
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Tyr Ser Tyr Pro
85 90 95
<210> 122
<211> 95
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 122
Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Phe Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser Tyr
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ala Ala Ser Thr Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Leu Asn Ser Tyr Pro
85 90 95
<210> 123
<211> 95
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 123
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Val Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser Trp
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ala Asn Ser Phe Pro
85 90 95
<210> 124
<211> 95
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 124
Ala Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser Ala
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Asp Ala Ser Ser Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Phe Asn Ser Tyr Pro
85 90 95
<210> 125
<211> 95
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 125
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Asn Tyr
20 25 30
Leu Ala Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Ser Leu Ile
35 40 45
Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asn Ser Tyr Pro
85 90 95
<210> 126
<211> 95
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 126
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Arg Asn Asp
20 25 30
Leu Gly Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Arg Leu Ile
35 40 45
Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln His Asn Ser Tyr Pro
85 90 95
<210> 127
<211> 95
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 127
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Asn Tyr
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Val Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ala Ala Ser Thr Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Lys Tyr Asn Ser Ala Pro
85 90 95
<210> 128
<211> 95
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 128
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gln Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Asp Ala Ser Asn Leu Glu Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asp Asn Leu Pro
85 90 95
<210> 129
<211> 96
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 129
Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Val Ser Gln Gly Ile Ser Ser Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Arg Gln Lys Pro Gly Lys Val Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ser Ala Ser Asn Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Gly Gln Arg Thr Tyr Asn Ala Pro Pro
85 90 95
<210> 130
<211> 95
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 130
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Pro
85 90 95
<210> 131
<211> 95
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 131
Val Ile Trp Met Thr Gln Ser Pro Ser Leu Leu Ser Ala Ser Thr Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Met Ser Gln Gly Ile Ser Ser Tyr
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Glu Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ala Ala Ser Thr Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Cys Leu Gln Ser
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Tyr Ser Phe Pro
85 90 95
<210> 132
<211> 95
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 132
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Val Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser Trp
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ala Asn Ser Phe Pro
85 90 95
<210> 133
<211> 95
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 133
Ala Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser Ala
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Asp Ala Ser Ser Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Phe Asn Asn Tyr Pro
85 90 95
<210> 134
<211> 95
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 134
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser Trp
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Glu Lys Ala Pro Lys Ser Leu Ile
35 40 45
Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asn Ser Tyr Pro
85 90 95
<210> 135
<211> 95
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 135
Asn Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ala Met Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Arg Gln Gly Ile Ser Asn Tyr
20 25 30
Leu Ala Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Lys Val Pro Lys His Leu Ile
35 40 45
Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln His Asn Ser Tyr Pro
85 90 95
<210> 136
<211> 95
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 136
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gln Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Asp Ala Ser Asn Leu Glu Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asp Asn Leu Pro
85 90 95
<210> 137
<211> 96
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 137
Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Val Ser Gln Gly Ile Ser Ser Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Arg Gln Lys Pro Gly Lys Val Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ser Ala Ser Asn Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Gly Gln Arg Thr Tyr Asn Ala Pro Pro
85 90 95
<210> 138
<211> 95
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 138
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Pro
85 90 95
<210> 139
<211> 96
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 139
Asp Ile Gln Met Ile Gln Ser Pro Ser Phe Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Ser Ile Ile Cys Trp Ala Ser Glu Gly Ile Ser Ser Asn
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Lys Ser Pro Lys Leu Phe Leu
35 40 45
Tyr Asp Ala Lys Asp Leu His Pro Gly Val Ser Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Arg Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ile Ser Leu Lys Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Ala Tyr Tyr Cys Lys Gln Asp Phe Ser Tyr Pro Pro
85 90 95
<210> 140
<211> 95
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 140
Ala Ile Arg Met Thr Gln Ser Pro Phe Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Trp Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser Tyr
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Ala Lys Ala Pro Lys Leu Phe Ile
35 40 45
Tyr Tyr Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Tyr Ser Thr Pro
85 90 95
<210> 141
<211> 100
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 141
Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Ser Pro Val Thr Leu Gly
1 5 10 15
Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser
20 25 30
Asp Gly Asn Thr Tyr Leu Ser Trp Leu Gln Gln Arg Pro Gly Gln Pro
35 40 45
Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Lys Ile Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ala Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Met Gln Ala
85 90 95
Thr Gln Phe Pro
100
<210> 142
<211> 100
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 142
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly
1 5 10 15
Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Leu His Ser
20 25 30
Asn Gly Tyr Asn Tyr Leu Asp Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Leu Gly Ser Asn Arg Ala Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Met Gln Ala
85 90 95
Leu Gln Thr Pro
100
<210> 143
<211> 100
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 143
Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Ser Val Thr Pro Gly
1 5 10 15
Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu His Ser
20 25 30
Asp Gly Lys Thr Tyr Leu Tyr Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Glu Val Ser Ser Arg Phe Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Met Gln Gly
85 90 95
Ile His Leu Pro
100
<210> 144
<211> 100
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 144
Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Leu Gly
1 5 10 15
Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val Tyr Ser
20 25 30
Asp Gly Asn Thr Tyr Leu Asn Trp Phe Gln Gln Arg Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Arg Arg Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Asp Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Met Gln Gly
85 90 95
Thr His Trp Pro
100
<210> 145
<211> 101
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 145
Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly
1 5 10 15
Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asp Ser
20 25 30
Asp Asp Gly Asn Thr Tyr Leu Asp Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln
35 40 45
Ser Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Thr Leu Ser Tyr Arg Ala Ser Gly Val
50 55 60
Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys
65 70 75 80
Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Met Gln
85 90 95
Arg Ile Glu Phe Pro
100
<210> 146
<211> 100
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 146
Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Ser Pro Val Thr Leu Gly
1 5 10 15
Gln Pro Ala Ser Ile Ser Phe Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser
20 25 30
Asp Gly Asn Thr Tyr Leu Ser Trp Leu Gln Gln Arg Pro Gly Gln Pro
35 40 45
Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ala Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Thr Gln Ala
85 90 95
Thr Gln Phe Pro
100
<210> 147
<211> 101
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 147
Glu Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Ser Ile Thr Pro Gly
1 5 10 15
Glu Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Leu His Ser
20 25 30
Asp Gly Tyr Thr Tyr Leu Tyr Trp Phe Leu Gln Lys Ala Arg Pro Val
35 40 45
Ser Thr Leu Leu Ile Tyr Glu Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Phe Gly Val Tyr Tyr Cys Met Gln Asp
85 90 95
Ala Gln Asp Pro Pro
100
<210> 148
<211> 100
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 148
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly
1 5 10 15
Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Leu His Ser
20 25 30
Asn Gly Tyr Asn Tyr Leu Asp Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Leu Gly Ser Asn Arg Ala Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Met Gln Ala
85 90 95
Leu Gln Thr Pro
100
<210> 149
<211> 100
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 149
Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Ser Val Thr Pro Gly
1 5 10 15
Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu His Ser
20 25 30
Asp Gly Lys Thr Tyr Leu Tyr Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Pro
35 40 45
Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Glu Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Met Gln Ser
85 90 95
Ile Gln Leu Pro
100
<210> 150
<211> 100
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 150
Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Leu Gly
1 5 10 15
Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val Tyr Ser
20 25 30
Asp Gly Asn Thr Tyr Leu Asn Trp Phe Gln Gln Arg Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Arg Arg Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Trp Asp Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Met Gln Gly
85 90 95
Thr His Trp Pro
100
<210> 151
<211> 101
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 151
Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly
1 5 10 15
Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asp Ser
20 25 30
Asp Asp Gly Asn Thr Tyr Leu Asp Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln
35 40 45
Ser Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Thr Leu Ser Tyr Arg Ala Ser Gly Val
50 55 60
Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys
65 70 75 80
Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Met Gln
85 90 95
Arg Ile Glu Phe Pro
100
<210> 152
<211> 97
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 152
Glu Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Pro Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Val Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser
20 25 30
Tyr Leu Thr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu
35 40 45
Ile Tyr Gly Ala Ser Thr Arg Ala Thr Ser Ile Pro Ala Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln
65 70 75 80
Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Asp His Asn Leu Pro
85 90 95
Pro
<210> 153
<211> 95
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 153
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Ser Asn Trp Pro
85 90 95
<210> 154
<211> 95
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 154
Glu Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Val Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Asn
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Gly Ala Ser Thr Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ser
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asn Asn Trp Pro
85 90 95
