KR101347816B1

KR101347816B1 - 동규자 추출물 또는 이로부터 단리된 화합물을 포함하는 탈모방지 또는 발모촉진용 조성물

Info

Publication number: KR101347816B1
Application number: KR1020130026173A
Authority: KR
Inventors: 강상진; 이은영; 최은주; 김영호; 김정아; 이민호
Original assignee: 차의과학대학교 산학협력단
Priority date: 2013-03-12
Filing date: 2013-03-12
Publication date: 2014-01-07
Anticipated expiration: 2031-05-17
Also published as: KR20130041848A

Abstract

본 발명은 동규자(Malvae Fructus) 추출물을 유효성분으로 포함하는, 탈모방지 또는 발모촉진용 조성물을 제공한다. 또한, 본 발명은 동규자 추출물로부터 단리된 화합물 즉, β-시토스테롤; 3-O-(β-D-글루코피라노실)-β-시토스테롤; 3-O-[β-D-(6'-리놀레오일)글루코피라노실]-β-시토스테롤; 및 미리스톨레산으로 이루어진 군으로부터 1종 이상 선택된 화합물을 유효성분으로 포함하는, 탈모방지 또는 발모촉진용 조성물을 제공한다.

Description

동규자 추출물 또는 이로부터 단리된 화합물을 포함하는 탈모방지 또는 발모촉진용 조성물{Composition for preventing hair loss or promoting hair growth comprising Malvae Fructus extracts or compounds isolated therefrom}

본 발명은 동규자(Malvae Fructus) 추출물 및 상기 추출물로부터 단리된 화합물을 유효성분으로 포함하는, 탈모방지 또는 발모촉진용 조성물에 관한 것이다.

모발의 발생과 성장, 주기조절은 모낭 기저부의 중배엽 유래 조직인 모유두에 의해 조절을 받는다. 모유두는 모모세포(hair matrix cell)와 상호작용하고 이들 세포를 자극하여 모낭과 모발을 구성하는 여러 세포로 분화시키는 역할을 담당하고 있는 것으로 알려져 있다. 실제로 모유두 세포(dermal papilla cell)는 모발이 없는 표피로부터 새로운 모낭을 유도하는 능력이 있음이 다양한 문헌을 통해 보고된 바 있다.

모낭은 성장기(anagen phase)-퇴행기(categen phase)-휴지기(telogen phase)로 구성된 모발주기를 반복하게 되어 모발이 주기적으로 발생하고 빠지는 과정을 거친다. 이 과정은 중배엽-외배엽 세포 상호작용에 의해 조절되며, 모유두 세포가 조절기능의 핵심을 담당하고 있다. 중배엽(모유두) 세포는 발생기에는 모발의 생성을 유도하고, 이후 모발의 성장을 자극하는 물질을 분비한다. 모유두 세포의 변화에 따라 퇴행기가 시작되고, 모낭이 축퇴됨에 따라 모유두는 위로 이동하여 모발줄기세포가 있는 모발돌출부(bulge)의 바로 밑에 존재한다. 휴지기 중에 모유두 세포의 신호에 의해 모발줄기세포가 분열하여 새로운 모낭을 형성하는 성장기가 시작된다. 문헌에 따르면, 탈모증 환자의 경우 모유두의 크기와 부피가 정상인에 비해 현저히 줄어들어 있다. 모유두의 수는 모발 주기 중 성장기 기간에서 증가하며, 이것의 부피는 모유두를 구성하는 세포의 수에 의존적이다. 더구나 모구(hair bulb)의 상피조직의 부피와 분열능 역시 모유두의 부피에 비례한다.

휴지기에서 새로운 성장기가 시작될 때는 발생기와 유사한 신호들이 작용한다. 성장기 초기에 모유두 세포에 인접한 모발돌출부(bulge) 부분의 상피세포에서 WNT 단백질 신호가 매우 강해지고, Wnt/β-카테닌(Wnt/β-catenin) 신호 등이 중요하게 작용하는 것으로 보고되고 있다.

본 발명자들은 다양한 천연물로부터 모낭의 발생과 모발의 성장 및 주기 조절에 중요한 조절기능을 담당하는 모유두 세포의 Wnt/β-카테닌 신호 조절물질에 대하여 다양한 검색을 수행하였다. 그 결과, 동규자 추출물 및 이로부터 분리한 특정 화합물이 우수한 Wnt 리포터 활성화 활성을 나타낸다는 것을 발견하였으며, 또한 모유두 세포의 증식능(proliferation) 및 β-카테닌 인산화, 다양한 사이토카인의 증가를 유도한다는 것을 발견하였다.

