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KR101574817B1 - 스테비아 추출물 또는 스테비아 추출물 구성성분을 함유하는 신규한 기능식품 조성물 및 이의 용도 - Google Patents

스테비아 추출물 또는 스테비아 추출물 구성성분을 함유하는 신규한 기능식품 조성물 및 이의 용도 Download PDF

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KR101574817B1
KR101574817B1 KR1020107014634A KR20107014634A KR101574817B1 KR 101574817 B1 KR101574817 B1 KR 101574817B1 KR 1020107014634 A KR1020107014634 A KR 1020107014634A KR 20107014634 A KR20107014634 A KR 20107014634A KR 101574817 B1 KR101574817 B1 KR 101574817B1
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레지나 고랄치크
클라우스 킬페르트
애니스 올리비아 메인-메칸
하산 모하예리
베른드 무슬러
아드리안 비스
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디에스엠 아이피 어셋츠 비.브이.
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Abstract

본 발명은 스테비아 추출물 또는 이의 구성성분, 예컨대 스테비올 및 스테비오사이드를 활성 성분으로서 함유하는 신규한 기능식품 조성물에 관한 것이다. 본원에 사용된 용어 "기능식품"은 영양학적, 약학적 및 수의학적 적용 분야에서 유용성을 나타낸다. 상기 조성물은 인지 기능, 예컨대 학습, 기억 및 민첩성의 개선, 및 정신적 안정성에 유용하다.

Description

스테비아 추출물 또는 스테비아 추출물 구성성분을 함유하는 신규한 기능식품 조성물 및 이의 용도{NOVEL NUTRACEUTICAL COMPOSITIONS CONTAINING STEVIA EXTRACT OR STEVIA EXTRACT CONSTITUENTS AND USES THEREOF}
본 발명은 스테비아(Stevia) 추출물 또는 이의 구성성분, 예컨대 스테비올 및 스테비오사이드를 활성 성분으로서 포함하는, 인지 기능, 예컨대 학습, 기억 및 민첩성을 개선시킬뿐만 아니라 심리사회적 압박을 경감시키기 위한 신규한 기능식품 조성물 또는 식품 첨가제에 관한 것이다.
기억, 학습 및 민첩성은 중뇌, 특히 정보가 처리되고 기억이 고정되는 해마의 신경 회로에 의존한다. 정신적 기능수행 및 학습은 시냅스 가소성(synaptic plasticity), 즉 새로운 수용체의 동원에 의한 신경 연결의 강화, 신규한 시냅스 형성 및 궁극적으로 신규한 신경 연결의 발생에 의존한다.
(장기) 기억의 형성 및 뇌의 효율적 기능수행은 뉴런 사이의 정보교환력의 강화를 위한 새로운 단백질의 합성에 의존한다. 시냅스 강화에 기여하는 새로운 단백질의 생성은 뉴런내의 화학적 및 전기적 신호에 의해 유발된다.
장기 강화작용(LTP)은 시냅스 전 전기 자극의 짧은 컨디셔닝 방출(1 초 동안 약 100 Hz) 후 중추신경계(CNS)내의 특정 시냅스에서 일어나는 시냅스 전달의 장기-지속 강화(시험관내에서 수 시간, 생체내에서 수 일 또는 수 주)를 기술하는 데 사용되는 용어이다. 이 현상은 광범위하게는 기억이 뇌에서 형성되고 저장되는 주요 기전중 하나인 것으로 간주된다. LTP는 시험관내 및 살아있는 동물내에서 관찰된다. 실험 조건하에서, 일련의 짧은 고-주파수 전기 자극이 시냅스에 인가되면 수 분 내지 수 시간 동안 화학적 시냅스의 강도가 강화될 수 있다. 가장 중요하게는, LTP는 고도로 적응가능한 신경계에 대한 기초를 제공하는, 살아있는 동물내의 시냅스 가소성에 기여한다.
2 종의 상이한 수용체 유형, 즉 N-메틸-D-아스파테이트(NMDA) 수용체 착물 및 α-아미노-3-하이드록시-5-메틸-4-이속사졸 프로피온산(AMPA) 수용체가 LTP의 과정에 주로 관여한다. LTP 동안, 주요 흥분 신경전달제인 글루타메이트가 시냅스 전 뉴런으로부터 방출되고, 시냅스 후 막상의 AMPA 수용체에 결합하여 상기 수용체를 활성화시킴으로써 그의 탈분극화를 야기한다. 휴지 막 전위에서, NMDA 수용체 채널은 마그네슘 이온에 의해 차단되지만, 시냅스 후 막의 탈분극화는 이 차단을 제거하여, NMDA 수용체가 활성화된 후 칼슘이 세포내로 도입될 수 있게 한다. 이러한 세포내 칼슘의 상승은 단백질 키나제를 활성화시키고, 단백질 키나제의 활성화는 유전자 전사 및 강화 단백질의 구축을 유발하고(문헌[Niehoff (2005), The Language of Life: How Cells Communicate in Health and Disease, 210-223]), AMPA 수용체의 감수성을 강화시킴으로써, 신경전달 및 LTP의 유지를 더 촉진하는 것으로 여겨진다.
NMDA 수용체는 NR1- 및 NR2-아단위의 조립체로 구성되고, 글루타메이트 결합 도메인은 상기 아단위의 접합부에서 형성된다. 글루타메이트 외에, NMDA 수용체는 수용체 기능의 조절을 위해 보조-작용제(co-agonist)인 글리신을 필요로 한다. 글리신 결합 부위는 NR1 아단위상에서 발견되지만, NR2 아단위는 NMDA 수용체의 기능수행을 조절하는 조절 분자인 폴리아민에 대한 결합 부위를 보유한다.
따라서, 아미노산 글리신은 NMDA 수용체 착물에서 글루타메이트와 함께 양성 알로스테릭 조절제 및 필수적인 보조-작용제로서 작용하는 것으로 공지되어 있다(문헌[Danysz and Parsons 1998 Pharmacol. Rev., 50(4):597-664]). 글리신 수송체(GlyT)는 글리신을 시냅스 전 신경 말단 또는 신경아교 세포내로 재흡수시킴으로써 시냅스 후 글리신 작용의 종결 및 낮은 세포외 글리신 농도의 유지에 있어서 중요한 역할을 수행한다. 따라서, 글리신의 작용 종결은 신속한 재흡수에 의해 주로 매개된다. 2 종의 글리신 수송체, 즉 GlyT1 및 GlyT2가 공지되어 있고, 12 개의 잠정적 막관통 영역을 가지고 있음을 특징으로 하며, 동일한 유전자로부터 코딩되는 GlyT1의 3 종의 변이체(GlyT1a, GlyT1b 및 GlyT1c)가 동정되었다(문헌[Borowsky and Hoffman 1998, J. Biol. Chem., 273 (44), 29077-29085]).
GlyT1은 전뇌내에서 NMDA 수용체와 함께 동시 발현되는 유일한 나트륨 클로라이드-의존성 글리신 수송체이다. GlyT1은 상기 부위에서 시냅스에서의 글리신의 세포외 수준을 조절함으로써(문헌[Lopez-Corcuera et al 2001, Mol. Membr. Biol., 18(1): 13-20]) NMDA 수용체의 기능을 조절하는 역할을 담당하는 것으로 생각된다.
실제로, 선택적인 GlyT1 길항제인 N-[3-(4'-플루오로페닐)-3-(4'-페닐페녹시)]프로필사르코신(NFPS)의 존재하에서, CA1 피라미드 세포에서의 강화된 NMDA 수용체 반응은 마우스 및 래트의 해마 슬라이스 표본에서 샤퍼 곁자극(Schaffer collateral stimulation)이 인가되었을 때 관찰되었다(문헌[Bergeron, et al 1998, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95(26), 15730-15734]). 생체내에서, NFPS의 전신 투여는 치아이랑(dentate gyrus)에서 LTP를 증가시키고, 성체 마우스에서 청각적 놀람 반응(acoustic startle response)의 맥박 전(prepulse) 억제를 강화시켰는데, 이는 GlyT1의 억제가 거동-관련 방식으로 NMDA 수용체 기능에 영향을 미치는 것을 나타낸다(문헌[Kinney, et al 2003, J. Neurosci., 23(20), 7586-7591]).
이러한 데이터는, 정신병적 증후군을 예방하고, 정상 개체에서 생리학적 인지 기능, 예컨대, 기억 및 학습을 유지하거나 강화시키는데 있어서 시냅스 NMDA 수용체의 국소 미세환경하에서 글리신의 세포외 농도를 상승시킴으로써 NMDA 수용체 시냅스 기능을 강화시킬 수 있는 화합물의 잠재적 유용성을 강조한다.
장년층 및 청년층 둘다, 특히 일상 업무에서 높은 기억 및 집중을 필요로 하는 개인(학생, 건설 노동자, 운전자, 파일럿, 의사, 판매원, 행정직원, 가정주부, "고능력 전문직", 및 정신적 스트레스를 받거나 매일 스트레스를 받는 사람들을 포함함)뿐만 아니라 정신병적 불안정, 예컨대 정신분열증에 걸리기 쉬운 개인의 학습, 기억 및 민첩성을 개선시키는데 사용될 수 있는 화합물 및 기능식품 조성물의 개발에 대한 관심이 증가하고 있다.
