KR101803108B1 - 방광암의 비뇨기적 검출 방법 - Google Patents
방광암의 비뇨기적 검출 방법 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 방광암의 진단, 더욱 구체적으로는 이행형의 방광 암종의 소변 샘플에서의 검출에 관한 것이다. 본 발명에 따른 검출 방법은 이러한 목적으로 설계된 DNA 칩의 이용을 통하여 검출 종양의 등급의 결정을 가능하게 한다.
Description
본 발명은 방광암의 진단, 더욱 구체적으로는 이행형의 방광 암종 (TCC: 이행 세포 암종)의 비뇨기적 검출에 관한 것이다.
이행형 암종은 이행 상피 종양에서 발견될 수 있으며, 이는 상피 방광 종양의 대략 70% 내지 90%를 구성한다. 상기 종양은 그의 큰 형태적 가변성을 특징으로 하여서, 그의 예후는 때로 예측이 어려워지게 된다.
조직학의 견지에서, 요로상피 종양은 고 또는 저 악성도 (조직학적 등급), 침윤성 또는 비침윤성의 유두상 또는 비-유두상 종양일 수 있으며, 각각의 병변은 이들 3가지 형태적 특성의 조합된 결과이다.
방광의 요로상피 종양에 대한 몇몇 분류가 있다. 지금까지 가장 일반적으로 사용된 분류는 WHO의 것이었으며, 이는 1974년으로 거슬러 올라간다. 이것은 이행 상피 암을 양성 (외성장 유두종, 반전성 유두종) 또는 악성 (1등급, 2등급 및 3등급의 이행 상피 암종)으로 분류하였다. 1998년에, 해부 병리학자, 비뇨기과 전문의, 암 전문의 및 생물학자를 포함한 몇 차례의 모임 이후에 요로상피 종양의 합의에 의한 분류가 확립되어 발효되었다. 현재 사용되는 것은 이러한 새로운 분류이다 (문헌[Epstein J. I., Am. J. Surg. Pathol. (1998), 22: 1435-1448]). 이전의 WHO 분류와 단지 약간 상이하지만, 이것은 요로상피 종양의 진화 잠재력 및 생물학과의 더욱 가까운 합의라는 이점을 갖는다.
이러한 분류에 따라, 방광 종양은 상이한 세포 형태학적 기준에 따르면 G1 내지 G3 "등급"에 의해 분류된다. 등급이 더욱 높을수록 세포의 외관이 덜 분화되고 세포가 더욱 공격적이다.
또한 종양은 그의 표면 특성에 따라 (pTa 및 T1) 또는 근육에서의 침습성에 따라 (T2 내지 T4) 분류된다. 저등급 종양은 일반적으로 비-침습성이거나 표층을 침윤하였으며 (Ta기 및 T1기), 반면, 고등급 종양은 더욱 공격적이고 흔히 T1기 또는 더욱 진행된 병기에서 검출된다.
종양 세포의 등급의 결정이 임상의에 있어서 결정적으로 중요하며, 그 이유는 어떠한 치료 방법이 사용되어야 하는지를 결정하는 것을 이것이 돕기 때문이다.
침습성 3등급 종양의 존재는 방광 및 그의 부속 선의 전적인 제거를 필요로 하는 반면에, 일반적으로 대부분의 낮은 등급/병기의 종양 (Ta 및 T1)은 상이한 치료적 접근법, 예컨대 화학요법, 면역요법 또는 BCG 요법에 의해 국소적으로 치료될 수 있으며, 이때 당해 기관은 온전하게 남아있다.
저등급, 비-침습성 종양에 의해 영향을 받은 환자는 일반적으로 양호한 예후를 갖지만, 암 재발 위험도가 대략 70%이기 때문에 주기적으로 추적되어야 한다. 따라서, 환자는 치료 이후 정기적으로, 처음 2년 동안 3개월마다, 그리고 그 후 6개월마다 모니터링되어야 하며, 재발의 경우에는 종양의 진행을 모니터링하는 것이 매우 중요하다.
게다가, 저등급 Ta 종양은 사례들 중 단지 10-15%에서 근육을 침습하며, 반면, T1 종양은 사례들 중 30-35%에서 T2 등급으로 진행된다. 고등급 종양은 더욱 급속하게 진행되며, 이때 환자는 T2 등급에 바르게 도달하고, 다음 2년의 코스 동안 원격 전이가 흔히 형성된다.
현재, 단지 침습적 임상 검사, 다시 말하면 생검체를 포함하는 것, 종양의 직접적인 내시경 검사에 의한 가시화, 또는 수술은 신뢰성 있는 진단이 종양 세포의 등급에 대하여 만들어지는 것을 가능하게 할 수 있게 하고 적절한 요법이 구현가능해 질 수 있게 한다.
아직도 내시경 검사는 때로 신뢰할 수 없으며, 해석이 어렵다. 생검 이후의 세포학적 검사에 관해서는, 그의 신뢰성이 평범하여 종양 중 50%의 검출이 실패한다는 것을 다양한 연구가 보여준다 (문헌[Boman, H., et al., 2002, J. Urol., 167(1 ): 80-83]).
집단, 특히 50세 초과의 사람에 있어서의 방광암의 높은 발병률 때문에, 그리고 환자의 편안함 및 진단 둘 모두의 개선을 목적으로, 상당한 연구 노력이 방광암의 비침습적, 간접적 검출법의 개발에 바쳐졌다.
이와 관련하여, 몇몇 연구 팀은 통상적인 종양 마커 단백질을 이용하여 비뇨기적 샘플에 의해 비뇨기과학적 종양을 검출하려고 시도하였다.
그럼에도 불구하고, 지금까지는 이들 단백질의 검출이 단백질의 기원 및 종양 발병의 병기와 관련하여 신뢰성이 있을만큼 충분히 특이적이지는 않은 것으로 밝혀졌다.
1999년에 미국 팀은 소변 내에 함유된 미소부수체 (microsatellite) DNA 서열을 분석함으로써 방광암의 진행을 따를 가능성을 기술하였다 (문헌[Steiner et al. (1997) Nature Medicine 3: 621-624]). 몇몇의 반복되는 비코딩 미토콘드리아 DNA 서열의 가변성의 측정 및 그의 증폭에 있는 이러한 검출 방법은 이들 서열이 일반적으로 암종 세포에서 변경된다는 관찰을 기반으로 한다.
그럼에도 불구하고, 이러한 기술은 이것이 종양의 등급 결정을 효과적으로 가능하게 하는 것이 아닌 한 전적으로 만족스러운 것은 아니다.
다른 분자적 방법은 PCR법을 기반으로 하며, 이는 환자의 소변에 존재하는 DNA에 적용되어 종양 억제 유전자에서의 국소적 돌연변이와 같은 유전자 마커를 증폭 또는 검출하려고 시도한다. 그러나, 이들 방법은 인간 게놈의 크기 및 가변성에 비추어 개발하기가 간단하지 않은, 20 내지 40개 뉴클레오티드를 포함하는 특정 개시자를 필요로 한다. 게다가, 소변 중 종양 세포의 DNA를 건강한 세포의 DNA와 혼합하자마자 후자에 의해 야기되는 것에 의해 요망되는 증폭이 차폐된다.
이행형의 방광 암종의 상이한 공지된 유전자 마커를 이용하는 데 있어서의 어려움의 결과로서, 본 발명자는 TCC 세포에서 빈번하게 발견되는 몇몇 유전자 이상의 동시 검출을 기반으로 한 혁신적인 접근법의 사용을 선호한다.
이 목적에 있어서, 본 발명자는 이행 방광 암종에서 발견되는 주요 유전자 이상을 열거하였으며, 그 후, 종양 세포의 등급을 가장 잘 나타내는 것을 선별하였다. 이러한 접근법에서, 본 발명자는 전형적으로 종양 세포의 핵형의 분석에서 생기는, 배수성 또는 결실과 같은 염색체에 대한 물리적 변경으로 이루어진 유전자 이상을 특혜로 주었다. 그 후 본 발명자는 환자의 소변에 함유된 DNA에서의 선별된 유전자 이상의 존재 또는 부재의 동시 탐지를 가능하게 하는 혁신적인 절차를 개발하였다.
더욱 구체적으로는, 본 발명자는 (소변 샘플로부터 추출된 총 DNA와 관련하여 어레이-기반 염색체 혼성화 비교 분석 기술을 이용하여) 유의한 형광 시그널을 제공하는 25가지의 인간 염색체 유전자좌의 특정 어레이를 선별하였다.
