KR101910099B1 - 미성숙 감으로부터 가압 열수 방법으로 추출한 추출물 유효성분으로 포함하는 지질대사 개선 또는 항비만용 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 미성숙 감으로부터 가압 열수 추출하는 단계 및 상기 가압 열수 추출물을 흡착수지를 이용하여 정제하는 단계를 포함하는 미성숙 감으로부터 폴리페놀을 추출하는 방법을 이용하여 추출한 폴리페놀 추출물을 유효성분으로 포함하는 지질대사 개선 또는 항비만용 조성물 및 상기 폴리페놀 추출물 또는 이의 식품학적으로 허용 가능한 염을 포함하는 지질대사 개선 또는 항비만용 건강기능식품에 관한 것이다.

Description

미성숙 감으로부터 가압 열수 방법으로 추출한 추출물 유효성분으로 포함하는 지질대사 개선 또는 항비만용 조성물 {Compositions for improving lipid metabolism or anti-obesity as an active ingredient extracted from an immature persimmon by pressurized hydrothermal method}

본 발명은 미성숙 감으로부터 가압 열수 추출하는 단계 및 상기 가압 열수 추출물을 흡착수지를 이용하여 정제하는 단계를 포함하는 미성숙 감으로부터 폴리페놀을 추출하는 방법을 이용하여 추출한 폴리페놀 추출물을 유효성분으로 포함하는 지질대사 개선 또는 항비만용 조성물 및 상기 폴리페놀 추출물 또는 이의 식품학적으로 허용 가능한 염을 포함하는 지질대사 개선 또는 항비만용 건강기능식품에 관한 것이다.

감은 중국의 중북부, 한국 중부 이남에 분포하는 감나무과의 낙엽 교목이다. 감은 영양가치가 매우 높은 과일중의 하나로 다른 과일에 비해서 수분은 적지만 당분은 주로 포도당과 과당으로 약 14% (v/v) 정도가 포함되어 있다. 감에는 유기산 함량은 적지만 펙틴, 카로티노이드가 함유되어 있고 또한 떫은 맛을 내며 고혈압 예방, 혈중 알코올의 상승률을 낮추는 탄닌, 비타민 C, 비타민 A, 무기염류로는 칼륨과 마그네슘도 많이 포함되어 있다.

또한, 감의 탄닌 성분은 위궤양이나 설사 등의 소화기 질환에 좋으며, 이는 탄닌산의 강한 수렴작용으로 인한 것이다. 탄닌산의 수렴작용은 화상의 회복에도 효과적이다. 감의 탄닌은 예로부터 중풍약으로 사용되어 왔다. 중풍은 일반적으로 고혈압이 주원인으로, 뇌출혈 후에 오는 마비상태를 말하는데, 감 탄닌은 고혈압 예방효과가 있어 중풍약으로 이용된다. 또한 탄닌은 동상이나 손발 트는 것을 예방 또는 치료하는 효과가 있으며, 세균 감염을 방지하여 염증이나 피부가 짓무르는 증상의 치유를 촉진한다. 뿐만 아니라, 탄닌은 뱀에 물렸을 때 상처에 도포하면 강한 항독작용을 나타낸다. 탄닌의 가장 중요한 효능은 니코틴과 결합하여 이를 체외로 방출시키는 것이다. 탄닌은 또한, 다른 유해성 금속류와도 잘 결합을 하여 해독작용을 하며, 병원균에 침투하여 단백질과 결합, 응고하여 균을 죽게 한다.

이러한 다양한 생리활성을 가진 탄닌 성분은 감의 성숙과정 중 주로 미성숙 상태인 어린 감에 다량 존재하며, 성숙된 감으로 성장 시 그 함량이 감소되는 경향을 보이고, 따라서 특유의 떫은 맛이 감소되는 특징이 있다. 그러나, 이러한 미성숙감으로부터 탄닌뿐만 아니라 이를 포함하는 폴리페놀이 증가된 추출물을 제조하는 공정, 및 상기 제조공정에 의해서 생산된 추출물의 용도에 관하여는 현재까지 알려진 바가 없다.

이와 관련하여, 종래기술의 한 예로써 한국공개특허 제2009-0084159호는 감 추출물 또는 탄닌을 유효성분으로 함유하는 면역관련질환 치료용 조성물에 관한 것으로서, 감을 파쇄하고 C3-6의 저급 알코올, 물, 또는 C3-6의 저급 유기산 등의 용매를 사용하여, 실온에서 1차 추출하고, 이에서 80℃에서 30분간 중탕하여 2차 추출하는 방법을 개시하였다. 그러나, 상기 추출 방법은 미성숙감에 관한 것이 아니며, 폴리페놀에 관하여는 구체적으로 언급하고 있지 않고, 추출물에 대하여 추가적으로 정제공정을 수행함에 대하여 기재하고 있지 않으며, 상기 추출물의 용도에 대해서는 구체적으로 기재하고 있지 않다.

이와 같이, 종래 기술에서는 감의 탄닌을 추출하기 위한 방법에 관하여는 일부 개시된 바 있으나, 미성숙 감으로부터 본 발명자들이 완성한 새로운 추출 방법인 가압추출 및 정제공정을 거쳐 탄닌을 포함한 폴리페놀이 증진된 추출물을 제조하는 방법 및 이의 용도인 지질대사 개선에 대하여는 현재까지 알려져 있지 않다.

이에 본 발명자들은 떫은 맛 성분인 탄닌을 다량 함유한 미성숙 감으로부터 특이하게 탄닌을 포함한 폴리페놀 성분이 증진된 추출방법을 새로이 발명하고, 상기 방법을 이용하여 추출한 추출물을 유효성분으로 포함하는 지질대사 개선 또는 항비만용 조성물을 개발하여 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 하나의 목적은 미성숙 감으로부터 가압 열수 추출하는 단계 및 상기 가압 열수 추출물을 흡착수지를 이용하여 정제하는 단계를 포함하는 미성숙 감으로부터 폴리페놀을 추출하는 방법을 이용하여 추출한 폴리페놀 추출물을 유효성분으로 포함하는 지질대사 개선 또는 항비만용 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 미성숙 감으로부터 가압 열수 추출하는 단계 및 상기 가압 열수 추출물을 흡착수지를 이용하여 정제하는 단계를 포함하는 미성숙 감으로부터 폴리페놀을 추출하는 방법을 이용하여 추출한 폴리페놀 추출물을 유효성분으로 포함하는 지질대사 질환의 예방 및 치료용 약학 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 미성숙 감으로부터 가압 열수 추출하는 단계 및 상기 가압 열수 추출물을 흡착수지를 이용하여 정제하는 단계를 포함하는 미성숙 감으로부터 폴리페놀을 추출하는 방법을 이용하여 추출한 폴리페놀 추출물 또는 이의 식품학적으로 허용 가능한 염을 포함하는 지질대사 개선 또는 항비만용 건강기능식품을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 미성숙 감으로부터 가압 열수 추출하는 단계 및 상기 가압 열수 추출물을 흡착수지를 이용하여 정제하는 단계를 포함하는 미성숙 감으로부터 폴리페놀을 추출하는 방법을 이용하여 추출한 폴리페놀 추출물 또는 식품학적으로 허용 가능한 염을 포함하는 지질대사 질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품을 제공하는 것이다.

본 발명에서 미성숙 감이라 함은 과육이 익지 않은 상태의 감을 의미하며 완숙한 감은 과육이 익은 상태의 감을 의미하고, 예컨대, 미성숙 감은 재배 후 대략 6~9개월에 수확한 감으로, 외형상 녹색을 띄고 크기는 직경 3~10㎝ 정도의 미성숙한 떫은 맛의 감일 수 있다. 또한, 미성숙 감은 수확일 이전에 수확한 감이며, 통상적 수확시기인 10월 이전에 바람 등의 자연적 요인 또는 재배 과정상의 요인으로 낙과한 감이고, 떫은 맛이 나서 식품으로서 가치가 떨어지는 것으로 알려져 있다. 감이 성숙하면서 탈삽기작 (removal of astringency)이 일어나므로, 성숙한 감의 경우 세포 내 호흡에 의하여 생긴 에탄올이 감 속의 알코올 분해효소에 의하여 탈수소되어 아세트알데하이드로 되고 이것이 다시 탄닌과 축합하여 불용성 물질로 변환되지만, 미성숙 감의 경우 세포 내 호흡이 상대적으로 덜 일어나게 되므로 세포 내 호흡에 의하여 생긴 에탄올이 탄닌과 축합하여 불용성 물질로 변환되지 않아 탄닌의 양이 유지되게 된다. 이러한 이유로 완숙한 감에 비해서 미성숙 감에 탄닌을 포함한 폴리페놀 함량이 보다 높은 것으로 알려져 있고, 따라서, 성숙 감에 비해서 미성숙 감이 폴리페놀 추출물을 생산하기 위한 대상 물질로 적합하다.

