KR101603276B1

KR101603276B1 - 방사선을 이용하여 해파리로부터 콜라겐의 분리방법

Info

Publication number: KR101603276B1
Application number: KR1020140028149A
Authority: KR
Inventors: 임윤묵; 정성린; 권희정; 박종석; 노영창; 강필현; 김영진
Original assignee: 한국원자력연구원
Priority date: 2013-03-29
Filing date: 2014-03-11
Publication date: 2016-03-25
Anticipated expiration: 2034-03-11
Also published as: KR20140118753A; US20160052962A1; CN105246913A; CN105246913B

Abstract

본 발명은 방사선을 이용하여 해파리로부터 콜라겐의 분리방법에 관한 것으로, 구체적으로 해파리에 방사선 조사기술과 화학물질 처리 기술의 복합화한 방법을 이용하여 산가용성 콜라겐 및 아텔로 콜라겐을 제조하였으므로 저비용 및 고수득율로 해파리로부터 콜라겐의 분리 기술로 유용하게 이용할 수 있을 것이다.

Description

방사선을 이용하여 해파리로부터 콜라겐의 분리방법{The method for extraction of collagen from the jellyfish using irradiation}

본 발명은 방사선 조사 기술을 이용한 해파리로부터 콜라겐을 추출하는 방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는, 방사선 조사기술과 화학물질 처리 기술의 복합화한 방법을 이용하여 저비용 및 고수득율로 해파리로부터 콜라겐을 분리하는 방법에 관한 것이다.

콜라겐은 세포 외 기질의 주요 구성성분으로 피부, 뼈, 연골 단백질에 분포되어 있으며 구조는 3중 나선구조의 섬유상 고분자 단백질이다. 그 직경은 약 14-15 , 길이는 2800 정도이며, 평균 분자량은 약 300,000 Da이다. 콜라겐은 섬유상 단백질의 기본단위 분자인 트로포콜라겐(tropocollagen) 분자 또는 트로포콜라겐 분자간의 공유 결합성 가교결합(cross-linking)에 의하여 물리적, 생물학적으로 안정한 구조를 이루고 있다. 일반적인 콜라겐 펩타이드 구조는 (Gly-X-Y)n으로서 X는 프롤린(proline), Y는 히드록시프롤린(hydroxyproline)으로 되는 경우가 1/3 정도이고, 나머지 2/3는 다른 아미노산으로 존재하는 것으로 알려져 있다.

콜라겐은 산업적으로 식품, 의약품, 화장품 및 세포 배양 등에서 다양하게 이용되고 있는 기능성 물질로서 식품에서는 가식성 케이싱(casing)이나 담체로 이용되며 소시지나 햄의 식감을 향상시키는 첨가제로도 사용된다. 또한, 세포 접착의 고정, 세포의 분열과 분화의 유도 및 혈전 용해작용, 기억력 증강 효과, 상처 치유 및 위점막 보호 기능 등의 다양한 콜라겐의 기능성으로 인해 수요가 증가되어 많은 양의 콜라겐이 요구되고 있는 실정이다. 그 중에서 의약품용 소재로써 가장 많이 사용되고 있는 동물유래 콜라겐은 최근 동물의 전염성 병원체(광우병, 조류독감, 전염성 해면양뇌증)와 같은 고위험군에 노출되어 있어, 이러한 문제를 해결하기 위해 인간의 콜라겐을 사용하기도 하나 추출이 용이하지 못해 낮은 생산성 및 높은 공정비용과 비윤리적인 사회적 문제 등의 복합적인 단점이 있다. 최근 이러한 문제점을 보완하고자 동물유래 단백질에 비해 세포친화성, 세포독성 및 면역반응의 위험이 없는 해양생물로부터 추출한 의약품용 바이오폴리머을 이용한 상처피복소재, 약물전달소재, 재생의학용 인공장기소재 등의 개발 및 제품화가 활발히 이루어지고 있다. 국내의 경우 의약품용 고순도 바이오폴리머 분리 정제와 저분자량화 공정 개발이 큰 비중을 차지하고 있고 현재 시제품 개발단계에 있으나, 가격경쟁력을 높이기 위한 새로운 기술의 융합이 절실히 요구되고 있다.

이에 따라 해양생물 유래 콜라겐에 관한 연구로는 해파리, 성어와 치어과 같은 어류 등의 어피와 뼈로부터 추출된 산가용성 콜라겐과 육상동물 유래 콜라겐을 아미노산 분석, 용해도 측정, 변성온도 및 용해도를 비교 측정한 결과 차이가 없는 유사 구조로 확인되었다. 그 중에서 해파리 콜라겐은 피부탄력 및 혈액순환의 조절을 비롯하여 관절염, 고혈압, 기관지염, 천식, 치료에 효과적이며, 고단백 다이어트 식품, 화장품 및 의약품 등의 용도로 이용 가능성이 높은 것으로 밝혀졌다.