지금까지는 동일 수준의 특이성 및 민감성을 제공하고 또한 저등급 종양과 고등급 종양을 명백하게 구별할 수 있는, 소변 샘플을 기반으로 한 검사가 이용가능하지 않았었다 (문헌[Budman L.I. et al., 2008 CLMJ 2(3):212-221]).
이 방법은 방광의 수술적 검사를 필요로 하지 않고서 방광의 이행 암종 세포의 존재를 진단하는 한편 이들 종양 세포의 등급의 양호한 지시를 제공하는 놀라운 능력을 갖는다.
[도면의 간단한 설명]
도 1: 일반적인 임상 기준에 따른, 실시예에서 분석된 종양의 분류.
도 2: 내시경 검사 및 세포 검사를 이용하여 얻어진 결과의 함수로서의, 실시예에서 소변을 분석한 환자의 분류.
[발명의 상세한 설명]
본 출원의 목적은 방광암의 검출 방법, 더욱 구체적으로는 방광암의 비뇨기적 검출을 제공하는 것이다.
이 검출은 환자의 소변 중 DNA의 총량의 표시, 및 이 DNA에서의, 유전자좌에 포함된 염색체 서열의 검출을 통하여 얻어지며, 이는 유전자 이상에 의해 잠재적으로 영향을 받을 수 있다.
본 발명에 따른 기준 DNA인 이들 염색체 서열은 그가 속하는 염색체 유전자좌의 결실의 경우 잠재적으로 결여되어 있을 수 있거나, 예를 들어 삼염색체 (trisomy)의 경우에서와 같이 중복될 수 있다.
방광암에서의 종양 세포는 빈번하게는 염색체 개편의 공급원이며, 이는 특정한 정도의 상기 세포의 종양 특질을 나타내는 것이다. 그러나 이러한 염색체 개편에 의해 영향을 받는 영역은 잠재적으로 많으며 그 정도가 가변적이다. 효과에 있어서, 일부의 유전자좌, 특히 종양 억제 유전자를 코딩하거나 세포 주기 조절에 연루된 것이 더욱 조직적으로 변경되지만, 염색체 이상은 항상 동일한 것은 아닌 상동 영역들 사이에 염색체내 재조합 및 염색체간 재조합이 일어날 때 발생한다.
제1 실시양태에 따르면, 본 발명의 하나의 목표는 환자에서 방광암을 시험관내 검출하는 방법을 제공하는 것이며, 이는 본 방법이 하기 단계들 중 하나 이상을 포함하는 것을 특징으로 한다:
제1 단계 (A)에서, 상기 환자로부터 취해진 소변 샘플에 함유된 DNA를 당업계의 숙련자에게 공지된 다수의 방법들 중 하나를 이용하여 추출한다. 상기에 언급된 바와 같이, 본 발명은 유리하게는 방광의 암 상태가 환자의 소변을 기반으로 하여 결정되게 한다. 따라서 이 방법은 소변 샘플에 함유된 DNA를 농축시켜야 하며, 상기 DNA는 이것이 부분적으로 방광에 존재하는 세포로부터 유래되기 때문에 그의 잔류물 상태로 존재한다. 상기 DNA는 고도로 파손되기 쉬운 물질은 아니기 때문에, 분석할 소변 샘플을 보존하기 위하여 극심한 조치를 취할 필요는 없다. 따라서 샘플은 환자의 가정에서 취해질 수 있다. 추출된 DNA는 이것이 종양 세포로부터 발원되었든 그렇지 않든 이것이 소변에 존재하는 전체 회수가능 DNA를 함유한다는 의미에서 완전하다.
다음 단계 (B)에서, 단계 (i)에서 추출된 DNA를 바람직하게는 초음파 처리에 의해 크기가 대부분 500 염기쌍 (bp; base-pairs) 초과, 바람직하게는 800 bp 초과, 더욱 바람직하게는 1000 내지 5000 bp인 DNA 단편으로 단편화한다. 대안적으로, DNA를 효소, 예컨대 제한 효소에 의해 절단할 수 있다.
다음 단계 (C)에서, 얻어진 DNA 단편을 제1 표지제에 의해 균일하게 표지하여 표지된 DNA의 풀을 형성한다. 따라서, 표지되는 것은 소변으로부터 추출된 총 DNA이다. "균일하게"라는 것은 표지가 비-특이적 방식으로 일어나서 동일한 크기의 2가지의 상이한 DNA 단편이 동일한 강도로 표지됨을 의미한다. 그러한 표지를 얻기 위해서는 바람직하게는 형광색소에 커플링된 뉴클레오티드가 이용되며, 상기 형광색소는 복제 단계 코스 동안 DNA 내로 도입된다. 이러한 시험관내 효소적 복제 단계는 유리하게는 DNA 풀에서 이용가능한 표지된 DNA 단편의 카피수를 증가시킨다. 표지된 DNA 풀은 랜덤하게 절단된 단편들로 우선적으로 이루어진다.
다음 단계 (D)에서, 적어도 하나의 분취물이 표지 DNA 풀로부터 형성되며, 상기 분취물은 상황에 따라 전체 표지 DNA 풀을 형성할 수 있다. 그 후 각각의 분취물은 하나의 기준 DNA, 바람직하게는 몇몇의 기준 DNA와 접촉시키며, 이들 기준 DNA 각각은 유전자 이상에 의해 영향을 받을 가능성이 있는 염색체의 유전자좌에 포함된 상이한 DNA 서열에 상응한다. 상기 유전자 이상은 바람직하게는 방광암의 특정 발병 시기, 더욱 구체적으로는 상기에 언급된 것과 같은 병기와 상관된다. 기준 DNA는 예를 들어 과학 문헌으로부터 취해진 데이터에 따라 또는 생검 분석 결과에 따라 선택되어질 수 있다.
본 발명에 따르면, 기준 DNA는 길이가 1,000 내지 200,000 염기쌍 (bp), 바람직하게는 길이가 2,000 내지 180,000 bp, 더욱 더 바람직하게는 길이가 5,000 내지 160,000 bp인 인간 염색체의 DNA 서열, 예컨대 인간 게놈 서열로부터 제작된 BAC (박테리아 인공 염색체) 또는 YAC (효모 인공 염색체) 클론 내에 클로닝된 것으로 이루어진다. 그러한 BAC 클론은 인간 게놈에 관련된 공개적으로 접근가능한 데이터베이스, 예컨대 CNBI 또는 UCSC의 것에 설명되어 있다.
따라서, 단리된 마커, 특히 유전자 증폭 검사의 실시 (PCR, TMA 등)를 가능하게 하는 짧은 유전자 서열에 상응하는 마커를 기반으로 하여 방광암을 진단하는 것은 어려운 것으로 입증된 반면, 본 발명에 따른 검출 방법은 일반적으로 600 bp보다 큰 DNA 서열을 이용한 검출 방법을 기반으로 한다.
본 발명자는 서열이 표 1에서 언급된 바와 같이 하기: 1p, 3q, 8q22qter, 20, 5p12-p13, 9p, 9q, 18q12, 1q22-q24, 5p, 6q22, 7, 11q13, 12q15, 13q, 15, 16, 17q, 6q25-q27, 7q, 8p, 10q, 11p, 14q22-qter, 17p, 19 및 22로부터 선택되는 인간 염색체의 유전자좌 내에 포함된 기준 DNA를 사용하는 것이 바람직함을 확립하였다. 바람직하게는, 본 발명에 따른 방법은 인간 염색체에 존재하는 하기 유전자좌 각각에 포함된 DNA 서열을 포함하는 기준 DNA를 포함한다: 1p, 3q, 8q22qter, 20, 5p12-p13, 9p, 9q, 18q12, 1q22-q24, 5p, 6q22, 7, 11q13, 12q15, 13q, 15, 16, 17q, 6q25-q27, 7q, 8p, 10q, 11p, 14q22-qter, 17p, 19 및 22.
본 발명에 따르면, 표지된 DNA 단편과 기준 DNA 사이의 접촉은 특이적 혼성화를 가능하게 하는 조건 하에서, 바람직하게는 엄격한 조건, 예컨대 본 출원의 실험 부분에 기술된 것 하에서 실시된다.
