KR101726814B1 - 새우말 추출물을 유효성분으로 함유하는 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 새우말(Phyllospadix iwatensis Makino) 추출물을 유효성분으로 함유하는 조성물에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 새우말 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 함유하는 약학, 식품 및 화장료 조성물과 이들의 용도에 관한 것이다. 본 발명의 새우말 추출물은 피부에 안전하고, 인간 티로시나아제 활성 억제효과가 현저하여 이로 인한 멜라닌 생성 억제 및 피부 미백 효과가 뛰어나다.

Description

새우말 추출물을 유효성분으로 함유하는 조성물{Composition comprising Phyllospadix iwatensis Makino extract}

본 발명은 새우말(Phyllospadix iwatensis Makino) 추출물을 유효성분으로 함유하는 조성물에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 새우말 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 함유하는 약학, 식품 및 화장료 조성물과 이들의 용도에 관한 것이다.

일반적으로 피부의 과색소침착은 체내 호르몬 이상, 유전적인 질환 등 자외선과 상관없이 발생하는 내적요인에 의한 경우와, 과도한 자외선 조사에 의해 멜라닌(melanin) 색소 과잉 합성 및 분포 이상인 외적요인에 의한 경우를 포함하고 있다. 피부에 존재하는 적정량의 멜라닌(melanin) 색소는 피부를 건강하게 유지시켜주기도 하고 자외선(UV)을 흡수하는 등 긍정적인 면이 있으나 과잉의 멜라닌(melanin) 색소는 피부를 검게 보이고, 피부색을 불균일하게 한다. 또한, 상기 멜라닌(melanin)의 과잉 생성은 흑화피부나 기미, 주근깨 등의 색소성 피부질환을 일으키므로 상기와 같은 질환을 개선, 치료하기 위하여 미백 성분에 관한 연구가 시작되었다.

피부의 색소침착에 주된 요인인 멜라닌은 피부의 표피에 존재하는 멜라노사이트라는 세포의 세포 내 소기관인 멜라노좀에서 여러단계의 산화반응을 거쳐 합성된다. 현상적으로는 티로시나아제(tyrosinase)라는 효소가 작용하고 뒤따르는 일련의 산화과정을 통해 멜라닌(melanin)이라는 중합체가 과량으로 만들어져 피부에 축적되는 것이다. 상기 티로시나아제(tyrosinase)는 아미노산의 일종인 티로신(tyrosine)을 멜라닌 중합체 생성의 중간산물인 도파(DOPA, 3,4-dihydro xyphenylalanine), 도파퀴논(DOPA-quinone, pheomelanin)으로 만드는 피부의 흑화과정에서 가장 중요하게 작용하는 효소이다. 상기와 같이 멜라닌(melanin) 생성 과정에서 타이로시나아제(tyrosinase)의 작용은 절대적이다. 따라서, 이 효소 단백질의 발현을 억제하거나 자외선에의해 자극되어 발현된 효소의 활성을 억제함으로써 멜라닌(melanin) 생성을 조절할 수 있으며, 이러한 효능을 가지는 기능성 소재들의 탐색이 이루어지고 있는 실정이다.

[비특허문헌 1]MIJIN KIM, SANG MI AN, JAE-SOOK KOH, DONG-IL JANG, and YONG CHOOL BOO, Use of non-melanocytic HEK293 cells stably expressing human tyrosinase for the screening of anti-melanogenic agents, J Cosmet Sci. 2011 Sep-Oct;62(5):515-23.

이에 본 발명자들은 멜라닌 생성 억제효과가 있는 천연물 소재를 연구하던 중, 해양식물인 새우말(Phyllospadix iwatensis Makino) 추출물이 인간 티로시나아제 활성을 억제하여 멜라닌 생성을 현저히 저해하는 것을 확인하고 본 발명을 완성하였다.

따라서 본 발명의 목적은 새우말 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 함유하는 멜라닌 과잉 축적에 기인한 피부 색소성 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 새우말 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 함유하는 멜라닌 과잉 축적에 기인한 피부 색소성 질환의 예방 또는 개선용 식품 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 새우말(Phyllospadix iwatensis Makino) 추출물 또는 이의 분획물; 및 피부학적으로 허용 가능한 부형제를 포함하는 화장료 조성물을 제공하는 것이다.

상기의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 새우말 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 함유하는 멜라닌 과잉 축적에 기인한 피부 색소성 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 새우말 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 함유하는 멜라닌 과잉 축적에 기인한 피부 색소성 질환의 예방 또는 개선용 식품 조성물을 제공한다.

본 발명의 또 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 새우말(Phyllospadix iwatensis Makino) 추출물 또는 이의 분획물; 및 피부학적으로 허용 가능한 부형제를 포함하는 화장료 조성물을 제공한다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명의 새우말 추출물은 인간 티로시나아제(tyrosinase) 활성 억제효과가 현저하며, 이로 인한 멜라닌 생성 억제 및 피부 미백 효과가 뛰어나다. 이와 같은 새우말 추출물의 신규한 용도는, 본 발명에서 최초로 공개하는 것이다.

따라서, 본 발명은 새우말(Phyllospadix iwatensis Makino) 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 함유하는 멜라닌 과잉 축적에 기인한 피부 색소성 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

새우말 (Phyllospadix iwatensis Makino)은 거머리말과(Zosteraceae)의 여러해살이 해초이다. 한국· 일본· 중국 등 주로 온대에 분포하는 여러해살이 해초로 바다의 수심 1-8m 되는 깊은 곳의 바위틈에서 자란다. 식물체는 땅속줄기로 기어가고 마디 사이가 짧으며 뭉쳐난다. 잎은 끝이 둥글고 길이 20-100cm, 나비 2-4.5㎜이다. 또한 3개의 잎맥이 세로로 뻗고 윗가장자리에 잔 톱니가 있으며 기부에는 잎집이 있어 넓어진다. 꽃은 3월에 피고 땅속줄기에서 포에 싸여 자라며 길이 10cm 정도이다. 꽃줄기는 길이 3cm 정도이다. 암수딴그루로서 암꽃은 작은 꽃줄기가 없는 1개의 씨방으로 되며, 수꽃은 꽃줄기가 없고 꽃가루주머니가 1실로 되어 있다. 열매는 심장형이며 길이와 나비가 4㎜ 정도이고 양 끝이 좁다. 꽃의 싹을 옆에서 보았을 때 새우와 비슷하기 때문에 새우말이라고 한다.

본 발명에서 상기 새우말은, 새우말을 구성하는 부위라면 어디든지 추출물 소재로 이용 가능한 것으로서, 이에 제한되지 않지만 예를들어 새우말의 전초(全草); 또는 열매, 잎, 꽃, 줄기 및 뿌리로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 것 을 이용하는 것일 수 있으며, 바람직하게 새우말의 뿌리, 줄기 및 잎을 이용하는 것 일 수 있다.

본 발명의 새우말 추출물은 공지의 천연물 추출방법에 의하여 추출될 수 있는 것으로서, 추출시 사용되는 추출용매의 종류는 당업계에 식물성분 추출 용매로서 알려진 것이라면 그 종류가 특별히 제한되지 않으나, 바람직하게는 물, 탄소수 1-6의 저급 알코올 (예. 메탄올, 에탄올, 프로판올, 부탄올, 펜탄올, 헥산올, 글리세린, 프로필렌글리콜 및 1,3-부틸렌글리콜 등), 탄소수 1-4개의 저급케톤 (예. 아세톤, 메틸에틸케톤 등), 탄소수 1-4개의 저급 에스테르 (예. 에틸 아세테이트 및 부틸 아세테이트 등), 아임계 유체 및 초임계 유체로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 용매에 의해 추출되는 것일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 물, 탄소수 1-6의 저급 알코올, 아세톤, 에틸아세테이트, 아임계 유체 및 초임계 유체로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 용매에 의해 추출되는 것일 수 있다. 가장 바람직하게는 물, 탄소수 1-4의 저급 알코올(특히 메탄올, 에탄올, 프로판올, 부탄올) 및 이들의 혼합물로 이루어지는 군에서 선택된 어느 하나의 용매에 의해 추출되는 것 일 수 있다.

