KR101813200B1 - 솔잎이 첨가된 고함량 s-아릴시스테인을 함유하는 흑마늘 타블렛의 제조방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 솔잎이 첨가된 고함량 S-아릴시스테인을 함유하는 흑마늘 타블렛의 제조방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 혈관 노화 억제 및 혈행 개선 효과를 가지는 솔잎 분말과 고함량 S-아릴시스테인이 함유된 흑마늘 분말의 최적배합비에 의해 선정된 흑마늘 타블렛을 통해 소비자의 섭취 용이도와 구매선호도를 높일 수 있는 솔잎이 첨가된 고함량 S-아릴시스테인을 함유하는 흑마늘 타블렛의 제조방법에 대한 것이다.

Description

솔잎이 첨가된 고함량 S-아릴시스테인을 함유하는 흑마늘 타블렛의 제조방법{MANUFACTURING METHOD OF BLACK GARLIC TABLET COMPRISING HIGH-CONTENT S-allylcysteine INCLUDING PINE NEEDLE}

본 발명은 솔잎이 첨가된 고함량 S-아릴시스테인을 함유하는 흑마늘 타블렛의 제조방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 혈관 노화 억제 및 혈행 개선 효과를 가지는 솔잎 분말과 고함량 S-아릴시스테인이 함유된 흑마늘 분말의 최적배합비에 의해 선정된 흑마늘 타블렛을 통해 소비자의 섭취 용이도와 구매선호도를 높일 수 있는 솔잎이 첨가된 고함량 S-아릴시스테인을 함유하는 흑마늘 타블렛의 제조방법에 대한 것이다.

현대의학과 문명과 생활수준의 향상 등으로 인간의 평균수명이 비약적으로 늘어났지만, 반면에 대기, 수질 등 환경오염과 다양한 스트레스, 과영양화 또는 영양편중으로 인해 야기되는 인체 내외의 많은 요인들은 건강을 위협하는 요소가 되고 있다. 우리나라는 사람들의 식사패턴이 식물성 식품 및 당질 위주에서 육류 및 가공식품 등 지방함량이 높은 식품의 섭취증가로 변화됨에 따라 질병 발생 양상도 다양해졌으며, 특히 고지혈증과 같은 심혈관계 질환은 건강상의 심각한 사회 문제로 대두되었고, 2008년 국민건강영양조사 결과 비만, 당뇨병, 고콜레스테롤혈증, 고중성지방혈증 등 만성질환의 유병률이 계속적으로 증가하고 있는 것으로 나타났으며, 이러한 만성질환의 증가는 통계적으로 삶의 질을 떨어뜨린다고 보고되었다.

특히, 동맥경화, 뇌졸중 등 혈행 장애로 발생하는 심혈관계 질환은 미국, 유럽, 아시아 등 전 세계적으로 주요한 사망 원인이 되고 있으며, 우리나라에서도 통계청에서 발표한 2012년 사망원인 조사 결과 1위가 암, 2위가 심혈관질환, 3위가 뇌혈관질환으로 보고되어 혈관계질환으로 사망하는 건수는 1위인 암과 동일한 것으로 나타났다.

이는 최근 급속한 경제성장과 가족형태의 변화 등으로 현대인들의 식습관 및 생활방식의 변화와 지방 및 가공식품의 섭취량 등이 증가하게 됨으로써 혈관계질환의 위험인자로 알려진 고콜레스테롤증, 고혈압, 당뇨병, 대사증후군의 유병율이 높아지고 결국 혈행 장애로 인한 혈관계질환의 발병율을 더 증가하는 경향을 보이고 있어 혈행 개선을 위한 건강기능성 식품 개발 요구가 시급하다.

또한, 기능성 식품의 범위는 유해물질의 중화, 해독 배설, 혈압, 혈당 및 콜레스테롤 저하, 비만예방, 다이어트 효과를 가지는 식품에서 더 나아가 생체방어, 면역, 질병의 예방 및 치료, 회복, 노화억제 등의 생체조절 역할까지로 점차 확대되고 있다.

노화와 함께 초래되는 생체의 가장 큰 변화 중 하나는 혈관이 굳어지고, 혈류의 장해를 초래하는 것인데, 혈관의 노화는 내피세포의 손상과 함께 시작되며, 내피세포가 손상되면 혈액 중 콜레스테롤이 함유한 LDL이 산화되어 대식세포(macrophage)에 식균되어 거품세포(foam cell)를 형성하고, 이들이 혈관 내피세포 하층에 축적되면 죽종이 형성되고, 나아가 지방반으로 굳어짐. 이어서 칼슘의 축적에 의해 석회화가 진행되어 동맥경화가 초래된다.

또한, 내피세포는 NO와 PGI2를 유리하여 혈관확장과 혈소판 응집을 억제하는데, 내피세포가 손상되면 혈관수축과 혈소판 응집을 초래하게 된다. 즉, 고지혈증에 의한 동맥경화, 혈소판 응집에 의한 혈전증, 혈관수축의 3가지 요인에 의해 혈류가 장해되면 각 조직에 저산소증이 초래된다.

정상 혈관에서는 지혈 기전의 활성화 반응과 함께 억제반응이 균형을 이룸으로써 항상성을 유지하고 있으나, 혈관이 손상을 받거나 고지방 식이 섭취, 운동 부족 등은 혈액응고 과정을 활성화시켜 혈관 내에 비정상적으로 혈액이 응고되는 현상인 혈전증(thrombosis)을 초래하기도 한다.

혈전은 혈관 벽에 붙어 굳어져서 혈류의 흐름을 원활하지 못하게 하며, 혈전이 혈류를 따라 이동하다가 심장이나 폐, 뇌의 혈관을 막게 되면 심근경색이나 폐색전증, 뇌졸중 등 여러 가지 형태의 혈관계질환을 일으키는 원인이 된다.

이러한 질환을 치료하기 위하여 항응고제, 아스피린 등의 항혈소판제를 장기복용 하도록 처방하고 있으나 이들 약제는 출혈의 부작용과 위장장애 등의 문제점을 가지고 있다.

혈관계 질환을 일으키는 주요 원인이 되는 혈전의 형성은 생활습관병으로 알려진 고지혈증, 비만, 고혈압, 당뇨병, 흡연 등에 의해 혈관내막이 손상되는 것부터 시작되므로 식생활 및 환경적 요인과 매우 밀접한 관련이 있다고 볼 수 있어, 혈행장애 질환이 발생하여 약물을 통한 치료가 이루어지기 전에 건강기능식품의 섭취를 통한 혈행 개선은 만성 성인병 예방에 매우 중요하다.

침엽수의 대표적인 소나무(Pinus densiflora sieb, et zucc)는 소나무과(Pinaceae)에 속하는 상록 교목으로 전국의 산지에 자생하며, 예로부터 잎, 솔방울, 꽃가루, 송진, 껍질 등 모든 부위가 구황식물로 이용되어왔다.

특히, 쉽게 채취할 수 있는 솔잎은 방부, 살균, 및 향기를 돋우는 효과뿐만 아니라 약리적 효능이 있어 장수와 건강을 위해 식용되어 왔으며, 한방 또는 민간요법에서 동맥경화증, 고혈압, 당뇨병, 신경통, 관절염 등의 노화 관련 질환예방에 효과적인 약용식물로 이용되었다.

솔잎의 유효성분은 chlorophyll, carotene, 식이섬유소, terpenoids, phenolic compounds, tannin 및 alkaloids 화합물이 알려져 있다.

솔잎은 항균, 항암, 혈압 강하, 호르몬 분비촉진, 항산화 그리고 심혈관계질환 예방 등과 같은 독특한 약리작용 효과가 있어, 아로마테라피(aromatheraphy)에 사용되기도 하고, 필수아미노산 8종을 포함해 단백질 구성 아미노산 16종을 풍부하게 함유하고 있기 때문에 신체의 성장, 활력 증강에 효과가 크며 혈액의 흐름을 좋게 하고 호르몬 분비를 왕성하게 하는 특성을 가지고 있어 노화방지와 고지혈증 및 콜레스테롤 저하에 뛰어난 효과를 나타낸다.

마늘(Allium sativum L)은 백합과(Lilliaceae)파속(Allium)에 속하는 비늘줄기채소이며, 식품의 맛과 건강을 증진시키는 대표적인 식품으로써 1985년부터 1998년까지 재배면적 및 생산량이 꾸준히 증가하여 1998년에는 생산액 약 1조원으로써, 소득으로 볼 때 쌀 다음의 주요 작물로서의 위치를 점유하고 있다.

