KR101474816B1

KR101474816B1 - Ｎａｄｈ 또는 ｎａｄｐｈ의 존재 하에 산화환원효소/탈수소화효소를 이용한 세코디온 유도체의 거울상이성질체 선택적인 효소적 환원 방법에 의한 세콜 유도체의 제조 방법

Info

Publication number: KR101474816B1
Application number: KR1020117020658A
Authority: KR
Inventors: 안트예 구프타; 안케 췌센처; 마리아 보브코바
Original assignee: 이에페 게엠베하
Priority date: 2006-12-07
Filing date: 2007-12-07
Publication date: 2014-12-19
Anticipated expiration: 2027-12-07
Also published as: US8323936B2; CN102382805B; PL2410047T3; ZA200904235B; CN102382805A; ES2386380T3; JP5627546B2; PL2087127T3; KR101445191B1; WO2008068030A3; CA2671319C; EP2410047A1; EP2087127A2; AT504542A1; EP2087127B1; AT504542B1; EP2410047B1; CA2671319A1; US20120040424A1; PT2087127E

Abstract

본 발명은 일반식 I의 세코디온 유도체의 거울상이성질체 선택적인 효소적 환원 방법에 관한 것으로, 상기 세코디온 유도체는 보조 인자로서 NADH 또는 NADPH의 존재 하에 산화환원효소/탈수소효소를 이용하여 환원된다. 본 발명에서, 세코디온 유도체는 반응 배치에 ≥ 10 g/L의 농도로 사용되며, 산화환원효소/탈수소효소에 의해 형성되는 산화된 보조 인자 NAD 또는 NADP는 계속적으로 재생된다:

상기 식 I에서,
환 구조는 헤테로원자를 포함하지 않거나, 또는 하나 또는 수개를 포함하며,
R₁은 수소 또는 C₁-C₄ 알킬기이며,
R₂는 수소, C₁-C₈ 알킬기 또는 에스테르와 같은, 종래에 공지된 OH에 대한 보호기이며,
R₃는 수소, 메틸기 또는 할라이드이고,
구조 요소

는 벤젠환 또는 0, 1 또는 2개의 C-C 이중결합을 가진 C₆ 환이고,
이중 결합은 선택적으로 6/7 또는 7/8번 위치에 존재하며, 및
1, 2, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 11, 12 및 16번 위치의 탄소가 독립적으로 수소, C₁-C₄ 알킬기, 할라이드 또는 페닐기로 치환된다.

Description

ＮＡＤＨ 또는 ＮＡＤＰＨ의 존재 하에 산화환원효소/탈수소화효소를 이용한 세코디온 유도체의 거울상이성질체 선택적인 효소적 환원 방법에 의한 세콜 유도체의 제조 방법{METHOD FOR THE PRODUCTION OF SECOL DERIVATIVES BY ENANTIOSELECTIVE ENZYMATIC REDUCTION OF SECODIONE DERIVATIVES BY MEANS OF OXIDOREDUCTASE/DEHYDROGENASE IN THE PRESENCE OF NADH OR NADPH}

본 발명은 일반식 1의 세코디온 유도체의 거울상이성질체 선택적인 효소적 환원 방법에 관한 것으로, 상기 세코디온 유도체는 보조인자로서 NADH 또는 NADPH의 존재 하에 산화환원효소/탈수소효소를 이용하여 환원된다.

스테로이드 호르몬 제조 산업은 서로 각각 독립적인 2가지 방식으로 이루어지고 있는데, 즉, 한가지 방법은 천연적으로 생성되는 식물 기원의 스테로이드 화합물에서 시작하는 방법이고, 다른 방법은 프로키랄 전구체로부터 거울상이성질체 선택적인 방법을 통한 전적인 합성 방식이다. 이러한 2가지 방법들 중, 스테로이드의 전합성(total synthesis) 방법은 특히 천연적으로 생성되는 스테로이드에 포함되어 있지 않은 구조적인 요소(structural element)를 도입할 수 있어, 그 중요성이 점점 증가하고 있다.

거울상이성질체 측면에서 순수한 스테로이드를 전합성하는데 있어 중요한 성분은, 세코스테로이드인 8,14-세코-고나-테트라엔-14,17-디온 또는 세코디온이라고도 하는, 일반식 1의 화합물이다. 이 그룹을 대표하는 구체적인 화합물로는, 예컨대, 약학적으로 활성인 화합물인 에티닐 에스트라디올(식 IV) 및 노르게스트렐(식 V)로부터 제조할 수 있는, 메틸 세코디온(식 II, 13-메틸-3-메톡시-8,14-세코-고나-1,3,5(10),9(11)-테트라엔-14,17-디온)과 에틸 세코디온(식 III, 13-에틸-3-메톡시-8,14-세코-고나-1,3,5(10),9(11)-테트라엔-14,17-디온)이 있다.

식 II 식 III

식 IV 식 V

거울상이성질체 측면에서 순수한 스테로이드 화합물의 제조 공정에서 중요한 단계는 식 I의 화합물(예, II 및 III)을, 케토기들 중 하나의 하이드록시기로의 거울상이성질체 선택적인 환원에 의해, 미리 형성되어 있는 비대칭성 C-13을 가진 선택적으로 활성인 화합물로 변환시키는 단계이다. 제조되는 선택적으로 활성인 하이드록시 세코스테로이드 화합물(세콜(secole), 식 VI - IX)은 사이클화에 의해 키랄 스테로이드 화합물로 추가로 가공될 수 있으며, 키랄성(chirality)은 유지된다.

식 I의 화합물의 케토기의 거울상이성질체 선택적인 환원에 의해, 이론상, 4종의 선택적으로 활성인 화합물( 식 VI - IX)이 제조될 수 있다.


식 VI (17-β-OH)	식 VII (17-α-OH)	식 VIII (14-β-OH)	식 IX (14-α-OH)

17번 위치에 하이드록시기가 β-배위로 있는, 식 VI의 화합물은, 천연 에스트론의 유도체를 생성하기 때문에, 특별히 경제적으로 이익이 된다. 이러한 화합물들은 17-β-하이드록시 세코스테로이드로 일컬어진다.

여러가지 미생물을 이용한 일반식 I의 세코디온 유도체의 거울상이성질체 선택적인 환원은, 특히 60년대와 70년대에 충분히 연구되었다. 그렇게 하여, 칸디다(Candida), 데바리오마이세스(Debaryomyces), 클로엑케라(Kloeckera), 피키아(Pichia), 크립토코커스(Cryptococcus), 로도토룰라(Rhodotorula), 토룰롭시스(Torulopsis) 및 한세뉼라(Hansenula) 속의 여러가지 효모 균주 종들이 세코디온을 다양한 하이드록시 화합물로 환원시킬 수 있다는 것을 확인할 수 있었다(US　3616226, US　1252524, US 3616225).

특히, 예컨대 사카로마이세스 유바룸(Saccharomyces uvarum)과 같은 사카로마이세스 속의 효모를, 예컨대 각각의 17-β-하이드록시 세코스테로이드를 제조하는데 유용하게 사용할 수 있다(Kosmol et al; Liebigs Ann. Chem. 701,199 (1967)). 그외 효모 균주, 예컨대 사카로마이세스 드로소필라룸(Saccharomyces drosophilarum)은 세코디온을 대응되는 14-α-하이드록시 세코스테로이드로 바람직하게 환원시킨다(Acta microbiol. Acad. Sci. hung. 22,463-471 (1975)). 아울러, 14-α-하이드록시 세코스테로이드의 생성은 바실러스 튜링기엔시스(Bacillus thuringiensis)에 의한 세코디온 환원에 의한 것으로도 기술되어 있다(Kosmol et al.; Liebigs Ann. Chem. 701,199 (1967)).

게스타겐과 에스트로겐 제제는 전세계적으로 피임제로서, 그리고 호르몬 대체 요법으로 널리 사용되고 있다. 지금까지 대부분 에스트로겐 및 게스타겐 유도체 합성은 전술한 반응 원리를 기본으로 하며, 중요한 단계는 세코디온의 대응되는 17-β-하이드록시 세코스테로이드로의 거울상이성체 선택적인 환원 단계이다.

이렇게, 세코디온 유도체의 거울상이성체 선택적인 환원은 지금까지 피키아 또는 사카로마이세스 종의 여러가지 효모 균주를 이용하여 전체 세포의 바이오변환으로서 수행되고 있다. 그러나, 이러한 방법은 1% 보다 훨씬 낮은 기질 농도(보통 1 내지 5 g/L)에 대해서만 실현가능하다는 점이 단점이다(US 3697379; Current Science, Feb. 5 (1984), Vol 53. No. 3, p. 124; Indian Journal of Experimental Biology, Vol.27, August 1989, p. 742-743). 따라서, 특히 대량의 바이오매스 분리 뿐만 아니라 대량의 바이오매스로부터의 반응 생성물의 재가공 및 분리는 매우 복잡한 것으로 나타났다. 발명자가 알고 있는 한, 환원 반응에 참여하는 효소들은 지금까지 분리, 동정 및 개시되지 않았다. 이처럼, 세코디온 유도체의 환원을 달성할 수 있는 산화환원효소를 코딩하는 DNA 서열은 아직 동정되지 않았다.

