KR101803500B1

KR101803500B1 - 식물의 냉해 스트레스 내성과 관련된 신규 유전자 및 그의 용도

Info

Publication number: KR101803500B1
Application number: KR1020160126055A
Authority: KR
Inventors: 이형석; 박현; 이정은; 김우택; 변미영; 최려화
Original assignee: 한국해양과학기술원
Priority date: 2016-09-30
Filing date: 2016-09-30
Publication date: 2017-11-30
Anticipated expiration: 2036-09-30

Abstract

본 발명은 식물의 냉해 스트레스 내성과 관련된 신규 유전자 및 그의 용도 에 관한 것으로, 남극좀새풀(Deschampsia antarctica Desv.) 유래의 DaCold1 (Deschampsia antarctica Cold expressed 1) 유전자를 이용한 냉해 스트레스에 대한 내성을 증진시키는 방법; 냉해 스트레스에 대한 내성이 증진된 형질전환 식물체의 제조 방법; 상기 방법에 의해 제조된 냉해 스트레스에 대한 내성이 증가된 형질 전환 식물체; 이의 종자; 및 상기 DaCold1 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 식물체의 냉해 스트레스 내성 증진용 조성물을 제공한다. 본 발명에 따르면, 본 발명의 남극좀새풀(Deschampsia antarctica Desv.) 유래의 DaCold1 (Deschampsia antarctica Cold expressed 1) 단백질을 코딩하는 유전자는 식물체의 냉해 스트레스에 대한 내성에 관여를 하며, 이를 과발현시킨 형질전환 식물체는 냉해 스트레스에 대한 내성이 탁월하므로, 재배지역의 기후나 환경에 구애받지 않는 신기능 작물로 유용하게 이용될 수 있다.

Description

식물의 냉해 스트레스 내성과 관련된 신규 유전자 및 그의 용도{Novel Gene Implicated in Plant Cold Stress Tolerance and Use Thereof}

본 발명은 식물의 냉해 스트레스 내성과 관련된 신규 유전자 및 그의 용도 에 관한 것이다.

식물은 고정된 생착 환경 내에서 건조, 고염, 냉해, 중금속, 열충격, 홍수 및 오존과 같은 다양한 환경 스트레스에 지속적으로 직면하게 되며, 이러한 비생물학적 스트레스는 작물의 생장과 발달의 제한 요인이 되어 작물생산 감소 및 경작환경 제한으로 인한 경작지 감소의 주요 원인이 된다.

환경 스트레스는 식물의 성장을 저해하고 많은 중요한 농업 분야에서 수확물의 생산성을 제한하는 요소로서, 수분 스트레스, 저온 스트레스, 염해 스트레스, 산화 스트레스 등이 있다. 특히 수분 스트레스는 탈수, 고염도 및 저온과 같은 외부 환경에 의해 유발되며, 식물의 생장을 저해하는 환경 스트레스에 있어서 가장 가혹한 스트레스 중의 하나이다.

한편, 식물은 상기 스트레스에 대한 방어 기작을 가지고 있어서 생육에 부적합한 환경에 처하게 되면 그들의 형태를 조절하거나 생리적 대사과정을 조절함으로써 환경에 적응하여 생존하고자 하는 경향이 있다. 상기 스트레스 조건을 극복하기 위해, 식물은 신속하고 효율적인 유전자 발현 프로그램을 통해 스트레스 적응 또는 내성과 연관된 수많은 유전자를 발현한다. 수많은 스트레스-유도성 유전자들이 다양한 식물 종에서 밝혀진 바 있고, 상기유전자 산물의 기능이 보고된 바 있다(Lushchak, 2011 Comp. Biochem. Physiol. C Toxicol. Pharmacol. 153, 175-190).

즉, 식물은 비생물학적 스트레스에 노출된 이후, 유전자 발현의 패턴에서 일련의 변화가 일어나며, 이러한 반응은 성장속도, 생산성 및 종 분포에 영향을 미친다.

특히, 열대 또는 아열대 원산지를 갖는 곡물류인 벼는 종종 저온 손상을 받으며, 이러한 손상을 받은 식물체는 퇴록, 괴사 또는 생장 지연과 같은 다양한 증상을 나타낸다 (De Datta, 1981). 온대 지역에서, 벼는 종종 개화시기 뿐 아니라 유식물체 단계에서도 저온 손상에 직면하게 된다.

저온-반응 기전을 이해하기 위하여, 연구자들은 몇 종의 식물체에서 저온-유도성 단백질을 코딩하는 다수의 유전자를 분리하였으며(Guy, 1999; Thomashow, 1999), 저온 하에서 유도되는 유전자들은 다양한 유전산물을 생성시킴으로써 세포를 보호하는 기능을 하는 것으로 예측되었다. 그러나 아직까지 고등식물에 있어서 스트레스에 대한 내성이나 민감성에 관여하는 스트레스-관련 유전자들의 생물학적 기능들에 대한 지식은 여전히 부족한 상태다. 그러므로 작물의 생산성을 증가시키기 위해 스트레스 반응 유전자들에 대한 기능 연구가 중요하다.

남극좀새풀(Deschampsia antarctica Desv.)은 남극 지방의 가혹한 환경에서 번성하는 유일한 단자엽 식물로서, 환경 스트레스에 대응하는 고등식물의 방어 메카니즘 연구에 매우 유용한 식물이다. 최근 남극좀새풀을 이용하여 저온, 건조 및 염 스트레스에 대한 내성에 관여하는 유전자를 발굴하고자 하는 노력이 계속 되어오고 있지만, 아직 남극좀새풀 내 환경 스트레스 저항성을 조절하는 유전자는 거의 밝혀진 바가 없다. 본 발명자들은 애기장대(Arabidopsis thaliana)의 AtCBF1 유전자와 상동성을 가지는 남극좀새풀 유전자를 탐색한 결과, 냉해 스트레스에 관여하는 새로운 유전자를 동정하고 이를 DaCold1으로 명명하였다. DaCold1은 그 기능이 아직 밝혀지지 않은 신규 유전자로서, 비생물학적 스트레스, 즉, 냉해 스트레스와의 관계가 본 발명자들에 의하여 최초로 규명되었다.

본 발명자들은 식물의 비생물학적 스트레스, 특히 저온에 의해 발생하는 냉해 스트레스에 대한 저항성을 향상시킬 수 있는 유전자를 발굴함으로써 궁극적으로 식물의 생산성을 향상시키고 경작지 제한을 극복하고자 예의 연구 노력하였다. 그 결과, 남극좀새풀(Deschampsia antarctica Desv.) 유래의 DaCold1 유전자의 발현을 대상 식물체에서 증가시킬 경우 상술한 냉해 스트레스에 대하여 강화된 내성을 확인함으로써, 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서 본 발명의 목적은 식물의 냉해 스트레스(cold stress) 내성 증진 방법을 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적은 냉해 스트레스(cold stress)에 대한 내성이 증진된 형질전환 식물체의 제조 방법을 제공하는 데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 냉해 스트레스(cold stress)에 대한 내성이 증진된 형질전환 식물체를 제공하는 데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 냉해 스트레스(cold stress)에 대한 내성이 증진된 형질전환 식물체의 종자를 제공하는 데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 식물의 냉해 스트레스(cold stress) 내성 증진용 조성물을 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.

