KR101847815B1

KR101847815B1 - 삼중음성유방암의 아형 분류 방법

Info

Publication number: KR101847815B1
Application number: KR1020150181163A
Authority: KR
Inventors: 준 정; 황승용; 김승준; 안성귀; 윤효정; 김정열
Original assignee: 바이오코아 주식회사; 연세대학교 산학협력단; 고려대학교 산학협력단
Priority date: 2015-12-17
Filing date: 2015-12-17
Publication date: 2018-04-12
Anticipated expiration: 2035-12-17
Also published as: KR20170072685A

Abstract

본 발명은 삼중음성유방암의 아형 분류 방법에 관한 것이다. 본 발명에 따른 삼중음성유방암의 아형 분류 방법은 구현 비용이 저렴하고 정밀성이 높으므로 임상 분야에서 큰 활용이 기대된다.

Description

삼중음성유방암의 아형 분류 방법{A method for classification of subtype of triple-negative breast cancer}

본 발명은 삼중음성유방암의 아형 분류 방법에 관한 것이다.

유방암은 임상적으로나 병리학적으로 매우 복잡하고 다양한 양상을 나타내는 암으로 알려져 있다. 이러한 유방암의 예후를 예측하고 치료 방법을 결정하기 위해서 원발 종양의 병기, 조직형과 조직학적 등급에 따라 여러 아형으로 분류되어 왔다. 최근 유방암 치료에 효과를 나타내는 다양한 표적 치료제가 개발되면서, 유방암도 점차 치료 표적의 발현 유무에 따라 분류하게 되었다. 현재까지 잘 알려진 유방암 치료의 표적은 호르몬 수용체와 HER2의 과발현이며, 이들 표적에 대한 치료를 통해 유방암의 예후를 향상시키는 효과를 가져왔다. 또한 최근에는 유전자 발현 양상에 따라 유전자 차원에서 유방암을 평가하고 있다. DNA 미세 배열(microarray) 방법에 의해 유방암을 내강형 A군(에스트로겐 수용체 양성, HER2 음성), 내강형 B군(에스트로겐 수용체 양성, HER2 양성), HER2 과발현군(에스트로겐 수용체 음성, HER2 양성), 에스트로겐 수용체와 HER2 음성인 기저형 군과 정상형 군으로 분류하였다(Nature 2000, (406)747-752, Proc Natl Acad Sci USA 2001, (98)10869-10874). 특히 기저형 유방암은 주로 호르몬 수용체가 없고 HER2/neu 발현이 되지 않는 군으로 나머지 군들에 비해 조기 재발이 많고, 예후가 불량하다고 알려져 있다(Clin Cancer Res 2004, (10)5367-5374).

삼중음성유방암은 에스트로겐 수용체, 프로게스테론 수용체와 HER2의 발현이 모두 음성인 유방암으로 전체 유방암의 18∼25%를 차지한다. 특히 한국을 비롯한 아시아권에서 삼중음성유방암의 비율이 높게 나타나고 있으며, 2011년 한국의 경우 연간 17,000 여명의 유방암 환자 중에 약 4,000 여명이 삼중음성유방암 환자인 것으로 추정되었다. 삼중음성유방암은 비삼중음성유방암 환자에 비해 상대적으로 불량한 예후를 보인다고 알려져 있으며(Lancet Oncol 2007, (8)235-244), 따라서 삼중음성유방암 환자들의 생존율을 높이기 위해 무엇보다 정확한 아형 분류 및 아형에 따른 표적 치료제의 선택이 중요하다.

미국 공개특허 2014-0303133 및 선행문헌 J Clin Invest 2011, (121)2750?2767은 DNA 미세 배열(microarray) 방법에 의해 삼중음성유방암을 7가지 아형(BL1, BL2, IM, M, M/SL, LAR, UNS)으로 분류하는 방법을 기재하고 있다. 그러나 상기 공지된 DNA 미세 배열 분석으로 삼중음성유방암의 아형을 분류하는 방법은, 3만여개에 달하는 유전자를 분석하는 것으로서 고가의 구현 비용을 요구하며, 유전자 발현 양상에 따라 정밀성이 떨어지는 문제점이 있다. 삼중음성유방암의 아형을 분류하기 위한 수천 개의 유전자 발현 양상을 확인하기 위해 3만여개의 유전자 발현을 모두 확인하는 것은 매우 비효율적인 것이라 할 것이다.

따라서 본 발명은 100여개의 유전자 발현 양상으로 삼중음성유전자의 아형을 분류 가능한 알고리즘으로, 본 발명에 따른 삼중음성유방암의 아형 분류 방법은 상기 공지된 기술에 비해 구현 비용이 저렴하고 정밀성이 높으므로 임상 분야에서 큰 활용이 기대된다.

본 발명은 상기와 같은 종래의 기술상의 문제점을 해결하기 위해 안출된 것으로, 삼중음성유방암의 아형 분류 방법에 관한 것이다.

그러나 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당 업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.

이하, 본원에 기재된 다양한 구체예가 도면을 참조로 기재된다. 하기 설명에서, 본 발명의 완전한 이해를 위해서, 다양한 특이적 상세사항, 예컨대, 특이적 형태, 조성물 및 공정 등이 기재되어 있다. 그러나, 특정의 구체예는 이들 특이적 상세 사항 중 하나 이상 없이, 또는 다른 공지된 방법 및 형태와 함께 실행될 수 있다. 다른 예에서, 공지된 공정 및 제조 기술은 본 발명을 불필요하게 모호하게 하지 않게 하기 위해서, 특정의 상세사항으로 기재되지 않는다. "한 가지 구체예" 또는 "구체예"에 대한 본 명세서 전체를 통한 참조는 구체예와 결부되어 기재된 특별한 특징, 형태, 조성 또는 특성이 본 발명의 하나 이상의 구체예에 포함됨을 의미한다. 따라서, 본 명세서 전체에 걸친 다양한 위치에서 표현된 "한 가지 구체예에서" 또는 "구체예"의 상황은 반드시 본 발명의 동일한 구체예를 나타내지는 않는다. 추가로, 특별한 특징, 형태, 조성, 또는 특성은 하나 이상의 구체예에서 어떠한 적합한 방법으로 조합될 수 있다.

명세서에서 특별한 정의가 없으면 본 명세서에 사용된 모든 과학적 및 기술적인 용어는 본 발명이 속하는 기술분야에서 당업자에 의하여 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 가진다.

본 발명의 일 구체예에서 “유방암”이란, 유방에 생긴 암세포로 이루어진 종괴를 의미하며, 일반적으로는 유방의 유관과 소엽에서 발생한 암을 의미한다. 예컨대, 유방암은 생검(biopsy)에 의해 악성 병리상태로 분류되는 상태로, 유방암 진단의 임상적인 기술은 의학 분야에 잘 알려져 있다. 당업자라면 유방암이, 예컨대 악성 종양 및 육종을 포함한, 유방 조직의 모든 악성을 나타냄을 이해할 것이다. 예시적으로, 유방암은 유방내암(ductal carcinoma in situ, DCIS), 상피내 소엽성 암종(lobular carcinoma in situ, LCIS), 점액성 유방암(mucinous carcinoma), 침윤성 관상피암(infiltrating ductal carcinoma, IDC), 침윤성 소엽내암(infiltrating lobular carcinoma, ILC) 등을 포함한다. 본 발명의 바람직한 실시예에 있어서, 목적 대상자는 실제 유방암으로 진단받아 수술 또는 항암 화학요법 등의 시술을 받은 인간 환자이다.