따라서, NMDA 수용체 기능을 강화시키고 학습, 기억 및 민첩성을 개선시킬 수 있는 화합물 또는 기능식품 조성물이 특히 바람직하다.
스테비아 추출물이 종래에 음료/식품 조성물에 첨가되었지만(예를 들어, 니뽕 페이퍼 케미칼 캄파니 리미티드(Nippon Paper Chemical Co., Ltd)의 일본특허공개 제2005-278467호 참고), 스테비아 추출물은 감미제로서 기능하였다.
본 발명에 따라서, 하기 화학식 I 및 II의 화합물이 LTP를 유도하는 이의 능력을 통한 해마 기능의 활성화제이고, 또한 인지 기능을 강화시키는 기능식품 및/또는 약제로서 유용함이 밝혀졌다. 이러한 화합물은 글리신 수송체인 GlyT1을 억제하여 글리신의 재흡수를 억제하거나, LTP 유도를 야기하는 다른 경로를 활성화시키거나, 상기 기전 둘다에 의해 기능할 수 있다. 따라서, 본 발명은 인지 기능을 강화시키는 양의 화학식 I 또는 II의 화합물, 또는 이들의 혼합물을 동물(인간을 포함함)에게 투여함으로써, 인지 기능을 강화시키는 방법에 관한 것이다.
또한, 본 발명에 따라서, 스테비아 추출물이 글리신 수송체인 GlyT1을 억제함으로써 글리신 재흡수를 억제하는 능력을 가지는 것이 밝혀졌다. 상기 능력으로 인한 세포외 글리신 수준의 증가는 다수의 유전자의 전사 활성화를 유도한 후, 기억 형성 및 기억 고정에 관여하는 주요 세포 기전인 LTP를 유도하는 제 1 단계인 NMDA 수용체의 강화된 활성화를 야기한다.
또한, 본 발명에 따라서, 스테비아 추출물에서 발견될 수 있는 화합물인 스테비올, 이소스테비올 및 스테비오사이드는 상이한 기전을 통해 LTP를 유도한다. 상기 과정 둘다가 동일한 생물학적 이익을 가지므로, 즉 상기 과정 둘다가 해마 기능을 촉진하므로, 본 발명의 다른 양상은 인지 기능을 강화시키기 위한 하나 이상의 상기 활성 성분의 용도이다.
따라서, 본 발명의 한 양상은 인지 기능을 강화시키기 위한, 하나 이상의 화학식 I 또는 II의 화합물 또는 스테비아 추출물을 포함하는 신규한 기능식품 조성물이다. 하기 표 1중 특히 바람직한 화합물은 이소스테비올 외에 스테비올 및 스테비오사이드이다.
[화학식 I]
Figure 112010042668360-pct00001
R 기의 상세한 내용에 대해서는 하기 표 1을 참고한다.
Figure 112010042668360-pct00002
[화학식 II]
Figure 112010042668360-pct00003
이소스테비올(CAS 번호, 27975-19-5)은 스테비올 글리코사이드의 분해 산물이다.
화학식 I 및 II의 화합물은 공지된 방법을 이용하여 합성적으로 제조될 수 있거나, 공지된 추출 과정을 이용하여 식물과 같은 천연 공급원으로부터 추출될 수 있거나, 식물 추출물, 바람직하게는 해마 기능의 효과적인 강화제가 되기에 충분한 양의 스테비올 및/또는 스테비오사이드를 함유하는 스테비아 추출물의 성분으로서 사용될 수 있다.
도 1은 GlyT1 억제 분석에서 스테비아 추출물의 투여량-반응 곡선을 도시한다. 분석 결과는 세포내로의 방사성 글리신의 내재화 억제율(%)로서 표시된다. 도 1은 스테비아 추출물이 세포 분석에서 GlyT1의 작용을 특이적으로 억제할 수 있음을 명확히 나타낸다.
도 2a는 스텝-다운(step-down) 시험에서의 오류율을 도시한다(a: 훈련 기간 동안 비히클-처리된 동일 연령의 한배 새끼와 유의하게 상이함, b: 시험 기간 동안 비히클-처리된 동일 연령의 한배 새끼와 유의하게 상이함, c: 유실 기간 동안 비히클-처리된 동일 연령의 한배 새끼와 유의하게 상이함, d: 유실 기간 동안 은행 나무(Ginkgo biloba)-처리된 마우스와 유의하게 상이함). 모든 경우에, 유의도는 p < 0.05로 나타낸다. 이러한 데이터는 스테비아-처리된 마우스가 다른 군보다 양호하게 학습할뿐만 아니라 보다 긴 기간 동안 이들의 기억을 유지함을 나타낸다.
도 2b는 스텝-다운 거동 시험 기간 동안 (전기 충격을 탈출하기 위한) 잠재기의 지속 시간으로부터의 결과를 도시한다(b: 시험 기간 동안 비히클-처리된 동일 연령의 한배 새끼와 유의하게 상이함, c: 유실 기간 동안 비히클-처리된 동일 연령의 한배 새끼와 유의하게 상이함, d: 유실 기간 동안 은행 나무-처리된 마우스와 유의하게 상이함). 모든 경우에, 유의도는 p < 0.05로 나타낸다. 따라서, 150 mg/kg 스테비아 추출물로 처리된 마우스는 이들의 동일 연령의 대조군보다 유의하게 양호한 학습 및 기억 수행을 나타내는 반면, 가장 높은 투여량에서, 스테비아-처리된 마우스는 동일 연령의 대조군 마우스 및 은행 나무-처리된 양성 대조군 둘다보다 양호하게 수행하였다.
도 3a는 훈련 일 동안 모리스(Morris) 수중 미로내의 숨겨진 플랫폼의 종래 위치에 위치하는 잠재기를 나타낸다(a: 제 1 일 동안 비히클-처리된 동일 연령의 한배 새끼와 유의하게 상이함). 이는 낮은 투여량의 스테비아 추출물(50 mg/kg)에 의한 처리가 동물의 학습 수행을 상당히 개선시키는 것을 강조한다. 유의도는 p < 0.05로 나타낸다.
도 3b는 시험 일(4 일)에 모리스 수중 미로내의 숨겨진 플랫폼의 종래 위치에 위치하는 잠재기를 나타낸다(a: 비히클-처리된 동일 연령의 한배 새끼와 유의하게 상이함). 이는 중간(150 mg/kg) 및 높은(450 mg/kg) 투여량의 스테비아 추출물에 의한 처리가 동물의 기억 수행을, 기준 물질인 은행 나무가 투여된 마우스에서 관찰되는 바와 동일한 정도로, 그리고 롤리프람-처리된 동물보다 양호하게, 상당히 개선시키는 것을 나타낸다. 유의도는 p < 0.05로 나타낸다.
도 4a는 셔틀 박스 시험에서의 오류율을 나타낸다(a: 시험 기간 동안 비히클-처리된 동일 연령의 한배 새끼와 유의하게 상이함, b: 소거 기간 동안 비히클-처리된 동일 연령의 한배 새끼와 유의하게 상이함). 유의도는 p < 0.05로 나타낸다. 이에 따라, 시험된 가장 높은 투여량에서의 시험 기간 동안, 스테비아-처리된 동물은 비히클-처리된 한배 새끼보다 유의하게 양호한 기억 수행 및 양성 대조군 화합물인 롤리프람이 투여된 마우스와 동등한 수행을 나타냈다.
도 4b는 셔틀 박스 시험에서의 탈출 시간을 나타낸다(a: 시험 기간 동안 비히클-처리된 동일 연령의 한배 새끼와 유의하게 상이함, b: 시험 기간 동안 은행 나무-처리된 동일 연령의 한배 새끼와 유의하게 상이함). 유의도는 p < 0.05로 나타낸다. 이러한 결과는 스테비아-처리된 마우스(150 및 450 mg/kg의 투여량)가 발-충격(foot-shock)을 탈출하는 것을 학습하고, 이의 수행이 비히클-처리된 대조군 마우스 및 기준 물질인 은행 나무가 투여된 마우스 둘다보다 양호함을 나타낸다.
도 5는 물체가 제공되기 전후 3 시간에 각각의 모서리에서의 방문 지속 시간을 도시한다. 화살표는 물체의 위치를 나타낸다. 은행 나무 및 스테비아 추출물은, 비히클-처리된 대조군 마우스(각각, p = 0.004 및 p = 0.005)에 비해서, 새로운 물체를 함유하는 모서리로의 방문의 지속 시간을 유의하게 증가시켰다. 따라서, 상기 처리 둘다 물체 인식 시험에서 마우스의 탐사 활동을 증가시켰다.
도 6은 위치 오류율(틀린 모서리를 방문할 백분율)을 나타낸다. 스테비아 추출물 처리는 비히클-처리된 대조군 마우스 및 은행 나무 투여된 마우스(각각 p = 0.012 및 p = 0.017)에 비해서 유의하게 낮은 오류율(%)을 야기하였다. 이러한 효과는 모듈의 출발 시부터 관찰되었고, 최초 12 시간(활동 시기)에 걸쳐 유지되었고, 스테비아에 의한 처리가 높은 수준의 주의 및 개선된 기억 수행을 야기함을 나타냈다.
