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KR101802260B1 - 전신 홍반성 낭창을 치료하기 위한 인간화된 항-ｉｌ-10 항체 - Google Patents

전신 홍반성 낭창을 치료하기 위한 인간화된 항-ｉｌ-10 항체 Download PDF

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KR101802260B1
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Abstract

본 발명은, 인터루킨-10(IL-10)에 결합가능한 인간화된 또는 키메라 항체 또는 항체 단편으로서, 상기 항체 또는 항체의 단편은, (i) IL-10 수용체 α (IL-10Rα)의 결합부와 동일한 IL-10의 영역에 결합하지만, IL-10이 IL-10 수용체에 결합되었을 때에는, IL-10에 결합할 수 없으며, (ii) 2개의 단량체의 잔기들을 포함하는 불연속 에피토프에 결합함으로써 동형이량체 형태의 IL-10에 결합하는 것을 특징으로 하는 항체 또는 항체의 단편을 제공한다. 또한, 본 발명은 관련 제품 및 항체 또는 항체의 단편의 사용을 수반하는 방법을 제공한다.

Description

전신 홍반성 낭창을 치료하기 위한 인간화된 항-ＩＬ-10 항체{HUMANIZED ANTI-IL-10 ANTIBODIES FOR THE TREATMENT OF SYSTEMIC LUPUS ERYTHEMATOSUS (SLE)}
본 발명은 인터루킨-10 (IL-10) 및 IL-10에 특이적인 물질에 관한 것이다. 구체적으로, 본 발명은 인간화된 IL-10 항체 및 이의 용도에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 전신 홍반성 낭창(SLE)의 치료 방법에 관한 것이다.
전신 홍반성 낭창 (SLE)은, B 림프구의 비정상적인 과다활성과 면역글로불린 γ(IgG) 자가-항체의 비정상적인 대량 생산이 주요 원인인, 자가면역 질환으로 간주된다. 이러한 병리학적 과정을 통해 Ig로 코팅된 세포의 격리 및 파괴, 보체 단백질의 고정 및 절단, 및 케모탁신, 혈관작용성 펩타이드 및 파괴성 효소의 조직으로의 분비가 이루어진다 (Hahn BH. Systemic Lupus Erythematosus. In: Kasper DL, Braunwald E, Fauci AS, Hauser SL, Longo DL, Jameson, JL, editors. In: Harrison's Principles of Internal Medi-cine (16th edition). New York (US): McGraw-Hill; 2005.pp.1960-1967).
SLE는 다양한 증상들로 특정된다. 병환 중인 환자의 전체 95%가 근골계 질환을, 80%는 피부 병변을, 85%는 혈액 질환을, 60%는 신경 장애를, 60%는 심폐 질환을, 30% - 50%는 신장 질환을, 40%는 위장 질환을, 15%는 혈전증을, 15%는 안 질환을 토로한다. 또한, 환자의 거의 대부분(95%)이 피로, 불쾌감, 열, 식욕부진 및 체중 감소와 같은 전신 증상들을 겪게 되며, 이러한 증상은 항상 존재한다. 대부분의 환자들은 증상이 발현되는 질환기와 관해기를 번갈아 경험한다. 영구적인 관해(치료를 하지 않아도 증상이 나타나지 않음)는 매우 드문 편이다. 50년 이상 이전에는 SLE로 진단받은 대부분의 환자들은 생존 기간이 5년 미만이었다. 오늘날, 대부분 조기 진단, 증상성 항염증 치료 및 면역억제 치료로 인해, 10년 생존율은 90%를 넘는다. 일반적인 사망의 원인은 면역억제의 결과로 인한 감염증이다 (Hahn 2005).
SLE의 치료에 항말라리아제, 항염증제 및 면역억제제들이 일상적으로 사용되고 있다. 증상 제어가 어려워지면 비스테로이드성 항염증제가 코르티코스테로이드와 함께 추가된다. 나아가, 주요 장기에 침범하는 활성형 SLE인 경우에는 사이클로포스파미드를 이용한 적극적인 치료가 요구된다.
지금까지, SLE를 치유하거나 및/또는 장기적으로 환자의 삶의 질을 개선시키기 위한 이용가능한 근원적인 치료제는 없는 실정이다. 그러나, 최근 항체 기법의 진보와 자가면역 질환의 근간을 이루는 인자들의 추가적인 동정을 통해, 치료 옵션으로서 단일클론 항체의 이용가능성이 열리게 되었다. 특히, SLE의 치료에 유익한 접근법은, 다클론성의 자가-항체를 대량 과잉 생산을 초래하는 병적 상태의 면역 반응에 상호작용하거나 이를 교정하는, 특이적인 치료법일 것이다. SLE 발병에는 주로 탈규제된 B 세포가 관여하기 때문에, B 세포를 타겟팅할 수 있는 단일클론 항체가 특히 관심의 대상이다. Robak 및 Robak (Current Drug Targets, 2009, No. 10, pages 26-37)에 의해 언급된 바에 따르면, 잠재적인 B 세포의 표면 항원 타겟은 CD19, CD20, CD21 및 CD22이다. 나아가, IL-10, IL-1ra, IL-12 (Capper et al., Clin. Exp. Immunol. 2004 Nov;138(2):348-56), 및 IL-6 (Chun et al., J. Clin. Immu-nol. 2007 Sep;27(5):461-6)도 면역 반응을 조절하는데 있어서 중요한 사이토카인이며, 특히 SLE 환자에서 발증기에 증가된다. IL-10의 혈장 수준과 2중 가닥 DNA(dsDNA)에 대한 자가항체가 보통 SLE 환자의 질환 활성 상태를 나타낸다. IL-10의 수준 증가는 SLE 환자의 질환 활성과 상호 관련있다 (Park et al., Clin. Exp. Rheumatol. 1998 May-Jun;16(3):283-8). 그러나, IL-10은 면역계에 다면적 효과를 가진 사이토카인으로, 전염증성 반응을 완화시키는데에도 관여하는 것으로 알려져 있다.
단일클론 항체를 이용한 임상 실험들이 SLE 환자를 대상으로 수행되었다. 구체적으로, 몇가지 연구들에서는 비호지킨스 림프종의 치료에 사용되는 키메라 마우스 항-CD20 단일클론 항체인 항체 Rituximab가 사용되었다. Robak 및 Robak (2009)에 언급된 바와 같이, 이러한 연구 결과는 SLE 환자에서 항체의 높은 활성을 나타내었고, CD20을 타겟팅하는 수종의 새로운 항체, 즉 Ofatumumab, IMMU-106 및 GA-101이 개발되었다. SLE에서의 단일클론 항체의 작용을 보고한 추가적인 임상 실험들은, 항-CD22 항체, Epratuzumab, 항-TNFα 항체, Infliximab, 항-IL-10 항체, B-N10 (Llorente et al., Arthritis Rheum. 2000 Aug;43(8):1790-800), 항-CD40L 항체, IDEC 131 및 BG 9588, BLYS 저해제, Belimumab, 항-IL6 수용체 항체, Toclimumab, 및 항-C5 항체 Eculizumab로 수행되었다.
본 발명의 목적은 추가적인 제제, 보다 상세하게는 본 분야에 유용한 항체를 제공하는 것이다.
이에, 본 발명의 일 측면은 인터루킨-10(IL-10)에 결합가능한 인간화된 또는 키메라 항체 또는 항체 단편으로서, (i) IL-10 수용체 α (IL-10Rα)의 결합부와 동일한 IL-10의 영역에 결합하지만, IL-10이 IL-10 수용체에 결합되었을 때에는 IL-10에 결합할 수 없으며; (ii) 2개의 단량체의 잔기들을 포함하는 불연속 에피토프에 결합함으로써 동형이량체 형태의 IL-10에 결합하는, 인터루킨-10(IL-10)에 결합가능한 인간화된 또는 키메라 항체 또는 항체 단편을 제공한다.
본 발명자들은, 본 발명의 항체가 IL-10의 수준 증가 또는 활성 증가에 의해 매개되는 의학적인 병태, 특히 자가면역 질환을 치료하는데 적합한, 특히 유용한 결합 방식을 취한다는 것을 확인하였다. 구체적으로, 본 발명의 항체 또는 항체의 단편은, IL-10이 IL-10Rα에 결합되었을 때에는, IL-10에 결합할 수 없기 때문에, ADCC 또는 CDC 반응을 촉발시킬 수 없다. 그 결과, 본 발명의 항체는, IL-10이 그 수용체에 결합되어 있는 세포에는 결합할 수 없고, 따라서 ADCC 또는 CDC 반응을 유도할 수 없으므로, 특히 유용한 결합 방식이다. 이러한 방식을 통해 면역계의 다른 영역에 대한 항체 효과는 통제된다. 아울러, 본 발명의 항체 또는 항체의 단편은 IL-10 단량체 보다 훨씬 더 높은 친화성으로 IL-10 동형이량체에 결합할 수 있다. 이처럼, 항체는 단량체나 분해 산물에 비해 기능적 활성 형태의 IL-10에 우선적으로 결합한다. 이러한 방식은, 중화 효과 발생에 필요한 IL-10 항체의 양을 감소시키고, 비-활성 분자에 대한 비특이적인 결합에 의한 부작용 발생의 위험성을 낮출 수 있어, 특히 유용하다.
본 발명은, 제2 측면에서, IL-10 수용체 α (IL-10Rα)의 결합부와 동일한 IL-10의 영역에 결합하지만, IL-10이 IL-10 수용체에 결합되었을 때에는 IL-10에 결합할 수 없는, 인터루킨-10(IL-10)에 결합가능한 인간화된 또는 키메라 항체 또는 항체 단편을 제공한다.
본 발명은, 제3 측면에서, 2개의 단량체의 잔기들로 구성된 불연속 에피토프에 결합함으로써, 동형이량체 형태의 인터루킨-10(IL-10)에 결합가능한 인간화된 또는 키메라 항체 또는 항체 단편을 제공한다.
본 발명은, 제4 측면에서, 뮤라인 항체 B-N10의 가변성 경쇄의 CDR1, CDR2 및 CDR3의 서열과 80% 이상 동일한 아미노산 서열을 포함하거나, 및/또는 뮤라인 항체 B-N10의 가변성 중쇄의 CDR1, CDR2 및 CDR3의 서열과 80% 이상 동일한 아미노산 서열을 포함하는, 청구항 제1항에 따른 인간화된 또는 키메라 항체 또는 항체 단편을 제공한다.
본 발명은, 제5 측면에서, 항체-의존적인 세포-매개의 세포독성 및/또는 보체-의존적인 세포독성을 유도하지 않는, 인터루킨-10(IL-10)에 결합가능한 인간화된 또는 키메라 항체 또는 항체 단편을 제공한다.
본 발명은, 제6 측면에서, IL-10α 수용체를 통한 IL-10 신호전달을 방지할 수 있는, 인터루킨-10(IL-10)에 결합가능한 인간화된 또는 키메라 항체 또는 항체 단편을 제공한다.
본 발명은, 제7 측면에서, IL-10R 발현 세포에 결합할 수 없는, 인터루킨-10(IL-10)에 결합가능한 인간화된 또는 키메라 항체 또는 항체 단편을 제공한다.
본 발명은 첨부된 도면을 참조하여 예시적으로 설명된다.
도 1A는 뮤라인 B-N10 항체의 경쇄 가변부의 아미노산 서열(서열번호 2)이다. 과가변성(hypervariable)의 상보성 결정부(CDR)는 밑줄 표시되어 있다(LCDR1은 서열번호 4; LCDR2는 서열번호 5; LCDR3는 서열번호 6임).
도 1B는 뮤라인 B-N10 항체의 중쇄 가변부의 아미노산 서열(서열번호 3)이다. 과가변성의 상보성 결정부(CDR)는 밑줄 표시되어 있다(HCDR1은 서열번호 7; HCDR2는 서열번호 8; HCDR3는 서열번호 9임).
도 2A는 뮤라인 B-N10 항체의 경쇄 가변부를 코딩하는 뉴클레오티드 서열(서열번호 10)이다.
도 2B는 뮤라인 B-N10 항체의 중쇄 가변부를 코딩하는 뉴클레오티드 서열(서열번호 11)이다.
도 3은 뮤라인 B-N10의 경쇄 가변부와 중쇄 가변부의 아미노산 서열(각각 서열번호 12 및 13)과, A17 (서열번호 14), JK1 (서열번호 15), 3-66+04 (서열번호 16) 및 JH4 (서열번호 17)에서 수득한 서열, 및 뮤라인 B-N10 항체의 인간화 과정 중에 제작된, 가변부 hVL1 - hVL12 (서열번호 18 - 29) 및 가변부 hVH1 - hVH29 (서열번호 30 - 58)를 나타낸 것이다.
도 4는 hIL-10 항원 ELISA를 이용하여 키메라 cB-N10 항체 대비, 인간화된 항체 변이체의 항원 결합 특성을 비교한 것이다.
도 5는 정제된 항체 조제물을 이용하여 키메라 B-N10 항체와 비교한, 3종의 인간화된 변이체, hVH20/hVL7, hVH20/hVL8 및 hVH26/hVL7의 결합 특성을 결정한 결과를 나타낸 것이다.
도 6은 림프구를 표지 물질로 표지된 BT061 및 BT063로 착색시킨 결과이다.
도 7은 BT-063 Fab (상단), IL-10 단량체 및 이량체(중간) 및 IL-10 이량체와 BT-063 Fab의 복합체 (하단)의 크기 배제 크로마토그래피를 나타낸 것이다.
도 8은 IL-10에 결합하는 BT-063 Fab의 전체 구조를 나타낸 것이다. IL-10과 Fab 단편은 리본으로 표시되어 있다.