본 발명의 일 구체예에서 “삼중음성유방암”이란, 에스트로겐 수용체, 프로게스테론 수용체와 HER2의 발현이 모두 음성인 유방암으로 전체 유방암의 18∼25%를 차지한다. 특히 한국을 비롯한 아시아권에서 삼중음성유방암의 비율이 높게 나타나고 있으며, 2011년 한국의 경우 연간 17,000 여명의 유방암 환자 중에 약 4,000 여명이 삼중음성유방암 환자인 것으로 추정되었다. 삼중음성유방암은 비삼중음성유방암 환자에 비해 상대적으로 불량한 예후를 보인다고 알려져 있으며(Lancet Oncol 2007, (8)235-244), 따라서 삼중음성유방암 환자들의 생존율을 높이기 위해 무엇보다 정확한 아형 분류 및 아형에 따른 표적 치료제의 선택이 중요하다. 미국 공개특허 2014-0303133 및 선행문헌 J Clin Invest 2011, (121)2750?2767은 DNA 미세 배열(microarray) 방법에 의해 삼중음성유방암을 7가지 아형(BL1, BL2, IM, M, M/SL, LAR, UNS)으로 분류하는 방법을 기재하고 있다. 대표적으로, BL 아형(BL1 또는 BL2)에는 시스플라틴(cisplatin), M 아형(M 또는 MSL)에는 NVP_BEZ235(일종의 PI3K/mTOR 저해제)와 다사티닙(dasatinib, 일종의 abl/src 저해제), LAR 아형에는 비칼루타미드(bicalutamide, 일종의 AR 길항제) 약물이 유효한 것으로 알려져 있다.

본 발명의 일 구체예에서 “아형군”이란, 특정 질병에 있어서 하위 단위로 분류되는 아형들의 집합을 의미한다.

본 발명의 일 구체예에서 “DNA 미세 배열(microarray)”이란, “마이크로어레이”라고도 하며, 다른 종류의 다양한 생화학 분자들을 동시에 병렬적으로 합성하는 기술이다. 합성된 마이크로어레이는 다양한 종류의 생화학 분자가 센티미터(cm)에서 마이크로미터(um) 수준의 합성 스폿(spot) 간격을 유지한 채 고체 기판(solid substrate) 위에 고정되어 있는 형태를 가지게 된다. 이렇게 합성된 생화학 분자 라이브러리(library)는 고체 기판 위에 고정된 상태로 사용되거나 기판 위에서 제거되어 수용액(solution) 상태로 사용되게 된다. 예를 들어, 상기 합성 생화학 분자 라이브러리는 유전체(genome) 염기서열 분석, 단일 염기 다형성(single nucleotide polymorphism, SNP) 분석, 전장유전체 연관분석(genome-wide association study, GWAS), 유전자 발현(gene expression) 분석 등 다양한 종류의 유전정보 분석에 활용되고 있을 뿐 아니라 shRNA 라이브러리 제작 및 스크리닝 등을 통한 유전자 기능 분석 분야, 유전자 합성 분야 등 생명과학, 생명공학 혹은 생화학 분야 전반에 걸쳐 필수적인 요소로써 각 분야의 발전을 촉진시켜왔다.

본 명세서에 있어서 미세 배열(microarray)은 삼중음성유방암의 아형을 분리하기 위해, 아형별로 특징적인 유전자의 mRNA 발현 정도를 분석하는 데 사용되는 것이나, 이에 한정하는 것은 아니다. 기존의 미세 배열(microarray)에 의한 삼중음성유방암의 아형 분류는 삼중음성유방암의 아형 분류에 관계된 수천 개의 유전자 발현 양상 확인을 위해 3만여개의 유전자 발현을 모두 확인해야 하는 것으로, 고비용이며 비효율적이라는 문제가 있었다. 따라서 본 발명에서는 100여개의 유전자 발현 양상으로 삼중음성유전자의 아형을 분류 가능한 알고리즘을 제공한다.

본 발명의 일 구체예에서 “알고리즘”이란, 주어진 문제를 해결하기 위해 컴퓨터 프로그래밍이 수행해야 할 과정들을 나타낸 것이다. 일정한 순서에 따라 기계적으로 처리하면 반드시 목적한 결과를 얻을 수 있을 때 그 일정한 순서를 목적에 대한 알고리즘이라고 한다. 일반적으로 알고리즘을 알고 있는 것은 컴퓨터의 프로그램으로 변환하여 처리 할 수 있다. 본 명세서에 있어서 알고리즘은 삼중음성유방암의 아형을 분류하기 위한 처리 과정이며, 삼중음성유방암의 아형별로 mRNA 발현이 높게 나타나는 100여 개의 유전자를 비교하여 삼중음성유방암의 아형을 분류하는 과정에 대한 것이나, 이에 한정하는 것은 아니다.

본 발명의 일 구체예에서 “바이오 마커 또는 진단용 마커”란, 대상이 되는 세포 또는 조직으로부터 타겟하는 질병의 발현 유무, 발현 정도, 및 유전학적 특징을 판별하기 위한 기준이 되는 것으로써, 대상물에서 증가 또는 감소를 보이는 폴리펩타이드 또는 핵산(예: mRNA 등), 지질, 당지질, 당단백질 또는 당(단당류, 이당류, 올리고당류 등) 등과 같은 유기 생체 분자 등을 포함한다. 본 발명의 목적상, 본 발명의 삼중음성유방암 아형 분류 마커는 삼중음성유방암의 아형(LAR, BL, IM 및 M)별로 mRNA가 높은 수준의 발현을 나타내는 유전자 또는 유전자군을 의미하나, 이에 한정하는 것은 아니다.

본 발명의 일 구체예에서 "mRNA 발현 수준”이란, 삼중음성유방암의 아형을 분류하기 위하여 생물학적 시료에서 각 아형(LAR, BL, IM 및 M)별로 높은 수준의 발현을 나타내는 유전자 또는 유전자군의 mRNA 발현 정도를 확인하는 것으로서, mRNA의 양을 측정함으로써 알 수 있다. 이를 위한 분석 방법으로는 역전사 중합효소반응(RT-PCR), 경쟁적 역전사 중합효소반응(Competitive RT-PCR), 실시간 역전사 중합효소반응(Real-time RT-PCR), RNase 보호 분석법(RPA; RNase protection assay), 노던 블랏팅(Northern blotting) 또는 DNA 마이크로어레이 칩 등이 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명에 따른 삼중음성유방암의 아형 분류용 마커 유전자의 mRNA 수준을 측정하는 제제는 바람직하게는 안티센스 올리고뉴클레오티드, 프라이머 쌍 또는 프로브이며, 상기 마커 유전자의 염기서열을 바탕으로 이들 유전자의 특정 영역을 특이적으로 증폭하는 프라이머 또는 프로브를 고안할 수 있다. 본 발명에 따른 삼중음성유방암의 아형 분류용 마커 유전자의 염기서열은 유전자뱅크(GenBank)에 등록되어 당해분야에 공지된 상태이므로, 당업자는 상기 염기서열을 바탕으로 이들 유전자의 특정 영역을 특이적으로 증폭할 수 있는 프라이머 또는 프로브를 디자인할 수 있다.

본 발명에서 용어, "안티센스"는 안티센스 올리고머가 왓슨-크릭 염기쌍 형성에 의해 RNA 내의 표적 서열과 혼성화되어 표적 서열 내에서 전형적으로 mRNA와 헤테로이중체를 형성할 수 있는 뉴클레오티드 염기서열 및 서브유닛간 백본을 갖는 올리고머를 지칭한다. 올리고머는 표적 서열에 대한 정확한 서열 상보성 또는 유사 상보성을 가질 수 있다. 이 안티센스 올리고머는 mRNA의 번역을 차단 또는 저해하고 mRNA의 스플라이스 변이체를 생산하는 mRNA의 프로세싱 과정을 변화시킬 수 있다.

