KR101835815B1

KR101835815B1 - 형광수명 측정장치 및 측정방법

Info

Publication number: KR101835815B1
Application number: KR1020160172862A
Authority: KR
Inventors: 이상윤; 강민구; 원영재; 이승락; 박병준; 김병연
Original assignee: (주) 인텍플러스; 재단법인 오송첨단의료산업진흥재단
Priority date: 2016-12-16
Filing date: 2016-12-16
Publication date: 2018-03-07
Anticipated expiration: 2036-12-16
Also published as: EP3546925A4; CN110178016B; US20190383740A1; EP3546925B1; WO2018110843A1; US10753872B2; CN110178016A; EP3546925A1

Abstract

본 발명의 일 실시예에 따른 형광수명 측정장치는 조사광을 발생시키는 조사광 발생부, 상기 조사광으로 형광 분자를 포함하는 샘플을 조사하여 생성되는 형광 광자를 수집하는 형광 광자 검출부, 상기 수집된 형광 광자를 제1클럭 신호, 상기 샘플을 통하지 않은 조사광을 제2클럭 신호로 변환하는 변환부, 상기 변환부로부터 수집된 형광 광자의 형광수명을 분석하는 제1모듈, 상기 제1모듈로부터 샘플의 관심영역(ROI, Range of interesting)을 지정하는 제어부, 상기 관심영역에 대응되는 형광 광자의 형광수명을 분석하는 제2모듈을 포함한다.

Description

형광수명 측정장치 및 측정방법{APPARATUS AND METHOD FOR MEASURING FLUORESCENCE LIFETIME}

본 발명은 형광수명을 측정하기 위한 형광수명 측정장치 및 측정방법에 관한 것으로, 상세하게는 샘플의 전기적, 열적 및 화학적 특성을 검출할 수 있는 측정장치 및 측정방법에 관한 것이다.

현미경은 제1세대 광학 현미경(optical microscope), 제2세대 전자 현미경(electron microscope), 제3세대 원자 현미경(scanning probe microscope)으로 분류되고, 의학, 분자 생물학, 신약 개발, 재료공학 분야에 폭넓게 활용된다.

제1세대 광학 현미경(wide-field)은 태양광 또는 할로겐 램프를 광원으로 사용하며 광학렌즈의 계통에 따라 조리개(aperature)로 배율을 조절하여 최대 1500 배율로 분석하도록 집광 렌즈(x15), 대물 렌즈(objectivelens)(x20/40/100), 투시 렌즈(projector lens)를 통해 샘플을 관찰하며, 핀홀(pinhole)을 구비하지 않는 현미경이다.

제2세대 전자 현미경은 광학 현미경의 광선 대신에 전자 빔(electron beam)을, 광학 렌즈 대신에 전자 렌즈를 사용하며, 집광 렌즈(condenser lens), 대물 렌즈(object lens), 투시 렌즈(projector lens)를 통해 시편의 형광면 위에 맺어진 물체를 확대하여 관찰하며, 목적에 따라 주사 전자현미경, 투과 전자현미경, 반사 전자 현미경으로 구분된다. 전자 현미경은 광학 현미경의 분해능이 빛의 파장(wavelength)에 의하여 제한되며 전자 빔의 파장은 0.05Å 정도로 짧아 광학 현미경으로 분석할 수 없었던 바이러스, 미생물까지 선명하게 관찰할 수 있다. 최근 전자현미경은 수백만 배까지 상을 확대하여 결정 내의 원자 배열(1~2Å간격)까지 관찰할 수 있으므로 의학, 생물학, 공학 등 넓은 분야에 사용되고 있다.

제3세대 원자 현미경은 원자 지름의 수십분의 1까지 측정할 수 있어, 나노 기술 발전에 필요한 첨단 계측장비이다. 원자 현미경은 진공 중에서도 사용이 가능하며 샘플의 물리적, 전기적 성질을 알아낼 수 있는 장점이 있다.