본 발명의 일예는 미성숙 감으로부터 가압 열수 추출하는 단계 및 상기 가압 열수 추출물을 흡착수지를 이용하여 정제하는 단계를 포함하는 미성숙 감으로부터 폴리페놀을 추출하는 방법을 이용하여 추출한 폴리페놀 추출물을 유효성분으로 포함하는 지질대사 개선 또는 항비만용 조성물에 관한 것이다.

상기 미성숙 감으로부터 가압 열수 추출하는 단계 및 상기 가압 열수 추출물을 흡착수지를 이용하여 정제하는 단계를 포함하는 미성숙 감으로부터 폴리페놀을 추출하는 방법을 이용하여 폴리페놀 등의 기능성 물질의 독성 및 안전성 등에 영향을 줄 수 있는 인자들을 최대한 배제하고, 미성숙 감 추출물에 존재할 수 있는 당을 최대한 제거하며, 다양한 농도의 주정으로 용출하여 폴리페놀의 함량을 향상시킬 수 있다.

본 발명의 또 다른 일예는 미성숙 감으로부터 가압 열수 추출하는 단계 및 상기 가압 열수 추출물을 흡착수지를 이용하여 정제하는 단계를 포함하는 미성숙 감으로부터 폴리페놀을 추출하는 방법을 이용하여 추출한 폴리페놀 추출물을 유효성분으로 포함하는 지질대사 질환의 예방 및 치료용 약학 조성물에 관한 것이다.

본 발명의 또 다른 일예는 미성숙 감으로부터 가압 열수 추출하는 단계 및 상기 가압 열수 추출물을 흡착수지를 이용하여 정제하는 단계를 포함하는 미성숙 감으로부터 폴리페놀을 추출하는 방법을 이용하여 추출한 폴리페놀 추출물 또는 이의 식품학적으로 허용 가능한 염을 포함하는 지질대사 개선 또는 항비만용 건강기능식품에 관한 것이다.

본 발명의 또 다른 일예는 미성숙 감으로부터 가압 열수 추출하는 단계 및 상기 가압 열수 추출물을 흡착수지를 이용하여 정제하는 단계를 포함하는 미성숙 감으로부터 폴리페놀을 추출하는 방법을 이용하여 추출한 폴리페놀 추출물 또는 식품학적으로 허용 가능한 염을 포함하는 지질대사 질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품에 관한 것이다.

이하, 본 발명을 더욱 자세히 설명하고자 한다.

본 발명은 미성숙 감으로부터 가압 열수 추출하는 단계 및 상기 가압 열수 추출물을 흡착수지를 이용하여 정제하는 단계를 포함하는 미성숙 감으로부터 폴리페놀을 추출하는 방법을 이용하여 추출한 폴리페놀 추출물을 유효성분으로 포함하는 지질대사 개선 또는 항비만용 조성물에 관한 것이다.

상기 미성숙 감은 재배 후 대략 6~9개월에 수확한 감으로, 외형상 녹색을 띄고 크기는 직경 3~10㎝ 정도의 미성숙한 떫은 맛의 감을 의미할 수 있고, 상기 상기 미성숙 감의 폴리페놀 함량은 0.05 내지 5 mg/mL일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 폴리페놀 함량은 전체 감 부피중에 존재하는 폴리페놀의 질량을 의미할 수 있다.

바람직하게, 본 발명에 따른 지질대사 개선 또는 항비만용 조성물을 얻기 위해서 미성숙 감으로부터 폴리페놀 추출물을 얻는 방법에서 상기 미성숙 감으로부터 용이하게 폴리페놀을 추출하기 위하여, 적절한 가공 공정, 예를 들어, 절단, 건조 및/또는 분말화할 수 있다. 이러한 미성숙감은 분말 형태인 것이 바람직하다. 본 발명의 구체적인 일예에서는 상기 미성숙 감을 적절한 온도, 예를 들어, 60℃에서 열풍건조 가공하여 미성숙 감 분말을 준비하고, 상기 미성숙 감 분말을 용매에 넣고, 가압증기 멸균하여 폴리페놀을 가압 열수 추출하였다.

상기 미성숙 감으로부터 폴리페놀 추출물을 얻는 방법에서 가압 열수 추출하는 공정에서는 상기와 같이 가공된 미성숙 감, 예를 들어 미성숙 감 분말을 추출 용매에 넣어, 가압하여 일정 온도를 유지하여 추출할 수 있다. 바람직하게, 상기 추출 용매는 물 (정제수) 및 주정으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상이나 이에 제한되는 것은 아니고, 더욱 바람직하게는 30 내지 90% (v/v), 가장 바람직하게는 70% (v/v)의 주정일 수 있다. 이러한 추출 용매의 부피는 미성숙 감 1 g당 용매 10 내지 100 mL을 사용할 수 있다.

상기 가압 열수 추출은 0.1 내지 0.4 MPa의 압력 및 95 내지 150℃에서 수행되는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

바람직하게, 상기 가압 열수 추출하는 단계 이후 및 상기 가압 열수 추출물을 흡착수지를 이용하여 정제하는 단계 이전에, 추출된 산물을 여과하는 단계 및 농축하는 단계를 추가적으로 포함할 수 있다.

따라서, 여과 및 농축단계를 포함하는 경우, 미성숙 감을 가압 열수 추출하고, 이 가압 열수 추출물을 여과하고 이후 감압농축 하고, 정제하는 과정을 통해 미성숙 감으로부터 폴리페놀을 추출할 수 있다. 상기 여과 단계는 통상의 추출물의 여과방법을 제한없이 사용할 수 있고, 바람직하게는 여과지 등을 사용할 수 있다.

상기 농축 단계에서는 상기 가압 열수 추출물을 여과한 여과물을, 10 내지 100 brix의 농축물로 만드는 과정일 수 있고, 바람직하게, 여과물은 농축 공정을 통해, 20 내지 100 brix, 30 내지 100 brix, 40 내지 100 brix, 20 내지 80 brix, 20 내지 60 brix, 30 내지 100 brix, 또는 30 내지 80 brix의 농축물로 만들어질 수 있다.

본 발명의 일예에서 상기 농축 단계에서는 여과물을 20 brix의 농축물로 제조하거나 40 brix의 고도 농축물로 제조하였고, 이 경우 여과물을 농축하기 이전에 비해서 농축 (20 brix, 또는 40 brix)하는 경우 추출물에 존재하는 폴리페놀의 함량이 현저하게 증가하였고, 여과물을 고도 농축 (40 brix)하는 경우 추출물에 존재하는 폴리페놀의 함량은 여과물을 농축하기 이전 또는 20 brix로 농축하는 경우 추출물에 존재하는 폴리페놀에 비해서 현저하게 증가하였다.

상기 "brix"는 가압 열수 추출 방식에 의해 추출된 액상의 추출액 내에 녹아 있는 형태로 존재하는 성분들의 총 함량을 나타내는 농도 단위를 의미한다.

이와 같이 가압 열수 추출된 미성숙감의 추출물을 여과 및 농축한 농축물을 정제하여 최종적으로 고함량으로 폴리페놀이 포함되는 미성숙감의 추출물을 제조할 수 있다. 상기 정제 단계에서 사용하는 흡착수지는 흡착수지는 다수의 세공이 존재하여 비표면적이 넓은 것일 수 있으며, 상기 흡착수지를 이용하여 정제한 정제물은 추가적인 식품 안전성 검증이 필요 없고, 곧바로 식품에 사용이 가능할 수 있다.

