KR101818901B1

KR101818901B1 - 돼지흉막폐렴균의 재조합 ApxIA, ApxIIA, ApxIIIA toxin의 N 또는 C 말단 분자 및 불활화 돼지흉막폐렴균을 이용한 돼지 흉막폐렴 백신 조성물

Info

Publication number: KR101818901B1
Application number: KR1020160109432A
Authority: KR
Inventors: 허진; 장현; 이희용; 김혜원; 문자영; 김성진
Original assignee: 우진 비앤지 주식회사
Priority date: 2016-08-26
Filing date: 2016-08-26
Publication date: 2018-01-16
Anticipated expiration: 2036-08-26

Abstract

본 발명은 돼지 흉막폐렴균의 재조합 ApxIA의 N 및 C 말단, ApxIIA의 N 및 C 말단 그리고 ApxIIIA의 N 및 C 말단 항원과 돼지흉막폐렴균 2형과 5형의 포르말린 불활화 사균체를 유효성분으로 포함하는 돼지 흉막폐렴의 예방 또는 치료용 백신 조성물에 관한 것이다. 본 발명은 돼지 흉막폐렴균 유래 ApxIA의 N 및 C 말단, ApxIIA의 N 및 C 말단 그리고 ApxIIIA의 N 및 C 말단 항원의 분비를 증가시키도록 개발된 벡터로 발현용 대장균(Escherichia coli)을 형질전환시키고 상기 형질전환된 발현용 대장균으로부터 각 해당 단백질을 분리 정제한 후 돼지 흉막폐렴 유래 혈청형 2형과 5형 포르말린 처리 불화화 균체와의 혼합물을 접종시킨 자돈에서 항원에 대한 체액성 면역 반응뿐 아니라 돼지 흉막폐렴균 독성에 대하여 효과적으로 저항성을 보임을 확인하였다. 따라서, 본 발명의 재조합 항원 및 포르말린 불활화 균체 혼합물은 안전하고 경제적이며 간편하게 접종할 수 있는 돼지 흉막폐렴 예방 및 치료용 백신으로 유용하게 사용될 것으로 기대된다.

Description

돼지흉막폐렴균의 재조합 ApxIA, ApxIIA, ApxIIIA toxin의 N 또는 C 말단 분자 및 불활화 돼지흉막폐렴균을 이용한 돼지 흉막폐렴 백신 조성물{Inactivated vaccine composition of Actinobacillus pleuroneumoniae inactivated bacterin and N or C fragments of Actinobacillus pleuroneumniae ApxIA, ApxIIA, ApxIIIA inactivated toxin}

본 발명은 돼지흉막폐렴균의 재조합 ApxIA, ApxIIA, ApxIIIA toxin의 N 또는 C 말단 분자 및 불활화 돼지흉막폐렴균을 이용한 돼지 흉막폐렴 백신 조성물에 관한 것이다.

돼지흉막폐렴은 악티노바실루스 플뢰로뉴모니애(Actinobacillus pleuropneumoniae) 라는 호흡기 세균에 의해 발병하며 흔히 줄여서 APP라고 명명한다. 돼지흉막폐렴은 우리나라를 포함하여 전세계적으로 고르게 분포되어 발생하는 흔한 질병이지만, 치사율이 높고 항생제 내성 증가로 인해 치료가 쉽지 않고, 육성돈 뿐만 아니라 비육돈 시기에서도 감염되어 APX toxin에 의한 급격한 호흡곤란으로 즉사를 일으키는 질병으로 농가에 큰 경제적 손실을 입히는 돼지의 주요 호흡기 질환 중에 하나이다.

돼지 흉막폐렴균인 악티노바실루스 플뢰로뉴모니애(Actinobacillus pleuropneumoniae ; APP)는 크게 15가지 혈청형이 존재하는데 모두 병원성을 나타내며, 지역과 나라에 따라 흉막폐렴을 일으키는 혈청형이 다르게 분포하고 있어 나라마다 혈청형이 다른 백신이 보급되어야 하는 실정이다.

우리나라에서는 특히 APP 1형, 2형과 5형이 가장 흔하게 발견되지만, 다른 혈청형도 현재 꾸준히 증가하고 있는 추세이다. 따라서 현재 사용되고 있는 불활화 백신(inactivated vaccine)으로는 다양한 혈청형에 대한 방어가 어려울 뿐만 아닐라 toxin에 의한 육성 및 비육돈의 즉사를 막을 방법이 없는 상태이다.

돼지흉막폐렴의 원인균인 APP에 일단 감염되면, 기후가 급변하는 환절기나, 사육환경이 넉넉하지 못해 돼지가 스트레스를 받는 환경에서 자연스럽게 면역력 저하로 인해 병증이 나타나게 된다. APP는 호흡기 세균인 만큼, 공기의 흐름을 통해 전달되며, APP가 만들어내는 헤모라이신(hemolysin)과 세포독소(cytotoxin)가 혈구를 파괴해 병증을 더욱 악화시킨다. 보통 돼지 흉막폐렴은 어린 돼지 보다는 20kg이 넘는 육성돈에서 출하를 앞둔 시기에 집중적으로 발병하게 되는데, 이런 문제 때문에 농가는 엄청난 경제적 손실을 입게 되는 경우가 많다.

악티노바실루스 플뢰로뉴모니애(Actinobacillus pleuropneumoniae;APP)는 파스퇴렐라과(Pasteurellaceae family)에 속하는 돼지 흉막폐렴의 원인균이다. 실험실에서 배양시 NAD (nicotinamide adenine dinucleotide)를 요구하느냐 그렇지 않느냐에 따라 2개의 생물형(biovar)으로 나뉘어진다. NAD를 요구하는 것이 biovar 1인데, 이것은 또 세균의 성분들(협막 다당질(capsular polysaccharides), 지질다당류(lipopolysaccharides;LPS))의 차이로 인한 혈청학적 특이성 때문에 15개의 혈청형으로 나뉜다. 그러나, 어떤 혈청형들은 유사한 구조 또는 LPS 유사성으로 교차반응이 나타난다. 1번에서 9번, 11번; 3번, 6번, 8번; 4번, 7번 혈청형들이 서로 교차반응을 나타내는 것으로 알려져 있다.

돼지의 흉막폐렴은 전 세계적으로 널리 발생하고 있으며, 양돈산업이 성장하면 할수록 이 질병에 대한 중요성이 더해지고 있다. 이 질병의 발생은 우리나라를 포함하여 유럽연합, 미국, 캐나다, 멕시코, 남미, 일본, 대만, 호주 등에서 보고되고 있다. 한 나라에서 한 개 또는 두 개의 혈청형이 우세하게 발생할 수 있으나 (예를 들면, 스위스, 덴마크, 스웨덴은 2번, 미국과 캐나다는 1번과 5번), 같은 나라에서 몇 개의 혈청형이 질병을 일으킬 수도 있으며, 같은 농장 내에서도 다른 혈청형이 존재할 수 있다. 우리나라의 경우에도 국립수의과학검역원의 보고에 의하면, 분리된 악티노바실루스 플뢰로뉴모니애(Actinobacillus pleuropneumoniae) 92주중 38주 (41%)가 2번, 54주 (59%)가 5번 혈청형으로 다른 혈청형에 비해 주로 감염되는 혈청형으로 알려져 있다. 이 질병은 급성으로 발생하면 폐사, 생산성 저하, 치료비용 증가 등의 문제를 야기하기 때문에 경제적으로 상당히 중요하다. 악티노바실루스 플뢰로뉴모니애(Actinobacillus pleuropneumoniae)는 돼지에 숙주특이성이 매우 높으며, 호흡기관에 기생하는 세균이다. 이 질병이 급성으로 진행되면, 폐병변이나 패혈증의 혈액뿐 아니라, 코 분비물에서도 원인균이 존재한다. 급성으로 진행되었다가 살아난 돼지는 원인균을 전파시킬 수 있으며, 이 경우 폐병변 또는 편도, 비강에 원인균이 존재한다.