한편, 최근에는 형광수명 현미경이 연구의 핵심으로 떠오르고 있다. 형광수명 현미경은 형광공명-에너지전이(Fluorescence Resonance Energy Transfer: FRET)를 가장 정확하게 측정할 수 있는 장비(FLIM-FRET)이다.. FRET이란 두 개의 형광체가 10 nm 이하의 근접거리에 위치해 있을 때 빛의 방출이나 흡수 없이 하나의 형광체에서 다른 형광체로 에너지가 전이되는 현상이다. 수 nm 이하의 스케일에서 일어나 기존의 광학현미경으로 볼 수 없었던 현상들을 FRET으로 확인할 수 있게 되면서, 세포막, DNA, RNA, 단백질-단백질 상호작용 등 수많은 생명과학 분야에서 수요가 급증하고 있다.

한국공개특허 KR 10-2015-0146074 "멀티모달 현미경"

본 발명의 일 실시예에 따르면, 다중 형광분석을 가능하게 하고 빠른 측정 속도를 갖는 형광수명 측정장치 및 측정방법을 제공한다.

본 발명의 일 실시예에 따른 형광수명 측정장치는 조사광을 발생시키는 조사광 발생부, 조사광으로 형광 분자를 포함하는 샘플을 조사하여 생성되는 형광 광자를 수집하는 형광 광자 검출부, 수집된 형광 광자를 제1클럭 신호, 샘플을 통하지 않은 조사광을 제2클럭 신호로 변환하는 변환부, 변환부로부터 수집된 형광 광자의 형광수명을 분석하는 제1모듈, 제1모듈로부터 샘플의 관심영역(ROI, Range of interesting)을 지정하는 제어부, 관심영역에 대응되는 형광 광자의 형광수명을 분석하는 제2모듈을 포함한다.

제1모듈은, 제1클럭 신호의 평균 시간과 제2클럭 신호의 평균 시간의 차이를 이용하여 형광수명을 계산하는 AMD(Analog mean delay) 계측부를 포함할 수 있다.

제2모듈은, 단일 형광 광자의 시간 데이터를 누적하여 형광수명을 계산하는 TCSPC(Time-correlated single photon counting) 계측부를 포함할 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 따른 형광수명 측정방법은 조사광을 발생시키는 광발생 단계, 조사광을 샘플에 조사하여 생성되는 형광 광자를 수집하는 제1조사 단계, 형광 광자 검출부로부터 수집된 형광 광자의 형광 수명을 계산하는 AMD(Analog mean delay) 계측 단계, AMD 계측 단계의 결과값으로부터 샘플의 관심영역(ROI, Range of interesting)를 지정하는 제어 단계 및 관심영역에 대응되는 형광 광자의 형광 수명을 계산하는 TCSPC(Time correlated single photon counting) 계측 단계를 포함할 수 있다.

제어 단계 다음, 조사광의 세기를 단일 광자 수준으로 낮추는 조절 단계 및 조절된 조사광을 관심영역에 재조사하여 생성되는 형광 광자를 재수집하는 제2조사 단계를 더 포함하고, TCSPC 계측 단계는, 제2조사 단계로부터 검출된 형광 광자의 형광수명을 계산할 수 있다.

본 발명의 일실시예에 따르면, 보다 빠르게 샘플의 형광 수명 값을 계산할 수 있도록 한다.

상세하게는, 측정 속도가 빠른 모듈로 형광 수명을 측정하여 샘플의 관심영역(ROI, Range of interesting)을 지정하고, 높은 시간 분해능을 갖는 모듈로 관심영역의 형광수명을 측정하여, 측정시간을 감소시킬 수 있는 통합 시스템을 구현할 수 있다.

도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 형광수명 측정장치의 블록도이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 형광수명 측정방법의 흐름도이다.
도 3은 본 발명의 다른 실시예에 따른 형광수명 측정방법의 흐름도이다.