마늘은 특유의 냄새와 독특한 맛으로 인하여 예로부터 향신료와 민간약으로 널리 사용되어 왔으며 콜레스테롤 저하, 혈소판응집 억제, 혈압강화, 항산화제 등의 효과가 있는 것으로 알려져 고혈압, 동맥경화증, 뇌졸중, 혈중지질 및 콜레스테롤 저하효과, 항혈전의 예방과 치료, 면역질환, 뇌의 노화, 관절염, 백내장과 같은 만성질환의 예방과 지연 및 정력과 순환계 개선을 목적으로 이용되고 있다.

마늘의 유효성분인 allicin은 마늘 특유의 휘발성 향기성분으로 마늘조직이 파괴될 때 allinase에 의하여 생성되며, glycominal이라는 배당체가 가수분해 되어 특유한 냄새를 가진 정유성분인 diallyl sulfide를 생성하고, 그 외 disulfide, dithiin, ajoene 등의 휘발성 성분과 S-allylcysteine(SAC), S-allylmercaptocysteine 등의 수용성 유황화합물로 분해된다.

대부분의 생리활성을 나타내는 주요 성분은 마늘이 함유하고 있는 유기황화합물이며, 마늘의 황화합물 함량은 1.1-3.5%로서 양파나 브로콜리의 약 4배에 이르며, 마늘 효과에 대한 연구의 약 90%가 황화합물을 중심으로 이루어지고 있다.

다수의 연구에서 생마늘이나 생마늘 추출액에서는 콜레스테롤, 중성지질, 혈중 LDL이 감소하며, HDL이 증가하는 등의 고지혈증 억제 효과와 혈소판 응고 억제 효과를 통해 혈행개선 효과가 있음을 보고하였으며, 최근에는 마늘의 정유(garlic oil)중에 함유되어 있는 diallyl, oligosulfide류가 Helicobacter pylori의 생육을 저해시키는 작용이 있다고 보고되었으며 이러한 diallyl disulfide 류는 황의 수가 증가함에 따라 기능성이 향상됨이 보고되었다.

마늘은 2015년 1월에 식품의약품안전처 개정안에 고시형 원료로 인정되어 ‘혈중 콜레스테롤 개선에 도움을 줄 수 있음기능성을 가짐으로서 마늘을 이용한 건강기능식품의 적극적인 시장 공략이 가능함에 따라 마늘 소재 건강기능식품시장의 급격한 증가가 예상된다.

전통적으로 마늘 섭취를 용이하게 하는 방법으로 굽거나 찌는 조리법을 활용하여 자극적인 냄새를 제거하는 방법이 이용되어 왔으며, 통마늘을 고온의 저장 상태에서 적절한 습도를 유지하면서 일정시간 숙성시킨 경우 마늘의 자체 성분과 효소 등에 의해 갈변반응을 일으켜 마늘 내부까지 진한 흑갈색을 띄며, 단맛이 증가하고 매운맛이 감소되는 반면 향과 점도가 높아져 씹힘성을 변화시킨 것을 “흑마늘” 이라고 부른다. 흑마늘은 마늘의 당 성분과 아미노산이 비효소적 갈변반응을 일으켜 melanoidins이 생성되고 휘발성 물질은 거의 소실되며 총 phenol, 플라보노이드가 증가하고 수용성 성분인 S-allylcysteine(SAC), S-ally melcaptocytein (SAMC) 등이 생성되어 생마늘보다 항산화, 항암, 콜레스테롤 저하, 암세포 성장 억제, 심장질환의 예방 효과가 높은 것으로 알려졌으며, 흑마늘의 대표적인 수용성 유황화합물인 SAC는 항산화, 암세포 증식억제, 인지기능향상, 간보호 등의 기능성이 보고되었다.

그러나, 마늘은 국내에서는 주로 생마늘 형태로 소비되고 있으며 가공품목이 단순하고 가공율 또한 매우 낮은 실정이며, 또한 농산물 시장 개방에 따라 중국한 마늘 수입량 증가 및 생산과 소비량 불균형 등으로 국내 마늘 생산 농가에 경제적 손실이 야기되었다. 또한, 마늘을 식자재 원료로 이용하거나 단순 가공(건조 분말 등)하여 복용할 때 마늘 특유의 냄새, 자극적인 맛과 강한 향으로 섭취에 어려움이 발생하였다. 그러나 흑마늘은 대부분 마늘 고유의 형태를 유지한 통마늘 또는 깐마늘 형태로 먹을 수 있게 제품화된 것으로, 이러한 흑마늘은 장기간의 보존과 유통이 용이치 않을 뿐만 아니라 마늘 고유의 형태를 그대로 가지고 있어 취식성과 기호성이 낮아 상품판매는 미흡한 실정이다.

원료 안전성 확보에 있어 미생물에 대한 오염 가능성과 원료의 흡습으로 인한 성상 변질 발생이 높아 제조과정 및 유통안전성에 문제가 발생할 수 있으므로 고함량 SAC 제조, 자극적인 향 제거 및 원료의 성상 변화가 없는 분말 제조 공정을 확립하고자 하였다.

제형별 시장구조를 분석한 결과 2010년에 액상/음료형태 39.0%, 알약형 57.7%, 2012년에 액상/음료형태 41.5%, 알약형 59.9%로 알약형의 건강기능식품 구매가 가장 높은 것으로 나타나 소비자의 섭취 용이도와 구매선호도를 높일 수 있는 알약형으로 제조하고자 한다.

한국등록특허 제10-0794383호에는 마늘로부터 생리활성 성분을 포함하는 유효성분을 추출하여 이를 주성분으로 하고, 팽이버섯, 구연산, 자일리톨, 함수포도당, 스테아린산 마그네슘, 옥타코사놀 그리고 비타민 C를 첨가하여 다양한 영양소를 함유한 마늘 타블렛 및 그 제조방법이 개시되어 있다.

또한, 한국등록특허 제10-1394527호에는 분말 또는 과립형태의 당류 씨드(seed)에, 흑마늘 추출액을 포함하는 조성물을 코팅한 이후 유자 추출액을 더 코팅한 유자미립분말 및 제조방법, 이를 포함하는 과립형 유자차 그리고 타블렛에 관한 기술이 개시되어 있다.

그러나, 상기 종래기술의 경우, 타블렛의 제형으로 소비자의 섭취 용이도를 높였다는 장점은 있으나, 솔잎과 흑마늘이 가지고 있는 항산화, 항노화, 혈관 노화 억제 및 형행 개선 효능 등이 제대로 발현되지 않아 합성 의약품에 비해 그 효과가 미비한 문제점을 가지고 있었다.

본 발명의 목적은 소비자의 섭취 용이도와 구매선호도를 높이며, 혈관 노화 억제 및 혈행 개선 효능이 우수하여 기능성이 좋은 솔잎분말과 S-아릴시스테인의 함유량이 높은 흑마늘 분말의 최적배합비에 의해 선정된 흑마늘 타블렛의 제조방법을 제공하는 것에 있다. 따라서 본 발명의 목적은 인체에 필요한 성분을 함유하고 있는 흑마늘을 쉽게 섭취하기 위하여 솔잎, 결정셀룰로오스, 칼슘32%이상인 해조칼슘분말P, 칼슘25%이상인 유청칼슘, 카르복시메틸셀룰로오스칼슘, 스테아린산마그네슘, HPMC 그리고 글리세린지방산에스테르혼합제의 재료를 원료로 사용한 건강기능식품으로 영양, 저장안정성 및 기호도가 향상될 뿐 아니라 휴대하기 쉬운 솔잎이 첨가된 고함량 S-아릴시스테인을 함유하는 흑마늘 타블렛의 제조방법을 제공하는데에 있다.

본 발명의 한 양태에 따르면, 본 발명은 마늘의 뿌리부분을 제거하고 발효숙성시키는 단계(제1단계); 발효숙성시켜 얻은 흑마늘을 수분을 제거하는 단계(제2단계); 수분이 제거된 흑마늘을 절단하여 1차 호화 및 건조하는 단계(제3단계); 1차 호화 및 건조된 흑마늘을 분쇄하여 2차 호화 및 건조하는 단계(제4단계); 2차 호화 및 건조된 흑마늘을 분쇄하고 건조하여 흑마늘 분말을 제조하는 단계(제5단계); 상기 흑마늘 분말에 솔잎분말을 함께 넣어 혼합하는 단계(제6단계); 및 상기 혼합물을 건조시킨 가압성형하여 타정하는 단계(제7단계);를 포함하는 솔잎이 첨가된 고함량 S-아릴시스테인을 함유하는 흑마늘 타블렛의 제조방법을 제공한다.