모든 연령의 돼지가 감수성이 있으나, 악티노바실루스 플뢰로뉴모니애(Actinobacillus pleuropneumoniae)가 생산하는 독소를 중화하는 항체를 가지고 있느냐에 따라서 감수성이 달라질 수 있다. 또한, 초유항체가 유지되었느냐에 따라서 6주에서 8주령 돼지에서 이 질병의 진행에 영향을 미칠 수 있다. 균주의 병원성과 사육환경에 따라서 폐사율은 달라질 수 있으나, 일반적으로 높은 편이다. 폐사율과 이환율은 오제스키병과 돼지 생식기호흡기 증후군 (PRRS)이 있는 농장에서는 상당히 악화된다.

질병 전파의 주요 경로는 공기전염이며, 대부분 직접 접촉에 의해 전파된다. 악티노바실루스 플뢰로뉴모니애(Actinobacillus pleuropneumoniae)는 분비물이나 분변 등의 유기물에 존재할 때는 수일동안 생존할 수 있으며, 깨끗한 물에서는 4℃에서 30일 동안 생존할 수 있다.

이전에 발병이 안된 농장의 경우, 새로 입식하는 돼지 중 잠복 감염된 개체가 있다면, 이 개체를 통하여 전파된다. 또한, 돼지를 많이 싣고 수송하는 것이 이 질병발생의 위험을 증가시키는 요인이 된다. 밀집사육과 불량한 외기조건, 가령, 돈사의 온도를 급격하게 변화시킨다거나 상대습도가 높다거나 환기가 불충분하다면 질병의 진행과 전파를 가속화시켜서 결국에는 폐사율과 이환율을 높게한다. 따라서, 가장 높은 발생을 보이는 시기가 비육기이며, 주로 기후조건이 좋지 않은 계절에 다발하는 것은 이러한 이유에서이다.

돼지 흉막폐렴은 대개 미세한 물방울 또는 접촉에 의해 감염되며, 편도와 폐 상피세포에 부착하여 집락을 형성한다. 폐에 있는 악티노바실루스 플뢰로뉴모니애(Actinobacillus pleuropneumoniae)는 폐포의 대식세포에 의해 탐식되며, ApxI, ApxII, ApxIII 등의 독소를 생산하여 폐포 대식세포, 내피세포, 폐포 상피세포, 폐포벽 모세혈관의 내피세포 등 조직세포에 독성을 발휘한다. 한편, 균의 세포벽을 싸고 있는 캡슐은 탐식작용과 보체의 기능에 대해 저항한다. 돼지가 감염되면 인터루킨-1베타와 인터루킨-8 등의 싸이토카인이 폐포액에 많이 존재하게 되며, 종양괴사인자 (tumor necrosis factor)도 초기 병변부위에 존재한다. 이렇게 감염에 수반되는 독소와 싸이토카인으로 유발되는 조직손상은 질병을 가속화시킨다. 혈청형들 사이의 병원성차이도 종종 발견되며, 심지어 같은 혈청형내에서도 병원성 차이가 발견될 때도 있다. 그러한 차이는 캡슐 구조, LPS 구성, 용혈독소형의 차이에 기인한다. 그럼에도 불구하고 일반적으로 1번, 5번, 9번, 10번, 11번이 다른 혈청형보다 더 병원성이 높은 것으로 밝혀졌다.

돼지에 실험적으로 감염을 시키면 악티노바실루스 플뢰로뉴모니애(Actinobacillus pleuropneumoniae)의 독성작용에 의한 폐병변은 3시간이 지나면 발견할 수 있다. 병변의 말단부위는 죽거나 손상받은 대식세포 또는 조직으로 채워지며, 감염후 4일까지 쉽게 정상폐와 구별될 수 있게 된다. 이후 병변이 진행되면서 병변의 중심부가 괴사되며 치유과정으로 진행되면 섬유화된다.

실험 감염이나 자연 감염이나 면역반응을 유도하며, 순환혈액 중 항체는 감염후 약 10 - 14일 후에 감지할 수 있다. 이러한 항체는 감염 후 4 - 6주 내에 최고수준에 도달하며, 여러 달 동안 낮은 수준을 유지하거나 질병이 치유되면 완전히 사라지는 경우도 있다. 면역시킨 암퇘지는 초유를 통하여 새끼돼지에게 면역능을 전달할 수 있다. 그러한 초유항체는 약 5 - 9주 동안 지속되나, 방어력은 3주밖에 지속되지 않을 수도 있다. 돼지 흉막폐렴 원인균인 APP에 감염이 되면, 돼지는 무기력증, 호흡곤란, 습서기침, 사기저하 등의 병증을 보이며, 항생제에 쉽게 내성을 보이기 때문에 치료 보다는 예방에 목적을 두고 관리하는 것이 그 무엇보다도 중요하다.

이에 본 발명자는 모든 혈청형에 공통으로 존재하는 APX tonin IA, IIA, IIIA toxin의 N 또는 C fragment로 나누어 기존의 불활화 백신에 혼합해 줌으로써 다양한 혈청형을 동시에 방어할 수 있을 뿐만 아니라 toxin을 이용한 Toxoid항원을 이용하여 다양한 혈청형에 대한 방어가 가능한 백신 제조 기술을 개발하였다.

한국공개특허 제10-2010-0009679호

따라서 본 발명의 목적은 모든 혈청형에 적용가능한 돼지 흉막폐렴균 유래 재조합 항원 및 돼지 흉막폐렴균 불활화 조성물을 포함하는 돼지 흉막폐렴 예방 또는 치료용 혼합 백신을 제공하는 것을 목적으로 한다.

본 발명의 다른 목적은 상기 돼지 흉막폐렴 예방 또는 치료용 백신 제조방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또다른 목적은 상기 백신을 이용한 돼지 흉막폐렴의 예방방법을 제공하는 것이다.

상기의 목적을 달성하기 위해, 본 발명은 돼지 흉막폐렴균 유래 재조합 항원 및 돼지 흉막폐렴균 불활화 조성물을 포함하는 돼지 흉막폐렴 예방 또는 치료용 혼합 백신을 제공한다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 돼지 흉막폐렴균 유래 재조합 항원은 ApxIA, ApxIIA 및 ApxIIIA으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나의 N 또는 C 말단 조각(fragment) 재조합 항원일 수 있다. 하기 표 1에 기재한 바와 같이 상기 APX tonin IA, IIA, IIIA toxin의 N 또는 C 말단 조각을 이용하면 여러 혈청형에 대해 동시에 방어가 가능하다.