본 발명의 이점 및 특징, 그리고 그것들을 달성하는 방법은 첨부되는 도면과 함께 상세하게 후술되어 있는 실시예들을 참조하면 명확해질 것이다. 그러나 본 발명은 이하에서 개시되는 실시예들에 한정되는 것이 아니라 서로 다른 다양한 형태로 구현될 것이며, 단지 본 실시예들은 본 발명의 개시가 완전하도록 하며, 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 발명의 범주를 완전하게 알려주기 위해 제공되는 것이며, 본 발명은 청구항의 범주에 의해 정의될 뿐이다.

다른 정의가 없다면, 본 명세서에서 사용되는 모든 용어(기술 및 과학적 용어를 포함)는 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 공통적으로 이해될 수 있는 의미로 사용될 수 있을 것이다. 또 일반적으로 사용되는 사전에 정의되어 있는 용어들은 명백하게 특별히 정의되어 있지 않은 한 이상적으로 또는 과도하게 해석되지 않는다.

이하에서, 도면을 참조하여 본 발명의 일 실시예에 따른 형광수명 측정장치(10)를 설명한다.

도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 형광수명 측정장치(10)의 블록도이다. 도 1을 참조하면, 조사광 발생부(100)는 샘플(S)을 여기시킬 수 있는 조사광을 발생시킨다. 조사광은 시간에 대하여 펄스 형태로 콜리메이터(120)(Collimator)를 통하여 공간상 평행하게 입사된다.

입사된 조사광은 SPF(130)(Short Pass Filter)를 통과한 다음, 다이크로익 필터(320)(Dichroic filter)로부터 반사되며 대물렌즈(310)를 통해 샘플(S)로 입사된다. 입사된 조사광은 샘플(S)로부터 형광 광자를 생성하도록 한다.

생성된 형광 광자는 대물렌즈(310)를 통해 공초점 스캐너(200)에 수집된 후 다이크로익 필터(320)를 통과한다.

따라서, 조사 광이 제거된 형광 광자는 LPF(Loss Pass Filter)를 통과한 후 콜리메이터(120)(Collimator)를 통해 집중되어 변환부(400)로 입사된다.

다음, 형광 광자는 변환부(400)를 통해 제1클럭 신호로 전이되고, 제1클럭 신호는 디지타이저(Digitizer)로부터 증폭된다. 증폭된 제1클럭 신호는 제1모듈(500)로 전달된다.

제1모듈(500)은 제1클럭 신호로부터 형광 광자의 형광수명을 계산한다. 제1모듈(500)에서 계산된 형광수명값은 제어부(600)로 전달되고, 제어부(600)는 제1모듈(500)에서 계산된 형광수명값으로부터 샘플(S)의 관심영역(Range of interesting)을 지정한다.

다음, 제2모듈(700)은 관심영역에 대응되는 형광 광자를 개별적으로 분석하여 형광 수명을 계산한다.

조사광 발생부(100)는 형광 분자를 포함하는 샘플(S)에 조사할 조사광을 발생시키는 구조로서, 조사광원(110)을 포함한다.

조사광은 100psec 이하의 펄스폭을 갖고, 300nm 내지 700nm 범위 내의 파장을 갖는다. 본 발명의 일 실시예에 따른 조사광원(110)은 반도체 레이저를 포함한다.

또한, 반도체 레이저는 300ps 이하의 펄스폭을 갖는 전기펄스 신호 발생기, 안정적 트리거 신호를 생성하는 펄스 클럭부, 400nm 파장의 반도체 펄스레이저 헤드를 포함할 수 있다.

조사광 발생부(100)는 조사광을 집광하기 위한 콜리메이터(120)(Collimator)와 SPF(130)(Short Pass Filter)를 더 포함할 수 있다.

공초점 스캐너(200)는 3차원 이미징을 가능하게 하므로, 샘플(S)에 대하여 빛의 시간 또는 파장에 따른 변화를 3차원으로 측정할 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 따른 공초점 스캐너(200)는 수평 스캔부 및 스직 스캔부를 포함한다. 수평 스캔부는 갈바노미터 미러를 포함하며, 갈바노미터 미러를 이용해 초고속으로 2차원 스캔할 수 있다. 수직 스캔부는 모터 구동식 수단 또는 압전 구동식 수단(PZT, piezoelectric-driven means)을 포함한다. 모터 구동식 수단 또는 압전 구동식 수단은 모두 개방 루프 또는 폐쇄 루프 시스템에 의해 조절될 수 있다.