따라서, 본 발명은 동규자 추출물 또는 동규자 추출물로부터 단리된 화합물을 유효성분으로 포함하는 탈모방지 또는 발모촉진용 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.

본 발명에 일 태양에 따라, 동규자(Malvae Fructus) 추출물을 유효성분으로 포함하는, 탈모방지 또는 발모촉진용 조성물이 제공된다.

상기 동규자 추출물은 동규자 씨의 분쇄물을 물, C₁∼C₄ 의 알코올, 및 물과 C₁∼C₄ 의 알코올의 혼합용매로 이루어진 군으로부터 선택된 추출용매, 바람직하게는 에탄올로 추출하는 단계를 포함하는 추출공정을 수행하여 얻어질 수 있다. 또한, 상기 동규자 추출물은 (a) 동규자 씨의 분쇄물을 물, C₁∼C₄ 의 알코올, 및 물과 C₁∼C₄ 의 알코올의 혼합용매로 이루어진 군으로부터 선택된 추출용매로 추출하는 단계; 및 (b) 단계(a)로부터 얻어진 추출물에 물 및 메틸렌 클로라이드를 가하여 추출하고, 메틸렌 클로라이드-가용성 분획물을 분리하는 단계를 포함하는 추출공정을 수행하여 얻어질 수 있다.

본 발명의 다른 태양에 따라, β-시토스테롤; 3-O-(β-D-글루코피라노실)-β-시토스테롤; 3-O-[β-D-(6'-리놀레오일)글루코피라노실]-β-시토스테롤; 및 미리스톨레산으로 이루어진 군으로부터 1종 이상 선택된 화합물, 바람직하게는 미리스톨레산을 유효성분으로 포함하는, 탈모방지 또는 발모촉진용 조성물이 제공된다.

본 발명에 의해 동규자 추출물 및 이로부터 분리한 특정 화합물 즉, β-시토스테롤; 3-O-(β-D-글루코피라노실)-β-시토스테롤; 3-O-[β-D-(6'-리놀레오일)글루코피라노실]-β-시토스테롤; 및 미리스톨레산으로 이루어진 군으로부터 1종 이상 선택된 화합물이 우수한 Wnt 리포터 활성화 활성을 나타낸다는 것이 밝혀졌으며, 모유두 세포의 증식능(proliferation) 및 β-카테닌 인산화, 다양한 사이토카인의 증가를 유도한다는 것이 밝혀졌다. 따라서, 동규자 추출물 및 이로부터 분리한 상기 화합물은 탈모방지 또는 발모촉진용 조성물에 유용하게 사용될 수 있다.

도 1a 및 도 1b는 각각 동규자로부터 분리된 3-O-(β-D-글루코피라노실)-β-시토스테롤의 ¹H-NMR 및 ¹³C-NMR 챠트를 나타낸다.
도 2a 및 도 2b는 각각 동규자로부터 분리된 β-시토스테롤의 ¹H-NMR 및 ¹³C-NMR 챠트를 나타낸다.
도 3a 및 도 3b는 각각 동규자로부터 분리된 3-O-[β-D-(6'-리놀레오일)글루코피라노실]-β-시토스테롤의 ¹H-NMR 및 ¹³C-NMR 챠트를 나타낸다.
도 4a 및 도 4b는 각각 동규자로부터 분리된 미리스톨레산의 ¹H-NMR 및 ¹³C-NMR 챠트를 나타낸다.
도 5a는 동규자 추출물의 농도별 처리에 따른 Wnt 리포터 시스템의 활성을 측정한 결과이고, 도 5b 및 도 5c는 동규자 추출물을 처리하였을 때 Wnt 경로의 활성화를 평가한 결과로서, β-카테닌의 인산화를 웨스턴 블롯팅을 통하여 분석한 결과(도 5b) 및 세포내 축적된 β-카테닌의 양을 웨스턴 블롯팅을 통하여 측정한 결과(도 5c)이다.
도 6a는 동규자의 메틸렌 클로라이드-가용성 분획물 및 이로부터 얻어진 화합물의 농도별 처리에 따른 Wnt 리포터 시스템의 활성을 측정한 결과이다. 도 6b는 동규자로부터 얻어진 미리스톨레산을 처리하였을 때 Wnt5a 및 β-카테닌의 발현량을 웨스턴 블롯팅을 통하여 측정한 결과이다.
도 7a 및 도 7b는 동규자로부터 얻어진 미리스톨레산을 모유두 세포에 처리한 후 Wnt 경로와 관련한 인자들의 발현을 분석한 결과로서, 각각 세포증식에 관여되는 신호경로를 분석한 결과(도 7a) 및 모발 성장에 효과 있는 사이토카인들의 발현을 분석한 결과(도 7b)이다.