도 9는 IL-10 수용체와 동일한 IL-10 결합부에 결합하는 것으로 확인된, BT-063의 Fab를 나타낸 것이다. IL-10, IL-10R1 및 Fab 단편은 리본으로 표시되어 있다.
도 10은 건강한 자원자에게 정맥내 주사한 후, BT-063의 총 용량 증가에 따른 이론적으로 계산한 용량 의존적인 IL-10 결합을 도시한 것이다.
도 11은 도 10에 도시된 용량-반응 곡선에서 여러가지 IL-10 농도에 따른 이론적 효과를 나타낸 것이다. 정상(15 pg/ml)을 기준으로 추산한 1000배 고농도 및 저농도에 대한 그래프를 도시한다. 그래프 간의 미세한 차이를 관찰할 수 있다.
도 12는 도 10에 도시된 용량-반응 곡선에서 IL-10에 대한 BT-063의 여러가지 친화성에 따른 이론적 효과를 나타낸 것이다. BT-063(3 nM)에서의 친화성을 기준으로 10배 높은 경우와 10배 낮은 경우의 그래프를 도시한 것이다. 용량-반응 곡선은 BT-063의 IL-10에 대한 친화성에 크게 의존한다.
도 13은 건강한 자원자에게 BT-063을 생체내 투여한 후 용량 대비 혈장내 사이토카인의 평균 Cmax 농도를 나타낸 그래프이다.
도 14는 건강한 자원자에게 BT-063을 생체내 투여한 후 경시적인 혈장내 평균 IL-10 농도를 나타낸 그래프이다.
전술한 바와 같이, 본 발명은 인터루킨-10(IL-10)에 결합가능한 인간화된 또는 키메라 항체 또는 항체 단편, 및 IL-10의 수준 또는 활성 증가에 의해 매개되는 의학적 병태들을 치료하기 위한 상기 항체 또는 항체의 단편의 용도에 관한 것이다.
인간 IL-10은 분자량 37 kDa의 동형이량체이다. 각 단량체는 아미노산 160개로 구성되며, 분자량은 18.5 kDa이다. IL-10 이량체는 IL-10 수용체 α (IL-Rα 또는 IL-10R1)와 결합한 다음, IL-10 수용체 β (IL-10Rβ 또는 IL-10R2)를 동원하여, 복합체를 형성한다. 수용체는 다양한 세포 상에, 특히 면역 세포의 표면에서 발현되며(Asadullah et al., Pharmacol. Rev. 2003 Jun;55(2):241-69), 그 예는 단핵구, 대식세포, T 림프구 및 B 림프구 등의 대부분의 조혈 세포이며, 또한 상피 세포나 각질세포와 같은 비-조혈세포에서도 발현된다. IL-10 수용체 α에 IL-10이 결합하고, IL-10 수용체 β가 조합되면, Jak1 및 Tyk2 티로신 키나제를 통해 신호 전달이 이루어지게 되고, 그런 후 STAT 패밀리에 속하는 전사 인자들이 활성화된다. IL-10의 다양한 세포 소스, 예컨대 T 헬퍼 세포, 조절성 T 세포, 단핵구, 대식세포, B 세포, 호산구, 비만세포, 각질세포, 수지상 세포 및 심지어 암 세포들이 알려져 있다. IL-10은 B 세포에 대해 세포 자살 방지, 증식 강화, 클래스 스위칭 발생, 형질 세포(plasma cell)로의 분화(Asadullah et al., Pharmacol. Rev. 2003 Jun;55(2):241-69) 및 염증 저해 등의 다양한 기능을 수행한다.
본 발명의 제1 및 제2 측면에서, 아울러, 본 발명의 다른 측면에 대한 바람직한 구현예들에서, 항체 또는 항체의 단편은 IL-10 수용체 α (IL-10Rα)의 결합부와 동일한 IL-10의 영역에 결합하지만, IL-10이 IL-10 수용체에 결합되었을 때에는 IL-10에 결합할 수 없으며, 즉, IL-10에 항체 또는 항체의 단편이 결합되었을 때에는 IL-10은 IL-10Rα에 결합할 수 없다.
전술한 바와 같이, 기능적으로 활성형인 IL-10 이량체는 IL-10Rα와 상호작용하며, 그런 후 IL-10Rβ를 동원하여 복합체를 형성하며, 그 결과 신호 전달이 이루어지게 된다. 그러나, 일부 준최적(suboptimal) 시그널링 현상은 IL-10이 처음에 IL-10Rα에 결합하는 경우에도 발생하는 것으로 생각된다.
IL-10의 작용을 중화시킬 수 있는 항체는 다수의 기전을 통해 작동할 수 있다. 항체가 IL-10에 결합하고, 입체 장애를 통해 IL-10이 IL-10Rα과 결합하는 것을 방해할 수 있다. 특히, 기능적으로 활성형 IL-10은 동형이량체이기 때문에, 하나의 IL-10 이량체에 2개의 항체 분자가 결합할 수 있다. 다른 예로, 중화 항체는 IL-10Rα 결합부와 중첩되지 않는 IL-10의 영역에 결합하여, IL-10에 구조적인 변화를 유도함으로써, IL-10Rα 결합에 대해 길항 작용을 나타낼 수도 있다 (Josephson et al. Structure (2002) 10; 981-987).
다른 예로, 항체는 IL-10과 IL-10Rβ 간의 상호작용을 방해하는 IL-10의 영역에 결합할 수 있다. 아울러, 항체는, 사이토카인이 고친화성의 수용체 체인에 결합한 후에도, 여전히 노출된 상태인 IL-10의 부위에 결합하여, 신호전달에 필수적인 제2 수용체 체인의 동원을 방해하는 구조적인 변화를 유도하는 것도 가능하다.
반면에, 본 발명의 항체 또는 항체의 단편은 IL-10Rα의 결합부와 동일한 IL-10 부위에 결합함으로써 IL-10과 IL-10Rα와의 상호작용을 저해한다. 즉, 본 발명의 항체는 IL-10과 IL-10Rα 간의 모든 결합을 방해한다. 이로써, 전술한 준최적 시그널링 현상도 방지할 수 있다. 이처럼, 본 발명은 IL-10Rα 수용체를 통한 IL-10의 신호전달을 방지할 수 있는, 인터루킨-10(IL-10)에 결합가능한 인간화된 또는 키메라 항체 또는 항체 단편을 제공한다.
본 명세서에서 사용된, "동일한 부위에 결합한다"라는 표현은 항체 또는 항체의 단편이 IL-10의 결합에 대해 IL-10Rα와 경쟁하는 능력을 지칭한다. 실제 본 발명의 항체 또는 항체의 단편이 경쟁적인 저해제로서 작용한다. IL-10Rα는 IL-10 이량체에서 19번 - 42번 영역, 그리고 138번 - 158번 영역에 있는 잔기들에 결합하는 것으로 알려져 있다. 즉, 본 발명의 항체 또는 항체의 단편은, 또한 IL-10Rα의 결합을 효과적으로 차단하기 위해, 상기한 영역들 내부에 있는 하나 이상의 잔기에 결합할 수 있다.
또한, "IL-10이 IL-10 수용체에 결합되었을 때"라는 표현은 IL-10의 양측이 결합된 상태, 즉 2개의 단량체를 통해 IL-10 수용체에 결합되어진 상태를 지칭한다.
바람직한 일 구현예에서, 항체 또는 항체의 단편은 IL-10 수용체 β (IL-10Rβ)의 결합부와 동일한 IL-10 부위에 결합하지 않는다.
본 발명의 이러한 측면과 구현예들은, 다른 예로, IL-10α 수용체를 통한 IL-10의 신호전달을 방지할 수 있는 항체 또는 항체의 단편, 또는 (즉, 결합된 IL-10을 통해) IL-10R 발현 세포에 결합할 수 없는 것으로서 정의될 수 있다.
본 발명의 제1 측면 및 제3 측면에서, 그리고 본 발명의 다른 측면에 대한 바람직한 구현예에서, 항체 또는 항체의 단편은, IL-10 동형이량체의 단량체들 중 하나의 단량체의 잔기들과 2번째 IL-10 동형이량체 단량체의 잔기들로 구성된 불연속 에피토프에 결합하며, 즉, 항체 또는 항체의 단편은 제1 단량체의 잔기들과 제2 단량체의 잔기들로 구성된 불연속 에피토프에 결합하며, 이때 제1 단량체와 제2 단량체는 동형이량체를 형성한다.
용어 "동형이량체 형태"는, 서로 90도로 위치된 2개의 α 나선 도메인(도메인 A와 도메인 B)으로 이루어진 대칭적인 동형이량체로 표시되는, 기능적 활성형 IL-10을 지칭한다. 각 도메인의 구조적 완전성은, 하나의 체인에서 앞에서 4개의 나선이, 다른 체인의 마지막 2개의 나선과 조합되는, 각각의 펩타이드 체인의 α 나선들간의 얽힘에 따라 결정된다. 2개의 체인들의 각각의 일부분이 인터페이스 구축에 필요하기 때문에, 하나의 IL-10 단량체가 IL-10 수용체에 결합할 순 없다.
본 발명의 항체 또는 항체의 단편은 야생형 IL-10 이량체를 구성하는 2개의 단량체 둘다와 동시에 상호작용한다. 이처럼, 항체 또는 항체의 단편은 "불연속 에피토프"에, 즉 폴딩된 단백질에서는 아미노산들이 매우 근접하게 있지만 폴딩되지 않았을 때는 아미노산들이 서로 떨어져 존재하는, 에피토프에 결합한다. 특히, 에피토프는 IL-10 이량체를 구성하는 2개의 체인들에 존재하는 아미노산들에 의해 제공된다.
항체 또는 항체의 단편은 이러한 결합 방식으로 인해, 불연속 에피토프의 일부분만 존재하는 IL-10 단량체에 비해 훨씬 높은 친화성으로 기능적으로 활성인 IL-10에 결합한다.
본 발명의 바람직한 일 구현예에서, 항체 또는 항체의 단편은 하나의 IL-10 단량체(즉, 제1 단량체)의 나선 A의 잔기들과, 다른 IL-10 단량체(즉, 제2 단량체)의 나선 F'의 잔기들로 구성된, 불연속 에피토프에 결합한다.
본 발명의 특히 바람직한 일 구현예에서, 인간화된 또는 키메라 항체 또는 항체의 단편은 하나의 IL-10 단량체의 처음 55개의 아미노산, 보다 바람직하게는 아미노산 20 - 55 영역과, 제2 단량체의 뒷쪽 아미노산 20개에 의해 제공되는, 또한 그 역으로 형성되는 불연속 에피토프에 결합한다.
IL-10R1 또는 BT-063에 의해 인지되는, 하나의 단량체에 나선 A-D 및 나선 E-F가 조합된 IL-10의 인공적인 돌연변이 형태들이 문헌에 공지되어 있다.
본원에 언급된 IL-10은 인간 IL-10이며, 그 아미노산 서열은 하기 서열로 표시될 수 있다:
SPGQGTQSEN SCTHFPGNLP NMLRDLRDAF SRVKTFFQMK DQLDNLLLKE SLLEDFKGYL
GCQALSEMIQ FYLEEVMPQA ENQDPDIKAH VNSLGENLKT LRLRLRRCHR FLPCENKSKA
VEQVKNAFNK LQEKGIYKAM SEFDIFINYI EAYMTMKIRN(서열번호 1)
항-IL-10 항체는, 공지된 펩타이드 스캐닝 기법 또는 크기 배제 크로마토그래피에 의해 원하는 활성을 가지고 있는지를 측정할 수 있다.
펩타이드 스캐닝 기법은, 막 또는 적정 표면 상에 전체 또는 단편을 고정시킬 수 있는 IL-10에 대해, 가능성있는 바인더를 스크리닝하는 단계로 이루어질 수 있다. 특히, IL-10 또는 IL-10 단편은 합성에 의해 합성하거나 또는 코딩하는 핵산 서열을 예컨대, E.coli 또는 곤충 세포와 같은 적정 숙주에서 과다 발현시킬 수 있다. 구체적으로, 본원의 항체에 대한 에피토프를 형성하는 것으로 본원에서 동정된 IL-10의 영역들을 사용할 수 있다.
항-IL-10 항체는 예컨대 파지 또는 리보솜 디스플레이(또는 mRNA 디스플레이, 폴리솜 디스플레이, 효모 디스플레이) 기법을 이용하여 동정할 수 있다. 이러한 기법들을 이용하여, 불연속 에피토프를 인지하는 바인더도 동정할 수 있다. 단백질 또는 리간드(즉, 항체가 선택될 수 있음)를 고정시키고, 잠재적인 결합 파트너와 함께 인큐베이션할 수 있다. 결합되지 않은 단백질은 제거하고, 결합된 리간드들을 용리시킨다. 몇번의 선택 과정을 수행하여 고친화성의 바인더를 동정한다.
본 출원에서, 용어 "키메라 항체"는, 중쇄 및/또는 경쇄의 일부가 특정 종으로부터 유래된 항체 또는 특정 항체 클래스 또는 서브클래스에 속하는 항체와 서열상 동일하지만, 항체의 나머지 부분은 다른 종, 항체 클래스 또는 서브클래스로부터 유래된 항체와 서열이 동일한, 항체를 지칭한다. 특히 바람직하게는, 키메라 항체의 CDR들은 하나의 기원으로부터 유래되지만, 항체의 나머지 부분은 기원이 상이하다. 구체적으로, 본 발명에서, 키메라 항체는, 비-인가 항체의 항원 결합 서열/가변 도메인이 인간 항체 프래임워크 영역 상에 그래프트된, 인간화된 항체일 수 있다.