따라서, 본 발명의 과제는 일반식 I의 세코디온 유도체, 특히 식 II 및 III의 화합물을 거울상이성질체 선택적으로 환원시킬 수 있는 방법을 제공하는 것이다. 이러한 방법은, 특히, 대응되는 17-β-하이드록시 세코스테로이드의 제조가 실현가능하도록 하여야 한다.

제1 측면에서, 상기 과제는 일반식 I의 세코디온 유도체의 거울상이성질체 선택적인 효소적 환원 방법에 의해 본 발명에 따라 달성된다:

상기 식 I에서,

환 구조는 헤테로원자를 포함하지 않거나, 또는 하나 또는 수개를 포함하며,

R₁은 수소 또는 C₁-C₄ 알킬기이며,

R₂는 수소, C₁-C₈ 알킬기 또는 에스테르와 같은, 종래에 공지된 OH에 대한 보호기이며,

R₃는 수소, 메틸기 또는 할라이드이고,

구조 요소(structural element)

는 벤젠환 또는 0, 1 또는 2개의 C-C 이중결합을 가진 C₆ 환이고,

이중 결합은 선택적으로 6/7 또는 7/8번 위치에 존재하며, 및

1, 2, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 11, 12 및 16번 위치의 탄소가 독립적으로 수소, C₁-C₄ 알킬기, 할라이드 또는 페닐기로 치환되고,

상기 세코디온 유도체는 보조 인자로서 NADH 또는 NADPH의 존재 하에 산화환원효소/탈수소효소를 이용하여 환원되며,

상기 방법은, 세코디온 유도체가 반응 배치에 ≥ 10 g/L의 농도로 사용되며, 산화환원효소/탈수소효소에 의해 형성되는 산화된 보조 인자 NAD 또는 NADP가 계속적으로 재생되는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 방법은 종래 기술에 비해 세코디온 유도체의 거울상이성질체 선택적인 효소적 환원의 현저한 개선을 보인다. 본 발명에 따른 방법은, 종래에 개시된 농도를 훨씬 초월하는 농도 범위에서, 유리 효소를 이용하여, 세코디온 유도체의 여러가지 대응되는 하이드록시 세코스테로이드로의 환원을 가능하게 한다.

제2 측면에서, 전술한 과제는 일반식 I의 세코디온 유도체의 거울상이성질체 선택적인 효소적 환원 방법에 의해 달성되며, 상기 세코디온 유도체는 보조 인자로서 NADH 또는 NADPH의 존재 하에 산화환원효소/탈수소효소를 이용하여 환원되며, 상기 방법은 산화환원효소/탈수소효소가

a) 서열번호 1, 2, 3, 4 또는 5의 아미노산 서열과 아미노산 서열이 50% 이상 동일한, 아미노산 서열을 포함하며,

b) 서열번호 6, 7, 8, 9 또는 10의 핵산 서열에 의해 코딩되며, 또는

c) 엄격한 조건 하에서, 서열번호 6, 7, 8, 9 또는 10과 혼성화하는 핵산 서열에 의해 코딩되는, 것을 특징으로 한다.

본 발명자들은 세코디온 유도체를 하이드록시 세코스테로이드로 환원시킬 수 있으며 산업적인 규모로 재조합에 의해 생산할 수 있는, 산화환원효소를 동정하였다. 유의적으로 높아진 기질 농도는 지금의 세포 전체를 이용하는 방법 보다는 본 발명에 따른 방법으로 달성할 수 있다.

본 발명에 따른 방법에서, 서열번호 1, 2, 3, 4 또는 5를 가지는 산화환원효소 또는 그 폴리펩타이드로부터 유래될 수 있는 폴리펩타이드 각각을 완전히 정제된 상태로, 부분 정제된 상태로, 또는 서열번호 1, 2, 3, 4 또는 5의 폴리펩타이드를 함유하고 있는 세포로서, 사용할 수 있다. 이로 인해, 사용되는 세포는 천연 상태, 투과화된 상태 또는 용혈된 상태(lysed state)로 제공될 수 있다. 바람직하게는, 산화환원효소 및 그로부터 유래될 수 있는 유도체 각각은 예컨대 에스케리키아 콜리(Escherichia coli)와 같은 적합한 숙주 유기체에서 과다발현되며, 재조합 폴리펩타이드는 식 I의 세코디온 유도체의 환원에 사용된다.

서열번호 1의 폴리펩타이드를 코딩하는 DNA 서열(서열번호 6)은 예컨대 유기체 클로로플렉서 아우란티아쿠스(Chloroflexus aurantiacus) DSM 635의 게놈으로부터 수득할 수 있다.

서열번호 2의 폴리펩타이드를 코딩하는 DNA 서열(서열번호 7)은 예컨대 유기체 루브로박터 자일라노필러스(Rubrobacter xylanophilu) DSM 9941의 게놈으로부터 수득할 수 있다.

서열번호 3의 폴리펩타이드를 코딩하는 DNA 서열(서열번호 8)은 예컨대 효모 칸디다 마그놀리애(Candida magnoliae) CBS 6396의 게놈으로부터 수득할 수 있다.

서열번호 4 및 5의 산화환원효소는 예컨대 칸디다 마그놀리애(Candida magnoliae) DSMZ 70638의 게놈으로부터 상동성 스크리닝에 의해 수득할 수 있다.

예컨대 서열번호 6에 엄격한 조건 하에서 혼성화하는 핵산 서열은, 서열번호 6 또는 서열번호 6의 부분 서열을 DNA 프로브로서 이용한 콜로니 혼성화 방법, 플라그 혼성화 방법, 서든 혼성화 방법 또는 동류의 방법을 통해 동정할 수 있는 폴리뉴클레오타이드로 이해된다. 이를 위해, 필터 상에 고정화된 폴리뉴클레오타이드를, 예컨대 0.7-1 M NaCl 용액 중에서 60 ℃에서 서열번호 6과 혼성화한다. 혼성화는 예컨대 Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Second Edition (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989) 또는 유사한 문헌에 기술된 바와 같이 수행한다. 그런 후, 필터를 0.1X 내지 2X SSC 용액으로 65 ℃에서 세정하며, 1X SSC 용액은 150 mM NaCl 및 15 mM 소듐사이트레이트의 혼합물이다.

전술한 엄격한 조건하에서 서열목록의 서열번호 6, 7, 8, 9 또는 10의 폴리뉴클레오타이드와 혼성화하는 폴리뉴클레오타이드는 서열번호 6, 7, 8, 9, 또는 10의 폴리뉴클레오타이드 서열과 60% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 더 바람직하게는 95% 이상의 서열 동일성을 보여야 한다.

다른 측면에서, 전술한 과제는 일반식 I의 세코디온 유도체의 거울상이성질체 선택적인 효소적 환원 방법에 의해 본 발명에 따라 달성되며, 세코디온 유도체는 보조 인자로서 NADH 또는 NADPH의 존재 하에 산화환원효소/탈수소화효소를 이용하여 환원되며, 상기 방법은 산화환원효소/탈수소화효소의 길이가 230 내지 260개의 아미노산 길이이며 서열번호 18 내지 42: nalvtgasrgig, nalvtggsrgig, nalitggsrgig, nalitgasrgig, nalitggsrgmg, halvtgasrgig, gysvtla, gynvtla, gysvtlv, gynvtlv, fkgaplpa, fkaaplpa, fvsnag, ffsnag, fvcnag, fvanag, spialtkal, spvaltkti, spialtktl, spvamtkal, sqialtkal, avysask, avysatk, pikgwi 및 pisgwi로 이루어진 군으로부터 선택되는 부분 서열(partial sequence) 중 하나 또는 수개를 포함하는 것을 특징으로 한다.

본 발명에 따른 방법에서, NADH 또는 NADPH는 보조 인자로서 사용된다. 용어 "NADP"는 니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오타이드 포스페이트이고, "NADPH"는 환원된 니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오타이드 포스페이트이다. 용어 "NAD"는 니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오타이드이고, 용어 "NADH"는 환원된 니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오타이드이다.

세코디온 유도체가 ≥ 10 g/L의 농도로 반응 배치에 사용되고, 산화환원효소/탈수소화효소에 의해 형성된 산화된 보조 인자 NAD 또는 NADP가 계속적으로 재생되는, 본 방법의 바람직한 예에 있어서, 산화환원효소/탈수소화효소는

a) 서열번호 1, 2, 3, 4 또는 5의 아미노산 서열과 아미노산 서열이 50% 이상 동일한, 아미노산 서열을 포함하거나,

b) 산화환원효소/탈수소화효소는 서열번호 6, 7, 8, 9 또는 10의 핵산 서열에 의해 코딩되거나, 또는

c) 산화환원효소/탈수소화효소가 엄격한 조건 하에서, 서열번호 6, 7, 8, 9 또는 10과 혼성하는 핵산 서열로 코딩되는, 것을 특징으로 한다.

