KR101899818B1 - 트라켈로사이드를 유효성분으로 함유하는 상처 치유용 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 털마삭줄에 분리된 화합물을 유효성분으로 포함하는 상처 치유용 약학 조성물에 관한 것이다.

Description

트라켈로사이드를 유효성분으로 함유하는 상처 치유용 조성물{A COMPOSITION FOR WOUND HEALING COMPRISING TRACHELOSIDE}

본 발명은 식물 유래 단일 화합물을 유효성분을 포함하는 상처 치유용 조성물에 관한 것이다.

피부는 외부환경과 접촉하여 외부 자극에 대한 신체를 보호하는 가장 기초적인 방어기관이며, 내부의 열과 수분의 손실을 방지하는 역할을 한다. 피부는 구조적으로 표피, 진피 및 피하조직으로 구성되며, 그 중 표피는 외부의 이물질 및 미생물 침입에 대한 장벽을 제공한다.

표피에서 최외측에 대부분 존재하는 각질층(Stratum Corneum)은 납작한 육각형 모양의 죽은 세포로 구성되며, 케라틴세포(keratinocyte)에 의해 형성됨과 동시에 끊임없이 박리 탈락함으로써, 외부의 이물질 및 미생물 침입으로부터 피부를 보호한다.

그러나 피부에 직접적인 창상, 열에 의한 화상, 물리적·화학적 자극에 의한 습진 또는 부신피질 호르몬의 증가로 인한 튼살 등의 다양한 종류의 손상이 발생하면, 피부 내부가 외부의 이물질 및 미생물에 노출된다.

따라서 피부에 상처, 화상, 찰과상 및 기타 손상이 발생하면, 외부의 이물질 감염을 방지하고 상처를 치유하는 과정이 일차적으로 행해진다.

상처 치유는 염증, 증식 및 재형성의 단계를 통해 임상적으로 피부가 완전히 봉합되는 것을 의미한다. 상처 치유의 과정은 케라틴세포, 섬유모세포, 혈관내피세포, 대식세포, 혈소판 등 여러 종류의 세포가 상호작용하며, 성장인자, 사이토카인 및 케모카인 등의 신호전달 물질에 의해 조절된다.

표피와 진피 사이의 기저층(basement membrane)에 접한 케라틴세포가 활발히 증식하면, 세포질의 형태가 바꿔 표피의 상층으로 이동한다. 케라틴세포의 증식과 이동은 상처 치유과정에서 상처 부위를 봉합하는 역할을 한다.

또한, 케라틴세포의 증식은 섬유아세포를 자극하여 세포외기질(extracellular matrix)에 채워지는 콜라겐(collagen)과 엘라스틴(elastin)의 생성을 촉진한다. 즉, 케라틴세포의 증식 및 이동은 상처 치유의 주요 요소이다.

현재까지 다양한 종류의 상처 치료제들이 개발되고 시판되어 왔다. 에피더말 성장인자(epidermal growth factor), 시토킨(cytokine), 인터루킨(interlukin), 트랜스포밍 성장인자-β(transforming growth factor-beta) 등과 같은 펩타이드와 마데카솔(Madecasol; 아시아티코사이드(Asiaticoside))이 대표적이다. 그러나 펩타이드는 제조되는 단가가 비싸서 다량 생산이 불가능하고, 불안정하여 보관이 어렵고 쉽게 변성될 위험이 있다.

마데카솔은 센텔라아시아티카(Centella asiatica)에서 유래한 천연성분을 포함하는 제품으로, 상처 치유 과정에서 정상적인 콜라겐 합성을 촉진하여 상처를 봉합한다. 하지만, 마데카솔은 효과가 미약하고, 접촉성 피부염 같은 부작용을 유발하는 단점이 지적되어 왔다.

따라서, 종래보다 안정적인 우수한 상처 치료제 소재의 개발이 절실한 상황에서, 본 발명자들은 상처 치료에 중요한 역할을 하는 것으로 알려진 세포 중에서 케라틴세포에 주목하여, 천연 식물 추출물에서 세포의 증식 및 이동이 촉진되는 화합물을 발견하고, 이를 상처 치료제로 활용하고자 하였다.