본 발명은 동규자(Malvae Fructus) 추출물을 유효성분으로 포함하는, 탈모방지 또는 발모촉진용 조성물을 제공한다.

동규자는 아욱(Malva verticillata)의 씨를 말하며, 구부러진 콩팥 모양으로 바깥 면은 회갈색이고 방사형의 융기가 있다. 잘라보면 가장자리는 회황색이고 배아는 백색이며 떡잎은 2개로 황색이고 질은 무르다. 활규자(滑葵子), 규채자(葵菜子) 등으로 불리기도 하는 동규자는 이뇨작용이 있어 임질, 혈뇨, 임신 중 소변을 못보고 붓는 증상, 유즙분비 부족, 유방염, 노인이나 허한 사람들의 장조변비에 유용하다고 알려져 있다. 약리작용으로는 장관의 연동운동 촉진이 보고된 바 있다.

상기 동규자 추출물은 동규자 씨의 분쇄물을 물, C₁∼C₄ 의 알코올, 및 물과 C₁∼C₄ 의 알코올의 혼합용매로 이루어진 군으로부터 선택된 추출용매, 바람직하게는 에탄올로 추출하는 단계를 포함하는 추출공정을 수행하여 얻어질 수 있다. 상기 동규자 씨의 분쇄물은 통상의 방법으로 동규자 씨를 분쇄하여 얻어진 분말화함으로써 얻어질 수 있다. 또한, 상기 추출용매는 동규자 씨의 분쇄물 1 kg에 대하여 1,500 ∼ 2,000 mL의 비율로 사용될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 또한, 상기 추출은 통상의 방법, 예를 들어 5∼10 시간 동안 초음파 처리함으로써 수행될 수 있으며, 1회 또는 복수회(예를 들어, 3회) 수행할 수 있다. 얻어진 추출액은 감압건조, 열풍건조, 동결건조 등의 통상의 방법에 따라 건조함으로써, 오일 형태(즉, 유상 형태) 혹은 고체 형태로 제조할 수 있다.

상기 동규자 추출물은 또한 추가의 분획화 단계를 수행하여 얻어진 분획물일 수 있다. 일 구현예에서, 상기 동규자 추출물은 (a) 동규자 씨의 분쇄물을 물, C₁∼C₄ 의 알코올, 및 물과 C₁∼C₄ 의 알코올의 혼합용매로 이루어진 군으로부터 선택된 추출용매, 바람직하게는 에탄올로 추출하는 단계; 및 (b) 단계(a)로부터 얻어진 추출물에 물 및 메틸렌 클로라이드를 가하여 추출하고, 메틸렌 클로라이드-가용성 분획물을 분리하는 단계를 포함하는 추출공정을 수행하여 얻어질 수 있다.

상기 단계(a)는 상기에서 설명한 바에 따라 수행될 수 있다.

상기 단계(b)는 단계(a)로부터 얻어진 추출물, 바람직하게는 에탄올 추출물을 물에 현탁한 후, 메틸렌 클로라이드를 가하여 추출하고, 메틸렌 클로라이드-가용성 분획물을 분리함으로써 수행될 수 있다. 물 및 메틸렌 클로라이드의 사용량은 단계(a)로부터 얻어진 추출물 1 g에 대하여 각각 10∼100 mL의 비율로 사용될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 단계(b)의 추출은 통상의 방법, 예를 들어 5∼10 시간 동안 초음파 처리함으로써 수행될 수 있다. 얻어진 추출액은 감압농축, 열풍건조, 동결건조 등의 통상의 방법에 따라 건조함으로써, 오일 형태(즉, 유상 형태) 혹은 고체 형태로 제조할 수 있다.

