KR101803757B1 - 생약재 복합 발효 추출물을 유효성분으로 함유하는 화장료 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 지실, 식방풍, 치자열매, 우슬, 붉나무 미숙과, 붉나무 성숙과, 찔레나무 미숙과, 찔레나무 성숙과 및 수세미로 이루어지는 군으로부터 1종 이상 선택되는 생약재 추출물을 얻는 단계; 상기 추출물에 잎새버섯 균사체 또는 잎새버섯 균사체의 전 배양액을 혼합한 본 배양한 후, 본 배양액으로부터 잎새버섯 균사체를 제거하여 생약재 발효 추출물을 얻는 단계; 상기 수득한 생약재 발효 추출물에 제주 오메기주를 혼합하여 배양한 배양액으로부터 누룩균을 제거하는 단계;로부터 수득된 생약재 복합 발효 추출물을 유효성분으로 함유하는 것을 특징으로 하는 화장료 조성물에 관한 것으로, 항산화 효과, 콜라겐 합성 촉진효과, 피부 잔주름 개선효과, 미백효과, 보습효과, 피부자극 완화효과, 여드름 방지 또는 완화 효과, 아토피 개선효과 및 항염 효과 등 피부개선에 우수한 효과를 발휘한다.

Description

생약재 복합 발효 추출물을 유효성분으로 함유하는 화장료 조성물 {Cosmetic composition containing natural complex fermented extracts}

본 발명은 생약재 복합 발효 추출물을 유효성분으로 함유하는 화장료 조성물에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 지실, 식방풍, 치자열매, 우슬, 붉나무 미숙과, 붉나무 성숙과, 찔레나무 미숙과, 찔레나무 성숙과 및 수세미의 단독 추출물 또는 2종 이상의 혼합 추출물이 포함된 생약재 추출물에 잎새버섯 균사체를 첨가, 배양하여 수득한 생약재 발효 추출물에 오메기주를 재첨가하고 배양하여 수득한 생약재 복합 발효 추출물을 유효성분으로 함유하는 피부 외용제 조성물에 관한 것이다.

자외선에 노출된 피부는 프리라디칼과 활성산소종 (Reactive Oxygen Species: ROS)을 생성하여 피부암, 광독성, 자기면역장애, 광과민증과 피부노화 등을 유발하게 된다(Norins, J. Invest. Dermatol., 39:445, 1962; Cadenas, Ann. Rev. Biochem., 58:79, 1989). 생체 내에서 콜라겐과 같은 세포외기질의 합성과 분해는 적절하게 조절되나, 노화가 진행되면서 그 합성이 점차 감소하며 콜라겐을 분해하는 효소인 기질 금속단백질 분해효소(MMP)의 발현이 촉진되어 피부의 탄력이 저하되고 주름이 형성된다. 또한 이러한 분해효소는 자외선 조사에 의해 활성화되기도 한다. 따라서, 세포 내에서 활성화가 유도되는 MMP 발현을 조절하거나 그 활성을 억제할 수 있는 물질의 개발이 요구되고 있다.

피부질환이란 사람을 포함한 포유동물의 머리털과 손톱, 발톱을 포함하는 모든 피부에 나타나는 이상 소견을 의미하는 것으로, 아토피 알러지를 가진 사람에게서 나타나는 아토피 피부염(atopic dermatitis)이 대표적인 피부질환이다. 아직까지 아토피 피부염의 원인은 명확히 밝혀지지 않았지만 아토피 피부염 환자의 약 70%에서 아토피 병력이 있었으며, 알레르기성 체질인 사람에서 잘 발병하고, 특히 다른 알러지 질환인 알러지성 비염, 천식 등을 동반하여 유전적 요인이나 면역 질환의 하나로 이해되고 있다. 아토피 피부염은 초기의 심한 가려움증에 의해 대부분이 피부를 긁게 되고 이에 따른 2차 감염이 발생하며, 특히 환자의 정신적 불안정 및 감정 상태에 따라 더욱 악화될 수도 있다. 아토피 피부염은 상당히 많은 사람이 앓고 있는데, 전 인구의 0.5-1%, 어린이의 경우는 5-10%가 고통받고 있다. 증상이 나타나는 시기는 대체로 생후 2~6개월 내이며, 특히 1세 미만의 영아에게서 가장 많이 나타나고, 85%가 만 다섯 살 안에 나타난다. 아토피성 피부염은 주로 유아기에 자주 발생하지만, 최근에는 사춘기 이후의 환자가 증가하고 있고 그 병력도 매우 길어지고 있다. 아토피성 피부염의 치료에는 높은 약리효과를 기대할 수 있는 부신피질 호르몬 등의 약제가 사용되고 있다. 그러나, 이와 같은 부신피질 호르몬제의 사용 중지에 의하여 리바운드(약물의 사용정지 후에 일어나는 극적인 환부의 병세약화)가 생기는 것도 잘 알려져 있다. 이와 같은 부작용에 대한 대책으로서, 부신피질 호르몬 등의 호르몬을 포함하지 않는 비스테로이드성 항염증제 또는 항히스타민제 등이 사용되고 있으나 완치는 어려운 상태이다. 따라서, 부작용이 없는 아토피 피부염의 경감 또는 치료용 약제 개발이 매우 절실한 실정이다.

사람의 피부는 나이를 먹으면서 끊임없이 변화하게 된다. 피부 노화는 크게 자연노화(혹은 내인성 노화)와 외적 노화로 구분되며(E.B. Doris, Cosmetics & Toiletories, 111, 31-37, 1996), 자연 노화(내인성 노화)는 유전적인 요소에 영향을 받기 때문에 인위적인 조절이 어려운 반면 외적 노화는 환경적인 요소에 영향을 받기 때문에 인위적인 조절이 비교적 용이하다. 대표적인 외적 노화 인자로는 자외선을 들 수 있으며, 가장 두드러진 외적 노화현상이 바로 주름형성이다(H.W. Daniell, Ann Intern Med, 75, 873-880, 1971, G.L. Grove, J AmAcad Dermatol, 21, 631-637, 1989, C.E. Griffiths et al, Arch Dermatol, 128, 347-351, 1992). 한편, 자외선에 노출된 피부는 프리라디칼과 활성산소종을 생성시켜 피부암, 광독성, 자기면역장애, 광과민증과 피부노화 등을 유발하게 된다(Norins, J. Invest. Dermatol., 39:445, 1962; Cadenas, Ann. Rev. Biochem., 58:79, 1989). 생체 내에서 콜라겐과 같은 세포외 기질의 합성과 분해는 적절하게 조절되나 노화가 진행되면서 그 합성이 감소하며 콜라겐을 분해하는 효소인 기질 금속단백질분해효소(MMP)의 발현이 촉진되어 피부의 탄력이 저하되고 주름이 형성된다.

한편, 멜라닌은 색소 세포 내에 존재하는 티로시나제의 작용에 의해 타이로신으로부터 도파(dopa), 도파퀴논(dopaquinone)으로 변환되어 도파크롬(dopachrome) 등을 거처 생성된다. 멜라닌은 자외선 등으로부터 신체를 보호하고 체내 호르몬 분비 조절에 중요한 기능을 나타낸다. 그러나, 멜라닌이 과잉생산되면 기미, 주근깨 등을 형성하고 피부노화를 촉진하며 피부암 유발에 중요한 작용을 하는 것으로 알려져 멜라닌 과잉생산을 예방하기 위한 연구개발이 활발히 진행되고 있다.

이미 아스코르브산(일본특개평 4-9320), 하이드로퀴논(일본특개평 6-192062), 코직산(일본특개소 56-7710), 알부틴(일본특개평 4-93150) 및 식물 추출물 등이 티로시나제 저해 활성을 나타내어 미백 화장료로 이용되고 있으나 이 화장료들은 화장품 제형 중에서의 안정성이 나빠 분해되어 착색되거나, 이취가 발생하거나, 생체 수준에서의 효능, 효과가 불분명하거나 또는 안전성이 문제가 되어 그 사용이 제한되고 있는 실정이다.

