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KR101306748B1 - 성장인자 전달속도 조절이 가능한 히알루론산-인산칼슘 복합체 및 그 제조방법 - Google Patents

성장인자 전달속도 조절이 가능한 히알루론산-인산칼슘 복합체 및 그 제조방법 Download PDF

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KR101306748B1
KR101306748B1 KR1020120032121A KR20120032121A KR101306748B1 KR 101306748 B1 KR101306748 B1 KR 101306748B1 KR 1020120032121 A KR1020120032121 A KR 1020120032121A KR 20120032121 A KR20120032121 A KR 20120032121A KR 101306748 B1 KR101306748 B1 KR 101306748B1
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김정주
정수현
유현승
서준혁
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주식회사 바이오알파
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Abstract

본 발명은 골 재생 관련 성장인자의 전달속도를 임의로 조절하는 것이 가능하여 특히 치과용이나 정형외과용 골 충진재에 응용 가능한 골조직 재생용 성장인자의 전달체에 관한 것이다.
본 발명에서 성장인자의 전달속도를 조절하는 전달체는 상호 연결된 기공 분포를 이루는 히알루론산 하이드로겔과 상기 히알루론산 하이드로겔의 기공 사이에 분포되어 있는 인산칼슘 마이크로스피어로 구성된다. 성장인자의 전달에 부합하는 기공도를 갖는 인산칼슘 마이크로스피어는 가교결합된 히알루론산 하이드로겔의 공극에 들어가서 자리하게 되면서 전달체가 구성된다.