상기 정제과정에서는 Diaion-HP 20 (하기 화학식 1) (MITSUBISHI CHEMICAL, Diaion-HP 20)을 흡착수지로 사용할 수 있고, 상기 흡착수지로 사용한 Diaion-HP 20는 다수의 세공이 존재하여 비표면적이 높아 물질의 흡착에 유리한 것으로 알려져 있다,

또한, 상기 흡착수지는 미국 FDA에서 식품, 약품, 화장품에 이용 가능한 식품 첨가물로서 인정 받았으며, 국내에서 식품 첨가물로 허가 받은 바 있기 때문에, 상기 수지로 분리해낸 정제물은 추가 공정 없이 식품에 이용 가능하다.

상기 흡착수지는 Diaion-HP 20 (하기 화학식 1) (MITSUBISHI CHEMICAL, Diaion-HP 20) 또는 Amberlite XAD-2, Bio-beads SM-2 일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

[화학식 1]

상기 폴리페놀은 탄닌류로서 갈릭산, 카테킨류 (catechin, catechin-3-gallate, gallocatechin, gallocatechin-3-gallate), 탄닌산 일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 방법에 의해서 추출한 폴리페놀 추출물에서 폴리페놀의 농도는 3 내지 800 mg/mL일 수 있고, 상기 폴리페놀의 농도는 전체 감 용량 중에 존재하는 폴리페놀의 질량을 의미할 수 있다.

본 발명에서는 상기 추출방법을 이용하여 미성숙 감으로부터 추출한 폴리페놀 추출물을 유효성분으로 포함하는 조성물이 지질대사 개선 또는 항비만용 용도가 있음을 확인하였다.

본 발명은 미성숙 감으로부터 가압 열수 추출하는 단계 및 상기 가압 열수 추출물을 흡착수지를 이용하여 정제하는 단계를 포함하는 미성숙 감으로부터 폴리페놀을 추출하는 방법을 이용하여 추출한 폴리페놀 추출물을 유효성분으로 포함하는 지질대사 개선 또는 항비만용 조성물에 관한 것이다.

상기 지질대사는 콜레스테롤 대사 또는 중성지질 대사를 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

용어 "콜레스테롤"은 동물세포의 세포막을 구성하는 데 필요한 기본 물질로, 식물에서는 합성되지 않고 동물에서만 합성된다. 사람의 담석에서 처음 분리되었는데 그리스어로 chole는 담즙, steroes는 고체라는 의미가 있어 콜레스테롤이라는 이름이 붙었다. 여러 가지 생물학적 스테로이드 물질의 전구체(precursor) 역할을 하며 특히 성호르몬ㆍ부신피질호르몬 등은 스테로이드 호르몬이기 때문에 콜레스테롤이 반드시 필요한 것으로 알려져 있다.

한편 생체에서 필요로 하는 콜레스테롤은 식이로부터의 외인성 콜레스테롤과 체내에서 합성되는 내인성 콜레스테롤로부터 공급된다. 사람은 보통 식이로부터 공급되는 외인성 콜레스테롤은 300 ㎎/일 정도인데 비하여 체내에서 합성되는 내인성 콜레스테롤은 1,000 ㎎/일 정도이다. 콜레스테롤은 간장을 비롯해서 소장, 부신피질, 피부, 정소, 난소, 대동맥 등에서 합성되며 비타민 D, 담즙산, 남성호르몬, 여성호르몬, 부신피질호르몬 등의 전구체로서 중요한 역할을 한다.

콜레스테롤은 간에서 최종 대사산물인 담즙산으로 변하고, 이것은 장을 통해 배설되게 된다. 콜레스테롤의 체내 합성량은 식이 콜레스테롤 섭취량에 의해 조절되는데, 섭취량이 증가하게 되면 체내 합성량은 감소된다. 신체는 이러한 조절작용을 통해 의해 상대적으로 일정한 콜레스테롤 수준을 유지한다. 그러나 흡수한 콜레스테롤이 세포에 의해 원활히 이용되지 못하는 경우 콜레스테롤은 체내에 축적될것이고, 이러한 축적은 죽상동맥경화증이나 관상동맥질환과 같은 여러가지 심혈관 질환의 일차적인 원인이 된다.

용어 "중성지질"은 물에 녹지 않는 지방을 가리킨다. 중성지방은 콜레스테릴 에스테르와 트리글리세라이드를 포함한다. 중성지방은 지방산에서 유해한 것으로 지방산에 3개의 글리세롤 1개가 합쳐진 모양으로 되어있다.

상기 중성지방은 포도당과 더불어 세포의 중요한 에너지원으로서, 물에 녹지 않는 중성지방은 무게와 부피가 적고 에너지는 많이 발생시키기 때문에 에너지 효율성이 높다. 중성지방은 음식을 통해 몸에 들어오기도 하지만 간에서 합성되기도 하는데 간에서 생성된 중성지방은 혈관을 통해 말초 조직으로 운반돼 에너지원으로 쓰인다.

중성지방은 물에 녹지 않으므로 혈액 속에서 단독으로 존재할 수 없어서 운반체가 필요한데, 운반체를 지단백이라고 한다. 지단백은 크게 4가지가 있는데, 가장 크면서 비중이 낮은 것을 VLDL이라고 하며, 다음이 IDL, LDL 순으로 되어있다. 크기는 가장 작고 비중이 제일 높은 지단백을 HDL이라고 한다. 중성지방은 90%이상이 VLDL속에 존재한다.

우리 몸 안의 지방은 콜레스테롤과 중성지방으로 구성되어있는데, 중성지방은 LDL, 즉 나쁜 콜레스테롤의 생성을 돕고 좋은 콜레스테롤인 HDL의 분해를 촉진하는 것으로 알려져 있다.

상기 지질대사 개선은 지질이 생성되어 축적되는 대사과정을 개선하여 지질이 생성되어 체내에 축적되지 않도록 조절하는 것을 의미할 수 있다.

본 발명의 일 실시 예에서 미성숙 감으로부터 가압 열수 추출하는 단계 및 상기 가압 열수 추출물을 흡착수지를 이용하여 정제하는 단계를 포함하는 미성숙 감으로부터 폴리페놀을 추출하는 방법을 이용하여 추출한 폴리페놀 추출물은 간 세포주 (HepG2)에서 콜레스테롤 대사 관련 유전자인 HMGCR, 및 ABCG5의 발현을 감소시키고, LDLR, 및 BSEP의 발현을 증가시켰으며, 중성지질 대사 과련 유전자인 SREBP의 발현을 감소시켜 간 세포내 지질 축적을 억제하는 효과가 있음을 확인할 수 있었다.

본 발명은 미성숙 감으로부터 가압 열수 추출하는 단계 및 상기 가압 열수 추출물을 흡착수지를 이용하여 정제하는 단계를 포함하는 미성숙 감으로부터 폴리페놀을 추출하는 방법을 이용하여 추출한 폴리페놀 추출물을 유효성분으로 포함하는 지질대사 질환의 예방 및 치료용 약학 조성물에 관한 것이다.

상기 지질대사 질환은 비만, 당뇨병, 고콜레스테롤증, 고중성지질혈증, 저지질증, 지방단백질증 또는 동맥경화일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 약학 조성물은 의도한 투여 방법에 적합한 임의의 형태일 수 있다. 본 발명의 약학 조성물에 있어서 "투여"는 어떠한 적절한 방법으로 환자에게 소정의 물질을 도입하는 것을 의미하며, 본 발명의 지질대사 질환의 예방 및 치료용 약학 조성물의 투여경로는 약물이 목적 조직에 도달할 수 있는 한 어떠한 일반적인 경로를 통하여 투여될 수 있다. 예를 들어, 복강 내 투여, 정맥 내 투여, 근육 내 투여, 피하 투여, 피내 투여, 경구 투여, 국소 투여, 비내 투여, 폐내 투여, 직장내 투여 등을 거론할 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다. 또한, 본 발명의 약학 조성물은 미성숙 감으로부터 가압 열수 추출하는 단계 및 상기 가압 열수 추출물을 흡착수지를 이용하여 정제하는 단계를 포함하는 미성숙 감으로부터 폴리페놀을 추출하는 방법을 이용하여 추출한 폴리페놀 추출물 유효성분이 표적 세포로 이동할 수 있는 임의의 장치에 의해 투여될 수 있다.

일 구현예는 경구 투여용 제형 또는 비경구 투여 제형으로 제형화된 것인 당뇨병 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.