본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 다음 단계를 포함하는 식물의 냉해 스트레스(cold stress)에 대한 내성을 증진시키는 방법을 제공한다:

(a) 서열번호 2의 아미노산 서열을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열로 이루어진, 남극좀새풀( Deschampsia antarctica Desv.) 유래의 DaCold1 (Deschampsia antarctica Cold expressed 1) 단백질을 코딩 하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 제작하는 단계; 및

(b) 상기 (a) 단계의 재조합 벡터를 식물세포에 형질전환시켜 DaCold1 단백질을 코딩하는 유전자를 과발현시키는 단계.

본 발명에서 "냉해 스트레스(Cold Stress)"란 식물체의 성장 또는 생산성을 저하시키는 외부적인 환경 요인 중 비생물학적 스트레스(abiotic stress)로서 저온 스트레스를 의미한다. "냉해 스트레스 내성"이란 상기와 같은 저온 환경 스트레스에 의한 식물체의 성장 저하 또는 생산성의 저하가 억제되거나 지연되는 형질을 말한다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 상기 (a) 단계의 서열번호 2의 아미노산 서열을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열은 서열번호 1로 표시된 뉴클레오타이드 서열로 이루어진다.

본 발명에 따르면, 서열번호 1의 뉴클레오타이드 서열은 식물체에 다양한 비생물학적 스트레스를 가해준 뒤 유전자 발현 프로파일을 조사한 결과, 대조군에 비해 발현이 유의적으로 증가하는 것으로 새롭게 밝혀진 남극좀새풀 유전자의 뉴클레오타이드 서열이며, 이 유전자의 이름은 본 발명자들에 의해 DaCold1 (Deschampsia antarctica Cold expressed 1)으로 명명되었다. 후술하는 실시예에서 보는 바와 같이, 상기 유전자를 과발현시킨 식물체는 냉해 스트레스가 가해지는 환경에서도 그 생존률이 크게 증가함을 확인하였다.

본 발명에서 이용되는 뉴클레오타이드 서열은 첨부한 서열목록에 기재된 뉴클레오타이드 서열에 한정되지 않는다는 것은 당업자에게 명확하다.

뉴클레오타이드에서의 변이는 단백질에서 변화를 가져오지 않는 것도 있다. 이러한 핵산은 기능적으로 균등한 코돈 또는 동일한 아미노산을 코딩하는 코돈 (예를 들어, 코돈의 축퇴성에 의해, 아르기닌 또는 세린에 대한 코돈은 여섯 개이다), 또는 생물학적으로 균등한 아미노산을 코딩하는 코돈을 포함하는 핵산분자를 포함한다.

상술한 생물학적 균등 활성을 갖는 변이를 고려한다면, 본 발명에서 이용되는 핵산 분자는 서열목록에 기재된 서열과 실질적인 동일성(substantial identity)을 나타내는 서열도 포함하는 것으로 해석된다. 상기의 실질적인 동일성은, 상기한 본 발명의 서열과 임의의 다른 서열을 최대한 대응되도록 얼라인하고, 당업계에서 통상적으로 이용되는 알고리즘을 이용하여 얼라인된 서열을 분석한 경우에, 최소 60%의 상동성, 보다 바람직하게는 70%의 상동성, 보다 더 바람직하게는 80%의 상동성, 가장 바람직하게는 90%의 상동성을 나타내는 서열을 의미한다. 서열비교를 위한 얼라인먼트 방법은 당업계에 공지되어 있다. 얼라인먼트에 대한 다양한 방법 및 알고리즘은 Smith and Waterman, Adv . Appl . Math. 2:482(1981); Needleman and Wunsch, J. Mol . Bio. 48:443(1970); Pearson and Lipman, Methods in Mol . Biol . 24: 307-31(1988); Higgins and Sharp, Gene 73:237-44(1988); Higgins and Sharp, CABIOS 5:151-3(1989); Corpet et al., Nuc . Acids Res. 16:10881-90(1988); Huang et al., Comp. Appl . BioSci . 8:155-65(1992) 그리고 Pearson et al., Meth . Mol . Biol. 24:307-31(1994)에 개시되어 있다. NCBI Basic Local Alignment Search Tool(BLAST)(Altschul et al., J. Mol . Biol . 215:403-10(1990))은 NBCI(National Center for Biological Information) 등에서 접근 가능하며, 인터넷 상에서 blastp, blasm, blastx, tblastn 및 tblastx와 같은 서열 분석 프로그램과 연동되어 이용할 수 있다. BLSAT는 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/에서 접속 가능하다. 이 프로그램을 이용한 서열 상동성 비교 방법은 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/blast_help.html에서 확인할 수 있다.

즉, 본 발명에 따른 남극좀새풀(Deschampsia antarctica Desv.) 유래의 DaCold1 (Deschampsia antarctica Cold expressed 1) 단백질의 범위는 남극좀새풀(Deschampsia antarctica Desv.)로부터 분리된 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 단백질 및 상기 단백질의 기능적 동등물을 포함한다. "기능적 동등물"이란 아미노산의 부가, 치환또는 결실의 결과, 상기 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열과 적어도 70% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상, 더 더욱 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 갖는 것으로, 서열번호 2로 표시되는 단백질과 실질적으로 동질의 생리활성을 나타내는 단백질을 말한다. "실질적으로 동질의 생리활성"이란 식물의 냉해 스트레스에 대한 내성을 의미한다.

본 명세서에서 용어 "재조합"은 세포가 이종의 핵산을 복제하거나, 상기 핵산을 발현하거나 또는 펩티드, 이종의 펩티드 또는 이종의 핵산에 의해 암호된 단백질을 발현하는 세포를 지칭하는 것이다. 재조합 세포는 상기 세포의 천연 형태에서는 발견되지 않는 유전자 또는 유전자 절편을, 센스 또는 안티센스 형태 중 하나로 발현할 수 있다. 또한 재조합 세포는 천연 상태의 세포에서 발견되는 유전자를 발현할 수 있으며, 그러나 상기 유전자는 변형된 것으로서 인위적인 수단에 의해 세포 내 재도입된 것이다.

본 발명에서, 상기 DaCold1 유전자 서열은 재조합 발현 벡터 내로 삽입될 수 있다.

본 명세서에서 용어 "재조합 벡터"는 세균 플라스미드, 파아지, 효모 플라스미드, 식물 세포 바이러스, 포유동물 세포 바이러스, 또는 다른 벡터를 의미한다. 대체로, 임의의 플라스미드 및 벡터는 숙주 내에서 복제 및 안정화할 수 있다면 사용될 수 있다. 상기 벡터의 중요한 특성은 복제 원점, 프로모터, 마커 유전자 및 번역 조절 요소(translation control element)를 가지는 것이다.