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<211> 96
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 155
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser
20 25 30
Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu
35 40 45
Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu
65 70 75 80
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85 90 95
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<211> 96
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 156
Glu Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser
20 25 30
Tyr Leu Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu
35 40 45
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50 55 60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln
65 70 75 80
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<211> 95
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 157
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
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Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly
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Ser Gly Pro Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro
65 70 75 80
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85 90 95
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<211> 95
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 158
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65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asn Asn Trp Pro
85 90 95
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<211> 96
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 159
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
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20 25 30
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Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu
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85 90 95
<210> 160
<211> 101
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 160
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
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20 25 30
Ser Asn Asn Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln
35 40 45
Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val
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65 70 75 80
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85 90 95
Tyr Tyr Ser Thr Pro
100
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<211> 95
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<213> Homo sapiens
<400> 161
Glu Thr Thr Leu Thr Gln Ser Pro Ala Phe Met Ser Ala Thr Pro Gly
1 5 10 15
Asp Lys Val Asn Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gln Asp Ile Asp Asp Asp
20 25 30
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35 40 45
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50 55 60
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65 70 75 80
Glu Asp Ala Ala Tyr Tyr Phe Cys Leu Gln His Asp Asn Phe Pro
85 90 95
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<211> 95
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<213> Homo sapiens
<400> 162
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1 5 10 15
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20 25 30
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35 40 45
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50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asn Ser Leu Glu Ala
65 70 75 80
Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys His Gln Ser Ser Ser Leu Pro
85 90 95
<210> 163
<211> 95
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 163
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Asp Phe Gln Ser Val Thr Pro Lys
1 5 10 15
Glu Lys Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Gly Ser Ser
20 25 30
Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
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50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asn Ser Leu Glu Ala
65 70 75 80
Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys His Gln Ser Ser Ser Leu Pro
85 90 95
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<211> 95
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 164
Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Phe Leu Ser Val Thr Pro Gly
1 5 10 15
Glu Lys Val Thr Ile Thr Cys Gln Ala Ser Glu Gly Ile Gly Asn Tyr
20 25 30
Leu Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gln Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Lys Tyr Ala Ser Gln Ser Ile Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Glu Ala
65 70 75 80
Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Asn Lys His Pro
85 90 95
<210> 165
<211> 99
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 165
Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Glu Ala Pro Arg Gln
1 5 10 15
Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Asn Asn
20 25 30
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35 40 45
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50 55 60
Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu Gln
65 70 75 80
Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Ala Trp Asp Asp Ser Leu
85 90 95
Asn Gly Pro
<210> 166
<211> 100
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 166
Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Gly Ala Pro Gly Gln
1 5 10 15
Arg Val Thr Ile Ser Cys Thr Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ala Gly
20 25 30
Tyr Asp Val His Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu
35 40 45
Leu Ile Tyr Gly Asn Ser Asn Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe
50 55 60
Ser Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Thr Gly Leu
65 70 75 80
Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Ser Tyr Asp Ser Ser
85 90 95
Leu Ser Gly Ser
100
<210> 167
<211> 99
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 167
Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly Gln
1 5 10 15
Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ser Asn
20 25 30
Thr Val Asn Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu
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Ile Tyr Ser Asn Asn Gln Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu Gln
65 70 75 80
Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Ala Trp Asp Asp Ser Leu
85 90 95
Asn Gly Pro
<210> 168
<211> 99
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 168
Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly Gln
1 5 10 15
Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ser Asn
20 25 30
Tyr Val Tyr Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu
35 40 45
Ile Tyr Ser Asn Asn Gln Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu Arg
65 70 75 80
Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Ala Trp Asp Asp Ser Leu
85 90 95
Ser Gly Pro
<210> 169
<211> 99
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 169
Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Gly Ala Pro Gly Gln
1 5 10 15
Arg Val Thr Ile Ser Cys Thr Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ala Gly
20 25 30
Tyr Val Val His Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu
35 40 45
Leu Ile Tyr Gly Asn Ser Asn Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Gln Phe
50 55 60
Ser Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Thr Gly Leu
65 70 75 80
Gln Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Lys Ala Trp Asp Asn Ser
85 90 95
Leu Asn Ala
<210> 170
<211> 99
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 170
Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Ala Ala Pro Gly Gln
1 5 10 15
Lys Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Asn Asn
20 25 30
Tyr Val Ser Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu
35 40 45
Ile Tyr Asp Asn Asn Lys Arg Pro Ser Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Thr Leu Gly Ile Thr Gly Leu Gln
65 70 75 80
Thr Gly Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gly Thr Trp Asp Ser Ser Leu
85 90 95
Ser Ala Gly
<210> 171
<211> 99
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 171
Gln Ser Ala Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Ser Pro Gly Gln
1 5 10 15
Ser Val Thr Ile Ser Cys Thr Gly Thr Ser Ser Asp Val Gly Gly Tyr
20 25 30
Asn Tyr Val Ser Trp Tyr Gln Gln His Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu
35 40 45
Met Ile Tyr Glu Val Ser Lys Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe
50 55 60
Ser Gly Ser Lys Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Val Ser Gly Leu
65 70 75 80
Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ser Ser Tyr Ala Gly Ser
85 90 95
Asn Asn Phe
<210> 172
<211> 99
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 172
Gln Ser Ala Leu Thr Gln Pro Arg Ser Val Ser Gly Ser Pro Gly Gln
1 5 10 15
Ser Val Thr Ile Ser Cys Thr Gly Thr Ser Ser Asp Val Gly Gly Tyr
20 25 30
Asn Tyr Val Ser Trp Tyr Gln Gln His Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu
35 40 45
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50 55 60
Ser Gly Ser Lys Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Ser Gly Leu
65 70 75 80
Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Cys Ser Tyr Ala Gly Ser
85 90 95
Tyr Thr Phe
<210> 173
<211> 99
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 173
Gln Ser Ala Leu Thr Gln Pro Ala Ser Val Ser Gly Ser Pro Gly Gln
1 5 10 15
Ser Ile Thr Ile Ser Cys Thr Gly Thr Ser Ser Asp Val Gly Gly Tyr
20 25 30
Asn Tyr Val Ser Trp Tyr Gln Gln His Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu
35 40 45
Met Ile Tyr Glu Val Ser Asn Arg Pro Ser Gly Val Ser Asn Arg Phe
50 55 60
Ser Gly Ser Lys Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Ser Gly Leu
65 70 75 80
Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ser Ser Tyr Thr Ser Ser
85 90 95
Ser Thr Leu
<210> 174
<211> 99
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 174
Gln Ser Ala Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Gly Ser Pro Gly Gln
1 5 10 15
Ser Val Thr Ile Ser Cys Thr Gly Thr Ser Ser Asp Val Gly Ser Tyr
20 25 30
Asn Arg Val Ser Trp Tyr Gln Gln Pro Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu
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Met Ile Tyr Glu Val Ser Asn Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe
50 55 60
Ser Gly Ser Lys Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Ser Gly Leu
65 70 75 80
Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ser Leu Tyr Thr Ser Ser
85 90 95
Ser Thr Phe
<210> 175
<211> 99
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 175
Gln Ser Ala Leu Thr Gln Pro Ala Ser Val Ser Gly Ser Pro Gly Gln
1 5 10 15
Ser Ile Thr Ile Ser Cys Thr Gly Thr Ser Ser Asp Val Gly Ser Tyr
20 25 30
Asn Leu Val Ser Trp Tyr Gln Gln His Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu
35 40 45
Met Ile Tyr Glu Gly Ser Lys Arg Pro Ser Gly Val Ser Asn Arg Phe
50 55 60
Ser Gly Ser Lys Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Ser Gly Leu
65 70 75 80
Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Cys Ser Tyr Ala Gly Ser
85 90 95
Ser Thr Phe
<210> 176
<211> 99
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 176
Gln Ser Ala Leu Thr Gln Pro Pro Phe Val Ser Gly Ala Pro Gly Gln
1 5 10 15
Ser Val Thr Ile Ser Cys Thr Gly Thr Ser Ser Asp Val Gly Asp Tyr
20 25 30
Asp His Val Phe Trp Tyr Gln Lys Arg Leu Ser Thr Thr Ser Arg Leu
35 40 45
Leu Ile Tyr Asn Val Asn Thr Arg Pro Ser Gly Ile Ser Asp Leu Phe
50 55 60
Ser Gly Ser Lys Ser Gly Asn Met Ala Ser Leu Thr Ile Ser Gly Leu
65 70 75 80
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85 90 95
Tyr Thr Phe
<210> 177
<211> 95
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 177
Ser Tyr Glu Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ser Pro Gly Gln
1 5 10 15
Thr Ala Ser Ile Thr Cys Ser Gly Asp Lys Leu Gly Asp Lys Tyr Ala
20 25 30
Cys Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Val Leu Val Ile Tyr
35 40 45
Gln Asp Ser Lys Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Gly Thr Gln Ala Met
65 70 75 80
Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Ala Trp Asp Ser Ser Thr Ala
85 90 95
<210> 178
<211> 95
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 178
Ser Tyr Glu Leu Thr Gln Pro Leu Ser Val Ser Val Ala Leu Gly Gln
1 5 10 15
Thr Ala Arg Ile Thr Cys Gly Gly Asn Asn Ile Gly Ser Lys Asn Val
20 25 30
His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu Val Ile Tyr
35 40 45
Arg Asp Ser Asn Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Arg Ala Gln Ala Gly
65 70 75 80
Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Val Trp Asp Ser Ser Thr Ala
85 90 95
<210> 179
<211> 96
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 179
Ser Tyr Glu Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ser Pro Gly Gln
1 5 10 15
Thr Ala Arg Ile Thr Cys Ser Gly Asp Ala Leu Pro Lys Lys Tyr Ala
20 25 30
Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Ser Gly Gln Ala Pro Val Leu Val Ile Tyr