세코디온 유도체가 ≥ 10 g/L의 농도로 반응 배치에 사용되고, 산화환원효소/탈수소화효소에 의해 형성되는 산화된 보조 인자 NAD 또는 NADP가 계속적으로 재생되는, 본 방법의 다른 바람직한 예에 있어서, 산화환원효소/탈수소화효소는 230 내지 260개의 아미노산 길이이며, 서열번호 18 내지 42: nalvtgasrgig, nalvtggsrgig, nalitggsrgig, nalitgasrgig, nalitggsrgmg, halvtgasrgig, gysvtla, gynvtla, gysvtlv, gynvtlv, fkgaplpa, fkaaplpa, fvsnag, ffsnag, fvcnag, fvanag, spialtkal, spvaltkti, spialtktl, spvamtkal, sqialtkal, avysask, avysatk, pikgwi 및 pisgwi로 이루어진 군으로부터 선택되는 부분 서열(partial sequence) 중 하나 또는 수개를 포함하는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 제2 및 제3 측면에 대한 본 발명에 따른 방법에서, 산화환원효소/탈수소화효소에 의해 형성되는 산화된 보조 인자 NAD 또는 NADP는 계속적으로 재생되는 것이 바람직하다.

본 발명에 따른 모든 방법에서 바람직한 예로, 산화된 보조 인자 NAD 또는 NADP는 알코올의 산화에 의해 재생된다.

그래서, 에탄올, 2-프로판올, 2-부탄올, 2-펜탄올, 3-펜탄올, 4-메틸-2-펜탄올, 2-헥사놀, 2-헵타놀, 2-옥타놀 또는 사이클로헥사놀과 같은 1차 및 2차 알코올이 공동-기질(cosubstrate)로서 바람직하게 사용된다. 재생하기 위한 공동-기질의 비율은 총 부피를 기준으로 5 내지 95 부피%의 범위일 수 있다.

바람직하기로는, 보조 인자 재생에, R_X 및 R_Y가 각각 독립적으로 수소, 분지형 또는 비분지형의 C₁-C₈ 알킬기이고 C_total ≥ 3인, 일반식 R_XR_YCHOH의 이차 알코올이 사용된다.

본 발명에 따른 방법에 대한 다른 바람직한 예에 있어서, 산화환원효소/탈수소화효소는 추가적으로 보조 인자의 재생을 위해 첨가된다.

적합한 NADH-의존적인 알코올 탈수소화효소는, 예컨대, 빵 효모, 칸디다 파랍실로시스(Candida parapsilosis) (CPCR) (US 5,523,223 및 US 5,763,236, Enzyme Microb. Technol., 1993, 15(11):950-8), 피키아 캡슐라타(Pichia capsulata)(DE 10327454.4), 로도코커스 에리트로폴리스(from Rhodococcus erythropolis)(RECR) (US 5,523,223), 노르카르디아 퓨스카(Norcardia fusca)(Biosci. Biotechnol. Biochem., 63(10), 1999, p. 1721-1729; Appl. Microbiol. Biotechnol, 2003, 62(4):380-6; Epub 2003, Apr. 26) 또는 로도코커스 루버(Rhodococcus ruber)(J. Org. Chem., 2003, 68(2):402-6)로부터 수득가능하다. 이들 알코올 탈수소화효소의 적절한 공동-기질은, 예컨대 2-프로판올(이소프로판올), 2-부탄올, 2-펜탄올, 4-메틸-2-펜탄올, 2-옥타놀 또는 사이클로헥사놀과 같이 이미 언급한 2차 알코올이다.

NADPH의 재생에 적합한 2차 알코올 탈수소화효소로는, 예컨대, 전술한 효소가 있으며, 락토바실랄레스(Lactobacillales) 목의 유기체, 예컨대 락토바실러스 케피르(Lactobacillus kefir)(US 5,200,335), 락토바실러스 브레비스(Lactobacillus brevis)(DE 19610984 A1; Acta Crystallogr. D. Biol. Crystallogr. 2000 Dec; 56 Pt 12:1696-8), 락토바실러스 마이너(Lactobacillus minor)(DE 10119274), 루코노스턱 카르노섬(Leuconostoc carnosum)(A 1261/2005, Kl. C12N) 또는, 개시된 써모아네로븀 브록키(Thermoanerobium brockii), 써모아네로븀 에탄올리쿠스(Thermoanerobium ethanolicus) 또는 클로스트리듐 베예린키(Clostridium beijerinckii)로부터 분리된다.

그러나, 원칙적으로 보조 인자 재생에 다른 효소 시스템도 사용할 수 있다. 예를 들어, 보조 인자 재생은 NAD- 또는 NADP-의존적인 포르메이트 탈수소화효소를 이용하여 수행할 수 있다(Tishkov et al., J. Biotechnol. Bioeng. [1999] 64, 187-193, Pilot-scale production and isolation of recombinant NAD and NADP specific formate dehydrogenase). 포르메이트 탈수소화효소에 적합한 공동-기질은 예컨대 암모늄 포르메이트, 소듐 포르메이트 또는 칼슘 포르메이트와 같은, 포름산 염이다.

본 발명에 따른 방법으로 수행한 TTN(총 턴오버 수 = 사용한 보조 인자 1 mol 당 환원된 세코디온 화합물의 mol 수)은 보통 10² 내지 10⁵의 범위이며, 바람직하기로는 ≥10³이다.

바람직한 예에 있어서, 본 발명에 따른 방법은 수성 유기 2상 시스템으로 수행된다.

따라서, 세코디온 유도체의 변환은 예컨대 보조 인자 재생을 위한 2-알코올, 산화환원효소, 물, 보조 인자 및 세코디온 화합물을 포함하는 2상 시스템에서 이루어진다. 그러나, 보조 인자의 재생에 관여하지 않는, 즉 어떠한 산화가능한 하이드록시가가 없는, 추가적인 유기 용매도 포함될 수 있다. 디에틸 에테르, 터셔리 부틸 메틸 에테르, 디이소프로필 에테르, 디부틸 에테르, 에틸 아세테이트, 부틸 아세테이트, 헵탄, 헥산, 톨루엔, 디클로로메탄, 사이클로헥산 또는 이의 혼합물이 바람직하기로는 추가적인 유기 용매로서 사용된다.

이와 관련하여, 2상 시스템의 물에 혼화되지 않는 유기 성분의 양은 반응 배치의 총 부피를 기준으로 10% - 90%, 바람직하게는 20% - 80%의 범위일 수 있다. 수성 성분의 양은 반응 배치의 총 부피를 기준으로 10% - 90%, 바람직하게는 20% - 80%의 범위일 수 있다.

또한, 완충제, 예컨대 pH 5-10, 바람직하기로는 pH 6-9의 포타슘 포스페이트, 트리스/HCl, 글리신 또는 트리에탄올아민 완충제를 물에 첨가할 수 있다. 아울러, 완충제는 예컨대 마그네슘 이온 또는 아연 이온과 같이 2가지 효소를 모두 안정화시키거나 활성화시키는 이온을 포함할 수 있다.

또한, 사용되는 효소를 안정화하기 위한 다른 첨가제, 예컨대 글리세롤, 소르비톨, 1,4-DL-디티오트레이톨(DTT) 또는 디메틸 설폭사이드(DMSO)를 본 발명에 따라 사용할 수 있다.

보조 인자 NAD(P)H의 농도는 수상을 기준으로 0.001 mM - 10 mM, 특히 0.01 mM - 1.0 mM의 범위이다. 사용되는 효소의 특이적인 특성에 따라, 온도는 10 ℃ - 70 ℃, 바람직하기로는 20 ℃ - 35 ℃일 수 있다.

통상, 환원할 세코디온 유도체는 수용성이 불량하다. 따라서, 반응 동안에 기질은 완전히 또는 불완전하게 용해된 상태로 제공될 수 있다. 기질이 반응 혼합물에 완전히 용해되지 않는다면, 기질의 일부는 고형 형태로 존재하게 되어 3번째 고상을 형성할 수 있다. 또한, 반응 혼합물은 변환 과정 동안에 일시적으로 에멀젼 형태를 취할 수 있다.

본 발명에 따른 방법에서, 일반식 1의 세코디온 유도체는 반응 배치에 총 부피를 기준으로 10 g/L - 500 g/L, 바람직하기로는 25 g/L - 300 g/L, 특히 바람직하기로는 50 g/L - 200 g/L의 양으로 사용된다.

본 발명의 바람직한 예는, 13-에틸-3-메톡시-8,14-세코-고나-1,3,5(10),9(11)-테트라엔-14,17-디온(에틸 세코디온 - 식 III) 또는 13-메틸-3-메톡시-8,14-세코-고나-1,3,5(10),9(11)-테트라엔-14,17-디온(메틸 세코디온 - 식 II)이 세코디온 유도체로서 사용되는 것을 특징으로 한다.