상기 새우말 추출물의 제조는, 추출효율을 증대시키기 위해 전처리 과정을 포함할 수 있으며, 예를 들어 새우말을 건조한 후 분쇄기로 분쇄하여 사용할 수 있다.

본 발명의 추출물 추출온도는 특별히 제한되지 아니하며, 예를 들어 0℃ 내지 150℃일 수 있으며, 바람직하게는 10℃ 내지 80℃일 수 있다. 본 발명의 추출물 추출시간은 추출 온도에 따라 당업자가 적절히 설정 및 변경 가능한 것으로서 특별히 제한되지 아니하며, 예를 들어 10분 내지 10일일 수 있으며, 바람직하게는 1시간 내지 72시간 일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 3시간 내지 60시간 일 수 있다.

본 발명 추출물은 공지의 천연물 추출법으로 추출될 수 있다. 예를 들어, 냉침추출, 상온추출, 열수추출, 환류냉각 추출, 가열 추출, 고압추출, 초음파 추출, 아임계 추출법, 초임계 추출법 등으로 추출할 수 있으며, 1회 내지 10회, 바람직하게는 2회 내지 7회 반복 추출할 수 있다.

또한 본 발명의 새우말 추출물의 제조시 처리, 보관 등의 용이함을 위하여 여과 과정, 농축 및 정제과정, 건조과정, 동결과정, 분말화 과정 등이 임의로 추가될 수 있다.

상기 여과 과정은 공지의 여과 방법에 의할 수 있으며 이에 제한되지 않으나, 예를 들어 여과망 또는 마이크로필터를 이용한 여과, 원심분리 및 분액깔때기를 이용할 수 있다.

상기 농축 과정은 공지의 농축 방법에 의할 수 있으며 이에 제한되지는 않으나, 예를 들어 침전농축, 증발농축, 감압농축, 한외여과법, 역삼투법 및 원심분리법을 이용하여 농축할 수 있다.

상기 건조 과정은 공지의 건조 방법에 의할 수 있으며 이에 제한되지 아니하나, 예를 들어 동결 건조, 분무 건조 또는 열풍건조 일 수 있다.

또한 분말화 과정은 공지의 분말화 방법에 의할 수 있으며 이에 제한되지 아니하나, 예를 들어 덱스트린 포접 등의 과정에 의해 분말화 될 수 있다.

본 발명에서 상기 분획물은, 특정 용매를 사용하여 상기 새우말 추출물[특히, 조 추출물(crude extract)]로부터 본 발명에서 목적으로 하는 활성을 가지는 물질을 분획(fractionation) 또는 정제하여 얻은 활성 분획물(fraction)을 의미한다. 예컨대, 상기 새우말 추출물을 극성 또는 비극성 용매를 사용하여 추가 추출 분획한 분획물, 일정한 분자량 컷-오프 값을 갖는 한외 여과막을 통과시켜 얻은 분획, 다양한 크로마토그래피(크기, 전하, 소수성 또는 친화성에 따른 분리를 위해 제작된 것)에 의한 분리 등 추가적으로 실시된 다양한 정제 방법을 통해 얻어진 분획물 일 수 있으며, 이에 제한되지 않는다.

본 발명에서 상기 분획물은 새우말 추출물의 비극성 용매 분획물 또는 새우말 추출물의 극성용매 분획물을 모두 포함하는 것일 수 있다. 바람직하게 본 발명에서 상기 분획물은 새우말 추출물의 극성용매 분획물일 수 있으며, 상기 극성 용매의 종류는 당업계에 잘 알려져 있다.

가장 바람직하게, 상기 새우말 추출물의 극성용매 분획물은 새우말 추출물을 물과 비극성 용매로 순차적으로 분획한 후, 물 분획물을 다시 부탄올 또는 에틸아세테이트의 극성용매로 분획하여 얻어지는 것일 수 있다. 이때, 상기 비극성 용매는 노르말헥산, 디클로로메탄 및 에틸에테르로 이루어지는 군에서 선택된 하나 이상의 용매일 수 있다.

상기 분획물의 제조 또한, 마찬가지로 처리, 보관 등의 용이함을 위하여 여과 과정, 농축 및 정제과정, 건조과정, 동결과정, 분말화 과정이 임의로 추가될 수 있으며, 이는 전술한 바와 같다.

상기 피부 색소성 질환은 멜라닌 과잉 축적에 기인한 것으로 당업계에 알려진 것이라면 그 종류가 특별히 제한되지 않으나, 예를들어 유전성대측성색소이상증(遺傳性對側性色素異常症), 망상지단(網狀肢端)색소침착증, 기미, 주근깨, 흑색점, 모반, 약물(예를들어 미노사이클린, 블레오마이신, 부술판 또는 지도부딘으로부터 선택되는 약물)에 의한 색소 침착, 염증 후 색소 침착, 피부염에서 발생하는 과색소 침착, 노인성색소반, 검버섯, 잡티, 표피 멜라닌세포성 병변(Epidermal melanocytic lesion), 밀크커피 반점(Cafe's au lait macules), 진피 멜라닌세포성 병변(Dermal melanocytic lesions), 몽고반(Mongolian spot), 흑자(Lentigines), 흑색종(Melanoma), 악성 흑자 흑색종(Lentigo maligna melanoma), 표재 확장성 흑색종(Superficial spreading melanoma), 선단 흑자성 흑색종(Acral lentiginous melanoma), 결절성 흑생종(Nodular melanoma), 색소성 기저세포암(pigment basal cell carcinoma), 색소성 피부섬유종(dermatofibromas), 색소성 피부낭종(dermoid cyst), 색소성 켈로이드(keloid) 및 색소성 각질극세포종(keratoacanthomas) 등을 포함하며, 상기 모반은 구체적으로 편평(扁平)모반, 색소성모반, 베커 모반(Becker's Nevus), 반문상 모반(Nevus Spilus), 오타 모반(Nevus of Ota), 후천성 양측성 오타 모반양 반(Acquired bilateral nevus of Ota-like macules), 이토 모반(Nevus of Ito), 청색 모반(Blue nevus), 멜라닌 세포성 모반(Melanocytic nevus), 경계 모반(Junctional nevus), 복합 모반(Compound nevus), 진피내 모반(Intradermal nevus), 운륜모반(Halo nevus), 선천성 멜라닌세포성 모반(Congenital nevocytic nevus), 스피츠 모반(Spitz nevus) 및 이형성 모반(Dysplastic nevus) 등을 포함한다.

바람직하게 본 발명의 상기 멜라닌 과잉 축적에 기인한 피부 색소성 질환은 유전성대측성색소이상증(遺傳性對側性色素異常症), 망상지단(網狀肢端)색소침착증, 기미, 주근깨, 흑색점, 모반, 약물(예를들어 미노사이클린, 블레오마이신, 부술판 또는 지도부딘으로부터 선택되는 약물)에 의한 색소 침착, 염증 후 색소 침착 및 피부염에서 발생하는 과색소 침착일 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물은 상기 새우말 추출물 또는 이의 분획물을 단독으로 함유하거나, 또는 하나 이상의 약학적으로 허용되는 담체, 부형제 또는 희석제를 추가로 함유할 수 있다.