본 발명의 솔잎이 첨가된 고함량 S-아릴시스테인을 함유하는 흑마늘 타블렛의 제조방법에 있어서, 상기 흑마늘은 편백나무함에 쑥과 함께 넣어 가열 숙성기에서 595 내지 605시간 동안 숙성시키는 것이 바람직하다.

본 발명의 솔잎이 첨가된 고함량 S-아릴시스테인을 함유하는 흑마늘 타블렛의 제조방법에 있어서, 상기 숙성은 고온 열풍 처리와 저온 열풍 처리로 2차례 발효숙성을 포함하는 것이 바람직하다.

본 발명의 솔잎이 첨가된 고함량 S-아릴시스테인을 함유하는 흑마늘 타블렛의 제조방법에 있어서, 상기 1차 호화 및 건조는 75 내지 85℃에서 1.5 내지 2.5시간 동안 이루어지는 것이 바람직하다.

본 발명의 솔잎이 첨가된 고함량 S-아릴시스테인을 함유하는 흑마늘 타블렛의 제조방법에 있어서, 상기 2차 호화 및 건조는 75 내지 85℃에서 1.5 내지 2.5시간 동안 이루어지는 것이 바람직하다.

본 발명의 솔잎이 첨가된 고함량 S-아릴시스테인을 함유하는 흑마늘 타블렛의 제조방법에 있어서, 상기 흑마늘 분말은 분말 입자의 크기가 16 내지 18메쉬(mesh)가 되도록 이루어지는 것이 바람직하다.

본 발명의 솔잎이 첨가된 고함량 S-아릴시스테인을 함유하는 흑마늘 타블렛의 제조방법에 있어서, 상기 혼합물은 흑마늘 분말 50 내지 53 중량% 및 솔잎 분말 18 내지 21 중량%의 비율로 혼합하는 것이 바람직하다.

본 발명의 솔잎이 첨가된 고함량 S-아릴시스테인을 함유하는 흑마늘 타블렛의 제조방법에 있어서, 상기 혼합물의 양은 전체 타블렛 중량의 68 내지 74 중량%이 되도록 이루어지는 것이 바람직하다.

본 발명의 솔잎이 첨가된 고함량 S-아릴시스테인을 함유하는 흑마늘 타블렛의 제조방법에 있어서, 상기 가압성형은 100 내지 300 kg/cm2의 압력으로 60초 내지 120초 동안 이루어지는 것이 바람직하다.

본 발명의 솔잎이 첨가된 고함량 S-아릴시스테인을 함유하는 흑마늘 타블렛의 제조방법에 있어서, 상기 흑마늘 타블렛은 결정셀룰로오스(M101) 16.7중량%, 칼슘32%이상인 해조칼슘분말P(아쿠아칼^® 사용가능) 5중량%, 칼슘25%이상인 유청칼슘(또는 밀크칼슘이라고도 함) 3중량%, 카르복시메틸셀룰로오스칼슘 2중량%, 스테아린산마그네슘 1중량%, HPMC 0.8중량% 및 글리세린지방산에스테르혼합제(미바셋^®-액상 사용가능) 0.1중량%가 포함된 솔잎이 첨가된 고함량 S-아릴시스테인을 더 포함하는 것이 바람직하다.

이하, 본 발명의 솔잎이 첨가된 고함량 S-아릴시스테인을 함유하는 흑마늘 타블렛의 제조방법을 제공한다.

상기 마늘은 남해에서 생산된 1등품을 선별하여 꼭지부분은 위로 1내지2cm 가량 남긴 상태로 뿌리부분을 제거하는 것이 바람직하다.

상기 고온 열풍 처리는 가열 숙성기에서 온도 50 내지 95℃, 습도 35 내지 85%를 유지하며, 120 내지 288시간동안 낮은 온도 및 습도, 높은 온도 및 습도를 오르락내리락하면서 열풍처리를 진행하는 것이 바람직하다. 이때에 온도의 변화는 마늘의 성분 및 품질에 영행을 미치게 되므로 주의햇 생산하는 것이 필요하게 되며, 적절한 온도는 82 내지 88℃가 가장 바람직한 온도이다. 고온 열풍 처리는 생마늘을 섭취할 경우의 속쓰림이나 마늘 고유의 쓴 냄새를 줄이거나 혹은 제거하는데 있어서 매우 중요한 요소로 작용하는 만큼 시간대별 적절한 온도관리가 중요하게 된다. 이렇게 고온 열풍 처리된 마늘의 경우 여러 가지 유기황화합물을 지니게되어 항산화활성을 나타내게 되며 미백색의 생마늘 고유의 색상이 홍갈색으로 변화하게 된다.

상기 저온 열풍 처리는 가열 숙성기에서 온도 30 내지 49℃에서 36 내지 90시간 동안 진행하는 것으로 마늘의 알리신 등 고유의 유효성분이 유기황화합물로 변화되도록 하며, 마늘의 색상이 홍갈색에서 흑갈색으로 변화되면서 이를 섭취할 경우 마늘의 당도가 나타나게 된다.

상기 고온 열풍 처리와 저온 열풍 처리 과정에서 가장 주의해야 할 부분은 시간대별 적절한 온도관리인데, 이 경우 자동온도조절장치의 시간대별 온도관리를 컴퓨터 프로그램화하여 입력 관리하는 것이 바람직하다.

본 발명에서는 발효숙성시켜 얻은 흑마늘을 계량한 후 1차 건조를 통해 최대한 수분을 제거하고 그 결과물을 5 내지 7mm 크기로 절단한 후 78 내지 82 ℃에서 1.5 내지 2.5시간 동안 1차 호화과정을 거친 다음 58 내지 62 ℃ 이하의 온도에서 건조과정을 거치는 것이 바람직하다. 이 과정을 통해 흑마늘이 가지고 있는 전분 및 탄수화물이 단순당으로 전환되어 총 당량은 증가하고 접착성과 인습성을 제거할 수 있다. 건조된 결과물을 2 내지 4mm 크기로 절단 후 2차 호화과정 및 건조과정을 거친 후, 흑마늘 분말을 0.8 내지 1.2 mm 크기로 분쇄한 다음 수분함량이 2.8 내지 3.2 % 이내가 되도록 건조하는 것이 바람직하다.

흑마늘 분말을 생산하는 과정은 단순당을 다량 함유하고 있는 흑마늘의 경우, 단순하게 동결건조만으로는 피막현상으로 인해 내부 수분이 외부로 빠져나오지 못하는 문제점 때문에 분말이 되지 않음을 확인할 수 있었다. 이를 바탕으로 고온과 저온에서 호화과정을 거친 분말 형태를 획득할 수 있었으나, 고온의 경우 건조과정에서 SAC가 모두 파괴되어 분석이 되지 않았다. 따라서, 흑마늘 분마을 만드는 최적의 과정은 50 내지 60℃에서 호화과정을 통해 전분을 포도당으로 전환시키는 것으로 이 과정을 통해 점착성과 인습성을 제거한 흑마늘 분말을 획득하는 것이 바람직하다.

식품공업에서 타블렛이라 함은 보통 내용물 그대로 또는 부형제, 결합제, 붕해제, 활택제 등을 첨가하여 과립으로 제조하고 이것을 압축기를 이용하여 성형하는 것이며, 용량이 정확하고 휴대, 보관이 편리하고 대량생산에 적합하다. 결합제로서 절라틴, 아라비아검 등의 고분자물질을 첨가함으로 구성성분의 종류와 양에 따라서도 붕해성에 차이가 있으나 성형압력 및 시간에 따라서도 상당한 차이가 있는 것으로 알려져 있다. 과립화하면 유동성과 압축비가 향상되므로 분말을 과립화시킨 다음 타블렛화 공정을 거치는 경우가 많다. 타블렛을 만드는 방법으로 첫째, 원료에 부형제를 넣고 습식과립, 건식과립 등을 만들어 타정하는 것과 둘째, 과립 만드는 과정 없이 직타법으로 바로 타정하는 것이 있다.