본 발명에서 용어, "프라이머"는 적절한 완충액 중의 적절한 조건(예를 들면, 4개의 다른 뉴클레오시드 트리포스페이트 및 DNA, RNA 폴리머라제 또는 역전사 효소와 같은 중합제) 및 적절한 온도 하에서 주형-지시 DNA 합성의 시작점으로서 작용할 수 있는 단일가닥 올리고뉴클레오티드를 말한다. 상기 프라이머의 적절한 길이는 사용 목적에 따라 달라질 수 있으나, 통상 15 내지 30개 뉴클레오티드이다. 짧은 프라이머 분자는 일반적으로 주형과 안정한 혼성체를 형성하기 위해서 더 낮은 온도를 필요로 한다. 프라이머 서열은 주형과 완전하게 상보적일 필요는 없으나, 주형과 혼성화할 정도로 충분히 상보적이어야 한다.

본 발명에서 용어, "프로브"는 mRNA와 특이적 결합을 이룰 수 있는 짧게는 수개 염기 내지 길게는 수백 개 염기에 해당하는 RNA 또는 DNA 등의 핵산 단편을 의미한다. 프로브는 올리고 뉴클레오티드 프로브, 단일가닥 DNA 프로브, 이중가닥 DNA 프로브, RNA 프로브 등의 형태로 제작될 수 있다. 적당한 프로브의 선택 및 혼성화 조건은 당 업계에 공지된 것을 기초로 변형할 수 있다.

본 발명에 따른 안티센스 올리고뉴클레오티드, 프라이머 또는 프로브는 포스포르아미다이트 고체 지지체 방법을 비롯한 당 업계에 널리 공지된 방법을 사용하여 화학적으로 합성할 수 있다. 이러한 핵산 서열은 또한 당 업계에 공지된 많은 수단을 이용하여 변형시킬 수 있다. 이러한 변형의 비-제한적인 예로는 메틸화, 캡핑, 천연 뉴클레오티드 하나 이상의 동족체로의 치환, 및 뉴클레오티드간의 변형, 예를 들면, 하전되지 않은 연결체(예: 메틸포스포네이트, 포스포트리에스테르, 포스포로아미데이트, 카바메이트 등) 또는 하전된 연결체(예: 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트 등)로의 변형이 있다.

본 발명의 일 구체예에서 "단백질 발현 수준”이란, 삼중음성유방암의 아형을 분류하기 위하여 생물학적 시료에서 각 아형(LAR, BL, IM 및 M)별로 높은 수준의 발현을 나타내는 유전자 또는 유전자군의 mRNA에 대응하는 단백질 발현 정도를 확인하는 것으로서, 상기 단백질에 대하여 특이적으로 결합하는 항체를 이용해 단백질의 양을 확인한다. 이를 위한 분석방법으로는 웨스턴 블랏팅(western blotting), ELISA(enzyme linked immunosorbent assay), 방사선면역분석법(radioimmunoassay), 방사면역확산법(radioimmunodiffusion), 오우크레로니(Ouchterlony) 면역확산법, 로케트(Rocket) 면역전기영동, 면역조직화학염색, 면역침전분석(immunoprecipitation assay), 보체고정분석(complete fixation assay), FACS, 단백질 칩(protein chip) 등이 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명에서 용어, "항체"는 당 업계에 공지된 용어로서, 항원성 부위에 대해서 지시되는 특이적인 단백질 분자를 의미한다. 본 발명의 목적상, 항체는 본 발명의 마커 유전자로부터 코딩된 단백질에 대해 특이적으로 결합하는 항체를 의미하며, 이러한 항체는 각 유전자를 통상적인 방법에 따라 발현벡터에 클로닝하여 상기 마커 유전자에 의해 코딩되는 단백질을 얻은 후, 얻어진 단백질로부터 통상적인 방법에 의해 제조될 수 있다. 여기에는 상기 단백질에서 만들어질 수 있는 펩티드 단편도 포함되며, 본 발명의 펩티드 단편으로는, 최소한 7개 아미노산, 바람직하게는 9개 아미노산, 더욱 바람직하게는 12개 이상의 아미노산을 포함한다. 본 발명의 항체는 그 형태가 특별히 제한되지 않으며, 다중클론 항체, 단일클론 항체 또는 항원 결합성을 갖는 것이라면 그것의 일부도 본 발명의 항체에 포함되고, 모든 면역글로불린 항체가 포함된다.

상기한 바와 같이 삼중음성유방암의 아형 분류용 마커 유전자가 규명되었으므로, 이를 이용하여 항체를 생성하는 것은 당업계에 널리 공지된 기술을 이용하여 용이하게 제조할 수 있다. 다중클론 항체는 상기한 삼중음성유방암의 아형 분류용 마커 유전자로부터 코딩되는 단백질 항원을 동물에 주사하고 동물로부터 채혈하여 항체를 포함하는 혈청을 수득하는 당 업계에 널리 공지된 방법에 의해 생산할 수 있다. 이러한 다중클론 항체는 염소, 토끼, 양, 원숭이, 말, 돼지, 소 개 등의 임의의 동물 종 숙주로부터 제조 가능하다. 단클론 항체는 당해분야에 널리 공지된 하이브리도마 방법(hybridoma method)(Kohler 및 Milstein, European Jounral of Immunology, 6: 511-519, 1976), 또는 파지 항체 라이브러리(Clackson et al, Nature, 352: 624-628, 1991; Marks et al, J. Mol. Biol., 222(58): 1-597, 1991) 기술을 이용하여 제조될 수 있다. 상기 방법으로 제조된 항체는 겔 전기영동, 투석, 염 침전, 이온교환 크로마토그래피, 친화성 크로마토그래피 등의 방법을 이용하여 분리, 정제할 수 있다.

나아가, 본 발명의 항체에는 인간화 항체 등의 재조합 항체도 포함된다. 본 발명에 사용되는 항체는 2개의 전체 길이의 경쇄 및 2개의 전체 길이의 중쇄를 가지는 완전한 형태뿐만 아니라 항체 분자의 기능적인 단편을 포함한다. 항체 분자의 기능적인 단편이란 적어도 항원 결합기능을 보유하고 있는 단편을 뜻하며, Fab, F(ab'), F(ab')2, Fv 등이 있다.

본 발명의 일 구체예에서 “예후”란, 유방암과 같은 질환의, 예를 들어 재발, 전이성 확산, 및 약물 내성을 비롯한 유방암-기인성 사망 또는 진행의 가능성 등의 병의 경과 및 완치 여부를 의미한다. 본 발명의 목적상 예후는 유방암 치료 후 전신 또는 국소 재발 가능성을 의미하며, 바람직하게는 유방암의 수술 또는 항암 화학요법을 시술 받은 후 2년 이내에 전신 또는 국소 재발할 지의 여부를 예측하는 것을 의미한다.

본 발명의 일 구체예에서 "양호한 예후"란 암 환자, 특히 유방암 환자의 질병이 완치될 가능성을 의미하고, "양호하지 않은 예후"는 투병 중인 암 또는 종양의 재생(relapse) 또는 재발(recurrence), 전이 또는 사망할 가능성이 있음을 의미한다. 양호한 결과를 갖는 것으로 분류된 암 환자는 투병 중인 암 또는 종양이 없는 상태이다. 이와는 반대로, 양호하지 않은 결과의 암 환자는 질병의 재생, 종양 재발, 전이 또는 사망에 이른다. "양호한 예후"는 유방암 환자가 투병 중인 암 또는 종양이 적어도 2년, 보다 구체적으로는 적어도 5년 이상 동안 없는 상태로 있을 수 있음을 의미한다. 본 발명의 다른 측면에서, "양호하지 않은 예후"는 유방암 환자가 5년 미만, 보다 구체적으로는 2년 미만 이내에 질병 재생, 종양 재발, 전이 또는 사망을 경험할 수 있음을 의미한다.