도 7은 측면 오류율(옳은 모서리의 틀린 측면에서의 노스포크(nosepoke)의 백분율)을 도시한다. 스테비아 추출물은 또한 비히클-처리된 대조군 및 은행 나무-처리된 마우스(각각 p = 0.002 및 p = 0.035) 둘다에 비해서 유의하게 낮은 오류율(%)을 유도하였다. 이러한 효과는 모듈의 출발 시부터 관찰되었고, 최초 12 시간(활동 시기)에 걸쳐 유지되었고, 이는 스테비아-처리된 마우스의 개선된 주의 및 기억을 나타낸다.
스테비아 추출물
스테비아 추출물은 스테비아 속의 임의의 종, 예컨대 스테비아 레바우디아나(Stevia rebaudiana), 스테비아 유파토리아(Stevia eupatoria), 스테비아 오바타(Stevia ovata), 스테비아 플루머라에(Stevia plummerae), 스테비아 살리시폴리아(Stevia salicifolia) 및 스테비아 세라타(Stevia serrata)로부터 제조될 수 있다. 일반적으로, 스테비아 추출물은 약 10 내지 95 % 이상, 바람직하게는 약 40 내지 85 %의 스테비오사이드 및 스테비올을 함유하여야 한다.
명세서 및 특허청구범위 전반에 걸쳐 사용된 용어 "스테비아 추출물"은 광범위하게 사용되는 것으로 의도되고, 통상적인 수단, 예컨대 증기 증류, 수계 추출, 알콜계 추출, 또는 유기 용매계 추출, 예컨대 에틸 아세테이트, 및 이온-교환 크로마토그래피에 의해 제조된 식물 추출물을 포함할 수 있다. 스테비아 추출물에 대한 유일한 임계 파라미터는 다음과 같다:
(1) 동물 또는 인간 소비용 기능식품에서의 사용에 허용되어야 한다. 따라서, 이의 제조에 사용되는 용매는 목적 용도를 위한 다양한 규제 관청에 의해 승인되어야 한다. 따라서, 바람직한 추출은 뜨거운 물, 증기, 알콜 및 에틸 아세테이트 추출이다.
(2) 효능이 있는 충분한 양의 스테비오사이드, 이소스테비올 및 스테비올로부터 선택된 하나 이상의 화합물을 함유하여야 한다.
또한, 건조된 식물 부분(예컨대, 잎)이 충분한 양의 활성 성분을 함유하는 것으로 밝혀졌다. 또한, 스테비아의 건조된 형태도 스테비아 추출물 및 이의 구성성분의 유용한 공급원으로서 본 발명에 포함되어야 하는 것으로 의도된다. 스테비아 추출물은 전형적으로 생체활성일 수도 있고/있거나 스테비아의 활성 성분의 생체이용률을 증가시킬 수 있는 다른 화합물을 함유한다. 스테비아 추출물내에 존재하는 양은 다수의 인자, 예컨대 사용된 스테비아의 종, 식물의 성장 조건, 및 당연히 스테비아 추출물을 제조하는데 사용된 방법에 따라서 변한다. 수성 추출 방법을 사용하여 제조된 전형적인 스테비아 추출물은 스테비올, 이소스테비올, 스테비오사이드 및 레바우디오사이드를 함유한다.
스테비아 추출물 및 이의 구성성분은 정신 상태에 이롭다
상기한 바와 같이, 기억, 학습 및 정신 안정의 기초는 LTP, 또는 뇌, 특히 해마내에서의 AMPA 및 NMDA 수용체의 활성화를 통해 일어나는 신경 연결의 강화이다. 글리신 재흡수 억제제는 GlyT1에서의 이의 활성을 통해 작용하기 때문에, 스테비아 추출물은 글리신이 NMDA 수용체의 근처에서 축적되게 함으로써 상기 수용체를 활성화시키고, 궁극적으로는 기억 형성 및 기억 고정에 관여하는 주요 세포 기전인 LTP를 유도한다.
또한, 스테비올, 이소스테비올 및 스테비오사이드도 LTP를 유도하는 동일한 생화학적 경로(스테비아 추출물과는 상이한 단계임에도 불구하고)의 활성화를 유도하고 마찬가지로 기억 기능을 개선시키는데 유리하다.
스테비아 추출물 및 이의 구성성분은 해마 기능을 활성화시킬 수 있고, 기억 형성 및 기억 고정을 개선시킬 수 있을뿐만 아니라 정신 건강을 개선시킬 수 있다. 따라서, 명세서 및 특허청구범위 전반에 걸쳐 사용된 용어 "인지 기능을 강화시키는 양"은 투여량이 해마 기능을 활성화시키기에 충분하고, 하기 추가로 설명된 개선된 인지 기능을 야기할 수 있음을 의미한다.
본 발명에 의해 개선되는 병태
본 발명의 내용에 있어서, "치료"는 또한 병용-치료 및 예방, 특정 병태와 관련된 증상의 완화, 특정 병태의 발생 횟수의 감소, 병태의 중증도의 완화, 및 자각 증상이 없는 개인이 미래에 병태를 나타낼 가능성의 감소를 포함한다.
본 명세서 및 특허청구범위에서 사용된 용어 "개선된 인지 기능"은 인지 호조 및 균형을 지지하고 유지하는 상태, 예컨대, 하기 (1) 내지 (8)을 의미한다:
(1) (i) 언어 처리, (ii) 문제 해결, 및 (iii) 지적 기능수행을 포함하는 강화된 학습;
(2) 심리사회적 부담에 대처하는 능력;
(3) 강화된 주의 및 집중;
(4) 강화된 기억 및 기억 능력, 특히 단기 기억;
(5) 강화된 정신적 민첩성 및 정신적 각성, 정신적 피로의 감소;
(6) (i) 산후 병태의 경감, (ii) 배우자 또는 자식과의 별거, 사랑하는 사람의 사망 또는 결혼 문제로 인한 심리적 부담의 경감, (iii) 거주지 또는 직업의 변화 또는 유사한 사건과 관련된 문제점의 경감, 및 (iv) 교통 사고 또는 다른 부정적인 사회적 압박 후 스트레스 상태의 경감을 포함하는 정신 상태의 안정화;
(7) (i) 업무과다, 소모 및/또는 소진과 관련된 증상의 치료, 예방 및 완화, (ii) 스트레스에 대한 증가된 내성 또는 인내력, 및 (iii) 정상적인 건강한 개인에서의 이완 지지 및 촉진을 포함하는 스트레스 경감; 및
(8) (i) 자극성 및 피로의 감소, (ii) 새로운 상황에 대처하는 능력, (iii) 육체적 및 정신적 피로의 감소, 예방 또는 완화, 및 (iv) 불면증 및 수면 장애를 해소하고 보다 일반적인 관점에서 질환을 앓는 개인 또는 정상적인 건강한 개인에서 에너지를 증가시키는 양질의 수면의 촉진을 포함하는 "병태 개선".
본 발명의 바람직한 양상에서, 조성물은, 특히 강화된 인지 기능 및/또는 심리사회적 지지에 대한 요구를 느낄 수 있는 사람을 위한 기능식품 보충제로서 사용될 수 있다. 강화된 인지 기능으로부터 이점을 얻을 사람의 비-제한적 목록은 다음을 포함할 것이다:
장년층;
시험을 준비하는 학생 또는 개인;
많은 학습에 참여하는 아동, 즉 유아, 걷기 시작한 유아, 미취학 아동 및 취학 아동;
건설 노동자, 또는 잠재적으로 위험한 기계를 작동시키는 노동자;
트럭 운전자, 파일럿, 기차 운전자, 또는 다른 운송 전문가;
항공 교통 관제관;
판매원, 행정직원 및 다른 "고능력 전문직";
경찰관 및 군인;
가정주부; 또는
일상 업무에서 과량의 스트레스에 노출된 임의의 사람, 또는 일상 업무에서 특별히 높은 주의/집중/높은 정신 및 심리적 수행을 필요로 하는 사람, 예컨대 스포츠에 참여하는 사람, 체스 선수, 골프 선수, 전문적 공연자(배우, 음악가 등).
이러한 개선을 달성하기 위해, 수 일(예를 들어, 6 또는 10 일 이상)에 걸친 투여가 권장되고, 수 주에 걸친 매일 투여가 일반적으로 바람직하다.
인간에게의 적용과는 별도로, 본 발명의 조성물은 수의학 분야에서 추가로 사용될 수 있다. 강화된 인지 기능으로부터 이익을 얻을 수 있는 동물은 스트레스를 받는 상태하에 놓인 동물을 포함한다. 이러한 상태는, 예를 들어 포획 또는 운송 후에 일어나거나 사육 상태(예컨대, 거주지 또는 소유자의 변경)로 인해 일어날 수 있고, 이때 동물은 유사한 장애가 발병하고, 괴로워하거나, 공격적이거나, 또는 전형적인 거동, 또는 불안증 또는 강박 거동을 보인다. 또한, 스트레스를 받는 동물은 경주 동물(예를 들어, 개, 말, 낙타) 또는 다양한 스포츠에 사용되는 동물, 공연 동물(예컨대, 서커스 동물, 및 무대, 텔레비젼 또는 영화에서 등장하는 동물) 및 마장마술 및 다른 고도로 훈련된 일과를 수행하는 말을 포함한다.