본 발명에 따르면, 혈관 노화 억제 및 혈행 개선 효능이 우수하여 기능성이 좋은 솔잎분말과 S-아릴시스테인의 함유량이 높은 흑마늘 분말의 최적배합비에 의해 선정된 흑마늘 타블렛을 제조하여 소비자의 섭취 용이도와 구매선호도를 높이고 휴대하기 쉬운 솔잎이 첨가된 고함량 S-아릴시스테인을 함유하는 흑마늘 타블렛의 제조방법을 제공할 수 있다.

도 1은 본 발명에 따른 흑마늘 분말의 S-아릴시스테인 함량을 나타낸 그래프이다.
도 2은 본 발명에 따른 고?t량 S-아릴시스테인 함유 흑마늘의 DPPH 라디칼 소거능을 나타낸 그래프이다.
도 3은 본 발명에 따른 고함량 S-아릴시스테인 함유 흑마늘의 TRAP 활성을 나타낸 그래프이다.
도 4는 본 발명에 따른 고함량 S-아릴시스테인함유 흑마늘의 ORAC 활성을 나타낸 그래프이다.
도 5는 본 발명에 따른 고함량 S-아릴시스테인 함유 흑마늘의 세포내 ROS 소거능을 나타낸 그래프이다.
도 6은 본 발명에 따른 고함량 S-아릴시스테인 함유 흑마늘의 항유전독성능을 나타낸 그래프이다.
도 7 및 도 8은 본 발명에 따른 3Te-L1 노화 세포에서 고함량 S-아릴시스테인 함유 흑마늘 처리에 의한 항노화유전자 sirtuin 1, 6의 유전자 발현을 나타낸 그래프이다.
도 9는 본 발명에 따른 고함량 S-아릴시스테인 함유 흑마늘의 NO 생성능을 나타낸 그래프이다.
도 10은 본 발명에 따른 고함량 S-아릴시스테인 함유 흑마늘의 ACE 저해능을 나타낸 그래프이다.
도 11은 본 발명에 따른 고함량 S-아릴시스테인 함유 흑마늘의 혈소판 응고능을 나타낸 그래프이다.
도 12 및 도 13은 본 발명에 따른 고함량 S-아릴시스테인 흑마늘 분말과 솔잎 분말의 혼합 조건에 따른 총폴리페놀 함량과 ORAC 활성의 반응표면 곡선을 나타낸 그래프이다.
도 14 및 도 15는 마늘분말(G), 고함량 S-아릴시스테인 흑마늘 분말(AG), 고함량 S-아릴시스테인 흑마늘과 솔잎 혼합 분말(AG+P)의 총폴리페놀과 총플라보노이드 함량을 나타낸 그래프이다.
도 16 및 도 17은 마늘분말(G), 고함량 S-아릴시스테인 흑마늘 분말(AG), 고함량 S-아릴시스테인 흑마늘과 솔잎 혼합 분말(AG+P)의 DPPH 라디칼 소거능과 DPPH IC₅₀을 나타낸 그래프이다.
도 18은 마늘분말(G), 고함량 S-아릴시스테인 흑마늘 분말(AG), 고함량 S-아릴시스테인 흑마늘과 솔잎 혼합 분말(AG+P)의 TRAP 활성을 나타낸 그래프이다.
도 19는 마늘분말(G), 고함량 S-아릴시스테인 흑마늘 분말(AG), 고함량 S-아릴시스테인 흑마늘과 솔잎 혼합 분말(AG+P)의 ORAC 활성을 나타낸 그래프이다.
도 20은 마늘분말(G), 고함량 S-아릴시스테인 흑마늘 분말(AG), 고함량 S-아릴시스테인 흑마늘과 솔잎 혼합 분말(AG+P)의 세포내 ROS 소거능을 나타낸 그래프이다.
도 21은 마늘분말(G), 고함량 S-아릴시스테인 흑마늘 분말(AG), 고함량 S-아릴시스테인 흑마늘과 솔잎 혼합 분말(AG+P)의 항유전독성능을 나타낸 그래프이다.
도 22 및 도 23은 마늘분말(G), 고함량 S-아릴시스테인 흑마늘 분말(AG), 고함량 S-아릴시스테인 흑마늘과 솔잎 혼합 분말(AG+P)의 항노화유전자 sirtuin 1과 6의 발현을 나타낸 그래프이다.
도 24는 마늘분말(G), 고함량 S-아릴시스테인 흑마늘 분말(AG), 고함량 S-아릴시스테인 흑마늘과 솔잎 혼합 분말(AG+P)의 NO 생성능을 나타낸 그래프이다.
도 25는 마늘분말(G), 고함량 S-아릴시스테인 흑마늘 분말(AG), 고함량 S-아릴시스테인 흑마늘과 솔잎 혼합 분말(AG+P)의 ACE 저해능을 나타낸 그래프이다.
도 26은 마늘분말(G), 고함량 S-아릴시스테인 흑마늘 분말(AG), 고함량 S-아릴시스테인 흑마늘과 솔잎 혼합 분말(AG+P)의 혈소판 응고능을 나타낸 그래프이다.
도 27은 콜레스테롤 유발 동물 모델의 혈소판 응집능에 고함량 S-아릴시스테인 흑마늘과 솔잎 혼합 분말이 미치는 영향을 나타낸 그래프이다.
도 28은 본 발명에 따라 제조된 솔잎이 첨가된 고함량 S-아릴시스테인을 함유하는 흑마늘 타블렛을 나타낸 사진이다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하기로 한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 예시하기 위한 것이므로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는다.

실시예1. S-아릴시스테인 함량 분석

고함량 S-아릴시스테인 함유 흑마늘 분말 제조를 위해 사용한 조건 3가지를 통해 얻어진 분말을 이용하여 분석에 이용하였다. 시료 건조조건은 진액을 이용해 덱스트린과 함께 건조한 분말(Case 1), 고온 열풍건조한 분말(Case 2) 그리고 호화과정을 거친 건조분말(Case 3)이고, 완성된 시료를 채취하여 증류수 100 mL에 30 g의 흑마늘을 침지시켜 1시간 동안 초음파 추출하였으며, 이 과정을 3회에 걸쳐 여과하여 분석에 이용하였다.

S-아릴시스테인 함량 분석을 위한 HPLC 조건

분석조건
칼럼	GL Sciences Inc. C18 Interstil ODS-2 5 mm, 150 mm * 4.6 mm
이동상	5% B solvent A - 0.1% Trifluoroacetic acid in water B - Acetonitrile
온도	38℃
검출량 계산	SAC 함량 (mg/kg) = C * V/S C : 검량선에서 구한 SAC의 농도 (μg/mL) V : 시험용액의 최종부피 (mL), S : 시료 채취량 (g)

실험예1. S-아릴시스테인 함량 분석 결과

고함량 S-아릴시스테인 함유 흑마늘 분말을 제조하기 위하여 시행항 제조공정들을 통해 얻어진 분말을 이용하여 S-아릴시스테인 함량을 분석하였다(도 1 참조). Case 1은 60 brix 고농축 흑마늘 진액을 10% 덱스트린과 혼합한 후 열풍건조하고, case 2는 90 ℃에서 12시간 건조하였다. 마지막으로 case 3은 호화과정에 의해 만들어진 분말의 SAC 함량 결과이다. 그 결과, 고온에서 장시간 건조한 분말의 경우 SAC 함량이 없는 것으로 나타났으며, 농축액을 이용한 시료의 경우 SAC를 함유하고 있으나 그 수준이 0.8 mg/g으로 case 3의 5.5 mg/g에 비해 1/7 수준인 것으로 나타났다. 따라서 본 연구의 결과, 고함량 S-아릴시스테인 함유 분말을 생산하기에는 Case 3가 적합한 것으로 판단되었다.

실시예2. 고함량 S-아릴시스테인 함유 흑마늘 추출물 제조

분말화한 고함량 S-아릴시스테인 흑마늘 5 g에 100mL의 에탄올을 첨가하여 실온에서 72시간 추출한 후 추출물은 여과지(Whatman No. 1)로 감압여과한 후, 회전진공농축기(EYELA N-1000, Tokyo Rikakikai Co., Tokyo, Japan)로 37°C에서 농축하였다. 농축물은 50 mg/mL의 농도로 DMSO에 녹여 4°C에서 보관하면서 적당한 농도로 희석하여 실험에 사용하였다.