본 발명에 따른 방법은, 예컨대, 유리나 금속 재질의 반응 바셀에서 이루어진다. 이를 위해, 화합물을 각각 반응 바셀에 옮기고, 예컨대 질소 또는 공기 대기하에서 교반한다. 반응 시간은 사용되는 세코디온 화합물과 산화환원효소에 따라 1시간 내지 7일, 특히 2시간 내지 48시간이다. 이 시간 동안에, 세코디온 화합물은 대응되는 하이드록시 세코스테로이드 화합물로 50% 이상이 환원된다.

실시예

이하, 본 발명은 실시예를 들어 보다 상세하게 설명된다.

실시예 1

클로로플렉서스 아우라티아쿠스 DSM 635로부터 산화환원효소의 클로닝

A) 클로로플렉서스 아우라티아쿠스 DSM 635의 배양

클로로플렉서스 아우라티아쿠스 DSM 635 세포를 하기 배지 중에서 48 ℃ 광하에 박테리아 배양기에서 배양하였다: 0.1% 효모 추출물, 0.1% 글리실 글리신, 0.01% Na₂HPO₄ x 2 H₂O, 0.01% MgSO₄ x 7 H₂O, 0.01% KNO₃, 0.05% NaNO₃, 0.01% NaCl, 0.005% CaCl₂ x 2 H₂O, 5 ml의 0.01% Fe(III) 시트레이트 용액, 1 ml의 미량 원소 용액 SL-6 [500 ㎕/L H₂SO₄, 2.28 g/L MnSO₄ x H₂O, 500 mg/L ZnSO₄ x 7 H₂O, 500 mg H₃BO₃, 25 mg/L CuSO₄ x 5 H₂O, 25 mg/L Na₂MoO₄ x 2 H₂O, 45 mg/L CoCl₂ x 6 H₂O]. 배양 12일째에, 원심분리하여 배양 배지로부터 세포를 분리하여 -80 ℃에 저장하였다.

B) 선택적인 산화환원효소를 코딩하는 유전자의 증폭

Manniatis & Sambrook의 "Molecular Cloning"에 기재되어 있는 방법에 따라, 게놈 DNA를 추출하였다. 수득되는 핵산은 NCBI 데이타베이스의 등재번호 76258197로 공개되는 유전자 서열로부터 유래한 특이적인 프라이머를 사용한 중합효소 연쇄 반응(PCR)용 주형으로 제공하였다. 프라이머에 5' 말단 위치에 나중에 발현 벡터에 클로닝하기 위한, 엔도뉴클레아제 NdeI, Hind　III 또는 Sph I 제한 부위 각각을 포함시켰다(서열번호 11, 서열번호 12, 서열번호 13).

증폭은 PCR 완충액[10 mM Tris-HCl, (pH 8.0); 50 mM KCl; 10 mM MgSO₄; 1 mM dNTP Mix; 각 프라이머 20 pMol 및 Platinum Pfx DNA 중합효소(Invitrogen) 2.5 U] 및 게놈 DNA 500 ng 중에서, 하기 온도 사이클로 수행하였다:

사이클 1: 94 ℃, 2 분

사이클 2 x 30: 94 ℃, 30 초

56 ℃, 30 초

68 ℃, 60 초

사이클 3: 68 ℃, 7 분

4 ℃, ∞

크기가 약 750 bp인 제조되는 PCR 산물을 1% 아가로스 젤 상에서 정제한 후, 엔도뉴클레아제 Nde I 및 Hind III 또는 엔도뉴클레아제 Sph I 및 Hind III 각각을 이용하여 절단한 다음, 벡본이 동일한 엔도뉴클레아제로 이미 처리된 pET21a 벡터(Novagen) 또는 pQE70 벡터(Qiagen)의 벡본에 연결하였다. 연결 배치 2 ㎕를 E.coli Top 10 F' 세포(Invitrogen)에 형질전환한 다음, 암피실린(또는 카나마이신)-내성 콜로니의 플라스미드 DNA를 대상으로, 엔도뉴클레아제 Nde I 및 Hind III 또는 엔도뉴클레아제 Sph I 및 Hind III 각각으로 절단하여 750 bp 크기의 삽입체의 존재를 평가하였다. 단편이 있는 클론으로부터 수득한 플라스미드로 서열 분석을 실시하였고, 이후 Escherichia coli BL21 Star (Invitrogen) 및 E.coli RB791 (genetic stock, Yale)에 각각 형질전환하였다.

실시예 2

E.coli 에서 재조합 클로로플렉서스 산화환원효소의 발현

발현 구조체로 형질전환된 E.coli BL21 Star(Invitrogen, Karlsruhe, Germany) 및 RB791(E.coli genetic stock, Yale, USA) 각각을, 암피실린 50 ㎍/ml 또는 카르베니실린 50 ㎍/ml이 각각 첨가된 LB 배지 200 ml(1% 트립톤, 0.5% 효모 추출물, 1% NaCl) 중에서, 550 nm에서의 광학 밀도가 0.5가 될때까지, 배양하였다. 이소프로필티오갈락토시드(IPTG)를 농도 0.1 mM로 첨가하여, 재조합 단백질의 발현을 유도하였다. 25 ℃ 및 220 rpm에서 8시간 또는 16시간 유도한 후, 세포를 회수하여 -20 ℃에서 냉동시켰다. 활성 테스트를 위해, 세포 10 mg을 500 ㎕의 100 mM TEA 완충액 pH 7.0 및 500 ㎕의 유리 비드와 혼합한 다음 글로브 밀을 이용하여 10분간 소화시켰다. 수득한 용혈물을 해당 측정시 희석하여 사용하였다. 활성 테스트를 다음과 같이 수행하였다: 870 ㎕의 100 mM TEA 완충액 pH 7.0, 160 ㎍ NADH, 10 ㎕의 희석한 세포 용혈물. 반응 혼합물에 100 mM 기질 용액 100 ㎕을 첨가하여, 반응을 개시하였다.

효소를 대량 회수하기 위해, 세포 30 g을 150 ml의 트리에탄올아민 완충액(100 mM, pH 7, 2 mM MgCl₂, 10% 글리세롤)에 재현탁하고, 고압 호모게나이저로 분쇄하였다. 이후, 효소 용액을 글리세롤 150 ml과 혼합하여 -20 ℃에 저장하였다.

실시예 3

유기체 배양 및 에틸 세코디온(식 III)의 환원 변환 후 스크리닝

스크리닝을 위해, 효모 균주 피키아 파리노사(Pichia farinosa) DSM 70362, 칸디다 그로펜기에세리(Candida gropengiesseri) MUCL 29836, 칸디다 백시니(Candida vaccinii) CBS 7318, 피키아 파리노사 DSM 3316, 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae) CBS 1508 및 칸디다 마그놀리애(Candida magnoliae) CBS 6396을 하기 배지에서 배양하였다: 효모 추출물(5), 펩톤(5) 및 글루코스(20)(괄호 안 숫자는 각각 g/L 단위임). 배지를 121 ℃에서 멸균하고, 효모를 분 당 140 회전의 교반기에서 25 ℃에서 pH를 추가적으로 조정하지 않으면서 배양하였다.

식 III의 에틸 세코디온의 대응되는 하이드록시 세코스테로이드 화합물로의 환원 변환을, 다음과 같이 전세포 바이오변환 배치로 테스트하였다: 400 mg의 신선하게 준비한 회수한 세포를, 글루코스 50 mg, 식 III의 에틸 세코디온 10 mg과 100 mM 트리에탄올아민 완충액(TEA) pH7.0 900 ㎕과 함께 배치에서 24시간 동안 28 ℃에서 1400 rpm으로 교반하였다. 그런 후, 배치를 1 ml의 디클로로메탄으로 추출하고, 원심분리한 다음 질소로 건조하고 아세토니트릴에 용해하여 HPLC 분석하였다.

스크리닝 결과는 표 2에 종합 개시한다.

균주 번호	미생물	24시간 후 wt 균주를 이용한 에틸 세코디온의 변환
균주 번호	미생물	배치 24 h
DSM 70362	피키아 파리노사	0.7%
MUCL 29836	칸디다 그로펜기에세리	0.2%
CBS 7318	칸디다 백시니	3.2%
DSM 3316	피키아 파리노사	15.8%
CBS 1508	사카로마이세스 세레비지애	0.7%
CBS 6396	칸디다 마그놀리애	41%

균주 CBS 6396이 가장 높은 에틸 세코디온 변환율을 보였으므로, 이 균주를 cDNA 라이브러리 제조용 출발 유기체로서 선택하였다.