본 발명에서, 용어 "단편"은 여전히 원하는 생물학적 활성을 보유하고 있는, 항체의 단편 또는 항체의 유도체를 지칭한다. 단편은 일반적으로 항체의 항원 결합부와, 구체적으로 Fab, Fab', F(ab)'2, Fv 및 scFv 단편, 뿐만 아니라 다가 항체 유도체, 특히 디아바디(diabody) 또는 탠덤 디아바디를 포함할 것이다. 단편은 바람직하게는 아미노산 25개 이상, 더 바람직하게는 50개 이상, 보다 더 바람직하게는 200 - 500개이다. 다른 예로, 단편은 30 KDa - 150 kDa의 크기를 가지는 것으로 정의될 수 있다. 또한, 항체 단편은 2 이상의 펩타이드/폴리펩타이드 체인을 포함할 수 있다. 예로, 각 체인의 아미노산 수가 200 - 300개인 체인 2개로 이루어진 Fab 단편, 또는 각 체인의 아미노산의 수가 400 - 500개인 체인 2개로 이루어진 TandAbs® (4가 2중 특이적인 항체 형태)가 있다.
본 발명의 제4 측면과, 본 발명의 다른 측면에 대한 바람직한 구현예에서, 항체 또는 항체 단편은 뮤라인 B-N10 항체 또는 BT-063 (변이체 hVH26/hVL7)로부터 유래된다. 특히, 이러한 항체 또는 항체의 단편은 B-N10 또는 BT-063 가변 경쇄의 CDR1, CDR2 및 CDR3과 80% 이상 동일한 CDR을 포함하거나, 및/또는 B-N10 또는 BT-063 가변 중쇄의 CDR1, CDR2 및 CDR3과 80% 이상 동일한 아미노산 서열을 포함할 것이다. 뮤라인 CDR의 아미노산 서열은 도 1에 나타낸다. BT-063 변이체의 가변성 서열들은 실시예 6에 나타낸다. 보다 바람직하게는, 서열은 B-N10 또는 BT-063 항체의 CDR들의 서열과 90% 이상 또는 95% 이상 동일할 것이다.
다른 예로, 항체 또는 항체의 단편은 B-N10 또는 BT-063 항체로부터 유래되며, B-N10/BT-063 가변 경쇄의 CDR1, CDR2 및 CDR3의 아미노산 서열 및/또는 B-N10/BT-063 가변 중쇄의 CDR1, CDR2 및 CDR3의 아미노산 서열을 포함할 수 있으며, 선택적으로 항체 또는 항체의 단편의 친화성 및/또는 특이성을 실질적으로 변이시키지 않는 변형을 상기한 서열에 포함한다. 구체적으로, 서열의 변이는, 뮤라인 B-N10 항체 또는 BT-063 (변이체 hVH26/hVL7) 항체의 CDR을 포함하는 항체 또는 항체의 단편과 비교하여, IL-10에 대한 항체 또는 항체 단편의 친화성 또는 특이성을 감소시키지 않는다.
구체적인 구현예에서, 인간화된 또는 키메라 항체 또는 항체의 단편은 뮤라인 항체 B-N10 가변 경쇄 및/또는 중쇄, 또는 BT-063 가변 경쇄 및/또는 중쇄의 CDR1, CDR2 및 CDR3의 아미노산을 포함한다. 보다 바람직하게, 본 발명은, 도 1에 나타낸 바와 같이 뮤라인 항체 B-N10의 가변 도메인, 또는 실시예 6에 나타낸 BT-063 항체의 가변 도메인과, 80% 이상, 보다 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 100%로 서열이 동일한 아미노산 서열을 포함하는, 인간화된 또는 키메라 항체 또는 항체의 단편을 제공한다.
또한, 본 발명자에 의해 수행된 X선 결정학 연구의 결과로, 본 발명의 항체 또는 항체의 단편이 또한 BT-063 경쇄의 CDR1 및 CDR2를 포함하는 가변부 및/또는 BT-063 중쇄의 CDR1, CDR2 및 CDR3를 포함하는 가변부를 포함하며, 선택적으로 상기 CDR의 서열에 하기 아미노산 치환을 포함하는, IL-10에 결합할 수 있는 인간화된 또는 키메라 항체 또는 항체의 단편으로서 정의될 수 있다:
(i) 경쇄 CDR1은 Ser32, Asn33, Asn35, Tyr37을 포함함
(ii) 경쇄 CDR2는 Lys55를 포함함
(iii) 중쇄 CDR1은 Phe27, Ser28, Ala30, Thr31, Tyr32를 포함함
(iv) 중쇄 CDR2는 Trp52, Arg53, Gly54, Ser56을 포함함
(v) 중쇄 CDR3는 Tyr100, Gly101, Tyr103를 포함함.
보다 바람직하게는, 중쇄 가변부는 추가로 Asn73과 Ser74를 포함한다. CDR 서열내 치환시, 이의 서열이 BT-063의 CDR 서열과 80% 이상, 보다 바람직하게는 90% 이상 동일한 것이 특이 바람직하다.
잔기 타입 및 번호의 사용은 언급하는 BT-063의 아미노산 잔기를 명확하게 식별하기 위한 목적으로 사용된다. 그러나, 잔기의 번호는 본 방법에서 스크리닝 중인 후보 항체 또는 항체의 단편내 그 위치에 있는 잔기로 한정하고자 하는 것은 아니다. 예컨대, 본 구현예의 항체에서, Ser32는, 비필수 아미노산 잔기가 경쇄의 섹션 1 - 30까지 결손된 경우에는 경쇄 CDR1내 31번 위치에 있을 수도 있다.
BT-063 중쇄 및 경쇄의 서열, 및 CDR들의 위치를 하기 실시예 6에 나타낸다.
본 발명의 제5 측면에서, 그리고 본 발명의 나머지 측면에 따른 바람직한 구현예에서, 인터루킨-10(IL-10)에 결합가능한 인간화된 또는 키메라 항체 또는 항체의 단편은 항체-의존적인 세포-매개 세포독성(ADCC) 및/또는 보체-의존적인 세포독성(CDC)을 유도하지 않는다.
전술한 바와 같이, 항체 또는 항체의 단편은 IL-10이 IL-10 수용체 α에 결합되었을 때에는 IL-10에 결합할 수 없다. 즉, 항체 또는 항체의 단편은 수용성(soluble) IL-10에만 결합할 수 있으며 IL-10R 발현 세포에는 (IL-10을 통해) 결합할 수 없다. 그 결과, 본 발명의 항체 또는 항체의 단편은 가용성 IL-10에만 결합하고 세포에 결합된 IL-10에는 결합하지 않는 특성으로 인해, 일정 부분 이상 ADCC 또는 CDC를 유도할 수 없다.
항체가 CDC를 유도하는지를 조사하기 위해, 대상 항원을 담지하고 있는 세포를 보체의 존재 하에 (또는 C1q와 같은 활성 보체를 함유하는 혈청) 항체의 양을 증가시키면서 함께 인큐베이션할 수 있다. 세포 사멸 정도는 유발된 CDC의 정도를 표시하는 파라미터로 측정할 수 있다.
항체가 ADCC를 유도하는지를 조사하기 위해, 대상 항원을 담지하고 있는 세포(타겟 세포)를 ADCC 유도성 세포(예, 천연 사살 세포, 작동자 세포)의 존재 하에 항체의 양을 증가시키면서 함께 인큐베이션할 수 있다. 타겟 세포에서의 세포 사멸 정도는 유발된 ADCC의 정도를 표시하는 파라미터로 측정할 수 있다.
아울러, 본 발명의 다른 측면과, 본 발명의 나머지 측면에 대한 바람직한 구현예에서, 인간화된 또는 키메라 항체 또는 항체의 단편은 인터루킨-10(IL-10)에 결합할 수 있어, 환자에게 투여시, 환자의 혈장내 IL-10은 50% 이상, 보다 바람직하게는 60% 이상, 가장 바람직하게는 75% 이상으로 상기 항체 또는 항체의 단편과 복합체를 형성한다. 이러한 맥락에서, 용어 "항체 또는 항체의 단편과 복합체를 이룬"은 환자에게 투여된 후 항체 또는 항체의 단편이 IL-10을 점유한 것을 지칭한다. 항체 또는 항체의 단편의 IL-10 점유력은 혈액 부피 3.5L를 기준으로, 항체 또는 항체의 단편과 IL-10 간의 해리 상수에 대한 지식을 이용하고, 아울러 아래 실시예 8에 제시된 추정 및 방법을 이용하여, 시험관내에서 측정할 수 있다.
일반적으로, 본 발명의 항체는 추가로 인간 불변부(Fc)를 포함한다. 이는, IgM, IgG, IgD, IgA 및 IgE 등의 임의 클래스의 면역글로불린, 및 IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4 등의 임의 이소형으로부터 유래된 불변 도메인들 중에서 선택할 수 있다. 바람직한 불변부는 IgG, 특히 IgG1의 불변 도메인들 중에서 선택된다.
기타 생성물
본 발명은 전술한 항체 또는 항체의 단편을 코딩하는 핵산을 추가로 제공한다. 핵산 서열은 DNA 또는 RNA일 수 있으며, 바람직하게는 DNA이다. 서열은 발현 카세트 또는 벡터 내에 사용할 수 있으며, 특히 본원에 기술된 항체 또는 항체의 단편 제조에 사용한다.
본 발명은 이들 폴리뉴클레오티드, 발현 카세트 또는 벡터로 형질전환된 숙주 세포를 추가로 제공한다. 적합한 숙주 세포는 진핵 생물 및 원핵 생물 둘다일 수 있다.
다른 예로, 숙주 세포는 본 발명의 항체 생산 세포를 골수종 세포와 융합시켜 수득하는 하이브리도마일 수 있다.
전술한 숙주 세포는 항체 또는 항체의 단편의 제조 방법에 이용할 수 있다. 특히, 이러한 방법은 항체 또는 항체의 단편의 발현을 허용하는 조건 하에 숙주 세포를 적정 배양 배지에서 배양하는 단계 및 상기 배양 배지로부터 상기 항체 또는 항체의 단편을 분리하는 단계를 포함할 수 있다. 이러한 유형의 방법들은 당해 기술 분야에 잘 알려져 있으며 개시되어 있다.
또한, 본 발명은 인간 IL-10의 아미노산 27 - 53 영역 및 아미노산 142 - 155 영역 중 하나 또는 둘다를 포함하는 50개 미만의 아미노산을 포함하는 분리된 펩타이드를 제공한다. 이러한 펩타이드는 후술하는 스크리닝 방법에서 특히 사용된다.
의학적 용도
본원의 항체 또는 항체의 단편은 IL-10의 수준 또는 활성 증가에 의해 매개되는 질환 또는 의학적 병태를 치료하는데 유용성을 가진다. 그 결과, 본원에 기술된 항체 또는 항체의 단편을 치료학적 유효량으로 투여하는 단계를 포함하는 개체에서 IL-10의 수준 또는 활성의 증가에 의해 매개되는 의학적 병태를 치료 또는 예방하는 방법을 제공한다.
특히, IL-10의 수준 또는 활성의 증가에 의해 매개되는 의학적 병태는 SLE이다. 즉, 본 발명은 또한 의약제, 특히 SLE의 치료에 사용하기 위한 본원에 따른 항체 또는 항체의 단편을 제공한다.
추가적인 예는 혈소판 감소성 자반병, 낭창성 신염, HIV, hCMV 및 C형 간염이다. 증식 또는 면역 반응의 억제를 직접 뒷받침함으로써 IL-10 의존적인 종양 세포의 치료도 다른 예이다.
본 발명의 다른 구현예는 전술한 항체 또는 항체의 단편과 약제학적으로 허용가능한 담체 또는 희석제를 포함하는 약학 조성물이다. 일 구현예에서, 조성물은 항체 또는 항체의 단편이 커플링된 리포좀을 포함한다.
이러한 조성물은 환자의 비경구로, 정맥내로 또는 피하로 투여할 수 있다. 바람직하게는, SLE의 치료시, 항체 또는 항체의 단편은 정맥내 또는 피하로 투여한다.
아울러, 본원에 기술된 항체 및 항체 단편은 IL-10의 수준 또는 활성 증가에 의해 매개되는 의학적 병태를 진단하는데 유용성을 가진다. 구체적으로, 항체 및 항체 단편은 개체로부터 취한 샘플내 IL-10의 비정상적인 수준의 존재를 측정하기 위해 시험관내 분석에서 이용할 수 있다. 이러한 진단 방법은, (a) 개체로부터 수집한 샘플을 입수 또는 제공하는 단계; (b) 상기 샘플을 본원에 기술된 항-IL-10 항체 또는 항체의 단편과 접촉시키는 단계; 및 (c) IL-10의 존재를 (예로, 항체 또는 항체의 단편의 존재를 검출함으로써) 검출하는 단계를 포함할 수 있다. 특히, 단계 (c)는 샘플에 존재하는 IL-10의 양을 측정하는 과정을 수반할 수 있다. 아울러, 본 방법은 환자 및 의학적 병태에 대한 평가를 수행하기 위해 IL-10의 존재량을 하나 이상의 정해진 수치와 비교하는 단계 (d)를 더 포함할 수 있다. 상기 정해진 수치는 건강한 개체로부터 취한 등가의 샘플에 존재하는 IL-10의 양인 표준 수치일 수 있다.
바람직하게는, 샘플은 개체의 혈액으로부터 취하여 수득하는 혈장 샘플이다. 특히, 진단 방법은 의학적 병태가 SLE인 경우에 이용할 수 있다.