형광 광자 검출부(300)는 샘플(S)에 조사하여 생성되는 다수의 형광 광자를 수집하는 모듈이다. 형광 광자 검출부(300)는 형광 광자 수집렌즈(310)와 조사광이 후출하는 변환부(400)에 수광되는 것을 막기 위한 다이크로익 필터(320)를 포함한다.

형광 광자 수집렌즈(310)는 샘플(S)로부터 생성된 다수의 형광 광자를 수집하는 렌즈이다. 형광 광자 수집렌즈(310)는 대물렌즈(310)의 역할을 할 수도 있다.

다이크로익 필터(320)는 입사된 조사광을 파장에 따라 선택적으로 통과시키는 광 필터이다. 본 발명의 일 실시예에 따른 다이크로익 필터(320)는 조사광에 대응되는 파장대역은 반사시키고 형광 광자에 대응되는 파장대역은 통과시키는 특성을 갖는다. 단, 필요에 따라 다이크로익 필터(320)의 통과 또는 반사 파장 대역은 조절될 수 있다.

변환부(400)는 다이크로익 필터(320)를 통과한 형광 광자를 증폭시켜 클럭 신호로 변환하는 모듈이다. 변환부(400)는 광검출기, 증폭기 및 디지타이저를 포함한다.

본 발명의 일 실시예에 따른 광검출기 및 증폭기는 광증폭관(PMT, Photo multiply tube), APD(Avalanche Photo Diode) 및/또는 LPF, 엠프를 포함할 수 있다.

광검출기는 수집된 형광 광자를 제1클럭 신호로 변환하고, 조사광원(110)을 동기화하여 제2클럭 신호로 변환한다. 제2클럭 신호는 조사광원(110)에 동기화된 클럭 신호에 기초하여 계산된 조사광원(110)이 샘플(S)을 통과하지 않은채 변환된 신호이다. 변환된 클럭 신호는 LPF로 전달된다.

LPF는 낮은 주파수를 통과시키는 필터로, 클럭 신호를 시간적으로 증폭시킨다. 본 발명의 일 실시예에 따른 LPF는 전자적 가우시안 저역 필터(GLPF, Gaussian low-pass filter)를 포함한다.

GLPF는 변환된 클럭 신호의 데이터 처리를 용이하게 할 수 있도록 높은 주파수 부분을 제거한다. GLPF는 대칭적이고, 링잉현상이 없도록 구현된다. GLPF는 디지타이저 대역폭에 대응될 수 있도록 클럭 신호의 대역폭을 감소시킨다.

디지타이저는 작을 펄스 폭을 갖는 조사 광을 참작하여, 신호 복원을 위해 고주파수 샘플링을 한다. 상세하게는, 클럭 신호들을 수집하고 이를 기초로 형광 수명을 계산하는 AMD 계측부의 일부로서 기능한다.

제1모듈(500)은 수집된 형광 광자의 형광 수명을 구하는 모듈이며, 신호 수집부와 AMD 계측부를 포함한다.

신호 수집부는 변환부(400)에서 변환된 제1클럭 신호와 조사광원(110)에 동기화된 제2클럭 신호를 수집한다.

본 발명의 일 실시예에 따른 신호 수집부는 전자 데이터 획득 보드(electronic data acquisition (DAQ) board)를 포함하며, DAQ 보드는 제1클럭 신호를 수집하는 제1채널과 제2클럭 신호를 수집하는 제2채널을 포함할 수 있다.

AMD 계측부는 제1클럭 신호의 평균 시간과 제2클럭 신호의 평균 시간의 차이를 이용하여 형광수명을 계산한다. 이러한 계산은 다음 수학식 1과 같다.

