[go: up one dir, main page]

KR101800004B1 - 산화그래핀으로 수식된 자성 비드, 이의 제조방법 및 이를 이용한 핵산의 분리방법 - Google Patents

산화그래핀으로 수식된 자성 비드, 이의 제조방법 및 이를 이용한 핵산의 분리방법 Download PDF

Info

Publication number
KR101800004B1
KR101800004B1 KR1020160149504A KR20160149504A KR101800004B1 KR 101800004 B1 KR101800004 B1 KR 101800004B1 KR 1020160149504 A KR1020160149504 A KR 1020160149504A KR 20160149504 A KR20160149504 A KR 20160149504A KR 101800004 B1 KR101800004 B1 KR 101800004B1
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
beads
magnetic beads
magnetic
bead
silica
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
KR1020160149504A
Other languages
English (en)
Inventor
전봉현
김동은
백아름
팜수안헝
김태한
Original Assignee
건국대학교 산학협력단
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 건국대학교 산학협력단 filed Critical 건국대학교 산학협력단
Priority to KR1020160149504A priority Critical patent/KR101800004B1/ko
Application granted granted Critical
Publication of KR101800004B1 publication Critical patent/KR101800004B1/ko
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C09—DYES; PAINTS; POLISHES; NATURAL RESINS; ADHESIVES; COMPOSITIONS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; APPLICATIONS OF MATERIALS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR
    • C09C—TREATMENT OF INORGANIC MATERIALS, OTHER THAN FIBROUS FILLERS, TO ENHANCE THEIR PIGMENTING OR FILLING PROPERTIES ; PREPARATION OF CARBON BLACK  ; PREPARATION OF INORGANIC MATERIALS WHICH ARE NO SINGLE CHEMICAL COMPOUNDS AND WHICH ARE MAINLY USED AS PIGMENTS OR FILLERS
    • C09C3/00—Treatment in general of inorganic materials, other than fibrous fillers, to enhance their pigmenting or filling properties
    • C09C3/06—Treatment with inorganic compounds
    • C09C3/063—Coating
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C01—INORGANIC CHEMISTRY
    • C01B—NON-METALLIC ELEMENTS; COMPOUNDS THEREOF; METALLOIDS OR COMPOUNDS THEREOF NOT COVERED BY SUBCLASS C01C
    • C01B32/00—Carbon; Compounds thereof
    • C01B32/20—Graphite
    • C01B32/21—After-treatment
    • C01B32/23—Oxidation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C01—INORGANIC CHEMISTRY
    • C01B—NON-METALLIC ELEMENTS; COMPOUNDS THEREOF; METALLOIDS OR COMPOUNDS THEREOF NOT COVERED BY SUBCLASS C01C
    • C01B33/00—Silicon; Compounds thereof
    • C01B33/113—Silicon oxides; Hydrates thereof
    • C01B33/12—Silica; Hydrates thereof, e.g. lepidoic silicic acid
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C09—DYES; PAINTS; POLISHES; NATURAL RESINS; ADHESIVES; COMPOSITIONS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; APPLICATIONS OF MATERIALS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR
    • C09C—TREATMENT OF INORGANIC MATERIALS, OTHER THAN FIBROUS FILLERS, TO ENHANCE THEIR PIGMENTING OR FILLING PROPERTIES ; PREPARATION OF CARBON BLACK  ; PREPARATION OF INORGANIC MATERIALS WHICH ARE NO SINGLE CHEMICAL COMPOUNDS AND WHICH ARE MAINLY USED AS PIGMENTS OR FILLERS
    • C09C1/00—Treatment of specific inorganic materials other than fibrous fillers; Preparation of carbon black
    • C09C1/22—Compounds of iron
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • C12N15/1003—Extracting or separating nucleic acids from biological samples, e.g. pure separation or isolation methods; Conditions, buffers or apparatuses therefor
    • C12N15/1006—Extracting or separating nucleic acids from biological samples, e.g. pure separation or isolation methods; Conditions, buffers or apparatuses therefor by means of a solid support carrier, e.g. particles, polymers
    • C12N15/1013—Extracting or separating nucleic acids from biological samples, e.g. pure separation or isolation methods; Conditions, buffers or apparatuses therefor by means of a solid support carrier, e.g. particles, polymers by using magnetic beads
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6806—Preparing nucleic acids for analysis, e.g. for polymerase chain reaction [PCR] assay
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N35/00—Automatic analysis not limited to methods or materials provided for in any single one of groups G01N1/00 - G01N33/00; Handling materials therefor
    • G01N35/0098—Automatic analysis not limited to methods or materials provided for in any single one of groups G01N1/00 - G01N33/00; Handling materials therefor involving analyte bound to insoluble magnetic carrier, e.g. using magnetic separation

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Inorganic Chemistry (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Geology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

본 발명은 산화그래핀으로 수식된 자성 비드, 이의 제조방법 및 이를 이용한 핵산의 분리방법을 제공한다.
본 발명의 산화그래핀으로 수식된 자성 비드는 miRNA와 같은 소분자 RNA의 추출이 필수적인 생명공학 분야에서 단일 가닥 DNA 또는 RNA를 정제하기 위한 간단하고 편리한 방법으로 유용하게 사용될 수 있다.