혈청형별 독소의 분비

Group	혈청형	APX toxin
Group 1	serotype 1, 5, 9, 11	ApxI, ApxII
Group 2	Serotype 2, 3, 4, 6, 8, 15	ApxII, ApxIII
Group 3	Serotype 7, 12, 13	ApxII
Group 4	Serotype 10, 14	ApxI
2016 23(1):85-95 Clinical and Vaccine Immunology. 참조

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 APX tonin IA의 N 말단 조각은 서열번호 19, C 말단 조각은 서열번호 20의, 상기 APX tonin IIA의 N 말단 조각은 서열번호 21, C 말단 조각은 서열번호 22의, 상기 APX tonin IIIA의 N 말단 조각은 서열번호 23, C 말단 조각은 서열번호 24의 염기서열을 각각 갖는다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 ApxIA N 말단 조각(fragment) 재조합 항원은 E. coli 균주(수탁번호 : KCTC 12983BP), ApxIA C 말단 조각(fragment) 재조합 항원은 E. coli 균주(수탁번호 : KCTC 12980BP), ApxIIA N 말단 조각(fragment) 재조합 항원은 E. coli 균주(수탁번호 : KCTC 12984BP), ApxIIA C 말단 조각(fragment) 재조합 항원은 E. coli 균주(수탁번호 : KCTC 12981BP), ApxIIIA N 말단 조각(fragment) 재조합 항원은 E. coli 균주(수탁번호 : KCTC 12985BP), ApxIIIA C 말단 조각(fragment) 재조합 항원은 E. coli 균주(수탁번호 : KCTC 12982BP) 으로부터 생산한 재조합 항원인 것일 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 돼지 흉막폐렴균 불활화 백신은 포르말린을 이용하여 불활화 시킨 것일 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 면역강화제를 추가로 포함할 수 있다.

또한 본 발명은 (a) 돼지 흉막폐렴균 유래 재조합 항원 발현 유전자를 증폭시키는 단계; (b) 상기 (a) 단계의 증폭된 유전자를 재조합 벡터(pET21a)에 클로닝하는 단계; (c) 상기 (b) 단계의 클로닝된 플라스미드를 발현용 대장균에 형질전환시키는 단계; (d) 상기 (c) 단계의 형질전환된 발현용 대장균을 선별한 후, 발현 정제하는 단계; 및 (e) 상기 (d) 단계의 발현 정제된 재조합 항원과 불활화 흉막폐렴균을 혼합하는 돼지 흉막폐렴 예방 또는 치료용 백신 제조방법을 제공한다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 (a) 단계의 돼지 흉막폐렴균 유래 재조합 항원은 ApxIA, ApxIIA 및 ApxIIIA으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나의 N 또는 C 말단 조각(fragment) 재조합 항원인 것일 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 (e) 단계의 불활화 흉막폐렴균은 포르말린을 이용하여 불활화 시킨 것일 수 있다.

또한 본 발명은 본 발명의 백신을 근육 또는 피하 경로를 통해 투여하는 것을 특징으로 하는 돼지 흉막폐렴 예방방법을 제공한다.

본 발명의 돼지 흉막폐렴균 불활화 박테린과 돼지 흉막폐렴균의 APX toxin N 또는 C 말단이 포함되어 다양한 혈청에 대한 방어력이 뛰어나고 안전한 백신을 제공함으로써 질병의 감염 및 증상을 완화시켜 돼지 흉막폐렴을 예방 또는 치료할 수 있는 효과가 있다.

도1은 SDS-PAGE를 이용한 ApxIA, ApxIIA 또는 APXIIIA의 각 N- 과 C- 말단 재조합 단백질 발현을 보여준다. Lane 1: ApxIA N말단, 2: ApxIA C말단, 3: ApxIIA N말단, 4: ApxIIA C말단, 5: ApxIIIA N말단, 6: ApxIIIA C말단. 각각의 크기는 40.8, 50, 39.6, 43.1, 40.8 그리고 50 kDa이다.
도2는 각 그룹별로 A. pleuropneumoniae의 혈청형 2와 5 항원에 대한 혈청 내 IgG 항체 역가 (A)를 그리고 ApxIA N말단과 C말단, ApxIIA N말단과 C말단 그리고 ApxIIIA N말단과 C말단 혼합 항원에 대한 혈청 IgG에 대한 항체 역가(B)를 나타낸다.

돼지 흉막페렴(porcine pneuneumoniae)은 악티노바실루스 플뢰로뉴모니애(Actinobacillus pleuropneumoniae)균의 감염에 의한 질병으로 Pasteurellaceae family에 속하는 돼지 흉막폐렴의 원인균이다.

본 발명은 돼지 흉막폐렴균으로부터 유래한 ApxIA, ApxIIA 및 ApxIIIA 독소 각각의 N 말단 조각 및 C 말단 조각(fragment)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 말단 조각 재조합 항원; 및 돼지 흉막폐렴균 불활화 조성물을 포함하는 돼지 흉막폐렴 예방 또는 치료용 불활화 백신 조성물을 제공한다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 말단 조각은 서열번호 19 내지 서열번호 24로 이루어진 군으로부터 선택되는 염기서열을 갖는 것을 특징으로 하는 것일 수 있다.

불활화 백신 조성물은 불활화 된 박테린 또는 불활화된 톡소이드(toxoid) 또는 전부 또는 일부 활성 성분을 포함하는 조성물을 의미한다.

백신은 동물에서 면역학적 반응을 유도하는 적어도 하나의 면역학적으로 활성인 성분을 함유하는 약학적 조성물을 의미한다. 백신의 면역학적으로 활성인 성분은 살아있는 바이러스 또는 죽은 바이러스의 적절한 요소를 함유할 수 있고(서브유니트 백신), 이에 의해 이들 요소는 전체 바이러스 또는 이의 성장 배양물을 파괴하고, 이어서 원하는 구조물(들)을 수득하는 정제 단계에 의해, 또는 제한되는 것은 아니지만 박테리아, 곤충, 포유동물 또는 다른 종과 같은 적절한 시스템의 적절한 조작에 의해 유도된 합성과정 및 이어서 단리 및 정제과정에 의해, 또는 적절한 약학적 조성물을 사용하여 유전자 물질의 직접적인 혼입에 의한 백신을 필요로 하는 동물에서 상기 합성 과정의 유도에 의해 (폴리뉴클레오타이드 백신화)제조된다. 백신은 상기 기술된 요소의 하나 또는 동시에 하나 이상을 포함할 수 있다.

상기 백신은 당업계에 알려진 임의의 형태, 예를 들면, 액제 및 주사제의 형태 또는 현탁액에 적합한 고체 형태일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 이러한 제제는 또한 리포좀이나 가용 유리 내로 유화 또는 캡슐화되거나 에어로졸이나 스프레이 형태로도 제조될 수 있다. 이들은 경피 (transdermal) 팻치에 함유시킬 수도 있다. 액제 또는 주사제의 경우, 필요시 프로필렌 글리콜 및 용혈 현상을 방지하는데 충분한 양 (예: 약 1%)의 염화나트륨을 함유할 수 있다.

본 발명의 백신은 추가로 약학적으로 허용 가능한 담체 또는 희석제를 포함할 수 있다. 상기에서 "약학적으로 허용 가능한" 이란 생리학적으로 허용되고 돼지에게 투여될 때, 활성성분의 작용을 저해하지 않으며 통상적으로 위장 장애, 현기증과 같은 알레르기 반응 또는 이와 유사한 반응을 일으키지 않는 비독성의 조성물을 말한다.