약학적으로 허용되는 담체로는 예컨대, 경구 투여용 담체 또는 비경구 투여용 담체를 추가로 포함할 수있다. 경구 투여용 담체는 락토스, 전분, 셀룰로스 유도체, 마그네슘 스테아레이트, 스테아르산 등을 포함할 수 있다. 또한 비경구 투여용 담체는 물, 적합한 오일, 식염수, 수성 글루코스 및 글리콜 등을 포함할 수 있으며, 안정화제 및 보존제를 추가로 포함할 수 있다. 적합한 안정화제로는 아황산수소나트륨, 아황산나트륨 또는 아스코르브산과 같은 항산화제가 있다. 적합한 보존제로는 벤즈알코늄 클로라이드, 메틸- 또는 프로필-파라벤 및 클로로부탄올이 있다. 그 밖의 약학적으로 허용되는 담체로는 다음의 문헌에 기재되어 있는 것을 참고로 할 수 있다(Remington's Pharmaceutical Sciences, 19th ed., Mack Publishing Company, Easton, PA, 1995).

본 발명의 약학적 조성물은 인간을 비롯한 포유동물에 어떠한 방법으로도 투여할 수 있다. 예를 들면, 경구 또는 비경구적으로 투여할 수 있다. 비경구적인 투여방법으로는 이에 한정되지는 않으나, 정맥내, 근육내, 동맥내, 골수내, 경막내, 심장내, 경피, 피하, 복강내, 비강내, 장관, 국소, 설하 또는 직장내 투여일 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물은 상술한 바와 같은 투여 경로에 따라 경구 투여용 또는 비경구 투여용 제제로 제형화 할 수 있다.

경구 투여용 제제의 경우에 본 발명의 조성물은 분말, 과립, 정제, 환제, 당의정제, 캡슐제, 액제, 겔제, 시럽제, 슬러리제, 현탁액 등으로 당업계에 공지된 방법을 이용하여 제형화될 수 있다. 예를 들어, 경구용 제제는 활성성분을 고체 부형제와 배합한 다음 이를 분쇄하고 적합한 보조제를 첨가한 후 과립 혼합물로 가공함으로써 정제 또는 당의정제를 수득할 수 있다. 적합한 부형제의 예로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨 및 말티톨 등을 포함하는 당류와 옥수수 전분, 밀 전분, 쌀 전분 및 감자 전분 등을 포함하는 전분류, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 나트륨 카르복시메틸셀룰로오즈 및 하이드록시프로필메틸-셀룰로즈 등을 포함하는 셀룰로즈류, 젤라틴, 폴리비닐피롤리돈 등과 같은 충전제가 포함될 수 있다. 또한, 경우에 따라 가교결합 폴리비닐피롤리돈, 한천, 알긴산 또는 나트륨 알기네이트 등을 붕해제로 첨가할 수 있다. 나아가, 본 발명의 약학적 조성물은 항응집제, 윤활제, 습윤제, 향료, 유화제 및 방부제 등을 추가로 포함할 수 있다.

비경구 투여용 제제의 경우에는 주사제, 크림제, 로션제, 외용연고제, 오일제, 보습제, 겔제, 에어로졸 및 비강 흡입제의 형태로 당업계에 공지된 방법으로 제형화할 수 있다. 이들 제형은 모든 제약 화학에 일반적으로 공지된 처방서인 문헌(Remington's Pharmaceutical Science, 15th Edition, 1975. Mack Publishing Company, Easton, Pennsylvania 18042, Chapter 87: Blaug, Seymour)에 기재되어 있다.

본 발명의 약학적 조성물의 총 유효량은 단일 투여량(single dose)으로 환자에게 투여될 수 있으며, 다중 투여량(multiple dose)으로 장기간 투여되는 분할 치료 방법(fractionated treatment protocol)에 의해 투여될 수 있다. 본 발명의 약학 조성물은 질환의 정도에 따라 유효성분의 함량을 달리할 수 있다. 비경구 투여시는 상기 새우말 추출물 또는 이의 분획물을 기준으로 하루에 체중 1 kg당 바람직하게 0.01 내지 50 mg, 더 바람직하게는 0.1 내지 30 mg의 양으로 투여되도록, 그리고 경구 투여시는 상기 새우말 추출물 또는 이의 분획물을 기준으로 하루에 체중 1 kg당 바람직하게 0.01 내지 100 mg, 더 바람직하게는 0.1 내지 50 mg의 양으로 투여되도록 1 내지 수회에 나누어 투여할 수 있다. 그러나 상기 새우말 추출물 또는 이의 분획물의 용량은 약학적 조성물의 투여 경로 및 치료 횟수뿐만 아니라 환자의 연령, 체중, 건강 상태, 성별, 질환의 중증도, 식이 및 배설율등 다양한 요인들을 고려하여 환자에 대한 유효 투여량이 결정되는 것이므로, 이러한 점을 고려할 때 당 분야의 통상적인 지식을 가진 자라면 본 발명의 조성물의 적절한 유효 투여량을 결정할 수 있을 것이다. 본 발명에 따른 약학적 조성물은 본 발명의 효과를 보이는 한 그 제형, 투여 경로 및 투여 방법에 특별히 제한되지 아니한다.

또한 본 발명의 상기 새우말 추출물 또는 이의 분획물은, 이를 유효성분으로 함유하여 멜라닌 과잉 축적에 기인한 피부 색소성 질환의 예방 또는 개선을 목적으로하는 식품 조성물로서 제공될 수 있다. 본 발명에 따른 식품 조성물은 기능성 식품(functional food), 영양 보조제(nutritional supplement), 건강식품(health food) 및 식품 첨가제(food additives) 등의 모든 형태를 포함한다. 상기 유형의 식품 조성물은 당업계에 공지된 통상적인 방법에 따라 다양한 형태로 제조할 수 있다.

예를 들면, 건강식품으로는 본 발명의 새우말 추출물 또는 분획물 자체를 차, 쥬스 및 드링크의 형태로 제조하여 음용하도록 하거나, 과립화, 캡슐화 및 분말화하여 섭취할 수 있다. 또한, 본 발명의 새우말 추출물 또는 분획물을 미백 효과가 있다고 알려진 공지의 물질 또는 활성 성분과 함께 혼합하여 조성물의 형태로 제조할 수 있다.

또한, 기능성 식품으로는 음료(알콜성 음료 포함), 과실 및 그의 가공식품(예: 과일통조림, 병조림, 잼, 마아말레이드 등), 어류, 육류 및 그 가공식품(예: 햄, 소시지콘비이프 등), 빵류 및 면류(예: 우동, 메밀국수, 라면, 스파게티, 마카로니 등), 과즙, 각종 드링크, 쿠키, 엿, 유제품(예: 버터, 치이즈 등), 식용식물유지, 마아가린, 식물성 단백질, 레토르트 식품, 냉동식품, 각종 조미료(예: 된장, 간장, 소스 등) 등에 본 발명의 새우말 추출물 또는 분획물을 첨가하여 제조할 수 있다.

본 발명의 식품 조성물 중 상기 본 발명의 새우말 추출물 또는 분획물의 바람직한 함유량으로는 이에 한정되지 않지만 예를들어 최종적으로 제조된 식품 중 0.01 내지 80 중량%일 수 있으며, 바람직하게는 최종적으로 제조된 식품 중 0.01 내지 50 중량%일 수 있다.

또한, 본 발명의 새우말 추출물 또는 분획물을 식품 첨가제의 형태로 사용하기 위해서는 분말 또는 농축액 형태로 제조하여 사용할 수 있다.

본 발명은 새우말(Phyllospadix iwatensis Makino) 추출물 또는 이의 분획물; 및 피부학적으로 허용 가능한 부형제를 포함하는 화장료 조성물을 제공한다. 본 발명의 화장료 조성물은 특정 용도에 한정되는 것은 아니나, 바람직하게 피부 미백용으로 사용되는 것일 수 있다.

상기‘미백’은 피부에 멜라닌 색소가 과도하게 침착되는 것을 방지하거나 기존에 침착된 멜라닌 색소를 제거 및 감소시키는 기능으로서, 본 발명에서 멜라닌 과잉 축적에 기인한 피부 색소성 질환의 예방 또는 개선효과를 포함하는 의미 일 수 있다. 멜라닌 과잉 축적에 기인한 피부 색소성 질환에 대해서는 전술한 바와 같다.