바람직한 "동물"은 애완동물 또는 반려동물 및 농장동물이다. 애완동물의 예는 개, 고양이, 새, 수족관 어류, 기니아 피그, (산) 토끼, 집 토끼 및 흰족제비가 있다. 농장동물의 예는 수족관 어류, 돼지, 말, 반추동물(소, 양 및 염소) 및 가금류가 있다.
기능식품 용도/제형/투여량
본원에서 사용된 용어 "기능식품"은 영양 및 약학 적용 분야에서 유용함을 의미한다. 따라서, 신규한 기능식품 조성물은 식품 및 음료에의 보충제, 및 캡슐제 또는 정제와 같은 고체 제형, 또는 용액 또는 현탁액과 같은 액체 제형일 수 있는 장 또는 비경구 적용을 위한 약학 제형으로서 사용될 수 있다.
본 발명에 따른 기능식품 조성물은 보호성 하이드로콜로이드(예컨대, 검, 단백질, 개질된 전분), 결합제, 막-형성제, 캡슐화제/캡슐화 물질, 벽/외피 물질, 매트릭스 화합물, 코팅물, 에멀젼화제, 계면활성제, 가용화제(오일, 지방, 왁스, 레시틴 등), 흡착제, 담체, 충전제, 보조-화합물, 분산제, 습윤화제, 가공 보조제(용매), 유동화제, 맛-가리움제, 가중제, 젤리화제, 겔-형성제, 산화방지제 및 항균제를 추가로 함유할 수 있다.
또한, 일부 식이요법에서 누락되는 적정량의 필수 영양분을 수득하기 위해 종합 비타민 및 미네랄 보충제가 본 발명의 기능식품 조성물에 첨가될 수 있다. 종합 비타민 및 미네랄 보충제는 또한 질환 예방, 및 생활 패턴으로 인한 영양 손실 및 결핍으로부터의 보호에 유용할 수 있다.
본 발명에 따른 기능식품 조성물은 신체에 투여하기에 적합한 임의의 생약 형태, 특히 경구 투여를 위한 통상적인 임의의 형태, 예를 들어 식품 또는 사료(를 위한 첨가제/보충제), 식품 또는 사료 예비혼합물, 강화식품 또는 사료, 정제, 환제, 과립, 당의정, 캡슐 및 비등성 제형, 예컨대 분말 및 정제와 같은 고체 형태; 또는 용액, 에멀젼 또는 현탁액, 예를 들어, 음료, 페이스트 및 유성 현탁액과 같은 액체 형태일 수 있다. 페이스트는 경질 또는 연질 외피 캡슐에 혼입될 수 있고, 이에 의해 캡슐은, 예를 들어 (어류, 돼지, 가금류, 소) 젤라틴, 식물 단백질 또는 리그닌설폰에이트로 이루어진 매트릭스를 특징으로 한다. 다른 적용 형태의 예는 경피, 비경구 또는 주사 투여 형태이다. 식이 및 약학 조성물은 조절된(지연된) 방출 제형의 형태일 수 있다.
식품의 예는, 예를 들어 마가린, 스프레드, 버터, 치즈, 요구르트 또는 우유-드링크를 포함하는 유제품이다.
강화식품의 예는 사탕 옥수수, 빵, 시리얼 바, 제과 제품, 예컨대 케이크 및 쿠키, 및 감자 칩 또는 크리스프가 있다.
음료는 비-알콜성 드링크 및 알콜성 드링크뿐만 아니라 음료수 및 액체 식품에 첨가되는 액체 제제를 포함한다. 비-알콜성 드링크는, 예를 들어 소프트 드링크, 스포츠 드링크, 과일 쥬스, 레몬에이드, 차 및 우유계 드링크이다. 액체 식품은, 예를 들어 수프 및 유제품이다. 스테비아 추출물, 이의 구성성분 또는 강화된 스테비아 추출물을 함유하는 기능식품 조성물은 성인이 1 일 분량 당 1 내지 1,000 mg, 더욱 바람직하게는 50 내지 750 mg, 가장 바람직하게는 100 내지 500 mg의 스테비아 추출물, 이의 구성성분 또는 강화된 스테비아 추출물을 소비하도록 소프트 드링크, 에너지 바 또는 캔디에 첨가될 수 있다.
기능식품 조성물이 약학 제형인 경우, 상기 조성물은 약학적으로 허용되는 부형제, 희석제 또는 보조제를 추가로 함유한다. 예를 들어, 문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences, 20th edition Williams & Wilkins, PA, USA]에 개시된 표준 기술이 상기 제형화에 사용될 수 있다. 경구 투여의 경우, 적절한 결합제, 예를 들어 젤라틴 또는 폴리비닐 피롤리돈, 적절한 충전제, 예를 들어 락토스 또는 전분, 적절한 윤활제, 예를 들어 마그네슘 스테아레이트, 및 선택적인 추가 첨가제를 함유하는 정제 및 캡슐이 바람직하게 사용된다. 투여 단위 당, 예를 들어 정제 또는 캡슐 당 10 내지 750 mg, 더욱 바람직하게는 50 내지 500 mg의 스테비아 추출물 또는 이의 구성성분을 함유하는 제형이 바람직하다.
인간을 비롯한 동물의 경우, 본 발명의 목적을 위한 스테비아 추출물 또는 이의 구성성분의 적합한 1 일 투여량은 1 일 당 체중 1 kg 당 0.15 내지 약 10 mg일 수 있다. 약 10 내지 약 750 mg/일, 바람직하게는 약 50 내지 약 500 mg/일의 투여량을 성인 인간(약 70 kg 체중)에게 투여하기에 충분한 양으로 스테비아 추출물 또는 이의 구성성분을 바람직하게 함유하는 본 발명의 기능식품 조성물이 더욱 바람직하다.
하기 비제한적인 실시예는 본 발명을 더욱 양호하게 설명하기 위해 제공된다.
실시예 1
스테비아 추출물의 조성 및 제조
본 발명에 의해 개시되는 전형적인 스테비아 수성 추출물은 약 70 %의 스테비오사이드, 약 20 %의 레바우디오사이드, 약 10 %의 스테비올, 이소스테비올을 함유한다.
스테비아 레바우디아나의 분쇄된 잎을 20 내지 30 분 동안 뜨거운 물과 혼합한다. 이어서, 최대 양의 추출물을 수득하기 위하여 압력을 사용하는 배출에 의해 수성 추출물을 제거한다. 여러 가지 유형의 유입/배출 공정이 사용될 수 있다. 추출물을 실온까지 냉각한다. 입자를 제거하기 위하여, 미립자 물질이 가라앉는 동안 추출물을 방치할 수 있거나, 또는 원심분리할 수 있다. 이어서, 분무-건조하거나 동결-건조함으로써 추출물을 건조한다. 이러한 추출물은 감미제 원소, 식물 안료 및 다른 수용성 성분을 함유한다.
하기 실시예에 사용된 스테비아 추출물("스테비아 잎 추출물, 85 % 분말"; 카탈로그 번호 S1964)을 미국 캘리포니아주 가데나 소재 스펙트럼 래보러토리 프로덕츠 인코포레이티드(Spectrum Laboratory Products Inc.)로부터 구입하였다.
실시예 2
세포 분석에서 글리신 수송체 1의 억제
인간 글리신 수송체 1b cDNA(GlyT1)를 안정하게 발현하는 CHO 세포를, 10 %의 투석된 소 태아 혈청, 페니실린, 스트렙토마이신, 프롤린 및 항생제 G418을 함유하는 둘베코 개질된 이글 배지(미국 칼스바드 소재 인비트로겐(Invitrogen))중에서 통상적으로 성장시켰다. 분석 1 일 전 트립신처리에 의해 세포를 수확하고, 상기 배지에 시딩하였다. 분석 직전, 배지를 150 mM NaCl, 1 mM CaCl2, 2.5 mM KCl, 2.5 mM MgCl2, 10 mM 글루코스 및 10 mM N-2-하이드록시에틸피페라진-N'-2-에탄설폰산이 함유된 흡수 완충액("HEPES" 완충액)으로 교체하였다.
60 nM의 방사성-표지된 [3H]-글리신(영국 슬라우 소재 아머샴 바이오사이언시스 지이 헬스케어(Amersham Biosciences GE Healthcare))을 첨가하고, 실온에서 30 분 동안 배양함으로써 세포내로의 글리신 흡수를 측정하였다. 상기 완충액으로 약하게 3 회 세척하여 혼입되지 않은 표지를 제거한 후, 흡수된 글리신을 액체 섬광 계수(liquid scintillation counting)로 정량화하였다.
GlyT1 수송체를 통한 글리신 흡수를 스테비아 추출물을 투여량-의존적 방식으로 첨가함으로써 억제하였다. 사르코신, ORG24598 및 ALX5407(모두 미국 세인트 루이스 소재 시그마(Sigma)로부터 입수함)을 GlyT1의 공지된 억제제로서 사용하였다. 글리신 흡수의 억제에 대해 측정된 IC50 값(스테비아 추출물, 추출물 구성성분 및 기준 화합물) 및 대표적인 투여량-반응 곡선(스테비아 추출물)은 각각 표 2 및 도 1에 표시되어 있다.