Description

성장인자 전달속도 조절이 가능한 히알루론산-인산칼슘 복합체 및 그 제조방법 {Tunable Hyaluronic acid-Calcium Phosphate Complexes with Delivery Rate of Growth Factors and Preparation Method Thereof}
본 발명은 성장인자 전달속도 조절이 가능한 히알루론산-인산칼슘 복합체 및 그 제조방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는, 골 재생 관련 성장인자의 전달속도를 임의로 조절하는 것이 가능하여 특히, 치과용이나 정형외과용 골 충진제에 응용 가능한 골 조직 재생용 성장인자의 전달체 역할을 하는 히알루론산-인산칼슘 복합체 및 그 제조방법에 관한 것이다.
성장인자를 전달하는 전달체에 대해서는 지금까지 다수의 특허 및 비특허 문헌을 통해 많은 연구결과가 제안되어 있다.
예를 들면, 한국 특허출원 제 10-2008-0100315 호는 다공성 인산삼칼슘계 과립의 제조방법 및 이를 이용한 기능성 골 이식재의 제조방법을 개시하고 있다.
그러나 이 기술은 단순 흡착방식으로 성장인자를 담지(loading)하기 때문에 골 형성 단백질을 지지체에 결속시켜 줄 물질이 존재하지 않아 골 형성 단백질이 짧은 시간 안에 방출(속방출)되고, 서방전달이 어려워 조직재생 과정에서 정상보다 과도하게 조직이 성장하는 등의 부작용을 일으킬 확률이 높다. [Yeh, T. T., S. S. Wu, et al., Osteoarthritis Cartilage 15(12): 1357-1366. 2007] 또한, 이 기술은 단백질을 흡착하여 동결 건조하는 방법을 채택하고 있는데, 이러한 방법은 골 형성 단백질의 구조를 변형시킬 가능성이 높으며, 골 이식재에 골 형성 단백질이 흡착된 상태로 멸균을 하기 어렵다는 단점도 아울러 지닌다.
성장인자의 전달체는 인체에 주입되는 제재이므로 의료기기의 제조과정에서 검증된 멸균방법인 감마선 멸균, 전자 빔 멸균, 고압증기 멸균, E.O (Ethylene Oxide : 에틸렌 옥사이드) 가스 멸균을 적용하게 되는데, 이러한 멸균방법들은 열과 방사선 조사를 수반하여 단백질의 구조에 영향을 미치게 된다. 따라서 멸균과정을 거친 골 형성 단백질은 본래의 효과가 충분히 발휘되기 어려울 뿐 아니라, 인체 내에서 변성된 단백질로 인식되어 부작용이 나타날 가능성도 높다. [Chen, J. B. et. al. J Biomed Mater Res A, 80(2): 435-443. 2007]
한편, 국제출원 제 PCT/EP2008/005340 호는 다공성의 블럭형 세라믹 지지체와 상기 지지체 내부에 배치되는 안정화 폴리머를 포함하는 세절 가능한 복합 골 복구물질에 관한 기술을 개시하고 있다.
상기 세라믹 지지체는 부갑상선 호르몬(Parathyroid hormone: PTH), 골형성 단백질 (Bone morphogenetic protein: BMP) 및 법랑기질 유도체 (Enamel matrix derivative: EMD) 등의 생리 활성물질이 포함된 폴리에틸렌글리콜-티올 (Polyethylene glycol thiol: PEG-thiol)의 수용액과 다분지 PEG-아크릴레이트 (polyarm-Polyethylene glycol acrylate: polyarm PEG-acrylate)의 폴리머 혼합물에 침지되어 생리 활성물질을 포함할 수 있는 골 복구물질을 형성한다. 그러나 이 방법에서 사용한 고분자인 PEG-티올의 수용액과 다분지 PEG-아크릴레이트에는 생리 활성물질을 지지체에 결속시켜주는 부분이 없기 때문에, 위에서 언급한 바와 같이 성장인자의 서방방출을 조장할 수 없다. 이 문헌에서 제시하는 PTH 방출시험 결과를 보더라도, 불과 5.8일 만에 성장인자의 방출이 완료되는 것으로 나타난다. 이러한 방출 프로파일을 골 형성 성장인자 단백질인 BMP에 적용할 경우 지나치게 빠른 방출(속방출)이 되어 골조직이 아닌 곳에서 골이 생겨나거나, 손상 골조직에서 재생이 빠르게 일어나지 않는 등 골 형성과 골 재생에 부작용을 일으킬 수 있다.
또한, 국제출원 제 PCT/IB2009/005235 호는 성장인자/양친매성 중합체 복합체, 가용성 양이온 염 및 유기 지지체를 포함하는 골 형성 조성물을 개시하고 있으며, 이 조성물은 골 형성 성장인자/양친매성 음이온성 폴리사카라이드 복합체와 하나 이상의 2가 이상인 양이온의 가용성 염을 혼합하여, 동결 건조물 형태의 개방 임플란트를 제안하고 있다. 이 문헌에서는 성장인자의 효과를 증진하고자 히알루론산을 사용한 것이 제시되어 있으나, 성장인자의 전달속도를 조절하는 방법에 대해서는 어떠한 대안도 제시하고 있지 않다.
또한, 한국 특허출원 제 10-2008-0038777 호에는 인산칼슘계 유도체를 히알루론산을 포함하는 매트릭스에 첨가하여 히알루론산의 골분화유도(osteoconductive) 작용에 의해 골 재생이 유도될 수 있도록 하는 히알루론산 골충진 복합체 및 그 제조방법을 개시하고 있다.
그런데, 이 문헌에 개시된 기술은 골 결손 부분을 메우기 위한 골 충진재 자체에 관한 것으로, 골 형성을 촉진하는 성장인자 전달체에 대해서는 어떠한 기술도 제시하고 있지 않다. 더욱이, 하이드록시아파타이트와 β-TCP로 이루어진 골 재생 유도체로 사용되는 인산칼슘 화합물이 화학적 침전반응에 의해 제조되기 때문에 기공도를 임의로 조절하는 것이 불가능하여 이것을 성장인자의 전달체로 사용할 경우 기공도가 조절되지 못하고 또 이들 기공이 상호 연결(interconnectivity)되어 있지 않기 때문에 성장인자를 내부에 담지할 수 없고, 또 성장인자의 방출속도를 임의로 조절할 수 없을 뿐 아니라, 속방출의 우려가 있어 성장인자의 전달체로는 적합하지 않다.