Description

산화그래핀으로 수식된 자성 비드, 이의 제조방법 및 이를 이용한 핵산의 분리방법{Graphene oxide modified magnetic bead, process for preparing the same and process for nucleic acid extraction using the same}
본 발명은 산화그래핀으로 수식된 자성 비드에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 산화그래핀으로 수식된 자성 비드, 이의 제조방법 및 이를 이용한 핵산의 분리방법에 관한 것이다.
생명공학 분야에서는 시험 또는 분석의 대상 시료가 대부분 생체 시료이다. 생체 시료에는 단백질·탄수화물과 같은 세포성 물질 또는 다른 불순물이 다량으로 존재하며, 이러한 복합적인 물질은 시험 반응 또는 분석 기술에 방해물로서 작용한다. 즉, 생명공학 분야에서 주로 수행되는 시험·분석 기술인 검출, 클로닝, 염기서열 분석, 증복, 혼성화, cDNA 합성 등과 같은 일련의 기술이 정제되지 않은 시료로 인해 수행될 수 없게 되거나, 그 검출감의 저하를 초래하게 된다. 따라서, 핵산(nucleic acid, NA)의 추출은 중합효소 사슬 반응(polymerase chain reaction, PCR), 상보적 DNA(complementary DNA, cDNA) 합성, 염기서열 분석, 유전자 클로닝, 및 혼성화 등의 많은 분자 생물학 기술에서 필수적인 단계이다.
이에 따라, 생물학적 시료로부터 NA을 추출하기 위한 다양한 방법이 개발되었으며, 이들은 일반적으로 유체-상(fluid-phase) 및 고체-상(solid-phase) 카테고리(category)로 분류된다. 그러나, 유체-상 방법은 대체로 복잡하고, 고비용이며, 시간-소모적이고, 특히, 독성이 있는 페놀 및/또는 클로로포름 화합물을 사용한다는 문제점이 있다. 또한, 페놀에 의한 NA의 오염으로 인해 PCR 및 제한효소 처리(restriction enzyme digestion, RED)에의 활용과 같은 후속 단계에 영향을 미칠 가능성이 있다. 따라서, 대량 유전자 스크리닝(mass genetic screening) 및 시험과 같은 다수의 생물학 연구 분야에서 간편하고, 신속하며, 경제적이고, 생체적합성이 우수한 NA 추출 방법의 개발이 요구되고 있다.
이와 관련하여, 실리카, 유리 섬유 및 나노입자 포함 고체 상 지지체를 사용하는 선택적 분리 방법이 보고되었다. 최근에는, 카본 나노튜브 및 자성 나노입자와 같은 다양한 나노물질이 단백질 및 NA와 같은 생체분자의 분리에 활용되고 있다. 특히, 산화그래핀(graphene oxide, GO) 시트(sheet)에 의한 NA의 분리가 보고된 바 있으며, 이는 넓은 표면적을 갖는 GO가 p-p 스태킹(stacking), 반 데르 발스력(van der Waals force) 및 수소 결합을 통하여 단일 가닥 DNA를 강하게 흡착할 수 있다는 원리를 이용한 것이다. 그러나, 이중 가닥 DNA에 있어서는, DNA 염기가 노출되지 않고 음전하로 하전된 포스페이트(phosphate) 그룹만이 노출되므로, 그 결과, GO에 대한 이중 가닥 DNA의 흡착은 고농도의 염 존재 하에서만 가능하다. 그러나, 상기 방법은 원심분리를 이용하여야 하기 때문에 시간 소모적이고 복잡한 공정이 포함되어 있다.
자성 분리는 화학적 또는 생물학적 분야에서 사용되고 있는 신생 기술이다. 상기 기술의 생물과학에서의 활용은 1970년대까지는 제한적이었다. 생리적 활성물질(핵산, 단백질 등), 세포, 및 세포 기관(organelle)을 정제하기 위하여 자성 분리 기술을 사용한다는 개념이 지난 수십년 동안에 다시 관심을 받고 있다. 이에 따라, 생명공학 분야에서 일부 복잡한 분리 공정이 필요하였던 부분에 대하여, 개선된 특성을 갖는 자성 입자가 새로이 개발·적용되고 있다.
자성 관련 기술은 분리 과정 중에 생물분자 또는 세포와의 비-접촉이라는 이점이 있으므로, 이로 인해 지난 수십년 동안 생물-활용 분야에서 관심을 받을 수 있었다. 자성 나노/마이크로입자의 크기는 성공적인 자성 분리 기술의 중요한 인자이고, 생체 표적물(대상물)과의 정확하고 선택적인 상호작용을 위하여 자성 나노/마이크로입자의 크기는 대부분 10 um보다 작다. 또한, 소수성(hydrophobic) 또는 자성 인력으로 발생되는 응집(aggregation)을 방지하고, 항체, 앱타머(aptamer) 및 DNA와 같은 특정 리간드(ligand)를 연구 대상인 생물학적 구조물에 용이하게 고정하기 위하여, 자성 입자의 표면은 생체적합성 무기 또는 유기 물질로 수식되어야 한다.
또한, 자성 마이크로입자는 용이하게 대량화되고, 시간-효율적이고, 비용-효과적이며, 외부 자기장 구배를 이용하여 생물학적 물질을 간단히 분리할 수 있다는 장점이 있으므로 최근 수년간 생물학적 분야에서 그 활용이 증가하고 있다. 특히, 자성 마이크로구형체는 단백질 정제, 표적화된 약물 전달, 세포 분리, 의학적 진단, 면역분석(immunoassay), DNA 염기서열 분석 및 세포 분석에 대한 고형 지지체로서 생물의학 분야에서 획기적으로 활용되고 있다.
메조다공성 실리카, 폴리사카라이드, 폴리(에틸렌 글리콜) 및 다수 다른 합성 중합체를 포함하는 마이크로비드의 형태로서 초상자성 나노입자를 내포하는 매트릭스로 다양한 물질이 사용되고 있다. 이에 의해 얻어진 마이크로비드는 크기 조절 가능성 및 초상자성 성질을 갖게 된다. 핵산은 혈액, 조직 분쇄물, 배양 배지, 물, 등의 비정제 시료 물질로부터 자성 기술로 직접 분리될 수 있다. 상기 입자는 시료 부피 측면에서 거의 제한이 없는 회분법(batch process)에 사용된다. 고체 물질의 자성 특성은 조절할 수 있으므로, 자성 특성을 갖는 고체 물질은 점성이 있는 시료 현탁물에서 조차도 비교적 용이하게 또한 선택적으로 제거될 수 있다. 실제로, 유사한 크기의 생물학적 잔해(debris) 및 다른 부착성 물질의 존재 하에서도, 작은 입자(직경 약 0.05-1　μm)의 회수를 위해서는 자성 분리가 유일하게 가능한 방법이다.
더욱이, 자성 분리의 효율은 대량 수준 정제에 특히 적합하다. 또한, 이러한 유망한 분리 기술은 시간 및 비용 절감을 가능하게 하는, 다양하게 자동화된 저-(low-) 내지 고-처리율(high-throughput) 과정의 기반으로 기여할 것이다. 원심분리 단계도 회피될 수 있으며, 전통적 방법 사용시의 교차-오염의 우려도 피해갈 수 있다. 핵산 정제용으로 다양한 형태의 자성 입자가 상업적으로 구입가능하며, 수동 및 자동 모드로 작동되는 자성 세퍼레이터(separator)을 구입할 수 있다.
자성 분리 전략의 효율은 자성 물질 상의 코팅에 의해 결정된다. 선행 연구에 의하면, 실리카-코팅된 또는 아민-수식된 자석이 용액으로부터 낮은 농도의 DNA를 분리시킨다고 보고된 바 있다. 최근에는, 자성 나노입자에 대한 신규한 전하-가역적(charge-reversible) 표면 화학이 개발되어, 단일 세균 세포로부터 DNA를 회수할 수 있다는 것이 보고된 바 있다. 그러나, 아직까지 GO-수식된 자성 비드에 의한 DNA, 특히 RNA의 분리는 보고된 바 없다.
대한민국 특허공개 제10-2014-0106268호(2014.09.03.) 대한민국 특허공개 제10-2015-0128612호(2015.11.18.) 대한민국 특허공개 제10-2011-0026972호(2011.03.16.)
본 발명자들은 보다 효과적으로 생물학적 시료로부터 RNA를 분리하기 위한 방법에 대하여 연구하던 중, 산화그래핀으로 수식된 자성 비드가 단일 가닥 핵산(특히, RNA)과의 결합 및 유레아에 의한 핵산의 해리라는 간편한 시험 과정으로 단일 가닥 핵산의 추출, 분리, 정량분석이 가능하며, 핵산을 포함하는 시료로부터 통상적인 RNA 추출 방법에 비하여 소규모 RNA 분자를 효과적으로 추출 및 분리할 수 있다는 것을 발견하였다.
따라서, 본 발명은 산화그래핀으로 수식된 자성 비드, 이의 제조방법 및 이를 이용한 핵산의 분리방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명의 일 태양에 따라, 산화그래핀으로 수식된 자성 비드가 제공된다.
일 구현예에서, 상기 비드는 직경 0.001 - 10,000 μm일 수 있으며, 분자량 103 - 1012일 수 있으며, 자성화 수치 0.1 - 1,000 emu/g일 수 있다.
일 구현예에서, 상기 자성 비드는 산화그래핀으로 수식된 실리카 코팅층을 갖는 자성 비드일 수 있으며, 상기 실리카 코팅층은 두께 10-4 - 104 μm일 수 있다.
일 구현예에서, 상기 산화그래핀은 두께 10-4 - 104 μm일 수 있다.
본 발명의 다른 태양에 따라, (a) 다공성 폴리스티렌-다이비닐벤젠 비드를 술폰화하는 단계; (b) 단계(a)에서 얻어진 상기 술폰화된 비드에 제1철(ferrous) 염, 제2철(ferric) 염 및 이들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택된 하나를 흡착시켜 자성화하는 단계; 및 (c) 단계(b)에서 얻어진 자성 비드를 산화그래핀과 반응시키는 단계를 포함하는, 산화그래핀으로 수식된 자성 비드의 제조방법이 제공된다.
일 구현예에서, 단계(b)와 단계(c) 사이에 (b-1) 단계(b)에서 얻어진 상기 자성화된 비드를 아민화 및 실리카 코팅하는 단계를 추가적으로 포함할 수 있다.
본 발명의 또 다른 태양에 따라, (ⅰ) 핵산을 포함하는 시료 및 산화그래핀으로 수식된 실리카 코팅층을 갖는 자성 비드를 혼합하여 인큐베이션하는 단계; (ⅱ) 단계 (ⅰ)의 상기 혼합물로부터 자석으로 핵산-비드 복합체를 분리하는 단계; 및 (ⅲ) 단계 (ⅱ)의 상기 핵산-비드 복합체에 유레아를 첨가하여 핵산과 비드를 해리시키는 단계를 포함하는 단일 가닥 핵산의 분리방법이 제공된다.