한국공개특허 제2005-0037106호

본 발명은 식물 유래의 단일 화합물을 유효성분으로 포함하는 상처 치유용 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.

본 발명의 일 측면에 따르면, 하기 화학식 1로 표시되는 화합물을 유효성분으로 포함하는 피부 상처 치유용 약학 조성물이 제공된다.

[화학식 1]

일 실시예에 있어서, 상기 화합물은 털마삭줄(Trachelospermum jasminoides)로부터 분리될 수 있다.

일 실시예에 있어서, 상기 조성물은 케라틴세포(keratinocyte)의 생장 및 이동을 촉진할 수 있다.

일 실시예에 있어서, 상기 조성물은 케라틴세포에서 p44/42 미토겐-활성화된 단백질 키나제(MAPK)의 인산화를 증가시킬 수 있다.

본 발명의 다른 측면에 따르면, 하기 화학식 1로 표시되는 화합물을 유효성분으로 포함하는 상처 치유용 피부 외용제 조성물이 제공된다.

[화학식 1]

본 발명에 따르면, 식물에서 유래한 단일 화합물을 유효성분으로 포함하므로 인체에 대한 독성이 낮고, 케라틴세포의 증식 및 이동을 효과적으로 촉진할 수 있다.

본 발명의 효과는 상기한 효과로 한정되는 것은 아니며, 본 발명의 상세한 설명 또는 청구범위에 기재된 발명의 구성으로부터 추론 가능한 모든 효과를 포함하는 것으로 이해되어야 한다.

도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 화합물의 농도별 세포 독성을 평가한 그래프이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 화합물의 농도별 상처 치유 능력을 측정한 사진이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른 화합물의 상처 치유 활성을 비교한 그래프이다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따른 화합물의 세포 영향 메커니즘을 확인하기 위한 웨스턴 블럿 결과이다.

본 명세서에서 사용되는 용어는 본 발명에서의 기능을 고려하면서 가능한 현재 널리 사용되는 일반적인 용어들을 선택하였으나, 이는 당 분야에 종사하는 기술자의 의도 또는 판례, 새로운 기술의 출현 등에 따라 달라질 수 있다. 또한, 특정한 경우는 출원인이 임의로 선정한 용어도 있으며, 이 경우 해당되는 발명의 설명 부분에서 상세히 그 의미를 기재할 것이다. 따라서 본 발명에서 사용되는 용어는 단순한 용어의 명칭이 아닌, 그 용어가 가지는 의미와 본 발명의 전반에 걸친 내용을 토대로 정의되어야 한다.

다르게 정의되지 않는 한, 기술적이거나 과학적인 용어를 포함해서 여기서 사용되는 모든 용어들은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 가지고 있다. 일반적으로 사용되는 사전에 정의되어 있는 것과 같은 용어들은 관련 기술의 문맥상 가지는 의미와 일치하는 의미를 가지는 것으로 해석되어야 하며, 본 출원에서 명백하게 정의하지 않는 한, 이상적이거나 과도하게 형식적인 의미로 해석되지 않는다.

수치 범위는 상기 범위에 정의된 수치를 포함한다. 본 명세서에 걸쳐 주어진 모든 최대의 수치 제한은 낮은 수치 제한이 명확히 쓰여져 있는 것처럼 모든 더 낮은 수치 제한을 포함한다. 본 명세서에 걸쳐 주어진 모든 최소의 수치 제한은 더 높은 수치 제한이 명확히 쓰여져 있는 것처럼 모든 더 높은 수치 제한을 포함한다. 본 명세서에 걸쳐 주어진 모든 수치 제한은 더 좁은 수치 제한이 명확히 쓰여져 있는 것처럼, 더 넓은 수치 범위 내의 더 좋은 모든 수치 범위를 포함할 것이다.