본 발명의 일 구체예에서 “키트”란, 특정한 목적을 위해 필요한 조성물 및 부속품들을 모아놓은 세트를 의미한다. 본 발명의 목적상, 본 발명의 키트는 삼중음성유방암의 아형을 분류하기 위하여 생물학적 시료에서 각 아형(LAR, BL, IM 및 M)별로 높은 수준의 발현을 나타내는 유전자 또는 유전자군의 mRNA, 또는 상기 mRNA 에 대응하는 단백질 발현 정도를 확인함으로써 삼중음성유방암의 아형을 분류하는 것이다. 본 발명의 키트에는 삼중음성유방암의 아형 분류용 유전자 마커의 발현수준을 측정하기 위한 프라이머, 프로브 또는 선택적으로 마커를 인지하는 항체뿐만 아니라 분석방법에 적합한 한 종류 또는 그 이상의 다른 구성성분 조성물, 용액 또는 장치가 포함될 수 있다.

구체적인 일례로서, 본 발명에서 상기 마커 유전자들의 mRNA 발현수준을 측정하기 위한 키트는 RT-PCR을 수행하는데 요구되는 필수요소를 포함하는 키트일 수 있다. RT-PCR 키트는 마커 유전자에 특이적인 각각의 프라이머 쌍 외에도 테스트 튜브 또는 다른 적절한 컨테이너, 반응 완충액, 데옥시뉴클레오티드(dNTPs), Taq-중합효소 및 역전사효소와 같은 효소, DNase, RNase 억제제, DEPC-물(DEPC-water), 멸균수 등을 포함할 수 있다.

또한, 본 발명의 키트는 본 발명에 따른 마커 유전자들의 발현 정도로 삼중음성유방암의 아형을 분류하기 위한 마이크로어레이 형태일 수 있다. 상기 마이크로어레이는 DNA 또는 RNA 폴리뉴클레오티드 프로브를 포함하는 것일 수 있다. 상기 마이크로어레이는 본 발명에 따른 삼중음성유방암의 각 아형(LAR, BL, IM 및 M)별로 높은 수준의 발현을 나타내는 유전자 또는 유전자군의 염기서열에 특이적인 프로브를 포함하는 것을 제외하고는 통상적인 마이크로어레이의 구성을 포함한다. 본 발명의 마이크로어레이는 본 발명에 따른 유방암의 예후 마커 유전자의 과다 발현을 검출하여 유방암의 재발 여부를 예후 예측하는데 유용한 정보를 제공할 수 있다.

본 발명에 따른 삼중음성유방암의 아형을 분류하기 위한 마커 유전자에 상응하는 프로브를 기판 상에 고정화하여 마이크로어레이를 제조하는 방법은 당 업계에 잘 알려져 있다. 예컨대, DNA 마이크로어레이는, 이들로 한정되는 것은 아니지만, 파이조일렉트릭(piezoelectric) 방식을 이용한 마이크로피펫팅(micropipetting) 또는 핀(pin) 형태의 스폿터(spotter)를 이용한 방법에 의해 본 발명에 따른 마커 유전자에 대한 프로브를 기판 상에 고정화시킬 수 있다. 본 발명의 마이크로어레이의 기판은 아미노-실란(amino-silane), 폴리-L-라이신(poly-L-lysine) 및 알데히드(aldehyde)로 이루어진 군에서 선택되는 활성기가 코팅된 것이 바람직하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 또한 상기 기판은 슬라이드 글래스, 플라스틱, 금속, 실리콘, 나일론 막 및 니트로셀룰로스 막(nitrocellulose membrane)으로 이루어진 군에서 선택되는 것이 바람직하나, 이들로 한정되는 것은 아니다.

또한, 마이크로어레이 상에서의 핵산의 혼성화 및 혼성화 결과의 검출은 당해분야에 잘 알려져 있다. 상기 검출은 핵산 시료를 형광물질, 예를 들면, Cy3 및 Cy5와 같은 물질을 포함하는 검출가능한 신호를 발생시킬 수 있는 표지물질로 표지한 다음, 마이크로어레이 상에 혼성화하고 상기 표지물질로부터 발생하는 신호를 검출함으로써 혼성화 결과를 검출할 수 있다.

또한, 본 발명에서 상기 마커 유전자들로부터 코딩된 단백질의 발현수준을 측정하기 위한 키트는 항체의 면역학적 검출을 위하여 기재, 적당한 완충용액, 발색효소 또는 형광물질로 표지된 2차 항체, 발색기질 등을 포함할 수 있다. 상기에서 기재로는 니트로셀룰로오스 막, 폴리비닐 수지로 합성된 96-웰 플레이트, 폴리스틸렌 수지로 합성된 96-웰 플레이트, 유리로 된 슬라이드 글라스 등이 이용될 수 있고, 발색효소로는 퍼옥시다아제(peroxidase), 알칼라인 포스파타아제(alkaline phosphatase) 등이 사용될 수 있다. 또한, 형광물질로는 FITC, RITC 등이 사용될 수 있고, 발색기질로는 ABTS(2,2'-아지노-비스-(3-에틸벤조티아졸린-6-설폰산)), OPD(o-페닐렌디아민), TMB(테트라메틸 벤지딘) 등이 사용될 수 있다.

본 발명의 일 구체예에서 “스크리닝”이란, 여러 물질로 이루어진 후보군으로부터 목적으로 하는 어떤 특정한 성질을 갖는 물질을 특정한 조작 또는 평가 방법으로 선별하는 것이다. 본 발명의 목적상, 본 발명의 스크리닝은, 삼중음성유방암의 아형을 분류하기 위하여 생물학적 시료에서 각 아형(LAR, BL, IM 및 M)별로 높은 수준의 발현을 나타내는 유전자 또는 유전자군의 mRNA, 또는 상기 mRNA 에 대응하는 단백질 발현 정도를 확인함으로써 삼중음성유방암의 아형을 분류하는 스크리닝이고, 삼중음성유방암 세포 또는 조직 시료에 삼중음성유방암의 치료 효과가 예상되는 약학조성물을 처리시 상기 유전자 또는 유전자군의 mRNA, 또는 상기 mRNA 에 대응하는 단백질 발현 정도가 저해되는 경우에, 상기 약학조성물을 삼중음성유방암 해당 아형의 치료제로 판단하는, 삼중음성유방암 아형별 치료제의 스크리닝이나, 이에 한정하는 것은 아니다.

자궁경부암 의심 개체에 자궁경부암 치료용 후보 물질의 투여 후 본 발명의 펩타이드 또는 본 발명의 핵산이 코팅하는 단백질에 의해 민감화된 CD8+ T세포 반응이 저해되는 경우에, 후보 물질을 자궁경부암 치료제로 결정하는 자궁경부암 치료제의 스크리닝 방법이다. 분자생물학적 어쎄이(assay), 디지털 이미징, 세포학적 질확대경 및 조직학적 검사와 같은 수단적 방법들이 유두종 바이러스 관련 병소 또는 유두종 바이러스 레벨에 대한 본 발명의 펩타이드와 핵산의 효과를 측정하는데 사용될 수 있다.

본 발명의 일 구체예에서, (a) 생물학적 시료로부터 목적하는 질병에 대한 유전자를 결정하는 단계; (b) 목적하는 질병의 아형군 각각의 유전자 mRNA 발현 정도의 평균값을 산출하는 단계; (c) 상기 아형군 중 목적하는 아형의 mRNA 발현 정도의 평균값에서 상기 아형군 중 목적하는 아형을 제외한 아형 중 어느 하나 이상의 mRNA 발현 정도의 평균값의 차이를 산출하는 단계; 및 (d) (c)의 평균값의 차이가 큰 상위 0.01% 내지 40%의 유전자를 선별하여는 단계; 를 포함하는, 목적하는 질병에 대한 목적하는 아형 특이적인 유전자를 선정하는 방법을 제공하고, 상기 목적하는 질병은 유방암인, 목적하는 질병에 대한 목적하는 아형 특이적인 유전자를 선정하는 방법을 제공하며, 상기 목적하는 아형은 LAR, BL, IM 또는 M 아형인, 목적하는 질병에 대한 목적하는 아형 특이적인 유전자를 선정하는 방법을 제공한다.