비의학적 용도
또한 본원에 기술된 항체 또는 항체의 단편 및 표지 물질을 포함하는 표지된 인간화된 또는 키메라 항체 또는 항체 단편을 제공한다. 표지 물질은 샘플내 항체의 존재를 검출하기 위한 당해 기술 분야에 공지된 임의의 적합한 유형의 표지 물질일 수 있다. 구체적으로, 표지 물질은 형광 표지 물질일 수 있다.
본 발명의 항체 또는 항체의 단편은, 특히 표지된 항체는, 샘플에서 IL-10의 존재를 검출하는 시험관내 방법에 특히 유용하다. 이 방법은 표지 또는 비표지된 항체 또는 항체의 단편을 샘플과 접촉시키는 단계, 상기 샘플을 헹구어 샘플에 결합되지 않은 항체 또는 항체의 단편(비결합된 항체 또는 항체의 단편)을 제거하는 단계 및 샘플에서 항체, 예컨대 표지물질을 통한 항체의 존재를 검출하는 단계를 포함할 수 있다.
다른 예로, 표지 물질로 표지되지 않은 항체 또는 항체의 단편은 샘플내 IL-10을 시험관내에서 중화시키는 방법에 사용할 수 있다. 이러한 방법은 IL-10에 항체 또는 항체의 단편을 결합시키기 위해, 샘플을 항체 또는 항체의 단편과 접촉시키는 단계를 포함한다.
아울러, 본 발명은 하기 단계를 포함하는 IL-10 수용체 α(IL-10Rα)의 결합부와 동일한 IL-10의 영역에 결합할 수 있는 하나 이상의 분자를 스크리닝하는 방법을 제공한다:
(a) 하나 이상의 분자를, 인간 IL-10의 아미노산 27 - 53 영역 및 아미노산 142 - 155 영역 중 하나 이상의 영역을 포함하는 펩타이드와 접촉시키는 단계; 및
(b) 상기 하나 이상의 분자가 상기 펩타이드의 하나 이상의 영역에 결합하는지를 검출하는 단계.
구체적으로, 상기 하나 이상의 분자는 바람직하게는 펩타이드이고, 가장 바람직하게는 항체 또는 항체의 단편이다. 스크리닝은 파지 디스플레이 라이브러리의 제작 및 스크리닝 등으로 당해 기술 분야에 공지된 방법에 의해 수행할 수 있다.
또한, 본 발명은 IL-10 수용체 α(IL-10Rα)의 결합부와 동일한 IL-10의 영역에 결합할 수 있는 항체 또는 항체의 단편을 스크리닝하는 방법으로서, 이 방법은
(a) 하나 이상의 항체 또는 항체의 단편을 IL-10과 접촉시키는 단계;
(b) IL-10과 IL-10 수용체 α (IL-10Rα) 간의 상호작용을 저해하는 상기 항체 또는 항체의 단편의 능력을 평가하는 단계;
(c) IL-10 수용체 α (IL-10Rα)와 동일한 IL-10 부위에 결합할 수 있는 항체 또는 항체의 단편을 동정하는 단계를 포함하며,
상기 하나 이상의 항체는 BT-063 경쇄의 CDR1 및 CDR2를 포함하는 가변부 및/또는 BT-063 중쇄의 CDR1, CDR2 및 CDR3를 포함하는 가변부를 포함하며, 선택적으로 상기 CDR의 서열에 하기 아미노산 치환을 포함한다:
(i) 경쇄 CDR1은 Ser32, Asn33, Asn35, Tyr37을 포함함
(ii) 경쇄 CDR2는 Lys55를 포함함
(iii) 중쇄 CDR1은 Phe27, Ser28, Ala30, Thr31, Tyr32를 포함함
(iv) 중쇄 CDR2는 Trp52, Arg53, Gly54, Ser56을 포함함
(v) 중쇄 CDR3는 Tyr100, Gly101, Tyr103를 포함함.
이러한 측면에서, 본 발명자들은 연구를 통해 분자가 IL-10에 대한 결합력이 있을 가능성이 있는지, 즉 특정 후보 분자를 이용한 스크리닝 방법이 가능하다는 것에 대한 상세한 내용을 확립하게 되었다. 후보 분자는 BT-063 항체의 가변부를 코딩하는 뉴클레오티드 서열의 표적화된 돌연변이를 통해 제조할 수 있다.
본 발명을 아래 구체적인 구현예들을 들어 더욱 상세하게 설명한다.
실시예
실시예 1 - 뮤라인 항-IL-10 항체 B-N10의 특정화
1.1. B-N10의 가변성 항체 도메인을 코딩하는 DNA의 분리
뮤라인 B-N10의 가변 서열을 동정하기 위해, 세포 펠렛을 이용하였다. mRNA를 세포에서 분리할 때까지 샘플 (3 x B-N10, 계대 배양 3, 1 x 107개의 세포)을 -80℃에 보관하였고, cDNA 합성 후 B-N10의 가변 서열을 PCR로 증폭시킨 다음 클로닝하였다.
총 14개의 클론을 서열분석하고(SEQ Laboratories, Gottingen), 가변 경쇄와 가변 중쇄를 분석하였다. B-N10의 가변 서열을 명확하게 결정하였다. 변이는 N-말단 프라이머 영역에서만 확인되었다(표 1 참조). 가변 중쇄의 경우, 서열 변이체 QVQLKQ (서열번호 59)는 프라이머 영역에서 9번 확인되었지만, 다른 변이들은 1번 또는 2번만 확인되었다. 서브클로닝용으로 이들 변이체를 선택하였다. 가변 경쇄의 경우, 2가지 변이체는 동일 비율로 존재하였다. 뮤라인 생식 세포(germ line) 서열들을 서열 비교한 결과, 돌연변이가 3개만 있는 cr1 서열이 동정한 VL 서열과 상동성이 높았다. 이는, DVLMTQ (서열번호 60) 서열이 가장 올바른 서열이라는 것을 의미한다. 서열 DIVMTQ (서열번호 61)는 생식 세포 서열의 다른 클래스의 전형적인 예이므로, 제외시켰다.
표 1: B-N10의 서열분석한 가변 경쇄 및 중쇄의 N-말단 서열에서의 변이체. 선택 서열은 굵은 글씨체로 표시한다.
서열 횟수
가변 경쇄 DIVMTQ (서열번호 61) 5
DVLMTQ (서열번호 60) 5
DVLMTR (서열번호 62) 1
DIVITQ (서열번호 63) 1
DIVLTQ (서열번호 64) 2
가변 중쇄 QVQLKQ (서열번호 59) 9
QVQLKE (서열번호 65) 2
EVQLQQ (서열번호 66) 1
QVQLNQ (서열번호 67) 1
QVQLTQ (서열번호 68) 1
가변성 경쇄 VL 및 가변성 중쇄 VH의 단백질 서열을 도 1A 및 도 1B에 각각 나타낸다. 과가변성의 상보성-결정부(CDR)는 밑줄 표시하였다. 대응되는 DNA 서열을 각각 도 2A 및 2B에 나타내었다.
실시예 2 - 키메라 B-N10 항체의 제작
실시예 1에서 동정한 항체의 중쇄 및 경쇄의 가변부 서열을 재조합 항체 발현용 벡터 시스템에 클로닝하였다. 1차 단계로, 이 서열을 BS 리더에 클로닝하였고; N-말단에 분비 신호를 추가하고, C-말단에 스플라이스-도너 서열을 부가하였다. 2차 단계로, 이들 서열을 불변 인간 카파 체인과 불변 인간 감마-1 체인이 각각 포함된 발현 벡터들에 클로닝하였다. 경쇄용 벡터와 중쇄용 벡터를 준비한 다음, 인산칼슘 침강 또는 리포펙션에 의해 COS-7 세포에 일시적으로 공동-형질감염시켰다. 세포 배양 상층액을 2일 후 회수하였다. COS-7 세포에서 키메라 B-N10을 발현시키고, 상층액으로 항체 역가를 측정(샌드위치 ELISA)한 후, 인간 인터루킨 10(R&D Systems, Cat. No. 217-IL/CF, Lot ET114021, -20℃에 보관)에 대한 특이적인 결합력을 ELISA로 테스트하였다.
샌드위치 ELISA를 위해, 마우스 항-인간 카파 체인 항체(Becton Dickinson)를 포착 항체로서 플레이트 표면에 결합시킨 다음, 세포 배양 상층액과 함께 인큐베이션하였고, 키메라 항체의 존재를 POD-접합된 토끼 항-인간 IgG(H+L) 항체(Dianova)로 검출하였다. 지정된 농도(0.125 - 12 ㎍/mL)의 키메라 대조군 항체를 양성 대조군으로 사용하였다.
항원 ELISA를 위해, 인간 IL-10을 ml 당 0.5 - 5 ㎍의 농도로 플레이트 표면에 결합시켰다. 세포 배양 상층액(희석하지 않은 경우와 1:5로 희석한 경우)과 인큐베이션한 후, 키메라 B-N10의 결합을 POD-접합된 토끼 항-인간 IgG(H+L) 항체(Dianova)로 검출하였다. 뮤라인 B-N10을 양성 대조군으로 사용하였다. 항체는 mL 당 0.5 - 5 ㎍의 농도로 사용하였고, 결합성은 POD-접합된 토끼 항-마우스 IgG/IgM 항체 (Dako)로 검출하였다.
ELISA 결과는 실시예 3에서 논의한다.
실시예 3 - 항-IL-10 항체의 인간화
인간에서의 설치류 항체의 면역원성을 낮추기 위한 일차 시도로, 설치류의 것을 인간 불변 항체 도메인으로 치환하여 키메라 항체를 제작하는 과정을 수행하였다. 가변성 도메인내 설치류 프래임워크 영역들이 여전히 면역 반응을 유도할 수도 있기 때문에, 보다 진보된 CDR 그래프팅 방법을 개발하였으며, 즉 항원 결합 서열(상보성 결정부, CDR)를 전체 인간 항체 프래임워크로 전위시키는 방법(인간화)을 개발하였다. 통상적으로, 인간화 과정을 통해 본래의 항원 특이성과 친화성의 복원 가능성을 높이기 위해, 뮤라인 도너 항체와 가장 비슷한 인간 어셉터 프래임워크를 선택하였다. 공정 개선을 위해, 인간 항체 생식 세포계 서열, 발현된 항체의 컨센서스 서열을 이용한 여러가지 방법들, 항체/항원 복합체의 CDR 루프 구조 및 X선 구조 분석을 이용하거나 이들을 조합할 수도 있다. 통상적으로 여러가지 인간화된 항체 변이체를 이러한 방식으로 제작하고, 이후에 서로 그리고 오리지날 항체와 상이할 수도 있는 생물학적 효과에 대해 분석하였다. 마지막으로, 항체의 원하는 기능에 따라, 적합한 인간 불변부를 선택할 수도 있을 것이다.
3.1 B-N10의 뮤라인 가변 서열과 인간 서열 간의 서열 비교, 및 인간화된 VL (hVL) 및 VH (hVH)의 서열 세트 설계
뮤라인 항-IL10 항체인 B-N10을 선택하였다(Llorente et al., Eur. Cytokine Netw. 1993 Nov-Dec;4(6):421-7; 및 Llorente et al., Arthritis Rheum. 2000 Aug;43(8):1790-80). 인간화된 항체를 수득하는 방법은 상보성 결정부(CDR)를 인간 어셉터 영역에 융합시키는 CDR-그래프팅 공정을 토대로 한다.
인간 어셉터 프래임워크는 3가지 데이타 세트를 조합 분석한 결과를 기초로 선정하였다:
1. 체세포 돌연변이 위험성을 최소화하기 위해, 뮤라인 서열과 인간 생식 세포계 서열의 상동성
2. 특이 아미노산 잔기를 동정하기 위해, 뮤라인 서열과 인간 컨센서스 서열의 비교
3. 중요한 구조 프래임워크 아미노산 잔기에 대한 정보를 수득하기 위해, CDR 서열의 표준적인 구조(canonical structure) 클래스의 동정.
B-N10의 뮤라인 가변 경쇄는, 인간 생식 세포계 가변 세그먼트2-30*01 (A17 (서열번호 14)) 및 연결성 세그먼트 JK1 (서열번호 15)와 최대 상보성을 나타낸다. B-N10과 상동성이 가장 높은 인간 컨센서스 서열은 HuKII이다. 가변성 경쇄의 상보성 결정부(CDR)는 L1 - 클래스 4인 경우와, L2 - 클래스 1, L3 - 클래스 1인 경우로 분류할 수 있었다. 주요 아미노산 잔기들이 동정되었다.
클래스 4-1-1의 표준적인 구조를 가진, 마우스 CDR과 인간 생식세포계 VL 유전자 간의 서열 비교시, 2-30*01 (미스매치되는 아미노산의 수를 최소화함)에서 최대 상동성이 확인되었다.
B-N10의 뮤라인 가변 중쇄는, 인간 생식 세포계 가변성 세그먼트 VH3-33 및 연결성 세그먼트 JH4(서열번호 17)와 최대 상동성을 나타내었다. B-N10과 상동성이 가장 높은 인간 컨센서스 서열은 HuHIII이다. 가변성 중쇄의 상보성 결정부(CDR)는 H1 및 H2 - 클래스 1으로 분류할 수 있었다. 주요 아미노산 잔기들이 동정되었다. 클래스 101의 표준적인 구조를 가진, 마우스 CDR과 인간 생식 세포계 VH 서열간의 서열 비교를 통해, 2-30*01 (서열번호 16)(미스매치되는 아미노산의 수를 최소화함)에서 최대 상동성이 확인되었다. 따라서, 생식 세포계 서열 VH3-66도 고려 대상에 넣었다.
수득되는 모든 데이타들을 고려하여, 인간화된 가변성 경쇄(변이체 12종) 및 가변성 중쇄(변이체 29종)의 여러가지 가변성 서열 세트를 제작하였다.