어떤 부분이 어떤 구성요소를 "포함"한다고 할 때, 이는 특별히 반대되는 기재가 없는 한 다른 구성요소를 제외하는 것이 아니라 다른 구성요소를 더 구비할 수 있다는 것을 의미한다.

본 명세서에 포함되는 용어를 포함하는 다양한 과학적 사전이 잘 알려져 있고, 당업계에서 이용가능하다. 본 명세서에 설명된 것과 유사 또는 등가인 임의의 방법 및 물질이 본원의 실행 또는 시험에 사용되는 것으로 발견되나, 몇몇 방법 및 물질이 설명되어 있다. 당업자가 사용하는 맥락에 따라, 다양하게 사용될 수 있기 때문에, 특정 방법학, 프로토콜 및 시약으로 본 발명이 제한되는 것은 아니다.

이하, 첨부한 도면을 참조하여 본 발명을 설명하기로 한다. 그러나 본 발명은 여러 가지 상이한 형태로 구현될 수 있으며, 따라서 여기에서 설명하는 실시예로 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 일 측면에 따르면, 하기 화학식 1로 표시되는 화합물을 유효성분으로 포함하는 피부 상처 치유용 약학 조성물이 제공된다.

[화학식 1]

상기 “상처”는 당업계에서 통상적으로 사용되는 의미를 가지며, 물리적 또는 화학적으로 외부의 압력에 의해 피부 또는 조직의 연속성이 파괴되거나 손상된 상태를 뜻한다. 여기에는 예를 들어 찰과상, 타박상, 열상, 칼날에 의한 절창, 자창, 할창, 총창, 폭창, 교창 등이 포함된다.

상기 상처치유는 염증, 새로운 조직 형성 및 조직 리모델링을 포함하는, 복합적이고 역동적이지만 잘 조율된 일련의 현상을 수반할 수 있다.

상기 상처치유는 조직이 손상되는 순간 개시되고 상피화(epithelialization) 및 피부 회복의 정밀한 협력을 필요로 하는데, 이것들 중에서 상피화 과정은 궁극적으로 케라틴세포(keratinocyte)의 이동, 증식, 및 분화 능력에 의존적이다(Singer and Clark, 1999).

상처 주변에 위치한 케라틴세포가 상피화 과정에서 이동하고 증식하여 상처 위에 단층을 형성할 수 있다.

손상된 조직이 본래의 구조와 기능을 복구하는 상처치유 과정은 염증매개인자, 성장인자, 사이토카인, 물리적 힘 등의 정상적인 세포 반응에 의해 진행될 수 있다. 상기 상처치유 과정은 크게 염증단계, 증식단계, 재형성단계로 구성되며, 염증단계에서 PDGF(platelet divided growth factor), TGF-β(transforming growth factor-β), 및 VEGF(vascular endothelial growth factor)와 같은 성장인자들이 분비되고 상처치유의 개시 과정에 관여한다.

이 때, 상기 조성물은 케라틴세포에서 p44/42 미토겐-활성화된 단백질 키나제(MAPK)의 인산화를 증가시킬 수 있고, 이를 통해 케라틴세포(keratinocyte)의 생장 및 이동을 촉진할 수 있다.

상기 “유효성분으로 포함하는”은 상처 치료 효과를 나타낼 수 있는 것으로, 케라틴 생성량이 증가되거나 단시간에 세포수가 증가 또는 이동하여 피부의 상처가 봉합되는 정도의 유효량을 함유하는 것을 의미할 수 있다.

상기 “화합물”은 트라켈로사이드(tracheloside)로 명명될 수 있으며, 혹은 (3S,4S)-4[(3,4-디메톡시페닐)메틸]-3-하이드록시-6-(하이드록시메틸)옥산-2-yl]옥시페닐]메틸]옥솔란-2-원((3S,4S)-4-[(3,4-dimethoxyphenyl)methyl]-3-hydroxy-3-[[3-methoxy-4-[(2S,3R,4S,5S,6R)-3,4,5-trihydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-2-yl]oxyphenyl]methyl]oxolan-2-one)으로 명명될 수 있다.