여기서,

는 측정된 시간적 형광 광자 신호이고,

는 측정 시스템의 임펄스 응답 함수(impulseresponse function, IRF)이다. <

>와 <

>는 각각 형광 광자 신호 및 IRF의 평균 지연으로 정의된다. AMD 방법을 이용해 형광 광자의 절대 형광수명을 추출하기 위해, 식(1)에서 시간함수

와

의 초기 시간 또는 t가 0인 지점은 정확하게 정의되어 완벽하게 일치되어야 한다. 실험에 있어서,

와

는 전자 데이터 획득 보드(electronic data acquisition (DAQ) board)에 의해 측정되고, 각 함수의 0 지점은 조사광원(110)으로부터의 트리거 신호에 의해 획득된다. AMD 계측부는 빠른 측정 속도와 높은 수명 정확도를 갖는다. 또한, 측정된 형광수명의 공간적 분포를 기반으로 이미지를 구성하므로, 샘플(S)의 관심 영역을 지정하는데 소요되는 시간을 대폭 감소시킬 수 있다.

제어부(600)는 제1모듈(500)로부터 샘플(S)의 형광 수명값을 수신하고, 대상이 분할된 각각의 영역에 해당하는 형광 수명값과 기준값을 대조하여 관심 영역 및 관심 영역에 포함된 형광 광자를 추출한다. 기준값은 미리 지정될 수 있고, 사용자에 의해 변경될 수 있다. 또한, 관심 영역은 적어도 하나 이상의 영역이 포함될 수 있다. 또한, 관심영역은 하나의 폐곡선에 의해 특정되는 하나의 영역일 수 있다. 반면, 형광 수명을 측정하는데 불필요한 부분을 제외한 나머지 부분이 관심영역이 될 수도 있다.

관심영역이 지정되고, 관심영역에 대응되는 형광 광자 정보가 제2모듈(700)에 전달되고, 제2모듈(700)은 관심영역에 대응되는 형광 광자에 대하여만 형광 수명을 측정한다. 여기서, 제2모듈(700)은 관심영역에 대응되는 형광 광자의 형광수명을 분석하는 모듈이며, TCSPC(Time correlated single photon counting) 계측부를 포함한다.

따라서 이후에 형광 수명이 측정될 때, 샘플(S) 전체 부분에 대하여 형광 수명이 측정되는 대신에 관심 영역에 대응되는 형광 광자에 대하여만 형광 수명이 측정된다. 이로써 형광 분석에 소요되는 시간을 단축시킬 수 있다.

상세하게는, TCSPC 계측부는 도수분포표를 작성하여 형광수명을 얻어내므로 단일 광자에 대하여 최소 100개 정도의 광자가 계측되어야 한다. 따라서 단일 형광 광자에 대하여 형광 수명을 최종적으로 결정하기 위한 시간은 10마이크로초 이상이 된다. 일반적으로 현미경 이미지는 보통 100만 픽셀 이상으로 구성되므로 한 장의 FLIM 이미지 전체를 획득하는데 걸리는 시간은 10초 이상이 된다.

더욱이, 3차원 이미지를 얻고자 하는 경우 더 많은 시간을 소모하게 된다. 예를 들어, 100장의 2차원 이미지를 획득하여 하나의 3차원 이미지를 얻고자 하는경우, 측정시간은 15분 이상이 되어 많은 시간이 소요된다.

반면, 본 발명의 일 실시예에 따른 TCSPC 계측부는 제어부(600)에서 지정한 관심영역에 대응되는 샘플(S)에 대하여만 계측하면 충분하므로 샘플(S) 전체에 대하여 3차원 이미지를 얻는데 필요한 시간보다 현저하게 감소된다.