본 발명에 따른 화장료 조성물은 활성성분으로서 본 발명의 새우말 추출물 또는 이의 분획물에 화장품학 및/또는 피부학적으로 허용 가능한 부형제를 추가로 함유함으로써, 당업계에 공지된 방법에 따라 국소 적용에 적합한 모든 형태의 제형으로 제조될 수 있다. 예를 들면, 이에 한정되지는 않으나 본 발명에 따른 화장료 조성물은 용액, 겔, 고체, 에멀전, 현탁액, 마이크로에멀전, 마이크로캡슐, 미세과립구, 이온형 및/또는 비이온형 소낭 분산제, 크림, 스킨, 로션, 파우더, 스프레이 또는 스틱의 형태로 제조될 수 있다. 구체적인 사용 목적에 따른 분류로는, 기초 화장품 조성물(화장수(스킨), 로션, 에센스, 크림, 에센스, 클렌징 폼 및 클렌징 워터와 같은 세안제, 팩, 보디오일), 색조 화장품 조성물(화운데이션, 립스틱, 마스카라, 메이크업 베이스), 두발 제품 조성물(샴푸, 린스, 헤어컨디셔너, 헤어젤) 및 비누 등의 형태로 제조될 수 있다.

본 발명의 화장료 조성물에 함유되는 상기 새우말 추출물 또는 이의 분획물의 함량은 이에 한정되지 않지만 전체 조성물 총중량에 대하여 0.01 내지 50 중량%인 것이 바람직하고, 0.1 내지 30 중량%인 것이 더욱 바람직하다.

본 발명의 화장료 조성물은 활성 성분에 대한 희석제, 분산제 또는 담체로서 작용하는 피부학적으로(또는 미용학적으로, 화장품학적으로) 허용 가능한 부형제를 포함한다. 부형제는 피부 관리 제품에 통상적으로 사용되는 물질, 예컨대 물, 액상 또는 고상연화제(피부연화제), 실리콘 기름, 유화제, 용매, 습윤제, 증점제, 분말, 추진제, 피부침투 증강제, 착색제, 방향제, 농후제 등을 포함할 수 있다.

구체적으로, 상기 피부 연화제는 피부의 연화, 진정, 코팅, 매끄럽게 하거나 또는 촉촉하게 하기 위해 사용한다. 본 발명에서 피부 연화제는 당업계에 공지된 모든 종류를 사용할 수 있으며 이에 제한되지 않으나, 예를 들어, 석유 기제, 지방산 에스테르, 알킬 에톡실레이트, 지방산 에스테르 에톡실레이트, 지방 알코올, 폴리실록산 또는 이의 혼합물일 수 있다. 이외에 프로필렌 글리콜, 부틸렌 글리콜, 글리세린, 트리에틸렌 글리콜, 경랍, 왁스, 지방산, 지방 알코올 에테르, 글리세라이드, 아세토글리세라이드, 에톡실화 글리세라이드, 폴리하이드록시 알코올의 다른 지방산 에스테르, 라놀린 및 이의 유도체와 같은 통상적인 피부 연화제를 포함한다. 상기 유화제는 화장료 조성물의 수상과 유상이 혼합되도록 하는 역할을 한다. 상기 유화제는 1종 이상을 임의로 함유할 수 있으며 비이온성, 음이온성 또는 양이온성을 모두 포함할 수 있다. 상기 유화제의 종류는 에멀전의 형태가 유중수 분산형인지 수중유 분산형인지에 따라 결정할 수 있다. 적합한 유화제의 예로는 이에 한정되지는 않으나, 솔비탄 트리올레이트, 솔비탄 트리스테아레이트, 글리세롤 모노올레이트, 글리세롤 모노스테아레이트, 글리세롤 모노라우레이트, 솔비탄 세스퀴올레이트, 솔비탄 모노올레이트, 솔비탄 모노스테아레이트, 폴리옥시에틸렌 스테알릴에테르, 폴리옥시에틸렌솔비톨 밀랍 유도체, PEG 200 디라우레이트, PEG 200 모노스테아레이트, PEG 400 디올레이트, 솔비칸 모노팔미테이트, 폴리옥시에틸렌 모노스테아레이트 및 폴리옥시에틸렌 솔비탄 모노스테아레이트 등이 있다. 상기 농후제는 이에 한정되지 않으나, 가교된 카르복시폴리메틸렌 중합체, 에틸 셀룰로오스, 폴리에틸렌 글리콜, 트라칸트검, 카라야검, 산탄검, 벤토나이트, 히드록시에틸 셀룰로오스 및 히드록시프로필 셀룰로오스를 포함한다. 상기 용매로는 정제수, 알코올 또는 정제수와 알코올의 혼합물을 사용할 수 있다. 기타 임의로 사용할 수 있는 일반적인 화장품 첨가제의 예로는 이에 한정되지는 않으나, 파라-히드록시벤조에이트 에스테르와 같은 보존제, 부틸 히드록시 톨루엔, 아스코르브산 및 그 유도체 및 토코페롤 및 그 유도체와 같은 항산화제, 글리세롤, 솔비톨, 2-피롤리돈-5-카르복실레이트, 디부틸프탈레이트, 젤라틴, 폴리에틸렌 글리콜과 같은 습윤제, 아세테이트, 인산염, 시트르산염, 트리에탄올아민 및 카르보네이트와 같은 pH 완충제, 밀랍, 파라핀과 같은 왁스류, 증점제, 활성 증강제, 착색제 및 향료가 사용될 수 있다.

이처럼 본 발명의 화장료 조성물에는 향료, 색소, 살균제, 산화방지제, 방부제 및 보습제 등을 추가로 포함할 수 있으며, 물성개선을 목적으로 점증제, 무기염류, 합성 고분자 물질 등을 포함할 수 있다. 예를들면, 본 발명의 화장료 조성물로 세안제 및 비누를 제조하는 경우에는 통상의 세안제 및 비누 베이스에 상기 새우말 추출물 또는 이의 분획물을 첨가하여 용이하게 제조할 수 있다. 크림을 제조하는 경우에는 일반적인 수중유적형(O/W)의 크림베이스에 상기 새우말 추출물 또는 이의 분획물을 첨가하여 제조할 수 있다. 여기에 향료, 킬레이트제, 색소, 산화방지제, 방부제 등과 물성개선을 목적으로 한 단백질, 미네랄, 비타민 등 합성 또는 천연소재를 추가로 첨가할 수 있다.

또한, 본 발명에 따른 화장료 조성물은 새우말 추출물 또는 이의 분획물 외에 본 발명이 목적으로 하는 주 효과를 상승 혹은 보조할 수 있는 다른 성분들을 함유할 수 도 있다. 예를 들어 종래에 미백 작용이 있는 것으로 알려진 알부틴, 나이아신아마이드, 아스코르브산 유도체, 레스베라트롤 유도체, 파라쿠마린산 유도체 등을 추가적으로 포함할 수 있다.

본 발명에서 상기 부형제는 통상적으로, 다른 미용 보조제(보조 화장료 물질)를 사용하지 않는다면 상기 활성 성분 이외의 잔량으로서 본 발명의 화장료 조성물을 구성할 수 있다.

본 발명의 새우말 추출물은 피부에 안전하고, 인간 티로시나아제 활성 억제효과가 현저하여 이로 인한 멜라닌 생성 억제 및 피부 미백 효과가 뛰어나다.

도 1은 본 발명의 새우말 추출물 처리 시, 처리 농도(0.025 내지 0.1%)에 따른 인간 타이로시나제 활성 변화를 측정한 결과이다.
도 2는 본 발명의 새우말 활성 분획물의 제조 시, 제조 과정 중 수득되는 비극성 용매 분획 또는 극성 용매 분획에 대하여 이들의 인간 타이로시나제 저해 활성을 측정한 결과이다.