35 40 45
Glu Asp Ser Lys Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Ser Ser Gly Thr Met Ala Thr Leu Thr Ile Ser Gly Ala Gln Val Glu
65 70 75 80
Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Tyr Ser Thr Asp Ser Ser Gly Asn His
85 90 95
<210> 180
<211> 97
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 180
Ser Tyr Glu Leu Thr Gln Pro His Ser Val Ser Val Ala Thr Ala Gln
1 5 10 15
Met Ala Arg Ile Thr Cys Gly Gly Asn Asn Ile Gly Ser Lys Ala Val
20 25 30
His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Asp Pro Val Leu Val Ile Tyr
35 40 45
Ser Asp Ser Asn Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Asn Pro Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Arg Ile Glu Ala Gly
65 70 75 80
Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Val Trp Asp Ser Ser Ser Asp His
85 90 95
Pro
<210> 181
<211> 97
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 181
Ser Tyr Glu Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ser Leu Gly Gln
1 5 10 15
Met Ala Arg Ile Thr Cys Ser Gly Glu Ala Leu Pro Lys Lys Tyr Ala
20 25 30
Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Phe Pro Val Leu Val Ile Tyr
35 40 45
Lys Asp Ser Glu Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Ser Ser Gly Thr Ile Val Thr Leu Thr Ile Ser Gly Val Gln Ala Glu
65 70 75 80
Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Leu Ser Ala Asp Ser Ser Gly Thr Tyr
85 90 95
Pro
<210> 182
<211> 97
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 182
Ser Ser Glu Leu Thr Gln Asp Pro Ala Val Ser Val Ala Leu Gly Gln
1 5 10 15
Thr Val Arg Ile Thr Cys Gln Gly Asp Ser Leu Arg Ser Tyr Tyr Ala
20 25 30
Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu Val Ile Tyr
35 40 45
Gly Lys Asn Asn Arg Pro Ser Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Ser Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Thr Gly Ala Gln Ala Glu
65 70 75 80
Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Asn Ser Arg Asp Ser Ser Gly Asn His
85 90 95
Leu
<210> 183
<211> 97
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 183
Ser Tyr Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ala Pro Gly Gln
1 5 10 15
Thr Ala Arg Ile Thr Cys Gly Gly Asn Asn Ile Gly Ser Lys Ser Val
20 25 30
His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu Val Val Tyr
35 40 45
Asp Asp Ser Asp Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Arg Val Glu Ala Gly
65 70 75 80
Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Val Trp Asp Ser Ser Ser Asp His
85 90 95
Pro
<210> 184
<211> 95
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 184
Ser Tyr Glu Leu Thr Gln Leu Pro Ser Val Ser Val Ser Pro Gly Gln
1 5 10 15
Thr Ala Arg Ile Thr Cys Ser Gly Asp Val Leu Gly Glu Asn Tyr Ala
20 25 30
Asp Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Glu Leu Val Ile Tyr
35 40 45
Glu Asp Ser Glu Arg Tyr Pro Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Thr Ser Gly Asn Thr Thr Thr Leu Thr Ile Ser Arg Val Leu Thr Glu
65 70 75 80
Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Leu Ser Gly Asp Glu Asp Asn Pro
85 90 95
<210> 185
<211> 97
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 185
Ser Tyr Glu Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ser Pro Gly Gln
1 5 10 15
Thr Ala Arg Ile Thr Cys Ser Gly Asp Ala Leu Pro Lys Gln Tyr Ala
20 25 30
Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu Val Ile Tyr
35 40 45
Lys Asp Ser Glu Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Ser Ser Gly Thr Thr Val Thr Leu Thr Ile Ser Gly Val Gln Ala Glu
65 70 75 80
Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Ser Ala Asp Ser Ser Gly Thr Tyr
85 90 95
Pro
<210> 186
<211> 95
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 186
Ser Tyr Glu Leu Thr Gln Pro Ser Ser Val Ser Val Ser Pro Gly Gln
1 5 10 15
Thr Ala Arg Ile Thr Cys Ser Gly Asp Val Leu Ala Lys Lys Tyr Ala
20 25 30
Arg Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu Val Ile Tyr
35 40 45
Lys Asp Ser Glu Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Ser Ser Gly Thr Thr Val Thr Leu Thr Ile Ser Gly Ala Gln Val Glu
65 70 75 80
Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Tyr Ser Ala Ala Asp Asn Asn Leu
85 90 95
<210> 187
<211> 94
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 187
Ser Ser Gly Pro Thr Gln Val Pro Ala Val Ser Val Ala Leu Gly Gln
1 5 10 15
Met Ala Arg Ile Thr Cys Gln Gly Asp Ser Met Glu Gly Ser Tyr Glu
20 25 30
His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu Val Ile Tyr
35 40 45
Asp Ser Ser Asp Arg Pro Ser Arg Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
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65 70 75 80
Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Tyr Gln Leu Ile Asp Asn His Ala
85 90
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<211> 103
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 188
Leu Pro Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Ala Leu Leu Gly Ala
1 5 10 15
Ser Ile Lys Leu Thr Cys Thr Leu Ser Ser Glu His Ser Thr Tyr Thr
20 25 30
Ile Glu Trp Tyr Gln Gln Arg Pro Gly Arg Ser Pro Gln Tyr Ile Met
35 40 45
Lys Val Lys Ser Asp Gly Ser His Ser Lys Gly Asp Gly Ile Pro Asp
50 55 60
Arg Phe Met Gly Ser Ser Ser Gly Ala Asp Arg Tyr Leu Thr Phe Ser
65 70 75 80
Asn Leu Gln Ser Asp Asp Glu Ala Glu Tyr His Cys Gly Glu Ser His
85 90 95
Thr Ile Asp Gly Gln Val Gly
100
<210> 189
<211> 99
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 189
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1 5 10 15
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20 25 30
Ile Ala Trp His Gln Gln Gln Pro Gly Lys Ala Pro Arg Tyr Leu Met
35 40 45
Lys Leu Glu Gly Ser Gly Ser Tyr Asn Lys Gly Ser Gly Val Pro Asp
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Ser Ser Gly Ala Asp Arg Tyr Leu Thr Ile Ser
65 70 75 80
Asn Leu Gln Phe Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Glu Thr Trp Asp
85 90 95
Ser Asn Thr
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<211> 98
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 190
Gln Leu Val Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ala Ser Ala Ser Leu Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Leu Thr Cys Thr Leu Ser Ser Gly His Ser Ser Tyr Ala
20 25 30
Ile Ala Trp His Gln Gln Gln Pro Glu Lys Gly Pro Arg Tyr Leu Met
35 40 45
Lys Leu Asn Ser Asp Gly Ser His Ser Lys Gly Asp Gly Ile Pro Asp
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Ser Ser Gly Ala Glu Arg Tyr Leu Thr Ile Ser
65 70 75 80
Ser Leu Gln Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Thr Trp Gly
85 90 95
Thr Gly
<210> 191
<211> 104
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 191
Gln Pro Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ser Ser Ala Ser Pro Gly Glu
1 5 10 15
Ser Ala Arg Leu Thr Cys Thr Leu Pro Ser Asp Ile Asn Val Gly Ser
20 25 30
Tyr Asn Ile Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Ser Pro Pro Arg Tyr
35 40 45
Leu Leu Tyr Tyr Tyr Ser Asp Ser Asp Lys Gly Gln Gly Ser Gly Val
50 55 60
Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Lys Asp Ala Ser Ala Asn Thr Gly Ile
65 70 75 80
Leu Leu Ile Ser Gly Leu Gln Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys
85 90 95
Met Ile Trp Pro Ser Asn Ala Ser
100
<210> 192
<211> 104
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 192
Gln Pro Val Leu Thr Gln Pro Thr Ser Leu Ser Ala Ser Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Ala Arg Phe Thr Cys Thr Leu Arg Ser Gly Ile Asn Val Gly Thr
20 25 30
Tyr Arg Ile Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Ser Leu Pro Arg Tyr
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Leu Leu Arg Tyr Lys Ser Asp Ser Asp Lys Gln Gln Gly Ser Gly Val
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Leu Leu Ile Ser Gly Leu Gln Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys
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Ala Ile Trp Tyr Ser Ser Thr Ser
100
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<211> 104
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 193
Gln Ala Val Leu Thr Gln Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Ala Ser Leu Thr Cys Thr Leu Arg Ser Gly Ile Asn Val Gly Thr
20 25 30
Tyr Arg Ile Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Ser Pro Pro Gln Tyr
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Leu Leu Ile Ser Gly Leu Gln Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys
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Met Ile Trp His Ser Ser Ala Ser
100
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<211> 104
<212> PRT
<213> Homo sapiens
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Ser Ala Arg Leu Thr Cys Thr Leu Arg Ser Gly Ile Asn Leu Gly Ser
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Leu Val Ile Ser Gly Leu Gln Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys
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Met Ile Trp His Ser Ser Ala Ser
100
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<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 195
Gln Pro Val Leu Thr Gln Pro Ser Ser His Ser Ala Ser Ser Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Arg Leu Thr Cys Met Leu Ser Ser Gly Phe Ser Val Gly Asp
20 25 30
Phe Trp Ile Arg Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Asn Pro Pro Arg Tyr
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Leu Leu Tyr Tyr His Ser Asp Ser Asn Lys Gly Gln Gly Ser Gly Val
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Leu Arg Ile Ser Gly Leu Gln Pro Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys
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Gly Thr Trp His Ser Asn Ser Lys Thr
100 105
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<211> 98
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 196
Asn Phe Met Leu Thr Gln Pro His Ser Val Ser Glu Ser Pro Gly Lys
1 5 10 15
Thr Val Thr Ile Ser Cys Thr Arg Ser Ser Gly Ser Ile Ala Ser Asn
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Tyr Val Gln Trp Tyr Gln Gln Arg Pro Gly Ser Ser Pro Thr Thr Val
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Ser Asn
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<211> 98
<212> PRT
<213> Homo sapiens
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Thr Val Thr Leu Thr Cys Ala Ser Ser Thr Gly Ala Val Thr Ser Gly
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35 40 45
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Gln Pro Glu Asp Glu Ala Glu Tyr Tyr Cys Leu Leu Tyr Tyr Gly Gly
85 90 95
Ala Gln
<210> 198
<211> 98
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 198
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1 5 10 15
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Gln Pro Glu Asp Glu Ala Glu Tyr Tyr Cys Leu Leu Ser Tyr Ser Gly
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Ala Arg
<210> 199
<211> 99
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 199
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1 5 10 15
Thr Val Thr Leu Thr Cys Gly Leu Ser Ser Gly Ser Val Ser Thr Ser
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50 55 60
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Gln Ala Asp Asp Glu Ser Asp Tyr Tyr Cys Val Leu Tyr Met Gly Ser
85 90 95
Gly Ile Ser
<210> 200
<211> 104
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 200
Gln Pro Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Ala Ser Leu Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Thr Leu Thr Cys Thr Leu Ser Ser Gly Tyr Ser Asn Tyr Lys
20 25 30
Val Asp Trp Tyr Gln Gln Arg Pro Gly Lys Gly Pro Arg Phe Val Met
35 40 45
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50 55 60
Asp Arg Phe Ser Val Leu Gly Ser Gly Leu Asn Arg Tyr Leu Thr Ile
65 70 75 80
Lys Asn Ile Gln Glu Glu Asp Glu Ser Asp Tyr His Cys Gly Ala Asp
85 90 95
His Gly Ser Gly Ser Asn Phe Val
100
<210> 201
<211> 98
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 201
Gln Ala Gly Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Lys Gly Leu Arg Gln
1 5 10 15
Thr Ala Thr Leu Thr Cys Thr Gly Asn Ser Asn Ile Val Gly Asn Gln
20 25 30
Gly Ala Ala Trp Leu Gln Gln His Gln Gly His Pro Pro Lys Leu Leu
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Ser Tyr Arg Asn Asn Asn Arg Pro Ser Gly Ile Ser Glu Arg Phe Ser
50 55 60
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65 70 75 80
Pro Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ser Ala Leu Asp Ser Ser Leu
85 90 95
Ser Ala
<210> 202
<211> 104
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 202
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1 5 10 15
Thr Ala Arg Leu Pro Cys Thr Leu Ser Ser Asp Leu Ser Val Gly Gly
20 25 30
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50 55 60
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65 70 75 80
Leu Leu Ile Ser Gly Leu Gln Pro Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys
85 90 95
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100
