KR101818816B1

KR101818816B1 - 효모 세포주를 이용한 로타바이러스의 바이러스 유사입자 생산 및 정제 방법

Info

Publication number: KR101818816B1
Application number: KR1020150136207A
Authority: KR
Inventors: 김원용; 김성근; 김예나
Original assignee: 중앙대학교 산학협력단
Priority date: 2015-09-25
Filing date: 2015-09-25
Publication date: 2018-01-17
Anticipated expiration: 2035-09-25
Also published as: KR20170037708A

Abstract

본 발명은 효모 세포주를 이용한 로타바이러스의 바이러스 유사입자 생산 방법 및 정제 방법에 관한 것이다.
본 발명에서는, 효모 기반 체계에서 로타바이러스의 주요 구조 단백질(VP2, VP6, VP7)을 동시에 발현시킴으로써 삼중층의 자가-조립된 바이러스 유사 입자를 생산하였으며, 발현 유도 조건을 최적화하여 상기 재조합 단백질들의 발현양을 증대시켰을 뿐만 아니라, 재조합 단백질들의 용해도를 높일 수 있는 세포파쇄 완충액(Cell lysis buffer)의 조성 변화에 따른 우수한 정제 효율을 확인하였는바, 로타바이러스 감염증의 예방 및 치료에 다양하게 이용될 수 있을 것으로 기대된다.

Description

효모 세포주를 이용한 로타바이러스의 바이러스 유사입자 생산 및 정제 방법 {Method for Producing and Purifying Virus-Like Particle of Rotavirus using Yeast strain}

본 발명은 효모 세포주를 이용한 로타바이러스의 바이러스 유사입자 생산 및 정제방법에 관한 것이다.

로타바이러스(Human Rotavirus, HRV)는 영유아에서 설사를 유발하는 주요 바이러스로서 한국을 비롯해 전 세계의 5세 이하 소아 95％가 적어도 한 번 이상 감염되며, 전 세계적으로 매년 발생하는 설사 환자의 약 40％를 차지하는 것으로 알려져 있다. 또한, 미국 질병관리본부(CDC)의 보고에 따르면 로타바이러스 설사증으로 미국에서 소요되는 의료비만도 1년에 1천만 달러에 달하며, 국내의 경우 급성 장염으로 입원하는 영유아 환자의 70％가 로타바이러스 감염에 기인하는 것으로 알려져 있다. 따라서 세계보건기구(WHO)는 개발도상국에서는 로타바이러스 발생을 감소시키고 선진국에서는 의료비의 절감을 목표로 로타바이러스에 대한 백신 개발을 최우선 과제로 삼고 있는 실정이다.

로타바이러스는 피막이 없고, 직경 75nm의 정 20면체 형태로 외부 캡시드(outer capsid), 내부 캡시드(inner capsid), 코어 단백질(core protein)의 3중층 단백질 캡시드(triple layered protein capsid)로 구성되어 있으며, 11개의 분절로 구성되어 있다. 각각의 분절은 6개의 구조 단백질(VP1, VP2, VP3, VP4, VP6, VP7)과 6개의 비구조 단백질(NSP 1-6) 중 하나를 암호화하고 있다. 로타바이러스는 VP6의 항원성에 따라 A군으로부터 G군까지 7개군으로 분류되고, 전 세계적으로 가장 흔한 A군은 다시 면역원성 단백인 VP7에 의한 G형(Glycoprotein type)과 VP4에 의한 P형(Protease-sensitive type)으로 세분될 수 있으며, 현재 23종의 G형과 32종의 P형이 보고되어 있다. 사람에서는 G1-G4, G6, G8-G10과 G12 등 9개 혈청형과 P[3], P[4], P[6], P[8]-P[11]과 P[14] 등 8개 유전자형이 감염을 일으키며 각 혈청형들은 서로 교차방어가 되지 않는 특징이 있다.

모든 혈청형간 교차 방어가 되지 않는 로타바이러스의 특징으로 인하여 각 혈청형에 대한 감염을 보호할 수 있는 효과적인 로타바이러스 백신의 개발이 요구되어 왔다. 현재까지 경구용 약독화 생백신과 동물-사람 재조합 백신을 사용하였으나 다른 혈청형의 감염에 대하여 충분한 방어능을 보여주지 못하고 있다, 미국 와이어스-아이어스트(Wyeth-Ayerst)사에서 개발한 Rotashield는 발생률이 가장 높은 G혈청형(G1~G4)을 혼합한 4가 약독화 생백신으로 FDA 승인을 받아 기본 접종에 포함되었으나 장 중첩 환자가 발생하여 사용이 중단된 상태이다. 이에, 새로운 백신의 소재로서 바이러스 유사입자(VLP)에 대한 관심이 증대되고 있으며, 다양한 연구가 이루어 지고 있다. 현재, 대장균(Escherichia coli) 발현 시스템 또는 곤충세포를 이용한 배큘로바이러스(Baculovirus) 발현 시스템이 주로 이용되고 있으나, 대장균 등의 원핵세포 발현계에서는 내독소를 가지고 있으며, 자연형과 유사한 바이러스 단백질 입자를 생산하기 어려워 항원성을 제대로 나타내지 못하며, 곤충세포를 이용한 경우에는 배양과정 중 오염 위험과 정제의 어려움 및 높은 생산비용과 낮은 수율로 인해 만족할 만한 생산 효과를 얻지 못하는바, 로타바이러스 백신으로 활용함에 있어서 한계가 있었다.

이에, 바이러스 유사입자(VLP)를 안정적이면서 효율적으로 생산하기 위한 방법에 대한 연구가 이루어지고 있으나(한국 특허공개번호 10-2015-0045191), 아직은 미비한 실정이다.

본 발명은 상기와 같은 문제점을 해결하기 위해 안출된 것으로서, 본 발명자들은 효모 기반 체계에서 로타바이러스의 바이러스 구조 단백질인 VP2, VP6, VP7을 동시에 발현시킨 바이러스 유사입자를 생산하였다. 또한, 로타바이러스의 바이러스 유사입자 생산 공정에서, 생산 수율을 증가시킬 수 있는 배양 및 정제 조건에 대해 연구한 결과, 발현 유도 조건 변화에 따른 단백질 발현량 증대 및 세포파쇄 완충액 조성 변화에 따른 정제 효율 증진 효과를 확인하고, 이에 기초하여 본 발명을 완성하게 되었다.

이에, 본 발명의 목적은 a) 로타바이러스 구조 단백질이 발현되도록 효모 세포를 형질전환하는 단계; b) 상기 형질전환된 효모 세포를 메탄올이 첨가된 배지에서 배양하는 단계; c) 상기 배양된 효모 세포를 용해시켜 세포 용해물을 얻는 단계; 및 d) 상기 세포 용해물로부터 로타바이러스의 바이러스 유사입자를 분리 및 정제하는 단계 포함하는 로타바이러스(Rotavirus)의 바이러스 유사입자(virus-like particle, VLP)의 생산 및 정제방법을 제공하는 것이다.

또한, 본 발명의 다른 목적은 상기 방법에 의해 생산 및 정제된 로타바이러스의 바이러스 유사입자를 제공하는 것이다.

또한, 본 발명의 또 다른 목적은 상기 로타바이러스의 바이러스 유사입자를 포함하는, 면역원성 조성물을 제공하는 것이다.

그러나 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.