실시예3. 고함량 S-아릴시스테인 함유 흑마늘의 항산화 효능 평가

3-1. 총 polyphenol 함량 측정

Phenol 함량은 Folin-Denis법에 따라 비색 정량하였다. 일정하게 희석한 S-아릴시스테인 추출물 1 mL을 취하여 증류수 1 mL를 가하여 희석하고 1 N Folin-Ciocalteu's phenol reagent 2 mL을 가하여 실온에서 3분간 방치한 후, 10% Na2CO3용액 2 mL을 가하여 이 혼합액을 1시간 동안 상온에서 방치하였다. 1시간 후 혼합액을 13,400 g에서 5분간 원심분리하고 상층액200μL를 취하여 ELISA reader(Sunrise, Tecan Co. Ltd., Grodig, Austria)를 사용하여 690 nm에서 흡광도를 측정하고, 표준물질로 gallic acid를 사용하여 검량선을 작성하였으며, 총 페놀 함량은 mg garlic acid equivalents(GAE)/100 g 단위로 나타내었다.

3-2. 총 flavonoid 함량 측정

Flavonoid 함량은 Davis법에 따라 비색 정량하였다. 일정하게 희석한 S-아릴시스테인 추출물 0.1 mL을 취하여 Diethyl glycol 1 mL을 가하여 실온에서 5분간 방치한 후, 1N NaOH용액 0.1 mL을 가하여 이 혼합액을 30분 동안 상온에서 방치하고, 30분 후 혼합액을 UV/VIS spectrometer-(UV 1601, shimadzu, Kyoto, Japan)를 사용하여 420 nm에서 흡광도를 측정하였다. 표준물질로 quercetin을 사용하여 검량선을 작성하였으며, 총 플라보노이드 함량은 mg quercetin equivalents(GAE)/100g 단위로 나타내었다.

3-3. DPPH 라디칼 소거능 측정

DPPH 라디칼 소거능은 0.2 mM DPPH 에탄올 용액 80 μL에 농도별 S-아릴시스테인 추출물 20 μL을 가한 후 10초 동안 혼합하고 상온에서 10분간 반응시켜 ELISA reader(Sunrise, Tecan Co. Ltd., Grodig, Austria)를 이용하여 492 nm에서 흡광도를 측정하였다.

3-4. 총 항산화능(TRAP) 측정

총 항산화능은 150 μM ABTS[2,2'-azinobis(3-ethylbenzothiazoline 6-sulfonate)와 2.5 μM metmyoglobin을 75 μM H2O2로 활성화시킴으로써 생성된 ferryl myoglobin radical species의 상호작용에 의해 형성된 ABTS radical cation의 흡광도를 억제하는 정도를 측정하는 것으로 농도별 S-아릴시스테인 추출물을 첨가한 반응액을 6분 동안 30°C에서 배양한 후 UV/VIS spectrophotomater(UV 1601, Shimazu, Kyoto, Japan)를 사용하여 740 nm에서 흡광도를 측정하였다. TRAP 농도는 Trolox(6-hydroxy-2,5,7,8-tetramethy lchroman-2-carbonyl acid)의 검정곡선(calibration curve)을 이용하여 계산하고 TEAC(Trolox equivalent antioxidant capacity, mM)로 표현하였다.

3-5. Oxygen radical absorbance capacity (ORAC) value 측정

Peroxyl radical 소거능을 통한 항산화 활성 측정은 peroxyl radical scavenging capacity(ORAC_ROO) 분석법을 이용하였다. 농도별 S-아릴시스테인 추출물에 peroxyl radical 생성을 위한 AAPH를 최종 반응 농도가 20 nM이 되도록 처리하고, 형광표준 용액인 fluorescein를 최종 반응 농도가 40 nM이 되도록 처리하고, 최종 반응 농도 1 μM의 Trolox를 control standard로 사용하였다. Peroxyl radical의 감소를 나타내는 형광감소율은 GENios fluorescence plate reader(Tecan Trading AG, Salzburg, Austria)를 이용하여 excitation wavelength 485 nm, emission wavelength 535 nm에서 매 2 분마다 2시간 동안 측정하였다. ORAC value는 각 시료의 형광이 감소하는 곡선 아래 부분의 총 면적(net area under the curve)을 산출하여 1μM trolox equivalents(TE)로 나타내었다.

3-6. 세포 내 ROS 저해능 측정(CAC assay; Cellular antioxidant capacity assay)

HepG2 세포를 이용한 살아 있는 세포 내에서 S-아릴시스테인 추출물의 항산화 활성 측정을 위한 CAC assay는 DCFH-DA 분석법을 변형하여 측정하였다. 96-well plate에서 HepG2 5×104 cells/mL을 DMEM 배지에 10% fetal bovine serum을 첨가하여 37℃, 5% CO2 incubator에서 배양함. 24시간 후 배지를 제거하고 형광에 안정한 HBSS(Hank's balanced salt solution)를 각 well에 200 μL 분주한 후 농도별 S-아릴시스테인 추출물을 처리하여 30 분 동안 배양하였다. 배양 후에 HBSS로 세척하고, HBSS 200 μL에 peroxyl radical 발생을 위해 80 mM AAPH 2 μL를 가하여 30 분 동안 배양함. 형광 probe로 40 mM DCFH-DA 2 μL를 가하고 빛을 차단하여 30 분 동안 배양한 후 GENios fluorescence plate reader(Tecan Trading AG, Salzburg, Austria)를 이용하여 excitation wavelength 485 nm, emission wavelength 535 nm에서 형광의 발생 정도를 측정하였다. 음성대조군(negative control)은 DCFH-DA만을 처리하였으며, 양성대조군(positive control)에는 AAPH와 DCFH-DA를 처리함. 대조군의 형광값을 100%로 하여 각 시료와 AAPH의 상대적인 형광값을 비교하였다.

3-7. 항유전독성 활성 측정(DNA 손상 보호능)

1) 혈액 내 백혈구 세포 분리

건강한 성인남성으로부터 전혈을 채취한 후 200 μL의 신선한 전혈과 800 μL의 phosphate buffered saline(PBS)를 혼합한 후 Histophaque-1077 (Sigma Chemical Co., St Louis, MO, USA) 200 μL에 조심스럽게 띄우고 1,450 rpm에서 5분간 원심분리하여 백혈구를 분리한 후 분석에 사용하였다.

2) 시료의 처리 및 산화적 스트레스 유발

분리한 백혈구에 S-아릴시스테인 추출물을 1-50 μg/mL의 농도로 처리하여 37°C에서 30분간 반응시키고, 반응이 끝난 후 백혈구를 phosphate buffered saline(PBS)로 세척한 후 인위적인 산화적 스트레스를 유발하기 위하여 200 μM의 H2O2를 4°C에 5분간 처리한 후 PBS로 세척하였다. Positive control은 200 μM H2O2을 처리하였다. 반응이 끝난 백혈구는 alkaline comet assay 방법에 따라 슬라이드를 제조하고 전기영동한 후 ethidium bromide (20μg/mL)로 염색하여 형광현미경(LEICA DMLB, Wetzlar, Germany)의 CCD camera(Nikon, Tokyo, Japan)를 통해 보내진 각각의 세포핵 image를 comet image analyzing system(Komet version 5.0, Kinetic Imaging, Liverpool, UK)을 통해 분석하였다.

실험예3. 고함량 S-아릴시스테인 함유 흑마늘의 항산화 효능 평가 결과

3-1. 총 polyphenol 함량과 flavonoid 함량 측정 결과

총 페놀함량 측정은 항산화 연구에 폭넓게 이용되는 방법으로, 천연에 존재하는 주요한 폴리페놀 화합물들은 라디칼 소거능과 강력한 항산화능을 포함한 생리활성을 가지는 것으로 보고되고 있다. 고?t량 S-아릴시스테인 함유 흑마늘의 총푤리페놀 함량은 1481.5±6.9 mg GAE/100 g, 총플라보노이드 함량은 248.6±0.4 mg QE/100 g으로 나타났다. 이는 강 등(강재란, 이수정, 권효지, 권민혜, 성낙주. 반응표면분석을 이용한 흑마늘의 항산화 활성 최적화를 위한 추출조건 확립. 한국식품저장유통학회지. 19: 577~585 (2012))의 논문에서 흑마늘의 최대가 되는 추출조건에서 총폴리페놀 함량 562.74 μg/m으로 제시하고 있어, 본 연구에서 개발한 제조공정에 의해 생산된 고함량 S-아릴시스테인 함유 흑마늘의 총폴리페놀 함량이 약 26배 더 높은 것을 확인 할 수 있었다.