3.2 소형 라이브러리 구축 및 인간화된 hIL-10 결합성 항체 단편의 선정
최적의 인간 IL-10 결합성 항체를 수득하기 위해, 잠재적인 hIL-10 결합 항체 단편들로 구성된 라이브러리를 제작하고자, 도 3에 나타낸 바와 같이 12개의 hVL와 29개의 hVH 단편을 코딩하는 cDNA 서열들을, 진핵 생물의 세포 코돈 이용성(codon usage)을 고려하여 제작하였다.
수득한 cDNA를 클러닝 벡터에 클로닝한 다음, SEQ Laboratories (Gottingen, Germany)에서 서열분석하였다. hVL 단편을 코딩하는 12종의 cDNA 각각을 hVH 단편을 코딩하는 29종의 cDNA와 조합하여, 잠재적으로 발현되는 항체 단편들 348종을 제작하는 방식으로, 라이브러리를 구축하였다.
박테리아에서 발현시킨 다음, 인간 IL-10(R&D Systems, Cat.-No. 217-IL/CF)로 2번의 선택 과정을 거친 후, 항체 단편들을 hIL-10(선택에서와 동일)에 대한 결합에 대해 ELISA로 분석하였다. 간략하게, Maxisorb 플레이트(Nunc, Germany)에 PBS 중의 1 ㎍/ml로 밤새 4℃에서 코팅하였다. 이 플레이트를 블럭킹한 다음 헹구고, 여기에 항체 단편을 생산하는 박테리아의 상층액을 첨가하였다. 결합된 인간화된 항체 단편을 검출하기 위해, POD 접합된 2차 항체를 사용하였다.
우수한 바인더들의 코딩 서열을 분석하고, 동정한 hVL-단편과 hVH-단편의 발생율을 기재하였다(표 2).
표 2: hIL-10에 결합하는 항체 단편에서의 VL 단편과 VH 단편의 존재율
가변성 중쇄 변이체 가변성 경쇄 변이체
hVH 변이체 발생 건수 hVL 변이체 발생 건수
hVH1 1 hVL1 2
hVH5 1 hVL2 1
hVH7 2 hVL3 1
hVH9 2 hVL5 1
hVH12 1 hVL6 3
hVH13 2 hVL7 4
hVH14 1 hVL8 18
(hVH16) 4 (hVL9) 4
hVH18 4 hVL10 1
hVH20 4 hVL11 1
hVH21 1 hVL12 2
hVH23 1
hVH26 9
hVH27 2
hVH28 3
hVH29 1
굵은 글씨체로 나타낸 서열들은, 완전한 항체에서의 결합 특성을 분석하기 위해, 적정 진핵 생물 발현 벡터에 서브클로닝하기 위한 용도로 선택하였다. 발현 벡터에 서브클로닝하기 위한 것으로 괄호 안 서열을 선택하였지만, 공정을 수행한 결과 결함이 있는 구조체들만 만들어졌다.
3.3 선택된 BT-063의 인간화된 경쇄 및 중쇄 변이체를 발현시키기 위한 발현 벡터의 제조
스크리닝 방법으로 확인된 결과를 기초로, BT-063의 인간화된 VL 및 인간화된 VH 변이체 세트를 벡터 시스템에 클로닝하기 위한 것으로 선택하였다. 1차 단계로, 인간화된 VL 변이체와 VH 변이체를 코딩하는 cDNA들을 적정 벡터으로 옮겨, 클로닝된 cDNA에 5'에 분비 신호를 코딩하는 서열과 3'에 스플라이스 도너 서열을 연결하였다. 이들 cDNA 구조체들을 2차 및 마지막 서브클로닝 단계에서 인간 불변 카파 및 인간 불변 감마-1 체인을 코딩하는 발현 벡터 각각에 삽입하였다. 독립적으로 수득한 hVL 함유 발현 벡터와 hVH 함유 발현 벡터인 플라스미드들을 내독소-결핍성 Qiagen Midi-prep 키트 (Qiagen, Germany)를 이용하여 준비하였다.
3.4 COS-7 세포에서의 선별된 인간화된 BT-063 변이체의 일시적인 발현 및 hIL-10에 대한 항체 결합성 비교
인간화된 항체 변이체들을 COS-7 세포에서 일시적으로 발현시키기 위해, 선택한 인간화된 VL 변이체들(hVL7 및 hVL8)을 선택한 인간화된 VH 변이체들(hVH1, hVH9, hVH13, hVH18, hVH20, hVH26, hVH28) 각각과 조합하여, 14종의 인간화된 항체를 제작하였다.
간략하게는, 경쇄를 코딩하는 발현 벡터와 중쇄를 코딩하는 발현 벡터를, 인산칼슘 침강에 의해 24웰 포맷에서 10% FCS가 함유된 DMEM 중에 COS-7 세포에 일시적으로 공동-감염시켰다. 형질감염 후, 배지를 무혈청 배지 CHO-S-SFM II (Invitrogen, Germany)로 교체하고, COS-7 세포의 상층액을 형질감염 후 2-3일간 수집하였다. 형질감염된 COS-7 세포의 상층액으로 분비된 인간화된 항체의 항체 역가를 샌드위치 ELISA로 분석하였다. 측정된 항체 농도를 기준으로, 모든 샘플의 상층액들을 동일 항체 농도로 조정하고, 모든 샘플에 대해 PBS 중의 2 ㎍/ml hIL-10으로 코팅된 Maxisorb 플레이트 (Nunc, Germany)에서 항원 ELISA로 인간 IL-10에 대한 결합성을 분석하였다.
도 4에 나타낸 바와 같이, 분석한 변이체들 모두 hIL-10에 결합하였지만, 결합 특성은 달랐다. 항원 ELISA에서 최고 신호는 BT-063 변이인 hVH20/hVL7, hVH26/hVL7 및 hVH20/hVL8에서 관찰되었고, 신호 세기가 키메라 B-N10 항체에서 수득되는 세기와 비슷하였다. 이들 3종의 항체들에서, 신호 세기의 편차는 샌드위치 ELISA로 정량한 결과로서 다양한 항체 농도가 원인일 수 있다(강한 신호: hVH20/hVL8, 낮은 신호: hVH20/hVL7 및 hVH26/hVL7)(상기 참조). 그외 테스트한 변이체들 모두 키메라 B-N10 항체에 비해 비교적 약한 신호를 표시하였다.
3.5 키메라 및 인간화된 항체 변이체들의 제조 및 친화성을 이용한 정제
선택한 인간화된 BT-063 변이체 (hVH20/hVL7, hVH20/hVL8, hVH26/hVL7)와 키메라 cB-N10 (실시예 2에서 논의됨)을 COS-7 세포에서 생산하였다.
섹션 3.4에 기술된 바와 같이 일시적인 발현을 수행하였고, 이때 10 cm 조직 플레이트를 사용하였다. 형질감염 후 5일간 각 변이체에서 무혈청 상층액 약 0.5 L를 수집하였다.
항체의 정제는 무혈청 상층액을 단백질 A 친화성 크로마토그래피로 정제하여 실시하였다. 상층액을 2 M NaCl의 존재 하에 주입하였다. 항체를 0.1 M 사이트레이트 완충액 pH 4.0으로 용출시키고, 2M 포스페이트 완충액 pH 7.2이 든 튜브로 분획들을 수집하였다. PBS에 대한 완충액 교체 및 개별 항체 프로브의 농축을 30 kDa 컷-오프 막을 이용한 원심분리에 의해 수행하였다. 정제된 물질의 품질을 항원 ELISA, 비환원 및 환원 조건에서의 SDS-PAGE 및 260nm 및 280nm에서의 UV 측정에 의해 체크하였다.
정제된 키메라 B-N10과 인간화된 변이체의 hIL-10에 대한 결합성을 실시예 2에 기술된 방법에 따라 ELISA로 테스트하였다. hIL10을 코팅하고, 항체의 결합성을 변이체 cB-N10, BT-063-1 (hVH20/hVL7), BT-063-2 (hVH20/hVL8) 및 BT-063-3 (hVH26/hVL7)을 대상으로 측정하였다. 결과는 도 5에 도시한다.
신호 세기는 키메라 B-N10과 hVH20/hVL7 변이체가 비슷하였고, 변이체 hVH20/hVL8와 hVH26/hVL7은 신호 세기가 다소 낮았다.
3.6 Biacore 인간 IL-10를 이용한 친화성 결정
표면 플라스몬 공명 분석을 이용하여, 여러가지 항체들(뮤라인, 키메라, 인간화된 변이체 3종)의 hIL-10에 대한 결합의 조합 속도 상수 및 해리 속도 상수를 BIACORE 2000 (Biacore AB, Uppsala, Sweden)을 이용하여 측정하였다. hIL-10을 제조사의 조건에 따라 CM-5 센서 칩에 고정시켰다. 유속 5 ㎕/분으로 20 ㎍/ml의 분액 50 ㎕을 첨가하여 hIL-10을 320RU의 고정 밀도로 고정시켰다. 고정된 hIL-10 표면을, 0.1M 카보네이트 완충액 pH 9.2와 0.01 M HCL/ 1M NaCl을 유속 50 ㎕/분으로 각각 1분간 사용하는 2단계 사이클로 재생시켰다. 각 항체 샘플을 항체 농도 범위 20 - 0.15 ㎍/ml에서 4회 이상 분석하였다. BIA 평가 버전 3 (1999) 소프트웨어를 이용하여, 센소그램으로부터 계산하였다.
표 3은 Biacore 측정 결과를 모두 나타낸 것이다. 변이체들 모두 hIL-10에 비슷한 수준으로 결합하였다. 그러나, 약간의 차이도 검출되었다. 그 결과, 마우스 단일클론 항체 B-N10, 키메라 cB-N10 및 인간화된 변이체 BT-063-1 (hVH20/hVL7)은 비슷한 친화성으로 결합하는데 반해, 다른 2종의 인간화된 변이체 BT-063-2 (hVH20/hVL8)와 BT-063-3 (hVH26/hVL7)는 친화성 감소를 나타내었다(뮤라인 B-N10과 비교하여 약 3배). 또한, 해리 속도와 조합 속도에서도 약간의 차이를 검출할 수 있었다.
표 3: Biacore 측정 결과
n = 각 측정의 수; ka = 조합 속도;
kd = 해리 속도; KD = 해리 상수
항체 변이체 n ka [1/Ms] kd [1/s] KD [M] ± SD
B-N10 6 4.43 E6 2.05 E-3 1.07 E-9 ± 3.11 E-10
cB-N10 4 6.23 E5 8.48 E-4 1.37 E-9 ± 2.42 E-10
BT-063-1 6 1.21 E6 1.03 E-3 1.22 E-9 ± 1.44 E-10
BT-063-2 4 1.21 E6 1.64 E-3 2.81 E-9 ± 1.03 E-9
BT-063-3 5 1.07 E6 2.66 E-3 2.91 E-9 ± 8.07 E-10
사이노콜거스(cynomolgus) IL-10
BT-63 변이체 3 (hVH26/hVL7)의 사이노몰거스 IL-10에 대한 친화성을 Biacore T100 (Biacore AB, Uppsala, Sweden)을 이용한 추가적인 표면 플라스몬 공명 실험으로 분석하였다.
BT-063를 10 mM 아세테이트 pH5.5에 5 ㎍/mL로 희석하고, 아민 커플링 공정을 이용하여 최종 수준 약 1000 RU이 되도록 고정시켰다. 10 mM 글리신-HCl pH 1.8을 30초간 주입하여, 센서 칩 표면을 재생시켰다. 샘플을 플로우 셀 뿐만 아니라 기준 셀로 여러가지 농도로 주입하였다. 기준 셀에서 수득되는 신호를 검출기 플로우 셀에서 수득되는 신호에서 제하고, 수득되는 결합 프로파일을 1:1 Langmuir-binding 모델을 이용하여 평가하였다. 농도 의존적인 결합 프로파일을 수득하였고, 사이노몰거스 IL-10의 평균 KD는 194 pM으로 계산되었다. 양성 대조군으로 rhIL-10을 분석하였고, 그 결과 KD는 4.6 nM이었다. 이 결과는 표 4에 요약 개시한다.
표 4: BT-063의 Biacore 측정 결과
rhIL-10: 재조합 인간 IL-10; rCIL-10: 재조합 사이노몰거스 IL-10;
ka = 조합 속도; kd = 해리 속도; KD = 해리 상수
분석물 분석 번호 ka [1/Ms] kd [1/s] KD [M]
rhIL-10 1 6.0 E5 0.3 E-2 4.6 E-9
rCIL-10 1 6.2 E7 1.2 E-2 0.196 E-9
rCIL-10 2 8.6 E7 1.7 E-2 0.195 E-9
rCIL-10 3 9.7 E7 1.8 E-2 0.191 E-9
실시예 4 - 항-IL-10 항체의 시험관내 활성
BT-063 (변이체 hVH26/hVL7)의 효능을 검증하기 위해, 말초 혈액 단핵구 세포(PBMC)에서의 IL-6 분비 차단을 평가하였다. PBMC는 리포폴리사카라이드(LPS)로 자극받아 인터루킨-6(IL-6)를 분비한다. 인터루킨-10(IL-10)의 생리 활성은 사이토카인, 예컨대 IL-6의 분비 저해이다. 즉, IL-10을 LPS로 자극한 세포에 첨가하면 IL-6 분비가 저해되며, 세포 배양물의 배지에 존재하는 IL-6이 현저히 감소되게 된다. 그러나, 세포 배양물에 BT-063을 첨가하면, IL-10이 결합되므로, 따라서 세포 표면에 있는 수용체에 결합할 수 없게 된다. 따라서, IL-10의 저해 효과는 상쇄되고, Il-6의 분비가 회복되어, 배지로 IL-6가 분비된다.