단계 (D)와 동시에, 단계 (E)는 방광암을 앓고 있지 않은 하나의 또는 몇몇의 개체로부터 취해진 대조 DNA 풀의 제조에 있다. 이상적으로는, 이 DNA는 인간 집단으로부터 랜덤하게 선택된, 암에 의해 영향을 받지 않은 몇몇 개체로부터 취해진 비뇨기적 샘플로부터 유래된다. 또한 시판용으로 제조된 인간 기준 DNA를 사용하는 것이 가능하다. 환자의 소변으로부터 추출된 DNA의 경우에서와 같이, 대조 DNA는 제2의, 바람직하게는 형광성인 마커에 의해 균일하게 표지된다. 바람직하게는 이 마커는 환자의 DNA의 표지에 사용된 것과 상이하다.
단계 (D)에서와 같이, 표지된 대조 DNA의 분취물을 선별된 기준 DNA와 접촉시키는데, 상기 기준 DNA는 단계 (D)에서 사용된 것과 동일하다. 이러한 접촉 작업은 단계 (D)에서 사용된 것과 동일한 혼성화 조건 하에서 별도로 또는 함께 실시될 수 있다. 접촉 작업이 함께 실시될 때, 이는 환자 DNA와 대조 DNA 둘 모두가 바람직하게는 동시에 동일 기준 DNA와 접촉됨을 의미한다.
다음 단계 (F)에서, 단계 (D) 및 단계 (E)에서 기준 DNA에 특이적으로 혼성화되지 않은 표지된 DNA 단편이 제거된다. 비-혼성화 DNA를 세척해 내는 이 단계는 어떠한 특정한 어려움 없이 당업자에게 공지된 절차에 따라 실시된다.
다음 단계 (G)에서, 선별된 기준 DNA 각각에 혼성화된 표지된 단편에 의해 생성되는 시그널의 강도가 결정된다. 시그널의 유형 및 강도는 사용되는 마커의 유형에 의존적이다. 예를 들어 시아닌 3 및 5의 경우에서와 같이 사용된 제1 및 제2 마커가 동일한 강도를 가질 때, 환자의 DNA와 대조 DNA 사이에 관찰된 변이는 각각의 기준 DNA에 위치한 혼성화 DNA 단편의 양에 직접적으로 관련된다.
다음 단계 (H)에서, 환자의 DNA로부터의 기록된 시그널과 대조 DNA로부터의 기록된 시그널 사이의 편차가 각각의 기준 DNA에 대하여 결정된다.
본 발명의 바람직한 실시양태에 따르면, 단계 (C)에서 환자로부터 취해진 DNA 단편은 2개의 풀로 나뉘어지며, 하나는 제1 마커를 이용하여 표지되고 두 번째 것은 제2 마커를 이용하여 표지된다. 단계 (D)로부터의 대조 DNA 단편도 2개의 풀로 나뉘어지며, 하나는 제1 마커를 이용하여 표지되고 두 번째 것은 제2 마커를 이용하여 표지된다. 이 절차에 의하면, 시그널 편차의 교차 결정은 제1 마커, 그리고 그 후 제2 마커에 의해 결정될 수 있다. 대조 DNA와 환자의 DNA 사이에 관찰된 편차가 동일한 차수의 것이라면, 어떠한 마커를 사용할지라도 이것은 유의한 편차를 나타내게 된다.
다음 단계 (I)에서, 환자의 암 병기는 이전 단계에서 관찰된 편차로부터 도출된다. 따라서, 본 발명에 따르면, 얻어진 편차의 수가 클수록 방광암 검출이 더욱 정확하다. 더욱이, 상기 편차는 특히 종양 등급을 나타내는 몇몇 유전자좌가 동시에 이용될 때 연루된 종양의 병기를 정성적으로 나타낸다.
대안적으로, 유전자좌가 종양 세포의 악성의 고도로 대표적인 마커인 것으로 여겨질 경우, 이 유전자좌로부터 도출되는 결과를 확인하기 위하여 몇몇 기준 DNA가 동일 유전자좌로부터 선별될 수 있다.
따라서 본 발명에 따른 방법은 단계 (I)에서 몇몇 기준 DNA의 비교 및 발견되는 유전자 이상의 연장된 표의 확립을 가능하게 한다. 그 후 이 단계 동안, 예를 들어 주어진 병기의 종양에 있어서 선별된 유전자좌에서 유전자 이상을 발견할 가능성을 고려하기 위하여 각각의 기준 DNA에 있어서 얻어진 결과들을 가중하는 것이 유용한 것으로 발견될 수 있다. 몇몇 기준 DNA를 사용하여 동일 유전자좌 상의 이상을 검출할 때, 기준 DNA에 있어서 얻어진 편차를 가중시키는 것이 또한 가능하고, 그에 의해 그의 가중치를 다른 나타낸 유전자좌에 관련하여 고려하게 된다. 이러한 가중, 또는 상이한 유전자좌들 사이의 상관성을 세팅하기 위하여 상수를 사용하는 것을 이용하여, 단계 (H) 동안 수집된 데이터를 기초로 하여 "이론적 병기"의 결정을 가능하게 하는 알고리즘을 설계할 수 있다.
상기 방법은 환자에서 방광암의 시험관내 검출 방법으로서 요약될 수 있으며, 이는 하기 단계를 포함하는 것을 특징으로 한다:
(i) 상기 환자로부터 취한 소변 샘플에 함유된 DNA를 추출하는 단계;
(ii) 단계 (i)에서 추출한 DNA를 단편화하는 단계;
(iii) 얻어진 DNA 단편을 표지제 (marking agent)로 균일하게 표지하여 표지된 DNA의 풀을 형성하는 단계;
(iv) 표지된 DNA의 풀로부터 적어도 하나의 분취물을 형성하고 각각의 분취물을 기준 DNA 세트와 접촉시키는 단계 - 상기 접촉은 표지된 DNA 단편과 상기 기준 DNA의 특이적 혼성화를 가능하게 하는 조건 하에 실시하고, 상기 기준 DNA는 인간 염색체에 존재하는 하기 유전자좌: 1p, 3q, 8q22qter, 20, 5p12-p13, 9p, 9q, 18q12, 1q22-q24, 5p, 6q22, 7, 11q13, 12q15, 13q, 15, 16, 17q, 6q25-q27, 7q, 8p, 10q, 11p, 14q22-qter, 17p, 19 및 22 각각에 포함된 DNA 서열을 포함함 -;
(v) 기준 DNA에 특이적으로 혼성화되지 않은 표지된 DNA 단편을 제거하는 단계;
(vi) 선별된 기준 DNA 각각에 혼성화된 표지된 단편에 의해 생성되는 시그널의 강도를 측정하는 단계;
(vii) 각각의 기준 DNA에 있어서 건강한 환자로부터의 대조 DNA에서 얻어진 시그널과 비교한 얻어진 시그널들 사이의 편차를 결정하는 단계;
(viii) 환자의 암 병기를 상기의 관찰된 편차로부터 도출하는 단계.
바람직하게는 본 발명에 따른 기준 DNA에 의해 커버되는 유전자좌가 표 1에 요약되어 있다.
기준 DNA는 NCBI에 의해 언급되는 상응하는 서열에 포함된 하나 또는 몇몇의 서열에 상응한다 (각각의 염색체의 게놈 서열 상의 시작 위치 및 마지막 위치).
관련 유전자좌의 특성이 하기와 같이 추가로 정의될 수 있다:
3p: 다수의 형태의 암에 연루된 몇몇 후보 유전자를 갖는 영역.
4: 종양의 개시에서보다 종양의 진행에 더 연루된 영역. 다른 암 병상에 대하여 표적화된 종양 억제 유전자가 이 영역에서 기술되었다.
5p12-p13: 종양 공격성, 특히 전이 확산에 연루된 영역.
6q: 근육을 침습한 고등급 종양에 연루된 영역. 유전자 M6P/IGF2R는 6q26-q27 유전자좌에서 유전적 지시자로서 나타내어진다.
8p: 종양 억제 유전자: EXTL3, WRN 및 PRLTS를 포함하는, 고등급 침습성 종양 (특히 8p21-pter)에서 빈번하게 결실된 영역.
9p 또는 전체 9: 흔히 초기에 영향을 받는 영역. p16/MTS1/CDKN2A/INK4A 및 p15/MTS2/CDKN2B 유전자는 세포 주기의 진행에서 강력한 키나제 저해제이다. 이후에 논의되는 바와 같이, 흔히 pTas에서 영향을 받을 경우 p16은 Rb에 의존적인 항-발암유전자이다. INK4A는 특히 p53의 제어 지점에서 작용할 수 있다.