백신에 적합한 담체는 기술분야의 당업자에게 공지되어 있으며, 단백질, 당 등을 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다. 상기의 담체는 수용액, 또는 비-수용액, 현탁액 또는 에멀젼일 수 있다. 면역원성을 증가시키기 위한 면역보조제로서 정형 또는 비정형 유기 또는 무기 고분자등이 사용될 수 있다. 면역보조제는 일반적으로 항원에 대한 화학적 물리적 결합을 통해 면역반응을 촉진시키는 역할을 하는 것으로 알려져 있다. 이 연구에서 사용된 면역보조제로서는 비정형 알루미늄 겔, 오일 에멀젼, 또는 이중 오일 에멀젼 그리고 이뮤노졸 등이 사용되었다. 또한 면역반응의 촉진을 위해 다양한 식물 유래 사포닌, 레바미솔, CpG 다이뉴클레오티드, RNA, DNA, LPS, 다양한 종류의 싸이토카인 등이 사용되었다. 위와 같은 면역 조성물은 다양한 보조제와 면역반응 촉진 첨가물의 조합에 의해 최적의 면역반응 유도를 위한 조성으로 사용될 수 있다. 또한 백신에 추가될 있는 조성물로는 안정제, 불활화제, 항생제, 보존제, 등이 사용될 수 있다. 백신의 투여 경로에 따라 백신 항원은 증류수, 완충용액 등과도 혼합하여 사용될 수 있다.

상기 백신은 경구, 근육, 피하, 등의 투여경로를 통해 투여될 수 있으나 이에 한정되지 않으며, 바람직하게는 근육 투여경로를 통해 투여될 수 있다.

본 발명은 돼지에서 돼지 흉막폐렴균의 감염에 대한 보호성 면역 반응을 유도하는 방법으로서, 상기 불활화 백신 조성물을 포함함을 특징으로 하는 백신의 면역 유효량을 돼지에게 투여하는 단계를 포함하는 것인 보호성 면역 반응의 유도법을 제공한다.

상기 면역 반응은 백신 조성물 또는 이를 포함하는 백신 중에 포함된 항원 또는 항원들에 대해 특이적으로 지시된 항체, B 세포, 헬퍼 T 세포, 서프레서 T 세포, 세포독성 T 세포 및 감마-델타 T 세포의 생산 또는 활성화, 숙주에서 치료학적 또는 보호 면역학적 반응을 나타내어 새로운 감염에 대한 내성이 증진되거나 질환의 임상적 중증도가 감소되는 효과중 하나 이상을 포함하지만 이에 제한되지는 않는다. 바람직하게는 보호 면역 반응일 수 있다.

상기 보호는 감염된 숙주가 통상적으로 나타내는 임상적 징후의 감소 또는 부재, 보다 신속한 회복 시간 또는 보다 낮아진 지속시간 또는 감염된 숙주의 조직 또는 체액 또는 배설물에서 보다 낮은 균의 역가에 의해 입증된다.

상기에서 유효량은 면역 반응을 유도하여 돼지에서 흉막폐렴을 일으킬 수 있는 균의 감염의 빈도수 또는 이의 중증도를 감소시킬 수 있는 백신의 양을 의미하며, 당업자라면 적절하게 선택할 수 있다. 예를 들면, 유효량은 상기 불화화 백신 조성물을 포함하는 백신일 경우 불활화 박테린의 경우 각 혈청형에 대하여 1일당 1X10¹⁰ 내지 1X10⁷ cfu/ml, 바람직하게는 1일당 1X10⁸내 1X10⁹ cfu/ml 범위일 수 있다. 더욱 바람직하게는 1X10⁹cfu/ml 범위일 수 있다

상기에서 톡소이드(toxoid) 유효량은 면역 반응을 유도하여 돼지에서 흉막폐렴을 일으킬 수 있는 균의 감염의 빈도수 또는 이의 중증도를 감소시킬 수 있는 백신의 양을 의미하며, 당업자라면 적절하게 선택할 수 있다. 예를 들면, 유효량은 상기 불화화 백신 조성물을 포함하는 백신일 경우 불활화 박테린을 포함하는 경우 각 toxoid에 대하여 1일당 50 ug/ml에서 10 ug/ml 바람직하게는 1일당 4 ug/ml 에서 30 ug/ml 더욱 바람직하게는 20 ug/ml 수 있다.

다양한 혈청형에 대한 감염의 빈도수 또는 중증도를 감소시키고 면역 반응 유도법은 이것에 한정되는 것은 아니지만, 경구, 경피, 근육내, 복막내, 정맥내, 피하내 경로로 백신을 접종하는 것일 수 있다. 바람직하게는, 1차 및 2차 접종시 백신을 근육내 접종하는 것일 수 있다.

본 발명은 상기 불활화 박테린 및 각각의 톡소이드(toxoid)를 포함하는 돼지 흉막폐렴 불활화 백신 조성물을 제공한다.

본 발명은 상기 불활화 백신 조성물 및 면역강화제를 추가로 포함함을 특징으로 하는 백신을 제공한다.

불활화백신 조성물은 죽은 박테리아 또는 이의 활성 성분을 포함하는 조성물을 의미하는 것으로, 상기 조성물을 포함하는 백신은 당업계에 알려져 있는 방법에 의해 제조될 수 있다. 예를 들어, 박테리아가 높은 농도로 증식되면, 박테리아를 수득한 후 이들을 포르말린, 베타프로프리오락톤 (BPL), 이성분 에틸렌이민 (BEI) 또는 감마선으로 처리하거나, 당업자에게 공지된 기타 방법에 의해 비활성화시킨다. 이어서 비활성화된 바이러스를 제약상 허용 가능한 캐리어 (예컨대 염수 용액) 및 임의의 보조제와 함께 혼합한다. 바람직하게는 최종농도 0.1% 포르말린에서 불활화한 것일 수 있다. toxin의 경우도 마찬가지로 정제된 톡신을 포르말린, 베타프로프리오락톤 (BPL), 이성분 에틸렌이민 (BEI) 또는 감마선으로 처리하거나, 당업자에게 공지된 기타 방법에 의해 비활성화시킨다. 이어서 비활성화된 바이러스를 제약상 허용 가능한 캐리어 (예컨대 염수 용액) 및 임의의 보조제와 함께 혼합한다. 바람직하게는 최종농도 0.1% 포르말린에서 불활화한 것일 수 있다.

면역강화제 또는 어쥬번트(Adjuvant)는 면역반응의 향상 및 접종 후 항원의 흡수를 촉진하거나 방출하는 속도를 조절하고 많은 면역반응에 관련된 면역세포의 활성을 촉진시키기도 한다. 예를 들어 수산화 알루미늄, 광유 또는 다른 오일 또는 백신에 첨가되거나 이러한 추가의 성분에 의해 각각의 유도 후 신체에 의해 발생되는 보조 분자, 예를 들어 이에 제한되는 것은 아니지만 인터페론, 인터류킨 또는 성장인자이다.

본 발명은 돼지에서 돼지 흉막폐렴에 대한 보호성 면역 반응을 유도하는 방법으로서, 상기 불활화 백신 조성물을 포함함을 특징으로 하는 백신의 면역 유효량을 돼지에게 투여하는 단계를 포함하는 것인 보호성 면역 반응의 유도법을 제공한다.

본 발명의 백신 조성물 및 이를 포함하는 백신은 돼지 흉막폐렴 바이러스 감염을 예방하기 위한 키트, 즉 사용설명서와 함께 미리 지정된 양으로 포장된 조합에 사용될 수 있다. 상기 돼지 흉막폐렴 바이러스 감염 예방용 조성물은 당업계에 임의로 알려진 형태, 예를 들면 액제 및 주사제의 형태 또는 현탁액에 적합한 고체 형태일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 또한, 그 형태에 따라 필요한 경우 용해 시 적절한 농도를 갖는 용액을 제공하게 될 부형제를 포함할 수 있다.

이하 본 발명을 실시예에 의하여 더욱 상세하게 설명한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 국한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

통계분석

모든 data는 SD 값으로 표시되었으며 data 분석은 SPSS version 16.0 software(SPSS, Chicago, IL)를 사용하였으며 백신 접종 그룹과 비접종 그룹간의 통계적 분석은 student t test를 이용하여 분석하였으며 통계적 유의성은 p<0.05로 결정하였다.