본 발명의 다른 구체예에서, (a) 생물학적 시료로부터 목적하는 질병에 대한 유전자를 결정하는 단계; (b) 목적하는 질병의 아형군 각각의 유전자에 대응하는 단백질 발현 정도의 평균값을 산출하는 단계; (c) 상기 아형군 중 목적하는 아형의 단백질 발현 정도의 평균값에서 상기 아형군 중 목적하는 아형을 제외한 아형 중 어느 하나 이상의 단백질 발현 정도의 평균값의 차이를 산출하는 단계; 및 (d) (c)의 평균값의 차이가 큰 상위 0.01% 내지 40%의 단백질에 대응하는 유전자를 선별하여는 단계; 를 포함하는, 목적하는 질병에 대한 목적하는 아형 특이적인 유전자를 선정하는 방법을 제공하고, 상기 목적하는 질병은 유방암인, 목적하는 질병에 대한 목적하는 아형 특이적인 유전자를 선정하는 방법을 제공하며, 상기 목적하는 아형은 LAR, BL, IM 또는 M 아형인, 목적하는 질병에 대한 목적하는 아형 특이적인 유전자를 선정하는 방법을 제공한다.

본 발명의 또 다른 구체예에서, 생물학적 시료로부터 목적하는 질병의 아형군에 대한 유전자의 mRNA 발현 정도의 평균값을 측정하는 측정부; 상기 아형군 중 목적하는 아형의 mRNA 발현 정도의 평균값에서 상기 아형군 중 목적하는 아형을 제외한 아형 중 어느 하나 이상의 mRNA 발현 정도의 평균값의 차이를 산출하고 연산부; 및 상기 평균값의 차이에 따라서 유전자를 나열하여 출력하는 출력부를 포함하는, 목적하는 질병에 대한 목적하는 아형 특이적인 유전자 선정 장치를 제공한다.

본 발명의 또 다른 구체예에서, 생물학적 시료로부터 목적하는 질병의 아형군에 대한 유전자에 대응하는 단백질 발현 정도의 평균값을 측정하는 측정부; 상기 아형군 중 목적하는 아형의 단백질 발현 정도의 평균값에서 상기 아형군 중 목적하는 아형을 제외한 아형 중 어느 하나 이상의 단백질 발현 정도의 평균값의 차이를 산출하고 연산부; 및 상기 평균값의 차이에 따라서 단백질에 대응하는 유전자를 나열하여 출력하는 출력부를 포함하는, 목적하는 질병에 대한 목적하는 아형 특이적인 유전자 선정 장치를 제공한다.

본 발명의 또 다른 구체예에서, 환자로부터 분리된 생물학적 시료로부터 SERHL, MUCL1, PIP, SERHL2, UGT2B28, CYP4Z2P, DHRS2, SDR16C5, TFAP2B 및 CYP4Z1 유전자로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나 이상의 유전자의 mRNA 또는 이의 단백질의 발현 수준을 측정하는 단계를 포함하는, 삼중음성유방암의 LAR 아형 분류 방법을 제공한다.

본 발명의 또 다른 구체예에서, 환자로부터 분리된 생물학적 시료로부터 KLK5, GABRP, S100A7, DMKN, KRT23, S100A9, LCN2, KLK6, C15orf48, S100A7, EN1, LCN2, KRT23, ART3, CXCL10, KRT16, KLK5, ADAMDEC1, LK7, KRT16, MUC15, SPRR1B, LCN2, SFN, SPRR3, KRT81, SPRR3, SDC1, ROPN1B, MX1, PPL, MUC16, IFI27, JUP, ANP32E, IFI44, MUC15, HORMAD1, FCGR3A, ZGP1, S100A2, KRT6A, KRT6A, FOXC1, BST2, KRT81, PROM1, S100A8, DRG1, VTCN1, IFI44L, CEL, NUF2, SPRR1B, KRTDAP, ROPN1, MMP12, GPR87, SPRR1B, 및 KRT16 유전자로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나 이상의 유전자의 mRNA 또는 이의 단백질의 발현 수준을 측정하는 단계를 포함하는, 삼중음성유방암의 BL 아형 분류 방법을 제공한다.

본 발명의 또 다른 구체예에서, 환자로부터 분리된 생물학적 시료로부터 FDCSP, CXCL11, GABRP, CXCL13, CXCL13, FDCSP, CCL19, IDO1, IDO1, LTF, ADAMDEC1, CXCL11, GZMB, CXCL10, IFI44L, CXCL9, CXCL9, MMP7, GZMK, IFI44L, PLAC8, MS4A1, LTF, LAMP3, CCR7, MMP7, CXCL10, MIR155, GBP5, HORMAD1, PLAC8, PLAC8, RTP4, GPR171, RSAD2, GZMB, GZMA, ANKRD22, ART3, GPR18, GZMB, CMPK2, GIMAP7, IFI44, CXCL13, IDO1, BCL2A1, GNLY, TRAT1, CD38, CXCL9, C16orf54, GZMA, RSAD2, CXCL11, MX1, MX1, ITK, C15orf48, 및 GZMA 유전자로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나 이상의 유전자의 mRNA 또는 이의 단백질의 발현 수준을 측정하는 단계를 포함하는, 삼중음성유방암의 IM 아형 분류 방법을 제공한다.

본 발명의 또 다른 구체예에서, 환자로부터 분리된 생물학적 시료로부터 ADIPOQ, TTYH1, GABRP, C2orf40, NPY1R, ROPN1B, NPY1R, 10orf116, NPY1R, IRX1, SCRG1, CRISPLD1, CHRDL1, C2orf40, KRT23, PLIN1, KLK5, SHC4, C10orf116, APOD, SCRG1, THBS4, H19, EN1, CLEC3B, TMEM100, TTYH1, FABP4, PPP1R14A, NLRP2, GPAM, ID1, SOSTDC1, ADH1B, PNMAL1, HORMAD, GHR, COMP, COL2A1, DLK1, COL9A3, KLK5, PCOLCE2, PPP1R1B, PNMAL1, CYYR1, TIMP3, FOXC1, LEP, THBS4, SOX8, PCK1, PXDN, MIA, FHL1, ADIPOQ, IRX1, CRISPLD1, DNRA, 및 CXorf61 유전자로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나 이상의 유전자의 mRNA 또는 이의 단백질의 발현 수준을 측정하는 단계를 포함하는, 삼중음성유방암의 M 아형 분류 방법을 제공한다.

본 발명의 또 다른 구체예에서, ADAMDEC1, CMPK2, FDCSP IFI44, MMP7, PXDN, TFAP2B, ADH1B, COL2A1, FHL1, IFI44L, MS4A1, ROPN1, THBS4, ADIPOQ, COL9A3, FOXC1, IRX1, MUC15, ROPN1B, TIMP3, ANKRD22, COMP, GABRP, ITK, MUC16, RSAD2, TMEM100, ANP32E, CRISPLD1, GBP5, JUP, MUCL1, RTP4, TRAT1, APOD, CXCL10, GHR, KLK5, MX1, S100A2, TTYH1, ART3, CXCL11, GIMAP7, KLK6, NDRG1, S100A7, UGT2B28, AZGP1, CXCL13, GNLY, KLK7, NLRP2, S100A8, VTCN1, BCL2A1, CXCL9, GPAM, KRT16, NPY1R, S100A9, BST2, CXorf61, GPR171, KRT23, NUF2, SCRG1, C10orf116, CYP4Z1, GPR18, KRT6A, PCK1, SDC1, C15orf48, CYP4Z2P, GPR87, KRT81, PCOLCE2, SDR16C5, C16orf54, CYYR1, GZM, KRTDAP, PIP, SERHL, C2orf40, DHRS2, GZMB, LAMP3, PLAC8, SERHL2, CCL19, DLK1, GZMK, LCN2, PLIN1, SFN, CCR7, DMKN, H19, LEP, PNMAL1, SHC4, CD38, EDNRA, HORMAD1, LTF, PPL, SOSTDC1, CEL, EN1, ID1, MIA, PPP1R14A, SOX8, CHRDL1, FABP4, IDO1, MIR155, PPP1R1B, SPRR1B, CLEC3B, FCGR3A, IFI27, MMP12, PROM1, 및 SPRR3 유전자로 이루어진 군으로부터 어느 하나 이상의 유전자에 특이적으로 결합하는 프라이머 또는 프로브를 포함하는, 삼중음성유방암 아형 분류 키트를 제공한다.