최근 여러 화학물질 등에 의한 피부 자극을 줄이기 위해 천연 추출물로부터 얻어진 항산화, 주름완화, 가려움 완화 등의 기능을 가진 기능성 화장품에 많은 관심이 집중되고 있다. 천연 재료는 피부에 부작용이 적을 뿐 아니라, 최근 천연 재료를 이용한 화장품에 대한 소비자들의 호응이 높아짐에 따라 화장품 원료로서 개발가치가 한층 높아지고 있다. 예를 들어, 미국 특허공보 US5,972,341은 코미포라(Commiphora)속 식물, 특히, 코미포라 무쿨(Commiphora mukul) 추출물의 주름개선 효과에 관하여 기술하고 있다. 일본특허공개 평9-672662는 히알우로니다제(Hyaluronidase)억제 효능을 가지는 해초류 추출물들에 관하여 기술하고 있다. 일본특허공개 평10-85905은 해조류로부터 추출된 푸코이단(Fucoidan)의 피부감촉 개선효과에 관하여 기술하고 있다. 일본특허공개 평2-245087은 사르가숨(Sargassum)속 추출물의 항산화 효과에 관하여 기술하고 있다. 일본특허공개 평 3-294384는 히지키아(Hizikia)속으로부터 추출된 항산화 조성물에 관하여 기술하고 있다. 일본특허공개 평7-10769는 수렴효과가 있는 페오피시에강(Phaeophyceae) 추출물에 관하여 기술하고 있다. 대한민국 특허 제0431076호는 백급, 자소, 에키나시아 및 발효대두 추출물을 포함하는 아토피 피부의 치유 개선용 화장료 조성물을 개시하고 있고, 대한민국 특허 제0511494호는 하수오, 시엽, 일라이트를 포함하는 아토피 피부염 치료를 위한 추출물 및 조성물을 개시하고 있으며, 대한민국 특허출원공개 제2004-0065126호는 천연의 영지버섯, 유근피, 감초, 백봉령, 백지마 및 백년초 등으로부터 얻은 한방 식물 추출물을 포함하는 아토피 피부의 치유와 예방에 효과를 갖는 한방 화장료 조성물을 개시하고 있다. 또한 대한민국 특허출원공개 제2004-0011584호는 감초, 창이자, 홍화, 돈지(돼지비계)와 같은 천연성분의 물질을 정제 혼합하여 구성된 아토피성 피부질환의 치료에 우수한 조성물에 관해 개시하고 있다.

누룩은 전분과 단백질을 포함하는 밀기울, 쌀 등에서 다양한 미생물, 특히 전분의 당화기능이 우수한 미생물이 생장하면서 세포외 효소를 분비하고 이 효소에 의해 생성된 당을 이용하여 효모가 증식하는 과정에 의해 제조된다. 누룩이 건조되면 효소는 건조된 상태로 활성을 유지하고 효모는 휴면상태에 있다가 수분과 전분이 첨가되면 전분의 당화와 알코올 발효를 촉진하게 된다. 누룩에 자란 누룩곰팡이(황곡균 : Aspergillus oryzae, 백곡균 : Asp Luchuensis mut. Kawachii, 흑곡균 : Asp awamori)를 주로 하여 젖산균(Homo lactic acid bacteria)과 효모(사카로마이세스 코리아누스 : Saccharomyces coreanus, 사카로마이세스 세르비제 : Saccharomyces crerevisiae)가 공생 공존하여 발효가 일어난다. 상기 제주 누룩균에 관한 특허문헌은 항스트레스용 조성물[대한민국 특허공개 10-2014-0072421], 주름 개선용 조성물[대한민국 특허공개 10-2014-0072419] 등이 보고되어 있으며, 식물 추출물을 함유하는 화장료 조성물[대한민국 특허등록 제10-0971629호] 등에서 다양한 식물 추출물에 누룩균 발효를 이용하고 있다.

한편, 한방 생약재의 유효성분은 체내흡수율과 생체이용률은 높으나, 이를 단순 추출한 추출물의 경우 생체 외에서는 유효한 효능을 나타내지만 이를 함유하는 피부 외용제의 경우는 그 효과가 만족스럽지 못한 문제점이 있어 실용성이 높지 않았다.

그러나, 발효액 추출물은 유기용매를 사용하지 않고, 인체에 유익한 미생물을 사용하여 생약재에 존재하는 당(glucose) 한 분자 이상이 결합되고 상대적으로 분자량이 큰 배당체(glycosides)를 저분자의 배당체(aglycones)로 전환하여 유효성분이 각질층을 좀 더 쉽게 통과하여 효과적으로 피부로 흡수되도록 하는 효과를 얻을 수 있다.

이와 같이, 고유의 생약재가 가지는 독성을 낮추어 피부 자극이 없어 안전하고 피부의 유효한 효능을 극대화한 생약재 발효 추출물을 이용한 새로운 피부 외용제 개발이 더욱 필요한 실정이다.

본 발명자들은 대한민국 특허 제10-1081913호에서 생약혼합물로부터 추출한 추출물에 잎새버섯 균사체를 가하여 배양한 발효 생약추출물에서 효능효과를 나타내는 성분이 비배당체인 플라보노이드(Flavonoid)임을 확인하였다.

또한, 기존 발효 생약추출물은 고점도의 수용성 다당체 성분이 염과 pH 등에 의한 점도 변화가 심하며, 알코올류와 만나 젤화(gelation) 되는 특징이 있어 화장료로 이용하기에 용이하지 않았다. 뿐만 아니라, 다당체는 친수성 고분자량인 분자구조로 인해 경피 투과가 어렵고 이로 인해 경구투여를 통해 기대할 수 있는 다양한 생리활성이 화장품의 사용 형태인 경피 도포를 통해 나타나기 어렵다는 단점이 있다.

따라서, 본 발명은 상기 종래 천연물 추출물을 원료로 하는 화장료의 단점을 극복하는 것을 목적으로 한다.

이에 본 발명자들은 상기의 같은 문제점을 해결하기 위하여 화장품 안정성에 영향을 미치는 유기용매를 이용한 산분해 방법을 이용하지 않고 발효 생약추출물의 다당체를 분해하여 저분자화할 경우 화장품 원료로서 가지는 물리화학적 단점 및 상용성 문제를 해결할 수 있으며, 또한 친수성 고분자가 가지는 특성으로 인해 경피 도포 등에 의해 주목할 만한 생리활성이 나타나지 않는 단점을 극복할 뿐만 아니라, 발효 생약추출물의 생리활성성분인 비배당체 형태의 플라보노이드 함량이 더 증강될 수 있음을 알게 되었다.

상기 목적을 달성하기 위해 본 발명자들은 누룩균을 함유한 오메기주를 활용하여 배양한 생약재 복합 발효 추출물에서 유효성분의 함량증가를 확인하고, 또한, 이 생약재 복합 발효 추출물이 피부자극을 유발하지 않으면서 화장료 조성물로 탁월한 효과를 갖는 것을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

본 발명은 지실, 식방풍, 치자열매, 우슬, 붉나무 미숙과, 붉나무 성숙과, 찔레나무 미숙과, 찔레나무 성숙과 및 수세미로 이루어지는 군으로부터 1종 이상 선택되는 생약재 추출물을 얻는 단계; 상기 생약재 추출물에 잎새버섯 균사체 또는 잎새버섯 균사체의 전 배양액을 혼합하여 본 배양한 후, 본 배양액으로부터 잎새버섯 균사체를 제거하여 생약재 발효 추출물을 얻는 단계; 상기 수득한 생약재 발효 추출물에 제주 오메기주를 혼합하여 배양하는 단계; 상기 오매기주 배양액으로부터 누룩균을 제거하는 단계;를 통해 수득된 생약재 복합 발효 추출물을 유효성분으로 함유하는 것을 특징으로 하는 피부 외용제 조성물을 제공한다.

이하 본 발명의 과제 해결 수단에 대해 상세히 설명하고자 한다.