그러나, 지구온난화로 인한 해파리의 다량 출현은 생태계에 좋지 않은 영향을 미치고 있으며, 그 양이 많아 처리 또한 곤란한 상황이다. 이러한 해파리는 단순 가동 식품으로 이용이 제한되어 있다. 또한, 지금까지는 해파리로부터 콜라겐을 추출하기 위해서는 단순 화학물질 처리 방법인 산, 알칼리, 염을 이용하여 추출하였으며, 이전의 화학물질 처리에 의한 추출방법은 화학물질의 처리에 따른 환경오염과 저수득율이 실용화에 문제점으로 지적되고 있다.

이에 본 발명자들은, 상기의 문제점을 해결하고자 해파리로부터 콜라겐을 분리하는데 있어서 보다 효율적인 새로운 방법을 개발하고자 노력한 결과, 해파리에 방사선 조사기술 및 화학물질을 적절히 처리하는 방법을 이용하면 기존의 화학물질만 처리하는 방법에 비해 콜라겐을 분리하는 비용, 효율 및 수득율이 향상됨을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 해파리로부터 산가용성 콜라겐(collagen)의 분리방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기의 방법으로 제조된 산가용성 콜라겐을 프로테아제(protease)로 처리한 후 건조시키는 단계를 포함하는 아텔로 콜라겐(attelo collagen)의 제조방법을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은

1) 해파리(jellyfish)를 세척 및 분쇄하는 단계;

2) 상기 단계 1)의 분쇄된 해파리를 산성 용액에 담침하는 단계;

3) 상기 단계 2)의 용액에 방사선을 조사한 후 교반시키는 단계; 및

4) 상기 단계 3)의 교반물을 여과한 후 건조시키는 단계를 포함하는 해파리로부터 산가용성 콜라겐(collagen)의 분리방법을 제공한다.

또한, 본 발명은

상기 방법으로 제조된 산가용성 콜라겐을 프로테아제(protease)로 처리한 후 건조시키는 단계를 포함하는 아텔로 콜라겐(attelo collagen)의 제조방법을 제공한다.

해파리에 방사선 조사기술 및 화학물질을 적절히 처리하는 방법을 이용하면 저비용 및 고효율로 콜라겐을 생산할 수 있으므로 기존의 화학물질만을 이용하는 방법에 비하여 비용이 절감되고, 수득률이 높아지며, 생태계에 좋지 않은 해파리를 이용할 수 있어 환경오염을 예방할 수 있고, 나아가 조직공학 분야의 기반 기술인 해파리 콜라겐의 원천소재 및 생체재료 제조기술에 활용할 수 있는 분리 공정 기술로 유용하게 이용될 수 있다.

도 1은 본 발명에 따른 해파리로부터 콜라겐을 분리하는 방법을 나타낸 순서도이다.
도 2는 본 발명에 따라 감마선의 조사량별 해파리로부터 추출된 콜라겐을 나타낸 도이다.
도 3은 세척한 해파리 분석 후 무게 변화를 나타낸 도이다.
도 4는 분쇄시간에 따른 해파리 입자크기를 나타낸 도이다.
도 5는 본 발명에 따라 해파리에서 추출된 산가용성 콜라겐의 수율을 감마선 조사 후 교반시간 별로 나타낸 도이다.
도 6은 본 발명에 따라 해파리에서 추출된 산가용성 콜라겐의 수율을 감마선의 조사선량 별로 나타낸 도이다.
도 7은 본 발명에 따라 해파리로부터 제조된 아텔로 콜라겐의 추출률을 감마선의 조사량선별로 나타낸 도이다.
도 8은 방사선 조사량별로 본 발명에 따라 해파리에서 추출된 산가용성 콜라겐의 화학적 특성을 나타낸 도이다.
도 9는 방사선 조사량별로 본 발명에 따라 해파리로부터 제조된 아텔로 콜라겐의 열적 특성을 나타낸 도이다.
도 10은 방사선 조사량별로 본 발명에 따라 해파리로부터 제조된 아텔로 콜라겐의 성분을 나타낸 도이다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은 하기 단계를 포함하는 해파리로부터 산가용성 콜라겐(collagen)의 분리방법을 제공한다:

1) 해파리(jellyfish)를 세척 및 분쇄하는 단계;

4) 상기 단계 3)의 교반물을 여과한 후 건조시키는 단계.

본 발명에 따른 제조방법에 있어서, 상기 단계 1)은 해파리(jellyfish)를 세척 및 분쇄하는 단계이다.

본 발명에 따른 제조방법에 있어서, 상기 단계 1)의 해파리 세척 및 분쇄는 하기 단계로 수행되는 것이 바람직하나 이에 한정하지 않는다:

I) 세척한 해파리를 분쇄하는 단계;

II) 상기 단계 I)의 분쇄된 해파리를 동결건조하는 단계; 및

III) 상기 단계 II)의 동결건조된 해파리를 분쇄하는 단계.