상기와 같은 본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 a) 로타바이러스 구조 단백질이 발현되도록 효모 세포를 형질전환하는 단계; b) 상기 형질전환된 효모 세포를 메탄올이 첨가된 배지에서 배양하는 단계; c) 상기 배양된 효모 세포를 용해시켜 세포 용해물을 얻는 단계; 및 d) 상기 세포 용해물로부터 로타바이러스의 바이러스 유사입자를 분리 및 정제하는 단계 포함하는 로타바이러스(Rotavirus)의 바이러스 유사입자(virus-like particle, VLP)의 생산 및 정제방법을 제공한다.

본 발명의 일 구현예로서, 상기 단계 a)는 서열번호 1로 표시되는 pPIC6-CAU200 VP2 벡터, 서열번호 2로 표시되는 pPICZ-CAU200 VP6 벡터, 및 서열번호 3으로 표시되는 pPIC3.5K-CAU200 VP7 벡터로 효모 세포를 형질전환할 수 있다.

본 발명의 다른 구현예로서, 상기 단계 a)에서의 효모는 피키아 파스토리스(Pichia pastoris)일 수 있다.

본 발명의 또 다른 구현예로서, 상기 단계 b)는 0.5 내지 1.5% 농도의 메탄올을 첨가하여 24 내지 96시간 배양할 수 있다.

본 발명의 또 다른 구현예로서, 상기 단계 b)는 1 내지 1.5% 농도의 메탄올을 첨가하여 24 내지 48시간 배양할 수 있다.

본 발명의 또 다른 구현예로서, 상기 단계 c)는 Tris-HCl, NaCl, CaCl₂, EDTA, PMSF, glycerol, 및 Tween20을 함유하는 세포파쇄 완충액으로 용해시킬 수 있다.

본 발명은 상기 방법에 의해 생산 및 정제된 로타바이러스의 바이러스 유사입자를 제공한다.

본 발명의 일 구현예로서, 상기 바이러스 유사입자는 로타바이러스 구조 단백질인 VP2, VP6, 및 VP7을 동시에 발현할 수 있다.

본 발명은 상기 로타바이러스의 바이러스 유사입자를 포함하는, 면역원성 조성물을 제공한다.

본 발명은 상기 로타바이러스의 바이러스 유사입자를 개체에 투여하는 단계를 포함하는 로타바이러스 감염증 예방 또는 치료방법을 제공한다.

본 발명은 로타바이러스의 바이러스 유사입자의 로타바이러스 감염증 예방 또는 치료용도를 제공한다.

본 발명에 따르면, 효모 기반 체계에서 로타바이러스의 구조 단백질인 VP2, VP6, 및 VP7을 동시에 발현시킴으로써 삼중층의 자가-조립된 바이러스 유사 입자를 생산하였으며, 발현 유도 조건을 최적화하여 상기 재조합 단백질들의 발현양을 증대시켰을 뿐만 아니라, 재조합 단백질들의 용해도를 높일 수 있는 특정 세포파쇄 완충액(Cell lysis buffer)을 이용함으로써 정제 효율을 증진시킬 수 있었다. 이에, 본 발명은 바이러스 유사입자의 제조에 있어서, 종래부터 지적되어왔던 낮은 수율 및 높은 생산 비용에 대한 문제점을 해소한 것으로 로타바이러스에 대한 신규 백신의 연구 및 개발에 효과적으로 활용될 수 있을 것으로 기대된다.

도 1은 로타바이러스(Rotavirus) 감염 환자로부터 분리한 인간 로타바이러스 구조 단백질 유전자(VP2, VP6, VP7)들이 피키아 파스토리스(Pichia pastoris)에서 동시에 발현될 수 있도록 형질전환시키는 과정을 개략적으로 나타낸 도이다.
도 2는 인간 로타바이러스 구조 단백질 유전자(VP2, VP6, VP7)가 모두 형질전환된 피키아 파스토리스 콜로니를 AOX1 프라이머와 각 유전자(VP2, VP6, VP7) 특이적 프라이머를 사용하여 콜로니 PCR을 한 결과이다(M 레인은 1kb DNA 크기 마커, 1번 레인은 universal AOX1 프라이머, VP2 특이 프라이머, 2번 레인은 VP6 특이 프라이머, 3번 레인은 VP7 특이 프라이머를 통해 확인한 결과이다.).
도 3a는 쥐의 단일클론 항-His 항체를 사용하여, 상층액 내 로타바이러스 구조 단백질(VP2, VP6, VP7)의 발현을 웨스턴 블로팅을 통해 확인한 결과이다(1번 레인은 피키아 파스토리스 음성대조군, 2번 레인은 재조합 VP2, 3번 레인은 재조합 VP6, 4번 레인은 재조합 VP7, 5번 레인은 VP2/VP6/VP7이 모두 발현된 군, M 레인은 Thermo Scientific Spectra Multicolor Broad Range Protein Ladder을 나타낸다.).
도 3b는 토끼의 다클론 로타바이러스 Wa 항혈청를 사용하여, 상층액 내 로타바이러스 구조 단백질(VP2, VP6, VP7)의 발현을 웨스턴 블로팅을 통해 확인한 결과이다(1번 레인은 피키아 파스토리스 음성대조군, 2번 레인은 재조합 VP2, 3번 레인은 재조합 VP6, 4번 레인은 재조합 VP7, 5번 레인은 VP2/VP6/VP7이 모두 발현된 군, M 레인은 Thermo Scientific Spectra Multicolor Broad Range Protein Ladder을 나타낸다.).
도 4는 정제된 로타바이러스의 바이러스 유사입자를 투과전자현미경으로 관찰한 결과이다.
도 5는 재조합 로타바이러스의 바이러스 유사입자의의 면역원성을 확인하기위하여 로타바이러스 Wa 항원에 대한 쥐 면역혈청의 항체가를 측정한 결과이다((□)는 음성대조군으로서 아무런 주사도 하지 않은 쥐 혈청의 항체가, (○)은 음성대조군으로서 항원을 섞지 않은 adjuvant만을 주사한 쥐 혈청의 항체가, (■)은 재조합 항원 로타바이러스 VLP의 쥐 면역혈청의 항체가를 나타낸 것으로서, 오차막대는 5마리의 쥐로 실험한 표준편차를 나타낸다.).
도 6은 첨가된 메탄올의 농도 및 발현 유도 시간에 따른 로타바이러스 구조 단백질의 발현양을 비교하기 위하여 웨스턴 블로팅을 통해 각 재조합 단백질들의 발현 정도를 측정하고 Image J 프로그램을 통해 정량화한 결과이다.
도 7은 세포 파쇄 완충액의 차이에 따른 상층액 단백질의 단백질 용해성(solubility)을 비교하기 위하여 각 재조합 단백질들의 발현 정도를 측정하고 Image J 프로그램을 통해 정량화한 결과이다.

본 발명자들은, 발현 균주로 피키아 파스토리스(Pichia pastoris)를 이용하여, 로타바이러스의 구조 단백질인 VP2, VP6, 및 VP7이 발현된 바이러스 유사 입자를 생산하였으며, 상기 바이러스 유사 입자의 우수한 면역원성을 확인하였다. 또한, 메탄올 농도 및 발현 유도 시간에 따른 로타바이러스 구조 단백질 발현양 증가 및 세포 파쇄 완충액에 따른 상층액 단백질의 용해성 차이를 확인하고, 이에 기초하여 본 발명을 완성하였다.