지실, 식방풍, 치자열매, 우슬, 붉나무 미숙과, 붉나무 성숙과, 찔레나무 미숙과, 찔레나무 성숙과 및 수세미로 이루어지는 군으로부터 1종 이상 선택되는 생약재에서 단순 추출한 추출물인 경우, 생체 외에서는 유효한 효능을 나타내지만 이를 피부 외용제에 적용한 경우에는 실질적으로 그 효과가 만족스럽지 못한 문제점이 있다.

또한, 상기 생약추출물에서 잎새버섯 균사체를 배양한 생약재 발효 추출물의 경우에는 고점도 수용성 다당체로 인하여 화장료로 이용하기가 용이하지 않은 문제점과 경피 투과가 어렵고 이로 인해 경구투여를 통해 기대할 수 있는 다양한 생리활성을 화장품의 사용 형태인 경피 도포를 통해서는 얻기 어렵다는 단점이 있다.

따라서, 본 발명은 피부투과가 용이하여 피부 외용제로서의 효과적인 역할을 하는 피부 외용제 조성물을 제공하기 위해 지실, 식방풍, 치자열매, 우슬, 붉나무 미숙과, 붉나무 성숙과, 찔레나무 미숙과, 찔레나무 성숙과 및 수세미로 이루어지는 군으로부터 1종 이상 선택되는 생약재 추출물을 얻는 단계; 상기 추출물에 잎새버섯 균사체 또는 잎새버섯 균사체의 전 배양액을 혼합하여 본배양한 후, 본배양액으로부터 잎새버섯 균사체를 제거하여 생약재 발효 추출물을 얻는 단계; 상기 수득한 생약재 발효 추출물에 제주 오메기주를 혼합, 배양하여 배양액을 얻는 단계; 및 상기 오메기주 배양액으로부터 누룩균을 제거하여 2차 여과액을 얻는 단계;를 통해 수득된 생약재 복합 발효 추출물을 유효성분으로 함유하는데, 상기 단계를 통해 수득된 생약재 복합 발효 추출물은 상기 1종 이상의 생약재로부터 추출한 추출물 또는 잎새버섯 균사체로부터 배양한 생약 발효 추출물보다 총 페놀함량 및 총 플라보노이드 함량이 증가하였으며, 고분자 다당체가 저분자화되었음을 확인하였다.

상기 생약재의 혼합 비율에 특별한 제한은 없으나, 바람직하게는 지실, 식방풍, 치자열매, 우슬, 붉나무 미숙과, 붉나무 성숙과, 찔레나무 미숙과, 찔레나무 성숙과 및 수세미가 각각 1~30중량부로 조성된 것이 좋다.

본 발명에서 최종적으로 얻은 생약재 복합 발효 추출물은 피부 외용제 조성물 전체에 대해 0.001~30.0중량% 함유되는 것이 바람직한데, 0.001중량% 미만으로 포함되는 경우에는 피부개선효과가 미미하고, 30.0중량%를 초과하는 경우에는 재료 투입량 대비 효율성이 떨어져 경제적이지 못하기 때문이다.

본 발명에서 생약재 추출물은 바람직하게는 추출 후 감압농축 또는 동결건조된 것이 좋고, 이때 감압농축 또는 동결건조된 추출물은 가장 바람직하게는 정제수, 에탄올, 부틸렌글리콜 및 프로필렌글리콜 중 선택되는 어느 하나 이상의 용매에 용해된 것이 좋으며, 바람직하게는 정제수, 에탄올, 부틸렌글리콜 및 프로필렌글리콜 중 선택되는 어느 하나 이상의 용매에 0.001~30.0중량% 용해된 것이 좋다.

본 발명에서 잎새버섯 균사체(KCTC 10337BP) 배양은 바람직하게는 배양액의 pH를 5.0~6.0으로 조정하고, 잎새버섯 균사체를 4~6%(v/v)되도록 접종 한 후, 온도 22~32℃, 회전수 120~180rpm, 통기량 1.2~1.8vvm 조건에서 5~7일간 배양하는 것이 좋다.

본 발명에서 제주 오메기주 배양은 바람직하게 상기 발효 생약재 추출물에 제주 오메기주를 1~50%(v/v) 되도록 접종한 후, 온도 25~37℃, 회전수 120~180rpm, 통기량 1.2~1.8vm 조건에서 3~6일간 배양하는 것이 좋다. 또 상기미생물 접종 후 배양은 접종되는 미생물을 고려하여 25~37℃의 온도 조건에서 이루어질 수 있다. 배양 온도가 상기 범위보다 낮을 경우 발효 속도가 느려질 수 있고 또한 원하지 않는 발효 산물이 생겨날 수 있으며, 배양 온도가 상기 범위보다 높을 경우도 발효 미생물의 사멸에 따라 마찬가지로 발효 속도가 느려지거나 원하지 않는 발효 산물이 생겨날 수 있다. 배양 시간의 경우는 접종된 미생물의 생장이 최대에 이를 때까지 지속하는 것이 바람직하다. 접종한 미생물의 생장이 최대에 이르는 시점은 배양 온도, 발효 원료의 양, 접종된 미생물의 양 등에 따라 결정될 것이다. 통상의 능력 범위 내에서 배양 온도, 발효 원료의 양, 접종되는 미생물의 양 등을 고려하여 접종된 미생물의 생장이 최대에 이르는 시점이 어느 시점인가를 결정할 수 있다.

한편, 본 발명에서 "유효성분으로 포함된다"는 의미는 본 발명의 화장료 조성물로부터 피부 상태의 개선 효과를 나타낼 수 있는 정도로 조성물에 2차 여과액이 첨가되는 것을 의미하고, 성분 전달 및 안정화 등을 위하여 다양한 성분을 부성분으로 첨가하여 다양한 형태로 제형화하는 것을 포함하는 의미이다.

또한, 본 발명은 화장료의 유효성분으로 함유되는 생약재 복합 발효 추출물이 항산화 효과, 세포 내 활성산소 제거 효과, 기질 금속단백질분해효소(MMP-1) 활성 저해효과, 기질 금속단백질분해효소(MMP-1) 발현 억제효과, 프로콜라겐 생합성 촉진효과, 엘라스틴 생성 촉진효과, 미백효과, 염증유발 관련 효소(hyaluronidase) 활성 억제효과, 자외선 조사에 의한 세포독성 완화효과, 자외선 조사에 의한 염증성 사이토카인 발현 억제효과, 여드름균에 대한 항균효과, 아토피 피부염에 대한 항염증효과 및 수분 흡습성이 우수한 것을 특징으로 한다.

또한, 본 발명은 상기 생약재 추출시 추출용매로 증류수가 85~99%(v/v) 함유된 수용액을 사용하는 것을 특징으로 하는 화장료 조성물에 관한 것이다.

또한, 본 발명은 상기 화장료 조성물이 화장수, 젤, 수용성 리퀴드, 크림, 에센스, 수중유(O/W)형 및 유중수(W/O)형으로 이루어진 기초 화장료 제형; 수중유형 또는 유중수형의 메이크업베이스, 파운데이션, 스킨커버, 립스틱, 립그로스, 페이스파우더, 투웨이케익, 아이새도, 치크칼라 및 아이브로우 펜슬류 중에서 선택된 화장료 조성물임을 특징으로 한다.

또한, 본 발명은 상기 생약재 복합 발효 추출물을 함유하는 피부 미백 효능을 나타내는 화장료 조성물에 관한 것이다.

또한, 본 발명은 상기 생약재 복합 발효 추출물을 함유하는 항노화 기능성 화장료 조성물에 관한 것이다.

또한, 본 발명은 생약재 복합 발효 추출물을 함유하는 피부자극 완화 효능을 나타내는 화장료 조성물에 관한 것이다.

또한, 본 발명은 생약재 복합 발효 추출물을 함유하는 아토피 피부 개선 효능을 나타내는 화장료 조성물에 관한 것이다.

또한, 본 발명은 생약재 복합 발효 추출물을 함유하는 여드름 예방 효능을 나타내는 화장료 조성물에 관한 것이다.