고함량 S-아릴시스테인 함유 흑마늘의 총 폴리페놀과 총 플라보노이드 함량

고함량 S-아릴시스테인 함유 흑마늘
총폴리페놀(mg GAE/100 g)	1481.5±6.9
총플라보노이드(mg QE/100 g)	248.6±0.4

3-2. DPPH 라디칼 소거능 측정

DPPH assay는 빠르고 간단하게 식물이나 식품 추출물 또는 단일 화합물의 항산화능을 측정하기 위해 널리 사용되는 방법으로 DPPH는 항산화제와 만나면 매우 빠른 속도로 hydrogen radical의 전자를 받아들이면서 환원되어 안정한 화합물인 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazine으로 비가역적으로 전환되며 짙은 보라색이 엷어지는 특징을 가진다. 고?t량 S-아릴시스테인 함유 흑마늘의 DPPH 라디칼 소거능은 농도의존적으로 증가하였으며, 1~10 mg/mL에서 20~85% DPPH 라디칼 소거능을 나타내었다(도 2 참조).

3-3. 총 항산화능(TRAP) 측정

TRAP assay는 2,2-azinobis-(3-ethylbenzothiazoline-6-sulphnate) 양이온(ABTS+)에 대한 항산화제의 소거능을 측정하는 방법으로 고?t량 S-아릴시스테인 함유 흑마늘의 TRAP 활성은 농도의존적으로 증가하였다(도 3 참조).

3-4. Oxygen radical absorbance capacity (ORAC) value 측정

ORAC assay는 산화물질에서 유도된 peroxy radical이 형광 probe와 반응하여 비형광의 생성물을 형성하는데, 항산화활성은 시간에 따른 비형광생성물의 양과 감소율을 평가하여 항산화활성을 측정한다. 고?t량 S-아릴시스테인 함유 흑마늘의 ORAC 활성은 농도의존적으로 증가하였으며, 50 μg/mL의 농도에서 ORAC 활성은 1 mM trolox 대비 약 4.8배 정도 증가한 것을 확인 할 수 있었다(도 4 참조).

3-5. 세포 내 ROS 저해능 측정(CAC assay; Cellular antioxidant capacity assay)

활성산소(ROS)는 산소의 환원 대사물로서 정상 세포 내 대사과정이나 세포질 내 효소 작용에 의해 내부로부터 형성되거나 다양한 외부 요소에 의해 형성된다. 세포들은 ROS의 축적과 손상에 대항하기 위해 항산화 방어기전을 갖추고 있는 데, ROS 발생이 세포의 항산화 능력을 초과하는 경우 산화적 스트레스에 노출된다. 8 mM AAPH 투여 후의 HepG2 세포 내의 ROS 생성 수준은 고함량 고?t량 S-아릴시스테인 함유 흑마늘에 의해 농도 의존적으로 형광 강도가 유의적으로 감소하였다(도 4 참조).

3-6. 항유전독성 활성 측정(DNA 손상 보호능)

산화적 스트레스에 의한 DNA 손상 보호능 Single-cell gel-electrophoresis(SCGE) assay로 잘 알려진 comet assay는 활성산소에 의한 산화적 스트레스 유발 시 세포내의 DNA 손상 정도를 직접적으로 확인할 수 있는 유용한 지표로 사용되고 있다. 고?t량 S-아릴시스테인 함유 흑마늘의 200 μM H₂O₂에 의한 DNA 손상 억제 효과는 그림 19와 같다. 건강한 성인의 백혈구에 산화적 스트레스를 유도하는 200 μM H₂O₂ 처리 시 DNA 손상은 유의적으로 증가한 반면, 고?t량 S-아릴시스테인 함유 흑마늘 처리구에서 그 손상은 유의적으로 감소되었다. 백혈구에 시료를 처리하여 cell viability를 측정해본 결과 90% 이상을 나타내어 고?t량 S-아릴시스테인 함유 흑마늘 처리에 의한 세포 독성은 나타나지 않았다(도 5 참조).

실시예4. 고함량 S-아릴시스테인 함유 흑마늘의 항노화 효능 평가

4-1. 항노화 유전자(Sirtuin) 발현 측정

고함량 S-아릴시스테인 함유 흑마늘 추출시료를 지방세포분화가 14일 된 3T3-L1 지방세포에 100 μg/mL의 농도로 24시간 처리하여 RT-PCR을 이용하여 SIRT1 (sirtuin-1) 및 SIRT6 (sirtuin-6)의 발현을 분석하였다.

PCR 분석을 위한 primer sequence

Gene	Primer sequence
SIRT1	forward: 5′-GAC TTC CCA GAC CTC CCA GA-3′ reverse: 5′-CTG CAA CCT GCT CCA AGG TA-3′
SIRT6	forward: 5′-AAC CTG CAA CCC ACA AAA CA-3′ reverse: 5′-CAT GCA CTG CAC CAT TGA GA-3 ′
β-actin	forward: 5′-GAT TAC TGC TCT GGC TCC TA-3′ reverse: 5′-ATC GTA CTC CTG CTT GCT-3 ′

실험예4. 고함량 S-아릴시스테인 함유 흑마늘의 항노화 효능 평가 결과

4-1. 항노화 유전자(Sirtuin) 발현 측정

인체에서 sirtuin 1 유전자는 히스톤과 비히스톤 단백질을 탈아세틸화하여 항염증, 항노화 작용을 한다고 알려져 있으며, sirtuin 1을 활성화 시키는 방법은 항산화성분에 의해 활성화될 수 있다고 보고되고 있다. Sirtuin 6의 경우 기능 오류가 난 경우 수명이 감소되고, 반대로 기능이 회복되었을 경우 수명을 늘릴 수 있음이 보고되었다. 따라서 본 연구에서 3T3-L1 전지방세포를 지방세포로 분화시킨 후 14일 째 되는 시점에서 고함량 S-아릴시스테인 함유 흑마늘을 24시간 처리한 결과 노화만 유도하고 물질을 처리하지 않은 PC군보다 sirtuin 1은 약 1.9배, sirtuin 6는 약 4배 유의적으로 증가한 것을 확인할 수 있었다(도 7 및 도 8 참조).

실시예5. 고함량 S-아릴시스테인 함유 흑마늘의 혈관 노화 억제 및 혈행 개선 효능 평가

5-1. Nitric oxide(NO) 저해 활성 측정; 혈관이완 지표

Raw 264.7 macrophage는 DMEM 배지에 10% fetal bovine serum (FBS), 100 U/mL penicillin, 100 μg/mL streptomycin을 포함한 배양액으로 95%의 습도가 유지되는 37℃, 5% CO2 incubator에서 배양하였다. 24well plate에 6×10⁵ cells/well로 24시간 배양한 후, 농도별 S-아릴시스테인 추출물과 1 μg/mL LPS를 동시에 처리하여 24시간 배양하였다. Raw264.7 macrophage로부터 생성된 nitric oxide의 양을 측정하고, 세포 배양액 중에 존재하는 NO2-를 griess 시약을 이용하여 측정하였다. 세포배양 상등액 100 μL와 griess 시약 100 μL를 혼합하여 15분 동안 반응시킨 후 microplate reader로 540 nm에서 흡광도를 측정하여 NO₂ ^-의 양은 NaNO₂의 표준곡선을 이용하여 정량하였다.

5-2. Angiotensin converting enzyme(ACE) 저해 활성; 항고혈압 지표

Rabbit lung acetone powder (Sigma)를 10배의 50 mM sodium borate buffer (pH 8.3)로 현탁하고 4℃에서 homogenization 하여 효소를 추출하였다. 이것을 40,000 g에서 40분간 원심분리하여 그 상등액을 ACE로 사용하였다. 효소 반응의 기질로 Hippuryl-L-histidyl-L-leucine (HHL)을 사용하였다. 50 mM sodium borate buffer (pH 8.3), 300 mM NaCl 및 효소액 0-10 mU를 사용하여 기질을 넣지 않은 상태에서 37℃에서 30분간 반응시켜 반응 정지 용액으로 1 N HCl 0.25 mL를 첨가하였다. 이 용액에 ethyl acetate 1.5 mL를 가하여 hippuric acid를 추출하고 3,000 rpm에서 10분간 원심분리한 다음, ethyl acetate 층 1.0 mL를 취하여 새 시험관에 옮기고 100℃, 30분간 evaporation하고, 50 mM sodium borate buffer (pH 8.3) 1.0 mL를 넣어 hippuric acid를 녹이고 spectrophotometer를 이용하여 228 nm에서 흡광도를 측정하였다.