일 구현예에서, 단계(ⅰ)의 상기 자성 비드는 농도 10-3 - 103 mg/ml로 혼합될 수 있으며, 상기 단일 가닥 핵산은 5S 리보솜 RNA, 18S 리보솜 RNA 및 28S 리보솜 RNA로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상일 수 있다.
본 발명에 의해, 산화그래핀으로 수식된 자성 비드와 단일 가닥 핵산(특히, RNA)과의 결합 및 유레아에 의한 핵산의 해리라는 간편한 시험 과정으로 단일 가닥 핵산의 추출 및 분리, 나아가, 핵산의 정량분석이 가능함을 확인하였으며, 핵산을 포함하는 시료, 예를 들어, 세포 분쇄 시료로부터 통상적인 RNA 추출 방법에 비하여 소규모 RNA 분자(5S, 18S 및 28S 리보솜 RNA), 특히, 5S 리보솜 RNA를 효과적으로 추출 및 분리할 수 있다는 것이 밝혀졌다.
따라서, 본 발명의 산화그래핀으로 수식된 자성 비드는 miRNA와 같은 소분자 RNA의 추출이 필수적인 생명공학 분야에서 단일 가닥 DNA 또는 RNA를 정제하기 위한 간단하고 편리한 방법으로 유용하게 사용될 수 있다.
도 1은 산화그래핀 수식된 자성 비드의 제조 과정을 나타낸 개략도이다.
도 2는 (A) 자성 비드, (B) 아민화 및 실리카 코팅된 자성 비드 및 (C) 산화그래핀 수식된 자성 비드의 서로 다른 배율의 SEM 사진이다(실리카 코팅된 자성 비드는 50 mg임).
도 3은 (A) 자성 비드, (B) 아민화 및 실리카 코팅된 자성 비드 및 (C) 산화그래핀 수식된 자성 비드의 서로 다른 배율의 TEM 사진이다(실리카 코팅된 자성 비드는 50 mg임).
도 4는 (i) 아민화 및 실리카 코팅된 자성 비드 및 (ii) 산화그래핀 수식된 자성 비드의 (A) SEM 및 (B) 횡단면 TEM 사진이고, 내부도는 1개 입자의 횡단면 TEM 사진, (C) GO, 아민화 및 실리카 코팅된 자성 비드 및 산화그래핀 수식된 자성 비드의 감쇄 전반사(Attenuated total reflectance) 퓨리에 변환 적외선 스펙트럼(Fourier transform infrared spectrum), 및 (D) 산화그래핀 수식된 자성 비드의 초자성 히스테리시스 곡선(supermagnetic hysteresis loop)이다.
도 5는 (A) 폴리스티렌, (B) 자성 비드 및 (C) 실리카 코팅된 자성 비드의 EDX 데이터이다.
도 6은 (A) 산화그래핀, (B) 아민화 및 실리카 코팅된 자성 비드 및 (C) 산화그래핀 수식된 자성 비드의 감쇄 전반사 퓨리에 변환 적외선 스펙트럼이다.
도 7은 (A) 50 mg, (B) 100 mg, (C) 150 mg, (D) 200 mg, 및 (E) 250 mg GO로 수식된 산화그래핀 수식된 자성 비드의 SEM 사진이다(아민화 및 실리카 코팅된 자성 비드는 50 mg임).
도 8은 (A) 0 mg, (B) 50 mg, (C) 150 mg, 및 (D) 250 mg GO로 수식된 산화그래핀 수식된 자성 비드의 TEM 사진이다(아민화 및 실리카 코팅된 자성 비드는 50 mg임).
도 9는 (A) 자성 물질에 의한 RNA 추출을 나타낸 것으로서, (i) 대표적인 RNA 추출 과정, (ii) 아민화 및 실리카 코팅된 자성 비드 및 GO-수식된 자성 비드에 의해 추출된 RNA의 15% 변성 유레아-PAGE 분석 결과, (iii) 아민화 및 실리카 코팅된 자성 비드 및 GO-수식된 자성 비드에 의해 추출된 RNA의 방사능 측정 결과(겔 상의 RNA의 방사능은 포스포르이미저 스크린에 노출시켜 사이클론 포스포르이미저로 측정함), (B) 1 - 10 mg/mL의 상이한 농도에서 세포로부터 GO-수식된 자성 비드에 의해 추출된 총 RNA[각 분획의 RNA 양은 각 레인(lane)의 RNA의 UV 형광 강도를 대조군과 비교하여 계산한 값이며, 대조군은 구아니디늄 티오시안산염-페놀-클로로포름 추출(guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction, TRIZOL)의 통상적 방법을 이용하여 추출된 RNA를 나타냄]이다.
본 발명은 산화그래핀으로 수식된 자성 비드를 제공한다.
일 구현예에서, 상기 비드는 직경 0.001 - 10,000 μm, 바람직하게는 0.01 - 1,000 μm, 더욱 바람직하게는 0.1 - 100 μm, 가장 바람직하게는 1 - 10 μm일 수 있다.
일 구현예에서, 상기 비드는 분자량 103 - 1012, 바람직하게는 103 - 109, 더욱 바람직하게는 103 - 106, 가장 바람직하게는 103 - 105일 수 있다.
일 구현예에서, 상기 비드의 재질은 통상적으로 사용되는 수지(resin) 중합체일 수 있으며, 예를 들어, 폴리스티렌-다이비닐벤젠(PS-DVB), 폴리스티렌(PS), 다이비닐벤젠(DVB), 폴리(메틸 메타크릴레이트(Poly(methyl methacrylate)), 폴리아세틸렌(polyacetylene), 폴리(p-페닐렌)(poly(p-phenylene)), 폴리피롤(polypyrrole), 폴리아닐린(polyaniline), 폴리이소시아나프텐(polyisothianaphtene), 폴리아세틸렌(polyacetylene), 폴리싸이오펜(polythiophene), 및 이들의 혼합물일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
일 구현예에서, 상기 비드는 자성화를 위하여 술폰화될 수 있다. 자성화된 비드는 직경 0.1 - 100 μm, 바람직하게는 0.5 - 50 μm, 더욱 바람직하게는 1 - 10 μm일 수 있다. 상기 자성화된 비드의 자성화 수치는 0.1 - 1,000 emu/g, 바람직하게는 1 - 100 emu/g, 더욱 바람직하게는 5 - 10 emu/g일 수 있다.
일 구현예에서, 상기 비드는 그 형태에 있어서 제한이 없으며, 예를 들어, 구형, 로드형(막대형), 와이어형(선형), 평면형, 무정형 등 어떠한 형태라도 가능하다.
일 구현예에서, 상기 비드는 실리카 코팅층을 포함하거나, 혹은, 포함하지 않을 수도 있으며, 실리카 코팅층을 포함할 경우에는 보다 용이하게 산화그래핀의 도입이 가능하다. 실리카 코팅층을 포함하지 않는 자성비드는 비특이적 결합, 수소결합, 공유결합(아민화실란 등의 물질을 동시에 반응시키는 경우) 등에 의해 얻어질 수 있으며, 이러한 반응에 의해 실리카 코팅층이 없이도 산화그래핀을 자성비드에 도입하는 것이 가능하다.
실리카 코팅층을 포함하는 경우에는, 예를 들어, 구형의 자성 비드를 실리카 코팅층이 둘러싼 코어-쉘(core-shell) 구조일 수 있다. 일 구현예에서, 상기 실리카 코팅층은 두께 10-4 - 104 μm, 바람직하게는 10-3 - 102 μm, 더욱 바람직하게는 10-2 - 1 μm일 수 있다.
일 구현예에서, 상기 산화그래핀은 두께 10-4 - 104 μm, 바람직하게는 10-3 - 102 μm, 더욱 바람직하게는 10-2 - 1 μm일 수 있다.
또한, 본 발명은 (a) 다공성 폴리스티렌-다이비닐벤젠 비드를 술폰화하는 단계; (b) 단계(a)에서 얻어진 상기 술폰화된 비드에 제1철(ferrous) 염, 제2철(ferric) 염 및 이들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택된 하나를 흡착시켜 자성화하는 단계; 및 (c) 단계(b)에서 얻어진 자성 비드를 산화그래핀과 반응시키는 단계를 포함하는, 산화그래핀으로 수식된 자성 비드의 제조방법을 제공한다.
단계(a)는 다공성 비드를 술폰화하는 단계이다. 술폰화는 통상의 술폰화 방법에 의해 수행될 수 있으며, 예를 들어, 단분산 폴리스티렌-다이비닐벤젠 비드를 아세트산에 첨가한 후, 여기에 황산을 실온에서 첨가하고, 온도를 상승시켜 반응을 진행시킨 다음, 온도를 하강시켜 반응을 종료시킴으로써 바람직하게 수행될 수 있다.
단계(b)는 술폰화된 비드를 자성화하는 단계이다. 자성화는 통상의 자성화 방법에 의해 수행될 수 있으며, 예를 들어, 술폰화된 마크로다공성 비드를 물에 분산시킨 후, 제1철(ferrous) 염 및 제2철(ferric) 염의 혼합물을 첨가하여 흡착시킴으로써 바람직하게 수행될 수 있다.
단계(c)는 자성화된 비드를 산화그래핀으로 수식하는 단계이다. 산화그래핀의 수식은 통상의 산화그래핀 수식 방법에 의해 수행될 수 있으며, 예를 들어, 초음파 처리한 산화그래핀 용액에 안정화제를 첨가하고, 커플링제를 첨가하여 카르복실 그룹을 활성화시킨 다음, 여기에 아민화 및 실리카 코팅된 자성 비드를 첨가하여 반응시킴으로써 수행될 수 있다.
일 구현예에서, 단계(b)와 단계(c) 사이에 (b-1) 단계(b)에서 얻어진 상기 자성화된 비드를 아민화 및 실리카 코팅하는 단계를 추가적으로 포함할 수 있다. 이러한 경에 단계(b-1)는 자성화된 비드를 아민화 및 실리카 코팅하는 단계이다. 아민화 및 실리카 코팅은 통상의 아민화 및 실리카 코팅 방법에 의해 수행될 수 있으며, 예를 들어, 자성화된 비드에 (3-아미노피롤)트리에톡시실란[APTS], 수산화암모늄 용액, 테트라에틸오르토실리케이트를 순서대로 첨가하여 혼합한 후, 세척한 다음, 얻어진 비드를 무수에탄올 중에 분산시켜 APTS 및 수산화암모늄을 첨가하여 반응시킴으로써 수행될 수 있다.
일 구현예에서, 단계(c)의 상기 산화그래핀은 아민화 및 실리카 코팅된 자성 비드 1 중량부에 대하여 10-6 - 104 중량부, 바람직하게는 10-3 - 103 중량부, 더욱 바람직하게는 1 - 102 중량부, 가장 바람직하게는 3 - 10 중량부로 혼합되어 반응될 수 있다.