상기 동결건조된 해파리는 입자크기가 100 내지 3000 ㎛로 분쇄되는 것이 바람직하나 이에 한정하지 않는다.

본 발명에 따른 제조방법에 있어서, 상기 단계 2)는 분쇄된 해파리를 산성 용액에 담침하는 단계이다.

상기 산성 용액은 아세트산, 시트르산 및 포름산으로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나인 것이 바람직하며, 아세트산인 것이 보다 바람직하나 이에 한정되지 않는다.

상기 산성 용액은 0.01 M 내지 2.0 M 농도인 것이 바람직하고, 0.1 M 내지 1.5 M 농도인 것이 보다 바람직하며, 0.3 M 내지 1.0 M 농도인 것이 보다 바람직하고, 0.5 M 농도인 것이 가장 바람직하나 이에 한정하지 않는다.

본 발명에 따른 제조방법에 있어서, 상기 단계 3)은 용액에 방사선을 조사한 후 교반시키는 단계이다.

상기 방사선은 감마선 또는 전자선인 것이 바람직하며, 감마선인 것이 보다 바람직하나 이에 한정하지 않는다.

상기 방사선은 5 kGy 내지 200 kGy의 조사선량으로 조사하는 것이 바람직하고, 5 kGy 내지 100 kGy의 조사선량인 것이 보다 바람직하며, 5 kGy 내지 50 kGy의 조사선량인 것이 보다 바람직하고, 5 kGy 내지 25 kGy의 조사선량인 것이 보다 바람직하며, 10 kGy인 것이 가장 바람직하나 이에 한정하지 않는다.

상기 범위를 벗어나는 경우, 5 kGy 이하의 조사선량에서는 방사선에 의한 콜라겐 추출의 효과가 없으며, 200 kGy 이상의 조건에서는 콜라겐의 분해 및 변성이 일어나는 문제점이 있다.

본 발명에 따른 제조방법에 있어서, 상기 단계 4)는 교반물을 여과한 후 건조시키는 단계이고 하기 구체적인 방법에 따른다.

i) 교반물을 여과한 여과액으로부터 침전물을 획득하는 단계;

ii) 상기 단계 i)의 침전물을 산에 용해시킨 후 상등액을 획득하는 단계;

iii) 상기 단계 ii)의 상등액에 염을 첨가하여 침전물을 획득하는 단계; 및

iv) 상기 단계 iii)의 침전물을 산에 용해시킨 후 희석한 후, 동결건조시키는 단계로 수행되는 것이 바람직하나 이에 한정하지 않는다.

또한, 본 발명은 상기 방법으로 제조된 산가용성 콜라겐을 프로테아제(protease)로 처리한 후 건조시키는 단계를 포함하는 아텔로 콜라겐(attelo collagen)의 제조방법을 제공한다.

상기 프로테아제는 펩신 또는 트립신인 것이 바람직하며, 펩신인 것이 보다 바람직하나 이에 한정하지 않는다.

상기 프로테아제는 1 내지 10 (w/w)%를 첨가하는 것이 바람직하고, 3 내지 6 (w/w) %인 것이 보다 바람직하며, 5 (w/w)%인 것이 가장 바람직하나 이에 한정하지 않는다.

상기 프로테아제는 콜라겐의 텔로 펩타이드(Telo peptide)를 제거하며, 콜라겐 분자의 말단 부분에 있는 헬릭스 구조가 제거되므로 항원성이 제거되므로 생체분자로 이용하기 용이하다.

상기 건조는 -178 내지 -70℃에서 급속동결시키는 것이나, 이에 한정하지 않는다.

본 발명은 하기 단계를 포함하는 해파리로부터 아텔로 콜라겐의 구체적인 제조방법을 제공한다.

a) 산가용성 콜라겐을 산과 펩신의 혼합용액에 용해시킨 후 교반시키는 단계;

b) 상기 단계 a)의 교반물로부터 침전물을 획득한 후 산에 용해시킨 다음 염을 첨가하여 콜라겐을 침전시키는 단계; 및

c) 상기 단계 b)의 침전된 콜라겐을 산에 녹인 후 희석한 다음, 동결시키는 단계.

본 발명에 있어서, 방사선을 이용하여 해파리로부터 콜라겐의 분리방법은 해파리를 세척 및 분쇄한 다음 산 용액에 담침하고 방사선을 조사하여 산가용성 콜라겐을 추출한 다음에 펩신을 처리하여 동결건조시키면 아텔로 콜라겐을 제조할 수 있다.

구체적으로, 도 1 및 도 2의 모식도와 같이 해파리를 세척 및 분쇄하고, 분쇄된 해파리를 산성 용액에 담침하며, 용액에 방사선을 조사한 후 교반시키고, 교반물을 여과한 여과액으로부터 침전물을 획득한 다음 산에 용해시킨 후 상등액을 획득하여 염을 첨가한 침전물을 산에 용해시킨 후 희석한 후 동결건조시켜 산가용성 콜라겐을 추출하였다. 그런 다음 산가용성 콜라겐을 산과 펩신의 혼합용액에 용해시킨 후 교반시키고, 교반물로부터 침전물을 획득한 후 산에 용해시킨 다음 염을 첨가하여 콜라겐을 침전시켜 산에 녹인 후 희석한 다음, 동결건조시키면 아텔로 콜라겐을 제조할 수 있다.