이에, 본 발명은 하기의 단계를 포함하는 로타바이러스(Rotavirus)의 바이러스 유사입자(virus-like particle, VLP)의 생산 및 정제방법을 제공한다.

a) 로타바이러스 구조 단백질이 발현되도록 효모 세포를 형질전환하는 단계;

b) 상기 형질전환된 효모 세포를 메탄올이 첨가된 배지에서 배양하는 단계;

c) 상기 배양된 효모 세포를 용해시켜 세포 용해물을 얻는 단계; 및

d) 상기 세포 용해물로부터 로타바이러스의 바이러스 유사입자를 분리 및 정제하는 단계.

본 발명의 바이러스 유사입자의 생산 및 정제방법에 따르면, 로타바이러스의 바이러스 구조 단백질인 VP2, VP6, VP7을 효모 세포에 동시에 발현시킬 수 있으며, 메탄올 농도, 발현 유도 시간, 세포 파쇄 완충액의 조성을 조절함으로써, 바이러스 유사입자의 생산 효율을 극대화하였는바, 로타바이러스에 대한 신규 백신의 연구 및 개발에 효과적으로 활용될 수 있을 것으로 기대된다.

이하에서는, 본 발명에 따른 바이러스 유사입자의 생산 및 정제방법의 각각 단계에 대하여 상세히 설명하기로 한다.

단계 a)에서는, 로타바이러스 구조 단백질이 발현되도록 효모 세포를 형질전환한다.

본 발명에서, '로타바이러스(Rotavirus)'는 직경 70mm의 reoviridae과에 속하는 이중 나선형의 RNA바이러스로서, genome은 11개의 유전자 분절로 구성되어 있으며, 핵은 이중 capsid로 둘러싸여 있다. 현재까지 6가지 이상의 구조 단백질과 4가지의 비구조 단백질이 알려져 있다. Inner capsid에 4종류의 구조 단백질(VP1, VP2, VP3, VP6)이 있으며, outer capsid에 2종류의 구조 단백질(VP4, VP7)이 있다. Rotavirus는 outer capsid가 없는 rough particle과 outer capsid가 있는 smooth particle의 형태로 존재하는데, outer capsid에만 숙주 세포막의 특이 수용체에 결합하는 구조 단백질 VP4, VP7이 있으므로 smooth particle만이 감염을 일으킬 수 있다고 알려져 있다. 또한, 현재까지 사람에서 7 가지의 혈청형이 분리되었으며, 특히 1형과 3형에 의한 감염이 가장 흔한 것으로 알려져 있다. 로타바이러스는 모든 혈청형간 교차 방어가 되지 않으므로 각각의 혈청형에 대한 감염에 대해 보호할 수 있는 효과적인 로타바이러스 백신의 개발이 필요한 실정이다. 이에, 본 발명에서는, 로타바이러스의 주요 구조 단백질의 동시 발현 및 자가 조립 기능을 통해 원래의 바이러스와 유사한 형태를 갖는 바이러스 유사입자를 제조하였고, 각각의 혈청형으로 유전자 교체 발현 혹은 동시 발현이 용이하도록 시스템을 구축하였다. 구체적으로는, 로타바이러스 구조 단백질인 VP2, VP6 및 VP7이 동시에 발현된 삼중층의 바이러스 유사입자를 생산하였으며, 자연적인 감염성 로타바이러스와 유사하여 항원 구조를 유지한 채로 체내의 면역세포에 제시되어 효율적으로 면역반응을 유도할 수 있을　뿐만 아니라, 바이러스 증식에 필요한 바이러스의 유전자를 포함하고 있지 않아 병원성이 없다는 장점이 있다.

본 발명에서 사용되는 용어, "형질전환"은 본래의 세포가 가지고 있던 것과 다른 종류의 외래 유전자가 있는 DNA사슬 조각 또는 플라스미드가 세포들 사이에 침투되어 원래 세포에 존재하던 DNA와 결합함으로써 세포의 유전형질을 변화시키는 분자생물학적 기술을 의미한다. 본 발명에서 형질전환은 상기 로타바이러스 구조 단백질 유전자가 효모 세포 내로 삽입되는 것을 의미한다. 일반적으로 형질전환에는 유전자를 발현할 수 있는 플라스미드 DNA가 세포 안으로 들어가는 형태, 그리고 선형의 플라스미드 DNA가 들어가서 일련의 분자생물학적 반응을 통해 숙주세포의 Genome 안으로 삽입되어 integration되는 형태가 있다. 본 발명에서는, 딸세포로 분화할 때에 플라스미드 DNA 형태로 남아 있는 것보다 Genome 안으로 삽입되어 있는 것이 더욱 안정적이라는 점으로 고려하여, 피키아 파스토리스의 Genome에 로타바이러스 구조 단백질 유전자를 integration 시키는 방법을 사용하였다.

본 발명에서, 상기 형질전환은 바람직하게 서열번호 1로 표시되는 pPIC6-CAU200 VP2 벡터, 서열번호 2로 표시되는 pPICZ-CAU200 VP6 벡터, 및 서열번호 3으로 표시되는 pPIC3.5K-CAU200 VP7 벡터를 효모세포에 도입함으로써 수행될 수 있다. 본 발명의 효모 세포 내로 삽입되는 로타바이러스 구조 단백질 유전자는 효모 세포내에서의 발현을 최적화시키기 위하여 코돈을 분석한 후, 이에 맞추어 서열을 변경함으로써 제작하였다. 상기 VP2, VP6, 및 VP7 유전자는 바람직하게 각각 서열번호 4 내지 6일 수 있으며, 상기 염기서열의 상동체가 본 발명의 범위 내에 포함된다. 구체적으로 상기 유전자는 서열번호 1 내지 6의 염기서열과 각각 70% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 가지는 염기서열을 포함할 수 있다.

또한, 본 발명에서, 상기 효모 세포는 바람직하게 피키아 파스토리스(Pichia pastoris)일 수 있다.

단계 b)에서는, 단계 a)에서 형질전환된 효모 세포를 메탄올이 첨가된 배지에서 배양한다. 이때, 로타바이러스 구조 단백질의 발현 증대를 위하여 메탄올을 첨가하고, 특정 시간 동안 배양시킨다는 점에 기술적 특징이 있다. 구체적으로, 메탄올의 농도는 0.5 내지 1.5% 농도이며, 배양시간은 24 내지 96시간일 수 있으며, 바람직하게는 메탄올의 농도가 1 내지 1.5%인 경우, 24 내지 48시간 배양하는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

단계 c)에서는, 단계 b)에서 배양된 효모 세포를 용해시켜 세포 용해물을 얻는다. 이때, 바이러스 유사입자의 정제 수율의 증진을 위하여 특정한 세포파쇄 완충액을 사용할 수 있다. 구체적으로, 세포파쇄 완충액 A (Tris-HCl pH7.5, NaCl, CaCl₂,EDTA(에틸렌다이아민테트라아세트산, ethylenediaminetetraacetic acid), PMSF(페닐메탄설포닐 플로라이드, phenylmethanesulfonyl fluoride), glycerol, Tween20)일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

단계 d)에서는, 단계 c)에서의 세포 용해물로부터 로타바의 바이러스 유사입자를 분리 및 정제한다. 상기 분리 및 정제는 바람직하게는 원심 분리법을 통해 실시할 수 있으나, 바이러스 유사입자를 분리 정제할 수 있는 당업계에서 널리 알려진 방법을 통해서도 제한없이 실시할 수 있다.