상기 화합물은 털마삭줄(Trachelospermum jasminoides)에서 분리될 수 있다.

상기 털마삭줄은 협죽도과(Apocynaceae), 마삭덩굴속(Trachelospermum)에 속하며, 한국, 중국, 베트남 그리고 일본 등지에 분포하고 있다. 털마삭줄의 전체 길이는 2-3m이고, 잎은 긴 타원형으로 잎의 길이는 4-8cm, 폭은 2-5cm이며 끝이 뾰족하다. 5-6월에 가지 끝에서 취산(聚) 꽃차례로 노란색을 띤 흰색 꽃이 피고, 털마삭줄의 꽃잎은 주로 향수 오일로 사용된다.

상기 화합물은 털마삭줄 추출물에서 수득할 수 있다. 상기 추출물은 물, 탄소수 1 내지 4개의 무수 또는 함수 저급 알코올, 피리딘, 아세톤, 석유에테르, 에틸아세테이트, 부틸아세테이트, 트리클로로메탄, 디클로로메탄, 클로로포름, 헥산 및 1,3-부틸렌글리콜로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 용매로 추출될 수 있고, 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 추출물은 60-100℃ 온도조건에서 추출될 수 있다.

상기 화합물은 상기 털마삭줄 추출물에서 분리 장치를 이용하여 분리할 수 있으며, 상기 분리 장치는 크로마토그래피 등을 예시할 수 있다.

상기 크로마토그래피는 액체 크로마토그래피(LC), 액체-고체 크로마토그래피(LSC), 종이 크로마토그래피(PC), 박층 크로마토그래피(TLC), 기체-고체 크로마토그래피(GSC), 액체-액체 크로마토그래피(LLC), 포말 크로마토그래피(FC), 유화 크로마토그래피(EC), 기체-액체 크로마토그래피(GLC), 이온 크로마토그래피(IC), 겔 여과 크로마토그래피(GFC) 또는 겔 투과 크로마토그래피(GPC)일 수 있고, 바람직하게는 액체 크로마토그래피, 더 바람직하게는 초고성능 액체 크로마토그래피(UPLC, ultra performance liquid chromatography)일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 예컨대, 초고성능 액체 크로마토그래피에서 비이온성 수지 컬럼을 사용할 수 있으며, 이동상인 유기 용매가 제거된 후 상기 화합물은 컬럼에 흡착하여 분리될 수 있다.

상기 조성물은 약학 조성물의 제조에 사용되는 담체, 부형제 및 희석제를 더 포함할 수 있다. 상기 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 또는 광물유를 들 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 조성물의 투여량은 상처의 중증도 및 범위, 상처가 발생된 이후 경과된 시간, 치료 기간 등을 고려하여 당해 기술분야의 의사 또는 약사가 적절하게 선택할 수 있다. 또한, 의사 또는 약사의 판단에 따라 1 일 1회 내지 수회 투여할 수 있으며, 투여 기간은 상처의 중증도와 치료 경과에 따라 달라질 수 있지만 상처 발생일로부터 7일 동안만 지속하더라도 원하는 효과를 얻을 수 있다.

투여 방법에 특별한 제한이 있는 것은 아니므로 상처 부위에 주사의 형태로 직접 주입하는 것도 가능하며, 바르는 형태로 투여할 수도 있다.

본 발명의 다른 측면에 따르면, 하기 화학식 1로 표시되는 화합물을 유효성분으로 포함하는 상처 치유용 피부 외용제 조성물이 제공된다.

상기 피부 외용제는 통상의 방법에 의해 제형화될 수 있다. 피부 외용제의 제형화에 있어서 Remington's Pharmaceutical Science, Mack Publishing Company, Easton PA에 개시되어 있는 내용을 참조할 수 있다.