본 발명의 구체적인 실시예에서는, 노무라 입깃 해파리(Nemopilema nomuri Kishinouye)를 증류수로 세척한 후 분쇄하였고, 아세트산(acetic acid)에 담근 후, 감마선을 조사하여 교반하였으며, 교반물을 여과 후 여과액으로 희석하여 얻은 침전물에 아세트산에 용해하여 상등액을 얻었고, 그런 다음 상등액에 염화나트륨을 첨가하여 침천물을 얻은 후 다시 아세트산에 용해시키고 동결건조하여 산가용성 콜라겐을 얻었다. 그런 다음 산가용성 콜라겐을 아세트산과 펩신을 용해시킨 후 교반하였고, 교반물로부터 침전물을 획득한 후 산에 용해시킨 다음 염을 첨가하여 콜라겐을 침전시켜 산에 녹인 후 희석한 다음, 동결건조시키면 아텔로 콜라겐을 제조하였다(도 1 및 도 2 참조)

본 발명의 실험예에서 분쇄에 따른 해파리의 무게 및 입자 크기를 분석한 결과, 동결건조 전 해파리를 분쇄하면 무게가 25% 감소하고, 분쇄 시간을 지속할수록 동결건조한 해파리의 입자가 작아지며, 특히 60초 동안 분쇄한 경우 약 128 ㎛의 입자크기를 가지는 것을 확인하였다(도 3 및 도 4, 및 표 1 및 표 2 참조)

본 발명의 실험예에서 추출시간에 따른 산가용성 콜라겐 추출 정도를 분석한 결과, 3일 또는 5일 동안 교반 후 콜라겐을 추출한 경우 콜라겐 수율이 현저히 증가하는 것을 확인하였다(도 5 참조).

본 발명의 실험예에서 방사선 조사량에 따른 산가용성 콜라겐 추출 정도를 분석한 결과, 방사선 조사량이 증가함에 따라 추출되는 콜라겐 수율이 증가하고, 특히 10 kGy 및 25 kGy의 조사선량 조사로 콜라겐 수율이 현저하게 증가하고, 100 kGy에서는 약간 노랗게 변하는 것을 확인하였다(도 6 참조).

본 발명의 실험예에서 방사선 조사량에 따른 아텔로 콜라겐 추출량을 분석한 결과, 방사선 조사선량이 높은 아텔로 콜라겐의 경우 무게변화가 더 적은 것을 확인하였다(도 7 참조).

본 발명의 실험예에서 방사선 조사량에 따른 콜라겐의 화학적 특성 및 열적 특성을 분석한 결과, 본 발명에 따라 해파리로부터 방사선을 조사하여 추출한 콜라겐이 동물유래 콜라겐과 유사한 스펙트럼 패턴을 가지는 것을 확인함으로써, 방사선 조사가 화학적 특성 및 열적 특성에 영향을 미치지 않음을 확인하였다(도 8 및 도 9 참조).

본 발명의 실험예에서 방사선 조사사량에 따른 아텔로 콜라겐의 성분을 분석한 결과, 10 kGy 조사선량으로 조사하고 본 발명에 따라 제조된 해파리 유래 아텔로 콜라겐과 동물유래 콜라겐의 성분이 유사한 것을 확인하였다(도 10 및 표 3 참조)

따라서, 본 발명의 해파리로부터 산가용성 콜라겐의 분리방법 및 아텔로 콜라겐의 제조방법을 이용하면 기존의 화학물질만 처리하는 방법에 비해 콜라겐을 분리하는 수득율이 매우 높고, 화학물질의 사용을 줄일 수 있어 비용이 절감되며, 생태계에 좋지 않은 해파리를 이용하므로 환경오염 예방에 도움을 줄 수 있다.

이하, 본 발명을 실시예 및 실험예에 의하여 상세히 설명한다.

단, 하기의 실시예 및 실험예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기의 실시예 및 실험예에 의하여 한정되는 것은 아니다.

< 실시예 1> 해파리 세척 및 분쇄

노무라 입깃 해파리(Nemopilema nomuri Kishinouye)는 국립수산과학원으로부터 얻어, 비흥항(군산, 한국)에서 아이스박스에 얼음과 함께 냉장 상태로 운반하였다. 염장 상태의 해파리를 4℃ 증류수로 세척한 후 3일 동안 4℃에서 증류수를 교체하며 세척하였다. 그 다음, 상기 세척한 해파리를 믹서기로 분쇄한 후 거름망으로 물기를 제거하였다. 그 다음, 상기 물기를 제거한 해파리를 동결건조하고 믹서기로 분쇄하였다.