PBMC를 피콜 구배에 의해 인간 혈액으로부터 분리하였다. 분리한 세포를 1x106 세포/ml로 접종하고, IL-10의 첨가에 의해 저해되는 IL-6의 분비 유도를 위해, LPS로 자극하였다. IL-10의 저해 효과는 BT-063의 첨가에 의해 중화되었고, 따라서 IL-6 분비가 다시 이루어졌다. 첨가하는 BT-063의 유형에 따라(기준, 저품질, 고품질의 대조군 샘플), BT-063을 여러가지 타이트레이션 농도로 사용하여, 농도 의존적인 IL-6의 분비를 유도하였으며, 이는 세포 배양물의 상층액에서 검출하였다.
표 5: 기준 표준 물질의 타이트레이션에 따른, IL-6의 2회 측정의 평균값과 IL-6 재분비율
S1: 40 ㎍/mL
BT-063의 농도(㎍/mL) IL-6의 평균 수준[pg/mL] IL-6 재분비율[%)
40,000 42546 72,8%
20,000 43134 73,8%
13,333 37910 64,9%
8,889 31107 53,2%
5,926 25602 43,8%
3,951 20793 35,6%
1,975 14200 24,3%
0,988 10227 17,5%
표 5에 나타낸 바와 같이, IL-6의 분비량은 BT-063의 농도와 직접적인 연관성을 나타낸다. BT-063의 농도가 높을 수록 IL-6은 PBMC에서 더 많이 분비되며, 즉 상층액에 더 많이 존재하게 된다. 세포를 40 ㎍/mL의 BT-063와 인큐베이션하면, 양성 대조군(IL-10과 인큐베이션하지 않고, 자극시킨 PBMC)과 비교하여, IL-6의 재분비율은 약 73%이었고, 0.988 ㎍/mL의 BT-063 (타이트레이션의 최종 단계)에서는 IL-6은 겨우 17.5%로 배지에서 검출되었다.
실시예 5- 인간 PBMC에 대한 항체 결합성
인간 말초 혈액 단핵구 세포(PBMC)를 농도 구배 원심분리를 이용하여 건강한 여러명의 자원자로부터 신선하게 준비하였다. 이를 위해, 혈액 샘플을 한스 완충 용액에 1:1로 희석하고, 50 ml의 멸균한 시험관에서, 피콜 20 ml을 용액 20 ml 위에 천천히 적층하였다. 이 시험관을 실온에서 1200 xg로 25분간 연속 원심분리하였다. 원심분리 후, 뿌연 인터페이스 또는 엷은 황갈색의 막을 50 ml 시험관으로 옮기고, PBS로 헹군 다음 10분간 260 g로 다시 원심분리하였다. 잔류하는 적혈구는 BD Pharm Lyse™을 제조사의 프로토콜에 따라 처리하여 용혈시켰다. 분리된 PBMC를 RPMI (10% FCS)에 재현탁하였다.
인간 PBMC에 대한 BT-063 (변이체 hVH26/hVL7)의 결합을 Zenon 표지 키트 (Invitrogen)를 이용하여 FACS 분석으로 측정하였다. 항-인간 IgG AlexaFluor488-Zenon 키트를 제조사의 설명서에 따라 사용하여 항체를 표지하였다. 키트의 시약으로 BT-063에 Fab-단편을 형광 표지하는 결합을 이용하여 이의 항원 인지 특성에는 영향을 미치지 않으면서 표지하였다. Zenon 키트로 동일하게 표지한 인간 IgG1 항-CD4 항체 (BT061, Biotest)를 양성 대조군으로 사용하였다.
플루오레센트 Fab-단편을 과량으로 항체와 함께 인큐베이션하여 mAb의 Fc 부분에 결합시켰다. 나머지 비결합 Fab-단편들은 관련없는 IgG와 2차 반응시켜 차단시킴으로써, 위양성 결합을 억제시켰다. 형광 표지된 BT-063 또는 BT061을 포함하는 혼합물을 염색 실험에 사용하였다. 음성 대조군은 항체없이 반응을 수행하였다.
일차 항체 1 ㎍ (BT-063, 음성 대조군: α-CD4 또는 PBS)을 5 ㎕의 Zenon-AF488 시약 (AF-488로 표지된 항-인간 IgG Fab 단편)으로 5분간 총 부피 6 ㎕로 표지하였다. 그런 후, 차단제(관련성 없는 인간 IgG) 5 ㎕와 20분간 인큐베이션하였다. 전체 혼합물을 PBS로 희석하여, 적정 항체 농도로 만들고, 세포 염색을 바로 수행하였다.
실험 결과는 도 6에 나타낸다. 표지된 BT-063는 25, 2.5, 0.25 및 0.025 ㎍/ml의 농도로 사용하였으며, 인간 PBMC과의 결합은 관찰되지 않았다. 항-CD4 항체를 이용한 경우, 인간 PBMC과의 예상된 결합이 검출되었지만, BT-063는 농도 최대 25 ㎍/ml에서도 림프구 또는 단핵구에 대한 어떠한 결합도 관찰되지 않았다. 따라서, BT-063는, 인간 오리진의 말초 혈액 단핵구 세포에 대해 검출가능한 수준의 교차-반응성이 없는 것으로 결론내릴 수 있었다.
이러한 결과들은, BT-063 항체가 PBMC에 결합하지 않으며, 따라서 BT-063은 가용성 IL-10에만 결합한다는 것을 입증해준다.
실시예 6 - X선 결정학
6.1 인간 IL-10과 복합체를 이룬 BT-063 Fab의 결정화
몇가지 IL-10 구조체들을 공개된 구조 데이타에 따라 설계하고 (Zdanov et al., Structure, Vol.3, 1995, pp.591), E. coli에서의 이종 발현용 벡터에서 표준 방법에 따라 클로닝하였다. 클로닝한 구조체들의 테스트 발현을 표준 방법에 따라 수행하였고, 예상 범위 약 18 kDa에서 밴드 크기 증가로 IL-10의 상당한 과다 발현을 확인하였다.
최적화된 조건에서 발현시킨 IL-10 단백질은 이후의 단백질 정제를 실행할 수 있는 정도의 양으로 회수되었다. 이를 다시 폴딩시킨 후, 고정화된 친화성 크로마토그래피, 크기 배제 크로마토그래피 및 이온 교환 크로마토그래피로 정제하여, 코마시 염색한 SDS-PAGE로 판단하였을 때 95% 이상의 상동성을 가진 단백질을 회수하였다. 정제된 단백질의 회수율은 발현 배양물 1 L 당 약 0.3 mg이었으며, 이는 결정화 실험에 충분한 양이었다.
프로테아제 파파인을 이용하여 온전한 항체로부터 BT-063 (변이체 hVH26/hVL7)의 Fab 단편을 잘라낸 다음 단백질 A로 정제하였다. 그 후, Fab 단편을 크기 배제 크로마토그래피로 다시 정제하였다.
정제한 단백질을 몰 과량의 IL-10과 혼합한 다음 크기 배제 크로마토그래피로 정제하여, IL-10:BT-063 Fab 복합체를 수득하였다. 체류 체적(retention volume)은 복합체의 크기와 일치하였다. 단백질을 결정화에 적합한 농도로 농축하였다.
IL-10:BT-063 Fab 복합체의 결정을, 공동-결정화 방법으로 제조하였다.
6.2 데이타 수집과 프로세싱
결정을 급속-냉각시키고, 온도 100 K에서 측정하였다. X선 회절 데이타는, IL-10과 BT-063의 Fab 단편의 공동-결정으로부터, 저온 조건에서 SWISS LIGHT SOURCE (SLS, Villigen, Switzerland)에서 수집하였다.
결정은 2개의 복합체가 비대칭적인 단위로 존재하는 공간군 P6에 속하였다. 데이타를 프로그램 XDS와 XSCALE로 처리하였다. 데이타 수집 결과는 표 6에 요약 개시한다.
표 6. 데이타 수집 및 가공 결과
복합체 IL-10:BT-063
X선 소스 PX(SLS1)
파장 [Å] 1.0007
검출기 PILATUS
온도 [K] 100
공간군 P 6
셀: a; b; c [Å]
α; β; γ [°]		 219.00; 219.00; 64.36
90.0; 90.0; 120.0
해상도[Å]2 3.48 (3.72-3.48)
고유 반사2 21124 (3817)
멀티플리시티2 3.0 (2.9)
완결도[%]2 91.2 (92.3)
Rsym[%]2,3 10.5 (44.0)
Rmeas[%]2,4 14.8 (62.2)
I/σI2 6.1 (1.7)
평균(I)/시그마2,5 7.0 (1.7)
1 SWISS LIGHT SOURCE(SLS, Villigenm Switzerland)
2 괄호안 번호는 최대 해상도 Bin임
3
Figure 112012051896635-pct00001
Figure 112012051896635-pct00002
I h,i 는 h의 i번째 측정의 세기 값
4
Figure 112012051896635-pct00003
Figure 112012051896635-pct00004
I h,i 는 h의 i번째 측정의 세기 값
5 개별 반사로부터 계산됨
6.3 구조모델링 및 정밀화
구조를 결정하고 분석하는데 필수적인 위상 정보를 분자 치환을 통해 입수하였다. IL-10과 Fab 단편의 공개 모델을 연구 모델로 사용하였다. 이후 모델 구축 및 정밀화를 소프트웨어 패키지 CCP4 및 COOT를 이용하여 표준 프로토콜에 따라 수행하였다. 최종 모델의 정확성을 교차-검증하기 위한 측정치인 프리 R-팩터를 계산하기 위해, 측정된 반사율 4.2%는 정밀화 과정에서 제외시켰다(표 7 참조).
나노바디(nanobody) 파라미터 측정을 프로그램 CHEMSKETCH으로 수행하였다. 대응되는 라이브러리 파일 작성을 위해 LIBCHECK (CCP4)를 사용하였다.
3.0σ 등고선의 Fo-Fc 맵의 피크들에 물 분자를 대입한 다음, REFMACS로 정밀화하고, 모든 물 분자를 COOT의 검증 툴로 체크함으로써, 물 모델을 COOT의 "물 발견,,,"-알고리즘으로 구축하였다. 추정의 물 분자 리스트에 대한 기준은, B-팩터 80 이상, 2Fo-Fc 맵 1.2 σ 미만, 가장 가까운 거리 2.3　Å 미만 또는 3.5　Å 이상이다. 추정의 물 분자와 활성 부위(저해까지의 거리 10　Å 미만)내 물 분자를 수동으로 체크하였다. Fo-Fc 맵 (-3.0 σ의 등고선 표시됨)에서의 네거티브 피크인 측쇄의 점유(occupancy)는 0으로 설정되었고, 다음 정밀화 사이클을 수행한 후 파지티브 피크가 나타나면 다음으로 0.5로 설정되었다.
최종 모델의 라마찬드란 플롯에서, 가장 우호적인 영역에 전체 잔기의 80.8%가, 부가적으로 허용되는 영역에 17.9%가, 관대 허용 영역에 0.7%가 속하는 것으로 나타난다. 잔기 Val86(A), His14(B), Asp86(B), Ser131(C), Val56(D)과 Val56(F)은 라마찬드란 플롯의 비허용 영역에서 확인되었다(표 7). 이는 전자 밀도 맵으로 검증하였고, 다른 합리적인 입체 배좌로는 모델링할 수 없다. 최종 구조 및 정밀화 과정의 통계치들을 표 7에 기재한다.
표 7. 정밀화 통계치1
복합체 IL-10:BT-063
해상도 [Å] 20.0-3.48
반사 횟수(작동/테스트) 20199 / 889
Rcryst [%] 29.7
Rfree 2 [%] 35.5
원자의 총 수:
단백질
물
리간드		 　
8870

-
이상적인 기하구조와의 편차3
결합 길이 [Å]
결합 각도 [°]
결합된 B's 4 [Å2]		 　
0.007
0.93
0.0
라마찬드란 플롯: 5
최우선 영역
부가적인 허용 영역
관대한 허용 영역
비허용 영역		 　
80.8
17.9
0.7
0.6
1 시그마 컷-오프 없이 REFMAC5에서 정의된 값
2 테스트-세트는 측정된 반사율 4.2 %를 포함함
3 기하 목표값으로부터의 평균평방근 편차(Root mean square deviation)
4 프로그램 MOLEMAN으로 계산함
5 프로그램 PROCHECK으로 계산됨
6.4 X선 구조 분석
BT-063 Fab 항체 단편이 결합된 인간 IL-10의 복합체 구조를 해상도 3.48 Å에서 분석하여, Fab 항체 단편의 구체적인 결합 방식을 확인하였다.
수득되는 전자 밀도는, Fab 단편의 배향 및 입체 배좌 등의 Fab 단편에 대한 명확한 결합 모드를 보여준다. 공간군 P6의 결정에는 2개의 복합체가 비대칭적인 단위로 포함되어 있다.
Fab와 복합체를 이룬 IL-10의 구조를 도 7에 나타낸다. 2개의 Fab 단편은 이의 CDR 루프를 이용하여 각 IL-10 동형이량체와 결합한다.
CDR 루프 주변, 최대 거리 3.9 Å 이내에서 다음과 같은 IL-10(A 분자 및 B 분자) 잔기들을 확인할 수 있다: Arg27, Lys 34, Gln38, Met39, Asp41, Gln42, Asp44, Leu46, Glu50, Leu53, Glu142, Asp144, Ile145, Asn148, Tyr149, Glu151, 및 Thr155.