본 발명의 일 실시예에서, pPIC6-CAU200 VP2 벡터, pPICZ-CAU200 VP6 벡터, 및 pPIC3.5K-CAU200 VP7 벡터를 피키아 파스토리스 GS115(HIS4)에 도입하여 형질전환시키고, 로타바이러스 구조 단백질(VP2, VP6, VP7)의 발현을 확인하였으며, 이로부터 바이러스 유사입자를 분리 정제 하였다(실시예 2 내지 4 참조). 또한, 본 발명의 다른 실시예서는, 상기 로타바이러스의 바이러스 유사입자를 처리한 군에서, 바이러스 유사 입자의 우수한 면역원성을 확인하였으며, 메탄올 농도 및 발현 유도시간을 최적화하여 로타바이러스 구조 단백질들의 발현양을 증대시켰을 뿐만 아니라, 재조합 단백질들의 용해도를 높일 수 있는 세포파쇄 완충액(Cell lysis buffer)으로 세포파쇄 완충액 A (Tris-HCl pH7.5, NaCl, CaCl₂, EDTA, PMSF, glycerol, Tween20)를 이용하여 바이러스 유사입자의 정제 효율을 높일 수 있음을 확인하였다(실시예 5 내지 7 참조).

이에, 본 발명은 로타바이러스(Rotavirus)의 바이러스 유사입자(virus-like particle)를 포함하는, 면역원성 조성물을 제공한다.

본 발명에서 사용되는 용어, "면역원성"은 특정 병원체에 대해 면역 반응을 유발시키는 조성물의 능력을 의미한다. 면역 반응은 세포독성 T-세포 및 사이토카인-생성 T-세포에 의해 주로 매개되는 세포 면역 반응, 또는 헬퍼 T-세포에 의해 주로 매개된 후 B-세포를 활성화시켜 항체를 생성시키는 체액 면역 반응일 수 있다.

본 발명의 면역원성 조성물은, 로타바이러스의 바이러스 유사입자에 더하여, 약제학적으로 허용되는 담체 또는 아주반트를 추가로 포함할 수 있다. 상기 담체는 희석제, 완충제, 보존제 등을 포함하는 의미로서 사용된다. 상기 담체에는 당업계에 알려진 부형제, 붕해제, 결합제 및 활택제로 이루어진 군으로부터 선택된 1 이상의 성분이 포함될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 또한, 상기 아주반트는 항원의 면역원성을 증진시키기 위하여 사용되는 물질이며, 본 발명에 사용하기에 적합한 아주반트로서, 미네랄 염, 예컨대 Alum, 알루미늄 히드록시드, 알루미늄 포스페이트 및 칼슘 포스페이트; 계면활성제 및 미립자, 예컨대, 비이온성 블록 중합체 계면활성제(콜레스테롤), 비로솜(virosome), 사포닌(saponin)(Quil A, QS-21 및 GPI-0100), 프로테오솜, 면역 자극 착체, 코클레에이트, 4차 아민(디메틸 디옥타데실 암모늄 브로마이드(DDA)), 아브리딘, 비타민 A, 비타민 E; 박테리아 생성물, 예컨대 RIBI 아주반트 시스템(Ribi Inc.), 미코박테리룸 플레이(Mycobacterum phlei)의 세포벽 골격(Detox(등록상표)), 무라밀 디펩티드(MDP) 및 트리펩티드(MTP), 모노포스포릴 지질 A, 바실러스 칼메테-구에린(Bacillus Calmete-Guerin), 열-불안정한 대장균 엔테로톡신(enterotoxin), 콜레라 독소, 트레할로스 디미콜레이트, CpG 올리고데옥시뉴클레오티드; 사이토카인 및 호르몬, 예컨대, 인터류킨(IL-1, IL-2, IL-6, IL-12, IL-15, IL-18), 과립구집락자극인자, 데히드로에피안드로스테론, 1,25-디히드록시 비타민 D3; 폴리아니온, 예컨대 덱스트란; 폴리아크릴릭(예컨대, 폴리메틸메타크릴레이트, Carbopol 934P); 담체, 예컨대 테타누스 톡시드, 딥테리아 톡시드, 콜레라 독소 B 서브유닛, 엔테로톡시제닉 대장균의 돌연변이체 열-불안정한 엔테로톡신(rmLT), 열 쇼크 단백질; 수중유적형 유화액, 예컨대 AMPHIGEN(등록상표)(Hydronics, 미국); 및 유중수적형 유화액, 예컨대 프로인트(Freund)의 완전 및 불완전 아주반트가 포함되지만, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 면역원성 조성물은 당업계에 알려진 임의의 형태 예를 들면, 액제 및 주사제의 형태일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 액제 또는 주사제의 경우, 필요시 10∼40%의 프로필렌 글리콜, 및 용혈현상을 방지하는데 충분한 양 (예: 약 1%)의 염화나트륨을 함유할 수 있다. 상기 액제 또는 주사제에는 당업계에 알려진 임의의 희석제 또는 완충제가 포함될 수 있다. 또한, 본 발명의 면역원성 조성물은, 로타바이러스 유사입자를 바이알과 같은 용기에 보존하고, 사용하기 전에 주사제에 필요한 담체 또는 아주반트, 식염수 등을 부가함으로써 사용 직전에 조제될 수도 있다.

본 발명의 면역원성 조성물은, 당업계에 알려져 있는 임의의 투여 수단에 의하여 투여될 수 있다. 예를 들면, 상기 투여는 정맥내, 근육내, 경구, 경피 (transdermal), 점막, 코안 (intranasal), 기관내 (intratracheal) 또는 피하로 개체로 직접적으로 투여될 수 있다. 상기 투여는 전신적으로 또는 국부적으로 투여되는 것일 수 있다.

본 발명의 면역원성 조성물은, 치료학적으로 또는 예방학적으로 유효한 양으로 투여될 수 있다. 상기 "치료학적으로 또는 예방학적으로 유효한 양"은 치료 또는 예방하고자 하는 증상을 완화 또는 제거하는데 요구되는 양을 의미하며, 증상의 경중, 개체의 성별, 나이 및 체중 등을 고려하여 적절하게 선택할 수 있다.

본 발명의 다른 양태로서, 본 발명은 상기 면역원성 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 로타바이러스 감염증의 예방 또는 치료방법을 제공한다. 본 발명에서 "개체"란 질병의 치료를 필요로 하는 대상을 의미하고, 보다 구체적으로는, 인간 또는 비-인간인 영장류, 생쥐(mouse), 개, 고양이, 말, 및 소 등의 포유류를 의미한다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.

[실시예]

실시예 1. 실험 준비

1-1. 로타바이러스 구조 단백질 유전자의 분리 및 코돈 최적화

로타바이러스 감염 환자로부터 한국 인간 로타바이러스 CAU200 균주 (GenBank 첨부 번호 : KT207485, ACD50880, ACD50874)를 분리하였다. 이후, 발현 균주인 피키아 파스토리스(Pichia pastoris)의 발현 시스템에 적합하도록 인간 로타바이러스 구조 단백질(VP2, VP6, VP7)을 코딩하는 유전자를 GeneArt (Regensberg, Germany)에서 코돈 최적화(codon optimization)하였다.