또한, 본 발명은 (ⅰ) 핵산을 포함하는 시료 및 산화그래핀으로 수식된 실리카 코팅층을 갖는 자성 비드를 혼합하여 인큐베이션하는 단계; (ⅱ) 단계 (ⅰ)의 상기 혼합물로부터 자석으로 핵산-비드 복합체를 분리하는 단계; 및 (ⅲ) 단계 (ⅱ)의 상기 핵산-비드 복합체에 유레아를 첨가하여 핵산과 비드를 해리시키는 단계를 포함하는 단일 가닥 핵산의 분리방법을 제공한다.
일 구현예에서, 단계(ⅰ)의 상기 자성 비드는 농도 10-3 - 103 mg/ml, 바람직하게는 10-2 - 102 mg/ml, 더욱 바람직하게는 1 - 10 mg/ml, 가장 바람직하게는 5 -10 mg/ml로 혼합될 수 있다.
일 구현예에서, 상기 단일 가닥 핵산은 RNA 또는 DNA일 수 있으며, 바람직하게는 5S 리보솜 RNA, 18S 리보솜 RNA 및 28S 리보솜 RNA로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상일 수 있다.
일 구현예에서, 단계 (ⅲ)에서 얻어진 분리된 핵산을 정량함으로써 핵산을 포함하는 시료 중 단일 가닥 핵산의 농도 또는 포함량을 얻을 수 있다.
이하, 본 발명을 실시예를 통하여 더욱 상세히 설명한다. 그러나, 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이에 제한되는 것은 아니다.
<실시예>
1. 시약
스티렌(Styrene), 2,2'-아조비스-이소부티로니트릴(2,2'-azobis-isobutyronitrile, AIBN), 다이벤조일 퍼옥시드(dibenzoyl peroxide, BPO), 다이부틸 프탈레이트(dibutyl phthalate, DBP), Fe3Cl3·6H2O, FeCl2·4H2O, 황산 도데실 나트륨(sodium dodecyl sulfate, SDS), 황산, 아세트산, 폴리비닐피롤리돈-40(polyvinylpyrrolidone-40, PVP-40, 분자량 40,000), 1-에틸-3-(3-다이메틸아미노피롤) 카르보디이미드(1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide, EDC), N-히드록시숙신이미드(N-Hydroxysuccinimide, NHS), 테트라에틸오르토실리케이트(Tetraethylorthosilicate, TEOS), 수산화암모늄(NH4OH), 및 (3-아미노피롤)트리에톡시실란((3-aminopropyl)triethoxysilane, APTS)은 시그마-알드리치사(Sigma-Aldrich, MO, USA)에서 구입하였다. 산화그래핀(graphene oxide, GO)은 그래핀수퍼마켓사(Graphene Supermarket, NY, USA)에서 구입하였다.
2. 방법
실리카 코팅된 마이크로비드는 선행문헌(Pham, X.-H. et al., Journal of nanomaterials 2016, 2016, 9.)에 따라 제조하였으며, 상세 과정은 하기와 같다.
2.1 실리카 코팅된 자성 비드의 제조
(1) 폴리스티렌- 다이비닐벤젠( PS-DVB) 비드의 제조
단분산 마크로다공성 PS-DVB(Monodisperse macroporous PS-DVB)를 시드 중합법(seeded polymerization method)으로 제조하였다. 단분산 폴리스티렌(PS) 시드(4 μm)는 분산 중합법(dispersion polymerization method)을 이용하여 제조하였다. 분산 매체는 입체 안정화제(steric stabilizer)로서 PVP-40 1 g을 포함하는 에탄올/2-메톡시에탄올(3:2)(90 mL)이었다. 억제제가 제거된 스티렌(15 mL)에 AIBN(150 mg)을 용해시킨 후, 제조된 분산 매체에 첨가하였다. 10분간 초음파 처리한 후, 70 ℃에서 20 h 동안 교반(120 cpm)하면서 실린더형 반응 챔버(cylindrical reaction chamber)에서 분산 중합화를 수행하였다. 현탁물을 원심분리하고 침전물을 증류수로 강하게 세척하였으며, 이는 반복적인 원심분리 및 와류교반에 의하였다. 최종적으로, PS 시드를 에탄올로 세척하였고, PS 시드에 적합한 방법으로 하룻밤 동안 진공 건조하였다(4 μm, 8.3 g).
유리 반응기 장착된 오버헤드 스터러(overhead stirrer) 및 온도조절기 장착된 오일 배스(oil bath) 중의 환류냉각기(reflux condenser)에서 팽윤 및 중합화 공정을 수행하였다. 단분산 마크로다공성 폴리(스티렌-공-DVB) [poly(styrene-co-DVB), PS-DVB] 비드를 제조하기 위하여 2-단계 시드 중합법을 이용하였다. PS 시드(4 μm, 700 mg)를 0.25 %(w/w) SDS 포함하는 DBP(0.7 mL) 유화된 수성 매체(100 mL)에 분산시켰다. 얻어진 분산 매체를 DBP와 함께 PS 시드를 팽윤시키기 위하여 20 h 동안 실온에서 교반하였다(400 rpm). BPO(240 mg)가 용해된 DVB(2.3 mL) 스티렌(4.6 mL)의 혼합물을 0.25%(w/w) SDS 포함 수성 매체(100 mL)에 균질화기기(homogenizer)를 이용하여 1분간 유화시켰다. 교반되고 있는 DBP-팽윤된 PS 시드 분산 매체에 유화된 단량체 용액을 첨가하였다. 단량체 팽윤은 계속적인 교반(400 rpm)을 수행하면서 실온에서 20 h 동안 진행하였다. 팽윤 공정 후에, 탈이온수(10 mL) 중의 10 %(w/v) PVA 수성 용액을 분산 매체에 첨가하고 이 분산 매체에 질소 가스를 30 분 동안 퍼징하였다. 계속적으로 교반(200 rpm)하면서 70 ℃에서 20 h 동안 시드 중합화를 수행하여 단분산 PS-DVB 비드를 얻었다. 중합체 비드를 반복적인 세척 및 원심분리에 의해 미온의 탈이온수(50 ℃)로 강하게 세척하였다. 이후, 비드를 모아 에탄올 및 THF로 강하게 세척하여 DBP 및 선형(linear) 중합체를 제거하였다. 최종적으로, 비드를 30 ℃에서 24 h 동안 진공 건조하여 마크로다공성 PS-DVB 비드(7.5 μm, 2.5 g)를 얻었다.
(2) 마크로다공성 PS-DVB 비드의 술폰화
PS-DVB 비드의 술폰화는 선행문헌(Chambers, T.K. et al., J. Chromatogr . A 1998, 797, 139-147)에 보고된 방법에 따라 수행하였다. 요약하면, 단분산 PS-DVB 비드(1 g)를 얼음 배스(ice bath) 중의 아세트산 5 mL에 첨가하였다. 황산(50 mL)을 실온에서 비드에 천천히 첨가하고 온도를 90 ℃까지 상승시킨 다음 수지(resin) 혼합물을 30 분 내지 2 시간 동안 교반하였다. 상기 분산액을 얼음물(400 mL)에 부어 반응을 종결시키고 원심분리하여 술폰화된 PS-DVB 비드를 수집하였다. 얻어진 비드를 반복적인 원심분리-상층액분리(decantation)에 의해 탈이온수로 강하게 세척하였다. 이후, 술폰화된 마이크로구형체를 에탄올로 3회 세척하고 진공 하에서 건조하였다(1.1 g).
(3) 술폰화된 마크로다공성 PS-DVB 비드의 자성화
술폰화된 마크로다공성 PS-DVB 비드(500 mg)를 기계적 교반(200 rpm)하면서 실온에서 탈이온수(10 mL)에 분산시키고 질소 퍼징(purging)하였다. 즉시 제조된, 탈이온수(10 mL) 중의 FeCl3·6H2O(618 mg, 2.26 mmol) 및 FeCl2·4H2O(257 mg, 1.28 mmol)의 혼합물을 분산액에 첨가하여 흡착시켰다. 2 시간 후에, 교반을 계속하면서 28% 수산화암모늄(50 mL)을 비드 현탁물에 40 분 동안 점적하였다. 자성화된 마이크로구형체를 원심분리에 의해 혼합물로부터 분리한 후 25% TFA로 세척한 다음 탈이온수 및 에탄올로 강하게 세척하였다. 최종적으로, 상기 자성화된 마이크로구형체를 진공 하에서 건조시켰다(자성화된 마이크로구형체, 7.5 μm, 653 mg).
(4) 아민화 및 실리카 코팅된 자성 비드의 제조
APTS[(3-아미노피롤)트리에톡시실란, (3-aminopropyl)triethoxysilane] 용액(1 %(v/v), 100 mL)을 술폰화된 PS-DVB 자성 비드 100 mg에 첨가하여 실온에서 10분 동안 혼합하였다. 이후, 비드 분산액에 수산화암모늄(28%, 2 mL)을 첨가하고, 실온에서 20분 동안 혼합하였다. 상기 분산액에 TEOS[테트라에틸오르토실리케이트(Tetraethylorthosilicate), 2 mL]를 첨가하여 실온에서 12 h 동안 격렬히 흔들었다. 얻어지 비드(실리카 코팅된 자성 비드)를 자석으로 수집하여 에탄올로 5회 세척하였다. 실리카 코팅된 자성 비드(100 mg)를 무수에탄올(absolute ethanol, 50 mL)에 분산시켰다. 얻어진 실리카 코팅된 자성 비드 용액에 APTS(0.5 mL) 및 NH4OH(0.5 mL)를 첨가하고, 아민 그룹으로 표면을 수식하기 위하여 분산된 용액을 180 rpm에서 6 시간 동안 회전시켰다. 아민화 및 실리카 코팅된 자성 비드를 자석으로 모아서 에탄올로 수회 세척하였다.
2.2 GO-수식된 자성 비드의 제조
(1) 실리카 쉘이 코팅된 자성 비드의 GO 수식
산화그래핀(300 mg)을 증류수에 분산시켜 9시간 동안 얼음 배스에서 100 m/min에서 초음파 처리하였다(10초 동안 펄스 온-20초 동안 펄스 오프). 이 후, 산화그래핀 용액을 0.45 μm 막으로 여과하여 큰 산화그래핀을 제거하였다. 산화그래핀 용액(150 mg)에 안정화제로서 PVP-40(300 mg)을 첨가하였다. 1 시간 동안 카르복실 그룹을 활성화하기 위하여 EDC(200 mg) 및 NHS(200 mg)을 산화그래핀에 첨가하였다. 이후, 아민화 및 실리카 코팅된 자성 비드(50 mg)를 활성화된 산화그래핀에 점적하고 하룻밤 동안 회전시켰다. GO-수식된 자성 비드를 자석으로 모아서 물 및 에탄올로 수회 세척하였다.