IL-10 주위 최대 거리 3.9 Å 이내에서 다음과 같은 CDR 루프 잔기들을 확인할 수 있다: Phe27, Ser28, Ala30, Thr31, Tyr32, Trp52, Arg53, Gly54, Ser56, Asn73, Ser74, Tyr100, Gly101, Tyr103 (분자 C 및 분자 E), Ser32, Asn33, Asn35, Tyr37, Lys55 (분자 D 및 분자 F).
BT-063의 결합 부위는, IL-10:BT-063의 복합체 구조를 공개된 IL-10:IL-10R1 수용체 복합체의 구조와 겹쳐 확인된 바와 같이, IL-10의 표면에 있는 IL-10 수용체의 결합 부위와 일치한다(도 8).
X선 분석으로 동정한, 인간 IL-10과 접촉하는 BT-063 아미노산 잔기들을, 아래 나타낸 BT-063 가변 항체의 선형 아미노산 서열에 강조 표시한다.
BT-063 VL:
DVVMTQSPLS LPVTLGQPAS ISCRSSQNIV H SN G N T Y LEW YLQRPGQSPR
LLIY K VSNRF SGVPDRFSGS GSGTDFTLKI SRVEAEDVGV YYCFQGSHVP
WTFGQGTKVE IK (서열번호 69)
BT-063 VH:
EVQLVESGGG LVQPGGSLRL SCAASG FS F A TY GVHWVRQS PGKGLEWLGV
I WRG G S TDYS AAFMSRLTIS KDNSKNTVYL QMNSLRAEDT AVYFCAKQA Y
G H Y MDYWGQG TSVTVSS (서열번호 70)
CDR 영역들 (Honegger and Pluckthun (2001) J. Mol. Biol., 309, 657-670)은 밑줄로 표시된 부분이다 (경쇄의 CDR1, CDR2 및 CDR3는 각각 서열번호 71, 72 및 73임; 중쇄의 CDR1, CDR2 및 CDR3는 각각 서열번호 74, 75 및 76임). IL-10과 접촉하는 잔기들은 굵은 글씨체로 표시된다.
경쇄에서는 접촉 잔기들이 CDR1과 CDR2에서 확인되고 CDR3에서는 확인되지 않는다. 중쇄의 경우 3가지 CDR들 모두 항원 결합에 참여한다. 또한, FR3의 잔기 2개 (Asn73 및 Ser74)도 항원 결합에 기여한다.
CDR1 시작부의 Ser28과 Ala30은 뮤라인 VH 선조(predecessor) 서열(BN-10)의 일부이며, 선택된 인간 프래임워크(3-66*04)에는 존재하지 않는다. 이들 위치 모두 항원 결합에 거의 참여하지 않으며, 인간화 과정 중에 대체 아미노산으로서 도입된 것이다.
잔기 Asn73과 Ser74는 뮤라인에서 확인되는 것으로, 종종 인간 항체 프래임워크 서열들에서도 확인되지만, 항원 결합에는 통상 참여하지 않는다 (www.bioc.uzh.ch/antibody; Honegger and Pluckthun, 2001). 이들 서열이 항원 결합에 참여하는 것은 예기치 못한 일이다.
BT-063과의 결합에 관여하는 IL-10 아미노산 잔기들을 아래에 나타낸다. 아울러, 고친화성 IL-10 수용체 체인 (IL-10R1)과 저친화성 수용체 체인 (IL-10R2)과의 결합에 참여하는 IL-10의 잔기들도 표시한다. 이들 수용체 체인들 둘다 IL-10 동형이량체와의 결합에 관여하며, 신호전달에 필수적이다. 서열 A에서, BT-063과 접촉하는 잔기는 굵은 글씨와 밑줄로 표시된다. 서열 B에서, IL-10R1에 대한 접촉 잔기는 굵은 글씨와 밑줄로 표시되며, IL-10R2에 접촉하는 잔기는 이탤릭체와 밑줄로 표시되며, IL-10R1와 IL-10R2에서 공유되는 접촉 잔기는 굵은 글씨체, 이탤릭체 및 밑줄로 표시된다(Pletnev et al 2005).
A
SPGQGTQSEN SCTHFPGNLP NMLRDL R DAF SRV K TFF QM K DQ L D N L LLK E
SL L EDFKGYL GCQALSEMIQ FYLEEVMPQA ENQDPDIKAH VNSLGENLKT
LRLRLRRCHR FLPCENKSKA VEQVKNAFNK LQEKGIYKAM S E F DI FI NY I
E AYM T MKIRN (서열번호 1)
B
SPGQGTQSEN SCTHF P G N L P N ML R DL R D AF S R VKTFF Q MK D Q LDNLLLKE
SLLEDFKGYL GCQALSEMIQ FYLEEVMPQA E NQDPDIK AH V N SLGENLKT
LRLRLRRCHR FLPCENKSKA VEQVKNAFNK LQEKGIY K AM S EF D IFINYI
E AYMTMK I RN (서열번호 1)
하나의 IL-10 단량체의 연결 루프 서열(Glu42, Asp44, Leu46)을 비롯하여 나선 A의 잔기(Arg27, Lys34, Gln38, Met39, Asp41)와 나선 B의 N-말단부 (Glu50 및 Leu53), 및 제2 IL-10 단량체의 나선 F'의 잔기(Glu142, Asp144, Ile145, Asn148, Tyr149, Glu151, Thr155)로 구성된, IL-10의 불연속 에피토프에 BT-063이 결합한다는 것을 알 수 있다.
이와 같이, BT-063이 고친화성 수용체 체인 IL-10R1의 결합 부위를 차단한다는 것을 알 수 있다.
실시예 7 - 사이노몰거스 원숭이에서의 생체내 1회 투여 독성 연구
안전성 약학 파라미터를 비롯하여 1회 투여 독성 실험을 BT-063 (변이체 hVH26/hVL7)을 1회 정맥내 주사한 사이노몰거스 원숭이를 대상으로 수행하였다. 동물을 4 동물/성별/그룹으로 4개의 그룹(위약, 1 mg/kg, 7 mg/kg 및 50 mg/kg)으로 나누었다. BT-063을 1일에 정맥내 주사하였다. 5일 후 동물의 절반을 검시하고, 나머지 동물은 28일에 희생시켰다.
본 실험에서 1 mg/kg의 저용량 수준은 인간에서의 ~300 ㎍/kg 용량에 해당되는 것으로, 총 인간 용량 18 mg(체중 60 kg)에 해당된다. 소규모의 연구자 주도 임상 연구로, BT-063 선조 항체 B-N10을 유사 용량으로 21일 동안 매일 투여하였다(Llorente, 2000). 이러한 항체 용량에서의 약리학적 효과와 임상 효능은 검증된 것이다. 따라서, 저용량을 그에 따라 선정하였다. 고용량은 출발 용량의 배수(50)로 선정하였다. 중간 수준의 용량은 저용량과 고용량의 기하 평균이다.
실험을 수행하는 동안, 독물학적인 유의성이나 생리학적 또는 조직병리학적 파라미터와 관련된 변화는 관찰되지 않았다. 또한, 임상적인 화학 파라미터의 변화도 독물학적 유의성이 거의 또는 전혀 없는 것으로 간주되었다.
실시예 8 - 정맥내 투여 후 IL-10 특이적인 BT-063 항체에 의한 타겟 점유 예측
건강한 인간 자원자들에서 IL-10의 중화를 평가하기 위해, mAb BT-063을 정맥내 1회 주사한 후, BT-063-IL-10 복합체의 해리 상수 및 인간 혈액 체적에 대한 표준 파라미터와, BT-063이 혈류내에서만 분포된다는 가정을 토대로, 건강한 자원자에서 BT-063 (변이체 hVH26/hVL7)에 의한 IL-10의 타겟 점유를 추산하였다.
8.1 방법
Unvalidate Microsoft-Excel-Software를 이용하여, BT063에 의한 IL-10의 용량 의존적인 타겟 점유를 계산하여 표시한다.
계산을 위한 가정:
- 혈액 부피(혈청): 3.5 L
- 건강한 자원자 혈청내 IL-10의 평균 농도: 15 pg/ml
- kD (해리 상수, BT063<->IL-10): 3 nM (Biacore 연구로 구함)
- IL-10 이량체의 분자량: 37 000 g/mol
- BT063의 분자량: 150 000 g/mol
질량 작용의 법칙을 이용하여, 여러가지 용량의 BT-063 항체에 대해 IL-10의 타겟 점유를 계산하였다. 유리형과 복합체형 IL-10의 이론적 계산에서는, 항-IL-10 항체 분자 1개가 IL-10 이량체 1개에 결합한다고 가정하였다. 아래 평형 등식을 적용하였다:
질량 작용의 법칙: BT063 + IL10 ↔ BT063/IL-10 복합체
수득되는 해리 상수는, BT063 ([BT063]), IL-10 ([IL-10]) 및 BT063-IL-10 복합체 ([복합체])의 정상 상태 농도(steady state concentration)에 의해 결정한다:
Figure 112012051896635-pct00005
정상 상태 농도는 직접 이용할 수 없지만, 출발 농도 [BT0630] 및 [IL-100]와, 복합체의 정상 상태 농도 ([complex])로부터 계산할 수 있다:
[BT063] = [BT0630] - [복합체]
[IL-10] = [IL-100] - [복합체]
mAb를 정맥내 주사한 후, BT-063에 의한 IL-10 점유율을 계산하기 위해, 하기와 같이 가정하였다:
- BT063은 주사 직후 혈액에 균일하게 분포하며 혈액에만 존재한다.
- BT063 분자는 혈액 체적에서 나가지 않는다.
- IL-10은 혈액에만 분포하며, IL-10의 다른 소스는 없다.
- IL-10 분자 또는 BT063-IL-10 복합체는 혈류에서 나가지 않으며, Fc-수용체 매개 또는 다른 기전에 의해 순환계로부터 이탈되지 않는다.
- 빠르게 평형 상태에 도달한다.
이러한 가정들은 인위적으로 선정한 것이며, 생체내 있을 법한 생물학적 해당 상황을 의미하는 것은 아니다. BT063 대부분은 체내 혈관외 구획들로도 또한 분포되어 순환계에서 mAb의 농도가 신속하게 낮아질 가능성이 있기 때문에, BT063 분배 체적(distribution volume)이 추산한 것 보다 더 크다고 볼 수 있다. 나아가, IL-10에 대한 혈관외 소스가 존재하며, 체내 존재하는 IL-10의 양이 상기에서 추정한 것 보다 많을 것으로 예상할 수 있다.
결론적으로, 본원에서 행한 계산은 생체내 복합체를 이룬 IL-10의 퍼센트를 과다 계산하였다. 따라서, 생체내에서는 추정한 IL-10의 복합화 수준에 도달하지 못할 것이며, 계산된 수치에 대한 안전역(safety margin)이 존재할 것이다.
계산의 토대로서, 아래 상수를 사용하였다:
- 분자량 (BT063): 150 000 g/mol
- 분자량 (IL-10 이량체): 37 000 g/mol
- 건강한 자원자의 혈청내 IL-10의 평균 농도: 15 pg/ml
- 혈액 혈청 부피: 3.5 L
이를 토대로, 평형 농도에서 BT063과 복합체를 이룬 IL-10의 용량 의존적인 복합화율을 산출할 수 있다. 표 8과 도 10에 mAb를 정맥내 주사한 후 BT063에 의한 IL-10의 용량 의존적인 차단성을 나타낸다.
표 8: 정맥내 주사된 BT-063의 총 용량 증가에 따른 BT-063에 의한 IL-10 점유율 계산. (* 임상 실험에서 건강한 자원자에게 투여하고자 하는 용량은 회색 음영으로 표시됨)
BT063 총 용량 (㎍) BT063과의 복합체를 이룬 IL-10의 비율 %
1.75 0.1
5.25 0.3
16 1.0
47 2.9
142 8.3
175* 10.0
425 21.3
750* 32.3
1,276 44.7
3,827 70.8
3,500* 69.0
7,500* 82.6
11,482 87.9
15,000* 90.5
30,000* 95.0
34,445 95.6
60,000* 97.4
100,000* 98.5
103,336 98.5
310,007 99.5
930,022 99.8
2,790,065 99.9
IL-10의 여러 농도 또는 IL-10에 대한 BT-063의 다양한 친화성(해리 상수)의 영향을 이론적으로 추정하기 위해, 해당 곡선들을 도 10에 도시된 오리지날 용량-반응 의존 곡선과 비교하였다.
도 11은 복합체를 형성한 IL-10의 비율이 혈액내 IL-10의 양과는 대부분 독립적임을 나타낸다. IL-10 수준을 1000배 변화시켰을 때에도 용량-반응 곡선에 대한 영향은 매우 경미한 수준이었다. 따라서, IL-10의 농도 변동은 BT-063에 의한 IL-10의 점유율에 변화를 유도하지 못한다.
인간 IL-10에 대한 BT-063의 친화성은 Biacore 실험들에서 알려졌지만, 다른 방법들에서는 복합체에 대한 약간 다른 해리 상수가 구해졌다 (Waibler et al., J Allergy Clin Immunol., 2008 Nov; 122(5): 890-2, Epub 2008, Sep 20). 이에, 다양한 친화성 수준에 따른, IL-10에 대한 용량-반응 점유율의 변화를 분석하였다.
IL-10 수준을 변수로 하였을 때와는 대조적으로, IL-10에 대한 친화성이 다양한 BT-063을 사용하였을 때에는, 고친화성(10배 이상)인 경우 BT-063의 점유율이 높은 쪽으로, 저친화성인 경우에는 반대로 곡선이 이동하였다(도 12).