본 발명에 따르면, 본 발명의 재조합 벡터는 (a) 상술한 본 발명의 뉴클레오타이드 서열; (b) 상기 뉴클레오타이드 서열에 작동적으로 결합(operatively linked)되어있고 식물세포에서 RNA 분자를 형성시키는 프로모터; 및 (c) 식물세포에서 작용하여 RNA 분자의 3'-말단의 폴리아데닐화를 야기시키는 폴리 A 시그널 서열을 포함하는 재조합 벡터일 수 있다.

본 명세서에서 용어 "작동적으로 결합"은 핵산 발현 조절 서열 (예: 프로모터, 시그널 서열, 또는 전사조절인자 결합 위치의 어레이)과 다른 핵산 서열사이의 기능적인 결합을 의미하며, 이에 의해 상기 조절 서열은 상기 다른 핵산 서열의 전사 및/또는 번역을 조절하게 된다.

본 발명의 벡터 시스템은 당업계에 공지된 다양한 방법을 통해 구축될 수 있으며, 이에 대한 구체적인 방법은 Sambrook et al. Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press(2001)에 개시되어 있다.

본 발명에 적합한 프로모터는, 식물체의 유전자 도입을 위해 당업계에서 통상적으로 이용되는 어떠한 것도 이용될 수 있으며, 예를 들어, SP6 프로모터, T7 프로모터, T3 프로모터, PM 프로모터, 옥수수의 유비퀴틴 프로모터, 컬리플라워 모자이크 바이러스 (CaMV) 35S 프로모터, 노팔린 씬타아제 (nos) 프로모터, 피그워트 모자이크 바이러스 35S 프로모터, 수가크레인 바실리폼 바이러스 프로모터, 콤멜리나 엘로우 모틀 바이러스 프로모터, 리불로오스-1,5-비스-포스페이트 카르복실라아제 스몰 서브유티트 (ssRUBISCO)의 광유도성 프로모터, 벼 사이토졸 트리오스포스페이트 이소머라아제 (TPI) 프로모터, 아라비돕시스의 아데닌 포스포리보실트랜스퍼라아제 (APRT) 프로모터 및 옥토파인 신타아제 프로모터를 포함한다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명에 적합한 3'-말단의 폴리아데닐화를 야기시키는 폴리 A 시그널 서열은 아그로박테리움 투메파시엔스의 노팔린 신타아제 유전자로부터 유래된 것 (NOS 3' end) (Bevan et al. Nucleic Acids Research, 11(2):369-385(1983)), 아그로박테리움 투메파시엔스의 옥토파인 신타아제 유전자로부터 유래된 것, 토마토 또는 감자의 프로테아제 억제자 I 또는 II 유전자의 3' 말단 부분, CaMV 35S 터미네이터 및 OCS 터미네이터(octopine synthase terminator)서열을 포함한다.

선택적으로, 상기 벡터는 리포터 분자(예: 루시퍼라아제 및 β-글루쿠로니다아제)를 코딩하는 유전자를 추가적으로 운반할 수 있다. 또한, 본 발명의 벡터는 선택 표지로서 항생제 (예: 네오마이신, 카베니실린, 카나마이신, 스펙티노마이신, 하이그로마이신 등) 내성 유전자 (예: 네오마이신 포스포트랜스퍼라아제 (nptII), 하이그로마이신 포스포트랜스퍼라아제 (hpt), 등)를 포함할 수 있다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 식물발현용 재조합벡터는 아그로박테리움(Agrobacterium) 바이너리 벡터이다.

본 명세서에서 용어 "바이너리 벡터"는 Ti(tumor inducible) 플라스미드에서 이동에 필요한 부분인 LB(left border)와 RB(right border)를 가지는 플라스미드와 타겟 뉴클레오타이드를 옮기는데 필요한 유전자를 가진 플라스미드를 두 개로 나누어 놓은 벡터를 말한다. 본 발명의 형질전환용 아그로박테리움은 본 발명의 상기 뉴클레오타이드 서열의 발현에 적합한 것이면 어느 것이라도 좋고, 예를 들어 본 발명에서 식물 형질전환용 아그로박테리움 균주로는 통상 아그로박테리움 투메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens) LBA4404을 사용할 수 있다.

본 발명의 재조합 벡터를 아그로박테리움에 도입하는 방법은 당업자에게 공지된 다양한 방법을 통해 실시될 수 있으며, 예를 들면 입자 충격법(particle bombardment), 전기천공법(electroporation), 형질감염법(transfection), 리튬아세테이트법(lithium acetate method) 및 열충격법(heat shock) 등이 있다. 구체적으로는 전기천공법(electroporation)을 사용한다.

특정 뉴클레오타이드 또는 이를 포함하는 식물발현용 재조합 벡터를 식물세포에 도입하는 방법은 당업계에 공지된 다양한 방법으로 실시될 수 있다.

형질전환된 식물세포의 선별은 형질전환 배양물을 선택제(예: 대사 억제제, 항생제 및 제초제)에 노출시켜 실시될 수 있다. 형질전환되고 선택제 내성을 부여하는 표지 유전자를 안정되게 포함하고 있는 식물세포는 상기한 배양물에서 성장하고 분할한다. 예시적인 표지는, 하이그로마이신 포스포트랜스퍼라아제 유전자, 글리코포스페이트 내성 유전자 및 네오마이신 포스포트랜스퍼라아제 (nptII) 시스템을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 식물 원형질 또는 다양한 익스플랜트로부터 식물체의 발달 또는 재분화시키는 방법은 당업계에 잘 알려져 있다. 아그로박테리움에 의해 도입된 외래 유전자를 포함하는 식물체의 발달 또는 재분화는 당업계에 공지된 방법에 따라 달성될 수 있다(참조: 미합중국 특허 제 5,004,863, 5,349,124 및 5,416,011 호).

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 다음 단계를 포함하는 냉해 스트레스(cold stress)에 대한 내성이 증진된 형질전환 식물체의 제조 방법을 제공한다:

(a) 서열번호 2의 아미노산 서열을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열로 이루어진, 남극좀새풀(Deschampsia antarctica Desv.) 유래의 DaCold1 (Deschampsia antarctica Cold expressed 1) 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 식물세포에 형질전환시켜 DaCold1 단백질을 코딩하는 유전자를 과발현시키는 단계; 및

(b) 상기 식물세포로부터 냉해 스트레스 저항성이 증진된 형질전환 식물체를 수득하는 단계.

본 발명에서 이용되는 아미노산 서열, 뉴클레오타이드 서열 및 이들을 포함하는 식물발현용 재조합 벡터에 대해서는 이미 상술하였으므로, 과도한 중복을 피하기 위하여 그 기재를 생략한다.