<실시예 1>

박테리아 혈청형과 성장 조건

흉막폐렴 증상을 보이는 야외 분리주 악티노바실루스 플뢰로뉴모니애 혈청형 2(Actinobacillus pleuropneumoniae serotype 2; HJL67)와 악티노바실루스 플뢰로뉴모니애 혈청형(A. pleuroneumoniae serotype 5; HJL263) 로부터 ApxIA, ApxIIA 그리고 ApxIIIA의 N 또는 C fragment 유전자를 클로닝 하였으며 HJL67 균주와HJL263 균주를 Tryptic soy borth(50 ug/ml β-NAD)에서 배양하여 포르말린 0.3 %로 불활화하여 박테린 항원으로 사용하였으며 같은 혈청형(serotype)의 균주는 농림축산검역본부에서 병원성 균주를 분양 받아 공격시험에 사용하였다.

<실시예 2>

ApxIA, ApxIIA, ApxIIIA toxin의 N 또는 C fragment 발현 재조합 대장균주의 제작 및 toxin fragment의 정제

상기 실시예 1에서 클로닝한 각각의 ApxIA, IIA 그리고 IIIA에 대한 N 또는 C fragment 유전자는 악티노바실루스 플뢰로뉴모니애 혈청형 2(Actinobacillus pleuropneumoniae serotype 2)와 악티노바실루스 플뢰로뉴모니애 혈청형 5(Actinobacillus pleuropneumoniae serotype 5)형의 게놈(genome)으로부터 각각의 유전자에 맞는 PCR 프라이머를 이용해 증폭하였다(표 3 참조). 각각의 유전자는 적절한 제한효소로 잘려 pET21a 플라스미드 벡터(plasmid vector)에 클로닝(cloning) 하였다. 각각의 유전자가 삽입된 pET21a 플라스미드 DNA(plasmid DNA)는 E. coli BL21에 형질전환(transformation)하여 HJL401, HJL402, HJL403, HJL411, HJL412 그리고 HJL413으로 명명하였다. 각각의 APX toxin의 N 또는 C 조각(fragment)은 nitrilotriacetic acid agarose(Qiagen , USA)를 이용하여 affinity 정제 과정을 거쳐 정제하였다. 정제된 N 또는 C toxin fragment는 SDS-PAGE(sodium dodesyl sulfate-polyacrylamide을 이용하여 확인하였다. 모든 정제된 toxin 항원은 -70 ℃ 에 보관하였다.

본 발명에서 사용된 균주와 사용 벡터

Strain/plasmid	Description	Source of reference
Strains E. coli
BL21(DE3)pLysS	F,ompT, hsdS_B(r_B,m_B),dcm, gal, λ(DE3), pLysS, Cm^r	Lab stock
HJL401	E. coli BL21 with pET21a-ApxIA C-terminal	This study
HJL402	E. coli BL21 with pET21a-ApxIIA C-terminal	This study
HJL403	E. coli BL21 with pET21a-ApxIIIA C-terminal	This study
HJL411	E. coli BL21 with pET21a-ApxIA N-terminal	This study
HJL412	E. coli BL21 with pET21a-ApxIIA N-terminal	This study
HJL413	E. coli BL21 with pET21a-ApxIIIA N-terminal	This study
A. pleuropneumoniae
HJL67	Actinobacillus pleuropneumoniae serotype 2	Lab stock
HJL263	Actinobacillus pleuropneumoniae serotype 5	Lab stock
Plasmids
pET21a	IPTG-inducible expression vector; Km^r	Novagen

각 독소의 N 말단과 C말단의 클로닝을 위해 사용된 프라이머 서열

Name	Sequence(5′→3′)	Size (bp)	Accession number	Reference
Apx IAN-F(서열번호 1)	GGATCCCAAGCAGGGCAG	1035	GQ369732	This study
Apx IAN-R(서열번호 2)	GTCGACAGCCCCAACACC
Apx IIAN-F(서열번호 3)	CGGGATCCACACTGAAGAAT	1005	AY736188	This study
Apx IIAN-R(서열번호 4)	TGTCGACAATAGTTCCTGTCTCAC
Apx IIIAN-F(서열번호 5)	CGGGATCCGCAAAATTACAAGC	1039	X68815	This study
Apx IIIAN-R(서열번호 6)	GTCGACTGTACTAATTGTAGTAATTGAGGC
Apx IAC-F(서열번호 7)	CGGGATCCGGTATTATTTCA	1293	GQ369732	This study
Apx IAC-R(서열번호 8)	GTCGACAGTACCATCGCTGC
Apx IIAC-F(서열번호 9)	ATTCGGATCCCAAGGTTATGA	1110	AY736188	This study
Apx IIAC-R(서열번호 10)	GCTTGTCGACTGTAATAGAATCATTT
Apx IIIAC-F(서열번호 11)	GGGATCCGCACCAATTACTTT	1293	X68815	This study
Apx IIIAC-R(서열번호 12)	TGTCGACAAGCACATTAAAACC
HPF(서열번호 13)	AAG GTT GAT ATG TCC GCA CC	956	AB007587.1	Jessing et al., 2003
HPR(서열번호 14)	CAC CGA TTA CGC CTT GCC A
Ap2F(서열번호 15)	ACT ATG GCA ATC AGT CGA TTC AT	482	AY357726.1	Jessing et al., 2003
Ap2R(서열번호 16)	CCT AAT CGG AAA CGC CAT TCT G
Ap5F(서열번호 17)	TTT ATC ACT ATC ACC GTC CAC ACC T	1107	AF053723.1	Jessing et al., 2003
Ap5R(서열번호 18)	CAT TCG GGT CTT GTG GCT ACT AA