<실시예 2> 해파리를 산성 용액에 담침 및 방사선 조사

상기 <실시예 1>에서 조각낸 해파리를 0.5 M 아세트산(acetic acid, glacial grade, Merck(Darmstadt, Germany)에 담근 후, 감마선(⁶⁰Co 선원, Pencil type, MDS Nordion, Cananda)을 10 kGy/hr의 선량으로 10 내지 100 kGy 조사한 후 4℃에서 2주 동안 교반하였다.

<실시예 3> 해파리에서 산가용성 콜라겐의 추출

상기 <실시예 2>에서 수득한 교반물을 여과 후 여과액을 0.02 M 인산수소제이나트륨(Na₂HPO_4,Sigma(St. Luis MO, USA))와 1:3(v/v)로 희석하여 투석한 후 원심 분리기(2000 rpm, 6 min)를 이용하여 침전물을 얻었다. 이 침전물을 다시 0.5M 아세트산에 용해하여, 다시 원심분리기(2000 rpm, 6 min)를 이용하여 상등액을 얻었다. 그런 다음 상등액에 염화나트륨(Sodium chloride, NaCl, Sigma)을 0.9 M이 되도록 첨가하여 침천물을 얻은 후 다시 0.5 M 아세트산에 용해시키고 0.1 M 아세트산이 되도록 희석한 후, 동결건조하여 산가용성 콜라겐을 얻었다.

<실시예 4> 아텔로 콜라겐의 제조

상기 <실시예 3>에서 분리한 산가용성 콜라겐을 0.5 M 아세트산과 5 w/w % 펩신(pepsin, EC 3.4.23.1, 2 x crystallized, Tokyo chemical industry, Japan) 혼합용액에 용해시킨 후 4℃에서 24 시간 교반하였다. 그 교반물을 0.02 M 인산수소제이나트륨에 희석하여 침전물을 원심분리하여 얻고 다시 0.5 M 아세트산에 용해시킨 후 염화나트륨을 첨가하여 농도를 0.9 M이 되게 하여 콜라겐을 침전시켰다. 그런 다음 침전시킨 콜라겐을 다시 0.5 M 아세트산에 녹인 후 0.1 M 아세트산이 되도록 희석한 다음 동결건조하여 아텔로 콜라겐을 제조하였다.

<실험예 1> 분쇄에 따른 해파리 무게 분석

노무라 입깃 해파리는 몸의 90% 이상이 수분으로 되어 있는 대형 해파리이므로 해파리의 동결 건조 전 부피를 줄일 필요가 있다. 따라서, 분쇄에 따른 해파리 무게를 확인하기 위하여 상기 <실시예 1>에 기재된 방법으로 세척한 해파리를 믹서기로 분쇄하여 무게를 측정하였다.

그 결과, 도 3 및 표 1에 나타낸 바와 같이, 분쇄 전후 해파리의 무게가 약 25% 감소하는 것을 확인하였다(도 3 및 표 1).

	분쇄 후 무게 소실(%)
평균 무게 소실	25.50138
평균 오차	1.101062

<실험예 2> 분쇄시간에 따른 해파리 입자 크기 분석

분쇄시간에 따른 해파리 입자 크기를 분석하기 위하여 상기 <실시예 1>에 기재된 방법으로 동결건조한 해파리를 0, 15, 30, 45 및 60초 동안 분쇄한 후 전자현미경으로 분쇄된 해파리의 입자크기를 확인하였다.

그 결과, 도 4 및 표 2에 나타낸 바와 같이, 분쇄시간에 따라 해파리의 입자크기가 감소하며, 특히, 동결건조한 해파리를 60초 동안 분쇄한 경우 15초 동안 분쇄한 경우보다 약 17배 정도까지 입자크기가 감소함을 확인하였다(도 4 및 표 2).

분쇄시간(초)	15	30	45	60
평균 입자크기(㎛)	2841.98	1214.30	472.02	128.69
평균 오차	322.41	211.87	116.60	22.87

< 실험예 3> 추출시간에 따른 산가용성 콜라겐의 분석

추출시간에 따른 산가용성 콜라겐 추출 정도를 분석하기 위하여 상기 <실시예 1>에서 조각낸 해파리를 0.5 M 아세트산(acetic acid, glacial grade, Merck(Darmstadt, Germany))에 담근 후 감마선을 10 및 25 kGy 조사한 다음 4℃에서 1, 3 및 5일 동안 교반한 후 상기 <실시예 3>의 방법으로 콜라겐을 추출하고, 수득한 콜라겐의 무게를 측정하여 하기 [수학식 1]에 따라 수율을 계산하여 확인하였다(도 5).

그 결과, 도 5에 나타낸 바와 같이, 1일 동안 교반한 후 콜라겐을 추출한 경우보다 3 또는 5일 동안 교반한 후 콜라겐을 추출한 경우 콜라겐 수율이 증가하였고, 10 kGy의 조사선량보다 25 kGy의 조사선량으로 감마선을 조사하였을 때 콜라겐 수율이 좀더 증가하는 것을 확인하였다(도 5).