<210> 203
<211> 6
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
6xHis tag
<400> 203
His His His His His His
1 5
<210> 204
<211> 98
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 204
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20 25 30
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Gly Trp Ile Ser Ala Tyr Asn Gly Asn Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Leu
50 55 60
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85 90 95
Ala Arg
<210> 205
<211> 98
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 205
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1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Ile Ile Asn Pro Ser Gly Gly Ser Thr Ser Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
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65 70 75 80
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85 90 95
Ala Arg
<210> 206
<211> 98
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 206
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
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50 55 60
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Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg
<210> 207
<211> 98
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 207
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Trp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
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Ala Arg
<210> 208
<211> 98
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 208
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr
20 25 30
Tyr Met Ser Trp Ile Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Tyr Ile Ser Ser Ser Gly Ser Thr Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg
<210> 209
<211> 100
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 209
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Ala
20 25 30
Trp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Gly Arg Ile Lys Ser Lys Thr Asp Gly Gly Thr Thr Asp Tyr Ala Ala
50 55 60
Pro Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr
65 70 75 80
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85 90 95
Tyr Cys Ala Arg
100
<210> 210
<211> 98
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 210
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly
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85 90 95
Ala Arg
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<211> 98
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 211
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
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Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
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<210> 212
<211> 98
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 212
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg
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Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
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85 90 95
Ala Arg
<210> 213
<211> 97
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 213
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Ile Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Val Ser Ser Asn
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85 90 95
Arg
<210> 214
<211> 98
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 214
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
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35 40 45
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65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg
<210> 215
<211> 98
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 215
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu
1 5 10 15
Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Trp Ile Gly Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Ile Ile Tyr Pro Gly Asp Ser Asp Thr Arg Tyr Ser Pro Ser Phe
50 55 60
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65 70 75 80
Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg
<210> 216
<211> 101
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 216
Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Ile Ser Gly Asp Ser Val Ser Ser Asn
20 25 30
Ser Ala Ala Trp Asn Trp Ile Arg Gln Ser Pro Ser Arg Gly Leu Glu
35 40 45
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65 70 75 80
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85 90 95
Tyr Tyr Cys Ala Arg
100
<210> 217
<211> 294
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 217
caggtgcagc tggtgcagag cggtgccgaa gtgaaaaaac caggcgccag cgtgaaagtt 60
agctgcaaag ccagcggcta tacctttacc agctatggca ttagctgggt tcgccaggcc 120
ccaggccagg gtctggaatg gatgggctgg attagcgcct ataacggcaa caccaactac 180
gcccagaaac tgcaaggccg cgtgaccatg accaccgata ccagcaccag caccgcctat 240
atggaactgc gctccctgcg cagcgacgat accgccgtgt attattgcgc gcgt 294
<210> 218
<211> 294
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 218
caggtgcagc tggtgcagag cggtgccgaa gtgaaaaaac caggcgccag cgtgaaagtt 60
agctgcaaag ccagcggcta taccttcacc agctactata tgcattgggt tcgccaggcc 120
ccaggccagg gtctggaatg gatgggcatt attaacccga gcggcggcag caccagctat 180
gcacagaaat ttcagggccg cgtgaccatg acccgcgata ccagcaccag caccgtgtat 240
atggaactga gcagcctgcg cagcgaagat accgccgtgt attattgcgc gcgt 294
<210> 219
<211> 294
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 219
caggtgcagc tggtgcagag cggtgccgaa gtgaaaaaac caggcagcag cgtgaaagtg 60
agctgtaaag ccagcggtgg cacctttagc agctatgcca ttagctgggt tcgccaggca 120
ccaggtcagg gtctggaatg gatgggtggc attattccga tttttggcac cgccaactat 180
gcccagaaat ttcagggtcg cgtgaccatt accgcagatg aaagcaccag caccgcctat 240
atggaactga gcagcctgcg cagcgaagat accgcagtgt attattgcgc gcgg 294
<210> 220
<211> 294
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 220
gaagtgcagc tggtggaaag cggcggtggc ctggtgcagc caggtggtag cctgcgcctg 60
agctgcgccg ccagcggctt tacctttagc agctattgga tgagctgggt tcgccaggcc 120
ccaggcaaag gcctggaatg ggtggcgaac atcaaacagg atggcagcga gaaatactat 180
gtggatagcg tgaaaggccg ctttaccatt agccgcgata acgccaaaaa cagcctgtat 240
ctgcaaatga acagcctgcg ggccgaagat accgccgtgt attattgcgc gcgt 294
<210> 221
<211> 294
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 221
caggtgcagc tggtggaaag cggcggtggc ctggtgaaac caggcggtag cctgcgcctg 60
agctgcgccg ccagcggctt tacctttagc gattactaca tgagctggat tcgccaggcc 120
ccaggcaaag gcctggaatg ggttagctat attagcagca gtggcagcac catctattac 180
gccgatagcg tgaaaggccg ctttaccatt agccgcgata acgccaaaaa cagcctgtat 240
ctgcaaatga acagcctgcg ggccgaagat accgccgtgt attattgcgc gcgt 294
<210> 222
<211> 300
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 222
gaagtgcagc tggtggaaag cggcggtggc ctggtgaaac caggcggtag cctgcgcctg 60
agctgcgccg ccagcggctt tacctttagc aacgcctgga tgagctgggt tcgccaggcc 120
ccaggcaaag gcctggaatg ggttggccgc atcaaaagca aaaccgatgg cggcaccacc 180
gattatgccg ccccagtgaa aggccgcttt accattagcc gcgacgatag caaaaacacc 240
ctgtacctgc aaatgaacag cctgaaaacc gaagataccg ccgtgtatta ttgcgcgcgt 300
<210> 223
<211> 294
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 223
gaagtgcagc tggtggaaag cggcggtggc ctggtgaaac caggcggtag cctgcgcctg 60
agctgcgccg ccagcggctt tacctttagc agctatagca tgaactgggt tcgccaggcc 120
ccaggcaaag gcctggaatg ggttagcagc atcagcagca gtagcagcta tatctattac 180
gccgatagcg tgaaaggccg ctttaccatt agccgcgata acgccaaaaa cagcctgtat 240
ctgcaaatga acagcctgcg ggccgaagat accgccgtgt attattgcgc gcgt 294
<210> 224
<211> 294
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 224
gaagtgcagc tgctggaaag cggtggcggt ctggtgcagc caggtggtag cctgcgcctg 60
agctgtgccg caagcggctt tacctttagc agctatgcca tgagctgggt gcgccaagca 120
ccaggcaaag gcctggaatg ggtgagcgcc attagcggca gcggtggcag cacctattat 180
gccgatagcg tgaaaggtcg ctttaccatt agtcgcgata acagcaaaaa caccctgtat 240
ctgcaaatga acagcctgcg ggcagaagat accgcagttt attattgcgc gcgg 294
<210> 225
<211> 294
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 225
caggtgcagc tggtggaaag cggcggtggc gttgtgcagc caggtcgcag tctgcgcctg 60
agctgtgccg ccagcggctt tacctttagc agctatgcca tgcattgggt tcgccaggcc 120
ccaggcaaag gcctggaatg ggtggccgtg attagctatg atggcagcaa caaatattac 180
gccgatagcg tgaaaggccg ctttaccatt agccgcgata acagcaaaaa caccctgtac 240
ctgcaaatga acagcctgcg ggccgaagat accgccgtgt attattgcgc gcgt 294
<210> 226
<211> 291
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 226
gaagtgcagc tggtggaaag cggcggtggc ctgattcagc caggcggtag cctgcgcctg 60
agctgtgccg ccagcggctt taccgttagc agcaactata tgagctgggt tcgccaggcc 120
ccaggcaaag gcctggaatg ggttagcgtg atctatagcg gcggcagcac ctattatgcc 180
gatagcgtga aaggccgctt taccattagc cgcgataaca gcaaaaacac cctgtacctg 240
caaatgaaca gcctgcgggc cgaagatacc gccgtgtatt attgcgcgcg t 291
<210> 227
<211> 294
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 227
gaagtgcagc tggtggaaag cggcggtggc ctggtgcagc caggtggtag cctgcgcctg 60
agctgcgccg ccagcggctt tacctttagc agctattgga tgcattgggt tcgccaggcc 120
ccaggcaaag gcctggtttg ggttagccgc attaacagcg acggcagcag caccagctat 180
gccgatagcg tgaaaggccg ctttaccatt agccgcgata acgccaaaaa caccctgtat 240
ctgcaaatga acagcctgcg ggccgaagat accgccgtgt attattgcgc gcgt 294
<210> 228
<211> 294
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 228
gaagtgcagc tggtgcagag cggtgccgaa gtgaaaaaac cgggcgaaag cctgaaaatc 60
agctgcaaag gcagcggcta tagctttacc agctattgga ttggctgggt tcgccagatg 120
ccgggcaaag gcctggaatg gatgggcatt atctatccgg gcgatagcga tacccgctat 180
agcccgagct ttcagggcca ggttacaatt agcgccgaca aaagcatcag caccgcctat 240
ctgcaatgga gcagcctgaa agccagcgat accgccatgt attattgcgc gcgt 294
<210> 229
<211> 303
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 229
caggtgcagc tgcaacagag cggcccaggc ctggttaaac cgagccagac cctgagcctg 60
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cagagcccga gccgcggtct ggaatggctg ggccgcacct attatcgcag caaatggtac 180
aacgattacg ccgttagcgt gaaaagccgc attaccatta acccggatac cagcaaaaac 240
cagttcagcc tgcaactgaa cagcgtgacc ccggaagata ccgccgtgta ttactgcgcg 300
cgt 303
<210> 230
<211> 88
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 230
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Trp
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Asp Ala Ser Ser Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys
85
<210> 231
<211> 88
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 231
Ala Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Arg Asn Asp
20 25 30
Leu Gly Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys
85
<210> 232
<211> 88
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 232
Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Phe Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser Tyr
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ala Ala Ser Thr Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys
85
<210> 233
<211> 88
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 233
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Val Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser Trp
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys
85
<210> 234
<211> 88
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 234
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Asn Tyr
20 25 30
Leu Ala Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Ser Leu Ile
35 40 45
Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys
85
<210> 235
<211> 88
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 235
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Asn Tyr
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Val Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ala Ala Ser Thr Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys
85
<210> 236
<211> 88
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 236
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys
85
<210> 237
<211> 88
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 237
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys
85
<210> 238
<211> 88
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 238
Glu Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Val Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Asn
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Gly Ala Ser Thr Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ser
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys
85
<210> 239
<211> 89
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 239
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser
20 25 30
Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu
35 40 45
Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu
65 70 75 80
Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys
85
<210> 240
<211> 264
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 240
gatattcaga tgacccagag cccgagcacc ctgagcgcaa gcgtgggcga tcgcgtgacc 60
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cgctttagcg gcagcggtag cggcaccgag ttcaccctga ccattagcag cctgcaaccg 240