본 발명은 상기 동규자 추출물로부터 단리된 특정 화합물을 유효성분으로 포함하는, 탈모방지 또는 발모촉진용 조성물을 포함한다. 즉, 본 발명은 β-시토스테롤; 3-O-(β-D-글루코피라노실)-β-시토스테롤; 3-O-[β-D-(6'-리놀레오일)글루코피라노실]-β-시토스테롤; 및 미리스톨레산으로 이루어진 군으로부터 1종 이상 선택된 화합물을 유효성분으로 포함하는, 탈모방지 또는 발모촉진용 조성물을 포함한다.

특히 바람직하게는 상기 화합물 중 미리스톨레산(myristoleic acid)을 유효성분으로 포함할 수 있다.

본 발명의 조성물은 약학 조성물 및/또는 화장료 조성물 형태로 제제화될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 조성물은 상기 동규자 추출물 및 이로부터 단리된 특정 화합물(즉, β-시토스테롤; 3-O-(β-D-글루코피라노실)-β-시토스테롤; 3-O-[β-D-(6'-리놀레오일)글루코피라노실]-β-시토스테롤; 및 미리스톨레산으로 이루어진 군으로부터 1종 이상 선택된 화합물)을 유효성분으로 포함하는, 탈모방지 또는 발모촉진용 약학 조성물 형태일 수 있다. 또한, 본 발명의 조성물은 상기 동규자 추출물 및 이로부터 단리된 특정 화합물을 포함하는, 탈모방지 또는 발모촉진용 화장료 조성물 형태일 수 있다.

상기 약학 조성물에 있어서, 상기 조성물은 약학적으로 허용가능한 담체를 포함할 수 있으며, 통상의 방법에 따라 액제, 현탁액, 에멀젼, 로오숀제, 연고제, 동결건조제 등의 비경구용 제형으로 제제화될 수 있다. 바람직하게는 외용액제, 에멀젼, 연고제 등의 경피투여용 제형으로 제제화될 수 있다. 상기 약학적으로 허용가능한 담체는 인산 완충 식염수(phosphate buffered saline), 정제수, 멸균수 등의 수성 희석제 혹은 용제를 포함하며, 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일등의 비수성 희석제 혹은 용제를 포함한다. 또한, 필요에 따라 습윤제, 방향제, 보존제 등을 포함할 수 있다. 상기 약학 조성물에 함유되는 상기 동규자 추출물 및 이로부터 단리된 특정 화합물은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 기간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 예를 들면, 상기 동규자 추출물 및 이로부터 단리된 특정 화합물은 1일 0.01 내지 1000 mg/kg으로, 바람직하게는 0.1 내지 100 mg/kg의 용량으로 투여할 수 있으며, 상기 투여는 하루에 한번 또는 수회 나누어 투여할 수도 있다.

상기 화장료 조성물에 있어서, 상기 조성물은 상기 동규자 추출물 및 이로부터 단리된 특정 화합물을 유효성분으로 포함하는 기능성 화장료 조성물 형태일 수 있다. 상기 화장료 조성물은 상기 동규자 추출물 및 이로부터 단리된 특정 화합물을 사용하여 통상의 화장료 제조방법에 따라, 다양한 형태로 제조될 수 있다. 예를 들어, 상기 화장료 조성물은 상기 동규자 추출물 및 이로부터 단리된 특정 화합물을 함유하는 향장 제품, 샴푸, 헤어로션, 헤어크림, 헤어 젤, 두피 에센스 등의 형태로 제조될 수 있으며, 이는 통상의 클렌징액, 수렴액 및 보습액으로 희석하여 사용될 수 있다. 또한, 상기 화장료 조성물은 화장료 조성물 분야에서 통상적으로 사용되는 안정화제, 용해화제, 비타민, 안료, 및 향료와 같은 통상적인 보조제를 포함할 수 있다. 상기 화장료 조성물에 있어서, 상기 동규자 추출물 및 이로부터 단리된 특정 화합물의 함량(또는 예를 들어, 상기 약학 조성물의 투여량에 해당하는 동규자 추출물 및 이로부터 단리된 특정 화합물)은 탈모방지 또는 발모촉진 효과를 달성하기에 유효한 양, 예를 들면 조성물 총 중량에 대하여 0.001 ∼ 50 중량%의 함량으로 함유될 수 있고, 바람직하게는 약 0.01 ∼ 1 중량%의 함량으로 함유될 수 있다.