상기 피부 외용제는 통상적으로 허용 가능한 담체를 포함할 수 있으며, 예컨대 유분, 물, 계면활성제, 보습제, 저급 알코올, 증점제, 킬레이트제, 색소, 방부제, 향료 등을 적절히 배합할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

상기 조성물은 통상적인 피부 외용제에 배합될 수 있는 기제 성분을 추가로 포함할 수 있고, 구체적으로 용해보조제, 계면활성제, 보습제, 점증제, pH 조정제, 방부제, 산화방지제, 금속이온봉쇄제, 살균제, 항염증제, 항미생물제, 용제, 착색제, 또는 착향제 등을 포함할 수 있다.

상기 제형에 있어서, 상기한 필수성분 이외에 다른 성분들은 기타 외용제의 용도 또는 사용목적에 따라 당업자가 적절하게 선정하여 배합할 수 있다.

예컨대, 상기 조성물의 제형이 페이스트, 크림 또는 겔인 경우에는 담체 성분으로서 동물섬유, 식물섬유, 왁스, 파라핀, 전분, 트라칸트, 셀룰로오스 유도체, 폴리에틸렌 글리콜, 실리콘, 벤토나이트, 실리카, 탈크 또는 산화아연 등이 사용될 수 있다.

상기 조성물의 제형이 파우더 또는 스프레이인 경우에는 담체 성분으로서 락토스, 탈크, 실리카, 알루미늄 히드록시드, 칼슘 실리케이트 또는 폴리아미드 파우더가 이용될 수 있고, 특히, 추가적으로 클로로플루오로히드로카본, 프로판, 부탄 또는 디메틸 에테르와 같은 추진체를 더 포함할 수 있다.

상기 조성물의 제형이 용액 또는 유탁액인 경우에는 담체 성분으로서 용매, 용매화제 또는 유탁화제가 사용될 수 있고, 예컨대 물, 에탄올, 이소프로판올, 에틸 카보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 알코올, 벤질 벤조에이트, 프로필렌 글리콜, 1,3-부틸글리콜 오일, 글리세롤 지방족 에스테르, 폴리에틸렌 글리콜 또는 소르비탄의 지방산 에스테르가 사용될 수 있다.

상기 조성물의 제형이 현탁액인 경우에는 담체 성분으로서 물, 에탄올 또는 프로필렌 글리콜과 같은 액상희석제, 에톡실화 이소스테아릴 알코올, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 에스테르 및 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르와 같은 현탁제, 미소결정성 셀룰로오스, 알루미늄 메타히드록시드, 벤토나이트, 아가 또는 트라칸트 등이 사용될 수 있다.

다만, 상기 보조제 및 그 혼합 비율은 본 발명에 따른 제품의 바람직한 성질에 영향을 미치지 않도록 적절히 선택할 수 있다.

이하 실시예를 통해, 본 발명을 더욱 상술하나 하기 실시예에 의해 본 발명이 제한되지 아니함은 자명하다.

실시예 : 화합물 분리

추출, 분획 과정을 거쳐 털마삭줄로부터 단일 화합물을 분리하였다.

털마삭줄(500 g)을 깨끗이 세척하고 건조한 뒤 분쇄기로 분쇄하였다.털마삭줄 분쇄물을 에탄올(10 L)에 침지시켜 4시간 동안 60℃에서 열탕 추출하였다. 털마삭줄 추출물을 여과지로 여과한 다음, 갑압하에서 농축하였다.

농축물을 컬럼 크로마토그래피를 이용하여 분획하였으며, 필요에 따라서 기존 통상적인 분획 방법인 n-헥산, 에틸아세테이트, 메탄올 순으로 분획할 수도 있다.

컬럼 크로마토그래피의 조건으로 고정상은 실리카겔 컬럼을 사용하고, 이동상 용매로는 클로로포름, 메탄올, 및 증류수의 혼합용매를 사용하였다. 분획물을 역상컬럼 크로마토그래피하여 화합물을 순수분리 하였다.