gaagactttg ccacctatta ttgc 264
<210> 241
<211> 264
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 241
gccattcaga tgacccagag cccgagcagc ctgagcgcaa gcgtgggcga tcgcgtgacc 60
attacctgcc gcgccagcca gggcattcgc aacgatctgg gctggtatca gcagaaaccg 120
ggcaaagccc cgaaactgct gatctatgcc gccagcagcc tgcaaagcgg cgtgccaagt 180
cgctttagcg gcagcggtag cggcaccgat ttcaccctga ccattagcag tctgcaaccg 240
gaagactttg ccacctatta ttgc 264
<210> 242
<211> 264
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 242
gatattcagc tgacccagag cccgagcttt ctgagcgcca gcgtgggcga tcgcgtgacc 60
attacctgcc gcgccagcca gggcattagc agctatctgg cctggtatca gcagaaaccg 120
ggcaaagccc cgaaactgct gatctatgcc gccagcaccc tgcaaagcgg cgtgccaagc 180
cgctttagcg gcagcggtag cggcaccgag ttcaccctga ccattagcag cctgcaaccg 240
gaagactttg ccacctatta ttgc 264
<210> 243
<211> 264
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 243
gatattcaga tgacccagag cccgagcagc gttagcgcca gcgtgggcga tcgcgtgacc 60
attacctgcc gcgccagtca gggcattagc agctggctgg cctggtatca gcagaaaccg 120
ggcaaagccc cgaaactgct gatctatgcc gccagcagcc tgcaaagcgg cgtgccaagt 180
cgctttagcg gcagcggtag cggcaccgat ttcaccctga ccattagcag tctgcaaccg 240
gaagactttg ccacctatta ttgc 264
<210> 244
<211> 264
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 244
gatattcaga tgacccagag cccgagcagc ctgagcgcaa gcgtgggcga tcgcgtgacc 60
attacctgcc gcgccagcca gggcattagc aactatctgg catggtttca gcagaaaccg 120
ggcaaagccc cgaaaagcct gatctatgcc gccagcagtc tgcaaagcgg cgtgccaagt 180
cgctttagcg gcagcggtag cggcaccgat ttcaccctga ccattagcag cctgcaaccg 240
gaagactttg ccacctatta ttgc 264
<210> 245
<211> 264
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 245
gatattcaga tgacccagag cccgagcagc ctgagcgcaa gcgtgggcga tcgcgtgacc 60
attacctgcc gcgccagcca gggcattagc aactatctgg cctggtatca gcagaaaccg 120
ggcaaagtgc cgaaactgct gatctatgcc gccagcaccc tgcaaagcgg cgtgccaagt 180
cgctttagcg gcagcggtag cggcaccgat ttcaccctga ccattagcag cctgcaaccg 240
gaagacgtgg cgacctatta ttgc 264
<210> 246
<211> 264
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 246
gatattcaga tgacccagag cccgagcagc ctgagcgcca gcgtgggtga tcgcgtgacc 60
attacctgtc gcgcaagcca gagcattagc agctatctga actggtatca gcagaaacca 120
ggcaaagccc caaaactgct gatttatgcc gcaagcagcc tgcaaagcgg tgtgccgagc 180
cgctttagcg gcagcggtag cggcaccgat tttaccctga ccattagtag cctgcaaccg 240
gaagactttg ccacctatta ttgc 264
<210> 247
<211> 264
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 247
gaaattgtgc tgacccagag cccagccacc ctgagcctga gcccaggtga acgcgcaacc 60
ctgagctgtc gcgcaagcca gagcgtgagc agctatctgg cctggtatca acagaaacca 120
ggccaggcac cacgcctgct gatttatgat gccagcaatc gcgcaaccgg cattccggca 180
cgctttagcg gcagcggtag cggcaccgat tttaccctga ccattagcag cctggaaccg 240
gaagactttg ccgtgtatta ttgc 264
<210> 248
<211> 264
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 248
gaaattgtga tgacccagag cccggccacc ctgagcgtta gcccaggcga acgcgcaacc 60
ctgagctgtc gcgccagtca gagcgttagc agcaacctgg cctggtatca gcagaaaccg 120
ggtcaggccc cacgcctgct gatctatggt gccagcaccc gcgccaccgg cattccagca 180
cgctttagcg gcagcggtag cggcaccgag ttcaccctga ccattagcag cctgcaaagc 240
gaagactttg ccgtgtatta ttgc 264
<210> 249
<211> 267
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 249
gaaattgtgc tgacccagag cccgggcacc ctgagcctga gcccaggcga acgcgcaacc 60
ctgagctgtc gcgccagtca gagcgttagc agcagctatc tggcctggta tcagcagaaa 120
ccgggccagg ccccacgcct gctgatctat ggtgccagca gccgcgccac cggcattcca 180
gatcgcttta gcggcagcgg tagcggcacc gatttcaccc tgaccattag ccgcctggaa 240
ccggaagact ttgccgtgta ttattgc 267
<210> 250
<211> 90
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 250
Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Gly Ala Pro Gly Gln
1 5 10 15
Arg Val Thr Ile Ser Cys Thr Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ala Gly
20 25 30
Tyr Asp Val His Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu
35 40 45
Leu Ile Tyr Gly Asn Ser Asn Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe
50 55 60
Ser Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Thr Gly Leu
65 70 75 80
Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys
85 90
<210> 251
<211> 89
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 251
Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly Gln
1 5 10 15
Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ser Asn
20 25 30
Tyr Val Tyr Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu
35 40 45
Ile Tyr Arg Asn Asn Gln Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu Arg
65 70 75 80
Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys
85
<210> 252
<211> 89
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 252
Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Ala Ala Pro Gly Gln
1 5 10 15
Lys Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Asn Asn
20 25 30
Tyr Val Ser Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu
35 40 45
Ile Tyr Asp Asn Asn Lys Arg Pro Ser Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Thr Leu Gly Ile Thr Gly Leu Gln
65 70 75 80
Thr Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys
85
<210> 253
<211> 90
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 253
Gln Ser Ala Leu Thr Gln Pro Arg Ser Val Ser Gly Ser Pro Gly Gln
1 5 10 15
Ser Val Thr Ile Ser Cys Thr Gly Thr Ser Ser Asp Val Gly Gly Tyr
20 25 30
Asn Tyr Val Ser Trp Tyr Gln Gln His Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu
35 40 45
Met Ile Tyr Asp Val Ser Lys Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe
50 55 60
Ser Gly Ser Lys Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Ser Gly Leu
65 70 75 80
Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys
85 90
<210> 254
<211> 90
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 254
Gln Ser Ala Leu Thr Gln Pro Ala Ser Val Ser Gly Ser Pro Gly Gln
1 5 10 15
Ser Ile Thr Ile Ser Cys Thr Gly Thr Ser Ser Asp Val Gly Gly Tyr
20 25 30
Asn Tyr Val Ser Trp Tyr Gln Gln His Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu
35 40 45
Met Ile Tyr Glu Val Ser Asn Arg Pro Ser Gly Val Ser Asn Arg Phe
50 55 60
Ser Gly Ser Lys Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Ser Gly Leu
65 70 75 80
Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys
85 90
<210> 255
<211> 90
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 255
Gln Ser Ala Leu Thr Gln Pro Ala Ser Val Ser Gly Ser Pro Gly Gln
1 5 10 15
Ser Ile Thr Ile Ser Cys Thr Gly Thr Ser Ser Asp Val Gly Ser Tyr
20 25 30
Asn Leu Val Ser Trp Tyr Gln Gln His Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu
35 40 45
Met Ile Tyr Glu Gly Ser Lys Arg Pro Ser Gly Val Ser Asn Arg Phe
50 55 60
Ser Gly Ser Lys Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Ser Gly Leu
65 70 75 80
Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys
85 90
<210> 256
<211> 87
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 256
Ser Tyr Glu Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ser Pro Gly Gln
1 5 10 15
Thr Ala Ser Ile Thr Cys Ser Gly Asp Lys Leu Gly Asp Lys Tyr Ala
20 25 30
Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Val Leu Val Ile Tyr
35 40 45
Gln Asp Ser Lys Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Gly Thr Gln Ala Glu
65 70 75 80
Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys
85
<210> 257
<211> 87
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 257
Ser Tyr Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ala Pro Gly Lys
1 5 10 15
Thr Ala Arg Ile Thr Cys Gly Gly Asn Asn Ile Gly Ser Lys Ser Val
20 25 30
His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu Val Ile Tyr
35 40 45
Tyr Asp Ser Asp Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu
65 70 75 80
Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys
85
<210> 258
<211> 270
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 258
cagagcgtgc tgacccagcc accaagcgtg agcggtgcac caggtcagcg cgtgaccatt 60
agctgcaccg gcagcagcag caacattggc gcaggctatg atgtgcattg gtatcagcag 120
ctgccaggca ccgcaccgaa actgctgatt tatggcaaca gcaatcgccc aagcggtgtg 180
ccggatcgct ttagcggcag caaaagcggc accagcgcca gcctggcgat taccggtctg 240
caagccgaag acgaagccga ttattactgc 270
<210> 259
<211> 267
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 259
cagagcgtgc tgacccagcc accaagcgca agcggcaccc caggccagcg cgtgaccatt 60
agctgtagcg gcagcagcag caacattggc agcaactatg tgtactggta tcagcagctg 120
ccgggcaccg ccccgaaact gctgatctat cgcaacaacc agcgcccgag cggcgtgcca 180
gatcgcttta gcggtagcaa aagcggcacc agcgcaagcc tggcgattag cggcctgcgc 240
agcgaagacg aagccgatta ttactgc 267
<210> 260
<211> 267
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 260
cagagcgtgc tgacccagcc gccgagcgtt agcgccgcac caggccagaa agtgaccatt 60
agctgtagcg gcagcagcag caacatcggc aacaactacg ttagctggta tcagcagctg 120
ccgggcaccg ccccgaaact gctgatctat gataacaaca aacgcccgag cggcatcccg 180
gatcgcttta gcggtagcaa aagcggcacc agcgccaccc tgggcattac cggcctgcaa 240
accgaagacg aagccgatta ttactgc 267
<210> 261
<211> 270
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 261
cagagcgccc tgacccagcc acgcagcgtt agcggtagcc caggccagag cgtgaccatt 60
agctgcaccg gcaccagcag cgacgtgggc ggctataact acgttagctg gtatcagcag 120
catccgggca aagccccgaa actgatgatc tatgatgtta gcaaacgccc gagcggcgtg 180
ccggatcgct ttagcggcag caaaagcggc aacaccgcca gcctgaccat cagcggcctg 240
caagccgaag acgaagccga ttattactgc 270
<210> 262
<211> 270
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 262
cagagcgccc tgacccagcc agccagcgtt agcggtagcc caggccagag cattaccatt 60
agctgcaccg gcaccagcag cgacgtgggc ggctataact acgttagctg gtatcagcag 120
catccgggca aagccccgaa actgatgatc tatgaagtta gcaaccgccc gagcggcgtt 180
agcaatcgct ttagcggcag caaaagcggc aacaccgcca gcctgaccat tagcggcctg 240
caagccgaag acgaagccga ttattactgc 270
<210> 263
<211> 270
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 263
cagagcgccc tgacccagcc agccagcgtt agcggtagcc caggccagag cattaccatt 60
agctgcaccg gcaccagcag cgacgtgggc agctataacc tggttagctg gtatcagcag 120
catccgggca aagccccgaa actgatgatc tatgaaggca gcaaacgccc gagcggcgtt 180
agcaaccgct ttagtggcag caaaagcggc aacaccgcca gcctgaccat tagcggcctg 240
caagccgaag acgaagccga ttattactgc 270
<210> 264
<211> 261
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 264
agctatgaac tgacccagcc gccgagcgtt agcgttagcc caggccagac cgccagcatt 60
acctgtagcg gcgacaaact gggcgacaaa tacgcctact ggtatcagca gaaaccgggc 120
cagagcccgg tgctggttat ctatcaggat agcaaacgcc cgagcggcat tccagaacgc 180
tttagcggca gcaacagcgg caacaccgcc accctgacca ttagcggcac ccaggccgaa 240
gacgaagccg attattactg c 261
<210> 265
<211> 261
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 265
agctatgtgc tgacccagcc gccgagcgtt agcgtggccc caggcaaaac cgcccgcatt 60
acctgcggcg gcaacaacat tggcagcaaa agcgtgcact ggtatcagca gaaaccgggc 120
caggccccgg tgctggttat ctattatgat agcgatcgcc cgagcggcat tccagaacgc 180
tttagcggca gcaacagcgg caacaccgcc accctgacca ttagccgcgt ggaagccgaa 240
gacgaagccg attattactg c 261
<210> 266
<211> 98
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 266
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Gly Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Trp Ile Ser Ala Tyr Gly Gly Asn Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Leu
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Thr Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Arg Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg
<210> 267
<211> 98
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 267
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Ile Ile Asn Pro Ser Gly Gly Ser Thr Ser Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg
<210> 268
<211> 98
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 268
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Gly Ile Ile Pro Ile Phe Gly Thr Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg
<210> 269
<211> 98
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 269
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Trp Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Asn Ile Lys Gln Ser Gly Ser Glu Thr Tyr Tyr Val Glu Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg
<210> 270
<211> 98
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 270
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp His
20 25 30
Tyr Ile Ser Trp Ile Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Tyr Ile Ser Ser Ser Gly Ser Thr Thr Tyr Tyr Ala Glu Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg
<210> 271
<211> 100
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 271
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr
20 25 30
Trp Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Gly Arg Ile Lys Ser Lys Thr Tyr Gly Gly Thr Thr Asp Tyr Ala Glu
50 55 60
Pro Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr
65 70 75 80
Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr
85 90 95
Tyr Cys Ala Arg
100
<210> 272
<211> 98
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 272