Figure 112013108266315-pct00019
실시예 3
해마 슬라이스 배양균
7 일령 위스타(Wistar) 래트의 목을 길로틴(guillotine)을 사용하여 잘랐다. 1 분 미만내에 두개골을 개방하고, 대뇌 반구를 분리하여 옮기고, 양쪽 해마를 절개하고, 137 mM NaCl, 5 mM KCl, 0.85 mM Na2HPO4, 1.5 mM CaCl2, 0.66 mM KH2PO4, 0.28 mM MgSO4, 1 mM MgCl2, 2.7 mM NaHCO3, 1 mM 키누렌산(Kynurenic acid) 및 0.6 % D-글루코스를 함유하는 빙냉 완충액으로 옮겼다.
횡단 해마 슬라이스(400 ㎛)를, 동일한 완충액중 진동 블레이드 마이크로톰(vibrating blade microtome)(VT1200S; 스위스 헤에르브루그 소재 라이카 마이크로시스템스 (슈바이즈) 아게(Leica Microsystems (Schweiz) AG))을 이용하여 준비하였다. 해마 슬라이스를 막 삽입물(밀리셀 컬쳐 플레이트 인서츠(Millicell Culture Plate Inserts), 0.4 ㎛)상에 개별적으로 배치하고, 25 % 열-불활성화된 말 혈청, 1x 글루타맥스(GlutaMAX), 1x 페니실린/스트렙토마이신, 0.6 % 글루코스 및 1 mM 키누렌산을 함유하는, BME 및 MEM(둘다 인비트로겐으로부터 입수함)의 1:1 혼합물을 함유하는 배지중에서 35 ℃, 5 % CO2 및 95 % 습도에서 배양하였다(문헌[Stoppini 1991 J. Neurosci. Methods, 37(2), 173-82]).
48 시간 동안 배양한 후, 스테비아 추출물, 이의 주요 구성성분 또는 대조군 물질을 140 mM NaCl, 5 mM KCl, 1.3 mM CaCl2, 25 mM HEPES(pH 7.3), 33 mM D-글루코스 및 0.02 mM 비쿠쿨린 메티오다이드에 15 분 동안 첨가함으로써 시냅스 NMDA 수용체를 활성화시켰다. 사르코신(100 μM) 및 ALX5407(20 nM)을 양성 대조군으로서 관용적으로 사용하였다. 추가 양성 대조군은 200 μM의 글리신을 시스터(sister) 배양균에 첨가함으로써 수득하였다. 처리 후, 절편을 세척하고, 면역조직화학적 분석을 위해 고정시켰다. 학습 및 기억의 생체외 모델을 나타내는, 장기 강화작용과 통상적으로 관련된 강화된 시냅스 활성의 마커를 정량화하였다(하기 표 3 참고).
Figure 112010042668360-pct00005
스테비아 추출물, 스테비올, 이소스테비올 및 스테비오사이드에 의한 해마 배양균의 처리는 LTP에 대해 전형적인 하나 이상의 생화학적 마커를 유도하였다(pCREB: cAMP 반응 요소 결합 단백질의 활성화된 형태; pMAPK: 미토겐-활성화된 단백질 키나제의 활성화된 형태; GluR1: AMPA 수용체 1의 세포 표면 존재).
실시예 4
학습 및 기억의 3 개의 전통적인 설치류 모델에서 스테비아 추출물의 효과:
1 - 스텝-다운 시험
마우스를 연상 학습 및 기억 페러다임인, 스텝-다운 시험에 적용하였다. 마우스를 바닥이 36 V 전기 격자로 피팅된 반응 상자내에 개별적으로 배치하였다. 동물이 전기 충격을 받는 경우, 이들의 정상적인 반응은 통증 자극을 피하기 위해 절연된 플랫폼상으로 점프하는 것이다. 따라서, 격자상으로 내려온 동물의 대다수는 전기 충격을 받는 경우 플랫폼상으로 다시 신속히 점프하여 돌아왔다. 제 0 일에 동물은 5 분 동안 훈련받았고, 마우스 각각이 충격을 받은 횟수, 즉 오류가 발생된 횟수를 기록하였다. 이러한 데이터는 학습 데이터를 구성하였다. 24 시간(제 1 일, 훈련 일) 및 48 시간(제 2 일, 시험 일) 후에 마우스를 재시험하였고, 이러한 시험은 기억 시험으로서 사용되었다. 각각의 군에서의 충격을 받은 동물의 수, 플랫폼으로부터 처음 내려오기 전의 시간(잠재기), 및 처음 3 분내의 오류 수를 기록하였다. 훈련을 종결한 후 6 일(제 8 일)에, 기억 감퇴를 시험하였다(유실 시험).
연구는 6 개의 시험 군(n = 군 당 12 마리)을 포함하였다. 동물을 훈련시키기 전 30 일 동안 시험 물질 또는 비히클을 매일 경구 위관영양(10 ㎖/kg)을 통해 투여하였다. 스테비아 추출물을 3 회 투여량(50(낮은 투여량), 150(중간 투여량) 및 450(높은 투여량) mg/kg)으로 시험하면서, 기준 물질인 은행 나무를 100 mg/kg의 투여량으로 투여하였다. 약리학적 양성 대조군인 롤리프람(0.1 mg/kg)을 시험 30 분 전에 복강내 주사로 투여하였다.
비히클-처리된 한배 새끼(음성 대조군)와 비교하는 경우, 오류율의 감소에 의해 나타나는 바와 같이, 스테비아-처리된 동물의 모든 군은 훈련 및 기억 시기 동안 및 유실 기간 후 유의하게 양호한 학습 및 기억 수행을 나타냈다(도 2a) 또한, 훈련 시기 동안, 스테비아-처리된 마우스(50 mg/kg)는 기준 화합물인 은행 나무가 투여된 마우스와 같이 잘 수행하였고, 롤리프람-처리된 마우스보다 양호하게 수행하였고; 시험 시기 동안, 스테비아 추출물의 3 개의 투여량 모두는 은행 나무 및 롤리프람 둘다로 처리된 마우스에서 관찰되는 바와 유사한 수행을 야기하였고; 유실 시기 동안, 낮은 및 중간 투여량의 스테비아 추출물이 투여된 마우스가 또한 기준 물질 및 양성 대조군으로 처리된 마우스와 같이 잘 수행하였지만, 가장 높은 투여량의 스테비아가 은행 나무-처리된 마우스에서 보이는 바보다 유의하게 양호한 수행을 유도하였다.
시험 시기 동안, 비히클-처리된 대조군 마우스와 비교되는 경우, 잠재기는 중간 투여량의 스테비아 추출물이 투여된 마우스에서 유의하게 증가하였다. 또한, 이러한 효과는 롤리프람-처리된 마우스에서 관찰되는 바와 동등하다. 유실 시기 동안, 비히클-처리된 대조군 마우스 및 은행 나무 추출물 투여된 마우스 둘다와 비교되는 경우, 가장 높은 투여량의 스테비아 추출물은 잠재기의 상당한 증가를 유도하였다(도 2b).
따라서, 요약하면, 스테비아 추출물은 천연 기준 물질인 은행 나무, 및 약학적인 양성 대조군 화합물인 롤리프람과 유사한 정도 또는 보다 양호한 정도의 개선된 학습 및 기억 수행을 가능하게 하였다.
도 2a: 스텝-다운 시험에서의 오류율; a: 훈련 기간 동안 비히클-처리된 동일 연령의 한배 새끼와 유의하게 상이함, b: 시험 기간 동안 비히클-처리된 동일 연령의 한배 새끼와 유의하게 상이함, c: 유실 기간 동안 비히클-처리된 동일 연령의 한배 새끼와 유의하게 상이함, d: 유실 기간 동안 은행 나무-처리된 마우스와 유의하게 상이함. 모든 경우에, 유의도는 p < 0.05로 나타낸다. 이러한 데이터는 스테비아-처리된 마우스가 다른 군보다 양호하게 학습할뿐만 아니라 보다 긴 기간 동안 이들의 기억을 유지함을 나타낸다.
도 2b: 스텝-다운 거동 시험 결과; 전기 충격을 탈출하기 위한 잠재기의 지속 시간; b: 시험 기간 동안 비히클-처리된 동일 연령의 한배 새끼와 유의하게 상이함, c: 유실 기간 동안 비히클-처리된 동일 연령의 한배 새끼와 유의하게 상이함, d: 유실 기간 동안 은행 나무-처리된 마우스와 유의하게 상이함. 모든 경우에, 유의도는 p < 0.05로 나타낸다. 따라서, 150 mg/kg 스테비아 추출물로 처리된 마우스는 이들의 동일 연령의 대조군보다 유의하게 양호한 학습 및 기억 수행을 나타내는 반면, 가장 높은 투여량에서, 스테비아-처리된 마우스는 동일 연령의 대조군 마우스 및 은행 나무-처리된 양성 대조군 둘다보다 양호하게 수행하였다.