실시예 4

칸디다 마그놀리애 CBS 6396으로부터 cDNA 라이브러리 제조 및 산화환원효소의 클로닝

A) (총 RNA 및 mRNA) 분리 및 cDNA 라이브러리 제조

신선한 세포 600 mg을 빙냉한 LETS 완충액 2.5 ml에 재현탁하였다. 질산으로 헹구고 페놀(pH 7.0) 3 ml로 평형화한 유리 비드 5 ml(약 20 g)을 상기 세포 현탁물에 첨가하였다. 배치 전체를 30초간 볼텍싱하고 30초간 얼음 위에서 냉각시키는 처리를 교대로 총 10분간 실시하였다. 그런 후, 빙냉한 LETS 완충액 5 ml을 첨가하여, 이를 다시 왕성하게 볼텍스하였다. 이 세포 현탁액을 5분간 11000 g으로 4 ℃에서 원심분리하였다. 수상을 회수하고 페놀:클로로포름:이소아밀 알코올(24:24:1) 혼합물을 동일 부피로 사용하여 2번 추출하였다. 그 후, 클로로포름으로 추출하였다. 최종 추출 후, 1/10 부피의 5 M LiCl₂을 첨가하여, 4시간 동안 -20 ℃에서 총 RHA를 침전시켰다.

mRNA 분자를 농화시키기 위해, 이렇게 수득한 총 RNA 1 mg을 올리고 dT 셀룰로스(NEB Biolabs)를 통해 사용하였다. 침전시킨 후, 5 ㎍ mRNA을 cDNA 합성에 사용였다(pBluescript IIXR cDNA Library Construction kit, Stratagene). 제조사의 설명서에 따라, 구축한 라이브러리를 XL-10 Gold E.coli에 형질전환하고, ADH의 활성에 대해 스크리닝하였다. 클론(cM4)을 동정하고, NADPH 또는 NADH을 각각 보조 인자로서, 그리고 기질로서 에틸 세코디온(식 III)을 이용한 흡광도 감소를 기초로 분리하였다. 프라이머 T7 및 프라이머 T3을 이용하여 클론으로부터 분리한 플라스미드의 서열을 분석함으로써 ORF 789 bp가 확인되었다. 이 단편은, 262개의 아미노산 크기의 융합 단백질을 코딩하며, 베타-갈락토시다제의 a-단편과 추정의 단쇄 알코올 탈수소화효소의 서열로 이루어져 있다.

B) 칸디다 마그놀리애 CBS 6396으로부터 PCR에 의한 단쇄 ADH를 코딩하는 전장 전사체의 합성

전장 전사체를 적절한 발현 시스템에 클로닝하기 위한 특이적인 프라이머를 구축하였다. 이로, Nde　I 및d Sph I 각각에 대한 인지 서열이 있는 5'-프라이머와, XhoI 및 SacI 각각의 인지 서열이 있는 3'-프라이머로 변형시켰다(서열번호 14, 서열번호 15, 서열번호 16, 서열번호 17). 칸디다 마그놀리애의 발현 라이브러리 클론(CM4)으로부터 분리한 플라스미드 DNA를 중합효소 연쇄 반응용 주형으로서 사용하였다. PCR 완충액[10 mM Tris-HCl (pH 8.0); 50 mM KCl; 10 mM MgSO₄; 1 mM dNTP Mix; 각각 20 pMol의 프라이머 및 2.5 U의 Platinum Pfx DNA 중합효소(Invitrogen)]과 주형 50 ng을 사용하고, 하기 온도 사이클로 증폭을 수행하였다:

사이클 1: 94 ℃, 2 분

사이클 2 x 30: 94 ℃, 15 초

58 ℃, 30 초

68 ℃, 75 초

사이클 3: 68 ℃, 7 분

4 ℃, ∞

수득되는 PCR 산물을 1% 아가로스 젤 상에서 정제한 후, 엔도뉴클레아제 Nde I 및 Xho I 또는 엔도뉴클레아제 Sph I 및 Sac I 각각을 이용하여 절단한 다음, 벡본이 동일한 엔도뉴클레아제로 이미 처리된 pET21a 벡터(Novagen) 또는 pQE70 벡터(Qiagen)의 벡본에 연결하였다. 연결 배치 2 ㎕를 E.coli Top 10 F' 세포(Invitrogen)에 형질전환한 다음, 암피실린(또는 카나마이신)-내성 콜로니의 플라스미드 DNA를 대상으로, 엔도뉴클레아제 Nde I 및 Xho I 또는 엔도뉴클레아제 Sph I 및 Sac I 각각으로 절단하여 750 bp 크기의 삽입체의 존재를 평가하였다. 발현 구조체 pET21-MgIV 및 pQME70-MgIV를 서열 분석하였다. 단쇄 산화환원효소를 코딩하는 칸디다 마그놀리애 유전자는 총 729 bp의 오픈 리딩 프래임(서열번호 8에 포함됨)을 가지며, 243개의 아미노산 단백질(서열번호 3)에 해당된다

실시예 5

E.coli 세포에서 재조합 산화환원효소의 발현

컴피턴트 E. coli StarBL21(De3) 세포(Invitrogen)와 RB791 세포(E.coli genetic stock, Yale, USA) 각각에, 산화환원효소를 코딩하는 발현 구조체 pET21-MgIV 및 pQME70-MgIV 각각을 형질전환하였다. 발현 구조체로 형질전환된 E. coli 콜로니를, 암피실린 50 ㎍/ml 또는 카나마이신 40 ㎍/ml이 각각 첨가된 LB 배지 200 ml(1% 트립톤, 0.5% 효모 추출물, 1% NaCl) 중에서, 550 nm에서의 광학 밀도가 0.5가 될 때까지, 배양하였다. 이소프로필티오갈락토시드(IPTG)를 농도 0.1 mM로 첨가하여, 재조합 단백질의 발현을 유도하였다. 25 ℃ 및 220 rpm에서 16시간 동안 유도한 후, 세포를 회수하여 -20 ℃에서 냉동시켰다. 활성 테스트를 위해, 세포 10 mg을 500 ㎕의 100 mM TEA 완충액 pH 7.0, 1 mM MgCl₂ 및 500 ㎕의 유리 비드와 혼합한 다음 글로브 밀을 이용하여 10분간 소화시켰다. 수득한 용혈물을 해당 측정시 희석하여 사용하였다.

활성 테스트를 다음과 같이 수행하였다: 960 ㎕의 100 mM TEA 완충액 pH 7.0, 1 mM MgCl₂, 160 ㎍ NADPH, 10 ㎕의 희석한 세포 용혈물. 반응 혼합물에 100 mM 기질 용액 10 ㎕을 메탄올 중에 첨가하여, 반응을 개시하였다.

실시예 6

서열번호 1의 산화환원효소를 이용한 에틸 세코디온(식 III)의 환원

에틸 세코디온(식 III)을 환원시키기 위해, 혼합물: 800 ㎕ 완충액(100 mM 포타슘 포스페이트, pH = 7, 2 mM MgCl₂), 1.2 ml 2-프로판올, 0.08 mg NAD, 100 mg 에틸 세코디온(식 III) 및 1 ml의 효소 현탁 산화환원효소(서열번호 1)(실시예 3 참조)를, 일정하게 잘 혼합하면서 24시간 동안 실온에서 반응 바셀에서 인큐베이션하였다. 96시간 후에, 사용한 에틸 세코디온(식 III)의 > 90%가 회수되었다.

반응 종료 후, 반응 혼합물을 디클로로메탄으로 추출하고, 산물을 포함하는 유기상을 분리하여, 용매를 증류/증발함으로써 17-β-하이드록시 화합물(에틸 세콜)을 수득하였다.

에틸 세코디온의 에틸 세콜로의 변환을 HPLC를 통해 확인하였다. 이를 위해, 분리 컬럼 EC125/4 Nucleodur 100-5 C18ec(Machery-Nagel, Duren, Germany)과 용매로서 아세토니트릴 및 물을 사용하였다. 분석을 위해, 용매내 아세토니트릴 부분의 선형 농도 구배를 30%에서 70%로 적용하였다. 반응 산물의 확인은 비교 기질과 비교하여 수행하였다.

실시예 7

산화환원효소(서열번호 2)를 통한 에틸 세코디온(식 III)의 환원

에틸 세코디온(식 III)을 환원시키기 위해, 혼합물: 250 ㎕ 완충액(100 mM 트리에탄올아민, pH = 8, 2 mM MgCl₂), 250 ㎕ 4-메틸-2-펜탄올, 0.02 mg NAD, 25 mg 에틸 세코디온(식 III) 및 25 ㎕의 효소 현탁 산화환원효소(서열번호 2)(실시예 3 참조)를, 일정하게 잘 혼합하면서 96시간 동안 실온에서 반응 바셀에서 인큐베이션하였다. 96시간 후에, 사용한 에틸 세코디온(식 III)의 > 30%가 하이드록시 화합물로 환원되었다.

실시예 8

산화환원효소(서열번호 3)을 통한 에틸 세코디온(식 III)의 환원

에틸 세코디온(식 III)을 환원시키기 위해, 혼합물: 100 ㎕ 완충액(100 mM 트리에탄올아민, pH = 7, 2 mM MgCl₂), 400 ㎕ 4-메틸-2-펜탄올, 0.02 mg NADP, 25 mg 에틸 세코디온(식 III) 및 100 ㎕의 효소 현탁 산화환원효소(서열번호 3)(실시예 3 참조)를, 일정하게 잘 혼합하면서 72시간 동안 실온에서 반응 바셀에서 인큐베이션하였다. 72시간 후에, 사용한 에틸 세코디온(식 III)의 > 95%가 하이드록시 화합물로 환원되었다.