(2) 실리카 쉘이 없는 자성 비드의 GO 수식
산화그래핀(300 mg)을 증류수에 분산시켜 9시간 동안 얼음 배스에서 100 m/min에서 초음파 처리하였다(10초 동안 펄스 온-20초 동안 펄스 오프). 이 후, 산화그래핀 용액을 0.45 μm 막으로 여과하여 큰 산화그래핀을 제거하였다. APTS[(3-아미노피롤)트리에톡시실란, (3-aminopropyl)triethoxysilane] 용액(1 %(v/v), 100 mL)과 상기 준비한 산화 그래핀을 술폰화된 PS-DVB 자성 비드 100 mg에 첨가하여 실온에서 하룻밤 동안 혼합하였다. GO-수식된 자성 비드를 자석으로 모아서 물 및 에탄올로 수회 세척하였다.
2.3 세포 배양 및 GO-수식된 자성 비드에 의한 세포성 RNA 분획
비-소세포 폐암 세포(Non-small cell lung cancer cell, NSCLC)인 A549을 DMEM 배지(supplemented with 10% fetal bovine serum 및 1% penicillin/streptomycin) 중에서 37 ℃, 5% CO2 조건으로 배양하였다. 총 RNA를 추출하기 위해서, 1ⅹ105 세포를 수집하여 초음파 처리(Vibra-cell, Sonics & Materials Inc., Newtown, CT; pulse on for 5 s 및 off for 10 s, 3 times at 20% amplitude)하여 용균시켰다. RNA를 산-페놀:클로로포름(pH 4.5, Ambion, Austin, TX, USA) 추출에 의해 세포 잔해물(debris)로부터 분리하였고, 상기 RNA에 다양한 양의 GO-수식된 자성 비드를 첨가하였다. 실온에서 15분간 인큐베이션한 후, RNA-GO-수식된 자성 비드 복합체를 자석으로 30초 동안 비결합 RNA(상층액 1, Sup. 1)로부터 분리하였다. 그 후, 펠렛(GO-수식된 자성 비드)에 8M 유레아 20 μL를 첨가하여 실온에서 10분 동안 추가로 인큐베이션하였다. 그 후, 비결합 RNA(상층액 2, Sup. 2)를 GO-수식된 자성 비드(펠렛)로부터 분리하고, 각 분획을 15% 변성 유레아-PAGE로 분석하여 에티디움 브로마이드(ethidium bromide) 염색으로 RNA를 시각화하였다.
miRNA(마이크로RNA, microRNA) 추출을 위하여, RNA 올리고핵산(oligonucleotide, miRNA21, 5'-UAG CUU AUC AGA CUG AUG UUG A-3')을 화학적으로 합성하였고(ST Pharm Co. Ltd., Seoul, Korea), HPLC 및 폴리아크릴아미드 겔 전기영동(polyacrylamide gel electrophoresis, PAGE)으로 정제하였다. 합성된 RNA를 T4 폴리뉴클레오타이드키나제(T4 polynucleotide kinase, New England Biolabs, Beverly, MA, USA)에 의해 [γ-32P] ATP(250 μCi, PerkinElmer, Waltham, MA, USA)로 5'-말단-표지화하였다. 5'-말단-표지화된 miRNA21(5 nM)을 실온에서 15분 동안 다양한 양의 GO-수식된 자성 비드와 인큐베이션하였다. miRNA21-GO-수식된 자성 비드 복합체를 자석으로 30초 동안 비결합 RNA(상층액, Sup.)로부터 분리하였다. 각 분획을 15% 변성 유레아-PAGE로 분석하였다. 겔 상의 RNA의 방사능을 포스포르이미저 스크린(phosphorimager screen)에 노출시켜 사이클론 포스포르이미저(Cyclone PhosphorImager, PerkinElmer)로 측정하였다.
3. 결과
3.1 GO-수식된 자성 비드의 특성 분석
GO-수식된 자성 비드의 제조 과정을 도 1에 나타내었다. 즉, 균일한 다공성 마이크로비드의 자성화, 이후의 실리카 층의 코팅 및 GO의 컨쥬게이션을 이용하는 방법을 적용하였다. 도 1에 나타난 바와 같이, 단분산 초상자성 마이크로비드는 자성화된 코어 PS-DVB 비드에 실리카 층으로 둘러싸인 구형(spherical) 코어-쉘(core-shell) 구조를 갖는다. 단분산 폴리스티렌-다이비닐벤젠(PS-DVB) 비드(7.5 μm, cross-linked with 33% DVB)를 선행문헌에 보고된 시드 중합법을 이용하여 제조하였다. PS 시드는 4.0~4.2 μm(61% 고체 수율) 범위로 제조되었고, 분자량은 29,000(GPC 분석으로 측정)였다.
최종 PS-DVB 비드는 포로겐(porogen)으로서 DBP 및 활성화된 팽윤제를 사용하여 시드(4 μm, 2.5 g, 47% 고체 수율)의 중합화로 제조되었다. PS-DVB 마이크로비드는 그 자체로서는 수성 용액에서 제1철(ferrous) 및 제2철(ferric) 염을 흡착하기에 적합하지 않다. 따라서, PS-DVB 마이크로비드 상에 술포네이트(sulfonate) 그룹을 도입하여 수성 용액 중에서 PS-DVB 마이크로비드가 혼화될 수 있도록 하였으며, 술포네이트 그룹의 영향으로 철 염이 마이크로비드에 도입되어 상당한 내부적 결합이 형성된 것으로 보인다. 최근 보고에 따르면, 술폰산 및 아세트산을 이용한 0.27~2.63 mmol/g 범위의 -SO3H 로딩(loading)으로 술폰화된 PS-DVB를 용이하게 제조하였다. 수산화암모늄의 과량의 염기성 용액 중에서 제1 철이온(ferrous ion) 및 제2 철이온(ferric ion)(2:1 mol 비율)의 혼합물로 술폰화된 PS-DVB 마이크로비드를 자성화한 후에, 거무스름한 빛으로 변하였으므로 비드에서뿐만 아니라 용액에서도 자철석(magnetite)의 침전물이 관찰되었다.
얻어진 비드의 포화 자성화 수치는 7.6 emu/g였고, 이는 상업적 자철석(~70 emu/g)의 값보다는 비교적 낮은 것이다. 그러나, 자성화된 비드는 강한 자성 성질을 나타내어 4,000 가우스(gauss) 자석으로 4초 내에 용매로부터 충분히 분리될 수 있다. 자성화된 술폰화된 PS-DVB 마이크로비드는 중합체 매트릭스 상에 또는 내부에 내포되는, 다수의 독립적인 수십 nm의 산화철(iron oxide) 알갱이를 포함하고 있으며, 이는 이들의 초상자성 거동으로 이어질 수 있다(도 2A 및 도 3A).
자성 비드는, 그 표면이 물과 혼화되고 기능성 실란 화합물의 다양한 형태를 이용하는 화학적 수식이 용이하도록 APTS 및 테트라에톡시오르토실리케이트(TEOS)를 이용하여 실리카 쉘로 코팅되었다. 아미노 실란 화합물 APTS은 음전하로 하전된 술폰화된 비드 상에 실란 층의 부착(adhesion)을 촉진시키는 경향이 있으며, 이로써 표면으로부터 TEOS의 추가적인 염기-촉매화(base-catalyzed) 응축(condensation)을 용이하게 한다. 이러한 전처리가 실리카 코팅 효율을 비-전처리 및 (3-머캅토프로필)트리에톡시실란[(3-mercaptopropyl)triethoxysilane] 용액에 비하여 현저히 상승시킨 것으로 확인되었다.
비드의 표면 형태는 졸-겔 공정 후에 뚜렷이 변화되었으며(도 2B 및 도 3B), 이로써 표면에 실리카 알갱이가 형성된 것을 나타냈다. 횡단면 분석에 의해, 실리카 쉘이 코어 자성 비드를 감싸고 있는 것으로 관측되었다(도 4A,(i)). 실리카 코팅된 자성 비드는 균일한 크기였고, 그램(gram) 단위로 얻을 수 있었다.
자성 비드 상에 실리카 코팅이 존재함을 확인하기 위하여, 술폰화된 PS-DVB, 자성 PS-DVB 및 실리카 코팅된 자성 PS-DVB 비드에 대하여 EDX 분석을 수행하여 그 결과를 도 5에 나타내었다. 술폰화된 PS-DVB 비드는 C, O 및 S 성분을 포함하였고, 원자 조성(atomic composition)은 각각 86.5%, 9.1% 및 4.4%였다. 술폰화된 PS-DVB 비드에 자성 나노입자가 침착된 후에, O 성분이 20.3%까지 증가한 반면에 C 성분이 67.2%로 현저히 감소하였다. 특히, Fe 성분의 5.7% 존재로써 술폰화된 PS-DVB 비드 상에 자성 나노입자가 성공적으로 침착되었음을 확인하였다. 실리카 쉘이 자성 PS-DVB 비드에 코팅된 후에는, 실리카 코팅된 자성 PS-DVB 비드는 C(50.3%), O(33.3%), S(5.9%), Fe(3.8%) 및 Si(6.7%) 성분을 포함하였다. 자성 PS-DVB 비드에 비하여 실리카 코팅된 자성 비드의 O 성분은 13% 증가하였으며, 이는 Si 성분의 약 2배에 해당하므로, 자성 PS-DVB 비드의 표면에 SiO2가 존재하는 것을 시사하였다. 따라서, EDX 데이터는 TEM 사진과 일치하였으며, 자성 PS-DVB 비드 표면 상에 실리카 쉘이 성공적으로 침착되었음을 입증하였다.
다음으로, 암모늄(ammonium) 존재 하에서 APTS와 인큐베이션함으로써 실리카 코팅된 자성 비드의 표면을 아민 그룹으로 기능화하였다. 아민화 및 실리카 코팅된 자성 비드의 표면은 도 4A-(i)에 나타나 있다. 아민화 및 실리카 코팅된 자성 비드의 표면은 작은 자성 입자 및 실리카 입자로 둘러싸여 있다. 도 4B-(i)에서의 횡단면 TEM 사진에 의하면 자성 입자 및 실리카 입자의 두께는 약 20-30 nm인 것으로 나타났다.