이러한 데이타로부터, 175 ㎍ BT-063 (인간 임상 실험에서 일차 건강한 자원자에게 출발 용량으로 계획한 용량)이 건강한 자원자의 혈액내 존재하는 총 IL-10의 약 10%를 중화시킬 수 있는 것으로 판단할 수 있었다. BT-063 용량 10 mg까지는, BT-063의 용량과 IL-10과의 복합체 형성율 간에 로그 선형 관계가 나타났다. 10 mg BT-063을 사용하면 전체 IL-10의 약 85%가 중화될 것이다.
산출된 곡선의 경로는 대게 혈중 IL-10의 농도와는 독립적인데, 이는 BT-063의 중화력(%)에 대해 다양한 IL-10 농도 수준은 매우 경미한 영향을 미친다는 것을 의미한다.
따라서, 건강한 자원자을 대상으로 하여 구한 곡선이, 혈중 IL-10 수준이 높은 전신 홍반성 낭창(SLE) 환자에게 추가적으로 적용될 수 있음을 추정할 수 있다. 이러한 데이타를 통해, 건강한 자원자에게 BT-063을 총 용량 175 ㎍ 보다 높은 용량으로 사용하면 사이토카인을 10% 이상 중화시킬 수 있을 것으로 판단할 수 있다. 이 용량에서 최대 10 mg까지인 총 용량 범위에서, IL-10의 mAb에 의한 복합체 형성율은 최대 85%까지로 로그 선형 관계를 나타낼 것이다. BT-063의 용량이 10 mg을 초과하는 범위에서는, 곡선은 포화 수준에 도달하게 된다. 거의 100% 중화는 총 용량 100 mg에서 이루어진다.
실시예 8 - 건강한 자원자를 대상으로 한 생체내 1회 투여 독성 검사
본 실험을 수행하여, BT-063 (변이체 hVH26/hVL7)의 안전성과 내인성(tolerability), 및 BT-063 투여 효과를, 건강한 자원자에서의 항체의 용량을 증가시키면서, 모니터링하였다. 8가지의 투약 그룹으로, 자원자 23명에게 BT-063을 1회 정맥내로 투여하였다. 투약 그룹은 다음과 같다: 0.175mg, 0.75 mg, 3.5 mg, 7 mg, 15 mg, 30 mg, 60 mg 및 100 mg. 그룹 당 자원자의 수는 3명이며, 100 mg 투약 그룹은 2명이었다.
각 용량을 0.9% 염화나트륨 주사액에 총 부피 최대 20 ml로 희석하였다. 용량은 2시간 동안 주입 펌프를 이용한 1회 연속 정맥내 주입으로 투여하였다.
주입 후 85일간 자원자를 검사하였고, 이 기간 동안 여러번 혈액을 채혈하였다.
혈액에서 사이토카인 IFNγ, IL-1β, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-8, IL-10 및 TNFα의 수준을 측정하였다.
결과
주입 후 24시간내에 IL-6과 IL-8의 비-용량 의존적인 일시적인 증가가 나타났으며, 3일 후에는 투여 전 수준으로 회복되었다. 이러한 현상은 용량 상관성이 없으며 최저 용량에서도 이러한 현상이 나타나기 때문에, 항체에 의한 것이기 보다는 주입 행위와 연관있는 것으로 보인다.
IL-10이 중요한 조절 사이토카인이라는 점을 감안할 때, 놀랍게도, 도 13에 나타낸 바와 같이 IFNγ, IL-1β, IL-2, IL-4, IL-5 및 TNFα의 수준 증가는 검출되지 않았다. IL-4, IL-5 IFN-γ, IL-2의 수준이 증가되지 않았다는 것은, BT-063 투여로 인한 T-헬퍼 세포의 활성화는 발생하지 않는다는 것을 뒷받침한다. 아울러, 체온 역시 전염증성 사이토카인의 대량 분비를 나타내는 징후이기 때문에, 투여한 자원자들의 체온을 측정하였다. 그러나, 투여 후 체온 상승은 나타나지 않았다.
도 14에 나타낸 바와 같이, IL-10 혈장 농도는 BT-063의 투여에 의해 영향을 받으며, BT-063 용량 증가에 따라 혈장내 검출되는 IL-10도 증가하였다. 사용한 분석법이 유리형 IL-10과 BT-063에 결합된 IL-10 둘다를 검출한다는 점에 유념하여야 한다. 이러한 증가에 대한 가능성 있는 설명은 2가지이다: (1) IL-10의 반감기 연장, BT-063이 IL-10에 결합하여 IL-10의 내재화(internalization) 방지, 및 혈액에서 IL-10이 소거되지 않음 (정상적으로 IL-10의 교체는 빠르게 이루어지며, 분비된 IL-10의 반감기는 약 2.3 - 3.5시간임 (Huhn et al., Blood (1996) Jan 15: 87(2): 699-705)); 및/또는 (2) 네거티브 피드백 고리 유도 - BT-063은 IL-10이 이의 수용체에 결합하는 것을 차단시킴, IL-10이 세포내로 흡수되지 않음, B 세포에서 IL-10을 더 많이 생산하도록 촉발됨. 본 발명자들은, BT-063과 뮤라인 IL-10R 낫아웃 세포를 이용한 전 혈액 배양 실험에서 입수한 시험관내 데이타를 기초로 검증한 결과, 시나리오 (2)가 가능성 높은 것으로 판단하였다 (Mahnke et al., unpublished data).
약동학
약동학 데이타에 따르면, BT-063의 Cmax, AUC 및 반감기는 예상한 이론치의 범위에 포함되는 것으로 나타났다. BT-063의 최종 반감기(terminal half-life)는 15 - 30일이다. BT-063을 30 mg 또는 그 이상으로 투여한 후, 85일 경과 후에도 여전히 혈장에서 BT-063이 검출되었다.
인간 항-인간 항체(HAHA) 반응을 다른 사이토카인 중화 항체(예, Adalimumab, 인간화된 항-TNF α)로 관찰하였지만, 투여한 자원자들에서 HAHA는 관찰되지 않았다.
BT-063을 투여한 후 IL-10의 검출 양은 증가하지만, 본 연구에서는 보다 높은 BT-063 용량에 대해서도 안전성과 내인성이 입증되었다는 사실에 유념하였으며, 따라서, 과잉의 IL-10의 효과를 상쇄시키기 위해 SLE 환자에게 BT-063을 충분한 양으로 안전하게 투여할 수 있는 것으로 결론내릴 수 있다.
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25 30 Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Arg Pro Gly Gln Ser 35 40 45 Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro 50 55 60 Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile 65 70 75 80 Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly 85 90 95 Ser His Val Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 110 <210> 70 <211> 117 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> BT-063 VH <400> 70 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ser Phe Ala Thr Tyr 20 25 30 Gly Val His Trp Val Arg Gln Ser Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu 35 40 45 Gly Val Ile Trp Arg Gly Gly Ser Thr Asp Tyr Ser Ala Ala Phe Met 50 55 60 Ser Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Asn Ser Lys Asn Thr Val Tyr Leu 65 70 75 80 Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys Ala 85 90 95 Lys Gln Ala Tyr Gly His Tyr Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser 100 105 110 Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 71 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> BT-063 VL CDR1 <400> 71 Ser Ser Gln Asn Ile Val His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr 1 5 10 <210> 72 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> BT-063 VL CDR2 <400> 72 Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro Asp Arg 1 5 10 <210> 73 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> BT-063 VL CDR3 <400> 73 Gly Ser His Val Pro Trp 1 5 <210> 74 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> BT-063 VH CDR1 <400> 74 Ala Ser Gly Phe Ser Phe Ala Thr Tyr Gly 1 5 10 <210> 75 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> BT-063 VH CDR2 <400> 75 Ile Trp Arg Gly Gly Ser Thr Asp Tyr Ser Ala Ala Phe Met Ser Arg 1 5 10 15 <210> 76 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> BT-063 VH CDR3 <400> 76 Gln Ala Tyr Gly His Tyr Met Asp 1 5

Claims (30)

  1. 인터루킨-10(IL-10)에 결합가능한 인간화된 항체 또는 항체의 단편으로서,
    상기 항체 또는 항체의 단편이,
    (i) 아미노산 서열 RSSQNIVHSNGNTYLE, KVSNRFS 및 FQGSHVPWT를 포함하는 가변성 경쇄; 및
    (ii) 아미노산 서열 FSXATYGVH, VIWRGGSTDYSAAFMSXXXXXXXNS 및 QAYGHYMDY를 포함하는 가변성 중쇄를 포함하며, 상기 X 는 임의의 아미노산을 나타내는 것인,
    인간화된 항체 또는 항체의 단편.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 가변성 경쇄의 아미노산 서열이 서열번호 2와 80% 이상의 서열 동일성을 가지며.
    상기 가변성 중쇄의 아미노산 서열이 서열번호 3과 80% 이상의 서열 동일성을 가지는 것을 특징으로 하는 인간화된 항체 또는 항체의 단편.
  3. 제1항에 있어서,
    (i) 상기 가변성 경쇄의 아미노산 서열이 서열번호 24이고, 상기 가변성 중쇄의 아미노산 서열이 서열번호 49이거나; 또는
    (ii) 상기 가변성 경쇄의 아미노산 서열이 서열번호 25이고, 상기 가변성 중쇄의 아미노산 서열이 서열번호 49인 것을 특징으로 하는 인간화된 항체 또는 항체의 단편.
  4. 제1항에 있어서, 상기 항체가 인간 IgG1 항체인 것을 특징으로 하는 인간화된 항체 또는 항체의 단편.
  5. 제1항에 있어서, 상기 항체 또는 항체의 단편이
    (i) IL-10 수용체 α (IL-10Rα)가 결합하는 IL-10의 동일 영역에 결합하지만, IL-10이 IL-10 수용체에 결합되었을 때에는, IL-10에 결합할 수 없으며,
    (ii) 2개의 단량체의 잔기들을 포함하는 불연속 에피토프에 결합함으로써 동형이량체 형태의 IL-10에 결합하는 것을 특징으로 하는 인간화된 항체 또는 항체의 단편.
  6. 제5항에 있어서,
    (i) 상기 항체 또는 항체의 단편은 IL-10 수용체 β (IL-10Rβ)가 결합하는 IL-10의 동일 영역에는 결합하지 않거나;
    (ii) 상기 항체 또는 항체의 단편은 IL-10의 제1 단량체의 나선 A의 잔기와 IL-10의 제2 단량체의 나선 F'의 잔기를 포함하는 불연속 에피토프에 결합하거나; 또는
    (iii) 상기 불연속 에피토프의 잔기들은 상기 제1 단량체의 처음 55개의 아미노산들로 이루어진 영역과 상기 제2 단량체의 마지막 20개의 아미노산들로 이루어진 영역 내에 존재하는 것을 특징으로 하는 인간화된 항체 또는 항체의 단편.
  7. 제5항에 있어서, 상기 불연속 에피토프의 잔기들은 제1 단량체의 20번에서 55번 아미노산들로 이루어진 영역과 제2 단량체의 마지막 20개의 아미노산들로 이루어진 영역 내에 존재하는 것을 특징으로 하는 인간화된 항체 또는 항체의 단편.
  8. 제5항에 있어서, 상기 항체 또는 항체의 단편은
    (i) 항체-의존적인 세포-매개의 세포독성 또는 보체-의존적인 세포독성을 유도하지 않거나;
    (ii) IL-10α 수용체를 통한 IL-10의 신호 전달을 방지할 수 있거나; 또는
    (iii) IL-10R 발현 세포에 결합할 수 없는 것을 특징으로 하는 인간화된 항체 또는 항체의 단편.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한항에 따른 항체 또는 항체의 단편을 코딩하는 핵산.
  10. 제9항에 따른 핵산을 포함하는 벡터.
  11. 제9항에 따른 핵산을 포함하거나, 또는
    상기 핵산을 포함하는 벡터를 포함하는, 숙주 세포.
  12. 제1항 내지 제8항 중 어느 한항에 따른 항체 또는 항체의 단편의 제조 방법으로서,
    제1항 내지 제8항 중 어느 한항에 따른 항체 또는 항체의 단편을 코딩하는 핵산을 포함하거나 또는 상기 핵산을 포함하는 벡터를 포함하는 숙주 세포를, 상기 항체 또는 항체의 단편의 발현을 허용하는 조건하에 배양 배지에서 배양하는 단계, 및 상기 배양 배지로부터 상기 항체 또는 항체의 단편을 분리하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  13. 제1항 내지 제8항 중 어느 한항에 따른 항체 또는 항체의 단편을 포함하며, 약제학적으로 허용가능한 담체 또는 희석제를 더 포함하는,
    전신 홍반성 낭창 (SLE)의 치료를 위한 약학 조성물.
  14. 제1항 내지 제8항 중 어느 한항에 따른 항체 또는 항체의 단편과 표지 물질을 포함하는, 표지된(labeled), 인간화된 항체 또는 항체의 단편.
  15. 샘플내 IL-10의 시험관내 중화 방법으로서,
    상기 샘플을 제1항 내지 제8항 중 어느 한항에 따른 항체 또는 항체의 단편과 접촉시켜, 상기 항체 또는 항체의 단편을 IL-10과 결합시키는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  16. 샘플에서 IL-10의 존재를 검출하는 시험관내 방법으로서,
    상기 샘플을, 제1항 내지 제8항 중 어느 한항에 따른 항체 또는 항체의 단편을 포함하는 비표지된 항체 또는 항체의 단편, 또는 제1항 내지 제8항 중 어느 한항에 따른 항체 또는 항체의 단편 및 표지 물질을 포함하는 표지된 항체 또는 항체의 단편과 접촉시키는 단계;
    상기 샘플을 헹구어 상기 샘플에 결합되지 않은 항체 또는 항체의 단편을 제거하는 단계; 및
    상기 샘플에서 상기 항체 또는 항체의 단편, 또는 상기 표지 물질의 존재를 검출하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
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