본 발명의 생약재 복합 발효 추출물은 피부 흡수력이 뛰어나고, 피부자극이 없으면서도, 기존의 단순 추출물보다 기미, 주근깨 및 피부 색소 침착의 원인이 되는 물질인 멜라닌 생성억제 효과 등 미백작용을 나타내었다.

또한, 본 발명의 생약재 복합 발효 추출물은 활성산소 소거효과와 MMP 저해효과와 자외선 조사에 의한 MMP 발현 조절효과 등 우수한 항노화 효과와 자외선 조사 후 야기되는 피부 자극을 완화시켜 주는 효과를 나타내었다.

또한 본 발명의 생약재 복합 발효 추출물은 염증매개 물질에 의한 피부자극 완화 및 아토피 개선효과를 나타내었다.

따라서, 이러한 생약재 복합 발효 추출물을 함유하는 화장수, 크림, 유액, 팩, 파우더 등의 화장료 조성물은 활성산소 소거효과와 콜라겐 분해효소 활성 조절효과, 피부 잔주름 개선 효과, 미백, 보습, 아토피 개선효과, 피부자극 완화효과 등 우수한 피부 외용제 효과를 나타낸다.

이하, 실시예를 통해 본 발명을 좀 더 구체적으로 설명한다. 단, 이들 실시예는 본 발명의 예시적인 기재일 뿐이며, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 국한되는 것은 아니다.

비교예 1: 생약재로부터 추출물 제조

세절하여 음건한 지실 30g, 식방풍 30g, 치자열매 30g, 우슬 30g, 붉나무 미숙과 30g, 붉나무 성숙과 30g, 찔레나무 미숙과 30g, 찔레나무 성숙과 30g, 수세미 30g을 95%(v/v) 증류수 수용액으로 5시간씩 3회 환류추출하고 냉침한 후, 와트만(Whatman) #5 여과지로 여과하였다. 여과된 추출물을 50℃ 이하에서 감압농축 및 동결건조시킨 후, 수득한 동결 건조물을 15 중량% 함유되도록 정제수, 에탄올, 부틸렌글리콜 및 프로필렌글리콜 혼합용매에 용해하여 생약재 추출물을 제조하였다.

비교예 2: 비교예 1의 생약재 추출물을 발효하여 생약재 발효 추출물 제조

잎새버섯 KCTC 10337BP 균사체를 효모-맥아즙 한천배지가 든 시험관에 사면배양하여 4℃에 보관하고 1개월마다 계대배양하여 사용하였다. 상기 사면배지에서 계대배양된 균사체를 무균적으로 균질화하여 비교예 1에서 수득한 생약 혼합추출물과 당이 혼합된 최적화된 합성배지(대한민국 특허: 10-0461960 참조)로 제조하였으며, pH 5.5로 조정한 액체배지에 잎새버섯 균사체가 5%(v/v) 되도록 접종한 후 발효조 내에서 온도 27℃, 회전수 150rpm, 통기량 1.5vvm의 조건으로 6일간 배양하였다. 배양 후 배양액으로부터 잎새버섯 균사체를 제거한 다음 생약재 발효 추출물을 수득하였다.

실시예 1: 비교예 2로부터 얻은 생약재 발효 추출물을 2차 발효하여 생약 재 복합 발효 추출물 제조

누룩균 또는 당 가수분해효소의 활성이 우수한 제주도 전통주 오메기주는 제조 직후 공급받아 4℃에 보관하고, 5일 이내에 사용하였다. 비교예 2에서 수득한 생약재 발효 추출물에 제주 오메기주가 10%(v/v) 되도록 접종한 후, 발효조 내에서 온도 32℃, 회전수 150rpm, 통기량 1.5vvm의 조건으로 5일간 배양하였다. 배양 후 배양액으로부터 누룩균을 제거한 다음 생약재 복합 발효 추출물을 수득하였다.

실험예 1: 추출물에 함유된 성분 및 함량 측정

상기 비교예 1의 생약재 추출물과 비교예 2에서 제조된 생약재 발효 추출물, 그리고 실시예 1에서 제조된 생약재 복합 발효 추출물의 주요성분 중 페놀성 물질, 플라보노이드, 플라보노이드 배당체 등을 정성분석하고, 페놀함량과 총 플라보노이드 함량을 비교하였다.

먼저 페놀성 물질, 플라보노이드, 플라보노이드 배당체 등의 정성분석은 하기와 같이 수행하였다.

(1) 페놀성 물질, 플라보노이드의 정성분석

비교예 1, 비교예 2와 실시예 1의 추출물에 각각 2.5% FeCl₃ 에탄올 용액을 1~2 방울 떨어뜨려 방치할 때, 암녹색으로 정색하거나 침전의 생성 여부를 관찰하였다.

(2) 플라보노이드 배당체의 정성분석

진한 황산법을 이용, 비교예 1, 비교예 2 와 실시예 1의 시료에 각각 5㎖의 진한 황산을 점적하여 황색 및 황적색 침전의 생성을 관찰하였다.

(3) 당의 정성분석

비교예 1, 비교예 2 와 실시예 1의 시료에 각각 5% a-나프톨 알콜 시액 2-3 방울을 넣은 후 농황산을 기벽을 통하여 가할 때 경계면에 적자색이 나타나는지 관찰하였다.

정성분석을 수행한 결과, 비교예 1, 비교예 2와 실시예 1의 시료에는 페놀성 물질, 플라보노이드 플라보노이드 배당체가 함유되어 있는 것을 확인할 수 있었다.

총 페놀 함량 및 총 플라보노이드 함량 측정은 하기와 같이 수행하였다.

(1) 총 페놀함량 측정

비교예 1, 비교예 2 와 실시예 1의 시료 1㎖에 각각 증류수 10㎖을 첨가한 후, 2㎖의 Folin-Ciocalteu phenol reagent(Sigma)첨가하여 혼합한 다음, 실온에서 5분간 반응시켰다. 이 반응물에 20% 소듐 카보네이트를 2㎖ 첨가하여 혼합한 다음, 상온에서 1시간 반응시킨 후 680nm에서 흡광도를 측정하였다. 이때 지표물질은 갈릭산(gallic acid)을 사용하였다.

(2) 총 플라보노이드 함량 측정

비교예 1, 비교예 2 와 실시예 1의 시료 각 1.5㎖에 동량의 메탄올에 용해된 2% AlCl₃·H₂O를 혼합한 다음, 상온에서 10분간 반응시킨 후 367nm에서 흡광도를 측정하였다. 이때 지표물질은 카테킨(catechin)을 사용하였다.

시료명	총 페놀 함량 (μg/mg of extract)	총 플라보노이드 함량 (μg/mg of extract)
비교예 1	580.5	21.2
비교예 2	615.1	30.9
실시예 1	912.5	58.7

총 페놀 함량 및 총 플라보노이드 함량을 측정한 결과(표 1), 비교예 1과 비교예 2보다 실시예 1의 시료에서 총 페놀 함량 및 총 플라보노이드 함량이 높은 것을 확인할 수 있었는데, 특히 페놀 함량은 약 1.5배, 플라보노이드 함량은 약 2배 이상 증가한 것을 확인할 수 있었다.

상기 결과로부터 단순 추출에 의해 제조된 생약재 추출물과 잎새버섯 균사체를 발효시킨 여액에 제주 오메기주를 가하여 발효시킴으로써 총 페놀함량 및 총 플라보노이드 함량을 증가시킬 수 있다는 사실을 확인하였고, 이를 바탕으로 생약재 복합 발효 추출물을 함유하는 것을 특징으로 하는 본 발명의 화장료 조성물을 제조하였다.

실험예 2: 자유라디칼 소거활성 측정 실험

실시예 1에서 수득한 시료의 자유라디칼 소거활성을 측정하기 위해 실험실 조건에서 녹차추출물 같은 우수한 항산화활성을 갖는 추출물을 비교샘플로 하고 DPPH법을 이용하여 자유라디칼 소거 활성을 측정하였다.