<실험예 4> 방사선 조사량에 따른 산가용성 콜라겐의 분석

방사선 조사량에 따른 산가용성 콜라겐 추출 정도를 분석하기 위하여 상기 <실시예 1>에서 조각낸 해파리를 0.5 및 1 M 아세트산에 담근 후 감마선을 0, 10, 25, 50 및 100 kGy 조사한 다음 4℃에서 2주 동안 교반한 후 상기 <실시예 3>의 방법으로 콜라겐을 추출하고, 수득한 콜라겐의 무게를 측정하여 상기 [수학식 1]에 따라 수율을 계산하여 확인하였다(도 6).

그 결과, 도 6에 나타낸 바와 같이, 0 kGy를 100%로 보았을 때 조사선량이 증가함에 따라 추출되는 콜라겐 수율이 증가하였고, 25 kGy의 조사선량에서는 421.20±67.66%까지 추출되는 콜라겐 수율이 현저하게 증가하는 것을 확인하였다(도 6).

<실험예 5> 방사선 조사량에 따른 아텔로 콜라겐의 분석

방사선 조사량에 따른 아텔로 콜라겐 추출량을 분석하기 위하여 상기 <실시예 1>에서 조각낸 해파리를 0.5 및 1 M 아세트산에 담근 후 감마선을 0, 10, 25, 50 및 100 kGy 조사한 다음 4℃에서 2주 동안 교반한 후 상기 <실시예 3>의 방법으로 산가용성 콜라겐을 분리하였다. 그 다음, 상기 분리한 산가용성 콜라겐을 0.5 M 아세트산과 5 w/w% 펩신(pepsin, EC 3.4.23.1, 2 x crystallized, Tokyo chemical industry, Japan) 혼합 용액에 담근 후 4℃에서 24시간 동안 교반한 후 <실시예 4>의 방법으로 아텔로 콜라겐을 추출하고, 무게를 측정하여 하기 [수학식 2]에 따라 추출률을 계산하여 확인하였다.

그 결과, 도 7에 나타낸 바와 같이, 펩신을 처리하여 생성된 아텔로 콜라겐의 무게는 감소하는데 조사선량이 높은 아텔로 콜라겐의 경우 무게변화가 더 적었으며, 방사선을 사용하여 콜라겐을 추출할 경우 추출량을 증가시킬 수 있음을 확인하였다(도 7).

<실험예 6> 방사선 조사량에 따른 콜라겐의 화학적 특성 분석

산가용성 콜라겐의 화학적 특성을 ATR-FTIR 분광광도계(spectrophotometer)를 사용하여 분석하였다.

구체적으로, 상기 <실험예 4>와 같이 조각낸 해파리에 감마선 0, 10 및 25 kGy 조사하여 추출한 콜라겐과 육상동물 유래 콜라겐으로 쥐 꼬리 1형 콜라겐(rat tail type I collagen)을 ATR-FTIR 분광광도계(Bruker TEMSOR 37, Bruker AXS. Inc., Germany)를 사용하여 분석하였다. 스펙트럼은 500-4000 cm^-1의 범위를 측정하였으며, ATR 모드와 주사회수는 64회, 4 cm^-1 분해능의 조건으로 분석하였다.

그 결과, 도 8에 나타낸 바와 같이, 산가용성 콜라겐의 화학적 특성을 확인하였다. 해양 유래 콜라겐은 동물유래 콜라겐과 유사한 스펙트럼 패턴을 가지고 있다. 아미드(amide) A, I 및 II의 영역은 폴리펩티드(polypeptide)의 형태와 직접적인 연관이 있다. 아미드 A 영역(3400-3440 cm^-1)은 N-H 신축(stretching)과 관련이 있으며, 아미드 I 영역(1600-1660 cm^-1)은 펩티드의 카르보닐기(carbonyl group)의 신축 진동(stretching vibrations)과 관련이 있으며 단백질의 2차 구조를 알아보는데 가장 유용하게 이용이 된다. 아미드 II 영역(-1550 cm^-1)은 NH 굽힘(bending)와 CN 신축과 관련이 있으며, 콜라겐의 트리플 헬리컬(triple helical) 구조와 관련이 있다. 해파리 콜라겐의 경우 1635 cm^-1, 1530 cm^-1 , 3280 cm^-1에서 아미드 I, 아미드 II, 아미드 A 피크를 확인할 수 있었다(도 8).

<실험예 7> 방사선 조사량에 따른 콜라겐의 열적 특성 분석

산가용성 콜라겐의 열적 특성을 시차주사 열량측정기(differential scanning calorimeters)를 사용하여 분석하였다.