이하 본 발명을 상세히 설명한다.

단, 하기 제조예 및 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 제조예 및 실시예에 한정되는 것은 아니다.

<제조예 1>

새우말 추출물의 제조

해양식물 새우말(Phyllospadix iwatensis Makino)의 뿌리, 줄기 및 잎 전체를 정제수로 3회 이상 세척한 후, 열풍건조기를 이용하여 50℃에서 24시간 이상 완전 건조 시킨 후 분쇄하였다. 80%(V/V) 에탄올 수용액을 새우말 분쇄물의 중량 대비 약 10배로 첨가하여, 실온에서 48시간동안 교반하며 추출물을 제조하였다. 이를 50℃ 이하에서 감압 농축 후 동결건조하여 새우말 추출물 분말을 제조하였다. 이때, 수율은 15.5% 였다.

<제조비교예 1 내지 49>

해양식물 추출물의 제조

하기 표 1에 기재된 다양한 해양 식물의 뿌리, 줄기 및 잎 전체를 상기 제조예 1의 방법에 따라 처리하여, 각 해양 식물들의 추출물(분말)을 제조하였다.

실험예 1. 인간 타이로시나제 저해 작용 측정

(1) 인간 타이로시나제의 수득

실험실상에서 정상의 인간 멜라노사이트는 장시간 배양을 하게 되면 멜라닌의 생성능이 저하되고 생존률도 감소할 뿐 아니라, 배양하는데 비용이 일반 세포에 비해 높아 정확한 실험을 수행하기에 어려움이 있다. 이러한 단점을 극복하기 위해, 인간배아신장세포(HEK293 cell)에 인간 타이로시나제 유전자를 영구적 주입하여 인간 타이로시나제를 영구적으로 발현하는 인간배아신장세포‘HEK293-TYR’을 제작하고, 본 실험에 사용하였다.

간략하게, 인간배아신장세포(HEK 293 cell)는 미국 세포주 균주은행(American Type Culture Collection)에서 구입하였고, MIJIN KIM et al., 2011에 기술된 바와 같이 HEK293-TYR 세포를 제작하였다. 배양된 HEK293-TYR 세포를 세포 용해용 용매(10 mM Tris-Cl, pH 7.4, 120 mM NaCl, 25 mM KCl, 2.0 mM EGTA, 1.0 mM EDTA, 및 0.5% Triton X-100, 단백질분해효소 억제제)로 용해하여 세포 용해액을 얻은 후, 13,000 × g 로 15분간 원심 분리하여 그 상층액을 인간 타이로시나제 세포 추출액으로 사용하였다.

(2) 해양 식물 50종의 인간 타이로시나제 저해 활성 비교

상기 제조예1 및 제조비교예1-49 해양식물 추출물들의 인간 타이로시나제에 대한 영향을 측정하기 위하여, 96-웰 마이크로플레이트(96-well microplate)에 0.1 M 인산염완충용액(pH 6.8), 인간 타이로시나제 세포 추출액 200μg/mL, 0.5mM L-타이로신, 1μM L-도파(DOPA) 및 0.1%의 각 해양 식물 추출물(분말)을 포함한 반응액이 200μL가 되도록 하여 37℃에서 120분간 반응시켰다. 마이크로플레이트 리더(reader)를 이용하여, 반응생성물인 도파크롬(DOPA chrome)의 흡수파장 490㎚에서 흡광도를 측정한 후 그 저해율을 계산하여, 각 해양 식물 추출물의 멜라닌 생성 저해능력 및 피부 미백능력을 평가하였다. 양성 대조군으로서 피부 미백 효과를 위해 흔히 사용되는 대표적 물질인 알부틴(arbutin)을 사용하였다. 제조예 1에 따라 수득된 새우말 추출물과 제조비교예 1~49의 각 해양 식물 추출물의 타이로시나제 활성 저해율을 계산하여 아래 표 1에 나타내었다. 음성 대조군으로 식물 추출물 대신 80%(v/v) 에탄올 수용액을 사용하였다.

상기와 동일한 방법으로, 제조예1 및 제조비교예1-49 해양식물 추출물들의 버섯 타이로시나제(Sigma-Aldrich)에 대한 효과를 평가하여, 마찬가지로 표 1에 나타내었다.

타이로시나제 활성 저해율(%)