본 발명의 방법을 실시하기 위한 형질전환 식물세포 및 형질전환 식물체의 제조는 당업계에 일반적으로 공지된 방법(Methods of Enzymology, Vol. 153, (1987))에 따라 실시될 수 있다. 외래성 폴리뉴클레오티드를 플라스미드나 바이러스 등과 같은 벡터 등의 운반체에 삽입하여 식물을 형질전환시킬 수 있고, 아그로박테리움 박테리아를 매개체로 사용할 수 있으며(Chilton et ai. Cell 11:263:271(1977)), 직접 외래성 폴리뉴클레오티드를 식물 세포내로 도입시켜 식물을 형질전환시킬 수 있다(Lorz et ai. Mol. Genet. 199:178-182;(1985)). 예를 들어, T-DNA 부위를 포함하지 않는 벡터를 이용하는 경우에는 전기천공법(electroporation), 입자충격법(microparticle bombardment), 폴리에틸렌글리콜 침전법(polyethylene glycol-mediated uptake)을 이용할 수 있다.

일반적으로 식물을 형질전환시킴에 있어 많이 사용되는 것이 외래성 폴리뉴클레오티드로 형질전환 된 아그로박테리움 투메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens)로 식물 세포나 종자 등을 감염시키는 방법이다(참조: 미합중국 특허 제 5,004,863, 5,349,124 및 5,416,011 호). 당업자는 공지된 적절한 조건하에서 형질전환된 식물 세포나 종자를 배양 또는 재배하여 식물로 발육시킬 수 있다.

또한, 본 발명의 방법은 본 발명에 따른 재조합 벡터로 형질전환된 식물 세포로부터 형질전환 식물을 재분화하는 단계를 포함할 수 있다. 형질전환 식물 세포로부터 형질전환 식물을 재분화하는 방법은 당업계에 공지된 임의의 방법을 이용할 수 있다.

형질전환된 식물세포는 전식물로 재분화되어야 한다. 캘러스 또는 원형질체 배양으로부터 성숙한 식물의 재분화를 위한 기술은 수많은 여러 가지 종에 대해서 당업계에 주지되어 있다(Handbook of Plant Cell Culture, 1-5권, 1983-1989 Momillan, N.Y.).

본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상기 방법에 의해 제조된 냉해 스트레스에 대한 내성이 증가된 형질전환 식물체 및 이의 종자를 제공한다.

본 명세서에서, 용어 "식물(체)"는 성숙한 식물뿐만 아니라 성숙한 식물로 발육할 있는 식물 세포, 식물 조직 및 식물의 종자 등을 모두 포함하는 의미로서 이해된다.

본 발명에서 형질전환의 대상이 되는 식물체는 벼, 밀, 보리, 옥수수, 콩, 감자, 밀, 팥, 귀리 및 수수를 포함하는 식량 작물류; 애기장대, 배추, 무, 고추, 딸기, 토마토, 수박, 오이, 양배추, 참외, 호박, 파, 양파 및 당근을 포함하는 채소 작물류; 인삼, 담배, 목화, 참깨, 사탕수수, 사탕무우, 들깨, 땅콩 및 유채를 포함하는 특용작물류; 사과나무, 배나무, 대추나무, 복숭아, 양다래, 포도, 감귤, 감, 자두, 살구 및 바나나를 포함하는 과수류; 장미, 글라디올러스, 거베라, 카네이션, 국화, 백합 및 튤립을 포함하는 화훼류; 및 라이그라스, 레드클로버, 오차드그라스, 알파알파, 톨페스큐 및 페레니얼라이그라스를 포함하는 사료작물류를 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다.

또한, 상기 본 발명에 따른 방법이 적용될 수 있는 식물체로는 쌍자엽 식물 또는 단자엽 식물을 포함하며, 바람직하게는 단자엽 식물이다.

상기 쌍자엽 식물의 예로는 이에 한정되지는 않으나, 애기장대, 가지, 담배, 고추, 토마토, 우엉, 쑥갓, 상추, 도라지, 시금치, 근대, 고구마, 샐러리, 당근, 미나리, 파슬리, 배추, 양배추, 갓무, 수박, 참외, 오이 호박, 박, 딸기, 대두, 녹두, 강낭콩 및 완두가 있다.

상기 단자엽 식물의 예로는 이에 한정되지는 않으나, 벼, 밀, 보리, 죽순, 옥수수, 토란, 아스파라거스, 양파, 마늘, 파, 부추, 달래, 마 및 생강이 있다.

상기 쌍자엽 식물체는 바람직하게는 애기장대(Arabidopsis thaliana)일 수 있고, 단자엽 식물체는 바람직하게는 벼(Oryza sativa)일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 서열번호 2의 아미노산 서열을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열로 이루어진, 남극좀새풀(Deschampsia antarctica Desv.) 유래의 DaCold1 (Deschampsia antarctica Cold expressed 1) 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 식물의 냉해 스트레스(cold stress) 내성 증진용 조성물을 제공한다.

본 발명의 조성물은 유효성분으로 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 남극좀새풀(Deschampsia antarctica Desv.) 유래의 DaCold1 (Deschampsia antarctica Cold expressed 1) 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터에 포함된 형태로 포함할 수 있다. 상기 유전자는 식물체의 냉해 스트레스 내성을 증진시키는 효과가 우수하다.

본 발명에서 이용되는 아미노산 서열, 뉴클레오타이드 서열 및 이들을 포함하는 재조합 벡터에 대해서는 이미 상술하였으므로, 과도한 중복을 피하기 위하여 그 기재를 생략한다.

본 발명의 남극좀새풀(Deschampsia antarctica Desv.) 유래의 DaCold1 (Deschampsia antarctica Cold expressed 1) 단백질을 코딩하는 유전자는 식물체의 냉해 스트레스에 대한 내성에 관여를 하며, 이를 과발현시킨 형질전환 식물체는 냉해 스트레스에 대한 내성이 탁월하여 재배지역의 기후나 환경에 구애받지 않는 신기능 작물로 유용하게 이용될 수 있다.