10q 또는 전체 10: 최소 10q11-q21 및 10q24-q25 영역: 많은 기타 암 (림프종, 전립선암, 결장암)에 연루되어 있다. 이 영역은 다수의 종양 억제 유전자를 포함한다. 10q 결실은 옳지 않은 예후에 이르게 되는 요인일 수 있다.
11p: 사배수성의 가능한 유도에서의 제1 역치인 종양 공격성에 상응하는 영역. 결실은 전이 억제 유전자인 KAI1 유전자 (11p11.2)의 발현에 영향을 줄 수 있다. EXT2, WT1, TSG101 및 TSSC5 유전자가 또한 기타 암에 연루되어 있다.
13q14: 암의 진행된 등급 및 병기에서 RB1에 상응하는 영역, RB는 P53과 협력한다. RB의 불활성화는 S기의 개시를 조절함으로써 종양 진행을 용이하게 한다. q14 유전자좌 바깥에서 다른 유전자가 연루될 수 있으며, 따라서 이는 일반적으로 검출되는 더욱 광범위한 결실을 설명하게 된다.
14q22-qter: 종양 진행과 연관된 것으로 보이는 영역. 결실은 균형을 잃은 전좌에 의해 야기될 수 있다. 적어도 하나의 종양 억제 유전자가 이 유전자좌에 존재한다.
16q: 종양 진행과 연관된 영역. CDH1은 E 카드헤린 (cadherin)을 코딩하여서, 결실은 종양 세포의 임상적 및 생물학적 공격성으로 이어진다. 또 다른 유전자는 보통 세포 성장을 저해하는 H 카드헤린을 코딩한다.
17: 보다 후기의 병기에서 나타나며 개시라기보다는 오히려 종양의 진행과 연관된 결실되거나 돌연변이된 영역. 17p13.1에서의 p53의 결실은 P53 단백질의 제어 결여로 인하여 유전자 변경의 수를 증가시킨다. 17p13.1에서의 HIC1 유전자가 또한 연루될 수 있다.
18q12 또는 전체 18: 근육-침습성 종양 (T2 이상)에서 전형적으로 변경된 영역. Smad4/DPC4 및 Smad2/MADR2/hMAD2/JU18-1은 RB 및 p15에서 이들의 불활성화에 의해 작용한다.
1q22-q25: Ta과 T1 사이에서의 이행에 상응하는 증폭된 영역. 흔히 P73이 과발현되며 따라서 이 영역에서 중복에 의해 잠재적으로 변경된다.
3q23-q24-q25-q26-qter: 심지어 그의 연루가 입증되지 않았음에도 불구하고, 변경이 잘 되는 것으로 이미 확인된 영역.
이소크롬 (Isochrome) 5p (5p 획득 및 연관된 5q의 손실): 원발암유전자의 활성화에 의해 변경된, 근육 침습성 종양에서의 영역.
6p22: 원발암유전자의 가능한 존재로 인하여 종양 침습과 연관될 수 있는 증폭된 영역.
7: 세포 성장에서 그 역할을 하는 EGF (상피 성장 인자 (epidermal growth factor)) 수용체를 코딩하는, 7p14-p21에서의 ERBB1/EGFR 유전자를 포함하는 영역. 7q31에서 cmet 유전자는 또 다른 성장 수용체, HGF/SF (간세포 성장 인자 (hepatocyte growth factor)/분산 인자 (scatter factor))를 코딩한다. 이들 영역은 종양의 무질서한 세포 성장에 연루된 것으로 보인다.
8q: 8q22-q23 영역 내의 발암유전자의 존재를 통한, 흔히 Ta-T1 이행과, 침습성 종양, 특히 전이성 종양으로의 진행에 연루된 영역.
10q22-q23: 드물게 증폭되고, 더욱 일반적으로는 결실된 영역 (상기 참조).
11: 세포 주기로의 진입을 제어하는 CCND1 유전자를 포함하는 적어도 11q13 밴드의 증폭. CCND1은 많은 암에서 활성화되지만 암 진행과의 상관성은 거의 없는 것으로 보인다. 이러한 증폭은 초기 암 성장 시기와의 관계를 수반한다.
12q15: MDM2 유전자를 포함하는 영역으로서, 이는 일부 종양에서 p53과 상호작용하여 그의 역할을 그의 활성화 부위의 차폐에 의해 억제한다.
13q33-q34: 때때로 방광 종양에서 발견되는 가능한 삼염색체 13은 가능하게는 원발암유전자를 포함하는 이 영역을 중복시킬 수 있다.
17q: 17q21에서 ERBB2 유전자를 포함하는 공통으로 중복된 영역. 이러한 이상은 진행된 등급 및 병기에서 더욱 일반적이거나, 재발과 연관된다.
18q11: 일부의 드문 상당한 증폭에 대하여 인식된 영역.
20: 가장 흔히는 2Oq 유전자좌에 제한된 공통 영역. 가족력 형태의 암종 원발암유전자가 20q11-q12 유전자좌에 존재한다. 20q13에서, STKIS/BTAK는 염색체 불안정성을 유도하는 단백질을 코딩한다.
본 발명의 바람직한 측면에 따르면, 시험관내 방광암 검출 방법은 하기 유전자좌 중 하나, 이들 중 몇몇, 또는 이들 모두를 기반으로 하여 환자의 비뇨기적 세포의 DNA의 배수성에 대하여 검사하는 것을 포함한다: 1q22-q24, 5p, 6q22, 7, 11q13, 12q15, 13q, 15, 16, 17q, 6q25-q27, 7q, 8p, 9p, 9q, 1Oq, 11p, 14q22-qter, 17p, 18q12, 19 및 22.
본 발명의 대안적인 실시양태에 따르면, 상기 방법은 하기 유전자좌 중 하나 또는 이들 중 몇몇에 있어서 환자의 비뇨기적 세포에서 DNA의 배수성을 검사하는 것을 포함한다:
- 1p, 3q, 8q22qter, 20, 5p12-p13, 9p, 9q, 18q12 및 17p;
- 1p, 3q, 8q22qter, 20, 5p12-p13, 9p, 9q, 18q12, 17p 및 11p;
- 1p, 3q, 8q22qter, 20, 5p12-p13, 9p, 9q, 18q12, 17p, 11p 및 7q;
- 1p, 3q, 8q22qter, 20, 5p12-p13, 9p, 9q, 18q12, 17p, 11p, 7q 및 1q22-24;
- 1p, 3q, 8q22qter, 20, 5p12-p13, 9p, 9q, 18q12, 17p, 11p, 7q, 1q22- 24 및 11q13;
- 1p, 3q, 8q22qter, 20, 5p12-p13, 9p, 9q, 18q12, 17p, 11p, 7q, 1q22- 24, 11q13 및 8p;
- 1p, 3q, 8q22qter, 20, 5p12-p13, 9p, 9q, 18q12, 17p, 11p, 7q, 1q22-
24, 11q13, 8p 및 14q22;
- 1p, 3q, 8q22qter, 20, 5p12-p13, 9p, 9q, 18q12, 17p, 11p, 7q, 1q22- 24, 11q13, 8p, 14q22 및 22;
- 1p, 3q, 8q22qter, 20, 5p12-p13, 9p, 9q, 18q12, 17p, 11p, 7q, 1q22- 24, 11q13, 8p, 14q22, 22 및 5p;
- 1p, 3q, 8q22qter, 20, 5p12-p13, 9p, 9q, 18q12, 17p, 11p, 7q, 1q22- 24, 11q13, 8p, 14q22, 22, 5p 및 6q22;
- 1p, 3q, 8q22qter, 20, 5p12-p13, 9p, 9q, 18q12, 17p, 11p, 7q, 1q22- 24, 11q13, 8p, 14q22, 22, 5p, 6q22 및 7;
- 1p, 3q, 8q22qter, 20, 5p12-p13, 9p, 9q, 18q12, 17p, 11p, 7q, 1q22-24, 11q13, 8p, 14q22, 22, 5p, 6q22, 7 및 12q15;
- 1p, 3q, 8q22qter, 20, 5p12-p13, 9p, 9q, 18q12, 17p, 11p, 7q, 1q22- 24, 11q13, 8p, 14q22, 22, 5p, 6q22, 7, 12q15 및 15;
- 1p, 3q, 8q22qter, 20, 5p12-p13, 9p, 9q, 18q12, 17p, 11p, 7q, 1q22-24, 11q13, 8p, 14q22, 22, 5p, 6q22, 7, 12q15, 15 및 6q25-q27;
- 1p, 3q, 8q22qter, 20, 5p12-p13, 9p, 9q, 18q12, 17p, 11p, 7q, 1q22- 24, 11q13, 8p, 14q22, 22, 5p, 6q22, 7, 12q15, 15, 6q25-q27 및 19;
- 1p, 3q, 8q22qter, 20, 5p12-p13, 9p, 9q, 18q12, 17p, 11p, 7q, 1q22-24, 11q13, 8p, 14q22, 22, 5p, 6q22, 7, 12q15, 15, 6q25-q27, 19 및 13q;
- 1p, 3q, 8q22qter, 20, 5p12-p13, 9p, 9q, 18q12, 17p, 11p, 7q, 1q22-24, 11q13, 8p, 14q22, 22, 5p, 6q22, 7, 12q15, 15, 6q25-q27, 19, 13q 및 16;
및
- 1p, 3q, 8q22qter, 20, 5p12-p13, 9p, 9q, 18q12, 17p, 11p, 7q, 1q22-24, 11q13, 8p, 14q22, 22, 5p, 6q22, 7, 12q15, 15, 6q25-q27, 19, 13q, 16 및 17q.