실시예 5
학습 및 기억의 3 개의 전통적인 설치류 모델에서 스테비아 추출물의 효과:
2 - 모리스 수중 미로
모리스 수중 미로는 설치류의 공간 기억을 시험하기 위해 허용되는 최선의 패러다임중 하나이다. 마우스는 원형 풀을 헤엄치고, 실험실의 시각적인 단서를 사용하여 숨겨진 플랫폼을 찾아야 한다.
이때, 스텝-다운 시험 패러다임과 동일한 투여량 및 처리 시간이 사용되었다.
본 연구에 사용된 모리스 수중 미로(직경 = 1.5 m)는 북서 4 분원("10 시")의 풀의 가장자리로부터 10 cm 떨어져 위치하는 숨겨진 플랫폼(10 cm x 10 cm)을 포함하였다. 제 0 일에, 마우스를 시험 아레나에 익숙하게 하고, 2 회의 시행 훈련을 받게 하고, 이 기간 동안 플랫폼으로 헤엄치게 훈련하였다.
제 1 내지 제 3 일에, 수중 미로로부터 플랫폼을 제거하고, 마우스가 1 일 당 2 회의 시행 훈련을 받게 하였다. 각각의 시행(90 초) 후, 플랫폼을 동일한 위치에 다시 놓아서 마우스가 찾아서 오를 수 있게 하였다. 이러한 과정은 마우스가 각각의 훈련 일에 플랫폼의 위치를 효과적으로 학습하고, 이어지는 시행에서 플랫폼의 위치를 상기하도록 하였다. 플랫폼이 위치된 구역을 위치시키는 초기 시간(제 1 크로스 플랫폼 시간(First Cross Platform Time; FCPT)) 및 마우스가 플랫폼이 위치된 구역을 가로질러 헤엄치는 횟수(크로싱 횟수)를 기록하고, 각각의 훈련 일에 대한 평균 점수를 제공하였다(제 1 내지 제 3 일: 훈련 점수). 제 4 일에, 마우스는 추가로 2 회의 시행을 받았고, 이의 결과가 시험 점수였다.
훈련 세션의 제 1 일에, 가장 낮은 투여량의 스테비아를 투여한 마우스는 비히클-처리된 대조군 마우스, 및 양성 대조군 화합물인 롤리프람을 투여한 마우스보다 상당히 양호하게 수행하였다(도 3a). 제 4 일에, 시행 시험 동안, 중간 및 높은 투여량의 스테비아로 처리된 마우스는 동일 연령의 대조군 동물에 비해 상당히 짧은 잠재 시간을 나타냈다(도 3b). 따라서, 이러한 데이터는 스테비아 추출물에 의한 처리가 마우스의 학습 및 기억 수행에 영향을 주고, 이러한 효과가 이용된 투여량에 의존함을 나타낸다.
도 3a는 훈련 일 동안 모리스 수중 미로내의 숨겨진 플랫폼의 종래 위치에 위치하는 잠재기를 나타낸다; a: 제 1 일 동안 비히클-처리된 동일 연령의 한배 새끼와 유의하게 상이함. 이는 낮은 투여량의 스테비아 추출물(50 mg/kg)에 의한 처리가 동물의 학습 수행을 유의하게 개선시키는 것을 나타낸다. 유의도는 p < 0.05로 나타낸다.
도 3b는 시험 일(제 4 일)에 모리스 수중 미로내의 숨겨진 플랫폼의 종래 위치에 위치하는 잠재기를 나타낸다; a: 비히클-처리된 동일 연령의 한배 새끼와 유의하게 상이함. 이는 중간(150 mg/kg) 및 높은(450 mg/kg) 투여량의 스테비아 추출물에 의한 처리가 동물의 기억 수행을, 기준 물질인 은행 나무가 투여된 마우스에서 관찰되는 바와 동일한 정도로, 그리고 롤리프람-처리된 동물보다 양호하게, 상당히 개선시키는 것을 나타낸다. 유의도는 p < 0.05로 나타낸다.
실시예 6
학습 및 기억의 3 개의 전통적인 설치류 모델에서 스테비아 추출물의 효과:
3 - 셔틀 박스 시험
본 동물 시험의 기초를 이루는 패러다임은 유해 자극의 능동 회피이다. 셔틀 박스의 하나의 부분에 전기 충격을 전달하는 격자가 장착되어 있다. 청각 신호(삑하는 소리, 7 초 지속)가 전기 충격에 선행한다. 동물은 셔틀 박스의 다른 측면으로 탈출하는 방법을 학습하여야 하고, 이에 의해 적외선 빔을 가로지른다.
이때, 스텝-다운 시험 패러다임과 동일한 투여량 및 처리 시간이 사용되었다.
5 일 동안, 1 일 당 1 회 마우스를 훈련시켰다. 훈련 프로그램은 15 개의 세션으로 구성되어 있고; 각각의 세션은 (1) 15 초 멈춤, (2) 7 초 청각 신호("비핑 기간(beeping period)"), 및 (3) 8 초 전기 충격("자극 기간")을 포함한다. 마우스가 비핑 또는 자극 기간 동안 셔틀 박스의 어느 한 쪽 말단에서 2 개의 적외선 빔중 하나를 가로지르는 경우, 후속 세션으로 진행한다. 능동 탈출 시간(비핑 기간) 및 수동 탈출 시간(자극 기간)을 기록하고, 총 탈출 시간을 계산하였다. 마우스가 비핑 기간 동안 적외선 빔을 가로지르지 않은 경우, 오류로서 기록하였다. 제 4 일에 기록된 오류 및 탈출 시간을 훈련 점수로서, 제 5 일에 시험 점수로서, 및 제 8 일에 소거 점수로서 취하였다.
시험 시기(제 5 일) 동안, 가장 높은 투여량의 스테비아 추출물은 비히클-처리된 대조군 마우스에 비해 상당히 적은 오류를 유도하였고; 오류율에 대한 효과는 롤리프람-처리된 양성 대조군 마우스에서 관찰된 바와 동등하였다. 또한, 중간 및 높은 투여량의 스테비아 추출물은 비히클-처리된 마우스 및 은행 나무-처리된 마우스 둘다에 비해서 탈출 시간을 상당히 감소시켰다. 따라서, 이러한 데이터는 또한 스테비아 추출물에 의한 처리가 마우스의 학습 수행에 영향을 주지만, 이러한 효과는 이용된 투여량에 의존함을 나타낸다.
도 4a는 셔틀 박스 시험에서의 오류율을 나타낸다; a: 시험 기간 동안 비히클-처리된 동일 연령의 한배 새끼와 유의하게 상이함, b: 소거 기간 동안 비히클-처리된 동일 연령의 한배 새끼와 유의하게 상이함. 유의도는 p < 0.05로 나타낸다. 이에 따라, 시험된 가장 높은 투여량에서의 시험 기간 동안, 스테비아-처리된 동물은 비히클-처리된 한배 새끼보다 유의하게 양호한 기억 수행 및 양성 대조군 화합물인 롤리프람이 투여된 마우스와 동등한 수행을 나타냈다.
도 4b는 셔틀 박스 시험에서의 탈출 시간은 나타낸다; a: 시험 기간 동안 비히클-처리된 동일 연령의 한배 새끼와 유의하게 상이함, b: 시험 기간 동안 은행 나무-처리된 동일 연령의 한배 새끼와 유의하게 상이함. 유의도는 p < 0.05로 나타낸다. 이러한 결과는 스테비아-처리된 마우스(150 및 450 mg/kg의 투여량에서)가 발-충격을 탈출하는 것을 학습하고, 이의 수행이 비히클-처리된 대조군 마우스 및 기준 물질인 은행 나무가 투여된 마우스 둘다보다 양호함을 나타낸다.
실시예 7
학습 및 기억의 전체적으로 자동화된 신규한 설치류 모델에서 스테비아 추출물의 효과
스테비아 추출물 또는 은행 나무로 처리된 마우스의 인지 수행을, 홈케이지형(homecage-like) 환경에서의 마우스의 자발적인 학습 거동의 자동화된 모니터링을 가능하게 하는 시스템인 인텔리케이지(IntelliCage(등록상표))(스위스 취리히 소재 뉴비헤이비어 아게(NewBehavior AG; www.newbehavior.com))에서 비히클-처리된 동일 연령의 대조군과 비교하였다(문헌[Galsworthy et al. 2005, Behav Brain Res 157: 211-217; Onishchenko et al. 2007, Toxicol Sci 97: 428-437]). 개별적인 마우스는 마우스의 목덜미에 이식된 트랜스폰더(참고 확인 태그)를 판독하는 인텔리케이지 모서리내의 센서에 의해 인식된다. 각각의 인텔리케이지(등록상표)는 본질적으로 4 개의 기록(작동) 챔버를 포함하는, 금속 틀내에 위치된 큰 우리(37.5 x 55 x 20.5 cm)이다. 기록 챔버는 바닥 공간의 우측으로 각진 삼각형 구역(15 x 15 x 21 cm)을 각각 커버하는 우리의 모서리내로 피팅되어 있다. 우리내의 안테나는 개별적인 마우스가 모서리를 방문하는 것을 자동적으로 모니터링할 수 있게 하고, 각 모서리내의 광선은 물병 입구의 개별적인 노스포크 및 핥기의 자동화된 기록을 가능하게 한다. 4 개의 삼각형 마우스 은신처를 우리의 중심에 배치하고, 상기 은신처 위에 식품 호퍼(hopper)를 배치하여 마우스가 음식에 자유롭게 접근할 수 있게 하였다.