한편, GO의 카르복실 그룹은 EDC/NHS로 활성화시켰다. 이후, 아민화 및 실리카 코팅된 자성 비드를 활성화된 GO에 점적하였다. 아민화 및 실리카 코팅된 자성 입자의 표면에 GO가 존재한다는 것은 도 4A-(ii)로 확인되었다. 아민화 및 실리카 코팅된 자성 비드와는 상이하게, GO 수식된 자성 비드의 표면은 거칠어졌고, 이는 수성 용액에서 실리카의 용해에 기인한 것으로 추정된다(도 2). 특히, GO 수식된 자성 비드는 부분적으로 주름있는 물질로 덮여 있었고, 이는 GO가 성공적으로 아민화 및 실리카 코팅된 자성 비드의 표면에 덮여졌다는 것을 시사한다. 실제로, 도 4B-(ii)에서의 횡단면 TEM 사진은 아민화 및 실리카 코팅된 자성 비드의 표면 상에 GO의 존재를 나타낸다. GO의 두께는 약 10 nm였다. 그러나, 도 4B-(ii)의 삽입도에 나타난 바와 같이, GO 두께는 GO 수식된 자성 비드의 표면 상에서 불균일하였다.
아민화 및 실리카 코팅된 자성 비드에 GO의 컨쥬게이션 여부를 확인하기 위하여, 상기 제조된 물질의 기능성 그룹을 감쇄 전반사 퓨리에 변환 적외선 스펙트럼(ATR-FTIR)로 분석하였다. GO, 아민화 및 실리카 코팅된 자성 비드 및 GO 수식된 자성 비드의 스펙트럼을 도 4C 및 도 6에 나타내었다. GO 중의 다양한 산소 기능기가 존재하고 있음이 발견되었다. 3000-3700 cm- 1 의 폭넓은(broad) 밴드 및 높은 흡광 강도(absorbance intensity)는 히드록실 그룹(-OH)의 신축(stretching)에 의한 것이다. 2920 및 2850 cm-1의 선명한 밴드에 의해 sp2 혼성화 C-C의 존재를 확인하였다. GO의 비결합 카르보닐 그룹(COOH)은 1720(C=O의 신축) 및 1360 cm-1(카르복시 C-O의 신축)에서 나타났다. GO C-C의 방향족 고리(aromatic ring)는 1620 cm-1에서 나타났다. 1217, 1040-1060 cm-1에서의 밴드는 각각 GO의 에폭시(C-OH) 및 알콕시(C-O)의 존재를 시사한다. 아민화 및 실리카 코팅된 자성 비드의 스펙트럼은 3000-3700, 2920, 2850, 1625, 1600, 1560, 1510, 1490, 1450, 1410, 1327, 1150, 1120 cm-1에서 얻어졌지만, 이는 실리카 코팅된 자성 비드의 표면 상에 APTS의 존재를 시사한다. 1625 및 1600 cm-1 근처의 진동 모드는 아민 중탄산 염의 산화에 의해 생성된 이민(imine) 그룹의 존재를 나타낸다. 또한, 실리카 코팅된 자성 비드의 표면 상의 아민은 공기중의 CO2와 반응하여 중탄산염 형태를 형성할 수 있으며, 결과적으로 1560, 1490 및 1327 cm-1에서의 진동 모드로 나타날 수 있다. APTS의 에톡시 모이어티(moiety) 유래 CH3 그룹의 비대칭 및 대칭 변형 모드는 각각 1450 및 1410 cm-1 근처에서 나타났고, 이는 APTS 내 에톡시 그룹의 존재를 시사한다. 1510 cm-1에서의 모드의 존재는 APTS 필름 내 아미노 그룹의 거의 모두가 정전기적(electrostatic) 상호작용 및/또는 수소 결합을 통하여 표면 실라놀(silanol)과 연결되었음을 암시한다. 마지막으로, 1120, 1010 및 960 cm-1에서의 밴드는 SiO2의 존재를 암시한다. 아민화 및 실리카 코팅된 자성 비드의 표면에 GO가 컨쥬게이션된 후에, GO-수식된 자성 비드의 밴드는 아민화 및 실리카 코팅된 자성 비드의 것과 유사하였고, 이는 전술한 바와 같이(도 4C-(i)), GO가 자성 비드의 표면 상에서 부분적으로 덮여졌기 때문이다. 1600-1650 cm-1에서의 밴드는 강도가 세고 폭넓게 되었으며, 이는 아미드 I의 형성을 암시하였다(도 4C-(ii)). 아미드 II의 진동은 1513 및 1525 cm-1 범위에서 나타났다. 또한, 2개의 신규 밴드가 1030 및 1050 cm-1에서 나타났으며, 이는 GO의 에폭시(C-OH) 및 알콕시(C-O)의 존재를 시사한다. 따라서, GO는 아민화 및 실리카 코팅된 자성 비드에 성공적으로 컨쥬게이션되었음이 확인되었다.
다음으로, 아민화 및 실리카 코팅된 자성 비드와 컨쥬게이션하는 GO의 농도는 도 7 및 도 8에서 최적화되었다. 낮은 농도에서는, GO는 자성 비드에 거의 컨쥬게이션되지 않았으나, 보다 높은 농도(>150 mg)에서는 GO가 아민화 및 실리카 코팅된 자성 비드의 표면을 수식하기 시작하는 것이 뚜렷이 나타났다. 따라서, 추가 연구는 GO 150 mg에서 수행하였다.
GO 수식된 자성 비드의 자성화 여부를 분석하였고, 그 결과를 도 4D 및 도 8에 나타내었다. 아민화 및 실리카 코팅된 자성 비드의 포화 자성화 수치는 5.0 emu/g였고, 이는 자성 비드의 표면 상의 실리카 코팅으로 인하여 자성 비드의 자성화(7.6 emu/g)보다는 낮은 값이다. 그러나, 아민화 및 실리카 코팅된 자성 비드 상에 GO가 컨쥬게이션되면 포화 자성화 수치는 5.2 emu/g로 약간 증가되었으며, 이는 전술한 바와 같이 수성 용액 중에서 자성 비드의 표면 상 실리카 층의 용해에 기인한 것이다.
3.2 GO-수식된 자성 비드를 이용한 RNA 추출
DMEM 배지(supplemented with 10% fetal bovine serum 및 1% penicillin/streptomycin) 중에서 37 ℃, 5% CO2 조건으로 배양된 비-소세포 폐암 세포(NSCLC)인 A549의 용균액으로부터 RNA를 추출하기 위하여 GO-수식된 자성 비드를 사용하였다. RNA를 15분 동안 인큐베이션하여 아민화 및 실리카 코팅된 자성 비드 및 GO-수식된 자성 비드의 표면에 흡착되도록 하였다. 30초간 자석을 이용하여 비결합 RNA(상층액 1, Sup. 1)로부터 RNA-GO-수식된 자성 비드 복합체를 분리하고, RNA의 해리를 위하여 GO-수식된 자성 비드에 유레아를 첨가하였다. 추가 인큐베이션한 후에, 비결합 RNA(상층액 2, Sup. 2)를 GO-수식된 자성 비드(펠렛)으로부터 분리하였고, 각 분획을 15% 변성 유레아-PAGE로 분석한 다음, RNA를 에티디움 브로마이드 염색으로 시각화하였다. RNA 추출 결과를 도 9A에 나타냈다.
아민화 및 실리카 코팅된 자성 비드를 흡착제로 사용하면, 대부분의 RNA가 상층액(상층액 1, Sup.1)에 남아 있고, PAGE에서는 RNA가 거의 나타나지 않았다(도 9A-(i)). 이와는 대조적으로, 용균액으로부터 RNA를 추출하기 위하여 GO-수식된 자성 비드를 사용하였을 때는 5S, 18S 및 28S 리보솜 RNA의 밴드가 뚜렷이 나타났으며, 이는 RNA가 용액으로부터 추출되었음을 의미한다. 그러나, 상기 밴드는 비교적 선명하지 못하였다. 본 발명 물질의 흡착 성능을 확인하기 위하여, [γ-32P] ATP로 5'-말단 표지화된 miRNA21를 사용하였다. 아민화 및 실리카 코팅된 자성 비드 및 GO-수식된 자성 비드에 의해 추출된 RNA의 방사능은 포스포르이미저 스크린에 노출시켜 사이클론 포스포르이미저로 측정하였다. 도 9A-(ii)에 나타난 바와 같이, 아민화 및 실리카 코팅된 자성 비드 및 GO-수식된 자성 비드 모두 용액으로부터 RNA를 추출할 수 있는 것으로 확인되었다. 특히, GO-수식된 자성 비드에 의해 추출된 RNA의 양은 아민화 및 실리카 코팅된 자성 비드에 의한 값보다 컸다. 특히, GO-수식된 자성 비드 농도가 증가함에 따라 miRNA 밴드가 커졌으며, 이는 사용된 GO-수식된 자성 비드 농도가 높아짐에 따라 용액으로부터 추출된 miRNA의 양이 증가되었음을 시사한다.
또한, GO-수식된 자성 비드에의 RNA의 결합 및 유레아에 의한 RNA의 해리라는 용이한 시험 과정을 이용하여 GO-수식된 자성 비드를 세포로부터의 총 RNA 추출에 적용하였다. 세포를 용균시킨 후에, GO-수식된 자성 비드 농도를 10 mg/mL까지 증가시켜 세포의 총 RNA를 분획하였다(도 9B). GO-수식된 자성 비드을 10 mg/ml 농도로 사용하였을 때, 추출된 RNA의 양은 대조군(TRIZOL)의 수치에 비하여 약 1.7배 많았다. 또한, GO-수식된 자성 비드로 추출된 총 RNA 중에서 18S 및 28S 리보솜 RNA 수치보다는 5S 리보솜 RNA의 양이 더 많은 것으로 나타났으며, 이로써 GO-수식된 자성 비드는 구아니디늄 티오시안산염을 사용하는 통상적인 RNA 추출 방법에 비하여 소규모 RNA 분자를 추출하기에 적합하다는 것이 확인되었다. 따라서, GO-수식된 자성 비드를 사용하는 상기 방법은 세포 내 존재하는 miRNA와 같은 소분자 RNA의 추출에 활용될 수 있을 것이다. 이동성 고체상 입자 후보로서 GO-수식된 자성 비드를 사용하는 RNA 분리가 성공적으로 수행되었으므로, 상기 방법은 생명공학 분야에서 단일 가닥 DNA 또는 RNA를 정제하기 위한 간단하고 편리한 방법으로 활용될 것이다.
4. 결론
용균 세포로부터 RNA를 분리하기 위하여 GO 수식된 자성 비드를 개발하였다. 먼저, 시드 에멀젼 중합화 및 이후의 아세트산/H2SO4 술폰화에 의하여 자성 비드를 합성하였다. 상기 제조된 술폰화된 마크로다공성 비드를 염기성 조건 하에서 Fe2 +/Fe3 + 존재 하에 자성화하고, 실리카 코팅을 거친 후에, 졸-겔 공정에 의해 APTS로 아민화하였다. 이후, GO를 EDC/NHS로 활성화시켜 아민화 및 실리카 코팅된 자성 비드와 컨쥬게이션시켰다. SEM 및 TEM 사진, EDX, ATR-FTIR, 히스테리시스 곡선 기술로 실리카 코팅된 자성 비드의 표면에 GO의 존재를 확인하였다. 상기 제조된 물질은 용균된 세포에서 RNA를 분리하기 위하여 활용될 수 있다. GO-수식된 자성 비드는 생체물질에서 RNA를 직접적으로 분리하기 위하여 사용되는 이동성 고체상 입자 후보로서 사용될 수 있다. GO-수식된 자성 비드(10 mg/ml)로 추출된 RNA 양은 대조군(TRIZOL) 값에 비하여 약 1.7배 높았다. 따라서, GO-수식된 자성 비드는 생명공학 분야에서 단일 가닥 DNA 또는 RNA를 정제하기 위한 간단하고 편리한 방법으로 활용될 것이다.