이하, 본 발명을 실시예 및 시험예를 통하여 더욱 상세히 설명한다. 그러나 이들 실시예 및 시험예는 본 발명을 예시하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예 및 시험예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. 동규자 추출물의 제조

동규자(Malva verticillata) 씨를 분쇄하여 얻어진 분말 2.3 kg을 에탄올 4,000 mL에 넣고, 6시간 동안 초음파 처리하여 추출하였다(1차 추출). 추출액을 여과하여 여액을 얻은 다음, 남아있는 고형물을 다시 에탄올 4,000 mL을 사용하여 동일한 방법으로 2회 더 추출하였다 (2차 및 3차 추출). 각각의 추출액을 모두 합하고, 감압하에서 건조하여 53 g의 갈색 유상의 추출물(에탄올-추출물)을 얻었다.

상기 에탄올 추출물에 물 500 ml을 가하여 현탁한 후, 메틸렌 클로라이드 500 ml를 가하여 추출한 후, 메틸렌 클로라이드 층을 분리하고, 감압하에서 건조하여 메틸렌 클로라이드-가용성 분획물 27 g을 얻었다.

실시예 2. 동규자 추출물로부터 활성 화합물의 분리

실시에 1에서 얻어진 메틸렌 클로라이드-가용성 분획물을 실리카 겔 컬럼크로마토그래피를 사용하여 10개의 분획물을 수득하였다. 즉, n-헥산 : 에틸 아세테이트 : 메탄올 : H₂O 의 혼합용매의 농도 구배(기울기 9.5:0.5:0:0, 9:1:0:0, 4:1:0:0, 1:1:0:0, 0:1:0:0, 0:9:1:0, 0:4:1:0, 0:1:1:0, 0:0:1:0, 0:0:9.5:0.5 v/v)를 사용하여 10 개의 분획 F1∼F10 을 수득하였다.

분획 F7 (0.9 g)를 차가운 메탄올 중에서 재결정하여 백색의 화합물 350.0 mg을 얻었으며, 이를 ¹H-NMR 및 ¹³C-NMR로 구조분석을 수행한 결과, 3-O-(β-D-글루코피라노실)-β-시토스테롤[3-O-(β-D-glucopyranosyl)-β-sitosterol]임을 확인하였다 (도 1a 및 도 1b 참조).

분획 F4 (2.6 g)를 용리액으로서 n-헥산 : 에틸 아세테이트의 혼합용매(9.5:0.5 v/v)를 사용하여 실리카겔 컬럼크로마토그래피로 용리시켜 백색의 화합물 200 mg을 얻었으며, 이를 ¹H-NMR 및 ¹³C-NMR로 구조분석을 수행한 결과, β-시토스테롤[β-sitosterol]임을 확인하였다 (도 2a 및 도 2b 참조).

분획 F5 (0.8 g) 및 F6 (0.6 g)을 합하여 용리액으로서 CH₂Cl₂ : 메탄올의 혼합용매(9.6:0.4 v/v)를 사용하여 실리카겔 컬럼크로마토그래피로 용리시켜 4개의 분획 F5A∼F5D를 수득하였다. F5B (494.5 mg)를 용리액으로서 n-헥산 : 에틸 아세테이트의 혼합용매(1:1, v/v)를 사용하여 실리카겔 컬럼크로마토그래피로 추가로 정제하여 백색의 화합물 40.0 mg을 얻었으며, 이를 ¹H-NMR 및 ¹³C-NMR로 구조분석을 수행한 결과, 3-O-[β-D-(6'-리놀레오일)글루코피라노실]-β-시토스테롤[3-O-[β-D-(6'-linoleoyl)glucopyranosyl]-β-sitosterol]임을 확인하였다 (도 3a 및 도 3b 참조).

분획 F9 (1.6 g)를 용리액으로서 CHCl₃:MeOH:H₂O의 혼합용매(7:3:0.3, v/v)를 사용하여 실리카겔 컬럼크로마토그래피로 용리시켜 밝은 갈색의 화합물 220 mg을 얻었으며, 이를 ¹H-NMR 및 ¹³C-NMR로 구조분석을 수행한 결과, 미리스톨레산[myristoleic acid]임을 확인하였다 (도 4a 및 도 4b 참조).