한편, 제2모듈(700)의 형광 광자에 대한 형광 수명의 분석을 위해, 제어부(600)는 조사광을 조절할 수 있다. 예를 들어, 제어부(600)는 조사광 펄스 간의 시간 간격을 형광 광자의 형광 수명보다 길게 조절한다. 만약 조사광 펄스 간의 시간 간격이 형광수명과 비슷한 수준이 되면 시간상에서 인접한 두 형광 광자의 파형이 서로 중첩되어 정확한 값을 얻을 수 없게 된다. 따라서, 제어부(600)는 제2모듈(700)의 정확한 분석을 위하여 조사광의 펄스 주기를 형광수명 τ의 5배 이상으로 조절할 수 있으며, 조사광의 세기를 조절할 수도 있다.

TCSPC 계측부는 단일한 광자를 대상으로 수십 Mhz에 달하는 높은 광자 검출 속도를 통해 제1클럭 신호와 제2클럭 신호의 시간차 데이터를 산출하고, 시간차 데이터를 누적하여 형광수명을 계산한다. 단일 광자에 의한 응답 펄스의 모양이 시간축에서 얼마나 긴 폭을 지니는가와는 상관없이 단일 광자의 도착 시간은 정밀하게 측정될 수 있다. 단일 광자만이 감지된 경우, 측정된 단일 광자 응답의 상승 모서리(rising edge)의 도착 시간을 검출함으로써 단일 광자의 도착 시간을 잴 수 있다.

한편, 수많은 형광 광자가 수집된 경우 얻어지는 형광 파형은 지수함수적 감쇠 모양을 지닌 형광의 확률분포 함수와 동일해진다. 이 경우, 매우 짧은 펄스폭을 갖는 조사광의 조사가 t=0 시간에 이뤄질 때, 이에 따라 생성되는 형광 광자 밀도, I_F(t)의 계산은 다음 수학식 2와 같다

이때 I₀는 초기값이며, τ는 형광 수명을 의미하고, u(t) 함수는 t<0일때 0, t≥0일때 1인계단 함수를 나타낸다. 즉, 형광 수명은 형광 광자의 방출 확률이 초기값에 비해 1/e 만큼 감소하는 시간을 의미한다. 현미경 응용에서 활용되는 형광 물질의 형광 수명은 대부분 0.1에서 5ns 범위를 가진다.

지금까지 본 발명의 일 실시예에 따른 형광수명 측정장치(10)의 구성에 대해서 설명하였다. 이후에서, 본 발명의 일 실시예에 따른 형광수명 측정방법(20)에 대하여 설명한다. 형광수명 측정방법은 도1에 도시된 형광수명 측정장치(10)에서 처리되는 단계들로 구성된다. 따라서 상기에 서술한 내용과 중복되는 내용은 생략하며, 생략된 내용들은 본 발명의 일 실시예에 따른 형광수명 측정방법(20)에도 적용된다.

도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 형광수명 측정방법(20)의 흐름도이다.

도 2를 참조하면 21단계는, 형광수명 측정장치(10)로 조사광을 발생시켜 샘플(S)을 통과하지 않은 상태의 조사광에 대하여 제2클럭 신호의 평균 시간을 측정하는 제2클럭 신호 측정 단계이다.

22단계는 형광 분자를 포함하는 샘플(S)을 형광수명 측정장치(10)에 준비시키고, 샘플(S)에 조사할 조사광을 발생시키는 광발생 단계이다.

23단계는 조사광으로 샘플(S)을 조사하는 제1조사 단계이다. 이 때, 형광 광자 수집부를 통해 샘플(S)에서 생성되는 형광 광자를 검출한다. 또한, 수집된 형광 광자를 증폭시켜 제1클럭 신호로 변환한다.

24단계는 제1모듈(500)(AMD, Analog mean delay)을 통해 제1클럭 신호의 평균 시간과 제2클럭 신호의 평균 시간의 차이를 이용하여 형광수명을 계산하는 AMD 계측 단계이다. 이 경우, 간단한 계산을 통해 일정한 범위의 샘플(S)에 대하여 형광수명을 매우 짧은 시간에 측정할 수 있다.

25단계는 제어부(600)는 제1모듈(500)(AMD, Analog mean delay)의 결과값으로부터 샘플(S)의 관심영역(ROI, Range of interesting)을 지정하는 제어 단계이다. 일 예로, 관심영역의 지정은 제1모듈(500)의 결과값자체로부터 결정될 수 있다.