도 1은 DaCold1 상동체(homologs)의 계통학적 분석 결과를 보여준다.
도 2는 독보리(ryegrass), 밀, 보리, 쌀 및 애기장대로부터의 10 개 DaCold1 상동체(homologs)의 다중 서열 정렬을 보여준다. 밑줄 친 부분은 보존적인 AP2 DNA 결합-도메인을 나타낸다.
도 3은 다양한 비생물학적 스트레스(냉해, 고염, 건조) 조건 하에서의 형질전환 식물체 내 DaCold1 유전자 발현 양상에 대한 qPCR 분석결과를 보여준다. 왼쪽의 수직 축은 유전자 전사체 양의 상대적 비율을 내부 대조군인 EF1a와 비교하여 상대적 비율로 표시한 것이다. 데이터 및 에러 바는 3개의 복제 샘플의 실험 값에 대한 평균 및 표준편차를 나타낸다.
도 4는 냉해 스트레스 조건 하에서의 형질전환 식물체의 조직별 DaCold1 유전자 발현 양상에 대한 qPCR 분석결과를 보여준다. 왼쪽의 수직 축은 유전자 전사체 양의 상대적 비율을 내부 대조군인 EF1a와 비교하여 상대적 비율로 표시한 것이다. 데이터 및 에러 바는 3개의 복제 샘플의 실험 값에 대한 평균 및 표준편차를 나타낸다.
도 5는 냉해 스트레스 조건 하에서의 형질전환 식물체의 시간별 DaCold1 유전자 발현 양상에 대한 qPCR 분석결과를 보여준다. 왼쪽의 수직 축은 유전자 전사체 양의 상대적 비율을 내부 대조군인 EF1a와 비교하여 상대적 비율로 표시한 것이다. 데이터 및 에러 바는 3개의 복제 샘플의 실험 값에 대한 평균 및 표준편차를 나타낸다.
도 6은 장기간 냉해 스트레스 조건 하에서의 형질전환 식물체의 DaCold1 유전자 발현 양상에 대한 qPCR 분석결과를 보여준다. 왼쪽의 수직 축은 유전자 전사체 양의 상대적 비율을 내부 대조군인 EF1a와 비교하여 상대적 비율로 표시한 것이다. 데이터 및 에러 바는 3개의 복제 샘플의 실험 값에 대한 평균 및 표준편차를 나타낸다.
도 7은 DaCold1과 GFP를 융합시킨 단백질을 일시적으로 발현시켜 DaCold1의 세포 내 위치를 분석한 그림이다. 담배(Nicotiana benthamiana) 잎에 35S:DaCold1-sGFP 또는 35S:NLS-sGFP 컨스트럭트를 포함하는 아그로박테리움(Agrobacterium)을 이용하여 공동-침투시켰다. NLS-sGFP은 핵 단백질 마커로서 사용하였다. 형광현미경의 GFP 필터로 관찰한 결과 DaCold1은 세포 내에서 핵에 위치하고 있음을 확인하였다.
도 8은 선별한 형질전환 식물체에서 DaCold1의 발현을 확인한 그림이다. 형질전환 벼 식물체에서 DaCold1이 발현하는지를 확인하고자 RNA를 추출하여 역전사 반응을 수행하고 이를 DaCold1 유전자에 대한 프라이머로 PCR을 수행한 결과, DaCold1이 돌연변이 식물체 내에서 발현되는 것을 확인하였다.
도 9는 DaCold1 과다발현 식물체(OE #1 및 #2)와 야생형 벼(WT)의 냉해 스트레스에 대한 저항성을 비교한 결과를 보여준다. 약 6 주된 식물을 4℃ 저온 챔버에서 5 일 내지 1 주일 간 배양한 후 다시 정상조건인 28℃에서 6 주 이상 키우며 생장을 비교해본 결과 DaCold1 과다발현 돌연변이 식물체가 야생형 벼보다 냉해 스트레스에 대해 저항성이 높은 것을 확인할 수 있었다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.

실시예

실험방법

유전자 클로닝

종래에 보고된 transcriptome 데이터(Lee et al., 2013)로부터 Arabidopsis thaliana(진뱅크 접근번호 ABV27070)의 AtCBF1에 대한 전체 아미노산 서열을 이용한 tBLASTN 알고리즘을 통해 DaCold1의 전체 유전자 서열을 수득하였다. RNeasy plant 미니 킷 (Qiagen, Chatsworth, CA)을 이용하여 잎으로부터 총 RNA를 분리하였다. 유전자 증폭을 위해 PCR을 수행하였다. PCR 반응을 위하여 사용된 프라이머는 다음과 같다:

프라이머 F(서열번호 3), CACCATGGACACCGCCTCCACG; 및

프라이머 R(서열번호 4), CTCGAACAGGTAGCTCCACAT.

PCR의 주요 산물은 젤로 정화하고 ABI3730XL DNA 시퀀서(Applied Biosystems, Foster City, CA)를 이용한 직접 PCR 시퀀싱을 통해 시퀀싱하였다.

남극좀새풀 배양

자연조건에서 생장한 남극좀새풀[Deschampsia antarctica Desv.(Poaceae)]을 킹 조지섬 바톤 반도의 대한민국 남극 세종과학 기지 인근(62°14'29"S; 58°44'18"W)에서 채집하였다. 채집한 식물을 연구실로 옮긴 후 2% 수크로오스를 포함하는 0.5X MS(Murashige and Skoog)배지를 공급하면서 150 μmol m^-2 s^-1의 광강도로 16시간 광 조건/ 8시간 암 조건 하에서 남극좀새풀의 루비스코(RuBisCo) 활성이 높아지는 15℃(Pet al. 2006)에서 수경재배하였다.

스트레스 처리 및 샘플링

3-4개의 새싹 중 가장 긴 5 cm 길이를 가지는 각 5 개의 식물을 실험에 사용하였다. 다음과 같이 다양한 스트레스에 노출시켰다:

(1) 저온 스트레스를 가하기 위해 식물들을 저온 챔버에 옮기고 4℃에서 정해진 시간동안 배양하였다.

(2) 고염 스트레스를 가하기 위해 식물들을 300mM NaCl을 포함하는 0.5X MS(Murashige and Skoog)배지에 옮기고 정해진 시간동안 배양하였다.

(3) 건조 스트레스를 가하기 위해 식물들을 30% PEG 을 포함하는 0.5X MS(Murashige and Skoog)배지에 옮기고 정해진 시간동안 배양하였다.

RT- PCR 을 이용한 유전자 발현양상 분석

RNeasy Plant 미니 킷(Qiagen)을 이용하여 제조사의 설명서에 따라 식물 샘플의 잎으로부터 총 RNA를 추출하였다. Superscript II(Invitrogen, Carlsbad, CA)를 이용하여 시료에서 추출한 1 ㎍ 총 RNA로부터 cDNA를 합성하였다.

유전자 특이적 프라이머는 DaCold1의 서열에 따라 설계하였다; DaCold1 RT 정방향 프라이머(서열번호 5; AGCTCGATGACGAGCAGTTGTT), 및 역방향 프라이머(서열번호 6; AAGCAGGAGACGGCGTAAACTT). 대조군 유전자인 EF1a가 내부 대조군으로 사용되었다: EF1a 정방향 프라이머(서열번호 7; TTTGTCCACTGCTACACTCGTGGT) 및 역방향 프라이머(서열번호 8; TCGAAGGCTGACGGACATAACCAA). 생물학적으로 복제된 샘플을 가지고 SYBR Premix Ex Taq^TM DNA 폴리머레이즈(Takara, Seoul, Korea) 및 Mx3000P 실시간 PCR 시스템(Stratagene, La Jolla, CA)을 이용하여 qPCR을 세 번 수행하였다.