상기 약학 조성물은 유효성분 (즉, 미성숙 감으로부터 가압 열수 추출하는 단계 및 상기 가압 열수 추출물을 흡착수지를 이용하여 정제하는 단계를 포함하는 미성숙 감으로부터 폴리페놀을 추출하는 방법을 이용하여 추출한 폴리페놀 추출물) 이외에 제형화에 사용 가능한 약학적으로 허용 가능한 부형제를 추가로 포함할 수 있다.

본 발명의 약학 조성물의 제형화에 사용될 수 있는 부형제는 담체, 희석제, 용매, 예를 들어 1가 알코올, 예를 들어 에탄올, 이소프로판올 및 다가 알코올, 예를 들어 글리세롤 및 식용 오일, 예를 들어 대두유, 코코넛유, 올리브유, 잇꽃유, 면실유, 유성 에스테르, 예를 들어 에틸 올레에이트, 이소프로필 미리스테이트; 결합제, 애주번트, 가용화제, 증점제, 안정화제, 붕해제, 활택제, 윤활제, 완충제, 유화제, 습윤제, 현탁제, 감미제, 착색제, 풍미제, 코팅제, 방부제, 항산화제, 가공제, 약물 전달 개질제 및 향상제(enhancer), 예를 들어 인산칼슘, 마그네슘 스테이트, 활석, 단당류, 이당류, 전분, 젤라틴, 셀룰로스, 메틸셀룰로스, 나트륨 카복시메틸 셀룰로스, 덱스트로스, 하이드록시프로필-β-사이클로덱스트린, 폴리비닐피롤리돈, 저융점 왁스, 이온 교환 수지 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 약학 조성물은 다양한 경구 투여 제형의 형태로 제형화 될 수 있다. 예를 들어, 정제, 환제, 경·연질 캅셀제, 액제, 현탁제, 유화제, 시럽제, 과립제, 엘릭서제(elixirs) 등의 임의의 경구 투여용 제형으로 될 수 있다. 이러한 경구 투여용 제형은 각 제형의 통상적인 구성에 따라 상기 유효 성분 외에, 예를 들어, 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 만니톨, 솔비톨, 셀룰로즈 및/또는 글리신 등의 희석제나, 실리카, 탈크, 스테아르산 및 그의 마그네슘 또는 칼슘염 및/또는 폴리에틸렌 글리콜 등의 활택제 등의 제약상 허용 가능한 담체를 포함할 수 있다.

또한, 상기 경구 투여용 제형이 정제인 경우, 마그네슘 알루미늄 실리케이트, 전분 페이스트, 젤라틴, 트라가칸스, 메틸셀룰로즈, 나트륨 카복시메틸셀룰로즈 및/또는 폴리비닐피롤리딘 등의 결합제를 포함할 수 있고, 경우에 따라, 전분, 한천, 알긴산 또는 그의 나트륨염과 같은 붕해제나, 비등 혼합물 및/또는 흡수제, 착색제, 향미제 또는 감미제 등을 포함할 수도 있다.

그리고, 상기 약학 조성물은 비경구투여 제형의 형태로 제형화 될 수도 있는데, 이러한 경우 피하주사, 정맥주사, 근육 내 주사 또는 흉부 내 주사 등의 비경구투여 방법에 의해 투여된다. 이때, 상기 비경구투여 제형으로 제제화하기 위하여, 상기 약학 조성물은 유효 성분이 안정제 또는 완충제와 함께 물에서 혼합되어 용액 또는 현탁액으로 제조되고, 이러한 용액 또는 현탁액이 앰플 또는 바이알의 단위 투여형으로 제조될 수 있다.

또한, 상기 약학 조성물은 멸균되거나, 방부제, 안정화제, 수화제 또는 유화 촉진제, 삼투압 조절을 위한 염 및/또는 완충제 등의 보조제를 더 포함할 수도 있고, 기타 치료적으로 유용한 물질을 더 포함할 수도 있으며, 혼합, 과립화 또는 코팅의 통상적인 방법에 따라 제제화될 수 있다.

상기 약학 조성물 내의 미성숙 감으로부터 가압 열수 추출하는 단계 및 상기 가압 열수 추출물을 흡착수지를 이용하여 정제하는 단계를 포함하는 미성숙 감으로부터 폴리페놀을 추출하는 방법을 이용하여 추출한 폴리페놀 추출물의 함량은 약학 조성물의 사용 목적, 제형의 형태 등에 따라서 적절하게 조절 가능하며, 예컨대, 약학 조성물의 전체 중량 기준으로 0.001 내지 50중량 %, 0.01 내지 50중량 %, 0.1 내지 50중량 %, 또는 1 내지 50중량 %일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

또한, 본 발명의 약학 조성물에 포함되는 미성숙 감으로부터 가압 열수 추출하는 단계 및 상기 가압 열수 추출물을 흡착수지를 이용하여 정제하는 단계를 포함하는 미성숙 감으로부터 폴리페놀을 추출하는 방법을 이용하여 추출한 폴리페놀 추출물의 치료상 유효량은 질환 치료 효과를 기대하기 위하여 투여에 요구되는 양을 의미한다. 따라서, 환자의 질환 종류, 질환의 경중, 투여되는 유효성분의 종류, 제형의 종류, 환자의 연령, 성별, 체중, 건강 상태, 식이, 약물의 투여 시간 및 투여 방법에 따라 조절될 수 있다. 예를 들어, 사람을 포함하는 포유류에 대하여, 하루에 0.01 내지 500 ㎎/㎏(체중)의 약학적 유효량으로 투여될 포함될 수 있다. 상기 약학적 유효량은 원하는 효과, 예를 들어 당뇨병의 치료 및/또는 예방 효과를 얻을 수 있는 양에 따를 수 있다. 상기 약학적 유효량은 1일 1회 또는 2회 이상 분할되어 경구 또는 비경구적 경로(예를 들어, 정맥 주사, 근육 주사 등)를 통해 투여될 수 있다.

본 발명은 미성숙 감으로부터 가압 열수 추출하는 단계 및 상기 가압 열수 추출물을 흡착수지를 이용하여 정제하는 단계를 포함하는 미성숙 감으로부터 폴리페놀을 추출하는 방법을 이용하여 추출한 폴리페놀 추출물 또는 이의 식품학적으로 허용 가능한 염을 포함하는 지질대사 개선 또는 항비만용 건강기능식품에 관한 것이다.

본 발명의 미성숙 감으로부터 가압 열수 추출하는 단계 및 상기 가압 열수 추출물을 흡착수지를 이용하여 정제하는 단계를 포함하는 미성숙 감으로부터 폴리페놀을 추출하는 방법을 이용하여 추출한 폴리페놀 추출물 또는 이의 식품학적으로 허용 가능한 염을 포함하는 조성물은 지질대사 질환의 예방 및 개선을 위한 약제, 식품 및 음료 등에 다양하게 이용될 수 있다. 본 발명의 미성숙 감으로부터 가압 열수 추출하는 단계 및 상기 가압 열수 추출물을 흡착수지를 이용하여 정제하는 단계를 포함하는 미성숙 감으로부터 폴리페놀을 추출하는 방법을 이용하여 추출한 폴리페놀 추출물 또는 이의 식품학적으로 허용 가능한 염을 포함하는 조성물에 첨가할 수 있는 식품으로는, 예를 들어, 각종 식품류, 음료, 껌, 차, 비타민 복합제, 건강보조 식품류 등이 있고, 분말, 과립, 정제, 캡슐 또는 음료인 형태로 사용할 수 있다.

본 발명의 미성숙 감으로부터 가압 열수 추출하는 단계 및 상기 가압 열수 추출물을 흡착수지를 이용하여 정제하는 단계를 포함하는 미성숙 감으로부터 폴리페놀을 추출하는 방법을 이용하여 추출한 폴리페놀 추출물 또는 이의 식품학적으로 허용 가능한 염을 포함하는 조성물은 독성 및 부작용은 거의 없으므로 예방 목적으로 장기간 복용 시에도 안심하고 사용할 수 있다.