실시예 9

산화환원효소(서열번호 4)를 통한 에틸 세코디온(식 III)의 환원

에틸 세코디온(식 III)을 환원시키기 위해, 혼합물: 200 ㎕ 완충액(100 mM 트리에탄올아민, pH = 9, 2 mM MgCl₂), 300 ㎕ 2-헵타놀, 0.025 mg NADP, 100 mg 에틸 세코디온(식 III) 및 50 ㎕의 효소 현탁 산화환원효소(서열번호 4)(실시예 3 참조)를, 일정하게 잘 혼합하면서 72시간 동안 실온에서 반응 바셀에서 인큐베이션하였다. 72시간 후에, 사용한 에틸 세코디온(식 III)의 > 80%가 하이드록시 화합물로 환원되었다.

실시예 10

산화환원효소(서열번호 5)를 통한 에틸 세코디온(식 III)의 환원

에틸 세코디온(식 III)을 환원시키기 위해, 혼합물: 300 ㎕ 완충액(100 mM 트리에탄올아민, pH = 7, 2 mM MgCl₂), 1.2 ml 4-메틸-2-펜탄올, 0.12 mg NADP, 150 mg 에틸 세코디온(식 III) 및 0.6 ml의 효소 현탁 산화환원효소(서열번호 5)(실시예 3 참조)를, 일정하게 잘 혼합하면서 72시간 동안 실온에서 반응 바셀에서 인큐베이션하였다. 72시간 후에, 사용한 에틸 세코디온(식 III)의 > 90%가 하이드록시 화합물로 환원되었다.