벼 원형질체 세포내 단백질 위치 분석

합성 녹색 형광 단백질(sGFP) 코딩 영역을 전장 DaCold1 코딩 영역의 3' 말단과 융합시켜서 pEarleyGate 100 (pEG100) 바이너리 벡터에 삽입하였다. 상기 벡터를 전기 천공법으로 아그로박테리움 투메파시엔스 LBA4404에 형질전환시켰다. 35S:DaCold1-sGFP 또는 35S:NLS-mRFP(35S:nuclear localizing signal-monomeric red fluorescent protein) 컨스트럭트를 포함하는 아그로박테리움을 이용하여 담배(Nicotiana benthamiana) 잎에 공동-침투시켰다. NLS-mRFP을 핵 단백질에 대한 대조군으로 사용하였다. 형질전환 2 일 후, 원형질체를 담배 잎에서 추출하여 형광 현미경(BX51, 올림푸스, 도쿄, 일본)으로 확인하였다.

유전자 과다발현 컨스트럭트 제작

DaCold1을 과다발현시키는 플라스미드를 재조합하기 위해 DaCold1의 코딩 부분의 5' 및 3'쪽에 해당하는 프라이머 세트를 이용하여 PCR을 수행하였다. PCR 결과물을 pENTR SD-TOPO 벡터(Invitrogen)에 삽입한 후, LR 크로나아제 효소(Invitrogen)를 이용하여 유비퀴틴 프로모터 하에서 유전자를 과다발현시키는 pGA2897 벡터에 치환시켰다. 대장균에서 플라스미드를 추출한 후 이를 아그로박테리움(LBA4404)에 전기천공법을 이용하여 삽입하였으며 유전자의 존재 유무는 PCR을 이용하여 확인하였다.

벼 식물체 배양

야생형 및 DaCold1 과다발현 돌연변이 식물체의 종자를 30% 락스와 0.025%의 트리톤 X-100에 30분간 살균 처리한 후 물로 10번 이상 세척하였다. 처리된 종자는 3% 수크로스, 2,4-D (2 mg/L), 0.03% 카제인 수화물, 25 mM L-프롤린, 0.2% 젤라이트로 구성된 CHU 배지(Duchefa Biochemie)에 심은 후 약 1주간 생장 챔버(16시간 광 조건/ 8시간 암 조건, 28℃)에서 키워 캘러스(callus)를 유도하여 조직배양의 재료로 사용하였다. 같은 방법으로 소독한 종자를 3% 수크로스, B5 비타민 (12 mg/L), 0.8% 아가로 구성되어 있는 MS 배지(Duchefa Biochemie)에 수직으로 심은 후 약 2주간 생장 챔버(16시간 광/8시간 암, 28℃ 조건)에서 키운 후, Sunshine MIX #5 (Sun Gro Horticulture)와 수도용 상토를 섞어서 만든 흙에 심어서 약 3주간 생장 챔버(16시간 광/8시간 암, 28℃ 조건)에서 성장시키고 이를 온실에 옮겨 약 4 달간 키운 후 종자를 수득하였다.

과다발현 형질전환체 제작

과다발현 형질전환체를 제작하기 위하여 아그로박테리움을 이용한 벼 조직배양을 수행하였다. 캘러스 유도 배지(CHU media)에서 약 7일간 키운 캘러스에 아그로박테리움을 감염시킨 후 200 μM의 아세토시린곤(acetosyringone)을 포함하는 배지에서 4일간 배양한 후 함께 자란 아그로박테리움을 수세하고 항생제가 들어있는 캘러스 유도배지로 옮겨주었다. 항생제 선별과정에서 새롭게 자란 캘러스를 옥신과 싸이토키닌이 들어있는 재분화배지에 옮겨 식물로 재분화시킨 후 흙으로 옮겨 순화과정을 거친 뒤 흙으로 옮겨 온실조건에서 키워 T0 세대의 식물을 획득하였다.

RT- PCR 을 이용한 과다발현 확인

과다발현 돌연변이 식물체에서 유전자의 발현을 확인하기 위하여 전체 RNA를 추출하고 올리고 dT 프라이머와 M-MLV 역전사효소(Enzynomics)를 이용하여 단일가닥 cDNA를 합성하였다. PCR 수행을 위해 주형으로 20 ng의 cDNA를 사용하였으며 두 종류의 프라이머를 각각 10 pmole 씩, 10 x Taq 폴리머라제 완충용액(Intron) 2.5 ㎕, dNTP 혼합액(각 2.5 mM) 2 ㎕ 및 1 유닛의 Taq DNA 폴리머라제(Intron)를 넣어 총 부피를 25 ㎕ 로 만들고 BioRad 써멀 사이클러로 PCR을 수행하였다. 먼저 95℃에서 3분간 변성시킨 후, 95℃에서 30초, 55℃에서 30초, 72℃에서 1분을 반복하는 것을 28회 수행하였고, 28회 반복이 끝난 후 72℃에서 5분간 추가로 중합반응을 수행한 다음 -20℃에 냉동 보관하였다. 사용된 유전자의 프라이머는 아래의 표 1과 같다.

RT-PCR에 사용된 유전자의 프라이머

프라이머	서열
DaCold1 FW(서열번호 9)	5'-TGCCTCAACTTCGCCGACTC-3'
DaCold1 RV(서열번호 10)	5'-GAGCTGCAACGCCACGACGG-3'
OsUbiQ10 RT FW(서열번호 11)	5'-ATGCAGATCTTTGTGAAGACATTG-3'
OsUbiQ10 RT AS(서열번호 12)	5'-TTACTGACCACCACGGAGGC-3'

저온 스트레스 민감도 측정

야생형 및 DaCold1 과다발현 돌연변이 식물체의 종자를 30% 락스와 0.025%의 트리톤 X-100에 30분간 살균 처리한 후 물로 10번 이상 세척하였다. 처리된 종자는 3% 수크로스, B5 비타민 (12 mg/L), 0.8% 아가로 구성되어 있는 MS 배지(Duchefa Biochemie)에 수직으로 심은 후 약 2 주간 생장 챔버(16 시간 광/ 8시간 암, 28℃ 조건)에서 키운 식물을 흙으로 옮겨 3주 동안 키운 뒤 실험에 사용하였다. 약 5주 된 식물을 7일 동안 4℃의 저온 챔버에서 키운 후, 다시 28℃의 생장 챔버로 옮겨 키우며 생장을 관찰하는 방법으로 저온 스트레스에 대해 내성을 갖는 정도를 비교하였다.