= [(ODblank-ODblank con.)-(ODexp.-ODcon.)]/(ODblank-ODblank con.)× 100

ODexp. : 타이로시나제 함유시 시료 측정값

ODcon. : 타이로시나제 비함유시 시료 측정값

ODblank : 타이로시나제 함유시 공시료 측정값

ODblank con. : 타이로시나제 비함유시 공시료 측정값

새우말 및 기타 해양식물 추출물의 인간 타이로시나제 활성 저해능 비교

NO.		과 명	국 명	학 명	인간 타이로시나제 활성 저해율 (%)	버섯 타이로시나제 활성 저해율 (%)
양성 대조군		알부틴			35.6	10.2
제조예	1	거머리과	새우말	Phyllospadix iwatensis Makino	39.7	-50.43
제조비교예	1	보라잎과	누은분홍잎	Acrosorium yendoi Yamada	11.2	-55.43
제조비교예	2	다시마과	야키시리쇠미역	Agarum cribrosum	-113.5	-67.28
제조비교예	3	산호말과	넓은게발	Amphiroa anceps (Lamarck) Decaisne	-2.0	-20.43
제조비교예	4	갈고리풀과	바다고리풀	Asparagopsis taxiformis (Delile) Trevisan	-1.7	-77.72
제조비교예	5	갈고리풀과	참갈고리풀	Bonnemaisonia hamifera Hariot	-15.4	-13.59
제조비교예	6	붉은땀띠과	볏붉은잎	Callophylis japonica Okamura inDeToni&Okamura	-10.8	-26.96
제조비교예	7	지누아리과	주름붉은잎	Callophyllis crispata Okamura	-5.4	-5.11
제조비교예	8	지누아리과	까막살	Carpopeltis affinis (Harvey) Okamura	-17.7	-12.07
제조비교예	9	사슬풀과	참사슬풀	Champia parvula (C. Agardh) Harvey	-9.2	-21.41
제조비교예	10	돌가사리과	돌가사리	Chondracanthus tenellus (Harvey) Homm. in Homm.	-26.0	-72.5
제조비교예	11	빨간검둥이과	서실	Chondria crassicaulis Harvey	-14.5	-10.43
제조비교예	12	돌가사리과	진두발	Chondrus ocellatus Holmes	-25.2	-16.3
제조비교예	13	대마디말과	갈색대마디말	Cladophora wrightiana Harvey	-9.4	-31.74
제조비교예	14	청각과	청각	Codium fragile (Suringar) Hariot	-9.7	-15.54
제조비교예	15	고리매과	불레기말	Colpomenia sinusa (Mertens ex Roth) Derbes et Solier in Castagne	-18.5	-22.07
제조비교예	16	다시마과	쇠미역	Costaria costata (C. Agardh) Saunders	-16.0	-39.78
제조비교예	17	산말과	담배잎산말	Desmarestia tabacoides Okamura	-11.2	-43.26
제조비교예	18	그물바탕말과	참그물바탕말	Dictyoperis dichotoma (Hudson) Lamouroux	-12.3	-37.93
제조비교예	19	그물바탕말과	개그물바탕말	Dictyota okamurae (Dawson) H?tning, Schnetter, et Prud'homme van Reine	-2.2	-96.85
제조비교예	20	디크티오타과	두켜부채	Distromium decumbens	-79.1	96.52
제조비교예	21	다시마과	감태	Ecklonia cava Kjellman inKjellman&Petersen	-120.2	108.04
제조비교예	22	다시마과	대황	Eisenia bicyclis (Kjellman) Setchell	-66.6	-5.43
제조비교예	23	가위손말과	여린가위손말	Galaxaura falcata Kjellman	-12.6	-32.39
제조비교예	24	우뭇가사리과	우뭇가사리	Gelidium amansii (Lam.) Lamouroux	-6.0	-29.24
제조비교예	25	풀가시리과	애기풀가사리	Gloiopeltis compianata (Harvey) Yamada	-12.3	-22.61
제조비교예	26	꼬시래기과	꼬시래기	Gracilaria verrucosa (Hudson) Papenfuss	-9.8	-24.78
제조비교예	27	지누아리과	주름까막살	Grateloupata crispata (Okamura) Lee	-11.8	-29.13
제조비교예	28	지누아리과	참도박	Grateloupia elliptica Holmes	-10.5	-14.89
제조비교예	29	고리매과	그물바구니	Hydroclathrus clathratus (C. Agardh) Howe	-11.8	-16.2
제조비교예	30	열매가지과	참가시우무	Hypnea charoides	-12.3	-31.63
제조비교예	31	패과	패	Ishige okamurae Yendo	-33.7	30.54
제조비교예	32	빨간검둥이과	검은서실	Laurencia intermedia Lamouroux	-12.6	-13.26
제조비교예	33	부스럼말과	바위두둑	Lethesia difformis (Linnaeus) Areschoug	-14.5	-21.85
제조비교예	34	마디잘록이과	애기마디잘록이	Lomentaria hakodatensis Yendo	-13.4	-20.65
제조비교예	35	보라잎과	비단망사	Martensia denticulata Harvey	-19.2	-105.11
제조비교예	36	모자반과	외톨개모자반	Myagropsis myagroides (Martens ex Turner) Fensholt	-15.7	-33.91
제조비교예	37	바위수염과	바위수염	Myelophycus simplex (Harvey) Papenfuss	-16.5	-19.13
제조비교예	38	그물바탕말과	참가죽그물바탕말	Pachydictyon coriaceum (Holmes) Okamura	-19.8	-39.46
제조비교예	39	그물바탕말과	부챗말	Padina arborescens Holmes	-37.8	-75.65
제조비교예	40	고리매과	미역쇠	Petalonia binghamiae (j.Agardh) Vinogradova	-17.2	-31.85
제조비교예	41	곱슬이과	참곱슬이	Plocamium telfairiae (Harvey) Harvey	-8.8	-12.93
제조비교예	42	지누아리과	붉은까막살	Prionitis cornea (Okamura) Dawson	-17.5	-23.7
제조비교예	43	우뭇가사리과	개우무	Pterocladia capillacea (Gmelin) Bornet	-34.9	-42.17
제조비교예	44	모자반과	톳	Sargassum fusiformis (Harvey) Okamura	-10.3	-22.5
제조비교예	45	고리매과	미역실	Scytosiphon gracilis Kogame	-17.1	-34.46
제조비교예	46	초록실과	초록실	Ulothrix flacca (Dillwyn) Thuret inLeJolis	0.3	-17.39
제조비교예	47	갈파래과	띠갈파래	Ulva fasciata Delile	-5.7	-46.74
제조비교예	48	미역과	미역	Undaria pinnatifida (Harvey) Suringar	-9.1	-37.17
제조비교예	49	거머리말과	거머리말	Zostera Marina L.	1.2	-38.26

그 결과 표 1에서 보는 바와 같이, 제조예 1의 새우말 추출물이 제조비교예 1-49의 해양 식물 추출물들보다 인간 타이로시나제 저해 작용이 우수하였다. 제조비교예 1-49의 추출물들은 대부분 인간 타이로시나제 저해 작용이 없거나 오히려 상기 효소의 활성을 촉진하였으며, 누은분홍잎 및 거머리말의 추출물에서 미약한 인간 타이로시나제 저해 작용이 관찰 되었을 뿐이다. 두켜부채, 감태, 패 등은 버섯 타이로시나제를 강력히 저해하였지만 인간 타이로시나제의 활성은 오히려 증가시켰다. 이러한 결과는, 기존의 많은 연구들이 버섯 타이로시나제 억제 효과를 근거로 특정 물질의 멜라닌 생성 저해 효능 및 미백효능을 설명하였지만, 이러한 입증방식은 상기 물질이 인간에 대해 나타내는 정확한 생화학적 효능을 증명하기에 부적절하다는 것을 시사한다. 본 발명에 의한 제조예 1 의 새우말 추출물은 양성 대조군(알부틴)과 비교하여 조금 높은 수준으로 우수한 타이로시나제 저해 활성 저해효과를 나타냈으며, 추출물을 정제할 경우 더 우수한 효과를 보일 것이라 기대할 수 있었다.

(3) 새우말 추출물의 인간 타이로시나제 저해 활성 확인

상기 인간 타이로시나제 세포 추출액에 제조예1의 새우말 추출물을 0.025 내지 0.1%의 다양한 농도로 처리하여 이의 효과를 확인하였다. 인간 타이로시나제에 대한 영향을 측정하기 위하여, 96-웰 마이크로플레이트(96-well microplate)에 0.1 M 인산염완충용액(pH 6.8), 인간 타이로시나제 세포 추출액 200μg/mL, 0.5mM L-타이로신, 1μM L-도파(DOPA) 및 제조예1의 새우말 추출물을 0.025 내지 0.1%의 다양한 농도로 포함한 반응액이 200μL가 되도록 하여 37℃에서 120분간 반응시켰다. 마이크로플레이트 리더(reader)를 이용하여, 반응생성물인 도파크롬(DOPA chrome)의 흡수파장 490㎚에서 흡광도를 측정하여 효소 활성 정도를 평가하였다. 음성 대조군으로 식물 추출물 대신 80%(v/v) 에탄올 수용액을 사용하였다.

그 결과 도 1에서 보는 바와 같이, 본 발명의 새우말 추출물은 농도 의존적으로 인간 타이로시나제를 저해하는 것을 확인하였다.

<제조예 2 내지 12>

새우말 추출물의 제조

새우말의 뿌리, 줄기 및 잎 전체를 정제수로 3회 이상 세척한 후, 열풍건조기를 이용하여 50℃에서 24시간 이상 완전 건조 시킨 후 분쇄하였다. 하기 표 2의 각 추출용매를 새우말 분쇄물의 중량 대비 약 10배로 첨가하고, 실온에서 48시간동안 교반하며 추출물을 제조하였다. 이를 50℃ 이하에서 감압 농축 후 동결건조하여 추출물 분말을 제조하였다.

실험예 2. 추출용매에 따른 새우말 추출물의 인간 타이로시나제 저해 작용 측정

상기 제조예 2 내지 12의 새우말 추출물들에 대하여, 상기 실험예 1의 방법에 따라 인간 타이로시나제 활성 저해율을 측정 및 계산하여, 아래 표 2에 나타내었다.

실험 결과 상기 표2에서 보는 바와 같이, 물, 에탄올, 메탄올, 아세톤을 단독으로 혹은 혼합하여 추출용매로 사용하였을 때, 추출 효율 및 인간 타이로시나제 저해 작용이 우수하였다.

<제조예 13 내지 18>

새우말 분획물의 제조

상기 제조예 1의 새우말 추출물을 약 10배 부피의 물에 희석하고, 하기 표 3에 기재된 동일 부피의 비극성 용매로 분배하여 불순물을 추출 및 제거한 후, 물 층은 다시 하기 표 3에 기재된 동일 부피의 극성 용매로 분배하여 유효성분을 추출함으로서, 새우말 추출물의 극성용매 분획물을 제조하였다. 이를 50℃ 이하에서 감압 농축 후 동결건조하여 새우말 분획물 분말을 제조하였다(이하의 내용에서 별다른 언급이 없는 한,‘새우말 분획물’의 기재는 ‘새우말 극성용매 분획물’을 의미한다.).