5-3. 혈소판 응집능 및 응집억제능 측정; 혈행 개선 지표

1) 흰쥐 혈소판 준비

준비된 rat을 에틸에테르(ethyl ether)로 마취하고, 미리 항응고제로서 0.38%의 구연산나트륨(sodium citrate) 1 ml을 주사기에 넣고 복대동맥으로부터 9 mL를 채혈하였고, 혈액은 1000 rpm에서 10분간 원심분리한 상층액을 3000 rpm, 5분 동안 재원심분리하였다. 침전된 혈소판을 혈소판이 없는 혈장에 현탁시켜서 혈소판(platelet rich plasma, PRP)으로 사용하였다. 그리고 세포수 측정기 (cell counter, Hema-vet HV950FS, Drew scientific, USA)를 이용하여 혈소판 수를 계측하고 혈장으로 희석하여 혈소판이 1×10⁸ platelet/mL이 되도록 조정하였다.

2) 혈소판 응집능 측정

흰쥐(SD rat)의 혈소판 응집 억제능은 측정계(Aggregometer, Chrono-Log Co., Ltd., Havertown, PA. USA)를 이용한 탁도 측정법으로 측정하였다. PRP를 37℃에서 2분간 인큐베이션(incubation) 시킨 후, Platelet-poor plasma (PPP) 500 ㎕과 Platelet Rich Plasma (PRP) 50 ㎕을 각각 quartz에 분주하고 stirrer bar를 넣은 후 프로그램을 실행시켰다. 시료 sample (500, 200, 100 ㎍/mL)을 넣고 2분간 배양한 후 ADP (10 μM)를 첨가하여 혈소판 응집반응을 5분간 측정한 후 응집능을 계산하였다. 시료를 처리하지 않은 것을 control로 하였다.

실험예5. 고함량 S-아릴시스테인 함유 흑마늘의 혈관 노화 억제 및 혈행 개선 효능 결과

5-1. Nitric oxide(NO) 저해 활성 측정; 혈관이완 지표

염증 매개인자인 NO의 생성 저해 활성을 측정하기 위하여 Law 264.7 세포를 LPS로 자극 후 고?t량 S-아릴시스테인 함유 흑마늘 추출물의 NO 생성능을 분석 시 농도의존적으로 감소하는 결과를 나타내었다(도 9 참조). 그리고 생성된 NO를 50% 저해하는 농도인 IC₅₀ 값은 204.4 μg/mL로 나타났다.

5-2. Angiotensin converting enzyme(ACE) 저해 활성; 항고혈압 지표

ACE는 혈압 상승의 원인이 되는 Angiotensin II를 Angiotensin I으로부터 전환하는 효소로서, ACE 활성을 저해하는 것은 혈압 상승을 억제하는 지표로 널리 이용 되고 있다. 고?t량 S-아릴시스테인 함유 흑마늘의 ACE 저해능의 결과를 나타내었다(도 10 참조). ACE 저해능은 농도의존적으로 증가하였으며, 10 mg/mL의 농도에서 약 74%의 ACE 저해능을 나타내었다.

5-3. 혈소판 응집능 및 응집억제능 측정; 혈행 개선 지표

혈관이 손상되었을 때 혈소판은 collagen, thrombin, ADP 등의 각종 agonists의 자극에 반응하여 활성화되어 점착반응 (adhesion), 방출반응(secretion) 및 응집반응(aggregation)을 일으키며, 이에 의해 혈관이 손상을 받아 출혈이 일어난 후 혈액이 혈괴 또는 조직 내에서 응고됨으로써 혈전이 생성된다. 혈소판은 혈관손상에 반응하여 혈액손실을 막아 주는 결정적인 역할을 하지만, 급성 죽상 동맥 혈전증을 일으키며, 이는 심혈관 질환 등의 초기 원인이 되기도 한다. 고?t량 S-아릴시스테인 함유 흑마늘과 혈소판과 반응시킨 후 ADP 처리하였을 때 500 μg/mL의 농도에서 시료무첨가군 대비 유의적으로 감소하는 결과를 나타내었다(도 11 참조).

실시예6. 흑마늘 타블렛의 성능 분석

제조한 최종 ‘솔잎 첨가 고함량 S-아릴시스테인 함유 흑마늘 타블렛’제품과 기존의 흑마늘 분말 제품의 SAC 함량 비교뿐만 아니라 항산화, 항노화, 혈관 노화 억제 및 혈행개선 효능을 비교 분석하여 흑마늘 타블렛의 성능을 검증하였다. 혈소판응고능을 분석하기 위해 Sprague Dawley계 5주령 웅성 흰쥐를 일주일간 고형배합사료로 적응시킨 후, 각 처리군당 8마리씩 4군으로 나누어 6주간 사육하였다. 실험군은 정상군(Normal diet, ND), 1%　고콜레스테롤 섭취군(High-cholesteol diet, HC), 1％　고콜레스테롤+ 3% 흑마늘 섭취군(HC+G), 1％　고콜레스테롤+3% 흑마늘과 솔잎 혼합 분말 섭취군(HC+GPA)으로 나누었다. 식이는 AIN-93을 기준으로 조제하였으며, 식이 조성은 아래에 제시하였고, 물과 식이는 제한없이 공급하고, 사육기간 동안 사육실의 온도는 20°C, 습도는 55%, 조명은 12시간 주기(08:00~20:00)로 조절하였다. 본 동물실험은 경남대학교 동물실험윤리위원회 승인(KUIAC-1502) 하에 진행되었으며, 6주 후 희생시킨 후 전혈은 혈소판 응고능 분석을 위해 사용하였다.

Ingredient	ND	HC	HC+AG	HC+AG+P
Casein	15	15	14.30322	13.8541222
Cornstarch	61.07	59.57	57.75428	58.1987135
Sucrose	10	10	10	10
Soybean Oil	4	4	3.91393	3.883067
Cellulose	5	5	5	5
Mineral mix	3.5	3.5	3.5	3.5
Vitamin mix	1	1	1	1
L-Cystein	0.18	0.18	0.18	0.18
Choline Bitartrate	0.25	0.25	0.25	0.25
Cholesterol	0	1	1	1
Cholic acid	0	0.5	0.5	0.5
Treatment
Pine needle	-	-		0.83
Aged garlic	-	-	3	2.16
Total	100	100	100.4	100.3

고함량 S-아릴시스테인 흑마늘 분말과 솔잎 분말의 최적 혼합 조건과 ORAC 활성및 총폴리페놀 함량의 예측값과 관찰값의 비교

	솔잎 (g)	흑마늘 (g)	ORAC(uM TE)		TP(mg GAE/100 g)
			예측값	실제값	예측값	실제값
최적혼합조건	1.97	5.08	2.0	6.4	1798.7	2017.8

실험예6. 흑마늘 타블렛의 성능 분석 결과

마늘분말(G), 고함량 S-아릴시스테인 흑마늘 분말(AG), 고함량 S-아릴시스테인 흑마늘과 솔잎 혼합 분말(AG+P)의 총폴리페놀함량은 고함량 S-아릴시스테인 흑마늘과 솔잎 혼합 분말(AG+P)에서 유의적으로 가장 높았으며 고함량 S-아릴시스테인 흑마늘 분말(AG)와 비교시 36% 증가하였다(도 14 및 도 15 참조). 총플라보노이드 함량 역시 마늘분말(G)(58.3 mg QE/100 g), 고함량 S-아릴시스테인 흑마늘 분말(AG)(248.6 mg QE/100 g)와 고함량 S-아릴시스테인 흑마늘과 솔잎 혼합 분말(AG+P) 비교 시 고함량 S-아릴시스테인 흑마늘과 솔잎 혼합 분말(AG+P)(524.2 mg QE/100 g)에서 유의적으로 가장 높았으며, 고함량 S-아릴시스테인 흑마늘 분말(AG) 대비 111% 증가하였다.