실시예 1. 유전자 염기서열 분석 결과 확인

애기장대(Arabidopsis thaliana)에서 분리한 AtCBF1의 전체길이 아미노산 서열을 이용한 tBLASTN 탐색 및 종래에 보고된 남극좀새풀 transcriptome 데이터에 기반하여, AtCBF1과 42%의 일치를 보이는 전체 서열 상동성 유전자를 동정하였다. 상업적으로 이용 가능한 PCR 기술을 통해 수득한 cDNA 서열은 216 아미노산의 ORF(open reading frame)을 가지는 것으로 예측되었다. 컴퓨터 분석을 통한 아미노산 서열 추정 결과, 60 아미노산으로 구성된 AP2 DNA 결합부위가 중앙 부위에 존재함을 알 수 있었다. DaCold1의 분자량 계산값은 23690.86 Da이고 등전점은 5.97이었다.

실시예 2. 남극좀새풀에서 DaCold1 발현 양상 확인

2-1. 비생물학적 스트레스별 DaCold1 발현 양상 확인

본 발명자들은 다양한 비생물학적 스트레스(냉해, 고염, 건조) 조건 하에서의 DaCold1 발현 변화를 조사하고자 남극좀새풀 식물체에 다양한 비생물학적 스트레스를 처리하여 DaCold1 발현 수준을 내부 대조군인 EF1a와 비교하였다.

그 결과, 도 3에 나타낸 바와 같이, 고염(NaCl) 및 건조 스트레스 조건 하에서는 DaCold1 발현이 유의하게 증가하지 않았으나, 반면 냉해 스트레스 조건하에서는 DaCold1 발현이 급격하게 증가하는 것을 확인할 수 있었다.

2-2. 조직별 DaCold1 발현 양상 확인

본 발명자들은 냉해 스트레스 조건 하에서의 조직별 DaCold1 발현 변화를 조사하고자 남극좀새풀 식물체에 냉해 스트레스를 처리하여 DaCold1 발현 수준을 내부 대조군인 EF1a와 비교하였다.

그 결과, 도 4에 나타낸 바와 같이, 냉해 스트레스 조건 하에서 DaCold1 발현은 남극좀새풀의 잎에서 급격하게 증가하는 것을 확인할 수 있었다.

2-3. 시간별 DaCold1 발현 양상 확인

본 발명자들은 냉해 스트레스 조건 하에서의 처리 시간에 따른 DaCold1 발현 변화를 조사하고자 남극좀새풀 식물체에 냉해 스트레스를 처리하여 DaCold1 발현 수준을 내부 대조군인 EF1a와 비교하였다.

그 결과, 도 5에 나타낸 바와 같이, 냉해 스트레스 조건 하에서 DaCold1 mRNA는 점차 축적되었으며, 2 시간 후 정점에 달하였다. 이는 기저값의 약 40 배까지 축적된 후 점차 감소하였다.

한편, 본 발명자들은 장기간 냉해 스트레스 조건 하에서의 DaCold1 발현 변화를 조사하고자 남극좀새풀 식물체에 냉해 스트레스를 처리하여 DaCold1 발현 수준을 내부 대조군인 EF1a와 비교하였다.

그 결과, 도 6에 나타낸 바와 같이, 장기간 냉해 스트레스 조건 하에서 DaCold1 발현은 1 주까지 장기간 유의하게 증가하는 것을 확인할 수 있었다.

실시예 3. 원형질체 세포내 단백질 위치 분석

식물세포 내에서 DaCold1의 단백질 위치를 담배 잎에 일시적으로 발현시키는 방법으로 확인하였다. DaCold1과 초록형광단백질(GFP)을 융합시키는 플라스미드를 제작하여 담배 잎에서 일시적으로 발현시킨 후 원형질체를 추출하고 형광현미경으로 관찰하였다.

그 결과, 도 7에 나타낸 바와 같이, DaCold1은 세포 내에서 핵에 위치하고 있음을 확인하였다.

실시예 4. DaCold1 과다발현 형질전환체 확보

야생종 종자에서 유도한 캘러스를 아그로박테리움을 이용한 조직배양의 방법으로 형질전환하여, 벡터가 삽입된 캘러스를 확보하고 이를 재분화시켜 T0 세대의 식물을 확보하였다. 다양한 조건 하에서, 이 형질전환 벼 식물체의 DaCold1이 과다발현되는 것을 확인하고자, 과다발현 돌연변이 식물체의 잎에서 RNA를 추출하여 역전사반응을 수행하였다. DaCold1을 특이적으로 인식하는 프라이머를 이용하여 PCR한 결과, 도 8에 나타낸 바와 같이, 형질전환 벼 식물체에서 DaCold1이 과다발현되는 것을 확인하였다.

실시예 5. DaCold1 과다발현 형질전환체의 냉해 스트레스 표현형 분석

본 발명자들은 DaCold1 과다발현 돌연변이 식물체(형질전환체)의 스트레스에 대한 내성 변화를 조사하고자 6 주된 DaCold1 과다발현 식물과 야생종에 저온 스트레스를 처리하여 저항성을 비교하였다. 4℃의 조건에서 1주간 배양하여 저온 스트레스를 처리한 후 정상조건인 28℃에서 다시 배양하며 성장을 확인하였다.

그 결과, 도 9에 나타낸 바와 같이, 야생종은 식물이 생장이 멈추고 시들어갔지만, DaCold1 과다발현 돌연변이 식물체는 지속적으로 성장하는 것을 확인할 수 있었다. 이를 통하여 DaCold1의 과다발현 형질전환 식물체가 야생종에 비하여 저온 스트레스에 대한 내성이 증가하였음을 확인할 수 있었다.

또한, 냉해 스트레스 조건 하에서의 야생종과 2 종의 독립적인 형질전환체(OE #1; Ubi:DaCold1 #1 및 OE #2; Ubi:DaCold1 #2)의 생존율을 표 2에 나타내었다.

그 결과, 표 2에 나타낸 바와 같이, 야생종의 생존율에 비해, DaCold1 과다발현 돌연변이 식물체의 생존율은 탁월하게 증진된 것을 확인할 수 있었다. 이를 통하여 DaCold1의 과다발현 형질전환 식물체가 야생종에 비하여 저온 스트레스에 대한 내성이 증가하였음을 확인할 수 있었다.