1-2. 효모 균주 및 재조합 플라스미드 벡터의 준비

로타바이러스 구조 단백질의 발현 균주로서, 피키아 파스토리스 GS115(HIS4)를 이용하였다. 또한, 피키아 파스토리스에 로타바이러스 구조 단백질인 VP2, VP6, 또는 VP7을 도입하기 위하여, 상기 구조 단백질 유전자들을 각각 pPIC6, pPICZ, 또는 pPIC3.5K (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) 플라스미드 벡터에 서브클로닝(subcloning)하였다. 상기 pPIC6 및 pPICZ 플라스미드 벡터는 피키아 파스토리스와 대장균 모두에서 기능을 갖는 선택적 마커로 각각 Blastcidin (Invitrogen)과 Zeocin (Invitrogen)을 포함하며, 상기 pPIC3.5K 벡터는 피키아 파스토리스에서는 Geneticin (Invitrogen), 대장균에서는 kanamycin 내성을 갖도록 설계하였다. 아울러, 플라스미드 벡터에 삽입된 유전자는 DNA 염기서열 분석을 통하여 확인하였다.

실시예 2. 재조합 플라스미드 벡터를 이용한 형질전환 및 확인

본 실시예에서는 상기 실시예 1에서 준비한 재조합 플라스미드 벡터를 피키아 파스토리스 GS115(HIS4)에 도입하여 형질전환시키고자 하였으며, 상기 형질전환 과정은 도 1에 개략적으로 나타내었다. 구체적으로, pPIC6-CAU200 VP2 플라스미드는 SacI (New England BioLab) 제한효소를 처리하여 선형으로 제조하였으며, 제조사 지침에 따라 Pichia EasyComp Kit (Invitrogen)을 사용하여 피키아 파스토리스 GS115 균주에 형질전환을 시켰다. 형질전환된 효모세포는 300mg/ml의 Blasticidin을 포함한 YPDS 한천배지를 이용하여 30℃ 조건 하에서 3-4일 동안 배양하였으며, Blasticidin 내성 콜로니들 중에서 유전자가 삽입된 형질전환체를 콜로니 중합효소 연쇄반응 (Polymerase chian reaction, PCR)을 통하여 확인하였다. 두 번째 형질 전환은, VP2가 도입된 피키아 파스토리스 GS115-cauVP2에 CAU 200 VP6(pPICZ-CAU200 VP6)를 삽입하여 형질전환체를 제조하였으며, 세 번째 형질 전환은, VP2 및 VP6가 도입된 피키아 파스토리 GS115-cau26 (VP2/VP6)에 CAU200 VP7(pPIC3.5K-CAU200 VP7)을 삽입하여 형질전환체를 제조하였다. 상기 방법을 통하여 최종적으로 3개의 로타바이러스 구조 단백질(VP2, VP6, VP7) 유전자가 삽입된 GS115-cau267을 생산하였다.

또한, 상기 형질전환된 피키아 파스토리스 콜로니에서 로타바이러스 구조 단백질(VP2, VP6, VP7)의 발현을 확인하기 위하여 콜로니 PCR을 실시한 후, 1.2% 아가로즈겔에서 전기영동하였으며, 대조군으로는 AOX1 프라이머를 이용하였으며, 본 실시예에서 사용한 프라이머 염기서열은 하기 표 1에 나타내었다.

그 결과 도 2에 나타낸 바와 같이, 형질전환된 피키아 파스토리스 콜로니에서, 2208bp의 VP2, 773bp의 VP6, 및 782bp의 VP7 구조 단백질을 확인하였으며, 이는, 상기 재조합 플라스미드(pPIC6-CAU200 VP2, pPICZ-CAU200 VP6, pPIC3.5K-CAU200 VP7)를 통해 로타바이러스 구조 단백질(VP2, VP6, VP7)이 발현 균주인 피키아 파스토리스 GS115(HIS4)에 도입되어 형질전환되었음을 나타낸다.

실시예 3. 로타바이러스 구조 단백질의 발현 유도 및 확인

상기 실시예 2에서 제조한 양성 형질전환체인 GS115-cau267을 20mL YPD 액체 배지(1% w/v yeast extract, 2 % w/v peptone and 2 % w/v dextrose)에 접종하여 30℃, 180rpm 조건하에서 하루 동안 진탕배양(shake culture)하였다. 배양된 세포는 5,000rpm, 5분, 4℃ 조건 하에서 원심분리하여 얻었으며, 얻은 세포를 300mL MGY 액체 배지(1.34% w/v yeast nitrogen base, 0.05% w/v biotin and 1% v/v glycerol)에 부유시킨 뒤, 30℃, 180rpm 조건하 OD 600nm에서 2.0-6.0 도달할 때까지 진탕배양하였다. 배양된 세포는 원심분리하여 얻었으며, 얻은 세포를 500mL의 MM 액체 배지(1.34% w/v yeast nitrogen base, 0.05% w/v biotin and 0.5-1.5% v/v methanol)에 부유시켜 OD 600nm의 1.0에 도달할 때까지 30℃에서 180rpm으로 24-96시간 동안 진탕배양하여 VP2, VP6, 및 VP7 단백질들을 발현시켰다. 배양된 세포는 4℃ 조건하에서 5,000rpm, 5분 동안 원심분리하여 상층액과 세포 펠렛을 얻었다. 수득한 세포 펠렛을 세포파쇄 완충액 A(10mM Tris-HCl pH 7.5, 140mM NaCl, 10mM CaCl₂, 1mM EDTA, 1mM PMSF, 5% v/v glycerol, 0.01% v/v Tween20)에 녹이고 유리 비드(Sigma, USA)와 함께 비드-비터(Bead-Beater)(Biospec Products, USA)의 챔버로 옮긴 후, 5분간 흔들어 세포를 파쇄하였다. 용해물(lysate)을 4℃에서 12,000 x g의 속도로 30분 동안 원심분리하여 맑은 상층액을 얻었다.

또한, 상기 수득한 상층액에 존재하는 바이러스 유사입자 내 로타바이러스 구조 단백질(VP2, VP6, VP7)의 발현을 확인하기 위하여 상기 상층액 내 단백질을 10％ SDS-PAGE 상에서 전기영동하였으며, 모든 단백질 성분은 Immuno-BlotTM PVDF membrane (Bio-Rad)에 옮긴 후, 이 멤브레인(memebrane)을 5％ 탈지유를 이용하여 블로킹(blocking)하였다. 쥐로부터 수득한 단일클론 항-His 항체(antibody) 및 토끼로부터 수득한 다클론 로타바이러스 Wa 항혈청을 1차 항체로 이용하였으며, 5％ 탈지유 용액 내 보관하였다. 상기 1차 항체를 사용하여 1시간 동안 반응시키고, peroxidase-conjugated goat anti-rabbit IgG (1:2000 dilution, Invitrogen)를 2차 항체로 사용하여 다시 반응시켰다. 발현된 단백질은 ECL(electrochemiluminescence) 기법을 이용하여 ImageQuant LAS4000 (GE Healthcare, USA)에서 확인하였다.

그 결과, 도 3에 나타낸 바와 같이, 쥐의 단일클론 항-His 항체(도 3a) 및 토끼의 다클론 로타바이러스 Wa 항혈청(도 3b) 실험에서 로타바이러스 구조 단백질인 VP2, VP6, 및 VP7의 발현을 확인하였다.