본 발명의 추가의 측면은 종양의 등급 및 공격성을 결정하기 위하여 상기에 나타낸 25개의 유전자좌로부터 취한 하나 이상의 기준 DNA를 사용하는 것을 포함한다.
바람직하게는, 본 발명의 구현에 유용한 상이한 기준 DNA의 수는 2 내지 500개, 바람직하게는 10 내지 400개, 더욱 더 바람직하게는 50 내지 400개 사이에 있다.
이와 관련하여, 본 발명은 또한 DNA 마이크로어레이 또는 칩, 더욱 구체적으로는 방광암의 비뇨기적 검출에 유용한 것에 관한 것으로서, 이것이 서로와 별개인 몇몇 기준 DNA 침적물들을 그의 표면 상에 포함하는 것을 특징으로 하며, 이들 침적물 각각은 상기에 기술된 유전자좌들 중 하나 이상에 포함된 서열에 상응한다. 바람직하게는 유리 슬라이드인 이러한 DNA 마이크로어레이 또는 칩은 본 발명에 따른 방법이 감소된 표면 영역 위에서 구현되게 하며 따라서 상기에 언급된 유전자좌들 중 하나, 이들 중 몇몇 또는 이들 모두에 있어서 건강한 DNA의 정상적인 이배체 상태에서 환자 DNA의 반수체 또는 배수체 상태의 동시 비교를 가능하게 한다.
본 발명에 따른 방광암 검출용의 그러한 DNA 마이크로어레이는 바람직하게는 이것이 그의 표면 상에 10 내지 1000가지의 기준 DNA 침적물을 포함한다는 것을 특징으로 하며, 상기 기준 DNA는 인간 염색체의 상기 유전자좌 1p, 3q, 8q22qter, 20, 5p12-p13, 9p, 9q, 18q12, 1q22-q24, 5p, 6q22, 7, 11q13, 12q15, 13q, 15, 16, 17q, 6q25-q27, 7q, 8p, 10q, 11p, 14q22-qter, 17p, 19 및 22 모두에 포함된 서열을 포함한다. 우선적으로는, 각각의 기준 DNA 침적물은 인간 염색체의 상기 유전자좌에 포함된 서열을 포함한다.
이전에 기술된 방법에 따르면, 본 발명에 따른 DNA 마이크로어레이는 이상적으로는 상기에 정의된 바와 같이 10 내지 1000가지, 바람직하게는 10 내지 400가지의 DNA, 더욱 바람직하게는 300 내지 400가지의 기준 DNA 침적물을 그의 표면 상에 포함한다. 침적물의 수는 배경 노이즈를 감소시키기 위하여 게놈 광범위 분석용 게놈 마이크로어레이와 비교하여 감소시킨다. 이 수는 방광암의 검출과 관련하여 검사 민감도를 향상시키기 위하여 본 발명자가 최적이라 생각한다.
DNA 칩은 상부에 공지된 핵산 DNA 서열, 예컨대 본 발명에 따른 기준 DNA가 두어진 평평한 유리, 규소 또는 플라스틱 기재이다.
바람직하게는, 본 발명에 따르면 염색체 이상이 방광암에 관련된 유전자좌에만 포함된, 바람직하게는 본 출원에 기술된 유전자좌들 중 하나, 이들 중 몇몇 또는 이들 모두에 포함된 DNA 서열을 포함하는 DNA 칩 상에 두어진 기준 DNA가 기술되었다.
또한 본 발명은 하기 요소들 중 하나 이상을 포함하는 키트에 관한 것이다:
- 전술한 것에 기술된, 유리 기재에 부착된, 바람직하게는 DNA 칩 또는 마이크로어레이의 형태의 본 발명에 따른 하나 이상의 기준 DNA;
- 건강한 환자로부터 취한 DNA 대조 샘플;
- 전술한 것에 기술된 총 DNA 마커 시약; 및
- 이배체 상태의 환자 DNA와 분석할 정상적인 이배체 상태의 대조 DNA의 비교를 가능하게 하는 소프트웨어 프로그램.
바람직하게는 그러한 키트는 본 발명에 따른 방법의 구현에 필요한 튜브, 플라스크 및 시약 모두를 수용하도록 하는 박스 내에 포장된다.
본 발명의 추가의 특징 및 이점이 하기 비제한적 실시예에 제공된다:
실시예
I - 유리 슬라이드의 준비
공개 데이터베이스 (UCSC 및 NCBI)의 이용가능성 덕분에, 일련의 BAC 클론 (인간 게놈 유래의 DNA 부분)을 선별하여 표 1에 열거된 선택된 마커들을 커버하였다. 이들 클론의 위치는 클로닝된 DNA의 두 말단을 서열결정함으로써 확인하여 게놈 내의 DNA 서열의 정확한 위치를 확인하였다. 이들 클론 각각은 본 발명이 의미하는 기준 DNA를 형성하였다.
선택된 클론의 전체성은 마커로서 선택된 염색체 유전자좌 모두를 커버하여 총 341가지의 BAC 클론이 만들어지게 하였다.
DNA를 BAC로부터 추출하고, 레플리G (repliG) 기술 (퀴아젠 (Qiagen), 독일)을 이용하여 증폭시켰다. 각각의 DNA를 PCR 플레이트의 341개의 웰을 형성하도록 두었는데, 각각은 10 μg의 정제 DNA를 함유하였다. 바이오로봇 (Biorobotic) 로봇 및 4개의 니들에 의해 DNA를 매우 소량으로 유리 슬라이드 상에 두었다. 어레이게노믹스 (ArrayGenomics)에 의해 생성된 설계는 2개의 혼성화 영역을 포함하여, 예방책으로서 이중 실험의 실시를 가능하게 하였다. 각각의 DNA를 각각의 혼성화 영역 내에 랜덤하게 5회 두어 5개의 독립적인 측정치를 얻었다.
그 후 DNA를 유리 슬라이드 상에 화학적으로 고정시켜 이것의 3 내지 6개월 동안의 보존을 가능하게 하였다.
II
- 방광 종양의 유전자 프로파일
냉동 종양을 수집하였다. 이들 종양의 염색체 DNA를 시판 키트를 사용하여 추출하였다. "저등급"의 것으로 여겨지는 종양은 병기 pTa/G2에 있다. "고등급"의 것으로 여겨지는 종양은 적어도 병기 pTa/G3, pT1 및 pT2에 있다. 종양을 표준 임상 기준에 따라 분류하였다 (도 2).
냉동 종양으로부터 추출한 DNA를 형광광도법 (큐빗 (QuBit) 시스템, 인비트로젠 (Invitrogen))에 의해 정량화하였다.
진단 방법의 구현에 있어서 대조 샘플로서 사용한 인간 게놈 DNA는 시판 DNA이었다 (프로메가 (promega), 인간 게놈 DNA (human genomics DNA).
III
-
DNA
표지 및 기준
DNA
와의
혼성화
전체
DNA
의 표지
1. 2.3 μg의 대조 DNA를 초음파 처리기 (엘마소닉 (Elmasonic) 초음파 처리기)를 사용하여 55 μl 에펜도르프 (eppendorf) 튜브에서 12 내지 13초 동안 초음파 처리에 의해 단편화하였다.