구체적으로, 상기 <실험예 4>와 같이 조각낸 해파리에 감마선 0, 10 및 25 kGy 조사하여 추출한 콜라겐과 쥐 꼬리 1형 콜라겐을 시차주사 열량측정기(differential scanning calorimeters)(TA Q100, TA instruments, USA)를 사용하여 분석하였다. 시료의 측정은 질소 상태에서 10℃/분의 승온속도로 0~300℃까지 측정하였다.

그 결과, 도 9에 나타낸 바와 같이, 열변화에 따라 10 kGy 및 25 kGy 조사 후 추출한 산가용 콜라겐 모두 감마선을 조사하지 않는 해파리에서 추출한 콜라겐과 유사한 패턴을 나타내고, 특히 10 kGy 조사 후 추출한 산가용 콜라겐은 감마선을 조사하지 않은 해파리에서 추출한 콜라겐과 거의 동일한 패턴을 나타냄을 확인함으로써, 해파리로부터 고농도의 콜라겐 수득을 위한 방사선 조사가 열적 특성에 영향을 미치지 않음을 확인하였다(도 9).

<실험예 8> 방사능 조사량에 따른 아텔로 콜라겐의 SDS-PAGE 분석

방사능 조사량에 따른 아텔로 콜라겐의 성분을 분석하기 위하여, SDS-PAGE를 수행하였다.

구체적으로, 전기영동은 Mini-Protean 3(Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA)를 사용하여 Laemmli(1970)의 방법으로 측정하였다. 폴리아크릴아마이드 겔(polyacrylamide gel)은 스태킹 겔(stacking gel)과 분해 겔(resolving gel)로 각각 5%의 농도로 만들어 사용하였다. 상기 <실험예 5>와 같이 0.5 M 아세트산에 담근 후 감마선을 0, 10 및 25 kGy 조사한 해파리로부터 추출한 아텔로 콜라겐 시료의 농도는 증류수를 이용하여 20 mg/㎖로 만들어 사용하였으며, 10% SDS를 함유하는 0.25 M Tris-HCl(pH 6.8), 20% 글리세롤(Glycerol), 5% 2-머캅토에탄올(2-Mercaptoethanol), 0.1%의 브로모페놀 블루(Bromophenol blue)를 혼합시킨 후 100℃에서 3분 동안 가열하였다. 쥐 꼬리 1형 콜라겐을 대조군 단백질로 비교 및 분석하기 위하여 상기 해파리 콜라겐과 동일한 방법으로 시료를 제조하였다. 상기 제조된 해파리 콜라겐 시료와 쥐 꼬리 1형 콜라겐 시료를 상기 폴리아크릴아마이드 겔에 주입한 뒤 20 mA/겔로 정기영동하였다. 전기영동이 끝난 겔은 0.25%(w/v) 쿠마쉬 브릴리언트 블루(coomassie brilliant blue) R250으로 염색한 뒤 메탄올(methanol)과 아세트산(acetic acid) 혼합액으로 탈색하여 쥐 꼬리 1형 콜라겐과 해파리 콜라겐을 비교 분석하였다.

그 결과, 도 10에 나타낸 바와 같이, 쥐 꼬리 1형 콜라겐은 두 개의 α1-사슬(chain), α2-사슬, β-요소(component)(α-사슬의 가교결합된 이량체)로 이루어져 있으며, 해파리 유래 아텔로 콜라겐의 경우는 α1-사슬, α2-사슬은 같은 이동도가 나타났으나, β-요소는 희미하게 나타났다(도 10).

<실험예 9> 방사능 조사량에 따른 아텔로콜라겐의 아미노산 분석

상기 <실험예 5>와 같이 0.5 M 아세트산에 담근 후 감마선을 0 및 10 kGy 조사한 해파리로부터 추출한 아텔로 콜라겐과 쥐 꼬리 1형 콜라겐 각각의 아미노산 분석을 수행하였다.

그 결과, 표 3에 나타낸 바와 같이, 해파리 콜라겐 및 쥐 꼬리 1형 콜라겐 모두 글리신(glycine), 알라닌(alanine)과 프롤린(proline)의 양이 많은 부분을 차지하여 전형적인 콜레겐의 특징을 보여 주었다. 특히, 감마선을 조사하지 않은 아텔로 콜라겐과 10 kGy 조사한 아텔로 콜라겐의 아미노산 성분이 거의 변화하지 않음을 확인하였다. 또한, 본 발명의 해파리 콜라겐의 경우 포유류인 쥐 꼬리 1형 콜라겐에 비해 히드록시프롤린(hydroxyproline)의 함량이 낮음을 확인할 수 있었다(표 3).