Claims (12)

  1. (a) 다공성 폴리스티렌-다이비닐벤젠 비드를 술폰화하는 단계;
    (b) 단계(a)에서 얻어진 상기 술폰화된 비드에 제1철(ferrous) 염, 제2철(ferric) 염 및 이들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택된 하나를 흡착시켜 자성화하는 단계;
    (b-1) 단계(b)에서 얻어진 상기 자성화된 비드를 아민화 및 실리카 코팅하는 단계; 및
    (c) 단계(b-1)에서 얻어진 아민화 및 실리카 코팅된 자성 비드 1 중량부에 대하여 산화그래핀 3 중량부 이상의 비율로 반응시키는 단계
    를 포함하는 제조방법에 의해 제조된, 산화그래핀으로 수식된 실리카 코팅층을 갖는 자성 비드.
  2. 제1항에 있어서, 상기 비드가 직경 0.001 - 10,000 μm인 것을 특징으로 하는 자성 비드.
  3. 제1항에 있어서, 상기 비드가 분자량 103 - 1012인 것을 특징으로 하는 자성 비드.
  4. 제1항에 있어서, 상기 자성 비드가 자성화 수치 0.1 - 1,000 emu/g인 것을 특징으로 하는 자성 비드.
  5. 삭제
  6. 제1항에 있어서, 상기 실리카 코팅층이 두께 10-4 - 104 μm인 것을 특징으로 하는 자성 비드.
  7. 제1항에 있어서, 상기 산화그래핀이 두께 10-4 - 104 μm인 것을 특징으로 하는 자성 비드.
  8. 삭제
  9. 삭제
  10. (ⅰ) 핵산을 포함하는 시료 및 제1항 내지 제4항 및 제6항 내지 제7항 중 어느 한 항의 자성 비드를 혼합하여 인큐베이션하는 단계;
    (ⅱ) 단계 (ⅰ)의 상기 혼합물로부터 자석으로 핵산-비드 복합체를 분리하는 단계; 및
    (ⅲ) 단계 (ⅱ)의 상기 핵산-비드 복합체에 유레아를 첨가하여 핵산과 비드를 해리시키는 단계
    를 포함하는 단일 가닥 핵산의 분리방법.
  11. 제10항에 있어서, 단계(ⅰ)의 상기 자성 비드가 농도 10-3 - 103 mg/ml로 혼합되는 것을 특징으로 하는 분리방법.
  12. 제10항에 있어서, 상기 단일 가닥 핵산이 5S 리보솜 RNA, 18S 리보솜 RNA 및 28S 리보솜 RNA로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상인 것을 특징으로 하는 분리방법.
KR1020160149504A 2016-11-10 2016-11-10 산화그래핀으로 수식된 자성 비드, 이의 제조방법 및 이를 이용한 핵산의 분리방법 Active KR101800004B1 (ko)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020160149504A KR101800004B1 (ko) 2016-11-10 2016-11-10 산화그래핀으로 수식된 자성 비드, 이의 제조방법 및 이를 이용한 핵산의 분리방법