실시예 4. 바이러스 유사 입자의 순수 분리 및 정제

상기 실시예 3에서의 세포 용해물을 12,000rpm에서 30분 동안 초고속 원심분리하여 맑은 상층액을 얻었다. 바이러스 유사입자를 함유하고 있는 상층액에 35％ 수크로오스 쿠션(sucrose in TNC buffer, 10mM Tris-HCl, pH 7.5, 140mM NaCl, 10mM CaCl₂)을 첨가하고, SW32Ti 로터(Beckman Coulter)를 이용하여 30,000rpm에서 120분 동안 원심분리함으로써 바이러스 유사입자 침전물을 얻었다. 수득한 바이러스 유사입자 침전물은 4㎖의 TNC 완충액에 부유시켰고, CsCl이 0.42g/ml 농도로 녹아있는 TNC 완충액을 첨가하고 SW41Ti 로터(Beckman Coulter)를 이용하여 35,000rpm에서 18시간 동안 원심분리하였다. 원심분리한 후, 확인된 2개의 밴드, 즉 하위 밴드와 상위밴드를 일회용 주사기를 이용하여 회수하였고, CsCl의 제거를 위해 TNC 완충액으로 투석(dialysis)하였다.

또한, 상기 수득한 바이러스 유사 입자의 존재를 확인하기 위하여 투과전자현미경 분석을 실시하였다. 구체적으로, Formvar-carbon이 코팅된 200 mesh copper 그리드(grid) 표면에 정제된 로타바이러스 바이러스 유사입자 샘플을 올려 놓은 후, 30초 뒤에 그리드로부터 용액 대부분을 필터 페이퍼로 제거하였다. 상기 그리드 위에 uranyl acetate 용액을 올려 30초간 염색한 후, 건조시켰으며, 샘플은 NICEM(The National Instrumentation Center of Environmental Management, Seoul National University) 안에 있는 JEM1010 모델(JEOL, Japan)을 사용하여 관찰하였다.

그 결과, 도 4에 나타낸 바와 같이, 투과전자현미경을 통해 1% uranyl acetate로 염색된 바이러스 유사 입자를 확인할 수 있었다.

실시예 5. 바이러스 유사 입자의 면역성 확인

본 실시예에서는, 동물 모델을 이용하여 상기 방법에 의해 제조된 로타바이러스의 바이러스 유사 입자의 면역원성을 확인하고자 하였다. 50㎍의 정제된 로타바이러스 바이러스 유사입자를 7주령 Balb/c 암컷 쥐에 완전 프로인드 면역 반응항진제(complete Freund's adjuvant)와 함께 피하 주사한 후(Day 0), 28일에 다시 불완전 프로인드 면역반응항진제(incomplete Freund's adjuvant)와 함께 부스팅(boosting)하였다. 40일 후, 심장으로부터 혈액을 채취하고, 혈청을 분리한 후, 항체형성 여부를 ELISA 기법을 이용하여 확인하였으며, 대조군으로는 아무 주사도 하지 않은 음성 Balb/c 암컷 쥐 혈청의 항체와, 항원이 들어있지 않은 면역반응항진제(adjuvant)를 주사한 음성 Balb/c 암컷 쥐 혈청의 항체를 이용하였다. 구체적으로, 분리 정제한 로타바이러스 Wa 항원을 웰(well) 당 0.1μg 농도로 코팅 용액(0.1M Na₂CO₃, 0.1M NaHCO₃, pH 9.4) 내에 준비한 후, 96-웰 면역플레이트(immunoplate)에 4℃에서 하루 동안 코팅하였다. 코팅된 플레이트를 PBS-T(1 X PBS with 0.05％ Tween20) 200㎕로 3회 세척한 후, 5％ (w/v) 탈지유를 사용하여 블로킹하였다. 쥐로부터 수득한 면역 혈청을 단계별로 희석하였으며, 이후, 37℃에서 1시간 동안 반응시켰다. 세척 후, peroxidase-conjugated goat anti-rabbit IgG (diluted in PBS-T, 5％ 탈지유 함유)를 웰 당 100㎕씩 첨가한 후, 37℃에서 1시간 반응시켰다. 기질 용액으로서 OPD(ortho-phenylenediamine)를 첨가한 후, 5분 동안 반응시켰으며, 1M H₂SO₄ 50㎕를 각 웰에 첨가하여 반응을 중지시켰다. 이후, ELISA reader(NanoQuant)를 이용하여 450nm에서 흡광도를 측정하여 항체 농도(항체가)를 정량하였다.

그 결과, 도 5에 나타낸 바와 같이, 대조군에 비교하여 로타바이러스의 바이러스 유사 입자를 처리한 군에서 유의적으로 높은 면역혈청의 항체가를 확인하였다. 이를 통해, 상기 방법에 의해 제조된 로타바이러스의 바이러스 유사 입자는 높은 면역원성을 나타내는 바, 면역원성 조성물로 활용할 수 있음을 알 수 있다.

실시예 6. 최적의 바이러스 유사 입자 생산을 위한 배양 조건 확인

본 실시예에서는, 피키아 파스토리스에서 재조합 단백질의 생산에 있어서, 메탄올 퍼센트 농도(v/v %)와 발현 유도시간(induction time)이 중요한 요소라는 점에 기반하여, 배양시 첨가되는 메탄올 농도 및 발현 유도시간에 따른 로타바이러스 구조 단백질 발현양 차이를 비교하였다. 구체적으로, 각각의 메탄올 함유량은 각 0.5, 0.75, 1.0, 1.5% (v/v)로 최종 농도를 결정하였으며, 매 24 시간마다 세포를 수득하여 4일 동안 측정하였다. 매 24시간마다 최종 농도를 유지하기 위하여 각기 농도에 맞추어 100% 메탄올을 첨가하였다. 세포파쇄 완충액 A를 이용하여 4℃ 조건하에서 5,000rpm, 5분 동안 원심분리하여 세포 잔여물을 제거하였다. 4℃ 조건에서 12,000xg로 10분간 원심분리를 한 뒤, 상층액을 얻어 사용 전까지 보관하였으며, 재조합 단백질 생산은 웨스턴 블로팅으로 확인하였다. 단백질의 생산의 수준의 정확한 양적 비교를 위해서, 조건마다 10⁶세포를 수득하여 샘플을 로딩하였으며, Image J 소프트웨어를 사용하여 Western blot 밴드의 농도를 비교를 하였다(Wayne Rasband, NIH, USA).

그 결과, 도 6에 나타낸 바와 같이, 0.5~0.75% 메탄올 첨가 조건에서 48~72시간 배양한 경우, 또는 1~1.5% 메탄올 첨가 조건에서 24~48시간 배양한 경우에 발현 유도된 재조합 단백질의 양이 증대됨을 확인하였다. 이를 통해, 메탄올 퍼센트 농도와 발현 유도시간을 조절함으로써, 로타바이러스 구조 단백질을 포함하는 재조합 단백질의 발현양을 증대시켜 파스토리스에서 로타바이러스의 바이러스 유사입자 생산을 극대화시킬 수 있음을 알 수 있다.

실시예 7. 세포 파쇄 완충액 차이에 따른 상층액 내 용해성 차이 확인

형질전환된 세포를 배양한 후, 이를 파쇄하여 수득한 상층액을 사용하여 정제단계로 진행되며, 이 과정에서 상층액에 보다 많은 재조합 단백질이 녹아 있는 경우, 생산 효율을 더욱 증대시킬 수 있다. 따라서 본 실시예에서는, 피키아 파스토리스에서 재조합 단백질의 생산에 있어서, 상층액 내 단백질 함량을 증진시키는 것이 중요한 요소라는 점에 기반하여, 세포 파쇄 완충액에 따른 상층액 단백질의 단백질 용해성(solubility)을 비교하였다. 구체적으로 일반적으로 사용하는 TNC 버퍼로 파쇄한 세포의 상층액 단백질과 세포파쇄 완충액 A로 파쇄한 세포의 상층액 단백질에서, 웨스턴 블로팅을 통해 각 재조합 단백질들의 발현 정도를 측정하였고, Image J 프로그램을 통해 정량하였다.