DPPH법은 DPPH(2,2-Di(4-tert-octylphenyl)-1-1picrylhydrazyl free radical)라는 유리기를 사용하여 환원력에 의한 자유라디칼 소거활성을 측정한다. 피검물질에 의해 DPPH가 환원되어 흡광도가 감소하는 정도를 공시험액의 흡광도와 비교하여 파장 560nm에서 자유라디칼 소거율을 측정하였다.

DPPH 자유라디칼 소거활성 측정을 위하여 0.2%, 0.1%, 0.05%, 0.005% 농도의 파극천 고온고압 추출물을 준비하였다. 상기 농도의 추출물을 96웰 플레이트에 각각 넣고, 여기에 100uM 메탄올용액으로 제조된 DPPH를 첨가하여 용액의 총 부피가 200㎕가 되도록 하였다. 이것을 37℃에서 30분간 방치한 후 560nm에서 흡광도를 측정하였다.

<수학식 1>

자유라디칼 소거활성(%)= {100-(B/A)}X100

A: 본 발명의 시료를 처리하지 않은 대조군 웰의 흡광도,

B: 본 발명의 시료를 처리한 실험군 웰의 흡광도,

표 2와 같이, 실시예 1의 생약재 복합 발효 추출물은 항산화 활성이 우수한 녹차추출물보다 더 우수한 항산화 효과를 나타냄을 알 수 있다.

시료명	항산화효과(%)
비교예 1 (0.1중량%)	85
비교예 2 (0.1중량%)	92
실시예1 (0.1중량%)	98
녹차 추출물	92

실험예 3: 시료의 세포독성

실시예 1에서 수득한 생약재 복합 발효 추출물의 피부세포에 대한 세포독성을 평가하였다. 96-웰 시험 플레이트에 세포배양 배지(DMEM에 10% FBS가 첨가된 것)에 희석된 섬유아세포(fibroblast)를 1x105cells/mL개씩 넣고 24시간 동안 부착시켰다. 실시예 1에서 수득한 시료를 각 웰에 적절한 농도로 희석하여 처리한 후 24시간 동안 배양하였다. 24시간이 지나면 배지를 제거하고, 각 웰 당 MTT(3-(4,5-dimethylthiazol-2yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide) 용액(2.5mg/㎖)이 함유된 세포배양 배지 200㎕를 넣은 후 2시간 동안 37℃ CO2배양기에서 배양하였다. 배지를 제거하고 DMSO(Dimethyl sulfoxide)를 100㎕씩 넣어주었다. 5분간 진탕하여 세포를 용해시킨 후 마이크로플레이트 판독기에서 565nm 흡광도를 측정하였다. 수학시 2와 같이 세포생존율(%)을 정하였으며, 세포의 생존에 영향을 미치지 않는 시료의 농도를 결정하였다.

<수학식 2>

세포생존율(%)={(St-Bo)/(Bt-Bo)}X 100

Bo: 세포배양배지만을 발색 반응한 웰의 565 nm 흡광값,

Bt: 시료를 처리하지 않고 발색 반응한 웰의 565 nm 흡광값,

St: 시료를 처리하고 발색 반응한 웰의 565 nm 흡광값.

시료명	100% 세포 생존 농도
비교예 1 (0.1중량%)	2%
비교예 2 (0.1중량%)	2%
실시예 1 (0.1중량%)	2%

상기 표 3과 같이, 피부 섬유아세포의 100% 생존 처리농도는 비교예 1, 비교예 2와 실시예 1 모두 0.1 중량%의 농도로 처리하였을 때 모두 2% 이하로, 이는 일반적으로 화장품에 사용되는 농도를 고려하였을 때 피부 자극 유발 가능성이 적은 안전한 시료인 것을 말해준다.

실험예 4: 인 비트로 MMP -1 활성저해 실험

MMP-1 활성 저해 효과를 측정하기 위하여 형광 분석법을 이용하였다. 실험에 사용한 기질은 형광물질이 표지된 DQ-Collagen이고, 효소(collagenase)는 Molecular probe사(Eugene, OR, USA)에서 시판중인 제품을 사용하였으며, 반응완충액(0.5 M Tris-HCl, 1.5 M NaCl, 50 mM CaCl2, 2 mM sodium azide, pH 7.6)은 10배 희석 후 사용하였다. 반응완충액 100㎕에 0.25㎎/㎖로 반응완충액에 용해한 DQ collagen 20㎕와 비교예 1, 2와 실시예 1에서 수득한 시료(0.1중량%) 40㎕을 첨가하고 0.5unit로 희석한 콜라게나아제(collagenase) 40㎕을 첨가하였다. 어두운 곳, 실온에서 20분 경과 후 형광 분광광도계(Perkin Elmer, UK)를 이용하여 흡수파장 495nm, 방출파장 515nm로 형광값을 측정하고, 대조군으로서 효소액 대신 반응완충액을 효소와 동량 첨가하여 형광값을 측정하였으며 시료 자체의 형광값도 측정하여 효소활성 계산시 보정하였다.

결과는 표 4에 나타냈으며 실시예 1의 시료를 0.25% 처리 시 금속단백질분해효소(MMP-1) 저해 활성이 우수하였으며, 녹차 추출물에 비해서도 저해 활성이 우수하였다.

상기 결과로부터 생약재 복합 발효 추출물의 금속단백질분해효소(MMP-1) 활성 저해효과가 우수하다는 사실을 확인할 수 있었고, 이를 바탕으로 본 발명의 피부 외용제 조성물은 금속단백질분해효소를 효과적으로 저해함으로써 피부의 탄력 저하 및 주름 형성을 예방 또는 개선할 수 있음을 추론할 수 있었다.

시료명	MMP-1 활성 저해율 (%)
비교예 1 (0.25중량%)	88
비교예 2 (0.25중량%)	70
실시예1 (0.25중량%)	51
녹차추출물 0.25중량%	67

실험예 5: 자외선 조사 후 생약재 복합 발효 추출물에 의한 MMP -1 발현억제 평가

UV 조사 후 실시예 1에서 수득한 시료 첨가 후 MMP-1 농도를 측정하기 위해서 효소면역 시험법(ELISA)을 실시하였다.

UV 챔버를 이용하여 인간 진피 섬유아세포에서 UVA를 6.3J/㎠의 에너지로 조사하였다. 자외선 조사량과 배양시간은 예비실험을 통하여 섬유아세포에서 MMP 발현량이 최대가 되는 조건을 확립하였다. 음성 대조군은 은박지로 싸서 UVA의 환경에 같은 전사되는 동안의 세포는 이전에 분주된 배지 그대로이고 UVA를 조사한 후 샘플이 들어간 배지로 교환하여 24시간 배양 후 배지를 회수하여 96웰에 코팅하였다. 일차항체(MMP-1 (Ab-5) 단일클론항체)를 처리하고 37℃에서 60분간 반응시켰다. 이차항체인 항마우스 IgG(whole mouse, alkaline phosphatase conjugated)를 가하여 다시 60분 정도 반응시킨 후, 알카린 포스파타제 기질용액(1㎎/㎖ p-나이트로페닐인산을 포함하는 다이에탄올아민 완충용액)을 상온에서 30분간 반응시키고 마이크로플레이트 판독기로 405nm 흡광도를 측정하였다. 대조군으로는 시료를 첨가하지 않은 것을 사용하였다.

표 5에서 확인할 수 있듯이, 자외선 조사시 발현이 유도되는 MMP-1에 대하여 실시예 1의 시료를 가하면 MMP-1 억제율이 증가되었고, 시료를 처리하지 않은 대조군에 비하여 65% 이상의 억제율을 보였다. 이는 대조군으로 사용한 레티놀의 억제율에 비해 상당히 우수한 결과이다.