본 발명의 상기 미성숙 감으로부터 가압 열수 추출하는 단계 및 상기 가압 열수 추출물을 흡착수지를 이용하여 정제하는 단계를 포함하는 미성숙 감으로부터 폴리페놀을 추출하는 방법을 이용하여 추출한 폴리페놀 추출물 또는 이의 식품학적으로 허용 가능한 염을 포함하는 조성물은 지질대사 질환의 예방 및 개선을 목적으로 식품 또는 음료에 첨가될 수 있다. 이때, 식품 또는 음료 중의 상기 조성물의 양은 일반적으로 본 발명의 건강식품 조성물은 전체 식품 중량의 0.01 내지 15 중량%로 가할 수 있으며, 건강 음료 조성물은 100 ㎖를 기준으로 0.02 내지 10 g, 바람직하게는 0.3 내지 1 g의 비율로 가할 수 있다.

본 발명의 건강 음료 조성물은 지시된 비율로 필수 성분으로서 상기 조성물을 함유하는 것 외에 액체성분에는 특별한 제한점은 없으며 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 상술한 천연 탄수화물의 예는 모노사카라이드, 예를 들어, 포도당, 과당 등의 디사카라이드, 예를 들어 말토스, 슈크로스 등의 및 폴리사카라이드, 예를 들어 덱스트린, 시클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 상술한 것 이외의 향미제로서 천연 향미제(타우마틴, 스테비아 추출물(예를 들어 레바우디오시드 A, 글리시르히진등) 및 합성 향미제(사카린, 아스파르탐 등)를 유리하게 사용할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 본 발명의 조성물 100 ㎖당 일반적으로 약 1 내지 20g, 바람직하게는 약 5 내지 12g이다.

상기 외에 본 발명의 조성물은 여러 가지 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합성 [0099] 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 중진제(치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다.

그밖에 본 발명의 조성물들은 천연 과일 쥬스 및 과일 쥬스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율은 그렇게 중요하진 않지만 본 발명의 조성물 100 중량부 당 0 내지 약 20 중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다.

본 발명은 미성숙 감으로부터 가압 열수 추출하는 단계 및 상기 가압 열수 추출물을 흡착수지를 이용하여 정제하는 단계를 포함하는 미성숙 감으로부터 폴리페놀을 추출하는 방법을 이용하여 추출한 폴리페놀 추출물 또는 식품학적으로 허용 가능한 염을 포함하는 지질대사 질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품에 관한 것이다.

본 발명은 미성숙 감으로부터 가압 열수 추출하는 단계 및 상기 가압 열수 추출물을 흡착수지를 이용하여 정제하는 단계를 포함하는 미성숙 감으로부터 폴리페놀을 추출하는 방법을 이용하여 추출한 폴리페놀 추출물을 유효성분으로 포함하는 지질대사 개선 또는 항비만용 조성물 및 상기 폴리페놀 추출물 또는 이의 식품학적으로 허용 가능한 염을 포함하는 지질대사 개선 또는 항비만용 건강기능식품에 관한 것으로서, 본 발명의 방법을 이용하여 추출한 폴리페놀 추출물을 사용하여 지질대사 질환의 예방 및 치료용 약학 조성물 및 지질대사 질환의 예방 및 치료용 건강기능식품에 활용이 가능하다.

도 1은 본 발명의 실시예에 따라서 미성숙 감으로부터 폴리페놀을 추출하는 공정을 나타낸 그림이다.
도 2는 본 발명의 실시예에 따라서 가압 열수 추출 각 과정 및 여과물의 농축 정도에 따른 총 폴리페놀 함량을 분석한 결과이다.
도 3은 본 발명의 실시예에 따라서 정제 과정 중 주정 농도에 따른 총 폴리페놀 함량을 분석한 결과이다.
도 4은 본 발명의 실시예에 따라서 미성숙 감에서 추출한 추출물이 지질 (Droplet) 축적을 억제하는 것을 확인한 결과로서, FFA는 자유지방산만을 처리한 것이고, PE는 자유지방산과 본 발명의 실시예에 따른 방법을 사용하여 미성숙 감에서 추출한 추출물을 동시에 처리한 결과이다.
도 5은 본 발명의 실시예에 따라서 미성숙 감에서 추출한 추출물이 지질대사 관련 유전자중 콜레스테롤 대사 관련 유전자의 발현을 조절함을 Real-time PCR을 수행하여 확인한 결과이다.
도 6은 본 발명의 실시예에 따라서 미성숙 감에서 추출한 추출물이 지질대사 관련 유전자중 콜레스테롤 대사 관련 유전자의 발현을 조절함을 Real-time PCR을 수행하여 확인한 결과이다.
도 7은 본 발명의 실시예에 따라서 미성숙 감에서 추출한 추출물이 지질대사 관련 유전자중 중성지질 대사 관련 유전자의 발현을 조절함을 Real-time PCR을 수행하여 확인한 결과이다.
도 8은 본 발명의 실시예에 따라서 확인한 실시예 1의 방법을 이용하여 제조한 폴리페놀 함량이 증진된 미성숙 감 추출물이 지질대사를 개선하는 기전을 도시한 것이다.

이하, 본 발명을 하기의 실시예, 비교예, 및 실험예에 의하여 더욱 상세히 설명한다. 그러나, 이들 실시예, 비교예, 및 실험예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐이며, 본 발명의 범위가 이들 실시예, 비교예, 및 실험예에 의하여 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. 미성숙 감으로부터 폴리페놀 함량이 증진된 추출물의 제조

1-1. 미성숙 감 분말의 준비

폴리페놀을 추출하기 위해서, 재배 후 6 내지 9개월이 지난 후 감의 통상적 수확시기인 10월 이전에 바람 등의 자연적 요인 또는 재배 과정상의 요인으로 낙과하거나, 감의 통상적 수확시기인 10월로부터 약 2-3개월 정도 전에 수확한 덜 익은 감인 미성숙 감을 사용하였다.

상기 미성숙 감은 60℃에서 열풍건조 가공하여 미성숙 감 건분 형태로 농촌진흥청에서 제공받았다.

미성숙 감 분말에 대한 구체적 정보는 하기 표 1에 나타나 있다.

미성숙 감 분말
원료	미성숙 감 건분
부위	꼭지를 제거한 열매 (씨는 포함)
품종	청도반시
수확시기	2015년 8월 26일
건조방법	60℃ 열풍건조
보관	냉장 보관

1-2. 가압 열수 추출

실시예 1-1의 미성숙 감 분말으로부터 폴리페놀 함량이 증진된 추출물을 제조하기 위해서, 하기와 같은 방법으로 가압 열수 추출을 수행하였다.

구체적으로, 5 L 스텐 비커 (SciLab-brand, SL.Bea7015)에 100 g의 상기 채취한 미성숙 감 분말을 칭량하고 DW (Distilled water) 3 L를 넣어주고 (감 분말 중량 (g): DW 부피 (mL) = 1 : 30) 호일로 감싼 후에, 0.2 MPa, 121℃에서 90분 동안 Autoclave (Biofree, SH-26A)를 사용하여 가압증기 멸균하였다. 그리고 나서, 4℃ 상태에서 2시간 동안 식히고, 직경 15 cm, Pore size 8 um의 여과지 (Whatman, 1002-150)로 여과하고, 여과물을 온도 30℃, 압력 20 mmHg 이하로 설정한 상태의 Evaporator (EYELA, N-1200B)를 이용하여 감압농축하였다.

1-3. 흡착수지를 사용한 정제공정

실시예 1-2에서 얻은 농축물을 흡착수지를 이용하여 정제하기 위해서 하기와 같은 실험을 수행하였다.

흡착수지로 사용한 Diaion-HP 20 (하기 화학식 1) (MITSUBISHI CHEMICAL, Diaion-HP 20)은 다수의 세공이 존재하여 비표면적이 높아 물질의 흡착에 유리하며, 상기 흡착수지는 미국 FDA에서 식품, 약품, 화장품에 이용 가능한 식품 첨가물로서 인정 받았으며, 국내에서 식품 첨가물로 허가 받은 바 있기 때문에, 상기 수지로 분리해낸 정제물은 추가 공정 없이 식품에 이용 가능하다.