실험예 3 . 용매별 새우말 분획물의 인간 타이로시나제 저해 작용 측정

(1) 먼저, 상기 새우말 분획물 제조시에 각 단계별로 수득되는 비극성 또는 극성 용매 분획(fraction)을 대상으로, 이들의 인간 타이로시나제 활성 저해능을 평가하였다. 대표적으로 제조예 16의 분획물 제조시 수득되는 비극성 또는 극성 용매 분획들을 본 실험에 사용하였다. 간략하게, 제조예1의 새우말 추출물을 약 10배 부피의 물에 희석하고, 디클로로메탄과 부탄올로 순차적으로 분배하고 각각을 감압농축 및 동결건조하여 디클로로메탄 분획, 부탄올 분획, 물 분획을 제조하였다. 상기 실험예 1의 방법에 따라 상기 세가지 분획을 각각 0.05% 농도로 처리하여, 인간 타이로시나제 활성을 측정하였다.

그 결과 도 2에서 보는 바와 같이, 인간 타이로시나제 활성이 부탄올 분획에 의해 가장 크게 감소하였다. 상기 결과를 통해 새우말의 극성용매 분획물이 비극성용매 분획과 비교하여 미백활성성분을 고농도로 포함하고 있는 것으로 생각되었다.

(2) 제조예 13 내지 18의 새우말 극성용매 분획물에 대하여, 상기 시험예 1의 방법에 따라 인간 타이로시나제 활성을 측정하였다.

실험 결과 상기 표3에서 보는 바와 같이, 추출물이 정제되면서 불순물이 제거되어 수율은 감소하는 반면 인간 타이로시나제 저해 작용이 향상됨을 알 수 있었다.

실험예 4. 세포에서 멜라닌생성억제 작용 측정

상기 제조예1 내지 10의 새우말 추출물과 상기 제조예 13 내지 18의 새우말 분획물의 세포 멜라닌(melanin) 생성억제 효과를, 인체 표피 멜라닌 세포에서 측정하였다. 상기 인체 표피 멜라닌 세포는 Cascade Biologics (Portland, OR, USA)로부터 구입하였고 human melanocyte growth supplements (Cascade Biologics)와 항생제들이 보충된 Medium254에서 배양되었다.

먼저, 세포 생존율은 공지의 trypan blue exclusion assay 방법으로 평가되었다. 간략하게, 상기 새우말 추출물 또는 분획물 각각을 0.1% 농도로 세포에 처리하고 37℃에서 48시간 배양하였다. 세포들은 트립신처리(trypsinization)된 후 1,200 rpm으로 3분동안 원심분리로 수집(harvest)되었다. 세포들을 배양액에 현탁(collectively suspended)하여 0.1% 트리판 블루 용액(Sigma-Aldrich)과 1:1의 비율로 혼합하였다. 염색된 죽은 세포와 염색되지 않은 살아있는 세포들의 수를, hemocytometer를 이용하여 현미경으로 카운트(count)하였다.

세포적 색소형성에 대한 새우말 추출물 및 분획물의 영향을 알아보기 위하여, 인체 표피 멜라닌 세포에 시험 물질들을 0.1% 농도로 60분동안 전처리한 후, 1.0 mM L-tyrosine을 처리하여 48시간 동안 자극하였다. 이 과정을 배지 교환과 함께 3번 반복하였다. 60 ℃에서 60분 동안 0.1 M NaOH를 처리하여 세포 내 멜라닌을 추출한 후, 490 nm에서 흡광도를 측정하여 정량하고, 단백질 양으로 보정하였다. 상기 단백질 양은 Bio-Rad DC 분석으로 평가되었다.

실험 결과 상기 표4에서 보는 바와 같이, 제조예 1 내지 10의 새우말 추출물들은 공지의 미백 물질인 알부틴과 동등하거나 더 우수한 활성으로 세포 멜라닌 생성을 억제하였고 세포 독성이 거의 없음을 알 수 있었다. 또한 제조예 13 내지 18의 새우말 분획물(극성용매 분획물)들의 세포 멜라닌 생성 억제 작용은 더욱 우수하였으며 세포 독성이 거의 없음을 알 수 있었다.

<실시예 1 내지 4, 비교예 1 및 2> 새우말 추출물 또는 이의 분획물을 포함하는 미백화장료 제조

하기 표 5에 기재된 바와 같이 각 유효 성분을 크림 베이스에 첨가하여, 하기 표 6의 성분을 함유하는 각각의 화장료를 제조하였다.

시험용 화장품의 유효 성분

NO.	유효 성분	배합비율 (%)
실시예 1	새우말 추출물 제조예 6	2
실시예 2	새우말 추출물 제조예 6	5
실시예 3	새우말 분획물 제조예 18	0.5
실시예 4	새우말 분획물 제조예 18	2
비교예 1 (양성 대조)	알부틴	2
비교예 2 (음성 대조)	-	-

크림 제형 성분

성분	함량(%)
유효성분	표 5의 표기량
알란토인	0.1
글리세린	4
1,3 부틸렌글라이콜	3
카보머	0.15
디프로필렌글라이콜	2
클로페네신	0.25
프로필파라벤	0.1
백납	2
글리세릴스테아레이트	1
글리세릴스테아레이트/피이지100 스테아레이트	1.5
소르비탄세스퀴올리에이트	0.8
폴리소르베이트60	1.6
세테아릴알코올	2
올리브 오일	8
토코페릴 아세테이트	0.1
디메치콘	1
소듐폴리아크릴레이트/하이드로게네이트	0.4
트리에탄올아민	0.15
정제수	잔량
총(total)	100

실험예 5. 인체피부 안전성 시험

상기 실시예 1-4 및 비교예 1-2에서 통상적인 방법에 따라 제조한 화장료 제품들의 인체 피부에 대한 자극성을 알아보기 위하여, 인체피부 일차자극 시험을 실시하였다. 화장품은 특정 질환의 치료를 위해 일정기간 사용되는 의약품과 달리 대개 건강한 정상인들이 일상적으로 장기간 연용하는 제품으로 절대적인 안전성이 확보되어야한다. 따라서 인체피부 일차자극 시험은 실제 사용조건에서의 피부자극을 예견할 수 있어 필수적으로 수행되고 있다.

건강한 성인남녀 30명을 대상으로 각 화장료의 적당량(20μl)을 첩포시험용 IQ 챔버에 적하시켜 등 부위에 48시간 첩포한 후, 챔버를 제거하였다. 제거 후 30분, 24시간 경과 시점에서 피부상태 변화를 육안으로 판독하였다. 피부반응의 평가 기준 및 점수는 아래의 표 7에 나타낸다.

점수	평가 기준
0	무반응
1	약한 홍반,
2	중간정도의 균일한 홍반
3	뚜렷한 홍반, 부종 동반
4	뚜렷한 홍반, 부종과 소수포 동반

첩포 제거 후 30분에 1차 판정, 다시 24시간 경과 후 2차 판정하여 아래와 같은 식에 따라 그 반응도를 계산하였다. 1차, 2차 판정의 평균 반응도로 인체피부에 대한 자극도를 나타내었으며 그 결과는 하기 표 8에 나타낸다.

반응도 = [(반응점수 × 반응자 수) / 최대 반응점수(4) × 총 시험자 수(n)]× 100

	반응자 수	48시간 (1차 판정)				72시간 (2차 판정)				반응도
		1+	2+	3+	4+	1+	2+	3+	4+	48 시간	72 시간	평균
실시예 1	0	-	-	-	-	-	-	-	-	0.0	0.0	0.0
실시예 2	1	1	-	-	-	-	-	-	-	0.8	0.0	0.4
실시예 3	0	-	-	-	-	-	-	-	-	0.0	0.0	0.0
실시예 4	1	1	-	-	-	-	-	-	-	0.8	0.0	0.4
비교예 1 양성 대조	2	2	-	-	-	2	-	-	-	1.6	1.6	1.6
비교예 2 음성 대조	0	-	-	-	-	-	-	-	-	0.0	0.0	0.0

상기 표 9에서 보는 바와 같이, 본 발명에 따른 실시예 1 내지 4의 화장료는 인체피부 일차자극 측면에서 양성 대조로 사용된 알부틴 2% 함유 화장료(비교예 1)에 비해 피부 자극이 현저히 적었다.