각각의 기록 챔버는 하기 (1) 내지 (7)을 포함한다: (1) 챔버내로의 입구로서 사용되고, 모서리 방문을 기록하는 원형 안테나를 수용하는 플라스틱 고리(30 mm 내부 직경); (2) 마우스가 챔버내로 들어갔을 때 앉는 격자 바닥; (3) 물병 입구에 접근할 수 있도록 하는 2 개의 원형 개구(13 mm 직경)로서, 각각 노스포크를 기록하는 광선에 의해 교차되는 개구; (4) 물병 입구로의 접근을 허용하거나(문 개방) 또는 금지하는(문 폐쇄), 엔진이 장착된 2 개의 문; (5) 2 개의 물병; (6) 회피 자극으로서 공기-퍼프를 전달할 수 있는 배관; 및 (7) 컨디셔닝 실험에서 사용될 수 있는 다양한 색채의 광 다이오드.
실험 단계:
본 연구는 3 개의 시험 군(n = 군 당 12 내지 14 마리), 비히클(대조군), 은행 나무(100 mg/kg) 및 스테비아 추출물(450 mg/kg)을 포함하였다. 모든 마우스는 8 주의 연구 기간 동안 매일 경구 위관영양(10 ㎖/kg)을 통해 시험 물질 또는 비히클을 투여받았다.
초기 적응 기간(제 4 내지 제 5 일) 동안 마우스는 모든 모서리, 물 및 사료에 자유롭게 접근하였고, 우리를 자유롭게 탐사할 수 있었다. 이어서, 마우스는 노스포크를 적용하는 것을 학습하였고(노스포크 적응 모듈, 3 일), 모든 문은 초기에 폐쇄되어 있었고(물로의 접근이 금지됨), 마우스는 문을 개방하여 물병 입구에 도달하기 위해 노스포크를 수행하여야 했다. 수집된 데이터는 여러가지 파라미터, 예컨대 각각의 개별적인 마우스의 최소-선호 모서리를 포함하였고, 이는 다음 모듈을 프로그래밍하기 위해 기록되었다.
물체 인식
마우스의 고유의 탐사 활동을 시험하기 위해, 2 개의 동일한 물체를 모서리 1 및 2에 각각 배치하거나 모서리 3 및 4(각각 각각의 군의 최소-바람직한 모서리를 포함함)에 각각 배치하였다. 동물은 우리를 자유롭게 탐사할 기회를 가졌고, 물 및 사료에 자유롭게 접근할 수 있었다. 방문을 물체를 제공하기 전후 3 시간에 기록하였다. 대조군의 방문 패턴은 물체를 모서리 1 및 2에 제공한 후 변화하지 않았지만, 은행 나무 및 스테비아 처리 둘다 새로운 물체를 함유하는 모서리로의 방문의 지속 시간을 상당히 증가시켰다(각각 코너 4 및 2)(도 5). 따라서, 스테비아 추출물의 만성 투여는 마우스의 탐사 활동을 은행 나무와 동일한 정도까지 상당히 증가시켰다.
도 5는 물체가 제공되기 전후 3 시간에 각각의 모서리에서의 방문 지속 시간을 도시한다. 화살표는 물체의 위치를 나타낸다. 은행 나무 및 스테비아 추출물은, 비히클-처리된 대조군 마우스에 비해서, 새로운 물체를 함유하는 모서리로의 방문의 지속 시간을 유의하게 증가시켰다(각각, p = 0.004 및 p = 0.005). 따라서, 상기 처리 둘다 물체 인식 시험에서 마우스의 탐사 활동을 증가시켰다.
측면 식별
본 모듈은 주의 및 연상 기억을 시험하기 위해 고안되었다. 하나의 옳은 모서리를 각각의 마우스에게 할당하였다. 이러한 모서리에서, (2 개중) 하나의 측면을 옳은 것으로서 할당하고, 녹색 LED에 의해 동물에게 표시하였다. 옳은 측면에서, 동물은 노스포크를 할 수 있고, 이어서 물병으로부터 물을 마실 수 있었다. 본 모듈을 하는 동안, 위치 오류(즉, 틀린 모서리로의 방문의 백분율) 및 측면 오류(즉, 옳은 모서리의 틀린 측면에서의 노스포크의 백분율)를 기록하였다.
위치 오류율(도 6) 및 측면 오류율(도 7) 둘다가 시험의 최초 12 시간(활동 시기)에 걸쳐 비히클- 및 은행 나무-처리된 바보다 상당히 낮으므로, 이러한 데이터는 스테비아 추출물에 의한 만성적인 처리에 따른 개선된 주의를 나타낸다.
도 6은 위치 오류율(틀린 모서리로의 방문의 백분율)을 나타낸다. 스테비아 추출물 처리는 비히클-처리된 대조군 마우스 및 은행 나무 투여된 마우스(각각 p = 0.012 및 p = 0.017) 둘다에 비해서 유의하게 낮은 오류율(%)을 야기하였다. 이러한 효과는 모듈의 출발 시부터 관찰되었고, 최초 12 시간(활동 시기)에 걸쳐 유지되었고, 스테비아에 의한 처리가 보다 높은 수준의 주의 및 개선된 기억 수행을 야기함을 나타냈다.
도 7은 측면 오류율(옳은 모서리의 틀린 측면에서의 노스포크의 백분율)을 도시한다. 스테비아 추출물은 또한 비히클-처리된 대조군 및 은행 나무-처리된 마우스(각각 p = 0.002 및 p = 0.035) 둘다에 비해서 유의하게 낮은 오류율(%)을 유도하였다. 이러한 효과는 모듈의 출발 시부터 관찰되었고, 최초 12 시간(활동 시기)에 걸쳐 유지되었고, 이는 스테비아-처리된 마우스의 개선된 주의 및 기억을 나타낸다.
요약하자면, 자동화된 인텔리케이지(등록상표)로부터의 결과는 8 주 동안의 스테비아 추출물에 의한 처리가 비히클-처리된 한배 새끼와 비교되는 경우 마우스의 학습 및 기억의 상당한 개선을 야기하는 고전적인 시험(실시예 4, 5 및 6)으로부터의 거동적인 결과를 확인한다. 일부 경우에, 스테비아-처리된 마우스에서 보여지는 수행의 개선이 천연 기준 물질인 은행 나무, 또는 약학적인 양성 대조군인 롤리프람에서 관찰되는 바보다 훨씬 더 컸다.
실시예 8
연질 젤라틴 캡슐의 제조
하기 성분을 포함하는 연질 젤라틴 캡슐을 제조할 수 있다:
Figure 112010042668360-pct00006
3 개월 동안 1 일 당 2 개의 캡슐을 성인 인간에게 투여할 수 있다. 인지 기능, 민첩성, 및 업무에 집중하는 능력이 개선된 것으로 보여진다.
실시예 9
인스턴트 향미 소프트 드링크의 제조
Figure 112010042668360-pct00007
모든 성분을 배합하고, 500 ㎛ 체를 통해 체질한다. 생성된 분말을 적절한 용기에 넣고, 20 분 이상 관형 배합기로 혼합한다. 드링크를 제조하기 위하여, 105 g의 수득된 혼합 분말을 충분한 물과 혼합하여 1 ℓ의 음료를 제조한다.
인스턴트 소프트 드링크는 1 회 분량(250 ㎖) 당 약 15 mg의 강화된 스테비아 추출물을 함유한다. 일반적인 행복을 위한 강화제로서는 1 일 당 2 회 분량(500 ㎖)을 마실 수 있다. 인지 기능, 민첩성, 및 업무에 집중하는 능력이 개선된 것으로 보여진다.
실시예 10
굽지 않은 강화 시리얼 바의 제조
Figure 112010042668360-pct00008
강화된 스테비아 추출물을 탈지유 분말과 예비혼합하고, 행성형 사발 혼합기에 위치시킨다. 콘플레이크 및 쌀 크리스피를 첨가하고, 전체를 천천히 혼합한다. 이어서, 건조되고 절단된 사과를 첨가한다. 제 1 조리용 솥에서 물 및 소금을 상기 양으로 혼합한다(용액 1). 제 2 조리용 솥에서, 글루코스-, 전화당- 및 소르비톨-시럽을 상기 양으로 혼합한다(용액 2). 지방 상은 베이킹 지방, 팜 커넬 지방, 레시틴 및 유화제의 혼합물을 구성한다. 용액 1을 110 ℃로 가열한다. 용액 2를 113 ℃로 가열한 후, 빙수 욕에서 냉각한다. 이어서, 용액 1 및 2를 합한다. 지방 상을 수 욕에서 75 ℃에서 용융시킨 후, 용액 1 및 2의 합한 혼합물에 첨가한다. 사과 향미제 및 시트르산을 액체 당/지방 혼합물에 첨가한다. 액체 물질을 무수 성분에 첨가하고, 행성형 사발 혼합기에서 잘 혼합한다. 상기 물질을 대리석 플레이트에 놓고, 목적 두께로 롤링한다. 실온까지 냉각하고, 조각으로 절단한다. 굽지 않은 시리얼 바는 1 회 분량(30 g) 당 약 10 mg의 강화된 스테비아 추출물을 함유한다. 일반적인 행복 및 활력을 위하여, 1 일 당 1 또는 2 개의 시리얼 바를 섭취할 수 있다. 인지 기능, 민첩성, 및 업무에 집중하는 능력이 개선된 것으로 보여진다.