종류 (단위 :　 몰 %)	아텔로 콜라겐 (Radiation dose,kGy)		쥐 꼬리 1형 콜라겐
종류 (단위 :　 몰 %)	0	10	쥐 꼬리 1형 콜라겐
시스테인(cysteine) 및 시스틴(cystine)	0.75	0.64	0.16
아스파라긴(asparagines) 및 아스파르트산(aspartic acid)	2.25	3.04	4.70
글루타민(glutamine) 및 글루탐산(glutamic acid)	9.06	9.30	7.57
하이드록시프롤린(Hydroxyproline)	0.40	1.08	9.38
세린(Serine)	6.00	6.23	3.20
글리신(Glycine)	10.05	10.62	32.90
히스티딘(Histidine)	1.14	1.07	0.43
아르기닌(Arginine)	3.37	3.96	5.29
트레오닌(Threonine)	6.67	6.24	1.80
알라닌(Alanine)	9.73	10.02	11.48
프롤린(Proline)	12.21	9.42	12.80
타이로신(Tyrosine)	2.83	2.12	0.19
발린(Valine)	6.88	8.14	2.41
메티오닌(Methionine)	2.03	1.30	0.59
이소류신(Isoleucine)	6.44	7.29	1.23
류신(Leucine)	8.66	8.90	2.32
페닐알라닌(Phenylalanine)	4.68	3.17	1.25
트립토판(Tryptophan)	1.46	0.68	0.17
리신(Lysine)	5.10	6.78	2.12
총 합	100 (%)	100 (%)	100 (%)

Claims

1) 해파리(jellyfish)를 세척 및 분쇄하는 단계;
2) 상기 단계 1)의 분쇄된 해파리를 산성 용액에 담침하는 단계;
3) 상기 단계 2)의 용액에 5 kGy 내지 100 kGy의 조사선량으로 감마선을 조사한 후 교반시키는 단계; 및
4) 상기 단계 3)의 교반물을 여과한 후 건조시키는 단계를 포함하는 해파리로부터 산가용성 콜라겐(collagen)의 분리방법.

제 1항에 있어서, 상기 단계 1)은
I) 세척한 해파리를 분쇄하는 단계;
II) 상기 단계 I)의 분쇄된 해파리를 동결건조하는 단계; 및
III) 상기 단계 II)의 동결건조된 해파리를 분쇄하는 단계로 수행되는 것을 특징으로 하는 해파리로부터 산가용성 콜라겐의 분리방법.

제 2항에 있어서, 상기 단계 III)의 동결건조된 해파리는 입자크기가 100 내지 3000 ㎛로 분쇄되는 것을 특징으로 하는 해파리로부터 산가용성 콜라겐의 분리방법.

제 1항에 있어서, 상기 단계 2)의 산성 용액은 아세트산, 시트르산 및 포름산으로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나인 것을 특징으로 하는 해파리로부터 산가용성 콜라겐의 분리방법.

제 1항에 있어서, 상기 단계 2)의 산성 용액은 0.01 M 내지 2.0 M 농도인 것을 특징으로 하는 해파리로부터 산가용성 콜라겐의 분리방법.

삭제

제 1항에 있어서, 상기 단계 4)는
ⅰ) 교반물을 여과한 여과액으로부터 침전물을 획득하는 단계;
ⅱ) 상기 단계 ⅰ)의 침전물을 산에 용해시킨 후 상등액을 획득하는 단계;
ⅲ) 상기 단계 ⅱ)의 상등액에 염을 첨가하여 침전물을 획득하는 단계; 및
ⅳ) 상기 단계 ⅲ)의 침전물을 산에 용해시킨 후 희석한 후, 동결건조시키는 단계로 수행되는 것을 특징으로 하는 해파리로부터 산가용성 콜라겐의 분리방법.

제 1항 내지 제 5항, 제 8항 중 어느 한 항의 방법으로 제조된 산가용성 콜라겐을 프로테아제(protease)로 처리한 후 건조시키는 단계를 포함하는 아텔로 콜라겐(attelo collagen)의 제조방법.

제 9항에 있어서, 상기 프로테아제는 펩신 또는 트립신인 것을 특징으로 하는 아텔로 콜라겐의 제조방법.

제 9항에 있어서, 상기 프로테아제는 1 내지 10 (w/w)%를 첨가하는 것을 특징으로 하는 아텔로 콜라겐의 제조방법.

제 9항에 있어서, 상기 프로테아제는 콜라겐의 텔로 펩타이드(Telo peptide)를 제거하는 것을 특징으로 하는 아텔로 콜라겐의 제조방법.

제 9항에 있어서, 상기 건조는 -178 내지 -70℃에서 급속동결시키는 것을 특징으로 하는 아텔로 콜라겐의 제조방법.

제 9항에 있어서, 상기 산가용성 콜라겐을 프로테아제(protease)로 처리한 후 건조시키는 단계는
a) 산가용성 콜라겐을 산과 펩신의 혼합용액에 용해시킨 후 교반시키는 단계;
b) 상기 단계 a)의 교반물로부터 침전물을 획득한 후 산에 용해시킨 다음 염을 첨가하여 콜라겐을 침전시키는 단계; 및
c) 상기 단계 b)의 침전된 콜라겐을 산에 녹인 후 희석한 다음, 동결시키는 단계로 수행되는 것을 특징으로 하는 아텔로 콜라겐의 제조방법.