마늘분말(G), 고함량 S-아릴시스테인 흑마늘 분말(AG), 고함량 S-아릴시스테인 흑마늘과 솔잎 혼합 분말(AG+P)군 모두 농도의존적으로 DPPH 라디칼 소거능이 증가하였다(도 16 및 도 17 참조). DPPH 라디칼을 50% 소거하는 능력인 DPPH IC₅₀을 비교하였을 때, G와 AG는 5.9 mg/mL로 나타났으나 AG+P는 5.4 mg/mL로 유의적으로 낮아 DPPH 라디칼 소거능이 다른 군에 비해 우수함을 확인할 수 있었다.

TRAP 활성을 비교하여 보면 G, AG, AG+P 모든 군에서 농도의존적으로 TRAP 활성이 증가함을 나타내었다(도 18 참조). 200 μg/mL에서 TRAP 활성 비교 시 AG+P(1.1 mM TEAC)가 가장 높았고, AG(0.9 mM TEAC)>P(0.6 mM TEAC) 순으로 나타났다. ORAC 활성의 결과를 나타낸다(도 19 참조). 세 시료 모두에서 농도의존적으로 ORAC 활성은 증가하였으며, 가장 높은 농도에서 ORAC 활성 비교시 AG+P (6.4 mM TE)>G(5.8 mM TE)>AG(4.4 mM TE) 순으로 나타났다.

세포내 ROS 소거능 측정 시 AAPH 무처리구 NC 보다 AAPH 처리구 PC에서 ROS 생성이 유의적으로 증가하였으며, G, AG, AG+P 처리구 모두에서 PC보다 ROS 소거능이 농도의존적으로 감소함을 확인할 수 있었다(도 20 참조).

고?t량 S-아릴시스테인 함유 흑마늘과 솔잎 혼합의 200 μM H₂O₂에 의한 DNA 손상 억제 효과는 그림 30과 같다. 건강한 성인의 백혈구에 산화적 스트레스를 유도하는 200 μM H₂O₂ 처리 시 DNA 손상은 유의적으로 증가한 반면, G, AG, AG+P 처리구에서 그 손상은 유의적으로 감소되었다. 백혈구에 시료를 처리하여 cell viability를 측정해본 결과 90% 이상을 나타내어 G, AG, AG+P 처리에 의한 세포 독성은 나타나지 않았다. H₂O₂에 의한 산화적 스트레스에 대한 손상을 50%로 낮추기 위한 ED₅₀을 비교해보면 G는 22.26 μg/mL, AG는 22.66 μg/mL, AG+P는 19.20 μg/mL로 나타나 AG+P의 항유전독성이 가장 높았음을 알 수 있었다(도 21 참조).

3T3-L1 세포를 지방세포 분화 후 14일째에 200 μg/mL G, AG, AG+P 각각을 24시간 처리한 후 노화 관련 유전자로 알려진 sirtuin 1, 6의 발현정도를 비교해보면 시료 무첨가구인 PC대비 시료 처리구에서 유의적으로 증가한 것을 확인할 수 있었다(도 22 및 도 23 참조). 시료 처리구 간에 비교 시 sirtuin 1에서는 AG+P와 G가 AG보다 유의적으로 높았지만, sirtuin 6에서는 AG+P가 다른 시료처리구 대비 유의적으로 발현이 증가하였다.

Law 264.7 세포에 LPS 처리시 LPS 무첨가군보다 NO 생성이 유의적으로 증가하였으며, G, AG, AG+P 처리에 따라 NO 생성능이 농도의존적으로 감소함을 확인 할 수 있었다. NO 생성을 50% 저해할 수 있는 각 시료의 IC₅₀을 비교해 본 결과 G 201.8 μg/mL, AG 204.4 μg/mL, AG+P는 183.7 μg/mL로 LPS 처리에 의해 생성되는 NO를 저해하는 데 있어 AG+P가 가장 우수하였다(도24 참조).

ACE 저해능을 비교해본 결과 각 시료들은 농도의존적으로 ACE 저해능이 증가하였으며, 10 mg/mL에서 비교 시 ACE 저해능은 AG+P(79.1%)>AG(74.4%)>G(66.2%) 순서로 나타났다(도 25 참조).

In vitro 혈소판 응고능을 비교 시 시료무첨가 혈소판 응고능을 100%로 보았을 때 G와 AG는 500 μg/mL에서 유의적으로 감소한 반면, AG+P는 200 μg/mL에서 유의적으로 혈소판 응고능이 감소하였다.

In vivo 혈소판 응집에 대한 결과(도 27참조)로 정상식이군에 비해 고콜레스테롤 식이군은 혈소판 응집능이 유의적으로 높아졌으며, 고콜레스테롤 식이+AG군, 고콜레스테롤 식이+AG+P군의 혈소판 응집능은 고콜레스테롤 식이군에 비해 유의적으로 낮아졌다. 그리고 그 효과는 AG보다 AG+P군에서 유의적으로 더 높았음을 확인 할 수 있었다(도 26 및 27 참조).

Claims (10)

1. 마늘의 뿌리부분을 제거하고 발효숙성시키는 단계(제1단계); 발효숙성시켜 얻은 흑마늘의 수분을 제거하는 단계(제2단계); 수분이 제거된 흑마늘을 절단하여 75 내지 85℃에서 1.5 내지 2.5시간 동안 1차 호화 및 건조하는 단계(제3단계); 1차 호화 및 건조된 흑마늘을 분쇄하여 2차 호화 및 건조하는 단계(제4단계); 2차 호화 및 건조된 흑마늘을 분쇄하고 건조하여 흑마늘 분말을 제조하는 단계(제5단계); 상기 흑마늘 분말에 솔잎분말을 함께 넣어 혼합하는 단계(제6단계); 및 상기 혼합물을 건조시키고 가압성형하여 타정하는 단계(제7단계);를 포함하는 솔잎이 첨가된 고함량 S-아릴시스테인을 함유하는 흑마늘 타블렛의 제조방법.
2. 제 1항에 있어서,
   상기 흑마늘은 편백나무함에 쑥과 함께 넣어 가열 숙성기에서 595 내지 605시간 동안 숙성시켜 얻은 것을 특징으로 하는 솔잎이 첨가된 고함량 S-아릴시스테인을 함유하는 흑마늘 타블렛의 제조방법.
3. 제 2항에 있어서,
   상기 숙성은 고온 열풍 처리와 저온 열풍 처리로 2차례 발효숙성을 포함하는 것을 특징으로 하는 솔잎이 첨가된 고함량 S-아릴시스테인을 함유하는 흑마늘 타블렛의 제조방법.
4. 삭제
5. 제 1항에 있어서,
   상기 2차 호화 및 건조는 75 내지 85℃에서 1.5 내지 2.5시간 동안 이루어지는 것을 특징으로 하는 솔잎이 첨가된 고함량 S-아릴시스테인을 함유하는 흑마늘 타블렛의 제조방법.
6. 제 1항에 있어서,
   상기 흑마늘 분말은 분말 입자의 크기가 16 내지 18메쉬(mesh)가 되도록 이루어지는 것을 특징으로 하는 솔잎이 첨가된 고함량 S-아릴시스테인을 함유하는 흑마늘 타블렛의 제조방법.
7. 제 1항에 있어서,
   상기 혼합물은 흑마늘 분말 50 내지 53 중량% 및 솔잎 분말 18 내지 21 중량%의 비율로 혼합하는 것을 특징으로 하는 솔잎이 첨가된 고함량 S-아릴시스테인을 함유하는 흑마늘 타블렛의 제조방법.
8. 제 7항에 있어서 ,
   상기 혼합물의 양은 전체 타블렛 중량의 68 내지 74 중량%임을 특징으로 하는 솔잎이 첨가된 고함량 S-아릴시스테인을 함유하는 흑마늘 타블렛의 제조방법.
9. 제 1항에 있어서 ,
   상기 가압성형은 100 내지 300 kg/cm2의 압력으로 60초 내지 120초 동안 이루어지는 것을 특징으로 하는 솔잎이 첨가된 고함량 S-아릴시스테인을 함유하는 흑마늘 타블렛의 제조방법.
10. 제 1항에 있어서,
    상기 타정하는 단계는 결정셀룰로오스 16.7중량%, 칼슘32%이상인 해조칼슘분말P 5중량%, 칼슘25%이상인 유청칼슘 3중량%, 카르복시메틸셀룰로오스칼슘 2중량%, 스테아린산마그네슘 1중량%, HPMC 0.8중량% 및 글리세린지방산에스테르혼합제 0.1중량%를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 솔잎이 첨가된 고함량 S-아릴시스테인을 함유하는 흑마늘 타블렛의 제조방법.

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