본 발명의 또 다른 구체예에서, ADAMDEC1, CMPK2, FDCSP IFI44, MMP7, PXDN, TFAP2B, ADH1B, COL2A1, FHL1, IFI44L, MS4A1, ROPN1, THBS4, ADIPOQ, COL9A3, FOXC1, IRX1, MUC15, ROPN1B, TIMP3, ANKRD22, COMP, GABRP, ITK, MUC16, RSAD2, TMEM100, ANP32E, CRISPLD1, GBP5, JUP, MUCL1, RTP4, TRAT1, APOD, CXCL10, GHR, KLK5, MX1, S100A2, TTYH1, ART3, CXCL11, GIMAP7, KLK6, NDRG1, S100A7, UGT2B28, AZGP1, CXCL13, GNLY, KLK7, NLRP2, S100A8, VTCN1, BCL2A1, CXCL9, GPAM, KRT16, NPY1R, S100A9, BST2, CXorf61, GPR171, KRT23, NUF2, SCRG1, C10orf116, CYP4Z1, GPR18, KRT6A, PCK1, SDC1, C15orf48, CYP4Z2P, GPR87, KRT81, PCOLCE2, SDR16C5, C16orf54, CYYR1, GZM, KRTDAP, PIP, SERHL, C2orf40, DHRS2, GZMB, LAMP3, PLAC8, SERHL2, CCL19, DLK1, GZMK, LCN2, PLIN1, SFN, CCR7, DMKN, H19, LEP, PNMAL1, SHC4, CD38, EDNRA, HORMAD1, LTF, PPL, SOSTDC1, CEL, EN1, ID1, MIA, PPP1R14A, SOX8, CHRDL1, FABP4, IDO1, MIR155, PPP1R1B, SPRR1B, CLEC3B, FCGR3A, IFI27, MMP12, PROM1, 및 SPRR3 유전자로 이루어진 군으로부터 어느 하나 이상의 유전자에 대응하는 단백질에 특이적으로 결합하는 항체를 포함하는, 삼중음성유방암 아형 분류 키트를 제공한다.

이하 상기 본 발명을 단계별로 상세히 설명한다.

본 발명의 삼중음성유방암의 아형 분류 방법은 구현 비용이 저렴하고 정밀성이 높으므로 임상 분야에서 큰 활용이 기대된다.

도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른, “TNBCtype(삼중음성유방암의 아형 분류 프로그램)”에 의거하여 실시한 203개의 유전자 데이터 세트의 삼중음성유방암 아형 분류 결과이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른, BL 대 IM 비교에서 선정된 유전자들의 아형별 발현값을 나타낸 결과이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른, BL 대 M 비교에서 선정된 유전자들의 아형별 발현값을 나타낸 결과이다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따른, BL 대 LAR 비교에서 선정된 유전자들의 아형별 발현값을 나타낸 결과이다.
도 5는 본 발명의 일 실시예에 따른, IM 대 BL 비교에서 선정된 유전자들의 아형별 발현값을 나타낸 결과이다.
도 6은 본 발명의 일 실시예에 따른, IM 대 M 비교에서 선정된 유전자들의 아형별 발현값을 나타낸 결과이다.
도 7은 본 발명의 일 실시예에 따른, IM 대 LAR 비교에서 선정된 유전자들의 아형별 발현값을 나타낸 결과이다.
도 8은 본 발명의 일 실시예에 따른, M 대 BL 비교에서 선정된 유전자들의 아형별 발현값을 나타낸 결과이다.
도 9는 본 발명의 일 실시예에 따른, M 대 IM 비교에서 선정된 유전자들의 아형별 발현값을 나타낸 결과이다.
도 10은 본 발명의 일 실시예에 따른, M 대 LAR 비교에서 선정된 유전자들의 아형별 발현값을 나타낸 결과이다.
도 11은 본 발명의 일 실시예에 따른, 본 발명의 LAR 아형 선별 알고리즘으로 LAR 아형 삼중음성유방암 시료를 분석한 결과이다.
도 12는 본 발명의 일 실시예에 따른, 본 발명의 BL 아형 선별 알고리즘으로 BL 아형 삼중음성유방암 시료를 분석한 결과이다.
도 13은 본 발명의 일 실시예에 따른, 본 발명의 IM 아형 선별 알고리즘으로 IM 아형 삼중음성유방암 시료를 분석한 결과이다.
도 14는 본 발명의 일 실시예에 따른, 본 발명의 M 아형 선별 알고리즘으로 M 아형 삼중음성유방암 시료를 분석한 결과이다.
도 15는 본 발명의 일 실시예에 따른, 한국인 삼중음성유방암 환자의 시료 100개의 “TNBCtype”아형 분류 결과이다.
도 16은 본 발명의 일 실시예에 따른, “TNBCtype”결과로 분류된 LAR 아형 10건에 대한 본 발명의 알고리즘 아형 분석 결과이다.
도 17은 본 발명의 일 실시예에 따른, “TNBCtype”결과로 분류된 BL 아형 5건에 대한 본 발명의 알고리즘 아형 분석 결과이다.
도 18은 본 발명의 일 실시예에 따른, “TNBCtype”결과로 분류된 IM 아형 18건에 대한 본 발명의 알고리즘 아형 분석 결과이다.
도 19는 본 발명의 일 실시예에 따른, “TNBCtype”결과로 분류된 M 아형 21건에 대한 본 발명의 알고리즘 아형 분석 결과이다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

실시예 1: 공지된 데이터의 확보

미국 국립생물정보센터(National Center for Biotechnology Information, part of the US National Institutes of Health, NCBI)에 등록된 삼중음성유방암 시료의 DNA 미세 배열(microarray) 결과 중 선행 문헌 J Clin Invest 2011, (121)2750?2767에서 사용한 데이터 세트를 기초로, 접근 가능한 203개의 유전자 데이터 세트를 다운로드하였다.

실시예 2:“ TNBCtype”와 연관 지수가 높은 시료 선별

선행 문헌(J Clin Invest 2011, (121)2750?2767)에 기재된 “TNBCtype(삼중음성유방암의 아형 분류 프로그램)”에 의거하여 상기 실시예 1에서 선별한 203개의 유전자 데이터 세트의 삼중음성유방암 아형을 분류하고, 그 결과를 도 1에 기재하였다.

“TNBCtype”알고리즘에서는 삼중음성유방암의 아형별로 “연관 지수(co-relation)”라는 수치를 이용한다. 예를 들어, 해당 아형의 연관 지수가 높다는 것은 시험한 시료의 mRNA 발현 패턴이 해당 아형의 mRNA 발현 패턴과 유사하는 것을 의미한다. 따라서 본 연구에서는 각 아형별로 연관 지수가 높은 시료들을 선정하였다. 선정은 하기 표 1과 같이 수행되었다.

아형유형	선정 시료 수	비고
BL	10	BL1 5개, BL2 5개
IM	10
LAR	10
M	10	M 5개, MSL 5개

실시예 3: 삼중음성유방암 아형 분류를 위한 새로운 알고리즘 개발

실시예 3-1. LAR 아형 분류를 위한 알고리즘 개발

실시예 2에서 선별된 LAR 유형 10개의 시료에 대하여, 유전자 별 mRNA 발현 강도의 평균값을 구하고, 나머지 3종류 아형(BL, IM, M) 30개 시료에 대해서도 유전자 별 mRNA 발현 강도의 평균값을 구하였다. 그 후, 차이값(LAR 10개 시료의 유전자 별 mRNA 발현 강도 평균값 - 나머지 30개 시료의 유전자 별 mRNA 발현 강도 평균값)을 구하였고, 이를 내림차순으로 정렬하였다. LAR 아형의 경우, 높은 수준으로 발현(high-expression)되는 유전자들의 발현 강도가 다른 아형에 비해 매우 높았다. 따라서 많은 유전자를 선정할 필요가 없었다. 이에, (LAR 평균값 - 나머지 평균값)이 가장 큰 상위 10개의 유전자를 선정하였다. 그 후, 해당 10개의 유전자의 평균 발현강도를 “LAR 지수(LAR score)”라는 변수로 지정하였다.