[화학식 1]

구체적으로, 실시예 1-2에서 얻은 감압 농축물을 수지 내에서 유동성이 있도록 가용성 고형분 함량 (brix)을 지표로 삼아 20 brix가 되도록 DW를 넣어 주었다. 한편 Diaion-HP 20 흡착수지를 활성화시키기 위해서, 비커에 Diaion-HP 20 흡착수지 120 g을 칭량하고 1 L의 DW를 잘 섞어준 후, 입구를 호일로 잘 막아 놓고 4시간이 경과한 후에, 상기 흡착수지를 흡착수지 사이에 틈이 발생하지 않도록 φ2.5 mm, 650 mL의 컬럼에 충진하고, 상기 제조한 감압 농축물 25 mL을 흡착수지에 로딩하고, 여과액을 20번 이상 다시 로딩하여 감압 농축물이 흡착수지에 잘 흡착될 수 있도록 한 후에 컬럼의 콕을 잠그고, 마지막으로 감압 농축물을 흡착수지에 로딩한 후, 감압 농축물을 12시간 동안 정치시키고, 컬럼의 콕을 열어 흡착수지에 결합하지 않고 용출되는 용액을 버린다. 그리고 나서, 총 100 mL의 DW를 흘려주어 당이 빠져 나가게 하고, 100 mL의 40% (v/v) 주정을 흘려주어 나오는 샘플을 모은 후에, 상기 샘프에 존재하는 주정을 제거하기 위해 20 mmHg 이하의 압력, 30℃의 온도에서 감압 농축하였고, 동결건조기 (Ilshin Lab co.,FD5518)를 사용하여 상기 감압 농축물을 동결건조하였다.

상기와 같이 Diaion-HP 20 흡착수지를 사용하여 폴리페놀을 정제하면, 정제물을 바로 식품에 사용 가능하므로, 본 발명의 방법에 의해서 얻은 폴리페놀 추출물에 대하여 추가적으로 식품 안전성 검증이 필요 없다는 이점이 있다.

상기 미성숙 감으로부터 폴리페놀 함량이 증진된 추출물을 제조하기 위한 방법은 도 1에 모식화되어 있다.

비교예 1. 환류 추출 방법

실시예 1-1과 같은 방법으로 준비한 미성숙 감 분말 15 g을 칭량하고 물 또는 주정 (70% (v/v)) (대한주정, ethyl alcohol)등의 용매를 150 mL을 넣은 후에 상기 혼합물을 환류 추출기 (Misung Scientific co, MS-EAMD9403-06)에 넣고 70℃에서 2시간 동안 1차 추출하고, 상층액을 직경 15 cm, Pore size 8 um 의 여과지 (Whatman,1002-150)로 여과하고, 여과물 1차 추출물이라 하고, 상기 환류 추출기에 남은 잔여물에 상기와 같은 방법으로 용매를 넣고 환류 추출하고, 상층액을 여과하여 얻은 여과물을 2차 추출물이라 하고, 그리고 나서, 상기 환류 추출기에 남은 잔여물에 상기와 같은 방법으로 용매를 넣고 환류 추출하고, 상층액 및 환류 추출기에 남은 잔여물 모두를 여과하여 얻은 여과물을 3차 추출물이라 하였다.

비교예 2. 산 추출 방법

실시예 1-1과 같은 방법으로 준비한 미성숙 감 분말 1 g를 칭량하고 0.5 M HCl 용액을 15 mL을 가한 후 30분간 60℃ 항온수조 (DAIHAN, WB-11)에서 추출하고, 5분 동안 4℃에서 냉각하고 3500 rpm에서 15분간 원심분리하고, 상층액을 GF/C 여과지 (Whatman, 1822-024)로 여과하고 50 mL 메스플라스크상에서 DW를 추가하여 50 mL로 맞췄다.

비교예 3. 환류 추출 방법 (용매의 산도 변화)

상기 비교예 1과 같은 방법으로 미성숙 감 분말로부터 환류 추출을 수행하되, 물 또는 주정에 대하여 0.1 M 구연산을 첨가하여 pH 3으로 맞춘 것을 사용하였다.

실험예 1. 가압 열수 추출물, 환류 추출물, 및 산 추출물의 총 폴리페놀 함량 분석

실시예 1 (가압 열수 추출물), 비교예 1 (환류 추출물), 및 비교예 2 (산 추출물)의 총 폴리페놀 함량 분석을 위해서 하기와 같은 실험을 수행하였다.

구체적으로, 증류수 7.5 mL, 실시예 1 (가압 열수 추출물), 비교예 1 (환류 추출물), 또는 비교예 2 (산 추출물) 시료 1 mL 넣고 섞은 후, 2N folin-ciocalteu's phenol reagent (sigma-aldrich, F9252) 0.5 mL과 35% (w/v) Na2CO3 1 mL을 차례로 넣어 1시간 동안 암실에서 발색시켰다. 상기 발색 반응 후에 UV/VIS spectrophotometer (Thermo Fisher Scientific, GENESYS™ 10S UV-Vis)를 이용하여 760 nm에서 흡광도를 측정하였으며, 탄닌산을 표준물질로 사용한 검량선 (standard curve)을 이용하여 실시예 1, 비교예 1, 또는 비교예 2의 시료에 존재하는 총 폴리페놀 함량을 측정하였다.

그 결과 표 2에 나타난 것과 같이 가압 추출한 경우 (실시예 1) 물로 환류 추출한 것에 비하여 약 19배 가량 총 폴리페놀 함량이 증가하였으며, 가압 추출한 경우 (실시예 1)는 주정으로 환류 추출한 것에 비하여 약 11배 가량 총 폴리페놀 함량이 증가하였다. 또한, 가압 추출한 경우 (실시예 1)는 산으로 추출한 것 대비 약 54배가량 현저하게 총 폴리페놀 함량이 증가하였다 (p<0.01).

시료		시간	총 폴리페놀의　양 (mg/mL)
환류추출	물	1,2차	0.193±0.004
		3차	0.173±0.031
	주정70%	1,2차	0.330±0.020
		3차	0.288±0.011
산 추출		90분	0.068±0.007
가압 열수 추출		90분	3.711±0.980

실험예 2. 산성화시킨 용매를 사용한 환류 추출물의 총 폴리페놀 함량 분석

미성숙 감 추출물은 천연물과 당이 결합을 이루고 있는 배당체의 형태로 존재하고 있으므로, pH를 낮추어 당만을 제거하여 효율적으로 폴리페놀만을 추출할 수 있는지 확인하기 위해서, 실시예 1과 같은 방법으로 추출을 수행하거나, 비교예 3과 같은 방법으로 용매를 산성화하여 환류 추출을 수행하고, 실험예 1과 같은 방법으로 총 폴리페놀 함량을 분석하였다.

한편, 수율은 미성숙 감 분말 30 g에 대비하여 추출, 여과, 감압농축, 동결건조 과정을 통해 얻은 동결건조 분말의 함량을 측정하여 % (w/w)함량으로 산출한 값으로서, 하기 수학식 1에 의해서 구할 수 있다.

[수학식 1]

수율 (% (w/w)) = 미성숙 감 분말 30 g을 이용하여 실시예 1의 방법을 통해 얻은 동결건조 산물 질량/30 X 100

그 결과 표 3에 나타난 바와 같이, 물에 구연산을 첨가해서 환류 추출한 경우 가압 열수 추출에 비해 총 폴리페놀 함량이 약 5배 가량 낮았으며 (p<0.01), 식품에 적용 시킬 경우 pH를 조절하는 추가 공정을 거쳐야 하는 문제가 있었다.

따라서, 상기 결과를 통해서 가압 열수 추출 방법이 1단계에 걸쳐서 간단하게 폴리페놀을 추출할 수 있어 추출 과정이 용이하고, 추가 공정 (pH 조절, 안전성 검사)등 없이 빠르게 수행할 수 있는 장점이 있음을 확인할 수 있었다.

시료		시간	총 폴리페놀의 양 (mg/mL)	수율(%)
환류추출	물 + 구연산	1차	0.346±0.003	29.7
		2차	0.719±0.019
		3차	0.734±0.022
가압 열수 추출		90분	3.940±0.007	54

실험예 3. 농축 정도에 따른 총 폴리페놀 함량 분석

정제공정에 적용하기 전에 농축 정도에 따른 총 폴리페놀 함량을 분석하기 위해서, 가압 열수 추출 각 과정 및 여과물을 고도농축 (40 brix) 한 경우의 총 폴리페놀 함량의 차이를 확인하였다. 실시예 1과 같은 방법으로 가압 열수 추출을 하였고, 가압 열수 추출의 과정중의 폴리페놀 함량은 실험예 1과 같은 방법으로 분석하였다. 다만, 가압 열수 추출 과정에서 40 brix로 고도농축을 하기 위해서, 20 brix의 농축물을 30℃)에서 압력을 15 mmHg 이하로 낮추고, 2시간 이상 (350 mL 기준) 감압농축기 (EYELA, N-1200B)를 사용해서 감압농축하였다.