2. 이러한 수단에 의해 제조한 DNA 200-300 ng을 0.8% 아가로스 겔 상에서 전기영동에 의해 조사하여 DNA가 올바르게 단편화되어 있는지 그리고 대부분의 단편이 600 bp 초과의 크기를 갖는지를 확인하였다.
3. 단편들을 미세-컬럼 (뉴클레오스핀익스트랙트 (NucleospinExtract) II)에서 정제하였다.
4. 정제 DNA 및 대조 DNA의 25 μl (약 1 μg) 분취물을 Cy5 및 Cy3 형광색소를 이용한 표지를 위하여 원심분리 튜브 내에 두었다.
5. 20 μl의 랜덤 서열 프라이머 (튜브 1, 엔조 키트 (Enzo Kit))를 각각의 튜브에 첨가하고, 그 후 와동시키고 원심분리하였다.
6. 튜브를 99℃의 수조에서 10분 동안 가온하였다.
7. 튜브를 얼음 내에 5분 동안 두고, 그 후 짧게 원심분리하고, 얼음으로 되돌렸다.
8. 시아닌으로 표지한 뉴클레오티드들의 혼합물 5 μl를 각각의 튜브 (튜브 2 또는 3, 엔조 키트)에 첨가하였다.
9. 1 μl의 클레나우 (Klenow) 효소 단편 (튜브 4, 엔조 키트)을 추가로 첨가하였다.
10. 상기 혼합물을 히트-블록 (heat-block)에서 3시간 30분 동안 37℃에서 인큐베이션하였다.
11. 5 μl의 중지 완충액 (튜브 5, 엔조 키트)을 첨가한 후 튜브를 얼음 상에 두었다.
표지된
DNA
의 세척
12. 100 μl의 DNA 당 200 μl의 NT 완충액을 튜브에 첨가하였다.
13. 각각의 튜브의 내용물을 컬럼으로 옮기고, 그 후 11,000 g에서 1분 동안 원심분리하였다.
14. 600 μl의 NT3 세척 완충액을 각각의 컬럼 내에 넣고, 그 후 11,000 g에서 1분 동안 원심분리하였다.
15. 컬럼을 11,000 g에서 2분 동안 원심분리하였다.
16. 51 μl의 살균수를 컬럼의 상부에 1분 동안 두었다.
17. 컬럼을 11,000 g에서 1분 동안 원심분리하고, 용해되고 표지된 DNA를 튜브에 회수하였다.
혼성화
전의
DNA
의 준비
18. 50 μl의 Cot-1 DNA (로슈 (Roche))를 각각의 튜브에 첨가하였다.
19. 0.3 M의 아세트산나트륨 (pH 5-8)을 이용하여 부피를 200 μl로 조정하였다.
20. 300 μl의 냉동 에탄올을 첨가하였다.
21. 혼합물을 와동시키고, 그 후 암소에서 70℃에서 15분 동안 인큐베이션하였다.
22. 튜브를 11,000 g에서 4 내지 8℃에서 15분 동안 원심분리하였다.
23. 상청액을 진공 펌프를 사용하여 제거하였다.
유리 슬라이드 상의
BAC
의 준비
BAC 클론 형태의 DNA를 탈수 형태로 유리 플레이트 상에 두고, 그 후 UV 광 (350 mJ)에 민감한 가교결합제를 사용하여 고정하였다.
표지된
DNA
/기준
DNA
(
BAC
)의
혼성화
24. 지점 23에서 회수한 잔류물을 5 μl의 ddH2O에 첨가하였다.
25. 50 μg/μl의 효모 tRNA (인비트로젠, 카탈로그 번호 15401-011) 10 μl 및 상기 혼합물을 교반하고, 95℃로 5분 동안 가온하였다.
26. 70℃로 예열한 15 μl의 혼성화 완충액 (암비온 슬라이드 Hyb 완충액 (Ambion Slide Hyb Buffer) #3)을 첨가하였다.
27. 혼합물을 30초 동안 강력하게 교반시키고, 13,000 rpm에서 30초 동안 원심분리하였다.
28. 혼합물을 37℃에서 30분 동안 가온하였다.
29. 유리 슬라이드를 상기 혼합물로 완전히 덮었다.
30. 청결한 리프터슬립 리프 (Lifterslip leaf) (24 x 32 인치) (이리 사이언티픽 (Erie Scientific), 카탈로그 번호 25X601-2-4789)를 마이크로어레이를 덮도록 유리 슬라이드 위에 두었다.
31. 20 μl의 물을 첨가하여 시일 (seal)을 축축하게 하였다.
32. 폐쇄시킨 혼성화 챔버 (혼성화 챔버, 코닝 (Corning), 카탈로그 번호 2551)를 55℃의 수조 내에 16시간 동안 침지시켰다.
혼성화
후 세척
33. 유리 플레이트를 0.1% SDS 0.1 X SSC의 제1 용액에서 50℃에서 인큐베이션하였다.
그 후 마이크로어레이를 하기 세척액 (각각의 용액에서 교반하면서 45 sec 동안, 그리고 교반 없이 45 sec 동안) 중에 연속적으로 두었다:
a) 0.1X SSC, 0.1% SDS;
b) 0.1X SSC, 0.1% SDS;
c) 0.1X SSC;
d) 0.1X SSC;
34. 유리 슬라이드를 실온에서 0.1X SSC 용액으로 충전된 표지 박스 ㄴ내냉내에 침지시키고, 그 후 100% 에탄올 (씨엠엘 (CML), 카탈로그 번호 BVITRI-PPL25L)로 충전된 또 다른 박스 내에 침지시켰다.
35. 그 후 유리 슬라이드를 원추형 50 ml 튜브 내에 넣고 그 후 수초 동안 원심분리하여 건조시켰다.
36. 유리 슬라이드를 암소에서 보존하였다.
표지 시그널의 강도에 따라 민감도를 조정한 형광 스캐너 (제네픽스 (GENEPIX) 4000B)를 이용하여 유리 슬라이드를 분석하였다.
이미지 분석 소프트웨어 백매직+ (BacMagic+) (어레이게노믹스 (ARRAYGENOMICS)에 의해 개발됨)를 사용하여 결과를 분석하여 염료 스왑 방식으로 프로파일들을 그래픽으로 가시화하였다. 각각의 DNA에 있어서, 텍스트 파일을 백매직+로 엑스포트하고 포맷하여서 이것이 시지에이치 (seeGH) 소프트웨어에 의해 사용될 수 있게 하였다. 결실 및 획득을 백매직+에서의 염료 스왑 대칭성의 가시화를 기반으로 하여 주석을 달았다.
시지에이치를 사용하여, 각각의 군에 있어서 주석을 컴파일링하여 검출된 이상 및 그의 빈도의 전체 이미지를 도출하였다. 핵형 표와 유사한 이들 영상에서, 마크는 이상 (적색 = 손실, 녹색 = 획득) 및 그의 위치를 나타낸다. 마크의 크기는 환자 풀에서의 상기 이상의 검출 빈도를 나타낸다.
도 2를 분석해 보면, 등급 및 병기에 따른 각각의 종양 군의 전형적인 프로파일의 생성이 가능하며, 이는 그 후 종양 군의 전형적인 프로파일과 비교할 수 있었다.
이 요약으로부터, pTaG2'가 더욱 높은 등급보다 훨씬 덜 변경된 것으로 보였다. 일부 이상은 저등급 종양에 특징적인 것으로 보였다. 문헌에 기술된 바와 같이, 9의 결실이 여기에서 또한 발견되며, 이는 개시에 더욱 밀접하게 관련되고 흔히 pTas와 연관된 것으로 나타났다. 본 사례에서, 3q 및 5p 획득이 또한 저등급에 특징적인 것으로 보였다 (여기서, 이것은 더욱 높은 등급에 대해 기술된 iso5p가 아니며, 그 이유는 5q 획득이 전혀 없기 때문이다).
고등급에 있어서의 획득 이상은 점진적으로 8q, 1q, 11q에서 나타나지만 또한 16 및 18에서도 나타나며, 이는 T2 병기 이상에서 더욱 흔히 나타나는 것으로 보였다.
고등급에 있어서의 손실 이상은 6q, 11p, 및 13이지만 또한 18q이기도 하며, 따라서 후자의 이벤트는 종양의 진행에서 늦게 나타나는 것으로 보였다.