본 발명의 N 말단과 C말단 염기서열

Name	Sequence(5′→3′)
Apx IA - N 말단 조각 (서열번호 19)
Apx IIA - N 말단 조각 (서열번호 20)	ACACTGAAGAATGGTTTAACTCAAACTGGTCATTCTCTACAGAATGGGGCTAAAAAATTAATCTTATATATTCCTCAAGGCTATGATTCGGGTCAAGGAAATGGAGTTCAAGATTTAGTTAAAGCTGCTAATGATTTAGGTATTGAAGTATGGCGAGAAGAACGCAGCAATTTGGACATTGCAAAAACTAGCTTTGATACAACTCAGAAAATTCTAGGTTTTACTGATAGAGGAATTGTATTATTTGCACCTCAGCTAGATAATTTATTAAAGAAGAATCCTAAAATTGGCAATACATTAGGAAGTGCTTCTAGCATCTCACAAAATATAGGTAAAGCCAATACTGTATTAGGTGGTATTCAATCTATTTTAGGATCTGTTTTATCTGGAGTAAATCTGAATGAATTACTTCAAAATAAAGATCCTAATCAATTAGAACTTGCAAAAGCAGGGCTAGAACTGACTAATGAATTAGTTGGTAATATTGCTAGCTCGGTGCAAACTGTAGATGCATTTGCAGAACAAATATCTAAACTAGGTTCACATTTACAGAATGTGAAAGGATTAGGAGGATTGAGTAATAAATTACAAAATCTACCAGATCTAGGAAAAGCAAGTTTAGGTTTGGACATTATCTCTGGTTTACTTTCTGGAGCATCTGCAGGTCTCATTTTAGCAGATAAAGAGGCTTCAACAGAAAAGAAAGCTGCCGCAGGTGTAGAATTTGCTAACCAAATTATAGGTAATGTAACAAAAGCGGTCTCATCTTACATTCTTGCCCAACGAGTCGCTTCAGGTTTGTCTTCAACTGGTCCTGTCGCTGCATTAATCGCATCTACAGTTGCACTAGCTGTTAGCCCTCTTTCATTCTTAAATGTAGCTGATAAGTTTAAACAAGCTGATTTAATCAAATCATATTCTGAACGCTTCCAAAAATTAGGATATGATGGAGATCGTTTATTAGCTGATTTTCACCGTGAGACAGGAACTATT
Apx IIIA - N 말단 조각 (서열번호 21)
Apx IA - C 말단 조각 (서열번호 22)	GAAAGGCGATGATGAAATCTACGGTAATGACGGCCACGATATCTTATACGGAGACGACGGTAATGATGTAATCCATGGCGGTGACGGTAACGACCATCTTGTTGGTGGTAACGGAAACGACCGATTAATCGGCGGAAAAGGTAATAATTTCCTTAATGGCGGTGATGGTGACGATGAGTTGCAGGTCTTTGAGGGTCAATACAACGTATTATTAGGTGGTGCGGGTAATGACATTCTGTATGGCAGCGATGGTACT
Apx IIA - C 말단 조각 (염기서열 23)	CTCGGGAGGTAAAGATAATGATATTTATGTCCATAAAACAGGCGATGGAAATGATTCTATTACA
Apx IIIA - C 말단 조각 (염기서열 24)	ATTTAAAGGTAGTAAATTCAGAGATATTTTCCATGGTGCCGATGGTGATGATCTATTAAATGGTAATGATGGGGATGATATTCTATACGGTGATAAAGGTAACGATGAGTTAAGAGGTGATAACGGTAACGACCAACTTTATGGTGGTGAAGGTGATGACAAACTATTAGGAGGTAATGGCAATAATTACCTCAGTGGTGGTGATGGCAATGATGAGCTTCAAGTATTAGGCAATGGTTTTAATGTGCTT

< 실시예 3>

박테린과 변성독소( Toxoid ) 혼합 백신의 제조

포르말린(Formalin) 불활화 박테린 악티노바실루스 플뢰로뉴모니애 혈청형 2형(HJL67)과 악티노바실루스 플뢰로뉴모니애 혈청형 5형(HJL263)은 불활화 이후 초콜릿한천(chocolate agar)에서 불활화가 되었음을 확인하였고 박테린의 농도를 1×10^9. ⁰cfu/ml로 조정하여 변성독소(toxoid)의 N 또는 C fragment와 조합하여 다양한 조합의 백신을 만들었으며 박테린과 혼합된 변성독소(toxoid)의 양은 변성독소(toxoid) 종류에 따라 N 과 C fragment 각각 20 μg/ml 로 첨가하였다. 최종 어쥬번트(adjuvant) 의 종류와 농도는 10 mg/ml의 수산화알루미늄(aluminium hydroxide)을 첨가하였으며 접종은 근육 접종을 통해 시행하였다.

< 실시예 4>

백신 접종과 sample 채취

50마리의 요크셔(yorkshire) 자돈을 5개 그룹으로 나누어 따로 격리하여 사육하면서 백신접종에 의한 항체 생성 및 공격접종 시험을 실시하였다. 백신 접종 시기는 4주령과 6주령 1번에 걸쳐 2 ml을 근육접종으로 실시하였다.

그룹A의 경우 멸균 PBS 2 ml을 접종하였으며 그룹 B에서 그룹 E 까지는 표4에 나타낸바와 같이 각각의 조합에 따라 백신을 2주 간격으로 접종하였다.

본 발명의 도전감염 후 그룹별 방어 효능

Group	Immunization		Challenge
	Immunization		No. of pigs used	No. of dead pigs	Isolation of challenge strain
	Prime	Booster	No. of pigs used	No. of dead pigs	Organ	No. of infected lung^a
A	PBS	PBS	10	0	Lung	8/10
B	Bacterins	Bacterins	10	0	Lung	2/10
C	Bacterins & individual N-terminal fragments of Apx toxins	Bacterins & individual N-terminal fragments of Apx toxins	10	0	Lung	0/10
D	Bacterins & individual C-terminal fragments of Apx toxins	Bacterins & individual C-terminal fragments of Apx toxins	10	0	Lung	0/10
E	Bacterins & individual N- and C-terminal fragments of Apx toxins	Bacterins & individual N- and C-terminal fragments of Apx toxins	10	0	Lung	0/10
^a The number of infected organs/the number of tested organs. * Bacterin : 균 자체를 항원으로 사용하는 백신 * individual N-terminal fragment of Apx toxins : 표2 에 나오는 재조합단백질 발현하는 균주에서 발현된 항원 단백질 * individual N-terminal fragment of Apx toxins : Apx I, II, III 의 각각 N-terminal fragment * E 그룹은 bacterin과 Apx I, II, III 의 N-terminal, C-terminal fragment 가 모두 포함된 것

백신 접종 후 백신 접종에 의한 면역반응 평가를 위해 백신 접종 0, 2, 4주후에 혈액을 채취하여 혈청에 대한 항체가를 측정하였다.

악티노바실루스 플뢰로뉴모니애 혈청형 2형(HJL67)과 악티노바실루스 플뢰로뉴모니애 혈청형 5형(HJL263) 세포외막 단백질에 특이적인 IgG titer(항체가)를 측정하기 위하여 ELISA 실험은 VDProSwine Respiratory ELISA system AP2-AB, AP5-AB(MEDIAN DiagnosticsInc.) kit를 사용하였다. ApxIA, ApxIIA 그리고 ApxIIIA에 대한 혈중 IgG 항체가를 측정하기 위해 정제된 재조합 N 또는 C fragment 250 ng/ml을 100 ul씩 ELISA 측정용 96 well plate에 코팅(coating) 하여 일반적인 ELISA측정 방법에 따라 항체가를 측정하였다. 최초 혈청 샘플은 PBS로 1/100으로 희석하여 10배씩 연속희석법(serial dilution) 방법으로 희석하여 최종 항체가를 측정하여 결정하였다.

도 1에서 나타난바와 같이 각각의 혈청형에 대한 항원에 대한 항체 반응은 백신 접종 후 2주 후부터 증가하여 그룹 C와 그룹 E에서 증가하는 것을 관찰할 수 있었다. 이것은 재조합 ApxiA, ApxIIA, ApxIIIA이 혼합된 백신의 면역 반응이 더 효과적인 것을 확인하였다.

<실시예 5>

공격접종을 통한 방어력 시험

공격 접종은 백신항원으로 사용된 APP serotype 2형과 그리고 5형과 같은 야외 분리주 Serotype 2형 그리고 serotype5 형(농림축산검역본부 제공)을 백신 접종 후 4주 후에 5 ×10^9.0 cfu/2 ml 농도로 비강 접종하였다. 대조군은 멸균 PBS 2 ml을 같은 방법으로 접종하였다. 공격접종 후 모든 자돈은 매일 관찰하였으며 이상 반응 또는 이상행동을 7일간 관찰하였다. 비정상적인 육안 관찰 소견을 보이는 모든 돼지는 안락사 시킨 후 폐 조직을 검사하여 공격 접종균을 검사하였으며 분리된 균은 초콜릿한천(chocolate agar)에 배양한 후 APP serotype 2형 또는 5형에 일치하는 프라이머(primer) 를 이용하여 PCR 검사로 혈청형을 검사하였다.