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ser Ile Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ser Ile Ser Ser Ser Ser Ser Tyr Thr Tyr Tyr Ala Glu Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg
<210> 273
<211> 98
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 273
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Glu Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg
<210> 274
<211> 98
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 274
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Val Ile Ser Tyr Ser Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Glu Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg
<210> 275
<211> 97
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 275
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Ile Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Val Ser Ser His
20 25 30
Tyr Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Val Ile Tyr Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Glu Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg
<210> 276
<211> 98
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 276
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Trp Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Val Trp Val
35 40 45
Ser Arg Ile Thr Ser Ser Gly Ser Ser Thr Ser Tyr Ala Glu Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg
<210> 277
<211> 98
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 277
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu
1 5 10 15
Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Trp Ile Ser Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Ile Ile Tyr Pro Gly Thr Ser Tyr Thr Arg Tyr Ser Pro Ser Phe
50 55 60
Gln Gly Gln Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg
<210> 278
<211> 101
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 278
Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Ile Ser Gly Gly Ser Val Ser Thr Ser
20 25 30
Ser Ala Ala Trp Asn Trp Ile Arg Gln Ser Pro Ser Arg Gly Leu Glu
35 40 45
Trp Leu Gly Arg Ile Tyr Tyr Arg Ser Lys Trp Tyr Asn Asp Tyr Ala
50 55 60
Val Ser Val Lys Ser Arg Ile Thr Ile Asn Pro Asp Thr Ser Lys Asn
65 70 75 80
Gln Phe Ser Leu Gln Leu Asn Ser Val Thr Pro Glu Asp Thr Ala Val
85 90 95
Tyr Tyr Cys Ala Arg
100
<210> 279
<211> 294
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 279
caggtgcagc tggtgcagag cggtgccgaa gtgaaaaaac caggcgccag cgtgaaagtt 60
agctgcaaag ccagcggcta tacctttacc agctatggca ttagctgggt tcgccaggcc 120
ccaggccagg gtctggaatg gatgggctgg attagcgcct atggcggcaa caccaactac 180
gcccagaaac tgcaaggccg cgtgaccatg accaccgata ccagcaccag caccgcctat 240
atggaactgc gctccctgcg cagcgacgat accgccgtgt attattgcgc gcgt 294
<210> 280
<211> 294
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 280
caggtgcagc tggtgcagag cggtgccgaa gtgaaaaaac caggcgccag cgtgaaagtt 60
agctgcaaag ccagcggcta taccttcacc agctactata ttcattgggt tcgccaggcc 120
ccaggccagg gtctggaatg gatgggcatt attaacccga gcggcggcag caccagctat 180
gcacagaaat ttcagggccg cgtgaccatg acccgcgata ccagcaccag caccgtgtat 240
atggaactga gcagcctgcg cagcgaagat accgccgtgt attattgcgc gcgt 294
<210> 281
<211> 294
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 281
caggtgcagc tggtgcagag cggtgccgaa gtgaaaaaac caggcagcag cgtgaaagtg 60
agctgtaaag ccagcggtta tacctttagc agctatgcca ttagctgggt tcgccaggca 120
ccaggtcagg gtctggaatg gatgggtggc attattccga tttttggcac cgccaactat 180
gcccagaaat ttcagggtcg cgtgaccatt accgcagatg aaagcaccag caccgcctat 240
atggaactga gcagcctgcg cagcgaagat accgcagtgt attattgcgc gcgk 294
<210> 282
<211> 294
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 282
gaagtgcagc tggtggaaag cggcggtggc ctggtgcagc caggtggtag cctgcgcctg 60
agctgcgccg ccagcggctt tacctttagc agctattgga ttagctgggt tcgccaggcc 120
ccaggcaaag gcctggaatg ggtggcgaac atcaaacaga gcggcagcga gacctactat 180
gtggagagcg tgaaaggccg ctttaccatt agccgcgata acgccaaaaa cagcctgtat 240
ctgcaaatga acagcctgcg ggccgaagat accgccgtgt attattgcgc gcgt 294
<210> 283
<211> 294
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 283
caggtgcagc tggtggaaag cggcggtggc ctggtgaaac caggcggtag cctgcgcctg 60
agctgcgccg ccagcggctt tacctttagc gatcattaca ttagctggat tcgccaggcc 120
ccaggcaaag gcctggaatg ggttagctat attagcagca gtggcagcac cacctattac 180
gccgagagcg tgaaaggccg ctttaccatt agccgcgata acgccaaaaa cagcctgtat 240
ctgcaaatga acagcctgcg ggccgaagat accgccgtgt attattgcgc gcgt 294
<210> 284
<211> 300
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 284
gaagtgcagc tggtggaaag cggcggtggc ctggtgaaac caggcggtag cctgcgcctg 60
agctgcgccg ccagcggctt tacctttagc aactattgga ttagctgggt tcgccaggcc 120
ccaggcaaag gcctggaatg ggttggccgc atcaaaagca aaacctatgg cggcaccacc 180
gattatgccg agccagtgaa aggccgcttt accattagcc gcgacgatag caaaaacacc 240
ctgtacctgc aaatgaacag cctgaaaacc gaagataccg ccgtgtatta ttgcgcgcgt 300
<210> 285
<211> 294
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 285
gaagtgcagc tggtggaaag cggcggtggc ctggtgaaac caggcggtag cctgcgcctg 60
agctgcgccg ccagcggctt tacctttagc agctatagca ttaactgggt tcgccaggcc 120
ccaggcaaag gcctggaatg ggttagcagc atcagcagca gtagcagcta tacctattac 180
gccgagagcg tgaaaggccg ctttaccatt agccgcgata acgccaaaaa cagcctgtat 240
ctgcaaatga acagcctgcg ggccgaagat accgccgtgt attattgcgc gcgt 294
<210> 286
<211> 294
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 286
gaagtgcagc tgctggaaag cggtggcggt ctggtgcagc caggtggtag cctgcgcctg 60
agctgtgccg caagcggctt tacctttagc agctatgcca ttagctgggt gcgccaagca 120
ccaggcaaag gcctggaatg ggtgagcgcc attagcggca gcggtggcag cacctattat 180
gccgagagcg tgaaaggtcg ctttaccatt agtcgcgata acagcaaaaa caccctgtat 240
ctgcaaatga acagcctgcg ggcagaagat accgcagttt attattgcgc gcgk 294
<210> 287
<211> 294
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 287
caggtgcagc tggtggaaag cggcggtggc gttgtgcagc caggtcgcag tctgcgcctg 60
agctgtgccg ccagcggctt tacctttagc agctatgcca ttcattgggt tcgccaggcc 120
ccaggcaaag gcctggaatg ggtggccgtg attagctata gcggcagcaa caaatattac 180
gccgagagcg tgaaaggccg ctttaccatt agccgcgata acagcaaaaa caccctgtac 240
ctgcaaatga acagcctgcg ggccgaagat accgccgtgt attattgcgc gcgt 294
<210> 288
<211> 291
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 288
gaagtgcagc tggtggaaag cggcggtggc ctgattcagc caggcggtag cctgcgcctg 60
agctgtgccg ccagcggctt taccgttagc agccattata ttagctgggt tcgccaggcc 120
ccaggcaaag gcctggaatg ggttagcgtg atctatagcg gcggcagcac ctattatgcc 180
gagagcgtga aaggccgctt taccattagc cgcgataaca gcaaaaacac cctgtacctg 240
caaatgaaca gcctgcgggc cgaagatacc gccgtgtatt attgcgcgcg t 291
<210> 289
<211> 294
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 289
gaagtgcagc tggtggaaag cggcggtggc ctggtgcagc caggtggtag cctgcgcctg 60
agctgcgccg ccagcggctt tacctttagc agctattgga ttcattgggt tcgccaggcc 120
ccaggcaaag gcctggtttg ggttagccgc attaccagca gcggcagcag caccagctat 180
gccgagagcg tgaaaggccg ctttaccatt agccgcgata acgccaaaaa caccctgtat 240
ctgcaaatga acagcctgcg ggccgaagat accgccgtgt attattgcgc gcgt 294
<210> 290
<211> 294
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 290
gaagtgcagc tggtgcagag cggtgccgaa gtgaaaaaac cgggcgaaag cctgaaaatc 60
agctgcaaag gcagcggcta tagctttacc agctattgga ttagctgggt tcgccagatg 120
ccgggcaaag gcctggaatg gatgggcatt atctatccgg gcaccagcta tacccgctat 180
agcccgagct ttcagggcca ggttacaatt agcgccgaca aaagcatcag caccgcctat 240
ctgcaatgga gcagcctgaa agccagcgat accgccatgt attattgcgc gcgt 294
<210> 291
<211> 303
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 291
caggtgcagc tgcaacagag cggcccaggc ctggttaaac cgagccagac cctgagcctg 60
acctgcgcca ttagcggcgg cagcgttagc accagcagcg ccgcctggaa ctggattcgc 120
cagagcccga gccgcggtct ggaatggctg ggccgcattt attatcgcag caaatggtac 180
aacgattacg ccgttagcgt gaaaagccgc attaccatta acccggatac cagcaaaaac 240
cagttcagcc tgcaactgaa cagcgtgacc ccggaagata ccgccgtgta ttactgcgcg 300
cgt 303
<210> 292
<211> 33
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(33)
<400> 292
tgg ggc cag ggc acc ctg gtt act gtc tcg agc 33
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
1 5 10
<210> 293
<211> 11
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 293
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
1 5 10
<210> 294
<211> 33
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(33)
<400> 294
tgg ggc cag ggc acc ctg gtt act gtc tcg agc 33
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
1 5 10
<210> 295
<211> 11
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 295
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
1 5 10
<210> 296
<211> 36
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(36)
<400> 296
ttc ggc cag ggt acc aaa gtg gaa atc aag cgc acc 36
Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr
1 5 10
<210> 297
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 297
Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr
1 5 10
<210> 298
<211> 36
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 298
ttcggccagg gtaccaaagt tgaaattaaa cgcacc 36
<210> 299
<211> 36
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(36)
<400> 299
ttc ggc cag cgt acc aaa gtg gaa att aaa cgc acc 36
Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr
1 5 10
<210> 300
<211> 36
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(36)
<400> 300
ttt ggc ggc ggt acc aag ctg acc gtg ctc ggc cag 36
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gln
1 5 10
<210> 301
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 301
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gln
1 5 10
<210> 302
<211> 36
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 302
tttggcggcg gtaccaaact cactgtgctg ggccag 36
<210> 303
<211> 36
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 303
tttggcggcg gtaccaaact cactgtcctg ggccag 36
<210> 304
<211> 990
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polynucleotide
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(990)
<400> 304
gcg tcg acc aaa ggc ccc agc gtg ttc cct ctg gcc ccc agc agc aag 48
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
1 5 10 15
agc acc tct ggc gga aca gcc gcc ctg ggc tgc ctg gtc aag gac tac 96
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
ttc ccc gag ccc gtg acc gtg tcc tgg aac tct ggc gcc ctg acc agc 144
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
ggc gtg cac acc ttt cca gcc gtg ctc cag agc agc ggc ctg tac agc 192
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
ctg agc agc gtc gtg acc gtg ccc agc agc agc ctg ggc acc cag acc 240
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
65 70 75 80
tac atc tgc aac gtg aac cac aag ccc agc aac aca aag gtg gac aag 288
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
cgg gtg gaa ccc aag agc tgc gac aag acc cac acc tgt ccc ccc tgc 336
Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
100 105 110
cct gcc cct gaa ctg ctg gga ggc ccc tcc gtg ttc ctg ttc ccc cca 384
Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
115 120 125
aag cct aag gac acc ctg atg atc agc cgg acc ccc gaa gtg acc tgc 432
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
130 135 140
gtg gtg gtg gac gtg tcc cac gag gac cct gaa gtg aag ttt aat tgg 480
Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp
145 150 155 160
tac gtg gac ggc gtg gaa gtg cac aac gcc aag acc aag ccc aga gag 528
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
165 170 175
gaa cag tac aac agc acc tac cgg gtg gtg tcc gtg ctg acc gtg ctg 576
Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
180 185 190
cac cag gac tgg ctg aac ggc aaa gag tac aag tgc aag gtg tcc aac 624
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
195 200 205
aag gcc ctg cct gcc ccc atc gag aaa acc atc agc aag gcc aaa ggc 672
Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
210 215 220
cag ccc cgc gag ccc cag gtg tac aca ctg ccc cct agc cgg gaa gag 720
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu
225 230 235 240
atg acc aag aac cag gtg tcc ctg acc tgc ctc gtg aag ggc ttc tac 768
Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
245 250 255
ccc agc gac att gcc gtg gaa tgg gag agc aac ggc cag ccc gag aac 816
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
260 265 270
aac tac aag acc acc ccc cct gtg ctg gac agc gac ggc tca ttc ttc 864
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
275 280 285
ctg tac agc aag ctg acc gtg gac aag agc cgg tgg cag cag ggc aac 912
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
290 295 300
gtg ttc agc tgc tcc gtg atg cac gag gcc ctg cac aac cac tac acc 960
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
305 310 315 320
cag aag tcc ctg agc ctg agc ccc ggc aag 990
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
325 330
<210> 305
<211> 330
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 305
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
1 5 10 15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
65 70 75 80
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
100 105 110
Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
115 120 125
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
130 135 140
Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp
145 150 155 160
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
165 170 175
Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
180 185 190
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
195 200 205
Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
210 215 220
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu
225 230 235 240
Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
245 250 255
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
260 265 270
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
275 280 285
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
290 295 300
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
305 310 315 320
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
325 330
<210> 306
<211> 363
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polynucleotide
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(363)
<400> 306
gcg tcg acc aaa ggc ccg agc gtg ttt ccg ctg gcc ccg agc agc aaa 48
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
1 5 10 15
agc acc agc ggc ggc acc gcc gca ctg ggc tgc ctg gtg aaa gat tat 96
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
ttc ccg gaa cca gtg acc gtg agc tgg aac agc ggt gcc ctg acc agc 144
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
ggc gtg cat acc ttt ccg gcg gtg ctg caa agc agc ggc ctg tat agc 192
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
ctg agc agc gtt gtg acc gtg ccg agc agc agc ctg ggc acc cag acc 240
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
65 70 75 80
tat att tgc aac gtc aac cat aaa ccg agc aac acc aaa gtc gat aaa 288
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
aaa gtc gaa ccg aaa agc gaa ttc gac tat aaa gat gac gat gac aaa 336
Lys Val Glu Pro Lys Ser Glu Phe Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys
100 105 110
ggg gcg ccg cac cat cat cac cat cac 363
Gly Ala Pro His His His His His His
115 120
<210> 307
<211> 121
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 307
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
1 5 10 15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
65 70 75 80
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Lys Val Glu Pro Lys Ser Glu Phe Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys
100 105 110
Gly Ala Pro His His His His His His
115 120
<210> 308
<211> 315
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polynucleotide
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(315)
<400> 308
gtg gcc gct ccc tcc gtg ttc atc ttc cca ccc agc gac gag cag ctg 48
Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu
1 5 10 15
aag tcc ggc aca gcc agc gtc gtg tgc ctg ctg aac aac ttc tac ccc 96
Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro
20 25 30
cgc gag gcc aaa gtg cag tgg aag gtg gac aac gcc ctc cag agc ggc 144
Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly
35 40 45
aac agc cag gaa agc gtc acc gag cag gac agc aag gac tcc acc tac 192
Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr
50 55 60
agc ctg agc agc acc ctg acc ctg agc aag gcc gac tac gag aag cac 240
Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His
65 70 75 80
aag gtg tac gcc tgc gaa gtg acc cac cag ggc ctg tcc agc ccc gtg 288
Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val
85 90 95
acc aag agc ttc aac cgg ggc gag tgc 315
Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
100 105
<210> 309
<211> 105
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 309
Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu
1 5 10 15
Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro
20 25 30
Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly
35 40 45
Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr
50 55 60
Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His
65 70 75 80
Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val
85 90 95
Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
100 105
<210> 310
<211> 315
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polynucleotide
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(315)
<400> 310
gtg gcc gca ccg agc gtg ttt atc ttt ccg ccg agc gat gaa cag ctg 48
Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu
1 5 10 15
aaa agc ggc acc gcc agc gtg gtg tgc ctg ctg aac aac ttt tat ccg 96
Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro
20 25 30
cgc gaa gcc aaa gtg cag tgg aaa gtg gat aac gcc ctg caa agc ggc 144
Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly
35 40 45
aac agc cag gaa agc gtt acc gaa cag gat agc aaa gat agc acc tac 192
Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr
50 55 60
agc ctg agc agc acc ctg acc ctg agc aaa gcc gat tat gaa aaa cat 240
Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His
65 70 75 80
aaa gtg tat gcc tgc gaa gtg acc cat cag ggc ctg agc agc cca gtg 288
Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val
85 90 95
acc aaa agt ttt aac cgc ggc gag gcc 315
Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Ala
100 105
<210> 311
<211> 105
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 311
Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu
1 5 10 15
Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro
20 25 30
Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly
35 40 45
Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr
50 55 60
Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His
65 70 75 80
Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val
85 90 95
Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Ala
100 105
<210> 312
<211> 312
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polynucleotide
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(312)
<400> 312
ccc aaa gcc gcc cct agc gtg acc ctg ttc ccc cca agc agc gag gaa 48
Pro Lys Ala Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser Glu Glu
1 5 10 15
ctc cag gcc aac aag gcc acc ctc gtg tgc ctg atc agc gac ttc tac 96
Leu Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp Phe Tyr
20 25 30
cct ggc gcc gtg acc gtg gcc tgg aag gcc gat agc agc cct gtg aag 144
Pro Gly Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Ser Ser Pro Val Lys
35 40 45
gcc ggc gtg gaa acc acc acc ccc agc aag cag agc aac aac aaa tac 192
Ala Gly Val Glu Thr Thr Thr Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn Lys Tyr
50 55 60
gcc gcc agc agc tac ctg agc ctg acc ccc gag cag tgg aag tcc cac 240
Ala Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys Ser His
65 70 75 80
aga tcc tac agc tgc cag gtc aca cac gag ggc agc acc gtg gaa aag 288
Arg Ser Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val Glu Lys
85 90 95
acc gtg gcc ccc acc gag tgc agc 312
Thr Val Ala Pro Thr Glu Cys Ser
100
<210> 313
<211> 104
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 313
Pro Lys Ala Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser Glu Glu
1 5 10 15
Leu Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp Phe Tyr
20 25 30
Pro Gly Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Ser Ser Pro Val Lys
35 40 45
Ala Gly Val Glu Thr Thr Thr Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn Lys Tyr
50 55 60
Ala Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys Ser His
65 70 75 80
Arg Ser Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val Glu Lys
85 90 95
Thr Val Ala Pro Thr Glu Cys Ser
100
<210> 314
<211> 309
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polynucleotide
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(309)
<400> 314
ccg aaa gcc gcc cca agc gtg acc ctg ttt ccg ccg agc agc gaa gaa 48
Pro Lys Ala Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser Glu Glu
1 5 10 15
ctg caa gcc aac aaa gcc acc ctg gtt tgc ctg atc agc gat ttt tat 96
Leu Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp Phe Tyr
20 25 30
ccg ggt gcc gtg acc gtg gcc tgg aaa gcc gat agc agc ccg gtg aaa 144
Pro Gly Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Ser Ser Pro Val Lys
35 40 45
gcc ggc gtg gaa acc acc acc ccg agc aaa cag agc aac aac aaa tat 192
Ala Gly Val Glu Thr Thr Thr Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn Lys Tyr
50 55 60
gcc gcc agc agc tat ctg agc ctg acc ccg gaa cag tgg aaa agc cat 240
Ala Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys Ser His
65 70 75 80
cgc agc tat agt tgt caa gtg acc cat gaa ggc agc acc gtg gaa aaa 288
Arg Ser Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val Glu Lys
85 90 95
acc gtg gcc ccg acc gag gcc 309
Thr Val Ala Pro Thr Glu Ala
100
<210> 315
<211> 103
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 315
Pro Lys Ala Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser Glu Glu
1 5 10 15
Leu Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp Phe Tyr
20 25 30
Pro Gly Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Ser Ser Pro Val Lys
35 40 45
Ala Gly Val Glu Thr Thr Thr Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn Lys Tyr
50 55 60
Ala Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys Ser His
65 70 75 80
Arg Ser Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val Glu Lys
85 90 95
Thr Val Ala Pro Thr Glu Ala
100
Claims (65)
- 합성 항체 또는 이의 기능적 단편의 집합으로, 이때 항체 또는 기능적 단편은 가변 중쇄 및 가변 경쇄 쌍을 포함하고, 가변 중쇄 및 가변 경쇄 쌍의 기본틀 영역은 가변 중쇄 및 가변 경쇄 쌍 SEQ ID NO: 204/SEQ ID NO: 236; SEQ ID NO: 204/SEQ ID NO: 238; SEQ ID NO: 204/SEQ ID NO: 239; SEQ ID NO: 205/SEQ ID NO: 238; SEQ ID NO: 205/SEQ ID NO: 252; SEQ ID NO: 205/SEQ ID NO: 257; SEQ ID NO: 206/SEQ ID NO: 252; SEQ ID NO: 207/SEQ ID NO: 233; SEQ ID NO: 207/SEQ ID NO: 234; SEQ ID NO: 207/SEQ ID NO: 235; SEQ ID NO: 207/SEQ ID NO: 236); SEQ ID NO: 207/SEQ ID NO: 238; SEQ ID NO: 207/SEQ ID NO: 251; SEQ ID NO: 207/SEQ ID NO: 252; SEQ ID NO: 208/SEQ ID NO: 230; SEQ ID NO: 208/SEQ ID NO: 236; SEQ ID NO: 208/SEQ ID NO: 238; SEQ ID NO: 208/SEQ ID NO: 250; SEQ ID NO: 208/SEQ ID NO: 251; SEQ ID NO: 208/SEQ ID NO: 252; SEQ ID NO: 208/SEQ ID NO: 255; SEQ ID NO: 209/SEQ ID NO: 230; SEQ ID NO: 209/SEQ ID NO: 231; SEQ ID NO: 209/SEQ ID NO: 233; SEQ ID NO: 209/SEQ ID NO: 234; SEQ ID NO: 209/SEQ ID NO: 235; SEQ ID NO: 209/SEQ ID NO: 237; SEQ ID NO: 209/SEQ ID NO: 250; SEQ ID NO: 209/SEQ ID NO: 251; SEQ ID NO: 209/SEQ ID NO: 252; SEQ ID NO: 209/SEQ ID NO: 254; SEQ ID NO: 210/SEQ ID NO: 233; SEQ ID NO: 210/SEQ ID NO: 235; SEQ ID NO: 210/SEQ ID NO: 253; SEQ ID NO: 211/SEQ ID NO: 236; SEQ ID NO: 211/SEQ ID NO: 238; SEQ ID NO: 211/SEQ ID NO: 255; SEQ ID NO: 211/SEQ ID NO: 256; SEQ ID NO: 212/SEQ ID NO: 239; SEQ ID NO: 213/SEQ ID NO: 238; SEQ ID NO: 213/SEQ ID NO: 253; SEQ ID NO: 214/SEQ ID NO: 230; SEQ ID NO: 214/SEQ ID NO: 231; SEQ ID NO: 214/SEQ ID NO: 233; SEQ ID NO: 214/SEQ ID NO: 235; SEQ ID NO: 214/SEQ ID NO: 239; SEQ ID NO: 214/SEQ ID NO: 252; SEQ ID NO: 215/SEQ ID NO: 236; SEQ ID NO: 215/SEQ ID NO: 250; SEQ ID NO: 215/SEQ ID NO: 252; SEQ ID NO: 216/SEQ ID NO: 232; SEQ ID NO: 216/SEQ ID NO: 238; SEQ ID NO: 216/SEQ ID NO: 239 및 SEQ ID NO: 216/SEQ ID NO: 252 중 스무 개 이상으로부터 선택되는 생식세포 단백질 서열을 포함하는, 집합.
- 삭제
- 제 1항에 있어서, 가변 중쇄 및 가변 경쇄 쌍의 기본틀 영역은 가변 중쇄 및 가변 경쇄 쌍 SEQ ID NO: 204/SEQ ID NO: 236; SEQ ID NO: 204/SEQ ID NO: 238; SEQ ID NO: 204/SEQ ID NO: 239; SEQ ID NO: 205/SEQ ID NO: 238; SEQ ID NO: 205/SEQ ID NO: 252; SEQ ID NO: 205/SEQ ID NO: 257; SEQ ID NO: 206/SEQ ID NO: 252; SEQ ID NO: 207/SEQ ID NO: 233; SEQ ID NO: 207/SEQ ID NO: 234; SEQ ID NO: 207/SEQ ID NO: 235; SEQ ID NO: 207/SEQ ID NO: 236; SEQ ID NO: 207/SEQ ID NO: 238; SEQ ID NO: 207/SEQ ID NO: 251; SEQ ID NO: 207/SEQ ID NO: 252; SEQ ID NO: 208/SEQ ID NO: 230; SEQ ID NO: 208/SEQ ID NO: 236; SEQ ID NO: 208/SEQ ID NO: 238; SEQ ID NO: 208/SEQ ID NO: 250; SEQ ID NO: 208/SEQ ID NO: 251; SEQ ID NO: 208/SEQ ID NO: 252; SEQ ID NO: 208/SEQ ID NO: 255; SEQ ID NO: 209/SEQ ID NO: 230; SEQ ID NO: 209/SEQ ID NO: 231; SEQ ID NO: 209/SEQ ID NO: 233; SEQ ID NO: 209/SEQ ID NO: 234; SEQ ID NO: 209/SEQ ID NO: 235; SEQ ID NO: 209/SEQ ID NO: 237; SEQ ID NO: 209/SEQ ID NO: 250; SEQ ID NO: 209/SEQ ID NO: 251; SEQ ID NO: 209/SEQ ID NO: 252; SEQ ID NO: 209/SEQ ID NO: 254; SEQ ID NO: 210/SEQ ID NO: 233; SEQ ID NO: 210/SEQ ID NO: 235; SEQ ID NO: 210/SEQ ID NO: 253; SEQ ID NO: 211/SEQ ID NO: 236; SEQ ID NO: 211/SEQ ID NO: 238; SEQ ID NO: 211/SEQ ID NO: 255; SEQ ID NO: 211/SEQ ID NO: 256; SEQ ID NO: 212/SEQ ID NO: 239; SEQ ID NO: 213/SEQ ID NO: 238; SEQ ID NO: 213/SEQ ID NO: 253; SEQ ID NO: 214/SEQ ID NO: 230; SEQ ID NO: 214/SEQ ID NO: 231; SEQ ID NO: 214/SEQ ID NO: 233; SEQ ID NO: 214/SEQ ID NO: 235; SEQ ID NO: 214/SEQ ID NO: 239; SEQ ID NO: 214/SEQ ID NO: 252; SEQ ID NO: 215/SEQ ID NO: 236; SEQ ID NO: 215/SEQ ID NO: 250; SEQ ID NO: 215/SEQ ID NO: 252; SEQ ID NO: 216/SEQ ID NO: 232; SEQ ID NO: 216/SEQ ID NO: 238; SEQ ID NO: 216/SEQ ID NO: 239 및 SEQ ID NO: 216/SEQ ID NO: 252 중 스물 다섯 개 이상으로부터 선택되는 생식세포 단백질 서열을 포함하는, 집합.