실험예 6. 인체피부에 대한 피부 미백 효과 시험

상기 실시예 1-4 및 비교예 1-2에서 통상적인 방법에 따라 제조한 화장료 제품들에 대하여 인체피부에서의 미백 효과 시험을 실시하였으며, 그 결과는 아래 표 9 및 표 10에 나타냈다. 구체적으로, 인체피부에 대한 피부 미백 효과 시험을 위하여 건강한 성인남녀 20명을 대상으로 피험자의 양쪽 전박부 내측에 1.5cm× 1.5cm의 구멍이 4개가 뚫린 불투명 테이프를 부착한 뒤, 각 피험자의 최소홍반량(MED) 2배 정도의 자외선(UVB)을 조사하여 피부의 인공 색소침착을 유도하였다. 본 발명에 따른 실시예의 화장료와 비교예의 화장료 각각을 상기 색소침착 부위에 8주간 1일 2회 아침, 저녁으로 도포하게 하였다. 평가는 제품 사용 전과 8주간 사용 후에 멕사메터(Mexameter)와 분광광도계(Spectrophotometer)를 이용하여 각각 멜라닌 지수와 피부색을 평가하였다.

멕사메터를 이용하여 측정한 멜라닌 지수는 아래 표 9에 나타낸다. 멜라닌 지수는 값이 작을수록 미백 효과가 큰 것이다.

	멜라닌 지수 (평균± 표준오차)
	사용 전	사용 후
실시예 1	231.56 ± 3.16	208.51 ± 7.55
실시예 2	229.45 ± 6.65	191.26 ± 5.57
실시예 3	228.10 ± 5.26	207.33 ± 5.25
실시예 4	231.10 ± 8.14	189.23 ± 5.68
비교예 1 양성 대조	230.74 ± 8.52	210.57 ± 2.54
비교예 2 음성 대조	229.85 ± 6.01	216.21 ± 6.45

상기 표 9에서 보는 바와 같이, 멜라닌 지수에 대하여 실시예 1 내지 4의 화장료 조성물은 비교예 1-2에 비해 우수한 저해 효과를 가짐을 알 수 있다. 제조예 6의 추출물을 2% 함유한 화장료(실시예 1)는 알부틴 2% 함유 화장료(비교예 1)와 동등 이상의 미백 효과를 보였고, 제조예 6의 추출물을 5% 함유한 화장료(실시예 2)는 알부틴 2% 함유 화장료(비교예 1)보다 훨씬 더 우수한 효과를 보였다. 제조예 18의 분획물을 0.5% 함유한 화장료(실시예 3)는 알부틴 2% 함유 화장료(비교예 1)와 동등 이상의 미백 효과를 보였고, 제조예 18의 분획물을 2% 함유한 화장료 (실시예 4)는 알부틴 2% 함유 화장료(비교예 1)보다 훨씬 더 우수한 효과를 보였다.

피부색에 대한 효과는 분광광도계에 의해 측정된 L*, a*, b*값을 이용하여 피부의 흰 정도를 반영하는 ITA°(Individual Typological Angle) 값을 계산하여 표 10에 나타내었으며, 상기 ITA°값 계산식은 다음과 같다. ITA°값은 클수록 미백 효과가 큰 것이다.

ITA° = arctg [(L* - 50) / b*] × (180 / π).

L*: 명도인자; 밝기

b*: 색채인자; 파랑-노랑

	ITA° 값 (평균 ± 표준오차)
	사용 전	사용 후
실시예 1	19.96 ± 1.40	27.33 ± 1.31
실시예 2	19.54 ± 2.00	31.84 ± 1.22
실시예 3	20.61 ± 0.95	27.11 ± 0.94
실시예 4	19.88 ± 0.86	32.24 ± 1.14
비교예 1 양성 대조	19.31 ± 1.07	26.87 ± 0.68
비교예 2 음성 대조	19.45 ± 0.99	24.12 ± 1.27

표 10에서 보는 바와 같이, 피부색에 있어서 실시예 1 내지 4의 화장료 조성물이 비교예 1-2 보다 우수한 피부 미백 효과를 가짐을 확인 할 수 있었다. 제조예 6의 추출물을 2% 함유한 화장료(실시예 1)는 알부틴 2% 함유 화장료(비교예 1)와 동등 이상의 미백 효과를 보였고, 제조예 6의 추출물을 5% 함유한 화장료 (실시예 2)는 알부틴 2% 함유 화장료(비교예 1)보다 훨씬 더 우수한 효과를 보였다. 제조예 18의 분획물을 0.5% 함유한 화장료(실시예 3)는 알부틴 2% 함유 화장료(비교예 1)와 동등 이상의 미백 효과를 보였고, 제조예 18의 분획물을 2% 함유한 화장료 (실시예 4)는 알부틴 2% 함유 화장료(비교예 1)보다 훨씬 더 우수한 효과를 보였다.

이상 살펴본 바와 같이, 본 발명은 새우말(Phyllospadix iwatensis Makino) 추출물을 유효성분으로 함유하는 조성물에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 새우말 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 함유하는 약학, 식품 및 화장료 조성물과 이들의 용도에 관한 것이다.

본 발명의 새우말 추출물은 피부에 안전하고, 인간 티로시나아제 활성 억제효과가 현저하여 이로 인한 멜라닌 생성 억제 효과가 뛰어나기 때문에, 피부 미백용 조성물 및 멜라닌 과잉 축적에 기인하는 질환에 대한 예방, 개선 또는 치료용 조성물로서 산업상 이용가능성이 높다.

Claims (9)

1. 새우말(Phyllospadix iwatensis Makino) 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 함유하는 멜라닌 과잉 축적에 기인한 피부 색소성 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
   
2. 새우말(Phyllospadix iwatensis Makino) 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 함유하는 멜라닌 과잉 축적에 기인한 피부 색소성 질환의 예방 또는 개선용 식품 조성물.
   
3. 새우말(Phyllospadix iwatensis Makino) 추출물 또는 이의 분획물; 및 피부학적으로 허용 가능한 부형제를 포함하는 피부 미백용 화장료 조성물.
   
4. 삭제
5. 제1항 또는 제2항에 있어서, 멜라닌 과잉 축적에 기인한 피부 색소성 질환은 유전성대측성색소이상증(遺傳性對側性色素異常症), 망상지단(網狀肢端)색소침착증, 기미, 주근깨, 흑색점, 모반, 약물에 의한 색소 침착, 염증 후 색소 침착 및 피부염에서 발생하는 과색소 침착으로 이루어지는 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 조성물.
   
6. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 새우말 추출물은 물, 탄소수 1-6의 저급 알코올, 탄소수 1-4개의 저급케톤, 탄소수 1-4개의 저급 에스테르, 아임계 유체 및 초임계 유체로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 용매에 의한 추출물인 것을 특징으로 하는 조성물.
   
7. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 분획물은 새우말 추출물의 극성용매 분획물인 것을 특징으로 하는 조성물.
   
8. 제7항에 있어서, 상기 새우말 추출물의 극성용매 분획물은
   새우말 추출물을 물과 비극성 용매로 순차적으로 분획한 후, 물 분획물을 다시 부탄올 또는 에틸아세테이트의 극성용매로 분획하여 얻어지는 것을 특징으로 하는 조성물.
   
9. 제8항에 있어서, 상기 비극성 용매는 노르말헥산, 디클로로메탄 및 에틸에테르로 이루어지는 군에서 선택된 하나 이상의 용매인 것을 특징으로 하는 조성물.
   

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