백신 접종 후 4주후에 각각의 그룹에 모든 돼지에게 공격 접종을 실시한 후 그룹 A에서 관찰 기간 동안 2마리가 폐사하였으며 나머지 6마리는 전형적인 흉막폐렴 육안 소견을 보였으며 부검 후 8마리에서 공격접종 한 2현 5형 균주가 검출되었다. 불활화 박테린만을 접종한 그룹 B에서는 관찰기간 동안 1마리가 폐사하였으며 추가적으로 1마리가 전형적인 흉막폐렴 증상을 보여 검사한 결과 2마리에서 공격접종 균주가 검출되었다. 그리고 제조한 변성독소(toxoid)를 첨가한 그룹에서는 공격 접종 후 흉막폐렴 증상이나 균 검출도 되지 않아 기존의 박테린을 이용한 불활화 백신보다 효능이 우수함을 확인하였다.

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<110> WOOGENE B&G CO., LTD. <120> Inactivated vaccine composition of Actinobacillus pleuroneumoniae inactivated bacterin and N or C fragments of Actinobacillus pleuroneumniae ApxIA, ApxIIA, ApxIIIA inactivated toxin <130> PN1603-104 <160> 24 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Apx IAN-F <400> 1 ggatcccaag cagggcag 18 <210> 2 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Apx IAN-R <400> 2 gtcgacagcc ccaacacc 18 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Apx IIAN-F <400> 3 cgggatccac actgaagaat 20 <210> 4 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Apx IIAN-R <400> 4 tgtcgacaat agttcctgtc tcac 24 <210> 5 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Apx IIIAN-F <400> 5 cgggatccgc aaaattacaa gc 22 <210> 6 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Apx IIIAN-R <400> 6 gtcgactgta ctaattgtag taattgaggc 30 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Apx IAC-F <400> 7 cgggatccgg tattatttca 20 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Apx IAC-R <400> 8 gtcgacagta ccatcgctgc 20 <210> 9 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Apx IIAC-F <400> 9 attcggatcc caaggttatg a 21 <210> 10 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Apx IIAC-R <400> 10 gcttgtcgac tgtaatagaa tcattt 26 <210> 11 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Apx IIIAC-F <400> 11 gggatccgca ccaattactt t 21 <210> 12 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Apx IIIAC-R <400> 12 tgtcgacaag cacattaaaa cc 22 <210> 13 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HPF <400> 13 aaggttgata tgtccgcacc 20 <210> 14 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HPR <400> 14 caccgattac gccttgcca 19 <210> 15 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Ap2F <400> 15 actatggcaa tcagtcgatt cat 23 <210> 16 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Ap2R <400> 16 cctaatcgga aacgccattc tg 22 <210> 17 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Ap5F <400> 17 tttatcacta tcaccgtcca cacct 25 <210> 18 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Ap5R <400> 18 cattcgggtc ttgtggctac taa 23 <210> 19 <211> 1023 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Apx IA-N fragment <400> 19 caagcagggc agaaattaat tttatatatt ccgaaagatt atcaagctag taccggctca 60 agtcttaatg atttagtgaa agcggcggag gctttaggga tcgaagtaca tcgctcggaa 120 aaaaacggta ccgcactagc gaaagaatta ttcggtacaa cggaaaaact attaggtttc 180 tcggaacgag gcatcgcatt atttgcacct cagtttgata agttactgaa taagaaccaa 240 aaattaagta aatcgctcgg cggttcatcg gaagcattag gacaacgttt aaataaaacg 300 caaacggcac tttcagcctt acaaagtttc ttaggtacgg ctattgcggg tatggatctt 360 gatagcctgc ttcgtcgccg tagaaacggt gaggacgtca gtggttcgga attagctaaa 420 gcaggtgtgg atctagccgc tcagttagtg gataacattg caagtgcgac gggtacggtg 480 gatgcgtttg ccgaacaatt aggtaaattg gcaatgcctt atctaacact cgcattaagc 540 ggtttagcaa gtaagttaaa 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ttcaaaaaat tgggctatga cggcgataaa 960 ctactttcag agttttatca cgaagctggt actattgatg cctcaattac tacaattagt 1020 aca 1023 <210> 22 <211> 1281 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Apx IA-C fragment <400> 22 ggtattattt caggtatttt agatgcttct aaacaggcaa tcttcgaacg agttgcaacg 60 aaattagcga ataagattga cgaatgggag aaaaaacacg gtaaaaacta ttttgaaaac 120 ggttatgacg cccgccattc cgcattctta gaagatacct ttgaattgtt atcacaatac 180 aataaagagt attcggtaga gcgtgtcgtt gctattacgc aacagcgttg ggatgtcaat 240 atcggggaac ttgccggtat cacgcgtaaa ggtgcggatg cgaaaagcgg taaggcttat 300 gtcgatttct ttgaagaagg aaaattgtta gagaaagatc cggatcgttt tgataaaaaa 360 gtgtttgatc cgcttgaagg caaaatcgac ctttcttcaa ttaacaaaac cactttattg 420 aaatttatta caccggtttt taccgcaggt gaagagattc gtgagcgtaa gcaaaccggt 480 aaatacgaat atatgaccga attattcgtt aaaggtaaag aaaaatgggt ggtaaccggt 540 gtggagtcac ataatgcgat ttatgactat acgaatctta tccaattagc gatagataaa 600 aaaggtgaaa aacgtcaagt gaccattgaa tctcatttgg gtgagaaaaa tgatcgtata 660 tatctttcat ccggttcatc tatcgtatat gcgggtaacg gacatgatgt agcatattac 720 gataaaaccg atacaggtta cttaacattt gacggacaaa gtgcacagaa agccggtgaa 780 tatattgtca ctaaagaact taaagctgat gtaaaagttt taaaagaagt ggttaaaact 840 caggatattt cagttggaaa aacgtgcagt gaaaaattag aatatcgtga ttatgagtta 900 agcccattcg aacttgggaa cggtatcaga gctaaagatg aattacattc tgttgaagaa 960 attatcggta gtaatcgtaa agacaaattc tttggtagtc gctttaccga tattttccat 1020 ggtgcgaaag gcgatgatga aatctacggt aatgacggcc acgatatctt atacggagac 1080 gacggtaatg atgtaatcca tggcggtgac ggtaacgacc atcttgttgg tggtaacgga 1140 aacgaccgat taatcggcgg aaaaggtaat aatttcctta atggcggtga tggtgacgat 1200 gagttgcagg tctttgaggg tcaatacaac gtattattag gtggtgcggg taatgacatt 1260 ctgtatggca gcgatggtac t 1281 <210> 23 <211> 1089 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Apx IIA-C fragment <400> 23 caaggttatg attctcgtca tttagctgat ttacaagaca atatgaagtt tcttatcaat 60 ttaaataaag aacttcaggc tgaacgcgta gtagctatta cccaacaaag atgggataac 120 caaattggag acctagcggc aattagccgt agaacggata aaatttccag tggaaaagct 180 tatgtggatg cttttgagga ggggcaacac cagtcctacg attcatccgt acagctagat 240 aacaaaaacg gtattattaa tattagtaat acaaatagaa agacacaaag tgttttattc 300 agaactccat tactaactcc aggtgaagag aatcgggaac gtattcagga aggtaaaaat 360 tcttatatta caaaattaca tatacaaaga gttgacagtt ggactgtaac agatggtgat 420 gctagctcaa gcgtagattt cactaatgta gtacaacgaa tcgctgtgaa atttgatgat 480 gcaggtaaca ttatagaatc taaagatact aaaattatcg caaatttagg tgctggtaac 540 gataatgtat ttgttgggtc aagtactacc gttattgatg gcggggacgg acatgatcga 600 gttcactaca gtagaggaga atatggcgca ttagttattg atgctacagc cgagacagaa 660 aaaggctcat attcagtaaa acgctatgtc ggagacagta aagcattaca tgaaacaatt 720 gccacccacc caacaaatgt tggtaatcgt gaagaaaaaa ttgaatatcg tcgtgaagat 780 gatcgttttc atactggtta tactgtgacg gactcactca aatcagttga agagatcatt 840 ggttcacaat ttaatgatat tttcaaagga agccaatttg atgatgtgtt ccatggtggt 900 aatggtgtag acactattga tggtaacgat ggtgacgatc atttatttgg tggcgcaggc 960 gatgatgtta tcgatggagg aaacggtaac aatttccttg ttggaggaac cggtaatgat 1020 attatctcgg gaggtaaaga taatgatatt tatgtccata aaacaggcga tggaaatgat 1080 tctattaca 1089 <210> 24 <211> 1275 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Apx IIIA-C fragment <400> 24 gcaccaatta ctttgttggt tactggtatc acaggattaa tttctggtat tttagagttc 60 tctaaacaac caatgttaga tcatgttgca tcgaaaattg gtaacaaaat tgacgaatgg 120 gagaaaaaat acggtaaaaa ttacttcgag aatggctatg atgctcgtca taaagctttc 180 ttagaagatt cattctcatt attgtctagt tttaataaac aatatgaaac tgaaagagct 240 gttttaatta cacaacaacg ttgggatgaa tatattggcg aacttgcggg tattactggt 300 aaaggtgaca aactctctag tggtaaggcg tatgtagatt actttcaaga aggtaaatta 360 ttagagaaaa aacctgatga ctttagcaaa gtagttttcg atccaactaa gggcgaaatt 420 gatatttcaa atagccaaac gtcaacgttg ttaaaatttg ttacgccatt attaacacca 480 ggtacagagt cacgtgaaag aactcaaaca ggtaaatatg aatatatcac gaagttagtt 540 gtaaaaggta aagataaatg ggttgttaat ggcgttaaag ataaaggtgc cgtttatgat 600 tatactaatt taattcaaca tgctcatatt agttcatcag tagcacgtgg tgaagaatac 660 cgtgaagttc gtttggtatc tcatctaggc aatggtaatg acaaagtgtt cttagctgcg 720 ggttccgcag aaattcacgc tggtgaaggt catgatgtgg tttattatga taaaaccgat 780 acaggtcttt tagtaattga tggaaccaaa gcgactgaac aagggcgtta ttctgttacg 840 cgcgaattga gtggtgctac aaaaatcctg agagaagtaa taaaaaatca aaaatatgct 900 gttggtaaac gtgaagaaac cttggaatat cgtgattatg aattaacgca atcaggtaat 960 agtaacctaa aagcacatga tgaattacat tcagtagaag aaattggaag taatcagaga 1020 gacgaattta aaggtagtaa attcagagat attttccatg gtgccgatgg tgatgatcta 1080 ttaaatggta atgatgggga tgatattcta tacggtgata aaggtaacga tgagttaaga 1140 ggtgataacg gtaacgacca actttatggt ggtgaaggtg atgacaaact attaggaggt 1200 aatggcaata attacctcag tggtggtgat ggcaatgatg agcttcaagt attaggcaat 1260 ggttttaatg tgctt 1275