IV
- 민감성 및 특이성의 계산 및 정의
민감성: 아픈 환자를 탐지하는 능력.
특이성: 어느 대상체가 건강한지를 결정하는 검사의 능력.
본 발명자가 공지된 종양을 이용한 덕분에, 이 검사의 민감성을 계산하는 것이 가능했다. 이는 평가할 저등급 종양 및 고등급 종양 둘 모두를 본 기술이 검출하는 능력을 허용한다. 계산에 있어서 두 군을 분리시키는데, 그 이유는 저등급 종양의 검출이 덜 어렵기 때문이다. 일상적인 검사, 예컨대 요세포 검사는 이들 암 중 50%만을 그의 초기 병기에서 검출하였다.
기존의 검사는, 하기 표 4에 나타낸 바와 같이, 과학 문헌에서 계산한 그의 민감성 및 특이성을 특징으로 하였다 (이는 최소치 및 최대치로 표현되며, 그 이유는 이들 값이 각각의 연구에 따라 다양하기 때문임 - 출처: 문헌[Biomarkers for detection and surveillance of bladder cancer, Lorne I. Budman, MSc, Wassim Kassouf, M. D., and Jordan R. Steinberg, MD from the Division of Urology, McGill University Health Centre, Montreal, Quebec]).
민감성을 주어진 수의 마커에 대하여 결정하였다. 이들 중 각각의 하나에 있어서, 민감성 값을 계산할 수 있었다. 명백하게도, 단지 하나의 유전자 마커는 신뢰성 있는 해답에 이르게 될 수 없었다. 그러나, 25가지의 마커의 조합은 표 5 및 표 6에서 요약 평가에 의해 나타낸 바와 같이 상당히 더욱 분별력이 있는 것으로 보였다.
저등급 군으로 분류된 10가지의 이상을 아직 침습성으로 되지 않은 개시 기의 종양의 모델로서 취할 수 있었다.
일반적으로, 종양이 침습성은 아니지만 고등급의 것일 때 또는 이것이 이미 T1 또는 T2 병기 또는 그보다 높은 병기에 있을 때, 본 발명의 마커에서 검출된 이상의 수는 증가하였다.
고등급의 경우, 본 방법에 의해 1번, 7번, 8번, 11번, 13번, 14번, 17번 및 18번 염색체의 중요성을 확인하였다.
그러나, 개별적으로 고려된 마커 각각의 민감성은 (일부의 연구에서 세포학적 검사 또는 NMP22의 경우에서 그러한 바와 같이) 36%를 초과하지 않음을 알아야 한다.
다른 한편으로는, 본 발명의 발명자에 의해 선별된 모든 유전자 마커의 풀링은 심지어 확실하게 저등급인 경우에서도 매우 양호한 민감성을 제공하였다 (본 발명 단독에서 얻어진 결과는 특정한 연구에서 사용한 이뮤노Cyt/uCyt+ 및 세포학적 검사의 병용만큼 만족스러웠다).
이와 유사하게, 특이성 (네가티브 내시경 검사 및 네가티브 추적의 결과를 이용하여 환자의 소변으로부터 추출한 DNA 또는 정상 샘플에 대하여 검사함)은 100%에 도달하였다.
V - 소변에서의 검증
소변 샘플을 진단하의 환자 또는 추적 중인 환자로부터 취하였다.
일상적인 내시경 검사를 수행하였다. 그 후 환자를 도 2에 예시된 바와 같이 분류하였다.
본 방법을 냉동 종양에서와 동일한 방식으로 구현하였다 (파트 II 참조).
백매직+ 소프트웨어를 사용하여 결과를 분석하여 염료 스왑 방식으로 프로파일들을 그래픽으로 가시화하였다. 각각의 DNA에 있어서, 텍스트 파일을 백매직+로 엑스포트하고 포맷하여서 이것이 시지에이치 소프트웨어에 의해 사용될 수 있게 하였다. 결실 및 획득을 백매직+에서의 염료 스왑 대칭성의 가시화를 기반으로 하여 주석을 달았다.
시지에이치를 사용하여, 각각의 군에 있어서 주석을 컴파일링하여 검출된 이상 및 그의 빈도의 전체 이미지를 도출하였다. 핵형 표와 유사한 이들 영상에서, 마크는 이상 (적색 = 손실, 녹색 = 획득) 및 그의 위치를 나타낸다. 마크의 크기는 환자 풀에서의 상기 이상의 검출 빈도를 나타낸다.
더욱 고도한 비뇨기 계통의 종양에 있어서, 검출된 이상의 요약 평가를 도출하는 것이 가능하다 (표 7 및 표 8).
포지티브 내시경 검사를 한 환자에 있어서, 방광암에 특징적인 이상이 인지되었으며, 이때 본원에 열거된 변이가 약간 있었다.
게다가, 이상 분포 표를 이들 검출된 종양의 등급을 결정하려는 노력으로 이용한다.
방광 종양의 경우, 검출된 변경의 요약 평가를 도출함으로써 이를 또한 실시하였다.
표 9 및 표 10에 열거한 결과는, 많은 특징적인 이상이 포지티브 내시경 검사에 의해 환자에서 검출됨을 보여주었다. 그러나, 의심될 경우의 내시경 검사는 더욱 적은 변경을 나타내었다. 내시경 검사에 의한 진단이 완전히 결정되지 않은 환자에 있어서, 추적은 이들 환자가 불리하게 진행되었음을 보여 주었다. 따라서, 의심될 경우의 내시경 검사는 6개월의 추적에 도달하기 전에 본 발명자의 검사에 의해 명백하게 된 것으로 보였다.
또한 네가티브 내시경 검사를 한 환자뿐만 아니라 12개월의 추적을 한 이들도 여전히 아무것도 나타내지 않았으며, 검사한 영역에 있어서 양성을 전혀 나타내지 않았음을 알아야 한다. (단지 약간의 클론이 변이를 나타내었지만, 이들은 시험하려고 의도된 영역이 아니었고 슬라이드 상에 스폿을 형성한 클론의 다형성 변이체에 상응하였다. 이들 클론은 본 발명의 슬라이드의 근간 버전에서 억제되어야 하며, 이는 그의 다양한 성질 및 중심체 근처의 위치 때문이다.)
포지티브 내시경 검사를 이용하여 환자 소변으로부터 추출한 DNA 각각을 기초로 하여 개별적으로 분석을 수행할 경우, 저등급 또는 고등급을 조합한 본 발명의 요약 표를 적용할 수 있다.
구체예
:
DNA 34016: 포지티브 내시경 검사에 의하면 UUTT. 저등급을 나타내는 9p 및 9q 결실을 검출하였다. 본 발명자의 비뇨기과 전문의 파트너는 검사 이후 생검을 실시하였다. 등급 1 또는 2가 결정되었다.
DNA 33276: 포지티브 내시경 검사에 의하면 UUTT. 다수의 이상 (총 8가지)이 검출되었으며, 이들 중 9q, 11p, 8p 및 1q22-q2는 고등급의 특징적인 것이었다. 생검 이후에, 등급 G3을 확인하였다.
DNA 32479: 의심될 경우의 내시경 검사에 의하면 방광 종양이지만 6개월에서는 양성으로 추적: 단지 19의 획득이 탐지되었다. 19의 획득의 미정의 영향 및 이러한 작은 수의 이상은 본 발명자가 이 종양을 저등급과 연관시키게 하였다. 생검에 의하면 등급 G1/G2가 나타났다.
이 연구에서 소변을 검사한 환자 대부분에서, 이들의 내시경 검사가 양성일 때마다 생검을 실시하였다. BCA 검사를 실시할 때에, 생검 결과는 입수가능하지 않았다.
따라서, 이 검사를 맹검 방식으로 실시하였다. 그 결과를 하기 표 11에 나타낸 바와 같이 방광암에 대하여 요약할 수 있었다.
생검 결과가 명확한 모든 환자에 있어서 종양의 등급 예측이 가능하였음을 알아야 한다. 게다가, 일부 경우에 있어서, 변경된 마커의 더욱 정확한 분석은 종양의 공격 특징, 그의 전이 잠재성 및 그의 가능한 진행에 관한 정보를 제공한다. 게다가, 너무 제한된 일부 생검체는 분석할 수 없었으며, 반면에 본 발명은 이들 종양의 등급에 관한 명확한 결과를 제공할 수 있다.