실시예 11
스테비아 추출물을 함유하는 무수 개 사료
개를 위한 시판중인 기초 사료(예를 들어, 메라 도그 "브로켄"(Mera Dog "Brocken"); 독일 데-47625 케베라에르-베텐 마리엔스트라쎄 80-84 소재 메라-티에르나룽 게엠베하(MERA-Tiernahrung GmbH))에 물중 스테비아 추출물의 용액을, kg 체중 당 4 mg의 스테비아 추출물의 일일 투여량을 개에게 투여하기에 충분한 양으로, 산화방지제, 예컨대 비타민 C(예컨대, 로비믹스(ROVIMIX, 등록상표) C-EC, 스위스 카이저아우그스트 소재 디에스엠 너트리셔널 프로덕츠 리미티드(DSM Nutritional Products Ltd)) 및 이의 유도체, 즉 나트륨 아스코르빌 모노포스페이트(예컨대, 스테이-C(STAY-C, 등록상표) 50, 스위스 카이저아우그스트 소재 디에스엠 너트리셔널 프로덕츠 리미티드), 또는 나트륨/칼슘 L-아스코르베이트의 트라이-, 다이- 및 모노-포스페이트 에스터의 혼합물(예컨대, 로비믹스(등록상표) 스테이-C(등록상표) 35, 스위스 카이저아우그스트 소재 디에스엠 너트리셔널 프로덕츠 리미티드)과 함께 분무한다. 사료 조성물이 약 90 중량%의 무수 물질을 함유하도록 건조한다. 1 일 당 약 200 g의 무수 사료를 소비하는 체중 10 kg의 평균적인 개를 위한 개 사료는 kg 사료 당 약 200 mg의 스테비아 추출물을 함유한다. 이에 따라, 더 큰 개를 위한 사료 혼합물을 제조한다. 개의 스트레스, 공포 및 공격성을 감소시키기 위해, 동물 은신처 농장에서 개에게 사료를 정기적으로 제공할 수 있다. 수의사가 방문하거나 동물 병원에 머무르거나 휴일 별거가 있기 전에, 적어도 스트레스를 주는 사건의 발생 전후 1 주일, 및 스트레스를 주는 사건의 발생 동안 사료를 제공한다.
실시예 12
스테비아 추출물을 함유하는 습윤 고양이 사료
고양이를 위한 시판중인 기초 사료(예를 들어, 해피 캣 "어덜트"(Happy Cat "Adult"); 독일 데-86517 베린겐 쉬드리헤 하우프트스트라쎄 38 소재 티에르파인나룽(Tierfeinnahrung))를 물중 스테비아 추출물의 용액과, kg 체중 당 4 mg의 스테비아 추출물의 일일 투여량을 고양이에게 투여하기에 충분한 양으로, 산화방지제, 예컨대 비타민 C(예컨대, 로비믹스(등록상표) C-EC, 스위스 카이저아우그스트 소재 디에스엠 너트리셔널 프로덕츠 리미티드) 및 이의 유도체, 즉 나트륨 아스코르빌 모노포스페이트(예컨대, 스테이-C(등록상표) 50, 스위스 카이저아우그스트 소재 디에스엠 너트리셔널 프로덕츠 리미티드), 또는 나트륨/칼슘 L-아스코르베이트의 트라이-, 다이- 및 모노-포스페이트 에스터의 혼합물(예컨대, 로비믹스(등록상표) 스테이-C(등록상표) 35, 스위스 카이저아우그스트 소재 디에스엠 너트리셔널 프로덕츠 리미티드)과 함께 혼합한다. 약 400 g의 습윤 사료를 소비하는 체중 5 kg의 평균적인 고양이를 위한 고양이 사료는 kg 사료 당 50 mg의 스테비아 추출물을 함유한다. 사료 조성물이 약 90 중량%의 무수 물질을 함유하도록 건조한다. 고양이의 스트레스, 공포 및 공격성을 감소시키기 위해, 동물 은신처 농장에서 고양이에게 사료를 정기적으로 제공할 수 있다. 수의사가 방문하거나 동물 병원에 머무르거나 휴일 별거가 있기 전에, 적어도 스트레스를 주는 사건의 발생 전후 1 주일, 및 스트레스를 주는 사건의 발생 동안 사료를 제공한다.
실시예 13
스테비아 추출물을 함유하는 개 트리트
시판중인 개 트리트(예를 들어, 메라 도그 "비스킷(Biscuit)"; 독일 데-47625 케베라에르-베텐 마리엔스트라쎄 80-84 소재 메라-티에르나룽 게엠베하)에 물중 스테비아 추출물의 용액을, g 트리트 당 0.5 내지 5 mg의 스테비아 추출물을 트리트에 투여하기에 충분한 양으로, 산화방지제, 예컨대 비타민 C(예컨대, 로비믹스(등록상표) C-EC, 스위스 카이저아우그스트 소재 디에스엠 너트리셔널 프로덕츠 리미티드) 및 이의 유도체, 즉 나트륨 아스코르빌 모노포스페이트(예컨대, 스테이-C(등록상표) 50, 스위스 카이저아우그스트 소재 디에스엠 너트리셔널 프로덕츠 리미티드), 또는 나트륨/칼슘 L-아스코르베이트의 트라이-, 다이- 및 모노-포스페이트 에스터의 혼합물(예컨대, 로비믹스(등록상표) 스테이-C(등록상표) 35, 스위스 카이저아우그스트 소재 디에스엠 너트리셔널 프로덕츠 리미티드)과 함께 분무하였다. 사료 조성물이 약 90 중량%의 무수 물질을 함유하도록 건조한다. 공포 및 긴장을 감소시키기 위해, 상기 트리트를 하루 동안 사료와 함께 제공할 수 있거나, 사료 제공이 보장되지 않는 경우, 즉 이동하는 경우, 상기 트리트를 1 일 당 5 회 이하로 제공할 수 있다.
실시예 14
스테비아 추출물을 함유하는 고양이 트리트
시판중인 고양이 트리트(예를 들어, 독일 데-27283 베르덴/알러 아이처 스트라쎄 215 소재 위스카스, 마스터푸드스 게엠베하(Whiskas, MasterFoods GmbH)에서 시판중인 고양이용 위스카스 덴타비츠(Whiskas Dentabits))에 물중 스테비아 추출물의 용액을, g 트리트 당 0.5 내지 5 mg의 스테비아 추출물을 트리트에 투여하기에 충분한 양으로, 산화방지제, 예컨대 비타민 C(예컨대, 로비믹스(등록상표) C-EC, 스위스 카이저아우그스트 소재 디에스엠 너트리셔널 프로덕츠 리미티드) 및 이의 유도체, 즉 나트륨 아스코르빌 모노포스페이트(예컨대, 스테이-C(등록상표) 50, 스위스 카이저아우그스트 소재 디에스엠 너트리셔널 프로덕츠 리미티드), 또는 나트륨/칼슘 L-아스코르베이트의 트라이-, 다이- 및 모노-포스페이트 에스터의 혼합물(예컨대, 로비믹스(등록상표) 스테이-C(등록상표) 35, 스위스 카이저아우그스트 소재 디에스엠 너트리셔널 프로덕츠 리미티드)과 함께 분무하였다. 사료 조성물이 약 90 중량%의 무수 물질을 함유하도록 건조한다. 공포 및 긴장을 감소시키기 위해, 상기 트리트를 하루 동안 사료와 함께 제공할 수 있거나, 사료 제공이 보장되지 않는 경우, 즉 이동하는 경우, 상기 트리트를 1 일 당 5 회 이하로 제공할 수 있다.

Claims (11)

  1. 스테비올, 이소스테비올 및 이들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택된 화합물을 인지 기능을 개선시키는 양으로 포함하는, 동물 또는 인간의 인지 기능을 개선시키기 위한 조성물로서, 10 내지 90 %의 스테비올, 이소스테비올 또는 이들의 혼합물을 함유하는 조성물.
  2. 제 1 항에 있어서,
    상기 인지 기능이 인지 호조 및 균형의 유지, 학습, 언어 처리, 문제 해결, 지적 기능수행, 심리사회적 부담에 대처하는 능력, 주의 및 집중, 기억, 기억 능력, 정신적 민첩성, 정신적 각성, 정신적 피로, 정신적 상태의 안정화, 스트레스 경감, 업무-과다 스트레스, 스트레스-관련 소모 또는 소진, 및 이완 촉진으로 이루어진 군으로부터 선택되는 조성물.
  3. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
    상기 인지 기능을 개선시키는 화합물이 1회 분량(serving) 당 50 내지 750 mg의 농도로 존재하는 조성물.
  4. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
    상기 인지 기능을 개선시키는 화합물이 스테비올인 조성물.
  5. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
    동물에서의 인지 기능을 개선시키기 위한 조성물.
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  7. 삭제
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  10. 삭제
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