시험군	MMP-1 발현억제율 (%)
음성 대조군	-
비교예 1 (0.25중량%)	73
비교예 2 (0.25중량%)	60
실시예1 (0.25중량%)	31
레티놀	41

실험예 6: 티로시나제 활성 억제 실험

상기 실시예 1에서 수득한 시료의 티로시나제 활성 저해효과를 확인하기 위해 미백제로 잘 알려진 알부틴을 비교시료로 사용하였다. 티로시나제는 버섯에서 분리 및 정제된 것으로 Sigma 사에서 구입하여 사용하였다. 기질인 L-티로신(Sigma)은 0.05M 인산나트륨 완충용액(pH 6.8)에 용해하여 0.1㎎/㎖ 용액으로 만들어 사용하였다. 실시예 1의 시료는 0.05M 인산나트륨 완충용액(pH 6.8)에 적당한 농도로 조절하여 용해한 후 사용하였다. L-티로신 용액 0.5㎖를 시험관에 넣고 여기에 시료 0.5㎖을 가하고 37℃에서 25분간 반응시켰다. 이 반응액이 든 시험관을 얼음 위에 놓고 급냉시켜 반응을 중지시킨 후 파장 475nm 흡광도를 측정하였다. 대조군으로는 상기 시료 대신 완충용액 0.5㎖를 넣은 것을 사용하였다.

상기 각 시료의 티로시나아제 활성 저해율은 수학식 3에 따라 계산하였다.

<수학식 3>

티로시나제 활성 저해율(%) = 100-[(비교군 흡광도/대조군 흡광도)]X100

결과는 표 6에 나타냈으며 실시예 1의 시료 처리시 티로시나아제 저해율은 알부틴과 유사하다.

시료명	티로시나제 활성 저해율(%)
대조군	-
비교예 1 (0.25중량%)	77
비교예 2 (0.25중량%)	68
실시예 1 (0.25중량%)	40
알부틴 0.25 중량%	59

실험예 7: B16F1 멜라닌 세포를 이용한 멜라닌 합성억제 실험

비교예 1, 비교예 2 및 실시예 1 시료의 미백효과를 확인하기 위해 B16F1 멜라닌 세포에 대한 멜라닌 합성억제 효과를 측정하였다.

B16F1 멜라닌 세포의 멜라닌 합성 억제효과 측정은 다음과 같이 행하였다. B16F1 멜라닌 세포를 6웰 플레이트에 각 웰당 2 x 10⁶ 농도로 분주하고 세포를 부착시킨 후 독성을 유발하지 않는 농도로 시료를 처리하여 72시간 동안 배양하였다. 72시간 배양 후 세포를 트립신(trypsin)-EDTA로 떼어낸 후 세포수를 측정한 다음 원심분리하여 세포를 회수하였다. 세포 내 멜라닌의 정량은 로탄[Lotan : Cancer Res., 40, 3345-3350(1980)]의 방법을 약간 변형하여 실시하였다. 셀 펠릿을 PBS로 1회 세척한 후 균질화 완충용액(50mM 소듐 포스페이트, pH 6.8, 1% Triton X-100, 2mM PMSF(phenylmethylsulfonyl fluoride)) 1㎖를 첨가하여 5분간 와류하여 세포를 파쇄하였다. 원심분리(3,00 rpm, 10분)gkdu 얻은 세포여액에 1N NaOH(10% DMSO(Dimethyl Sulfoxide))를 첨가하여 추출된 멜라닌을 용해한 후 마이크로 플레이트 판독기로 405nm에서 멜라닌의 흡광도를 측정한 다음 멜라닌을 정량하여 시료의 멜라닌 생성 저해율(%)을 측정하였다. B16F1 멜라닌 세포의 멜라닌 생성 저해율(%)은 수학식 4에 의하여 계산하였다.

<수학식 4>

멜라민 합성 저해율(%) = [(A-B)/A] × 100

A: 시료를 첨가하지 않은 웰의 멜라닌 양

B: 시료를 첨가한 웰의 멜라닌 양

표 7과 같이, B16F1 멜라닌 세포의 멜라닌 합성 억제효과를 시험한 결과 실시예 1의 생약재 복합 발효 추출물 시료는 0.25%에서 47%의 멜라닌 합성 억제 효과를 나타내었다. 특히 비교예 2의 생약재 발효 추출물보다 뛰어난 멜라닌 합성 억제 효과를 나타내었으며, 알부틴과 유사한 멜라닌 합성 억제 효과를 나타내었다.

시료명	멜라닌 합성 저해율(%)
음성 대조군	-
비교예 1 (0.25중량%)	20
비교예 2 (0.25중량%)	33
실시예1 (0.25중량%)	57
알부틴 0.25 중량%	44

실험예 8: 자외선 조사에 의한 세포독성 완화 효과

비교예 1, 비교예 2 및 실시예 1 시료의 자외선 조사에 의한 세포독성의 완화 효과를 평가하였다. 섬유아세포(fibroblast)를 24-웰 시험 플레이트에 1x10⁵개씩 넣고 24시간 동안 부착시켰다. 각 웰을 PBS로 1회 세척하고 각 웰에 500ul의 PBS를 넣었다. 이 섬유아세포에 자외선 B(UVB) 램프(Model: F15T8, UV B 15W, Sankyo Dennki사, Japan)를 이용하여 자외선 10mJ/㎠를 조사한 후 PBS를 덜어내고 세포배양 배지(DMEM에 10% FBS가 첨가된 것) 1㎖을 첨가하였다. 여기에 평가하고자 하는 시료를 처리한 후 24시간 동안 배양하였다. 24시간이 지나면 배지를 제거하고, 각 웰 당 세포배양 배지 500㎕배지와 MTT 용액(2.5㎎/㎖) 60㎕를 넣은 후 2시간 동안 37℃ CO2배양기에서 배양하였다. 배지를 제거하고 이소프로판올-HCl(0.04N)을 500㎕씩 넣어주었다. 5분간 진탕하여 세포를 용해시키고 상등액 100㎕씩을 96-웰 시험 플레이트에 옮긴 후, 마이크로플레이트 판독기에서 565nm 흡광도를 측정하였다. 수학식 5와 같이 세포생존율(%)을 측정하고 자외선에 의한 세포독성 완화율은 수학식 6에 의하여 계산하였다.

<수학식 5>

세포생존율(%) ={(St-Bo)/(Bt-Bo)}X 100

Bo: 세포배양배지 만을 발색 반응한 웰의 565nm 흡광도,

Bt: 시료를 처리하지 않은 웰을 발색 반응한 웰의 565nm 흡광도,

St: 시료를 처리한 웰을 발색 반응한 웰의 565nm 흡광도.

<수학식 6>

자외선에 의한 세포독성 완화율(%) =1-(St-Bo)/(Bt-Bo)X 100

Bo: 자외선 조사하지 않고 시료 처리하지 않은 웰의 세포 생존율,

Bt: 자외선 조사하고 시료를 처리하지 않은 웰의 세포생존율,

St: 자외선 조사하고 시료를 처리한 웰의 세포생존율.

표 8에서 확인할 수 있듯이, 실험 결과 실시예 1의 생약재 복합 발효 추출물은 0.25% 농도에서 60%의 자외선에 의한 세포 독성 완화를 보였다. 비교예 1의 시료와 비교하여 세포독성 완화가 증가한 것으로 확인되어, 낮은 농도에서도 자외선에 의한 세포독성을 효과적으로 방어함을 알 수 있었다.

시료명	세포독성 완화율 (%)
비교예 1 (0.25중량%)	35
비교예 2 (0.25중량%)	47
실시예 1 (0.25중량%)	80

실험예 9: 자외선 조사에 의한 염증성 사이토카인 발현 억제효과

비교예 1, 비교예 2 및 실시예 1 시료의 자외선 조사에 의해 발현되는 염증성 사이토카인 발현 억제효과를 평가하기 위하여 사람의 표피조직에서 분리한 섬유아세포(Fibroblast)를 24-웰 시험 플레이트에 5X10⁴개씩 넣고 24시간 동안 부착시켰다. 각 웰을 PBS로 1회 세척하고 각 웰에 500㎕의 PBS를 넣었다. 이 섬유아세포에 자외선B(UVB) 램프(Model : F15T8, UV B 15W, Sankyo Dennki사, Japan)를 이용하여 자외선 10mJ/㎠를 조사한 후 PBS를 덜어내고 세포배양 배지(DMEM에 FBS가 첨가되지 않은 배지) 350㎕를 첨가하였다. 여기에 평가하고자 하는 시료를 처리한 후 5시간 동안 배양하였다. 배양 상층액을 150㎕ 취하여 IL-1α를 정량함으로써 시료의 염증성 사이토카인 발현억제효과를 판단하였다. IL-1α의 양은 효소면역분석법 (Enzyme-linked Immunosorbent Assay)를 이용하여 정량화하였으며, IL-1α의 생성율은 수학식 7에 의해 계산하였다.