다른 예로, 관심영역의 지정은 사전에 저장된 기준값과 제1모듈(500)의 결과값의 비교를 통해 결정될 수 있다. 관심영역은 하나의 폐곡선에 의해 특정되는 하나의 영역일 수도 있고, 하나의 폐곡선을 제외한 나머지 부분일 수도 있다.

상술한 바와 같이, 지정되는 관심영역은 제2모듈(700)(TCSPC, Time correlated single photon counting)의 측정대상이 된다. 반면, 관심영역을 제외한 샘플(S)의 나머지 영역은 제2모듈(700)의 측정대상이 되지 않는다. 따라서, 관심영역을 제외한 샘플(S)의 나머지 영역의 측정시간만큼 소요되는 측정시간을 감소시킬 수 있다.

26단계는 제2모듈(700)((TCSPC, Time correlated single photon couting)을 통해 단일 광자를 수백에서 수천번 이상 계수한 다음 도수분포표를 작성하고, 관심영역에 대응되는 형광 광자의 형광 수명을 측정하는 TCSPC 계측 단계이다.

이후에서, 본 발명의 다른 실시예에 따른 형광수명 측정방법(30)에 대하여 설명한다. 본 발명의 다른 실시예에 따른 형광수명 측정방법(30) 또한 도1에 도시된 형광수명 측정장치(10)에서 처리되는 단계들로 구성된다. 따라서 상기에 서술한 내용과 중복되는 내용은 생략하며, 생략된 내용들은 본 발명의 다른 실시예에 따른 형광수명 측정방법(30)에도 적용된다.

도 3은 본 발명의 다른 실시예에 따른 형광수명 측정방법(30)의 흐름도이다.

도 3을 참조하면, 31단계는 형광수명 측정장치(10)로 조사광을 발생시켜 샘플(S)을 통과하지 않은 상태의 조사광에 대하여 제2클럭 신호의 평균 시간을 측정하는 제2클럭 신호 측정 단계이다.

32단계는 형광 분자를 포함하는 샘플(S)을 형광수명 측정장치(10)에 준비시키고, 샘플(S)에 조사할 조사광을 발생시키는 광발생 단계이다.

33단계는 조사광으로 샘플(S)을 조사하는 제1조사 단계이다. 이 때, 형광 광자 수집부를 통해 샘플(S)에서 생성되는 형광 광자를 수집한다. 또한, 수집된 형광 광자를 증폭시켜 제1클럭 신호로 변환한다.

34단계는 제1모듈(500)(AMD, Analog mean delay)을 통해 제1클럭 신호의 평균 시간과 제2클럭 신호의 평균 시간의 차이를 이용하여 형광수명을 계산하는 AMD 계측 단계이다. 이 경우, 간단한 계산을 통해 일정한 범위의 샘플(S)에 대하여 형광수명을 매우 짧은 시간에 측정할 수 있다.

35단계는 제어부(600)는 제1모듈(500)(AMD, Analog mean delay)의 결과값으로부터 샘플(S)의 관심영역(ROI, Range of interesting)을 지정하는 제어 단계이다. 일 예로, 관심영역의 지정은 제1모듈(500)의 결과값자체로부터 결정될 수 있다. 다른 예로, 관심영역의 지정은 사전에 저장된 기준값과 제1모듈(500)의 결과값의 비교를 통해 결정될 수 있다. 관심영역은 하나의 폐곡선에 의해 특정되는 하나의 영역일 수도 있고, 하나의 폐곡선을 제외한 나머지 부분일 수도 있다.

36단계는 제어부(600)는 조사광의 세기를 단일 광자 수준으로 낮추도록 조절하는 조절 단계이다. 이 경우 제2모듈(700)을 통해 형광수명을 측정하게 될 때, 펄스 하나당 하나의 광자를 측정하여 히스토그램을 그릴 수 있다.