- 제3항에 있어서,
가변 중쇄 및 가변 경쇄 쌍의 기본틀 영역은 가변 중쇄 및 가변 경쇄 쌍 SEQ ID NO: 204/SEQ ID NO: 236; SEQ ID NO: 204/SEQ ID NO: 238; SEQ ID NO: 204/SEQ ID NO: 239; SEQ ID NO: 205/SEQ ID NO: 238; SEQ ID NO: 205/SEQ ID NO: 252; SEQ ID NO: 205/SEQ ID NO: 257; SEQ ID NO: 206/SEQ ID NO: 252; SEQ ID NO: 207/SEQ ID NO: 233; SEQ ID NO: 207/SEQ ID NO: 234; SEQ ID NO: 207/SEQ ID NO: 235; SEQ ID NO: 207/SEQ ID NO: 236; SEQ ID NO: 207/SEQ ID NO: 238; SEQ ID NO: 207/SEQ ID NO: 251; SEQ ID NO: 207/SEQ ID NO: 252; SEQ ID NO: 208/SEQ ID NO: 230; SEQ ID NO: 208/SEQ ID NO: 236; SEQ ID NO: 208/SEQ ID NO: 238; SEQ ID NO: 208/SEQ ID NO: 250; SEQ ID NO: 208/SEQ ID NO: 251; SEQ ID NO: 208/SEQ ID NO: 252; SEQ ID NO: 208/SEQ ID NO: 255; SEQ ID NO: 209/SEQ ID NO: 230; SEQ ID NO: 209/SEQ ID NO: 231; SEQ ID NO: 209/SEQ ID NO: 233; SEQ ID NO: 209/SEQ ID NO: 234; SEQ ID NO: 209/SEQ ID NO: 235; SEQ ID NO: 209/SEQ ID NO: 237; SEQ ID NO: 209/SEQ ID NO: 250; SEQ ID NO: 209/SEQ ID NO: 251; SEQ ID NO: 209/SEQ ID NO: 252; SEQ ID NO: 209/SEQ ID NO: 254; SEQ ID NO: 210/SEQ ID NO: 233; SEQ ID NO: 210/SEQ ID NO: 235; SEQ ID NO: 210/SEQ ID NO: 253; SEQ ID NO: 211/SEQ ID NO: 236; SEQ ID NO: 211/SEQ ID NO: 238; SEQ ID NO: 211/SEQ ID NO: 255; SEQ ID NO: 211/SEQ ID NO: 256; SEQ ID NO: 212/SEQ ID NO: 239; SEQ ID NO: 213/SEQ ID NO: 238; SEQ ID NO: 213/SEQ ID NO: 253; SEQ ID NO: 214/SEQ ID NO: 230; SEQ ID NO: 214/SEQ ID NO: 231; SEQ ID NO: 214/SEQ ID NO: 233; SEQ ID NO: 214/SEQ ID NO: 235; SEQ ID NO: 214/SEQ ID NO: 239; SEQ ID NO: 214/SEQ ID NO: 252; SEQ ID NO: 215/SEQ ID NO: 236; SEQ ID NO: 215/SEQ ID NO: 250; SEQ ID NO: 215/SEQ ID NO: 252; SEQ ID NO: 216/SEQ ID NO: 232; SEQ ID NO: 216/SEQ ID NO: 238; SEQ ID NO: 216/SEQ ID NO: 239 및 SEQ ID NO: 216/SEQ ID NO: 252 중 서른 개 이상으로부터 선택되는 생식세포 단백질 서열을 포함하는, 집합. - 제1항에 있어서,
가변 중쇄 및 가변 경쇄 쌍의 기본틀 영역은 가변 중쇄 및 가변 경쇄 쌍 SEQ ID NO: 204/SEQ ID NO: 239; SEQ ID NO: 205/SEQ ID NO: 238; SEQ ID NO: 205/SEQ ID NO: 252; SEQ ID NO: 206/SEQ ID NO: 252; SEQ ID NO: 207/SEQ ID NO: 233; SEQ ID NO: 207/SEQ ID NO: 235; SEQ ID NO: 207/SEQ ID NO: 238; SEQ ID NO: 207/SEQ ID NO: 251; SEQ ID NO: 207/SEQ ID NO: 252; SEQ ID NO: 208/SEQ ID NO: 250; SEQ ID NO: 208/SEQ ID NO: 251; SEQ ID NO: 208/SEQ ID NO: 252; SEQ ID NO: 208/SEQ ID NO: 255; SEQ ID NO: 209/SEQ ID NO: 230; SEQ ID NO: 209/SEQ ID NO: 231; SEQ ID NO: 209/SEQ ID NO: 233; SEQ ID NO: 209/SEQ ID NO: 235; SEQ ID NO: 209/SEQ ID NO: 237; SEQ ID NO: 209/SEQ ID NO: 252; SEQ ID NO: 210/SEQ ID NO: 233; SEQ ID NO: 211/SEQ ID NO: 236; SEQ ID NO: 211/SEQ ID NO: 238; SEQ ID NO: 211/SEQ ID NO: 255; SEQ ID NO: 211/SEQ ID NO: 256; SEQ ID NO: 213/SEQ ID NO: 238; SEQ ID NO: 213/SEQ ID NO: 253; SEQ ID NO: 214/SEQ ID NO: 230; SEQ ID NO: 214/SEQ ID NO: 231; SEQ ID NO: 214/SEQ ID NO: 233; SEQ ID NO: 214/SEQ ID NO: 239; SEQ ID NO: 215/SEQ ID NO: 236; SEQ ID NO: 215/SEQ ID NO: 250; SEQ ID NO: 215/SEQ ID NO: 252; SEQ ID NO: 216/SEQ ID NO: 232; SEQ ID NO: 216/SEQ ID NO: 239 및 SEQ ID NO: 216/SEQ ID NO: 252의 생식세포 단백질 서열을 포함하는, 집합. - 제1항에 있어서, 가변 중쇄 및 가변 경쇄 쌍의 기본틀 영역은 가변 중쇄 및 가변 경쇄 쌍 SEQ ID NO: 204/SEQ ID NO: 239; SEQ ID NO: 205/SEQ ID NO: 238; SEQ ID NO: 205/SEQ ID NO: 252; SEQ ID NO: 206/SEQ ID NO: 252; SEQ ID NO: 207/SEQ ID NO: 233; SEQ ID NO: 207/SEQ ID NO: 235; SEQ ID NO: 207/SEQ ID NO: 238; SEQ ID NO: 207/SEQ ID NO: 251; SEQ ID NO: 207/SEQ ID NO: 252; SEQ ID NO: 208/SEQ ID NO: 250; SEQ ID NO: 208/SEQ ID NO: 251; SEQ ID NO: 208/SEQ ID NO: 252; SEQ ID NO: 208/SEQ ID NO: 255; SEQ ID NO: 209/SEQ ID NO: 230; SEQ ID NO: 209/SEQ ID NO: 231; SEQ ID NO: 209/SEQ ID NO: 233; SEQ ID NO: 209/SEQ ID NO: 235; SEQ ID NO: 209/SEQ ID NO: 237; SEQ ID NO: 209/SEQ ID NO: 252; SEQ ID NO: 210/SEQ ID NO: 233; SEQ ID NO: 211/SEQ ID NO: 238; SEQ ID NO: 213/SEQ ID NO: 238; SEQ ID NO: 213/SEQ ID NO: 253; SEQ ID NO: 214/SEQ ID NO: 230; SEQ ID NO: 214/SEQ ID NO: 231; SEQ ID NO: 214/SEQ ID NO: 233; SEQ ID NO: 214/SEQ ID NO: 239; SEQ ID NO: 215/SEQ ID NO: 236; SEQ ID NO: 215/SEQ ID NO: 250; SEQ ID NO: 215/SEQ ID NO: 252; SEQ ID NO: 216/SEQ ID NO: 232; SEQ ID NO: 216/SEQ ID NO: 239 및 SEQ ID NO: 216/SEQ ID NO: 252의 생식세포 단백질 서열을 포함하는, 집합.
- 삭제
- 제6항에 있어서,
가변 중쇄 및 가변 경쇄 쌍의 기본틀 영역은 가변 중쇄 및 가변 경쇄 쌍 SEQ ID NO: 211/SEQ ID NO: 236; SEQ ID NO: 211/SEQ ID NO: 255; 및 SEQ ID NO: 211/SEQ ID NO: 256으로부터 선택되는 생식세포 단백질 서열을 더 포함하는, 집합. - 제1항, 제 3항 내지 제 6항 및 제8항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 항체 또는 이의 기능적 단편은 각각의 가변 중쇄 및 가변 경쇄 쌍으로부터의 생식세포 단백질 서열을 포함하는 하나 이상의 상보성 결정 영역을 포함하는, 집합. - 제9항에 있어서,
상기 항체 또는 이의 기능적 단편은 각각의 가변 중쇄 및 가변 경쇄 쌍으로부터의 생식세포 단백질 서열을 포함하는 CDR1 영역을 포함하는, 집합. - 제9항에 있어서,
상기 항체 또는 이의 기능적 단편은 각각의 가변 중쇄 및 가변 경쇄 쌍으로부터의 생식세포 단백질 서열을 포함하는 CDR2 영역을 포함하는, 집합. - 제9항에 있어서,
상기 항체 또는 이의 기능적 단편은 잠재적인 번역 후 변형 부위를 제거하는 아미노산 변형을 포함하는 하나 이상의 상보성 결정 영역을 포함하는, 집합. - 제12항에 있어서,
상기 항체 또는 이의 기능적 단편은 SEQ ID NO: 266 내지 SEQ ID NO: 278에 기술된 각각의 가변 중쇄로부터의 상보성 결정 영역 서열을 포함하는 하나 이상의 중쇄 상보성 결정 영역을 포함하는, 집합. - 제13항에 있어서,
상기 항체 또는 이의 기능적 단편은 SEQ ID NO: 266 내지 SEQ ID NO: 278에 기술된 각 HCDR1 영역으로부터의 HCDR1 영역을 포함하는, 집합. - 제13항에 있어서,
상기 항체 또는 이의 기능적 단편은 SEQ ID NO: 266 내지 SEQ ID NO: 278에 기술된 각 HCDR2 영역으로부터의 HCDR2 영역을 포함하는, 집합. - 제13항에 있어서,
상기 항체 또는 이의 기능적 단편은 SEQ ID NO: 293, SEQ ID NO: 297 및 SEQ ID NO: 301로 이루어진 군으로부터 선택되는 FR4 영역을 포함하는, 집합. - 제13항에 있어서,
상기 항체 또는 이의 기능적 단편은 다양화된 HCDR3 영역을 포함하는, 집합. - 제13항에 있어서,
상기 항체 또는 이의 기능적 단편은 다양화된 LCDR3 영역을 포함하는, 집합. - 제1항, 제 3항 내지 제 6항 및 제8항 중 어느 한 항에 있어서,
집합은 적어도 1 X 104개의 항체 또는 이의 기능적 단편을 포함하는, 집합. - 제1항, 제 3항 내지 제 6항 및 제8항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 항체는 인간 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA, IgE, IgM 및 IgD로 이루어진 군으로부터 선택되는, 집합. - 제1항, 제 3항 내지 제 6항 및 제8항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 항체의 상기 기능적 단편은 Fab, F(ab')2, Fab’, Fv 및 scFv로 이루어진 군으로부터 선택되는, 집합. - 제1항, 제 3항 내지 제 6항 및 제8항 중 어느 한 항에 따른 항체 또는 이의 기능적 단편의 집합을 암호화하는 핵산의 집합.
- 제22항에 따른 핵산의 집합을 포함하는 벡터.
- 제23항의 벡터를 포함하는 재조합 숙주 세포.
- a) 인간 면역 레퍼토리에 존재하는 가변 중쇄 및 가변 경쇄 생식세포 유전자 쌍을 확인하는 단계;
b) 다음과 같은 특성에 대해 a) 단계에서 확인된 가변 중쇄 및 가변 경쇄 생식세포 단백질 쌍을 시험하는 단계:
i) 1.538mL/mg의 흡광계수를 이용하고 280nm에서 흡광도를 측정하는 UV 분광측정법으로 확인한, 적어도 2.5mg/L의 Fab 포맷의 발현 수율;
ii) Fab 포맷의 70℃ 이상의 열 안정성;
iii) 크기 배제 크로마토그래피(SEC)로 확인한, 적어도 98%의 Fab 포맷의 단량체 함량(단량체 %);
iv) 1.369mL/mg의 흡광계수를 이용하고 280nm에서 흡광도를 측정하는 UV 분광측정법으로 확인한, 적어도 30mg/L의 IgG1 포맷의 발현 수율;
v) IgG1 포맷의 73℃ 이상의 열 안정성; 및
vii) SEC로 확인한, 적어도 99%의 IgG1 포맷의 단량체 함량(단량체 %); 및
c) 제 1항에 따른 집합을 생성하는 단계를 포함하는,
합성 항체 또는 이의 기능적 단편의 집합을 생산하는 방법. - 삭제
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 삭제
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- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 삭제
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- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- (a) 항원을 제 1항에 따른 항체 또는 이의 기능적 단편의 집합과 접촉시키는 단계, 및
(b) 상기 항원에 결합하는 하나 이상의 항체 또는 항체 단편을 선택하는 단계를 포함하는,
항원에 대해 특이적인 항체 또는 항체 단편을 동정하는 방법. - 삭제
- 삭제
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- 삭제
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