<수학식 7>

염증성 사이토카인 발현 억제율(%) =1-(St-Bo)/(Bt-Bo)X 100

Bo : 자외선 조사하지 않고 시료 처리하지 않은 웰의 IL-1α생성량,

Bt : 자외선 조사하고 시료를 처리하지 않은 웰의 IL-1α생성량,

St : 자외선 조사하고 시료를 처리한 웰의 IL-1α생성량.

실험 결과, 실시예 1의 생약재 복합 발효 추출물은 자외선에 의한 염증성 사이토카인인 IL-1α의 생성을 0.25% 농도에서 47% 억제하여, 자외선에 의한 염증 발생을 낮은 농도에서 효과적으로 방어함을 알 수 있다(표 9).

시료명	염증성 사이토카인 발현 억제율(%)
비교예 1 (0.25중량%)	25
비교예 2 (0.25중량%)	40
실시예 1 (0.25중량%)	67

실험예 10: 타입 1 프로콜라겐 생합성 촉진 효과

실시예 1에서 수득한 생약재 복합 발효 추출물을 첨가한 후 피부기질 성분인 타입 1 프로콜라겐의 생합성을 촉진시키는 효과를 알아보기 위하여 프로콜라겐 분석(procollagen assay)을 아래와 같은 방법으로 실시하였다.

신생아의 포피조직에서 분리한 사람진피섬유아세포(human dermal fibroblast)는 Modern Tissue Technology(MTT, Korea)로부터 분양받아 DMEM/F-12(3:1)배지에 10% 우태아혈청(FBS)을 첨가하여 1× 10⁴cell/㎠ 농도로 배양하였다. 70-80% 정도 자라면 1:3의 비율로 분주하여 계대 배양하였고, 3~4차 계대배양된 세포를 실험에 이용하였다. 프로콜라겐의 양을 측정하는 실험을 위해서 섬유아세포를 48 웰 플레이트(well plate)에 90% 이상 배양한 후 실시예 1 시료를 0.25% 농도로 가하고, 24시간 후에 배지 중에 유리된 프로콜라겐의 양을 프로콜라겐타입-1C-펩타이드 EIA 키트(procollagen type-1 C-peptide EIA kit)(MK101, Takara, Japan)를 사용하여 측정하였다.

결과는 표 10에 나타냈으며, 실시예 1 시료를 0.25% 처리시 프로콜라겐의 생합성이 64%를 촉진하였으며 비교예 1에 비해 프로콜라겐의 생합성 촉진이 약 2배 이상 증가하였고, 이는 세포신호전달 물질인 TGF-β와 유사한 효과였다.

시료명	프로콜라겐 생합성촉진효과
비교예 1 (0.25중량%)	25
비교예 2 (0.25중량%)	40
실시예 1 (0.25중량%)	64
TGF-β	50

실험예 11

실시예 1에서 수득한 생약재 복합 발효 추출물을 함유한 화장료를 제조하여 사람을 대상으로 비교예 3과 비교실험을 행하여 피부 탄력 개선 효과 및 주름 개선 효과를 평가하였다.

비교실험에 사용된 화장료는 크림형태이고, 그 조성은 표 10과 같다. 우선 표 11에 기록되어 있는 나)상을 가열하여 70℃에 보존한다. 이것에 가)상을 가하여 예비유화 후 호모믹서로 균일하게 유화하고 다음에 서서히 냉각하여 크림(실시예 2, 비교예 3)을 제조한다. 실험자(20세-35세의 여성) 20명을 대상으로 얼굴 오른쪽 부위에는 실시예 2에서 제조된 크림을, 얼굴 왼쪽 부위에는 비교예 3에서 제조된 크림을 각각 1일 2회씩 연속 2개월간 도포하였다.

실험완료 후 피부 탄력 개선 효과는 제품 사용 전과 2개월간 사용 후에 피부탄력측정기(cutometer SEM 575, C+K Electronic Co., Germany)를 이용하여 측정하였다. 실험결과는 하기 표 12에 Cutometer SEM 575의 △R7 값으로 기재하였는데 R7 값은 피부의 점탄성(viscoelasticity)을 나타낸다. 표 12와 같이 생약재 복합 발효 추출물을 함유한 크림을 도포한 실험자의 피부 탄력개선 효과가 우수함을 알 수 있다.

원료	실시예 2	비교예 3
스테아릴 알콜	8	8
스테아린산	2	2
스테아린산 콜레스테롤	2	2
스쿠알란	4	4
2-옥틸도데실알콜	6	6
폴리옥시에틸렌(25몰부 가)알콜에스테르	3	3
글리세릴모노스테아린산 아스테르	2	2
실시예 1의 생약재 복합 발효 추출물	1	-
프로필렌글리콜	5	5
적량	적량	적량

주)단위: 중량%

실험제품	피부탄력효과(△R7)
실시예 2	0.38
비교예 3	0.11

n=20, p<0.05

실험자(20세-35세의 여성) 20명을 대상으로 얼굴 오른쪽 부위에는 실시예 2에서 제조된 크림을, 얼굴 왼쪽 부위에는 비교예 3에서 제조된 크림을 각각 1일 2회씩 연속 2개월간 도포하였다.

실험완료 후 피부 주름 개선 효과는 제품 사용 전과 2개월간 사용 후에 피부의 주름개선효과를 알아보기 위하여 실리콘 재질의 모사판(replica)을 제작하여 지정 부위의 주름의 상태를 화상분석기인 비지오미터(visiometer: SV60, C+K Electronic Co., Germany)로 측정하였다. 그 결과를 하기 표 13에서 나타내었으며, 이 결과는 2개월 후의 각각의 파라미터(parameter) 값에서 2개월 전 파라미터 값을 뺀 것의 평균을 나타낸 것이다. 즉, 이 값이 음수가 나올수록 주름 개선 효과가 높다는 것을 의미한다. 따라서 표 13에서 나타나듯 실시예 1의 생약재 복합 발효 추출물을 함유한 실시예 2의 피부 주름 개선 효과가 크게 증진되었음을 확인할 수 있었다.

실험제품	R1	R2	R3	R4	R5
실시예 2	-0.21	-0.17	-0.11	-0.08	-0.09
비교예 3	-0.12	-0.06	-0.05	-0.04	-0.02
R1: 주름 등고선의최고치와 최저치의 차이값 R2: 주름 등고선을 임의로 5칸씩 나눈 후 그 중 R1값 들의 평균 R3: 5개씩 나눈 R1값 중 최고치 R4: 주름 등고선의 기선(baseline)에서 각각의 꼭대기와 계곡의 값을 뺀 평균값 R5: 주름 등고선의 기선에서 각각의 주름 윤곽을 뺀 값의 평균값

실험예 12

실시예 1에서 수득한 생약재 복합 발효 추출물을 함유한 화장료를 제조하여 사람을 대상으로 피부 미백효과를 비교예 3과 비교실험을 행하여 평가하였다.