37단계는 광 세기가 조절된 조사광을 관심영역에 재조사하는 제2조사 단계이다. 재조사된 샘플(S)로부터 형광 광자가 다시 발생되고, 발생된 형광 광자를 재수집한다.

38단계는 제2모듈(700)(TCSPC, Time correlated single photon couting)을 통해 재수집된 단일 광자를 수백에서 수천번 이상 계수한 다음 도수분포표를 작성하고, 관심영역에 대응되는 형광 광자의 형광 수명을 측정하는 TCSPC 계측 단계이다.

10: 형광수명 측정장치 20: 형광수명 측정방법
100: 조사광 발생부 200: 공초점 스캐너
300: 형광 광자 검출부 400: 변환부
500: 제1모듈 600: 제어부
700: 제2모듈

Claims

조사광을 발생시키는 조사광 발생부;
상기 조사광으로 형광 분자를 포함하는 샘플을 조사하여 생성되는 형광 광자를 수집하는 형광 광자 검출부;
상기 수집된 형광 광자를 제1클럭 신호, 상기 샘플을 통하지 않은 조사광을 제2클럭 신호로 변환하는 변환부;
상기 변환부로부터 수집된 형광 광자의 형광수명을 분석하는 제1모듈;
제1모듈로부터 형광 수명값을 수신하고 대상이 분할된 각각의 영역에 해당하는 형광 수명값과 기준값을 대조하여 관심 영역 및 관심 영역에 포함된 형광 광자를 추출하여 샘플의 관심영역(ROI, Range of interesting)을 지정하며, 조사광 펄스 간의 시간 간격을 형광 광자의 형광 수명보다 적어도 5배 길게 조절하는 제어부; 및
상기 관심영역에 대응되는 형광 광자의 형광수명을 분석하는 제2모듈을 포함하고,
상기 제1모듈은 상기 제1클럭 신호의 평균 시간과 제2클럭 신호의 평균 시간의 차이를 이용하여 형광수명을 계산하는 AMD(Analog mean delay) 계측부를 포함하고,
상기 제2모듈은 단일 형광 광자를 대상으로 광자 검출 속도를 통해 제1클럭 신호와 제2클럭 신호의 시간차 데이터를 산출하고, 시간차 데이터를 누적하여 형광수명을 계산하는 TCSPC(Time-correlated single photon counting) 계측부를 포함하는 형광수명 측정장치.
삭제
삭제
조사광을 발생시키는 광발생 단계;
상기 조사광을 샘플에 조사하여 생성되는 형광 광자를 수집하는 제1조사 단계;
상기 형광 광자 검출부로부터 수집된 형광 광자의 형광 수명을 계산하는 AMD(Analog mean delay) 계측 단계;
형광 수명값을 수신하고 대상이 분할된 각각의 영역에 해당하는 형광 수명값과 기준값을 대조하여 관심 영역 및 관심 영역에 포함된 형광 광자를 추출하여 샘플의 관심영역(ROI, Range of interesting)을 지정하며, 조사광 펄스 간의 시간 간격을 형광 광자의 형광 수명보다 적어도 5배 길게 조절하는 제어 단계; 및
상기 관심영역에 대응되는 형광 광자의 형광 수명을 계산하되, 단일한 광자를 대상으로 광자 검출 속도를 통해 제1클럭 신호와 제2클럭 신호의 시간차 데이터를 산출하고, 시간차 데이터를 누적하여 형광수명을 계산하는 TCSPC(Time correlated single photon counting) 계측 단계를 포함하는 형광수명 측정방법.
제 4 항에 있어서,
상기 제어 단계 다음,
상기 조사광의 세기를 단일 광자 수준으로 낮추는 조절 단계; 및
상기 조절된 조사광을 상기 관심영역에 재조사하여 생성되는 형광 광자를 재수집하는 제2조사 단계를 더 포함하고,
상기 TCSPC 계측 단계는, 상기 제2조사 단계로부터 검출된 형광 광자의 형광수명을 계산하는 형광수명 측정방법.