Claims

서열번호 19로 이루어진 ApxIA 독소의 N 말단 조각(fragment);
서열번호 20으로 이루어진 ApxIIA 독소의 N 말단 조각(fragment);
서열번호 21로 이루어진 ApxIIIA 독소의 N 말단 조각(fragment);
서열번호 22로 이루어진 ApxIA 독소의 C 말단 조각(fragment);
서열번호 23으로 이루어진 ApxIIA 독소의 C 말단 조각(fragment); 및
서열번호 24로 이루어진 ApxIIIA 독소의 C 말단 조각(fragment);으로 이루어진 말단 조각 재조합 항원; 및
불활화된 돼지 흉막폐렴균 박테린을 포함하는 돼지 흉막폐렴 예방 또는 치료용 불활화 백신 조성물.
삭제
제1항에 있어서,
상기 ApxIA N 말단 조각(fragment) 재조합 항원은 E. coli 균주(수탁번호 : KCTC 12983BP), ApxIA C 말단 조각(fragment) 재조합 항원은 E. coli 균주(수탁번호 : KCTC 12980BP), ApxIIA N 말단 조각(fragment) 재조합 항원은 E. coli 균주(수탁번호 : KCTC 12984BP), ApxIIA C 말단 조각(fragment) 재조합 항원은 E. coli 균주(수탁번호 : KCTC 12981BP), ApxIIIA N 말단 조각(fragment) 재조합 항원은 E. coli 균주(수탁번호 : KCTC 12985BP) 및 ApxIIIA C 말단 조각(fragment) 재조합 항원은 E. coli 균주(수탁번호 : KCTC 12982BP) 으로부터 생산한 재조합 항원인 것을 특징으로 하는 돼지 흉막폐렴 예방 또는 치료용 불활화 백신 조성물.
제1항에 있어서,
상기 불활화된 돼지 흉막폐렴균 박테린은 포르말린을 이용하여 불활화 시킨 것을 특징으로 하는 돼지 흉막폐렴 예방 또는 치료용 불활화 백신 조성물.
제1항에 있어서,
상기 불활화 백신 조성물은 면역강화제를 추가로 포함함을 특징으로 하는 돼지 흉막폐렴 예방 또는 치료용 불활화 백신 조성물.
돼지 흉막폐렴균을 불활화시키는 단계; 및 상기 불활화된 돼지 흉막폐렴균에 제1항의 재조합 항원을 혼합시키는 단계를 포함하는 돼지 흉막폐렴 예방 또는 치료용 불활화 백신 제조방법.
제6항에 있어서,
추가적으로 수산화알루미늄(aluminium hydroxide)을 어쥬번트(adjuvant)로 첨가하여 혼합하는 것을 특징으로 하는 돼지 흉막폐렴 예방 또는 치료용 불활화 백신 제조방법.
제6항에 있어서,
상기 돼지 흉막폐렴균을 불활화시키는 단계는 포르말린을 이용하여 불활화 시킨 것을 특징으로 하는 돼지 흉막폐렴 예방 또는 치료용 불활화 백신 제조방법.
제6항에 있어서,
상기 ApxIA N 말단 조각(fragment) 재조합 항원은 E. coli 균주(수탁번호 : KCTC 12983BP), ApxIA C 말단 조각(fragment) 재조합 항원은 E. coli 균주(수탁번호 : KCTC 12980BP), ApxIIA N 말단 조각(fragment) 재조합 항원은 E. coli 균주(수탁번호 : KCTC 12984BP), ApxIIA C 말단 조각(fragment) 재조합 항원은 E. coli 균주(수탁번호 : KCTC 12981BP), ApxIIIA N 말단 조각(fragment) 재조합 항원은 E. coli 균주(수탁번호 : KCTC 12985BP), ApxIIIA C 말단 조각(fragment) 재조합 항원은 E. coli 균주(수탁번호 : KCTC 12982BP) 으로부터 생산한 재조합 항원인 것을 특징으로 하는 돼지 흉막폐렴 예방 또는 치료용 불활화 백신 제조방법.
제1항의 백신 조성물을 근육 또는 피하 경로를 통해 투여하는 것을 특징으로 하는 돼지 흉막폐렴 예방방법.