Claims (20)
- (i) 환자로부터 취한 소변 샘플에 함유된 DNA를 추출하는 단계;
(ii) 단계 (i)에서 추출한 DNA를 단편화하는 단계;
(iii) 얻어진 DNA 단편을 표지제로 균일하게 표지하여 표지된 DNA의 풀 (pool)을 형성하는 단계;
(iv) 표지된 DNA의 풀로부터 하나 이상의 분취물을 형성하고 각각의 분취물을 기준 DNA 세트와 접촉시키는 단계이며, 상기 접촉은 표지된 DNA 단편과 상기 기준 DNA의 특이적 혼성화를 가능하게 하는 조건 하에 실시하고, 상기 기준 DNA는 인간 염색체 유전자좌 3q, 8q22qter, 9p, 9q, 18q12, 1q22-q24, 11q13, 13q, 7q, 8p, 11p, 14q22-qter, 17p 및 22 각각에 포함된 DNA 서열을 포함하는 것인 단계;
(v) 기준 DNA에 특이적으로 혼성화되지 않은 표지된 DNA 단편을 제거하는 단계;
(vi) 선별된 기준 DNA 각각에 혼성화된 표지된 단편에 의해 생성되는 시그널의 강도를 측정하는 단계;
(vii) 각각의 기준 DNA에 있어서 건강한 환자로부터의 대조 DNA에서 얻어진 시그널과 비교한 얻어진 시그널들 사이의 편차를 결정하는 단계;
(viii) 환자의 암 병기를 단계 (iv)에 특정된 유전자좌에 대한 상기의 관찰된 편차로부터 도출하는 단계
를 포함하고, 상기 기준 DNA는 방광암의 등급 결정을 가능하게 하는 것임을 특징으로 하는, 환자에서의 방광암의 시험관내 검출 방법. - (i) 환자로부터 취한 소변 샘플에 함유된 DNA를 추출하는 단계;
(ii) 단계 (i)에서 추출한 DNA를 단편화하는 단계;
(iii) 얻어진 DNA 단편을 표지제로 균일하게 표지하여 표지된 DNA의 풀 (pool)을 형성하는 단계;
(iv) 표지된 DNA의 풀로부터 하나 이상의 분취물을 형성하고 각각의 분취물을 기준 DNA 세트와 접촉시키는 단계이며, 상기 접촉은 표지된 DNA 단편과 상기 기준 DNA의 특이적 혼성화를 가능하게 하는 조건 하에 실시하고, 상기 기준 DNA는 인간 염색체 유전자좌 1p, 3q, 8q22qter, 20, 5p12-p13, 9p, 9q, 18q12, 1q22-q24, 5p, 6q22, 7, 11q13, 12q15, 13q, 15, 16, 17q, 6q25-q27, 7q, 8p, 10q, 11p, 14q22-qter, 17p, 19 및 22로 이루어진 군으로부터 선택된 27개의 인간 염색체 유전자좌 중 25개 이상에 포함된 DNA 서열을 포함하는 것인 단계;
(v) 기준 DNA에 특이적으로 혼성화되지 않은 표지된 DNA 단편을 제거하는 단계;
(vi) 선별된 기준 DNA 각각에 혼성화된 표지된 단편에 의해 생성되는 시그널의 강도를 측정하는 단계;
(vii) 각각의 기준 DNA에 있어서 건강한 환자로부터의 대조 DNA에서 얻어진 시그널과 비교한 얻어진 시그널들 사이의 편차를 결정하는 단계;
(viii) 환자의 암 병기를 단계 (iv)에 특정된 유전자좌에 대한 상기의 관찰된 편차로부터 도출하는 단계
를 포함하고, 상기 기준 DNA는 방광암의 등급 결정을 가능하게 하는 것임을 특징으로 하는, 환자에서의 방광암의 시험관내 검출 방법. - 제2항에 있어서, 상기 단계 (iv)에서 상기 기준 DNA가 인간 염색체 유전자좌 1p, 3q, 8q22qter, 20, 5p12-p13, 9p, 9q, 18q12, 1q22-q24, 5p, 6q22, 7, 11q13, 12q15, 13q, 15, 16, 17q, 6q25-q27, 7q, 8p, 10q, 11p, 14q22-qter, 17p, 19 및 22 각각에 포함된 DNA 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 기준 DNA가 1,000 내지 200,000 bp (염기쌍) 길이의 인간 염색체의 DNA 서열로 이루어진 것을 특징으로 하는 방법.
- 제4항에 있어서, 기준 DNA가 2,000 내지 180,000 염기쌍 길이의 인간 염색체의 DNA 서열로 이루어진 것을 특징으로 하는 방법.
- 제5항에 있어서, 기준 DNA가 5,000 내지 160,000 염기쌍 길이의 인간 염색체의 DNA 서열로 이루어진 것을 특징으로 하는 방법.
- 제4항에 있어서, 기준 DNA가 인간 게놈의 BAC 클론으로 이루어진 것을 특징으로 하는 방법.
- 제5항에 있어서, 기준 DNA가 인간 게놈의 BAC 클론으로 이루어진 것을 특징으로 하는 방법.
- 제6항에 있어서, 기준 DNA가 인간 게놈의 BAC 클론으로 이루어진 것을 특징으로 하는 방법.
- 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 및 제2 마커를 상기 소변 추출 DNA 단편 및 건강한 환자로부터의 대조 DNA의 표지에 각각 사용하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제10항에 있어서, 제1 및 제2 마커가 상이한 파장에서 발광하는 형광 마커인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제11항에 있어서, 제1 및 제2 마커가 Cy3 및 Cy5인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (viii)에서의 종양 세포의 등급을 기준 DNA에 대하여 관찰된 편차의 함수로서 결정하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 기준 DNA를 표지된 DNA 단편과의 혼성화 이전에 마이크로어레이 상에 별도로 침적시키는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (iii)에서 환자로부터 취한 DNA 단편을 두 풀로 나누고, 하나는 제1 마커로 표지하며 두 번째의 것은 제2 마커로 표지하고, 단계 (vii)의 대조 DNA도 2개의 풀로 나누고, 하나는 제1 마커로 표지하며 두 번째의 것은 제2 마커로 표지하고, 시그널 편차의 교차 결정을 상기 표지한 풀 각각의 사이에서 단계 (vii)에서 실시하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 인간 염색체 유전자좌 3q, 8q22qter, 9p, 9q, 18q12, 1q22-q24, 11q13, 13q, 7q, 8p, 11p, 14q22-qter, 17p 및 22 각각에 포함된 서열을 포함하는 기준 DNA의 50 내지 1000가지의 침적물을 표면 상에 포함하고, 상기 기준 DNA는 방광암의 등급 결정을 가능하게 하는 것임을 특징으로 하는, 방광암 검출용 DNA 마이크로어레이.
- 인간 염색체 유전자좌 1p, 3q, 8q22qter, 20, 5p12-p13, 9p, 9q, 18q12, 1q22-q24, 5p, 6q22, 7, 11q13, 12q15, 13q, 15, 16, 17q, 6q25-q27, 7q, 8p, 10q, 11p, 14q22-qter, 17p, 19 및 22로 이루어진 군으로부터 선택된 27개의 인간 염색체 유전자좌 중 25개 이상에 포함된 서열을 포함하는 기준 DNA의 50 내지 1000가지의 침적물을 표면 상에 포함하고, 상기 기준 DNA는 방광암의 등급 결정을 가능하게 하는 것임을 특징으로 하는, 방광암 검출용 DNA 마이크로어레이.
- 제16항 또는 제17항에 있어서, 표면 상에 50 내지 400가지의 상기 기준 DNA 침적물을 포함하는 것을 특징으로 하는 DNA 마이크로어레이.
- 제18항에 있어서, 표면 상에 300 내지 400가지의 상기 기준 DNA 침적물을 포함하는 것을 특징으로 하는 DNA 마이크로어레이.
- 제18항에 있어서, 각각의 기준 DNA 침적물이 인간 염색체 유전자좌 1p, 3q, 8q22qter, 20, 5p12-p13, 9p, 9q, 18q12, 1q22-q24, 5p, 6q22, 7, 11q13, 12q15, 13q, 15, 16, 17q, 6q25-q27, 7q, 8p, 10q, 11p, 14q22-qter, 17p, 19 및 22에 포함된 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 DNA 마이크로어레이.
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