비교실험에 사용된 화장료는 크림형태이고, 그 조성은 표 11에 나타낸 바와 같다. 우선 표 11에 기록되어 있는 나)상을 가열하여 70℃에 보존한다. 이것에 가)상을 가하여 예비유화 후 호모믹서로 균일하게 유화하고 다음에 서서히 냉각하여 크림 (실시예 2, 비교예 3)을 제조한다. 실험자 (20세-35세의 여성) 20명을 대상으로 얼굴 오른쪽 부위에는 실시예 2에서 제조된 크림을, 얼굴 왼쪽 부위에는 비교예 3에서 제조된 크림을 각각 1일 2회씩 연속 2개월간 도포하였다. 시험 완료 후 얼굴 좌우 양편의 도포 부위 피부를 화상분석기 및 피부색의 변화를 크로마메타(Minolta CR300)를 이용하여 색의 밝기변화(ΔL)를 측정하고, 복수의 숙련자에 의한 객관적 육안 관찰과 피검자에 의한 주관적 육안관찰을 실시하여 하기 등급 분류에 따라 효과를 측정하였다. 그 결과를 하기 표 15에 나타내었다. 이때 미백효능 정도를 다음의 7등급으로 분류하여 평가하였다.

미백효능 평가 기준; -3: 매우 악화, -2: 악화, -1: 약간 악화, 0:변화 없음, 1: 약간 개선, 2: 개선, 3: 매우 개선.

표 14에서 나타낸 바와 같이 생약재 복합 발효 추출물을 함유한 크림을 도포한 실험자의 안면 피부에서 미백효과가 우수함을 알 수 있다.

피부색의 밝기 변화(ΔL)		숙련자의객관적 평가		피검자의 주관적 평가
실험예 11	비교예 4	실험예 11	비교예 4	실험예 11	비교예 4
3.98	1.44	2.77	1.55	3.07	1.7

실험예 13: SLS 에 의한 피부자극 완화 효과

본 실험에서는 실시예 1에서 수득한 생약재 복합 발효 추출물을 함유한 화장료의 자극 완화 효과를 인체 첩포 시험으로 평가하였다.

일반적 화장품 처방(크림, 로션, 스킨, 에센스)에 자극을 일으키는 SLS(Sodium lauryl sulfate) 1%와 실시예 2에서 제조된 제품을 혼용하여 24시간, 48시간, 72시간 동안 첩포하여 자극 유발지수를 바탕으로 자극완화 효과를 평가한 것이다.

20-50세의 건강한 남녀 50명의 팔 상박 부위에 FINN CHAMBER(FINLAND)를 이용하여 각각의 제품을 0.3 mg씩 첩포하고, 24시간 후 급성 자극 지수를 평가하였다. 평가 후 재차 동일한 부위에 동량의 제품을 첩포하여 48시간 및 72시간 후의 지연성 자극 지수를 평가하였다.

시험 결과 SLS를 단독으로 첩포한 부분은 24시간 후부터 피부에 붉게 자극이 나타났으나, 본 발명의 생약재 복합 발효 추출물을 함유하는 제품을 첩포한 경우에는 24시간, 48시간, 72시간 경과 후에도 아무런 피부 발작을 일으키지 않았다.

이 결과는 본 발명의 생약재 복합 발효 추출물이 화장료에 혼용되었을 때 자극을 유발시키는 기재(계면 활성제, 향, 알콜)에 의한 피부 자극을 감소시킬 수 있는 유의한 효과가 있음을 나타내는 것이다.

이하에 그 외의 실시예를 나타내었다. 즉, 실시예 1에서 수득한 본 발명의 생약재 복합 발효 추출물을 함유한 화장수, 유액 및 미용액을 실시예 3 내지 5와 같이 제조하였다. 이들 본 발명의 생약재 복합 발효 추출물을 함유한 화장수, 유액 및 미용액은 항산화 효과, 콜라겐 합성 촉진 효과, 피부 잔주름 개선 효과, 미백효과, 보습효과, 피부자극 완화효과, 아토피 개선효과 및 항염효과 등 피부개선에 우수한 효과를 나타내었다.

실시예 3: 본 발명의 생약재 복합 발효 추출물을 함유하는 화장수 제조

95% 에탄올 8g에 폴리피로리돈 0.05g, 올레일알콜 0.1g, 폴리옥시에틸렌모노올레이트 0.2g, 향료 0.2g, 파라옥시안식향산메틸에스테르 0.1g, 소량의 산화방지제, 소량의 색소를 혼합하였다. 실시예 1에서 수득한 본 발명의 생약재 복합 발효 추출물 10g, 글리세린 5g을 정제수 85.33g에 용해한 것에 상기 혼합액을 첨가한 후 교반하여 피부개선효과가 있는 화장수를 얻었다.

실시예 4: 본 발명의 생약재 복합 발효 추출물을 함유한 유액 제조

세틸알콜1.2g, 스쿠알란 10g, 바세린 2g, 파라옥시안식향산에틸에스테르 0.2g, 글리세린모노에스테아레이드 1g, 폴리옥시에틸렌(20몰 부가)모노올레이트 1g및 향로 0.1g을 70℃에서 가열·혼합하여 용해하고, 실시예 1에서 수득한 본 발명의 생약재 복합 발효 추출물 0.5g, 디프로필렌글리콜 5g, 폴리에틸렌글리콜-1500 2g, 트리에탄올아민 0.2g, 정제수 76.2g을 75℃로 가열해서 용해하였다. 양자를 혼합하여 유화시킨 후 냉각하여 수중유(O/W)형의 피부개선효과가 있는 유액을 얻었다.

실시예 5: 본 발명의 생약재 복합 발효 추출물을 함유한 미용액 제조

95% 에틸알콜 5g에 폴리옥시에틸렌솔비탄모노올레이트 1.2g, 키툴로오즈 0.3g, 히아루론산나트륨 0.2g, 비타민 E-아세테이트 0.2g, 감초산 나트륨 0.2g, 파라옥시안식향산에틸에스테르 0.1g, 실시예 1에서 수득한 본 발명의 생약재 복합 발효 추출물 1g 및 적량의 색소를 혼합하여 피부개선효과가 있는 미용액을 얻었다.

Claims (9)

1. (가) 지실, 식방풍, 치자열매, 우슬, 붉나무 미숙과, 붉나무 성숙과, 찔레나무 미숙과, 찔레나무 성숙과 및 수세미를 포함하는 생약재를 추출하는 단계;
   (나) 상기 생약재 추출물에 잎새버섯 균사체 또는 잎새버섯 균사체의 전 배양액을 혼합하여 1차 배양한 후, 배양액으로부터 잎새버섯 균사체를 제거하여 생약재 발효 추출물을 얻는 단계;
   (다) 상기 생약재 발효 추출물에 제주 오메기주를 혼합하여 2차 배양하는 단계; 및
   (라) 2차 배양액으로부터 누룩균을 제거하여 생약재 복합 발효 추출물을 얻는 단계;를 거쳐 얻어진 생약재 복합 발효 추출물을 유효성분으로 함유하는 화장료 조성물.
2. 청구항 1에 있어서,
   상기 (가) 단계의 생약재는 지실, 식방풍, 치자열매, 우슬, 붉나무 미숙과, 붉나무 성숙과, 찔레나무 미숙과, 찔레나무 성숙과 및 수세미가 각각 1~30 중량부임을 특징으로 하는 화장료 조성물.
3. 청구항 1에 있어서,
   상기 생약재 복합 발효 추출물은 화장료 조성물 전체에 대해 0.001~30.0 중량% 함유되는 것을 특징으로 하는 화장료 조성물.
   
4. 청구항 1에 있어서,
   상기 화장료 조성물의 제형은 화장수, 젤, 수용성 리퀴드, 크림, 에센스, 수중유(O/W)형 및 유중수(W/O)형으로 이루어진 기초화장료 제형; 수중유형 또는 유중수형의 메이크업베이스, 파운데이션, 스킨커버, 립스틱, 립그로스, 페이스파우더,투웨이케익, 아이새도, 치크칼라 및 아이브로우펜슬로 이루어진 색조화장료 제형; 중에서 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는 화장료 조성물.
   
5. 청구항 1에 있어서,
   상기 화장료 조성물은 피부 미백용인 것을 특징으로 하는 화장료 조성물.
6. 삭제
7. 청구항 1에 있어서,
   상기 화장료 조성물은 피부자극 완화용인 것을 특징으로 하는 화장료 조성물.
8. 삭제
9. 삭제