상기의 LAR 아형 비교에서 선정된 유전자를 표 2에 기재하였다.

LAR 아형 선정을 위한 비교	LAR 대 나머지 3종류 아형
선정된 유전자	SERHL
	MUCL1
	PIP
	SERHL2
	UGT2B28
	CYP4Z2P
	DHRS2
	SDR16C5
	TFAP2B
	CYP4Z1

실시예 3-2. BL , IM 또는 M 아형 분류를 위한 알고리즘 개발

본 선정방법은 BL, IM 또는 M 아형 분류를 위한 바이오 마커 선정 시 사용하였다. 해당 아형들은 실시예 3-1과 동일한 선정방법으로는 만족스러운 유형 분류가 이루어지지 않았다. 따라서 분류하고자 하는 아형과 나머지 아형들을 일일이 비교하는 방법을 사용하였다. 예를 들어, BL 아형의 바이오 마커를 선정하는 경우, BL 대 IM의 비교, BL 대 M의 비교, BL 대 LAR의 비교를 수행하였다. 각 비교 쌍에서 구체적인 비교 방법은 실시예 3-1에 기술된 바와 같다. BL 대 IM을 예로 들어 설명하면, 실시예 2에서 선별된 BL 유형 10개의 시료에 대하여 유전자 별 mRNA 발현 강도의 평균값을 구하고, 나머지 3종류 아형(IM, M, LAR) 30개 시료에 대해서도 유전자 별 mRNA 발현 강도의 평균값을 구하였다. 그 후, 차이값(BL 10개 시료의 유전자 별 mRNA 발현 강도 평균값 - IM 10개 시료의 유전자 별 mRNA 발현 강도 평균값)을 구하였고, 이를 내림차순으로 정렬하였다. 그 후, 해당 값이 높은 유전자 20개를 선정하였다. 상기와 같은 방법으로 BL 대 M의 비교 및 BL 대 LAR의 비교를 추가로 수행하여, 각 비교쌍 별로 20개씩 총 60개의 유전자를 선정하였다. 이 중 중복되는 유전자는 중복되는 데로 비교 지수에 포함하였다. 중복되는 유전자가 해당 아형을 분류하는데 있어서 매우 중요하다고 판단되었기 때문이다.

상기의 BL 아형 비교쌍에서 선정된 유전자를 표 3에 기재하고, 각 비교쌍에서의 차이값을 도 2 내지 도 4에 나타내었다.

BL 아형 선정을 위한 비교쌍	BL 대 IM	BL 대 M	BL 대 LAR
선정된 유전자	KLK5	GABRP	S100A7
	DMKN	KRT23	S100A9
	LCN2	KLK6	C15orf48
	S100A7	EN1	LCN2
	KRT23	ART3	CXCL10
	KRT16	KLK5	ADAMDEC1
	KLK7	KRT16	MUC15
	SPRR1B	LCN2	SFN
	SPRR3	KRT81	SPRR3
	SDC1	ROPN1B	MX1
	PPL	MUC16	IFI27
	JUP	ANP32E	IFI44
	MUC15	HORMAD1	FCGR3A
	AZGP1	S100A2	KRT6A
	KRT6A	FOXC1	BST2
	KRT81	PROM1	S100A8
	NDRG1	VTCN1	IFI44L
	CEL	NUF2	SPRR1B
	KRTDAP	ROPN1	MMP12
	GPR87	SPRR1B	KRT16

상기의 IM 아형 비교쌍에서 선정된 유전자를 표 4에 기재하고, 각 비교쌍에서의 차이값을 도 5 내지 도 7에 나타내었다.

IM 아형 선정을 위한 비교쌍	IM 대 BL	IM 대 M	IM 대 LAR
선정된 유전자	FDCSP	CXCL11	GABRP
	CXCL13	CXCL13	FDCSP
	CCL19	IDO1	IDO1
	LTF	ADAMDEC1	CXCL11
	GZMB	CXCL10	IFI44L
	CXCL9	CXCL9	MMP7
	GZMK	IFI44L	PLAC8
	MS4A1	LTF	LAMP3
	CCR7	MMP7	CXCL10
	MIR155	GBP5	HORMAD1
	PLAC8	PLAC8	RTP4
	GPR171	RSAD2	GZMB
	GZMA	ANKRD22	ART3
	GPR18	GZMB	CMPK2
	GIMAP7	IFI44	CXCL13
	IDO1	BCL2A1	GNLY
	TRAT1	CD38	CXCL9
	C16orf54	GZMA	RSAD2
	CXCL11	MX1	MX1
	ITK	C15orf48	GZMA

상기의 M 아형 비교쌍에서 선정된 유전자를 표 5에 기재하고, 각 비교쌍에서의 차이값을 도 8 내지 도 10에 나타내었다.

M 아형 선정을 위한 비교쌍	M 대 BL	M 대 IM	M 대 LAR
선정된 유전자	ADIPOQ	TTYH1	GABRP
	C2orf40	NPY1R	ROPN1B
	NPY1R	C10orf116	NPY1R
	IRX1	SCRG1	CRISPLD1
	CHRDL1	C2orf40	KRT23
	PLIN1	KLK5	SHC4
	C10orf116	APOD	SCRG1
	THBS4	H19	EN1
	CLEC3B	TMEM100	TTYH1
	FABP4	PPP1R14A	NLRP2
	GPAM	ID1	SOSTDC1
	ADH1B	PNMAL1	HORMAD
	GHR	COMP	COL2A1
	DLK1	COL9A3	KLK5
	PCOLCE2	PPP1R1B	PNMAL1
	CYYR1	TIMP3	FOXC1
	LEP	THBS4	SOX8
	PCK1	PXDN	MIA
	FHL1	ADIPOQ	IRX1
	CRISPLD1	EDNRA	CXorf61

또한, 상기에서 기술된 표 2 내지 5의 각 아형별 유전자로 실시예 2의 40개 시료를 분석한 결과를 도 11 내지 14에 기재하였다. 시험 결과, 공지된 각 시료의 삼중음성유방암 아형과 실시예 1 내지 3의 방법으로 분석된 삼중음성유방암 아형이 일치하였다. 이로써, 본 발명의 새로운 삼중음성유방암 아형 분류 알고리즘이 기존의 분류 방법과 결과가 일치함을 증명하였다.

실시예 4. 삼중음성유방암 아형 분류 알고리즘의 적합성 확인

실시예 1 내지 3의 방법으로 선정된 유전자를 종합하여, 삼중음성유방암 아형 분류에 사용할 수 있는 유전자 128개를 선정하였다. 이를 표 6에 나타내었다.