유전자형(Genotype)	생존율(%)
야생종	12.5
Ubi : DaCold1 #1	58.0
Ubi : DaCold1 #2	43.9

이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

<110> Korea Institute of Ocean Science and Technology <120> Novel Gene Implicated in Plant Cold Stress Tolerance and Use Thereof <130> KIOST-1-20p <160> 12 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 651 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> Deschampsia antarctica <400> 1 atggacaccg cctccacgtc cggtcagcag cagcaggagc aggagcgcca caggacggtg 60 ggctcggaac cgccgaagcg gccggcgggg cggaccaagt tccacgagac gcggcacccg 120 gtgtaccgcg gcgtgcggag ccgggggcgc gtcgggcagt gggtgtgcga gatgcgcgtc 180 cacgggacca agggctccag gctctggctc ggcaccttcg ccaccgccga gatggcggcc 240 cgcgcgcacg acgccgccgc gctcgcgctc tccggccccg acgcgtgcct caacttcgcc 300 gactccgcct ggcggatgct gcccgtgctc gccgccgggt cgttcggctt cggcagcgcg 360 cgggagatca agaccgccgt cgcgctcgcc gtcgtggcgt tccagctccg cccggtcgag 420 ttcccggctg tgaaggacgt tgtcatctca ccgacgccga acgctctgtt ttacatgtcc 480 tccagcgacc tgctggagct cgatgacgag cagttgttcg gcggcatggt cgccgggccg 540 tactacgaga gcatggcgca ggggatgctc gtggagccgc cggaggccgg agcgtggcgt 600 gaggaccgcg gcgtggtgga gacgccgatg tggagctacc tgttcgagtg a 651 <210> 2 <211> 216 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> Deschampsia antarctica <400> 2 Met Asp Thr Ala Ser Thr Ser Gly Gln Gln Gln Gln Glu Gln Glu Arg 1 5 10 15 His Arg Thr Val Gly Ser Glu Pro Pro Lys Arg Pro Ala Gly Arg Thr 20 25 30 Lys Phe His Glu Thr Arg His Pro Val Tyr Arg Gly Val Arg Ser Arg 35 40 45 Gly Arg Val Gly Gln Trp Val Cys Glu Met Arg Val His Gly Thr Lys 50 55 60 Gly Ser Arg Leu Trp Leu Gly Thr Phe Ala Thr Ala Glu Met Ala Ala 65 70 75 80 Arg Ala His Asp Ala Ala Ala Leu Ala Leu Ser Gly Pro Asp Ala Cys 85 90 95 Leu Asn Phe Ala Asp Ser Ala Trp Arg Met Leu Pro Val Leu Ala Ala 100 105 110 Gly Ser Phe Gly Phe Gly Ser Ala Arg Glu Ile Lys Thr Ala Val Ala 115 120 125 Leu Ala Val Val Ala Phe Gln Leu Arg Pro Val Glu Phe Pro Ala Val 130 135 140 Lys Asp Val Val Ile Ser Pro Thr Pro Asn Ala Leu Phe Tyr Met Ser 145 150 155 160 Ser Ser Asp Leu Leu Glu Leu Asp Asp Glu Gln Leu Phe Gly Gly Met 165 170 175 Val Ala Gly Pro Tyr Tyr Glu Ser Met Ala Gln Gly Met Leu Val Glu 180 185 190 Pro Pro Glu Ala Gly Ala Trp Arg Glu Asp Arg Gly Val Val Glu Thr 195 200 205 Pro Met Trp Ser Tyr Leu Phe Glu 210 215 <210> 3 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> F primer <400> 3 caccatggac accgcctcca cg 22 <210> 4 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> R primer <400> 4 ctcgaacagg tagctccaca t 21 <210> 5 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DaCold1 forward primer <400> 5 agctcgatga cgagcagttg tt 22 <210> 6 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DaCold1 reverse primer <400> 6 aagcaggaga cggcgtaaac tt 22 <210> 7 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> EF1a forward primer <400> 7 tttgtccact gctacactcg tggt 24 <210> 8 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> EF1a reverse primer <400> 8 tcgaaggctg acggacataa ccaa 24 <210> 9 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DaCold1 FW primer <400> 9 tgcctcaact tcgccgactc 20 <210> 10 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DaCold1 RV primer <400> 10 gagctgcaac gccacgacgg 20 <210> 11 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> OsUbiQ10 RT FW primer <400> 11 atgcagatct ttgtgaagac attg 24 <210> 12 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> OsUbiQ10 RT AS primer <400> 12 ttactgacca ccacggaggc 20

Claims

다음 단계를 포함하는 식물의 냉해 스트레스(cold stress)에 대한 내성을 증진시키는 방법:
(a) 서열번호 2의 아미노산 서열을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열로 이루어진, 남극좀새풀(Deschampsia antarctica Desv.) 유래의 DaCold1 (Deschampsia antarctica Cold expressed 1) 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 제작하는 단계; 및
(b) 상기 (a) 단계의 재조합 벡터를 식물세포에 형질전환시켜 DaCold1 단백질을 코딩하는 유전자를 과발현시키는 단계.
제 1 항에 있어서, 상기 (a) 단계의 뉴클레오타이드 서열은 서열번호 1로 표시되는 것을 특징으로 하는 방법.
다음 단계를 포함하는 냉해 스트레스(cold stress)에 대한 내성이 증진된 형질전환 식물체의 제조 방법:
(a) 서열번호 2의 아미노산 서열을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열로 이루어진, 남극좀새풀(Deschampsia antarctica Desv.) 유래의 DaCold1 (Deschampsia antarctica Cold expressed 1) 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 식물세포에 형질전환시켜 DaCold1 단백질을 코딩하는 유전자를 과발현시키는 단계; 및
(b) 상기 식물세포로부터 냉해 스트레스 저항성이 증진된 형질전환 식물체를 수득하는 단계.
제 3 항에 있어서, 상기 (a) 단계의 뉴클레오타이드 서열은 서열번호 1로 표시되는 것을 특징으로 하는 방법.
제 3 항의 방법에 의해 제조된 냉해 스트레스(cold stress)에 대한 내성이 증진된 형질전환 식물체.
제 5 항에 있어서, 상기 식물체는 쌍자엽 식물 또는 단자엽 식물인 것을 특징으로 하는 식물체.
제 5 항에 있어서, 상기 식물체는 벼, 밀, 보리, 옥수수, 콩, 감자, 밀, 팥, 귀리 및 수수를 포함하는 식량 작물류; 아라비돕시스, 배추, 무, 고추, 딸기, 토마토, 수박, 오이, 양배추, 참외, 호박, 파, 양파 및 당근을 포함하는 채소 작물류; 인삼, 담배, 목화, 참깨, 사탕수수, 사탕무우, 들깨, 땅콩 및 유채를 포함하는 특용작물류; 사과나무, 배나무, 대추나무, 복숭아, 양다래, 포도, 감귤, 감, 자두, 살구 및 바나나를 포함하는 과수류; 장미, 글라디올러스, 거베라, 카네이션, 국화, 백합 및 튤립을 포함하는 화훼류; 및 라이그라스, 레드클로버, 오차드그라스, 알파알파, 톨페스큐 및 페레니얼라이그라스를 포함하는 사료작물류로 구성된 군으로부터 선택된 1 종 이상인 것을 특징으로 하는 식물체.
제 5 항에 따른 냉해 스트레스(cold stress)에 대한 내성이 증진된 형질전환 식물체의 형질전환된 종자.
서열번호 2의 아미노산 서열을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열로 이루어진, 남극좀새풀(Deschampsia antarctica Desv.) 유래의 DaCold1 (Deschampsia antarctica Cold expressed 1) 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는, 식물의 냉해 스트레스(cold stress) 내성 증진용 조성물.
제 9 항에 있어서, 상기 뉴클레오타이드 서열은 서열번호 1로 표시되는 것을 특징으로 하는 조성물.