시험예

인간 모유두 세포(Human dermal papilla cell)는 Promocell GmbH (Heidelberg, Germany)에서 구입하여 사용하였다. 세포는 동일회사의 Follicle dermal papilla cell growth medium (이하, 달리 표기하지 않는한 '배지'라 칭한다)에서 배양하였으며, 부착된 세포들이 80% 합류(confluence) 때까지 유지하여 계대 배양하였다.

시험예 1. Wnt 리포터 시스템( 루시퍼라아제 ) 활성 평가

공지의 방법(Chang Deok Kim, Min-Ho Lee, Seok-Seon Roh Identification of androgen-regulated genes in SV40-transformed human hair dermal papilla cells. Journal of Dermatological Science (2003) 32, 143-149)에 따라 β-카테닌(β-catenin)과 TCF 전사조절인자가 붙게 되는 DNA 염기서열부위의 뒷부분에 루시퍼라아제를 유합시킨 리포터 유전자를 제조하고, 이를 아데노바이러스의 게놈에 삽입한 후, 숙주세포(인간 모유두 세포)에 형질도입하여 재조합 아데노바이러스를 제조하였다.

80-90% 성장한 인간 모두유 세포에 위에서 제조한 아데노바이러스를 감염시켜 하루 동안 배양한 후, 24-웰 세포배양용기에서 계대배양하였다. 계대배양 18시간 후, 배양액을 제거하고 혈청을 포함하지 않은 배지로 희석한 동규자 추출물(실시예 1에서 제조한 동규자의 에탄올 추출물, 10 ㎍/ml 및 50 ㎍/ml)을 가하고 24시간 동안 추가 배양하였다. 대조군의 경우 혈청을 포함하지 않은 배지를 가하고 24시간 동안 추가 배양하였다. 각각의 세포배양용기에서 배지를 제거하고, 루시퍼라아제 분석키트(Promega, 미국)를 이용하여 세포를 용해시키고 기질과 반응시킨 후, 루미노메터(luminometer)를 이용하여 루시퍼라아제 활성을 측정하였으며, 그 결과는 도 5a와 같다. 도 5a에서 알 수 있는 바와 같이, 대조군을 기준으로 하였을 때 동규자 추출물은 용량 의존적으로 루시퍼라아제 활성을 증가시켰다.

시험예 2. 모유두 세포에서 동규자 추출물의 Wnt 경로 활성 평가

모유두 세포를 혈청이 제거된 배지에 5X10⁵개의 세포로 100π 배양접시에 접종하여 하루 동안 안정화시킨 후, β-카테닌의 인산화 분석을 위하여 실시예 1에서 제조한 동규자의 에탄올 추출물 50 ㎍/ml를 처리하고 10분, 30분, 및 60 분 후에 분석을 수행하였다. 또한, 전체 β-카테닌의 발현 분석을 위하여, 실시예 1에서 제조한 동규자의 에탄올 추출물 50 ㎍/ml 처리 후 24시간 후에 전체 β-카테닌의 발현을 분석하였다. 각각의 세포를 모아 PRO-PREP protein extraction solution(iNtRON Biotech., Gyeinggi, Korea)을 넣고 얼음에 놓은 채로 20분간 용해시키고 원심분리하고 상층액을 얻었다. 각각의 상층액(용해물)에서 단백질(각각 약 35 ㎍)을 10% SDS-PAGE 겔에 전개하고, 0.2 ㎛ 포어의 PVDF 막에 전이하여 웨스턴 블롯팅을 수행하였다. 분석에 사용한 일차 항체는 항-포스포-β-카테닌(Cell signaling Technology, 미국), 항-β-카테닌(Santacruze, 미국), 항-β-액틴(AbFrontier, 한국)을 사용하였다.

β-카테닌의 Ser675번 인산화는 β-카테닌이 활성화되어 핵으로 전이되고 그 하위 경로가 작동되도록 하는 인산화 자리이다. 동규자 50 ㎍/ml을 모유두 세포에 처리하였을 때, Ser675번에 인산화가 30분 처리시에 증가하였다(도 5b참조). 또한 이 자리에 인산화가 되면 유비퀴티네이션(ubiquitination)에 의한 분해로부터 안전하게 되어 세포 내에 그 양이 축적되게 되는데, 도 5c로부터 그 정도의 증가를 확인할 수 있다.