삼중음성유방암 아형 분류에 사용할 수 있는 유전자 128개
ADAMDEC1	CMPK2	FDCSP	IFI44	MMP7	PXDN	TFAP2B
ADH1B	COL2A1	FHL1	IFI44L	MS4A1	ROPN1	THBS4
ADIPOQ	COL9A3	FOXC1	IRX1	MUC15	ROPN1B	TIMP3
ANKRD22	COMP	GABRP	ITK	MUC16	RSAD2	TMEM100
ANP32E	CRISPLD1	GBP5	JUP	MUCL1	RTP4	TRAT1
APOD	CXCL10	GHR	KLK5	MX1	S100A2	TTYH1
ART3	CXCL11	GIMAP7	KLK6	NDRG1	S100A7	UGT2B28
AZGP1	CXCL13	GNLY	KLK7	NLRP2	S100A8	VTCN1
BCL2A1	CXCL9	GPAM	KRT16	NPY1R	S100A9
BST2	CXorf61	GPR171	KRT23	NUF2	SCRG1
C10orf116	CYP4Z1	GPR18	KRT6A	PCK1	SDC1
C15orf48	CYP4Z2P	GPR87	KRT81	PCOLCE2	SDR16C5
C16orf54	CYYR1	GZM	KRTDAP	PIP	SERHL
C2orf40	DHRS2	GZMB	LAMP3	PLAC8	SERHL2
CCL19	DLK1	GZMK	LCN2	PLIN1	SFN
CCR7	DMKN	H19	LEP	PNMAL1	SHC4
CD38	EDNRA	HORMAD1	LTF	PPL	SOSTDC1
CEL	EN1	ID1	MIA	PPP1R14A	SOX8
CHRDL1	FABP4	IDO1	MIR155	PPP1R1B	SPRR1B
CLEC3B	FCGR3A	IFI27	MMP12	PROM1	SPRR3

국내의 종합병원으로부터 한국인 삼중음성유방암 환자의 시료 100개를 제공받아, 선행 문헌(J Clin Invest 2011, (121)2750?2767)에 기재된 “TNBCtype(삼중음성유방암의 아형 분류 프로그램)”으로 아형을 분류하였다. 그 결과를 도 15에 기재하였다.

그 후, “TNBCtype”결과로 분류된 LAR 아형 10건, BL 아형 5건, IM 아형 18건 및 M 아형 21건에 대하여 표 6에 기재된 유전자로 삼중음성유방암 아형 분류를 시행하였다. “TNBCtype”분석 결과 삼중음성유방암이 아닌 시료로 판정되거나, ‘분류 불가능’으로 판정된 시료는 분석에서 제외하였다. 각 아형에 대한 본 발명의 알고리즘 분석 결과를 도 16 내지 19에 기재하였다.

분석 결과, 표 7에 기재된 바와 같이, “TNBCtype”를 이용한 삼중음성유방암 아형 분류 결과와 본 발명의 알고리즘을 이용한 아형 분류 방법이 높은 일치율을 나타내는 것을 확인하였다. 이로써, 본 발명의 알고리즘을 이용한 삼중음성유방암 아형 분류 방법이 의료 분야에 적용될 수 있음을 증명하였다. 또한, “TNBCtype”아형 분류 방법이 100% 정확한 아형 분류 결과를 나타낸다는 것을 보장할 수 없으므로, 본 발명의 삼중음성유방암 아형 분류 방법은 삼중음성유방암 환자들의 정확한 아형 분류 및 아형에 따른 치료법 선정에 크게 공헌할 수 있을 것으로 기대된다.

아형	"TNBCtype"	본 발명의 알고리즘	일치율(%)
BL (BL1 + BL2)	23	18	78
IM	18	18	100
LAR	10	8	80
M (M+M/SL)	27	17	63
Total	78	61	78

Claims

(a) MUCL1, CYP4Z2P, SDR16C5, 및 CYP4Z1 유전자로 구성되는 그룹으로부터 어느 하나 이상의 유전자를 선택하는 단계;
(b) PIP, SERHL2, UGT2B28, DHRS2, 및 TFAP2B 유전자로 구성되는 그룹으로부터 어느 하나 이상의 유전자를 선택하는 단계;
(c) 삼중음성유방암 시료로부터 상기 (a) 단계와 (b) 단계에서 선택된 유전자들의 mRNA 발현값을 측정하는 단계;
(d) 정상 시료로부터 상기 (a) 단계와 (b) 단계에서 선택된 유전자들의 mRNA 발현값을 측정하는 단계; 및
(e) 상기 (c)단계에서의 측정값이 (d)단계에서의 측정값보다 30% 이상 큰 경우에, 상기 삼중음성유방암을 LAR(luminal androgen receptor) 아형 삼중음성유방암으로 분류하는 단계를 포함하는, 삼중음성유방암의 LAR(luminal androgen receptor) 아형 분류 방법.
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(a) MUCL1, CYP4Z2P, SDR16C5, 및 CYP4Z1 유전자로 구성되는 그룹으로부터 어느 하나 이상의 유전자를 선택하는 단계;
(b) PIP, SERHL2, UGT2B28, DHRS2, 및 TFAP2B 유전자로 구성되는 그룹으로부터 어느 하나 이상의 유전자를 선택하는 단계;
(c) 삼중음성유방암 시료로부터 상기 (a) 단계와 (b) 단계에서 선택된 유전자들의 단백질 발현값을 측정하는 단계;
(d) 정상 시료로부터 상기 (a) 단계와 (b) 단계에서 선택된 유전자들의 단백질 발현값을 측정하는 단계; 및
(e) 상기 (c)단계에서의 측정값이 (b)단계에서의 측정값보다 30% 이상 큰 경우에, 상기 삼중음성유방암을 LAR(luminal androgen receptor) 아형 삼중음성유방암으로 분류하는 단계를 포함하는, 삼중음성유방암의 LAR(luminal androgen receptor) 아형 분류 방법.
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MUCL1, CYP4Z2P, SDR16C5, 및 CYP4Z1 유전자로 구성되는 그룹으로부터 어느 하나 이상의 유전자를 선택하고, PIP, SERHL2, UGT2B28, DHRS2, 및 TFAP2B 유전자로 구성되는 그룹으로부터 어느 하나 이상의 유전자를 선택하는 선별부;
삼중음성유방암 시료로부터 상기 선별부에서 선택된 유전자들의 mRNA 발현값을 측정하는 제 1 측정부;
정상 시료로부터 상기 선별부에서 선택된 유전자들의 mRNA 발현값을 측정하는 제 2 측정부; 및
상기 제 1 측정부와 제 2 측정부의 결과값을 비교하는 비교부를 포함하는, 삼중음성유방암의 LAR(luminal androgen receptor) 아형 분류 장치.
MUCL1, CYP4Z2P, SDR16C5, 및 CYP4Z1 유전자로 구성되는 그룹으로부터 어느 하나 이상의 유전자를 선택하고, PIP, SERHL2, UGT2B28, DHRS2, 및 TFAP2B 유전자로 구성되는 그룹으로부터 어느 하나 이상의 유전자를 선택하는 선별부;
삼중음성유방암 시료로부터 상기 선별부에서 선택된 유전자들의 단백질 발현값을 측정하는 제 1 측정부;
정상 시료로부터 상기 선별부에서 선택된 유전자들의 단백질 발현값을 측정하는 제 2 측정부; 및
상기 제 1 측정부와 제 2 측정부의 결과값을 비교하는 비교부를 포함하는, 삼중음성유방암의 LAR(luminal androgen receptor) 아형 분류 장치.
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MUCL1, CYP4Z2P, SDR16C5, 및 CYP4Z1 유전자로 구성되는 그룹으로부터 선택된 어느 하나 이상의 유전자와, PIP, SERHL2, UGT2B28, DHRS2, 및 TFAP2B 유전자로 구성되는 그룹으로부터 선택된 어느 하나 이상의 유전자에 특이적으로 결합하는 프라이머 또는 프로브를 포함하는, 삼중음성유방암의 LAR(luminal androgen receptor) 아형 분류 키트.
MUCL1, CYP4Z2P, SDR16C5, 및 CYP4Z1 유전자로 구성되는 그룹으로부터 선택된 어느 하나 이상의 유전자와, PIP, SERHL2, UGT2B28, DHRS2, 및 TFAP2B 유전자로 구성되는 그룹으로부터 선택된 어느 하나 이상의 유전자에 대응하는 단백질에 특이적으로 결합하는 항체를 포함하는, 삼중음성유방암의 LAR(luminal androgen receptor) 아형 분류 키트.