분리된 화합물은 핵자기공명분석(Bruker AMX 500)을 통하여 ¹H NMR, ¹³C-NMR, 호모코지(HOMOCOSY), HMQC(¹H-Detected heteronuclear Multiple-Quantum Coherence), HMBC(Heteronuclear Multiple-Bond Coherence), DEPT(Distortionless Enhancement by Polarization) 스펙트럼을 얻고 분자구조를 결정하였다.

측정결과 화합물은 (3S,4S)-4[(3,4-디메톡시페닐)메틸]-3-하이드록시-6-(하이드록시메틸)옥산-2-yl]옥시페닐]메틸]옥솔란-2-원((3S,4S)-4-[(3,4-dimethoxyphenyl)methyl]-3-hydroxy-3-[[3-methoxy-4-[(2S,3R,4S,5S,6R)-3,4,5-trihydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-2-yl]oxyphenyl]methyl]oxolan-2-one)으로 동정하였다.

실험예 1 : 세포 독성 평가

트라켈로사이드의 피부 안정성을 검증하기 위해, 각질세포(HaCaT)에 대한 MTT assay 실험을 수행하였다.

각질세포(HaCaT)를 각각 96-웰 플레이트(96-well tissue culture plates(SPL))에 1×10⁴ cells/0.1ml의 농도로 분주하였다.

화합물을 DMSO에 농도별로 처리한 배지를 추가하고 48 시간 동안 배양하였다. 대조군의 DMSO는 최대 농도가 0.2%를 초과하지 않도록 추가하였다.

배양 100μl 5mg/ml MTT(sigma Cat. M2128)를 투입한 후, 3시간 동안 37℃ 반응하였다.

배지를 제거 후 0.1 ml의 DMSO를 투입하고 10분 동안 반응 시킨 후 microplate reader(BioTek Instruments, Korea)를 이용하여 540nm 흡광도에서 활성을 측정하였다. 모든 실험은 3회 이상 반복 수행되었다(도 1)

측정 결과, 트라켈로사이드의 모든 농도에서 세포 독성은 확인되지 않았으며, 오히려 세포가 성장하는 것을 확인하였다.

상기 결과는 트라켈로사이드가 인체에 무해할 뿐만 아니라 인체 안전성이 우수함을 시사한다.

실험예 2 : 상처 회복 활성 평가( In vitro scratch assay)

트라켈로사이드의 세포 생장 및 이동 촉진 효과를 확인하기 위해, 각질세포(HaCaT)에 상처를 가한 후 치유 활성을 확인하였다.

각질세포(HaCaT)를 각각 96-웰 플레이트(96-well tissue culture plates(SPL))에 각 웰에 90% 이상 배양한 후 배지를 제거하였다.

White tip(Sorensson)을 이용하여 각 웰에 상하 좌우로 손상을 유도하였다. PBS를 이용하여 각 웰을 씻어준 뒤 serum-free 배지를 각 웰에 2ml 투입하고 DMSO(dimethyl sulfoxide)로 시료를 용해하여 농도별로 처리하였다.

Microscopy(Thermo fisher scientific, USA)를 이용해 각 well의 상처 난 부분을 촬영하고 24시간 배양 뒤 다시 같은 부위를 촬영하여 세포 치유 활성을 확인하였다(도 2).

도 2를 참조하면, 트라켈로사이드의 농도에 따라 24시간 후 긁힌 면적이 감소되었다.

상기 결과를 세포 회복율로 Scion-Image(Scion Corporation, MA) 프로그램을 이용하여 면적비로 수치화하고, 대조군과 비교군으로 비교하였다.

대조군(Control)은 DMSO만 처리하였고, 세포의 생장 및 이동의 효과를 비교하기 위해 비교군으로 알란토인(Allantoin)을 처리하였다(표 1 및 도 3).