시험예 3. 동규자로부터 단리된 분획물 및 화합물의 Wnt 리포터 시스템( 루시퍼라아제 ) 활성 평가

실시예 1에서 얻어진 메틸렌 클로라이드-가용성 분획물 및 실시예 2에서 얻어진 화합물을 각각 10 ㎍/ml, 50 ㎍/ml, 및 100 ㎍/ml로 처리하여, 시험예 1과 동일한 방법으로 루시퍼라아제 활성을 측정하였으며, 그 결과는 도 6a와 같다. 도 6a에서 알 수 있는 바와 같이, 대조군을 기준으로 하였을 때 동규자 추출물 및 이로부터 얻어진 화합물은 모두 용량 의존적으로 루시퍼라아제 활성을 증가시켰으며, 특히 미리스톨레산은 다른 화합물에 비하여 약 3배의 활성 증가를 유도하였다.

시험예 4. 미리스톨레산의 Wnt 경로 활성 평가

실시예 2에서 얻어진 미리스톨레산을 20 ㎍/ml 및 50 ㎍/ml로 처리하여, 시험예 2와 동일한 방법으로 Wnt5a 및 β-카테닌의 발현량을 웨스턴 블롯팅을 통하여 측정하였다. 도 6b의 결과에서 알 수 있는 바와 같이, Wnt5a의 단백질 수준이 미리스톨레산을 20 ㎍/ml로 처리하였을 때 약간씩 증가하였으며, β-카테닌 Ser675번의 인산화 역시 미리스톨레산 처리에 의하여 증가하였다.

시험예 5. 미리스톨레산의 모유두 세포의 Wnt 경로와 관련한 인자들의 발현 평가

모유두 세포를 혈청이 제거된 배지에 5X10⁵ 개씩 100π 배양접시에 접종하여 하루 동안 안정화시킨 후, 실시예 2에서 얻어진 미리스톨레산을 β-카테닌 분석을 위해서 10 ㎍/ml, 25 ㎍/ml 및 50 ㎍/ml로 24시간 동안, 다른 인자의 분석을 위해서 30분 동안 처리한 후, 단백질 분석을 위한 시료를 준비하였다. 또한, 실시예 2에서 얻어진 미리스톨레산을 10 ㎍/ml, 25 ㎍/ml 및 50 ㎍/ml로 처리한 후 6 시간 동안 배양하여 RNA 분석을 위한 시료를 준비하였다. 이후, 단백질 분석을 위한 시료는 시험예 2와 동일한 방법으로 Wnt 경로와 관련한 인자들의 발현을 측정하였으며, 분석에 사용한 일차 항체는 항-포스포-p-38(Cell signaling, 미국), 항-p-38(Santacruze, 미국), 항-포스포-ERK(Santacruze, 미국), 항-ERK(Santacruze, 미국), 항-포스포-CREB(Cell signaling, 미국), 항-CREB(Cell signaling, 미국), 항-포스포-Akt(Cell signaling, 미국), 항-Akt(Cell signaling, 미국)을 사용하였다. 미리스톨레산 10 ㎍/ml, 25 ㎍/ml 및 50 ㎍/ml로 처리한 후 6시간 동안 배양하여 얻은 세포로부터 Easy-spin total extraction kit((iNtRON Biotech., Gyeinggi, Korea)를 사용하여 RNA를 분리한 후, 2 ㎍의 RNA로 cDNA를 합성하여 PCR 분석을 위한 주형으로 1 ㎕씩 사용하였다. 그 결과는 도 7a 및 도 7b와 같다.

도 7a는 미리스톨레산을 모유두 세포에 처리한 후 세포증식에 관여되는 신호경로를 분석한 결과로서, p-38, ERK, CREB, Akt의 인산화가 미리스톨레산에 의해 농도 의존적으로 증가하는 것을 확인할 수 있다. 또한, 도 7b에서 알 수 있는 바와 같이, 미리스톨레산은 농도 의존적으로 모발 성장에 효과 있는 사이토카인들인 IGF-1, KGF, VEGF, HGF의 발현 증가를 유도하였다.

Claims

3-O-(β-D-글루코피라노실)-β-시토스테롤; 또는 3-O-[β-D-(6'-리놀레오일)글루코피라노실]-β-시토스테롤을 유효성분으로 포함하는, 탈모방지 또는 발모촉진용 조성물.