SEQUENCE LISTING <110> IEP GmbH <120> Verfahren zur enantioselektiven enzymatischen Reduktion von Secodionderivaten <130> I 11005 <160> 42 <170> PatentIn version 3.3 <210> 1 <211> 252 <212> PRT <213> Chloroflexus auratiacus DSM 635 <400> 1 Met Glu Pro Pro Phe Ile Gly Lys Val Ala Leu Val Thr Gly Ala Ala 1 5 10 15 Ala Gly Ile Gly Arg Ala Ser Ala Leu Ala Phe Ala Arg Glu Gly Ala 20 25 30 Lys Val Val Val Ala Asp Val Asn Val Glu Gly Gly Glu Glu Thr Ile 35 40 45 Ala Leu Cys Arg Ala Leu Asn Thr Asp Ala Met Phe Val Arg Cys Asp 50 55 60 Val Ser Gln Arg Asp Glu Val Glu Arg Leu Ile Ala Leu Ala Val Asp 65 70 75 80 Thr Phe Gly Arg Ile Asp Phe Ala His Asn Asn Ala Gly Ile Glu Gly 85 90 95 Val Gln Ala Met Leu Ala Asp Tyr Pro Glu Glu Val Trp Asp Arg Val 100 105 110 Ile Glu Ile Asn Leu Lys Gly Val Trp Leu Cys Met Lys Tyr Glu Ile 115 120 125 Arg His Met Leu Lys Gln Gly Gly Gly Ala Ile Val Asn Thr Ser Ser 130 135 140 Val Ala Gly Leu Ala Gly Ser Arg Gly Val Ser Ala Tyr Val Ala Ser 145 150 155 160 Lys His Gly Ile Val Gly Ile Thr Lys Ala Ala Ala Leu Glu Tyr Ala 165 170 175 Arg Asn Gly Ile Arg Val Asn Ala Ile Cys Pro Gly Thr Ile His Thr 180 185 190 Ala Met Ile Asp Arg Phe Thr Gln Gly Asp Pro Gln Leu Leu Ala Gln 195 200 205 Phe Ala Glu Gly Glu Pro Ile Gly Arg Leu Gly Ser Pro Glu Glu Val 210 215 220 Ala Asn Ala Val Ile Trp Leu Cys Ser Asp Lys Ala Ser Phe Val Thr 225 230 235 240 Gly Ala Thr Leu Ala Val Asp Gly Gly Arg Leu Ala 245 250 <210> 2 <211> 249 <212> PRT <213> Rubrobacter xylanophilus DSM 9941 <400> 2 Met Leu Glu Gly Lys Val Ala Val Ile Thr Gly Ala Gly Ser Gly Ile 1 5 10 15 Gly Arg Ala Thr Ala Leu Lys Phe Ala Arg Glu Gly Ala Arg Val Val 20 25 30 Ala Ala Glu Leu Asp Glu Arg Gly Gly Glu Gly Val Val Arg Glu Val 35 40 45 Arg Ser Leu Gly Gly Glu Ala Val Phe Val Arg Thr Asp Val Ser Glu 50 55 60 Phe Ala Gln Val Glu Asp Ala Val Glu Arg Ala Val Gly Glu Tyr Gly 65 70 75 80 Thr Leu Asp Val Met Phe Asn Asn Ala Gly Ile Gly His Tyr Ala Pro 85 90 95 Leu Leu Glu His Glu Pro Glu His Tyr Asp Arg Val Val Arg Val Asn 100 105 110 Gln Tyr Gly Val Tyr Tyr Gly Ile Leu Ala Ala Gly Arg Lys Met Val 115 120 125 Ala Leu Lys Asn Pro Gly Leu Ile Ile Asn Thr Ala Ser Val Tyr Ala 130 135 140 Phe Leu Ala Ser Pro Gly Val Ile Gly Tyr His Ala Ala Lys Gly Ala 145 150 155 160 Val Lys Met Met Thr Gln Ala Ala Ala Leu Glu Leu Ala Pro His Gly 165 170 175 Ile Arg Val Val Ala Ile Ala Pro Gly Gly Val Asp Thr Pro Ile Ile 180 185 190 Gln Gly Tyr Lys Asp Met Gly Leu Gly Glu Arg Leu Ala Arg Gly Gln 195 200 205 Met Arg Arg Arg Leu Gln Thr Pro Glu Gln Ile Ala Gly Ala Val Ala 210 215 220 Leu Leu Ala Thr Asp Glu Ala Asp Ala Ile Asn Gly Ser Val Val Met 225 230 235 240 Thr Asp Asp Gly Tyr Ala Glu Phe Lys 245 <210> 3 <211> 243 <212> PRT <213> Candida magnoliae CBS 6396 <400> 3 Met Ser Ala Thr Ser Asn Ala Leu Ile Thr Gly Ala Ser Arg Gly Met 1 5 10 15 Gly Glu Ala Thr Ala Ile Lys Leu Ala Leu Glu Gly Tyr Ser Val Thr 20 25 30 Leu Ala Ser Arg Gly Ile Glu Gln Leu Asn Ala Ile Lys Glu Lys Leu 35 40 45 Pro Ile Val Lys Lys Gly Gln Gln His Tyr Val Trp Gln Leu Asp Leu 50 55 60 Ser Asp Ile Glu Ala Ala Ser Thr Phe Lys Gly Ala Pro Leu Pro Ala 65 70 75 80 Ser Ser Tyr Asp Val Phe Phe Ser Asn Ala Gly Val Val Asp Phe Ala 85 90 95 Pro Phe Ala Asp Gln Ser Glu Thr Ala Gln Lys Asp Leu Phe Thr Val 100 105 110 Asn Leu Leu Ser Pro Val Ala Leu Thr Lys Thr Ile Val Lys Ala Ile 115 120 125 Ala Asp Lys Pro Arg Glu Thr Pro Ala His Ile Ile Phe Thr Ser Ser 130 135 140 Ile Val Gly Ile Arg Gly Val Pro Asn Val Ala Val Tyr Ser Ala Thr 145 150 155 160 Lys Gly Ala Ile Asp Ser Phe Ala Arg Ser Leu Ala Arg Glu Phe Gly 165 170 175 Pro Lys Asn Ile His Val Asn Cys Val Asn Pro Gly Thr Thr Arg Thr 180 185 190 Glu Met Thr Lys Gly Val Asp Leu Ala Ala Phe Gly Asp Val Pro Ile 195 200 205 Lys Gly Trp Ile Glu Val Asp Ala Ile Ala Asp Ala Val Leu Phe Leu 210 215 220 Ile Lys Ser Lys Asn Ile Thr Gly Gln Ser Leu Val Val Asp Asn Gly 225 230 235 240 Phe Gly Val <210> 4 <211> 241 <212> PRT <213> Candida magnoliae DSM 70638 <400> 4 Met Thr Ser Thr Pro Asn Ala Leu Ile Thr Gly Gly Ser Arg Gly Ile 1 5 10 15 Gly Ala Ser Ala Ala Ile Lys Leu Ala Gln Glu Gly Tyr Ser Val Thr 20 25 30 Leu Ala Ser Arg Asp Leu Glu Lys Leu Thr Glu Val Lys Asp Lys Leu 35 40 45 Pro Ile Val Arg Gly Gly Gln Lys His Tyr Val Trp Gln Leu Asp Leu 50 55 60 Ala Asp Val Glu Ala Ala Ser Ser Phe Lys Ala Ala Pro Leu Pro Ala 65 70 75 80 Ser Ser Tyr Asp Leu Phe Val Ser Asn Ala Gly Ile Ala Gln Phe Ser 85 90 95 Pro Thr Ala Glu His Thr Asn Ser Glu Trp Leu Asn Ile Met Thr Ile 100 105 110 Asn Leu Val Ser Pro Ile Ala Leu Thr Lys Ala Leu Leu Gln Ala Val 115 120 125 Ser Gly Arg Ser Ser Glu Asn Pro Phe Gln Ile Val Phe Ile Ser Ser 130 135 140 Val Ala Ala Leu Arg Gly Val Ala Gln Thr Ala Val Tyr Ser Ala Ser 145 150 155 160 Lys Ala Gly Thr Asp Gly Phe Ala Arg Ser Leu Ala Arg Glu Leu Gly 165 170 175 Pro Gln Gly Val His Val Asn Val Val Asn Pro Gly Trp Thr Lys Thr 180 185 190 Asp Met Thr Glu Gly Val Glu Thr Pro Lys Asp Met Pro Ile Lys Gly 195 200 205 Trp Ile Gln Pro Glu Ala Ile Ala Asp Ala Val Val Phe Leu Ala Arg 210 215 220 Ser Lys Asn Ile Thr Gly Ala Asn Ile Val Val Asp Asn Gly Phe Ser 225 230 235 240 Thr <210> 5 <211> 241 <212> PRT <213> Candida magnoliae DSM 70638 <400> 5 Met Thr Thr Thr Ser Asn Ala Leu Val Thr Gly Gly Ser Arg Gly Ile 1 5 10 15 Gly Ala Ala Ser Ala Ile Lys Leu Ala Gln Glu Gly Tyr Asn Val Thr 20 25 30 Leu Ala Ser Arg Ser Val Asp Lys Leu Asn Glu Val Lys Ala Lys Leu 35 40 45 Pro Ile Val Gln Asp Gly Gln Lys His Tyr Ile Trp Glu Leu Asp Leu 50 55 60 Ala Asp Val Glu Ala Ala Ser Ser Phe Lys Gly Ala Pro Leu Pro Ala 65 70 75 80 Arg Ser Tyr Asp Val Phe Val Ser Asn Ala Gly Val Ala Ala Phe Ser 85 90 95 Pro Thr Ala Asp His Asp Asp Lys Glu Trp Gln Asn Leu Leu Ala Val 100 105 110 Asn Leu Ser Ser Pro Ile Ala Leu Thr Lys Ala Leu Leu Lys Asp Val 115 120 125 Ser Glu Arg Pro Val Asp Lys Pro Leu Gln Ile Ile Tyr Ile Ser Ser 130 135 140 Val Ala Gly Leu His Gly Ala Ala Gln Val Ala Val Tyr Ser Ala Ser 145 150 155 160 Lys Ala Gly Leu Asp Gly Phe Met Arg Ser Val Ala Arg Glu Val Gly 165 170 175 Pro Lys Gly Ile His Val Asn Ser Ile Asn Pro Gly Tyr Thr Lys Thr 180 185 190 Glu Met Thr Ala Gly Ile Glu Ala Leu Pro Asp Leu Pro Ile Lys Gly 195 200 205 Trp Ile Glu Pro Glu Ala Ile Ala Asp Ala Val Leu Phe Leu Ala Lys 210 215 220 Ser Lys Asn Ile Thr Gly Thr Asn Ile Val Val Asp Asn Gly Leu Ile 225 230 235 240 Ala <210> 6 <211> 759 <212> DNA <213> Chloroflexus aurantiacus DSM 635 <400> 6 atggagccac ctttcattgg gaaggttgcg ctggtcaccg gcgcagcagc cggtattggt 60 cgtgcttcag cactggcgtt tgcccgtgag ggtgccaagg ttgtcgttgc tgatgtgaat 120 gtcgagggcg gggaagagac gattgcgctg tgtcgggctt tgaataccga tgcaatgttc 180 gtgcgttgtg atgtttcgca acgcgatgaa gtggagcgat taattgctct ggcagttgac 240 acgttcggtc ggatcgactt tgcgcacaac aacgccggga ttgaaggcgt gcaggcaatg 300 ctggccgatt atcccgaaga ggtctgggat cgggtgatcg agatcaacct caaaggggtc 360 tggttgtgta tgaagtacga aatccggcac atgctcaagc agggtggcgg tgcgattgtg 420 aatacctcat cggtcgccgg tctggccgga tcacgtggcg tttcggcgta tgtagccagc 480 aagcacggta ttgttggtat taccaaagcg gcagcccttg agtatgcgcg taacggtatt 540 cgtgtcaacg caatctgtcc aggtacgatt catactgcga tgatcgaccg ctttacccag 600 ggtgatcccc aactgcttgc ccagttcgct gagggtgaac cgattggtcg gctcggctcg 660 cctgaagagg tcgccaatgc ggtgatctgg ctctgctcag ataaggcttc gtttgtgacc 720 ggagcgacac tggcggttga tggtggccgc ctggcgtaa 759 <210> 7 <211> 750 <212> DNA <213> Rubrobacter xylanophilus DSM 9941 <400> 7 atgctcgagg ggaaggtcgc ggtcatcacg ggggccggaa gcggcatagg ccgggccacc 60 gcgctcaagt tcgcccgcga gggggcccgg gtcgtcgccg ccgagctcga cgagcgcggc 120 ggggaggggg tggtccggga ggtgcgcagc ctcgggggcg aggcggtctt cgtccggacc 180 gacgtctcgg agttcgcgca ggtggaggac gccgtcgagc gggcggtcgg ggagtacggc 240 accctcgacg tgatgttcaa caacgccggc atcgggcact acgcccccct gctggagcac 300 gagcccgagc actacgaccg ggtggtccgg gtgaaccagt acggcgtcta ctacgggata 360 ctcgccgccg ggagaaagat ggtcgccctg aagaaccccg gcttgatcat caacaccgcc 420 tcggtctacg ccttcctcgc ctcgccgggg gtcatcggct accacgccgc caagggggcg 480 gtcaagatga tgacccaggc ggcggcgctg gagctcgccc cgcacggcat aagggtcgtc 540 gccatcgccc cgggcggggt ggacaccccc atcatccagg gctacaagga catggggctc 600 ggcgagaggc tggcccgcgg ccagatgcgc cgccggctcc agacccccga gcagatcgcc 660 ggggcggtcg ccctgctcgc caccgacgag gccgacgcca taaacggctc ggtggtcatg 720 accgacgacg gctacgcgga gttcaagtag 750 <210> 8 <211> 732 <212> DNA <213> Candida magnoliae CBS 6396 <400> 8 atgtctgcta cttcgaacgc tcttatcact ggtgccagcc gcggaatggg cgaggccaca 60 gctattaagc ttgcccttga ggggtacagc gtcacccttg catcacgcgg tattgagcag 120 ctcaatgcca tcaaggaaaa actacccatc gtgaagaagg gccagcagca ctacgtttgg 180 cagctcgatc ttagtgacat cgaggcggct tccaccttca agggggctcc tctgcctgcc 240 agcagctacg acgtgttctt cagcaacgcc ggtgtggtgg actttgctcc gttcgcagac 300 caaagcgaga ctgcgcaaaa ggacctgttc acggttaacc tgctgtcgcc tgttgcgttg 360 accaagacca ttgttaaggc catcgccgac aagccccgcg agacgcctgc tcacattatc 420 ttcacctcgt ccattgtcgg aattcgcggt gttcccaacg tggcggtcta cagcgccacc 480 aagggcgcga ttgacagctt tgcgcgctcg cttgctcgtg agttcggtcc caagaacatc 540 cacgttaact gcgtgaaccc gggcacgacg cgcaccgaga tgacaaaggg cgttgatctc 600 gcggctttcg gcgatgttcc tatcaagggc tggatcgagg tcgatgcgat tgccgacgct 660 gtgctgtttt tgatcaagtc caagaacatc actggccagt cgctcgttgt tgacaacgga 720 ttcggtgttt aa 732 <210> 9 <211> 726 <212> DNA <213> Candida magnoliae DSM 70638 <400> 9 atgacatcta cacctaatgc cctcatcacg ggaggcagcc gcggcattgg cgcttccgcc 60 gccatcaaac tggctcaaga agggtacagc gtcacgctgg cgtcccgcga ccttgagaaa 120 cttactgagg tcaaggacaa gctgccaatc gtgagaggtg gacagaaaca ctacgtttgg 180 cagctcgatc ttgccgatgt ggaggctgca tcgtctttca aggcggctcc tctgccggcc 240 agcagctacg atttgtttgt ttcgaacgcc ggaattgccc agttctcgcc tacggcagag 300 catactaata gtgagtggct gaacattatg accattaact tagtgtcccc gattgccctg 360 acgaaggctc ttttgcaggc cgtttctggg aggtcgagcg agaacccgtt tcagatcgtc 420 ttcatctcgt cggttgcagc actacgtggc gttgcacaaa cggccgtcta cagtgcgtcg 480 aaggctggta ctgatggatt cgcacgctca cttgctcgcg aactaggtcc tcaaggtgtt 540 catgtgaacg tggtgaaccc tggctggact aagacagaca tgacggaagg agtcgaaacc 600 ccaaaggaca tgcccattaa gggctggatc cagcctgagg caattgctga tgctgtagta 660 ttccttgcga ggtcgaaaaa cattaccggc gcgaatattg tagtggacaa tggtttctcg 720 acgtaa 726 <210> 10 <211> 726 <212> DNA <213> Candida magnoliae DSM 70638 <400> 10 atgacgacta cttcaaacgc gcttgtcact ggaggcagcc gcggcattgg cgctgcctcc 60 gccattaagc tggctcagga gggctacaat gttacgctgg cctctcgcag tgttgataaa 120 ctgaatgaag taaaggcgaa actcccaatt gtacaggacg ggcagaagca ctacatttgg 180 gaactcgatc tggctgatgt ggaagctgct tcgtcgttca agggtgctcc tttgcctgct 240 cgcagctacg acgtctttgt ttcgaacgcg ggcgtcgctg cgttctcgcc cacagccgac 300 cacgatgata aggagtggca gaacttgctt gccgtgaact tgtcgtcgcc cattgccctc 360 acgaaggccc tcttgaagga tgtctccgaa aggcctgtgg acaagccact gcagattatc 420 tacatttcgt cggtggccgg cttgcatggc gccgcgcagg tcgccgtgta cagtgcatct 480 aaggccggtc ttgatggttt tatgcgctcc gtcgcccgtg aggtgggccc gaagggcatc 540 catgtgaact ccatcaaccc cggatacacg aagactgaaa tgaccgcggg cattgaagcc 600 cttcctgatt tgcctatcaa ggggtggatc gagcccgagg caattgctga cgcggttctg 660 tttctggcaa agtccaagaa tatcaccggc acaaacattg tggtcgacaa tggcttgatt 720 gcttaa 726 <210> 11 <211> 38 <212> DNA <213> Synthetic construct <220> <221> misc_feature <222> (1)..(38) <400> 11 ggaattccat atgatggagc cacctttcat tgggaagg 38 <210> 12 <211> 34 <212> DNA <213> Synthetic construct <220> <221> misc_feature <222> (1)..(34) <400> 12 cccaagctta ttattacgcc aggcggccac catc 34 <210> 13 <211> 34 <212> DNA <213> synthetic construct <220> <221> misc_feature <222> (1)..(34) <400> 13 cccaagctta ttattacgcc aggcggccac catc 34 <210> 14 <211> 35 <212> DNA <213> synthetic construct <220> <221> misc_feature <222> (1)..(35) <400> 14 ggaattccat atgatgtctg ctacttcgaa cgctc 35 <210> 15 <211> 33 <212> DNA <213> synthetic construct <220> <221> misc_feature <222> (1)..(33) <400> 15 ccgctcgagt tattaaacac cgaatccgtt gtc 33 <210> 16 <211> 35 <212> DNA <213> synthetic construct <400> 16 cacatgcatg cagatgtctg ctacttcgaa cgctc 35 <210> 17 <211> 34 <212> DNA <213> synthetic construct <220> <221> misc_feature <222> (1)..(34) <400> 17 gcccgagctc ttattaaaca ccgaatccgt tgtc 34 <210> 18 <211> 12 <212> PRT <213> Synthetic construct <400> 18 Asn Ala Leu Val Thr Gly Ala Ser Arg Gly Ile Gly 1 5 10 <210> 19 <211> 12 <212> PRT <213> Synthetic construct <400> 19 Asn Ala Leu Val Thr Gly Gly Ser Arg Gly Ile Gly 1 5 10 <210> 20 <211> 12 <212> PRT <213> Synthetic construct <400> 20 Asn Ala Leu Ile Thr Gly Gly Ser Arg Gly Ile Gly 1 5 10 <210> 21 <211> 12 <212> PRT <213> Synthetic construct <400> 21 Asn Ala Leu Ile Thr Gly Ala Ser Arg Gly Ile Gly 1 5 10 <210> 22 <211> 12 <212> PRT <213> Synthetic construct <400> 22 Asn Ala Leu Ile Thr Gly Gly Ser Arg Gly Met Gly 1 5 10 <210> 23 <211> 12 <212> PRT <213> Synthetic construct <400> 23 His Ala Leu Val Thr Gly Ala Ser Arg Gly Ile Gly 1 5 10 <210> 24 <211> 7 <212> PRT <213> Synthetic construct <400> 24 Gly Tyr Ser Val Thr Leu Ala 1 5 <210> 25 <211> 7 <212> PRT <213> Synthetic construct <400> 25 Gly Tyr Asn Val Thr Leu Ala 1 5 <210> 26 <211> 7 <212> PRT <213> Synthetic construct <400> 26 Gly Tyr Ser Val Thr Leu Val 1 5 <210> 27 <211> 7 <212> PRT <213> Synthetic construct <400> 27 Gly Tyr Asn Val Thr Leu Val 1 5 <210> 28 <211> 8 <212> PRT <213> Synthetic construct <400> 28 Phe Lys Gly Ala Pro Leu Pro Ala 1 5 <210> 29 <211> 8 <212> PRT <213> Synthetic construct <400> 29 Phe Lys Ala Ala Pro Leu Pro Ala 1 5 <210> 30 <211> 6 <212> PRT <213> Synthetic construct <400> 30 Phe Val Ser Asn Ala Gly 1 5 <210> 31 <211> 6 <212> PRT <213> Synthetic construct <400> 31 Phe Phe Ser Asn Ala Gly 1 5 <210> 32 <211> 6 <212> PRT <213> Synthetic construct <400> 32 Phe Val Cys Asn Ala Gly 1 5 <210> 33 <211> 6 <212> PRT <213> Synthetic construct <400> 33 Phe Val Ala Asn Ala Gly 1 5 <210> 34 <211> 9 <212> PRT <213> Synthetic construct <400> 34 Ser Pro Ile Ala Leu Thr Lys Ala Leu 1 5 <210> 35 <211> 9 <212> PRT <213> Synthetic construct <400> 35 Ser Pro Val Ala Leu Thr Lys Thr Ile 1 5 <210> 36 <211> 9 <212> PRT <213> Synthetic construct <400> 36 Ser Pro Ile Ala Leu Thr Lys Thr Leu 1 5 <210> 37 <211> 9 <212> PRT <213> Synthetic construct <400> 37 Ser Pro Val Ala Met Thr Lys Ala Leu 1 5 <210> 38 <211> 9 <212> PRT <213> Synthetic construct <400> 38 Ser Gln Ile Ala Leu Thr Lys Ala Leu 1 5 <210> 39 <211> 7 <212> PRT <213> Synthetic construct <400> 39 Ala Val Tyr Ser Ala Ser Lys 1 5 <210> 40 <211> 7 <212> PRT <213> Synthetic construct <400> 40 Ala Val Tyr Ser Ala Thr Lys 1 5 <210> 41 <211> 6 <212> PRT <213> Synthetic construct <400> 41 Pro Ile Lys Gly Trp Ile 1 5 <210> 42 <211> 6 <212> PRT <213> Synthetic construct <400> 42 Pro Ile Ser Gly Trp Ile 1 5