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020160149504A KR101800004B1 (ko) 2016-11-10 2016-11-10 산화그래핀으로 수식된 자성 비드, 이의 제조방법 및 이를 이용한 핵산의 분리방법

Publications (1)

Publication Number Publication Date
KR101800004B1 true KR101800004B1 (ko) 2017-11-21

Family

ID=60808745

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020160149504A Active KR101800004B1 (ko) 2016-11-10 2016-11-10 산화그래핀으로 수식된 자성 비드, 이의 제조방법 및 이를 이용한 핵산의 분리방법

Country Status (1)

Country Link
KR (1) KR101800004B1 (ko)

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR102076567B1 (ko) * 2018-10-31 2020-02-12 한국세라믹기술원 효소를 고정할 수 있는 go/peg 자성 비드 및 그 제조방법
CN113995444A (zh) * 2021-11-03 2022-02-01 深圳大学 一种水凝胶微针贴片及其制备方法与应用
CN114093586A (zh) * 2021-11-11 2022-02-25 苏州海狸生物医学工程有限公司 一种聚合物包覆磁性微球及其制备方法
CN116035338A (zh) * 2022-10-11 2023-05-02 成都中医药大学 一种白芷珠保健产品及其制备方法

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR101442418B1 (ko) * 2013-06-19 2014-09-22 건국대학교 산학협력단 산화그래핀 및 요소를 이용한 핵산의 분리방법
US20150246128A1 (en) 2012-10-04 2015-09-03 Xinyan Cui Conductive polymer graphene oxide composite materials

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20150246128A1 (en) 2012-10-04 2015-09-03 Xinyan Cui Conductive polymer graphene oxide composite materials
KR101442418B1 (ko) * 2013-06-19 2014-09-22 건국대학교 산학협력단 산화그래핀 및 요소를 이용한 핵산의 분리방법

Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR102076567B1 (ko) * 2018-10-31 2020-02-12 한국세라믹기술원 효소를 고정할 수 있는 go/peg 자성 비드 및 그 제조방법
CN113995444A (zh) * 2021-11-03 2022-02-01 深圳大学 一种水凝胶微针贴片及其制备方法与应用
CN113995444B (zh) * 2021-11-03 2024-05-07 深圳大学 一种水凝胶微针贴片及其制备方法与应用
CN114093586A (zh) * 2021-11-11 2022-02-25 苏州海狸生物医学工程有限公司 一种聚合物包覆磁性微球及其制备方法
CN116035338A (zh) * 2022-10-11 2023-05-02 成都中医药大学 一种白芷珠保健产品及其制备方法

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US10816546B2 (en) Binding a target substance
Sosa-Acosta et al. Iron Oxide Nanoparticles (IONPs) with potential applications in plasmid DNA isolation
US10724031B2 (en) Highly active silica magnetic nanoparticles for purifying biomaterial and preparation method thereof
US10125199B2 (en) Manufacture of magnetic particles
US7868145B2 (en) Magnetic particles containing a copolymer core, magnetic layer and silicon layer
Rittich et al. SPE and purification of DNA using magnetic particles
KR101800004B1 (ko) 산화그래핀으로 수식된 자성 비드, 이의 제조방법 및 이를 이용한 핵산의 분리방법
US20110054162A1 (en) Silica Magnetic Particles Having a Spherical Form and a Process for Preparing the Same
JP2002543979A (ja) ｐＨ依存型イオン交換マトリックス及び核酸の単離におけるその使用法
Maciel et al. Magnetic extraction and purification of DNA from whole human blood using a γ-Fe2O3@ Chitosan@ Polyaniline hybrid nanocomposite
Pham et al. Graphene oxide conjugated magnetic beads for RNA extraction
Xu et al. Aptamer-enhanced fluorescence determination of bisphenol A after magnetic solid-phase extraction using Fe 3 O 4@ SiO 2@ aptamer
Ji et al. Development of boronic acid-functionalized mesoporous silica-coated core/shell magnetic microspheres with large pores for endotoxin removal
KR20100070171A (ko) 단백질 분리용 나노입자, 그 제조 방법 및 이를 이용한 단백질 분리 정제 방법
Demir et al. Reversible immobilization of BSA on Cu-chelated PAMAM dendrimer modified iron oxide nanoparticles
KR100762969B1 (ko) 기능성 실리카 코팅 자성 나노입자를 이용한 고효율의 핵산및 단백질의 선택적 분리정제 방법
JP2006327962A (ja) 目的物質の分離方法および分子コンプレックス
JP4911280B2 (ja) 有機ポリマー粒子およびその製造方法
KR20070018501A (ko) 고순도 및 고용량으로 ｄｎａ를 분리 정제할 수 있는아미노 치환기를 가지는 실리카 코팅 자성나노입자와 그의제조방법
JP4903449B2 (ja) 磁性複合体およびその製造方法、マンノースを表面に有する物質の除去方法及びマンノースを表面に有する物質の濃縮方法
Elaissari Reactive polymer based colloids for biomedical applications
HK40057097A (en) Highly active silicon dioxide magnetic nanoparticles for purifying biomaterial and preparation method thereof
AU2003244985B2 (en) Remanent magnetic paricles capable of binding a target substance, their production and uses thereof
CN120577379A (zh) 溶菌酶表面印迹磁性微球、制备及电化学分析方法
CN103990443B (zh) 一种单链dna核酸修饰壳聚糖磁性微球的制备方法

Legal Events

Date Code Title Description
PA0109 Patent application

St.27 status event code: A-0-1-A10-A12-nap-PA0109

PA0201 Request for examination

St.27 status event code: A-1-2-D10-D11-exm-PA0201

D13-X000 Search requested

St.27 status event code: A-1-2-D10-D13-srh-X000

D14-X000 Search report completed

St.27 status event code: A-1-2-D10-D14-srh-X000

PE0902 Notice of grounds for rejection

St.27 status event code: A-1-2-D10-D21-exm-PE0902

T11-X000 Administrative time limit extension requested

St.27 status event code: U-3-3-T10-T11-oth-X000

E13-X000 Pre-grant limitation requested

St.27 status event code: A-2-3-E10-E13-lim-X000

P11-X000 Amendment of application requested

St.27 status event code: A-2-2-P10-P11-nap-X000

P13-X000 Application amended

St.27 status event code: A-2-2-P10-P13-nap-X000

P22-X000 Classification modified

St.27 status event code: A-2-2-P10-P22-nap-X000

E701 Decision to grant or registration of patent right
PE0701 Decision of registration

St.27 status event code: A-1-2-D10-D22-exm-PE0701

GRNT Written decision to grant
PR0701 Registration of establishment

St.27 status event code: A-2-4-F10-F11-exm-PR0701

PR1002 Payment of registration fee

St.27 status event code: A-2-2-U10-U11-oth-PR1002

Fee payment year number: 1

PG1601 Publication of registration

St.27 status event code: A-4-4-Q10-Q13-nap-PG1601

PR1001 Payment of annual fee

St.27 status event code: A-4-4-U10-U11-oth-PR1001

Fee payment year number: 4

PR1001 Payment of annual fee

St.27 status event code: A-4-4-U10-U11-oth-PR1001

Fee payment year number: 5

PR1001 Payment of annual fee

St.27 status event code: A-4-4-U10-U11-oth-PR1001

Fee payment year number: 6

PR1001 Payment of annual fee

St.27 status event code: A-4-4-U10-U11-oth-PR1001

Fee payment year number: 7

R18-X000 Changes to party contact information recorded

St.27 status event code: A-5-5-R10-R18-oth-X000

PN2301 Change of applicant

St.27 status event code: A-5-5-R10-R13-asn-PN2301

St.27 status event code: A-5-5-R10-R11-asn-PN2301

R18-X000 Changes to party contact information recorded

St.27 status event code: A-5-5-R10-R18-oth-X000

PR1001 Payment of annual fee

St.27 status event code: A-4-4-U10-U11-oth-PR1001

Fee payment year number: 8

R18-X000 Changes to party contact information recorded

St.27 status event code: A-5-5-R10-R18-oth-X000

R18-X000 Changes to party contact information recorded

St.27 status event code: A-5-5-R10-R18-oth-X000

R18 Changes to party contact information recorded

Free format text: ST27 STATUS EVENT CODE: A-5-5-R10-R18-OTH-X000 (AS PROVIDED BY THE NATIONAL OFFICE)

R18-X000 Changes to party contact information recorded

St.27 status event code: A-5-5-R10-R18-oth-X000