그 결과, 도 7에 나타낸 바와 같이, 세포파쇄 완충액 A로 파쇄한 상층액에서 발현된 단백질의 양은 TNC 완충액으로 파쇄한 상층액과 비교하여 2배 이상 증가하였으며, 침전 단백질의 양은 42%에서 25%로 크게 감소함을 확인하였다. 이를 통해, 세포파쇄 완충액 A를 이용함으로써, 정제 효율을 높여 파스토리스에서 로타바이러스의 바이러스 유사입자 생산을 극대화시킬 수 있음을 알 수 있다.

전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다.

<110> Chung-Ang University Industry-Academy Cooperation Foundation <120> Method for Producing and Purifying Virus-Like Particle of Rotavirus using Yeast strain <130> CAU20151894KR_MP15-100 <160> 10 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 6031 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pPIC6-CAU200 VP2 <400> 1 agatctaaca tccaaagacg aaaggttgaa tgaaaccttt ttgccatccg acatccacag 60 gtccattctc acacataagt gccaaacgca acaggagggg atacactagc agcagaccgt 120 tgcaaacgca ggacctccac tcctcttctc ctcaacaccc acttttgcca tcgaaaaacc 180 agcccagtta ttgggcttga ttggagctcg ctcattccaa ttccttctat taggctacta 240 acaccatgac tttattagcc tgtctatcct ggcccccctg gcgaggttca tgtttgttta 300 tttccgaatg caacaagctc cgcattacac ccgaacatca ctccagatga gggctttctg 360 agtgtggggt caaatagttt catgttcccc aaatggccca aaactgacag tttaaacgct 420 gtcttggaac ctaatatgac aaaagcgtga tctcatccaa gatgaactaa gtttggttcg 480 ttgaaatgct aacggccagt tggtcaaaaa gaaacttcca aaagtcggca taccgtttgt 540 cttgtttggt attgattgac gaatgctcaa aaataatctc attaatgctt 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gtaggcggtg ctacagagtt 8460 cttgaagtgg tggcctaact acggctacac tagaaggaca gtatttggta tctgcgctct 8520 gctgaagcca gttaccttcg gaaaaagagt tggtagctct tgatccggca aacaaaccac 8580 cgctggtagc ggtggttttt ttgtttgcaa gcagcagatt acgcgcagaa aaaaaggatc 8640 tcaagaagat cctttgatct tttctacggg gtctgacgct cagtggaacg aaaactcacg 8700 ttaagggatt ttggtcatga gattatcaaa aaggatcttc acctagatcc ttttaaatta 8760 aaaatgaagt tttaaatcaa tctaaagtat atatgagtaa acttggtctg acagttacca 8820 atgcttaatc agtgaggcac ctatctcagc gatctgtcta tttcgttcat ccatagttgc 8880 ctgactcccc gtcgtgtaga taactacgat acgggagggc ttaccatctg gccccagtgc 8940 tgcaatgata ccgcgagacc cacgctcacc ggctccagat ttatcagcaa taaaccagcc 9000 agccggaagg gccgagcgca gaagtggtcc tgcaacttta tccgcctcca tccagtctat 9060 taattgttgc cgggaagcta gagtaagtag ttcgccagtt aatagtttgc gcaacgttgt 9120 tgccattgct gcaggcatcg tggtgtcacg ctcgtcgttt ggtatggctt cattcagctc 9180 cggttcccaa cgatcaaggc gagttacatg atcccccatg ttgtgcaaaa aagcggttag 9240 ctccttcggt cctccgatcg ttgtcagaag taagttggcc gcagtgttat cactcatggt 9300 tatggcagca ctgcataatt ctcttactgt catgccatcc gtaagatgct tttctgtgac 9360 tggtgagtac tcaaccaagt cattctgaga atagtgtatg cggcgaccga gttgctcttg 9420 cccggcgtca acacgggata ataccgcgcc acatagcaga actttaaaag tgctcatcat 9480 tggaaaacgt tcttcggggc gaaaactctc aaggatctta ccgctgttga gatccagttc 9540 gatgtaaccc actcgtgcac ccaactgatc ttcagcatct tttactttca ccagcgtttc 9600 tgggtgagca aaaacaggaa ggcaaaatgc cgcaaaaaag ggaataaggg cgacacggaa 9660 atgttgaata ctcatactct tcctttttca atattattga agcatttatc agggttattg 9720 tctcatgagc ggatacatat ttgaatgtat ttagaaaaat aaacaaatag gggttccgcg 9780 cacatttccc cgaaaagtgc cacctgacgt ctaagaaacc attattatca tgacattaac 9840 ctataaaaat aggcgtatca cgaggccctt tcgtcttcaa gaattaattc tcatgtttga 9900 cagcttatca tcgataagct gactcatgtt ggtattgtga aatagacgca gatcgggaac 9960 actgaaaaat aacagttatt attcg 9985 <210> 4 <211> 2694 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CAU200 VP2co <400> 4 gaattcatgg cttacagaaa gagaggtgct aagagagagg acttgccaca acagaacgag 60 agattgcaag agaaagagat cgagaacaac actgacgtta ctatggaaaa caagaacaag 120 aacaaaaaca acaatagaaa gcagcagttg tccgacaagg ttttgtccca gaaagaagag 180 atcatcactg acgttcagga cgacatcaag atcgctgacg aagttaagaa gtcctccaaa 240 gaagagtcca agcagttgtt ggagatcttg aaaacaaaag aggaccacca gaaagaggtt 300 cagtacgaga tcttgcaaaa gactatccca actttcgagc caaaagagtc catcttgaag 360 aagttggagg acatcaagcc agagcaggct aagaaacaga tgaagttgtt cagaatcttc 420 gagccaagac agttgccaat ctacagagct aacggtgaga aagaattgag aaacagatgg 480 tactggaagt tgaagaaaga cactttgcca gacggtgact acgacgttag agagtacttc 540 ttgaacttgt acgaccagat cttgatcgag atgccagact acttgttgtt gaaggacatg 600 gctgttgaga acaagaactc cagagatgct ggtaaggttg ttgactccga gactgctaga 660 atctgtgacg ctattttcca ggacgaagag actgagggtg ttattagaag attcattgct 720 gacatgagac agcaggttca ggctgacaga aacatcgtta actacccatc catcttgcac 780 ccaatcgacc acgctttcaa cgagtacttt ttgaaccacc agttggttga gccattgaac 840 aacgagatca tcttcaacta catccctgag agaatcagaa acgacgttaa ttacatcttg 900 aacatggaca tgaacttgcc atccactgct agatatatca gaccaaactt gttgcaggac 960 agattgaact tgcacgacaa cttcgaatcc ttgtgggaca ctatcactac ttccaactac 1020 atcttggcta gatccgttgt tccagacttg aaagagaaag agttggtttc cactgaggct 1080 cagatccaga agatgtccca agacttgcaa ttggaggctt tgactatcca gtccgagact 1140 caattcttgg ctggtattaa ctcccaggct gctaacgact gtttcaagac tttgatcgct 1200 gctatgttgt cccagagaac tatgtccttg gacttcgtta ctacaaacta catgtccttg 1260 atctccggta tgtggttgtt gactgttatc ccaaacgaca tgttcttgag agaatccttg 1320 gttgcttgtg agttggctat catcaacact atcgtttacc cagctttcgg tatgcagaga 1380 atgcactaca gaaacggtga cccacaaact ccattccaga ttgctgagca gcagatccag 1440 aacttccaag ttgctaactg gttgcacttc atcaacaaca acagattcag acaggttgtt 1500 atcgacggtg ttttgaacca gactttgaac gacaacatca gaaacggtca ggttatcaac 1560 cagttgatgg aagctttgat gcagttgtcc agacagcagt tcccaactat gccagttgac 1620 tacaagagat ccatccagag aggtatcttg ttgttgtcca acagattggg tcagttggtt 1680 gacttgacta gacttttgtc ctacaactac gagactttga tggcttgtat cactatgaac 1740 atgcagcacg ttcagacttt gactactgag agattgcagt tgacttccgt tacttccttg 1800 tgtatgttga tcggtaacac tactgttatt ccatccccac agactttgtt ccactactac 1860 aacgttaatg ttaacttcca ctccaactac aacgagagaa tcaacgacgc tgttgctatc 1920 atcactgctg ctaatagatt gaacttgtac caaaagaaga tgaagtccat cgttgaggat 1980 ttcttgaaga gattgcagat cttcgacgtt ccaagagttc cagacgacca gatgtacaga 2040 ttgagagaca gattgagact tttgccagtt gagagaagaa gattggacat cttcaacttg 2100 atcttgatga acatggaaca gatcgagaga gcttccgaca agattgctca gggtgttatc 2160 attgcttaca gagatatgca gttggagcgt gatgagatgt acggtttcgt taacattgct 2220 agaaacttgg acggttacca gcagatcaac ttggaagagt tgatgagaac tggtgactac 2280 ggtcagatca ctaacatgtt gttgaacaac cagccagttg ctttggttgg tgctttgcct 2340 ttcgttactg actcctccgt tatctccttg atcgctaagt tggacgctac tgttttcgct 2400 cagatcgtta agttgagaaa ggttgacact ttgaagccaa tcttgtacaa aatcaactcc 2460 gactccaacg acttctactt ggttgctaac tacgactgga tcccaacttc cactactaag 2520 gtttacaagc aggttccaca gccattcgac ttcagagctt ctatgcacat gttgacttcc 2580 aacttgactt 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ctatcacttt gttgccagac gctgagagat tctcattccc aagagttatc 720 aactccgctg acggtgctac tacatggttc ttcaacccaa tcatccttag accaaacaac 780 gttgaggttg agttcttgtt gaacggtcag atcatcaaca cttaccaggc tagattcggt 840 actattatcg ctagaaactt cgacactatc agattgtcct tccagttgat gaggccacca 900 aacatgactc cagctgttaa cgctttgttc ccacaagctc aaccattcca acaccacgct 960 actgttggtt tgactttgag aatcgagtcc gctgtttgtg agtccgtttt ggctgatgct 1020 aacgagactt tgttggctaa cgttactgct gttagacaag agtacgctat cccagttggt 1080 ccagtttttc caccaggtat gaactggact gagttgatca ctaactactc cccatccaga 1140 gaggacaact tgcagagagt tttcactgtt gcttccatca gatccatgtt gatcaagctc 1200 gag 1203 <210> 6 <211> 990 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CAU200 VP7co <400> 6 gaattcatgt acggtatcga gtacactact atcttgattt tcttgatctc catcatcttg 60 ttgaactaca tcttgaagtc cgttactaga atcatggact acatcatcta cagattcttg 120 ttgatctccg ttgctttgtt cgctttgact aaggctcaga actacggttt gaacatccca 180 atcactggtt ccatggacac tgtttactcc aactccactc aagaagaggt tttcttgact 240 tccactttgt gtttgtacta cccaactgag gcttccactc agatttctga cggtgagtgg 300 aaagaatcct tgtcccagat gttcttgact aagggttggc caactggttc cgtttacttc 360 aaagagtact ccaacatcgt tgacttctcc gttgacccac agttgtactg tgactacaac 420 ttggttttga tgaagtacga ccagaacttg gagttggaca tgtctgagtt ggctgacttg 480 atcttgaacg agtggttgtg taacccaatg gacatcactt tgtactacta ccagcaatcc 540 ggtgagtcca acaagtggat ttctatgggt tcctcctgta ctgttaaggt ttgtccattg 600 aacactcaga ctttgggtat cggttgtcag actacaaacg ttgactcctt cgagactgtt 660 gctgagaacg agaagttggc tatcgttgac gttgttgacg gtatcaacca caagatcaac 720 ttgactacta ctacttgtac tatcagaaac tgtaagaagt tgggtccaag agagaacgtt 780 gctgttatcc aagttggtgg ttccaacgtt ttggacatca ctgctgaccc aactacaaac 840 ccacagatcg agagaatgat gagagttaac tggaagagat ggtggcaggt tttctacact 900 atcgttgact acatcaacca gatcgttcag gttatgtcca agagatccag atccttgaac 960 tccgctgctt tctactacag agttctcgag 990 <210> 7 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> AOX1 primer <400> 7 gcaaatggca ttctgacatc c 21 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> VP2 primer <400> 8 ccaggacgaa gagactgagg 20 <210> 9 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> VP6 primer <400> 9 caacagttcg agcacatcgt 20 <210> 10 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> V7 primer <400> 10 cagttgtact gtgactacaa ctt 23