그 결과 표 4 및 도 2에 나타난 것과 같이, 미성숙 감 분말의 총 폴리페놀 함량에 비해서 농축 한 경우 (20 brix) 총 폴리페놀 함량이 약 125배 이상 증가 하였고, 미성숙 감 분말의 총 폴리페놀 함량에 비해서 고도농축 한 경우 (40brix) 총 폴리페놀 함량이 약 250배 이상 증가한 결과를 확인할 수 있었다.

과정	총폴리페놀 함량 (mg/mL)
미성숙 감 분말	0.214
가압열수 추출 후	3.711
여과 후	3.189
농축 후 (20 brix)	25.95
고도농축 후 (40 brix)	61.487

실험예 4. 주정 농도에 따른 총 폴리페놀 함량 분석

정제시 주정 농도에 따른 용출되는 총 폴리페놀 함량을 분석하기 위해서 실시예 1과 동일하게 실험을 수행하되, 정제물 추출 시 각각 100 mL의 주정 20% (v/v), 40% (v/v), 60% (v/v), 80% (v/v), 또는 100% (v/v)를 흘려주었다.

구체적으로, 감압 농축물을 12시간 동안 정치시키고, 그리고 나서 제정물을 받아낸 후에 DW 50 mL을 흘려주고 나오는 샘플을 얻고, 추가적으로 DW 50 mL을 흘려주고 나오는 샘플을 얻었다. 정제물을 추출하기 위해서, 각각 100 mL의 주정 20%, 40%, 60%, 80%, 또는 100%를 흘려주고 나오는 샘플을 얻고, 실시예 1과 같은 방법으로 모두 감압 농축하여 동결 건조 시키고, 실험예 1과 같은 방법으로 총 폴리페놀 함량을 분석하였다.

그 결과 표 5 및 도 3에 나타난 것과 같이, 주정 20%를 사용하여 정제공정을 수행한 경우 미성숙 감 분말에 존재하는 총 폴리페놀 함량 비해서 총 폴리페놀 함량이 약 230배 이상 증가하였고, 주정 40%를 사용하여 정제공정을 수행한 경우 미성숙 감 분말에 존재하는 총 폴리페놀 함량 비해서 총 폴리페놀 함량이 약 2200배 이상 증가하였고, 주정 60%를 사용하여 정제공정을 수행한 경우 미성숙 감 분말에 존재하는 총 폴리페놀 함량 비해서 총 폴리페놀 함량이 약 3800배 이상 증가하였고, 주정 80%를 사용하여 정제공정을 수행한 경우 미성숙 감 분말에 존재하는 총 폴리페놀 함량 비해서 총 폴리페놀 함량이 약 3500배 이상 증가하였고, 주정 100%를 사용하여 정제공정을 수행한 경우 미성숙 감 분말에 존재하는 총 폴리페놀 함량 비해서 총 폴리페놀 함량이 약 570배 이상 증가함을 확인할 수 있었다.

과정	총 폴리페놀함량 (mg/mL)
미성숙 감 분말	0.214
DW 50 mL	56.5
DW 100 mL	18.561
EtOH 20% (v/v)	50.859
EtOH 40% (v/v)	475.870
EtOH 60% (v/v)	833.333
EtOH 80% (v/v)	756.667
EtOH 100% (v/v)	122.454

따라서, 상기 결과를 통해서 가압 열수 추출 방법으로 미성숙 감에서 폴리페놀을 추출할 경우, 주정 30% (v/v) 미만 또는 주정 90% (v/v) 초과를 사용하여 정제공정을 수행하는 경우 추출물의 총 폴리페놀의 함량이 현저하게 낮아지므로, 가압 열수 추출 방법으로 미성숙 감에서 폴리페놀을 추출할 때에는 주정 30% (v/v) 내지 90% (v/v) 범위의 농도를 정제공정을 수행하는 것이 가장 추출 효율이 좋음을 알 수 있었다.

실험예 5. 미성숙 감 추출물의 지질의 축적 억제효과 확인

실시예 1의 방법으로 추출한 미성숙 감 추출물이 지질의 축적 억제효과가 있는지 확인하기 위해서 하기와 같은 실험을 수행하였다.

구체적으로 인간 간암세포주인 HepG2 (Human hepatocytes; ATCC No. HB-8065) 세포를 ATCC로부터 구입하여 10% (v/v) FBS (fetal bovine serum; Gibco, Grand Island, NY, USA, Cat#16000-044), 1% (w/v) penicillin (Gibco, Cat#15140-122)을 첨가한 DMEM (Dulbeccos modified Eagles medium; Gibco, Cat#L0103-500) 배지로 37℃, 5% CO2 환경에서 배양하였다. 세포는 2-3일마다 새로운 배양액으로 계대배양하였다.

상기 HepG2 세포를 6 well plate에 1x10⁴ cell/well로 분주하고 90% 이상 면적을 채웠을 때 시료군에는 실시예 1의 방법으로 제작한 미성숙감 추출물을 처리(최종 농도 0.25 mg/ml)하였고, 대조군에는 PBS를 처리하였다. 그리고 나서 한 시간 뒤에 자유지방산 (Free Fatty Acid, FFA)의 전구체인 2 mM Palmitic acid(Sigma-Aldrich Co., St. Louis, MO, USA, Cat# P0500), 및 2 mM Oleic acid (Sigma, Cat# O1008)를 1:1 비율로 섞어서 처리하여, 최종농도가 1 mM Palmitic acid, 및 1 mM Oleic acid가 되도록 처리하였다.

세포내의 지방축적은 Oil-Red-O staining을 이용하여 측정하였다. 세포를 10% (w/v) formaldehyde(Sigma, Cat# F8775)로 1시간 고정시킨 후 60% (v/v) isopropanol액(Sigma, Cat#W292907)으로 세척하였다. 세포를 60% (w/v) Oil-Red-O(Sigma, O0625)로 30분간 염색하고 현미경 (Nikon ECLIPSE, TS100, Tokyo, Japan)으로 관찰하였다.

도 4에 나타난 것과 같이, 자유지방산만을 처리했을 때 (FFA)에 비해서, 자유지방산에 실시예 1의 방법을 이용 (다만, 농축단계시 실시예 4와 같은 방법으로 40 brix로 농축함)하여 미성숙 감에서 추출한 추출물을 처리하였을 경우 (PE) HepG2 세포 내 지질 축적이 현저하게 억제됨을 확인할 수 있었다.

실험예 6. 미성숙 감 추출물의 지질대사 관련 유전자의 발현 조절 확인

6-1. 콜레스테롤 대사 관련 유전자 발현 분석

실시예 1의 방법으로 추출한 미성숙 감 추출물이 지질대사 관련 유전자중 콜레스테롤 대사 관련 유전자의 발현을 조절하는지 확인하기 위해서 하기와 같은 실험을 수행하였다.

구체적으로, 실험예 5에서 사용한 것과 동일한 HepG2 세포를 12 well plate에 1x10⁴ cell/well로 분주하고 90% 이상 면적을 채웠을 때 시료군에는 실시예 1의 방법으로 제작한 미성숙감 추출물을 처리(최종 농도 0.25 mg/ml)하였고, 대조군에는 PBS를 처리하였다. 그리고 나서 한 시간 뒤에 자유지방산 (Free Fatty Acid, FFA)의 전구체인 2 mM Palmitic acid(Sigma-Aldrich Co., St. Louis, MO, USA, Cat# P0500), 및 2 mM Oleic acid (Sigma, Cat# O1008)를 1:1 비율로 섞어서 처리하여, 최종농도가 1 mM Palmitic acid, 및 1 mM Oleic acid가 되도록 처리하였다.