Claims

산화환원효소 활성을 가지는 폴리펩타이드로서,
a) 서열번호 3의 아미노산 서열을 포함하거나,
b) 서열번호 8의 핵산 서열에 의해 코딩되거나, 또는
c) 엄격한 조건 하에서, 서열번호 8과 혼성화하는 핵산 서열에 의해 코딩되며, 상기 엄격한 조건은, 60 ℃ 0.7-1 M NaCl 용액 중에서 혼성화한 후 필터를 65 ℃에서 0.1X 내지 2X SSC 용액으로 세정하며, 1X SSC 용액은 150 mM NaCl 및 15 mM 소듐사이트레이트의 혼합물인 것을 특징으로 하는, 산화환원효소 활성을 가지는 폴리펩타이드.
제1항에 있어서, 서열번호 3의 아미노산 서열을 가지거나, 또는 서열번호 8의 핵산 서열에 의해 코딩되는 것을 특징으로 하는 폴리펩타이드.
제1항에 있어서, 칸디다 마그놀리애(Candida magnoliae) CBS 6396의 게놈으로부터 수득가능한 것을 특징으로 하는 폴리펩타이드.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 따른 폴리펩타이드를 사용하여 일반식 I로 표시되는 세코디온 유도체를 환원하는 방법:

상기 식 I에서,
R₁은 수소 또는 C₁-C₄ 알킬기이며,
R₂는 수소, C₁-C₈ 알킬기 또는 에스테르와 같은, 종래에 공지된 OH에 대한 보호기이며,
R₃는 수소, 메틸기 또는 할라이드이고,
구조 요소
는 벤젠환 또는 0, 1 또는 2개의 C-C 이중결합을 가진 C₆ 환이고,
이중 결합은 선택적으로 6/7 또는 7/8번 위치에 존재하며, 및
1, 2, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 11, 12 및 16번 위치의 탄소가 독립적으로 수소, C₁-C₄ 알킬기, 할라이드 또는 페닐기로 치환됨.