Claims

a) 로타바이러스 구조 단백질이 발현되도록 효모 세포를 형질전환하는 단계;
b) 상기 형질전환된 효모 세포를 메탄올이 첨가된 배지에서 배양하는 단계;
c) 상기 배양된 효모 세포를 용해시켜 세포 용해물을 얻는 단계; 및
d) 상기 세포 용해물로부터 로타바이러스의 바이러스 유사입자를 분리 및 정제하는 단계를 포함하는 로타바이러스(Rotavirus)의 바이러스 유사입자(virus-like particle, VLP)의 생산 및 정제방법으로서,
상기 단계 a)에서의 효모는 피키아 파스토리스(Pichia pastoris)인 것을 특징으로 하고;
상기 단계 b)는 1 내지 1.5% 농도의 메탄올을 첨가하여, 24 내지 48시간 배양하고;
상기 단계 c)는 Tris-HCl, NaCl, CaCl₂, EDTA(ethylenediaminetetraacetic acid), PMSF(phenylmethanesulfonyl fluoride), glycerol, 및 Tween20을 함유하는 세포파쇄 완충액으로 용해시키는 것을 특징으로 하는, 생산 및 정제방법.
제1항에 있어서,
상기 단계 a)는 서열번호 1로 표시되는 pPIC6-CAU200 VP2 벡터, 서열번호 2로 표시되는 pPICZ-CAU200 VP6 벡터, 및 서열번호 3으로 표시되는 pPIC3.5K-CAU200 VP7 벡터로 효모 세포를 형질전환하는 것을 특징으로 하는, 생산 및 정제방법.
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제1항의 방법에 의해 생산 및 정제된 로타바이러스(Rotavirus)의 바이러스 유사입자(virus-like particle).
제7항에 있어서,
상기 바이러스 유사입자는 로타바이러스 구조 단백질인 VP2, VP6, 및 VP7을 동시에 발현하는 것을 특징으로 하는, 바이러스 유사입자.
제7항의 로타바이러스(Rotavirus)의 바이러스 유사입자(virus-like particle)를 포함하는, 면역원성 조성물.