시료처리 및 자유지방산을 처리하고 24시간 뒤 TRIzol (Ambion, Austin, TX, USA, Cat#15596018)을 이용하여 세포에서 총 RNA를 추출하였다. 추출된 RNA는 BioSpec nano spectrophotometer (Shimadzu, Kyoto, Japan)를 사용하여 RNA의 양과 질을 측정한 후, cDNA reverse transcription kit (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA, Cat#4368814)를 사용하여 cDNA를 합성하였다. 합성된 cDNA 는 SYBR Green PCR master mix (Kapa Biosystems, Cat#KK4605)와 각각의 유전자별 프라이머를 함께 사용하여 Real-time PCR 기기 (Applied Biosystems, Foster City, USA)를 통해 mRNA 발현을 분석하였다. mRNA 발현 수준은 ΔΔCT 방법으로 계산하였으며, 모든 데이터는 GAPDH 값에 대한 상대적인 양을 나타낸다. 실험에 사용한 프라이머는 하기 표 6에 나타나 있다.

명명	서열 (5' ＞ 3')	서열번호
HMGCR_F	ACT TAT GGC AGC ATT GGC AG	1
HMGCR_R	ACT GTC GGG CTA TTC AGG CT	2
LDLR_F	TGT TCC AAG GGG ACA GTA GC	3
LDLR_R	CGC AGT TTT CCT CGT CAG AT	4
ABCG5_F	GTG GAT ACC CAA AGC AAG GA	5
ABCG5_R	TGA AAG GAA CCA TTG GTA ACG	6
BSEP_F	GGC ACA CTC CTT GTT CCT GG	7
BSEP_R	GTC CAA TGC CTG CGA CAG AT	8
SREBP2_F	CCC TGG GAG ACA TCG ACG A	9
SREBP2_R	CGT TGC ACT GAA GGG TCC A	10
GAPDH_F	AGG CAA CTA GGA TGG TGT GG	11
GAPDH_R	TGG ACT CCA CGA CGT ACT CA	12

도 5에 나타난 것과 같이, 콜레스테롤 합성 속도 조절인자인 HMGCR의 유전자 발현은 자유지방산만을 처리했을 때 (FFA)에 비해서 자유지방산에 실시예 1의 방법을 이용 (다만, 농축단계시 실시예 4와 같은 방법으로 40 brix로 농축함)하여 미성숙 감에서 추출한 추출물을 처리하였을 경우 (PE)에서 0.9배 감소하였으나,

LDL-콜레스테롤을 간 조직 내로 이동시키는 LDLR 유전자 발현은 자유지방산만을 처리했을 때 (FFA)에 비해서 자유지방산에 실시예 1의 방법을 이용 (다만, 농축단계시 실시예 4와 같은 방법으로 40 brix로 농축함)하여 미성숙 감에서 추출한 추출물을 처리하였을 경우 (PE)에서 1.3배 증가하였다.

상기 결과를 통해 실시예 1의 방법을 이용하여 제조한 폴리페놀 함량이 증진된 미성숙 감 추출물이 간 세포 내 콜레스테롤 합성 억제와 LDL콜레스테롤 축적 및 간 세포내로 유입 된 콜레스테롤을 담즙산으로 생성하여 배출을 증가시킬 수 있음을 확인할 수 있었다.

또한, 도 6에 나타난 것과 같이, 콜레스테롤을 배출과 관련한 유전자인 ABCG5 유전자 발현은 자유지방산만을 처리했을 때 (FFA)에 비해서 자유지방산에 실시예 1의 방법을 이용 (다만, 농축단계시 실시예 4와 같은 방법으로 40 brix로 농축함)하여 미성숙 감에서 추출한 추출물을 처리하였을 경우 (PE)에서 0.5배 감소하였으나,

담즙산 배출과 관련한 유전자인 BSEP의 발현은 자유지방산만을 처리했을 때 (FFA)에 비해서 자유지방산에 실시예 1의 방법을 이용 (다만, 농축단계시 실시예 4와 같은 방법으로 40 brix로 농축함)하여 미성숙 감에서 추출한 추출물을 처리하였을 경우 (PE)에서 2.3배 증가하였다.

상기 결과를 통해 실시예 1의 방법을 이용하여 제조한 폴리페놀 함량이 증진된 미성숙 감 추출물의 처리에 의해서 간으로 들어온 콜레스테롤을 담즙산으로 전환하여 이의 배출을 증가시키는 것을 알 수 있었다.

6-2. 중성지질 대사 관련 유전자 발현 분석

실시예 1의 방법으로 추출한 미성숙 감 추출물이 지질대사 관련 유전자중 중성지질 대사 관련 유전자의 발현을 조절하는지 확인하기 위해서 실시예 6-1과 같은 방법으로 실험을 수행하였다.

도 7에 나타난 것과 같이, 지방산 합성 관련 유전자인 SREBP2의 발현은 자유지방산만을 처리했을 때 (FFA)에 비해서 자유지방산에 실시예 1의 방법을 이용 (다만, 농축단계시 실시예 4와 같은 방법으로 40 brix로 농축함)하여 미성숙 감에서 추출한 추출물을 처리하였을 경우 (PE)에서 0.8배 감소하였다.

상기 결과를 통해 실시예 1의 방법을 이용하여 제조한 폴리페놀 함량이 증진된 미성숙 감 추출물의 처리는 간세포에서 지방산이 합성되어 지질이 축적되는 것을 억제할 수 있음을 확인할 수 있었다.

<110> Ewha University - Industry Collaboration Foundation <120> Compositions for improving lipid metabolism or anti-obesity as an active ingredient extracted from an immature persimmon by pressurized hydrothermal method <130> DPP20171107KR <160> 12 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HMGCR_F <400> 1 acttatggca gcattggcag 20 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HMGCR_R <400> 2 actgtcgggc tattcaggct 20 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> LDLR_F <400> 3 tgttccaagg ggacagtagc 20 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> LDLR_R <400> 4 cgcagttttc ctcgtcagat 20 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ABCG5_F <400> 5 gtggataccc aaagcaagga 20 <210> 6 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ABCG5_R <400> 6 tgaaaggaac cattggtaac g 21 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> BSEP_F <400> 7 ggcacactcc ttgttcctgg 20 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> BSEP_R <400> 8 gtccaatgcc tgcgacagat 20 <210> 9 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SREBP2_F <400> 9 ccctgggaga catcgacga 19 <210> 10 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SREBP2_R <400> 10 cgttgcactg aagggtcca 19 <210> 11 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GAPDH_F <400> 11 aggcaactag gatggtgtgg 20 <210> 12 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GAPDH_R <400> 12 tggactccac gacgtactca 20

Claims (13)

1. 폴리페놀을 함유하는 미성숙 감의 추출물을 포함하며, SREBP2의 발현 감소에 의한 간 세포내 지질 축적 개선용 식품 조성물로서,
   상기 감 추출물은,
   (a) 미성숙 감을 열풍건조하여 건조 분말을 얻는 단계; (b) 상기 미성숙 감의 건조 분말을 미성숙 감 1g 당 10 내지 100mL인 비율의 물과 혼합하고, 0.1 내지 0.4MPa의 압력 및 95 내지 150℃의 온도 조건에서 가압 열수 추출하는 단계; 및 (c) 상기 가압 열수 추출물을 여과 및 농축하는 단계; (d) 상기 농축물을 흡착수지에 흡착하고, 30 내지 90%(v/v) 주정으로 흡착된 폴리페놀을 용출하여 정제하는 단계;를 포함하는 제조방법으로 제조되고,
   상기 감은 청도반시이며,
   상기 감의 추출물은 SREBP2의 발현을 감소시켜 간 세포내 지질 축적을 개선하는 것인
   식품 조성물.
   
2. 제1항에 있어서, 상기 미성숙 감은 외형상 녹색을 띠고 크기는 직경 3~10㎝ 정도의 미성숙한 떫은 맛의 감인, 식품 조성물.
   
3. 삭제
4. 제1항에 있어서, 상기 흡착수지는 다수의 세공이 존재하여 비표면적이 넓은 것인, 식품 조성물.
   
5. 제4항에 있어서, 상기 흡착수지를 이용하여 정제한 정제물은 식품에 이용이 가능한 것을 특징으로 하는 것인, 식품 조성물.
   
6. 제1항에 있어서, 상기 폴리페놀은 탄닌, 카테킨, 또는 안토시아닌인, 식품 조성물.
   
7. 제1항에 있어서, 상기 지질은 콜레스테롤 또는 중성지질인, 식품 조성물.
   
8. 삭제
9. 삭제
10. 삭제
11. 삭제
12. 제 1항에 있어서, 상기 식품은 건강기능식품인 것인, 식품 조성물
    
13. 삭제

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