시료의 농도	트라켈로사이드	비교군	대조군
1 μg/ml	12.86±3.24	11.17±2.38	10.12±1.29
5 μg/ml	15.22±3.90	10.07±2.26	9.13±1.94
10 μg/ml	15.20±4.32	10.08±2.42	10.38±0.19

도 2 및 표 1을 참조하면, 대조군 및 비교군과 비교하였을 때 트라켈로사이드의 세포 생장 및 이동 증진 효과가 현저히 우수하였다.

실험예 3 : 신호 전달 단백질 분석(웨스턴 블랏)

트라켈로사이드의 세포 증식 및 이동 촉진에 대한 메커니즘을 확인하기 위해 세포 성장 및 이동에 관여하는 단백질에 대한 변화를 측정하였다.

각질세포(HaCaT)를 60Φ cell culture dish(SPL)에서 배양하고, 70-80% 성장하면, 배지를 제거하고 serum-free media 3ml 처리하였다. 시료를 1, 5, 10 μg/ml 농도로 주입해주고 24시간 배양하였다.

Cell scraper(SPL)를 이용하여 세포를 plate에서 분리하고 튜브에 모았다. RIPA buffer를 이용하여 세포로부터 단백질을 추출하고 일정량을 acrylamide gel에 로딩하였다.

ECL은 Bio-Rad 제품을 이용하였으며 antibody는 santa cruz biotechnology와 cell signaling technology 제품을 사용하였다. 모든 실험은 3회 이상 반복 수행되었다(도 4).

도 4를 참조하면, p38, JNK 및 이들의 인산화 형태는 시료의 농도와 관계없이 단백질 농도 변화가 없었으나, p44/42의 경우 인산화 형태에서 시료의 농도가 증가함에 따라 양이 증가하는 것을 확인하였다.

상기 결과는 트라켈로사이드의 세포 생장 및 이동 증진에 있어서 p44/42의 인산화가 관여함을 시사한다.

실험예 4 : 상처 회복 활성 평가( In vivo scratch assay)

마우스 피부에 상처를 형성하고, 제형화한 트라켈로사이드를 상처 부위에 적용하여 상처 치유 활성을 확인하였다.

시간의 경과에 따른 상처 치유 속도를 비교하였으며, 상처 크기의 비율은 상처를 형성한 날의 상처 크기를 1로 간주하여 상대적인 감소비를 산출하였다(표 2).

대조군(Control)은 DMSO만 처리하였고, 세포의 생장 및 이동의 효과를 비교하기 위해 비교군으로 알란토인(Allantoin)을 처리하였다.

표 2를 참조하면, 트라켈로사이드를 적용하였을 때 상처치유 속도가 현저히 증대되었다.

구분	트라켈로사이드	비교군	대조군
1일 경과	1.00	1.00	1.00
5일 경과	0.72	0.91	0.82
10일 경과	0.45	0.64	0.53
15일 경과	0.21	0.34	0.28

상기 결과는 트라켈로사이드가 상처의 회복을 효과적으로 촉진할 수 있음을 시사한다.

전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다. 예를 들어, 단일형으로 설명되어 있는 각 구성 요소는 분산되어 실시될 수도 있으며, 마찬가지로 분산된 것으로 설명되어 있는 구성 요소들도 결합된 형태로 실시될 수 있다.

본 발명의 범위는 후술하는 청구범위에 의하여 나타내어지며, 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 균등 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

Claims (5)

1. 하기 화학식 1로 표시되는 화합물을 유효성분으로 포함하는 피부 상처 치유용 약학 조성물.
   [화학식 1]
   

   
2. 제1항에 있어서,
   상기 화합물은 털마삭줄(Trachelospermum jasminoides)로부터 분리된 조성물.
3. 제1항에 있어서,
   케라틴세포(keratinocyte)의 생장 및 이동을 촉진하는 조성물.
4. 제3항에 있어서,
   케라틴세포에서 p44/42 미토겐-활성화된 단백질 키나제(MAPK)의 인산화를 증가시키는 조성물.
5. 하기 화학식 1로 표시되는 화합물을 유효성분으로 포함하는 상처 치유용 피부 외용제 조성물.
   [화학식 1]
   

   

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