즉, 골 조직 재생용 성장인자 전달체는 무엇보다도 인체 내에 주입해야 하기 때문에 멸균 가능하고 독성 유발의 가능성이 낮아야 한다. 또한, 생분해 가능하며 성장인자의 전달속도를 임의로 조절하여 골 결손의 크기나 정도에 맞게 적용할 수 있어야 하고, 성장인자가 빠르게 속방출의 경우에 발생할 수 있는 부작용을 줄일 수 있어야 한다. 무엇보다도 성장인자는 손상조직의 재생 속도에 맞추어 방출되고, 손상조직 부위에 한정되어 방출되어야 효율적인 재생이 일어난다. 그러나 상기한 종래기술은 이러한 특징을 지닌 골 조직 재생용 성장인자 전달체에 대한 해결책을 제시하고 있지 않아 이에 대한 필요성이 여전히 요구되고 있는 실정이다.
한국특허출원 제10-2008-100315호 한국특허출원 제10-2008-0038777호 국제출원 제PCT/IB2009/005235호 국제출원 제PCT/EP2008/005340호
본 발명은 이러한 배경에서 제안된 것으로, 그 목적은 특히, 치과나 정형외과 분야에서 예를 들면 치주골 손실 부분, 임플란트 주변골, 골다공증, 외과수술, 또는 외상성 골 손상 등에 의해 발생하는 뼈의 재생을 도울 수 있는 골 조직 재생용 성장인자를 방출속도의 조절이 가능한 상태로 담지할 수 있는 전달체 및 그 제조방법을 제공하는 것이다.
이러한 목적을 달성하기 위해 본 발명에 의하면, 상호 연결된 기공 분포를 이루고, 가교제에 의해 가교된 히알루론산 하이드로겔; 및 상기 히알루론산 하이드로겔의 상기 기공 내에 분포하며, 45㎛~75㎛의 크기를 가지는 인산칼슘 마이크로스피어로 구성되는 성장인자 담지용 히알루론산-인산칼슘 복합체가 제공된다.
또한, 본 발명에 의하면, 인산칼슘 분말을 1050~1250℃에서 소결하여 45㎛~75㎛ 범위의 크기를 가지는 구형의 인산칼슘 마이크로스피어를 얻는 단계; 및 가교제로 가교시킨 히알루론산 하이드로겔과 상기 인산칼슘 마이크로스피어를 혼합하여 성장인자 담지용 히알루론산-인산칼슘 복합체를 얻는 단계를 포함하는 성장인자 담지용 히알루론산-인산칼슘 복합체의 제조방법이 제공된다.
본 발명에 따르면, 자연상태의 골 조직에 존재하는 칼슘과 인산 및 자연상태의 세포 외기질에 존재하는 히알루론산을 사용하여 히알루론산-인산칼슘 복합체를 제조하기 때문에 골 재생 관련 성장인자의 전달에 적합하여 골 재생을 촉진하는 유용한 이점이 있다.
또한, 병변에 미세 주입이 가능하고, 적용부위에 상처의 정도에 따라 방출속도를 다르게 하여 성장인자를 전달하여 주변 골 재생 및 증강을 효과적으로 유도할 수 있는 이점도 있다.
도 1은 성장인자의 등전점과 주변 환경의 pH에 따른 성장인자의 총 전하(net charge)의 모식도이다.
도 2는 β-TCP 마이크로스피어의 소결온도에 따른 주사전자현미경 이미지이다.
도 3은 본 발명에 따라 히알루론산 하이드로겔과 인산칼슘 마이크로스피어를 이용한 성장인자 전달속도 조절 가능한 전달체의 모식도이다.
도 4는 본 발명에 따라 성장인자 전달속도 조절 가능한 전달체를 이용한 골 재생 관련 성장인자의 방출결과이다.
도 5는 가교결합도에 따라 기공크기가 상이한 것을 나타내는 히알루론산 하이드로겔의 주사전자현미경 이미지이다. (A: 20% 가교결합도, B: 10% 가교결합도)
이하에서 본 발명을 더욱 상세하게 설명한다.
본 발명에서는 성장인자 전달속도 조절이 가능한 전달체를 제공하며, 이 전달체는 상호 연결된 기공 분포를 이루는 히알루론산 하이드로겔, 및 이러한 히알루론산 하이드로겔의 기공 사이에 분포되어 있는 인산칼슘 마이크로스피어로 구성된다. 기공도가 서로 다른 인산칼슘 마이크로스피어는 가교결합 정도가 상이한 히알루론산 하이드로겔의 공극에 들어가서 자리하게 되면서 전달체가 구성된다.
본 발명에서 성장인자 전달속도를 조절하는 원리는 첫째로, 성장인자와 전달체 간의 전기적인 인력(attraction)이다. 골 재생에 관련된 골 형성 성장인자들의 등전점(iso-electric point)은 대략 8~10으로, 생체내의 환경인 pH 7 정도에서는 전기적으로 양전기를 띄게 된다. (도 1 참조) [T. Boix et. al. Journal of Inorganic Biochemistry 99 (2005), Atsushi Iwakura et. al. J Thorac Cardiovasc Surg 126: (2003), Jeroen J.J.P et. al. Tissue Engineering, Volume 13, Number 4, (2007))
이러한 점에 착안하여, 본 발명에서는 골 재생관련 성장인자를 전달하기 위한 전달체의 구성물질로 생체 pH에서 음전하를 띄는 히알루론산과 인산칼슘을 선택하였다. 히알루론산에는 하이드록시기(-OH)나 카르복실기(-COOH)와 같은 많은 음전기를 띠는 작용기가 존재하며, 인산칼슘의 인산기(-PO4)에 의해 표면전하도 음전기를 띄게 된다. 이러한 음전하를 가지는 전달체의 작용기에 골 재생 성장인자가 전기적 결합에 의해 담지되고, 히알루론산 하이드로겔과 인산칼슘 마이크로스피어의 구조에 따라 성장인자는 전달체에서 방출되는 속도가 조절될 수 있는 것이다.
또한 본 발명에서 성장인자 전달속도를 조절하는 두 번째 원리는 성장인자 전달체의 기공도와 관계가 있다. 성장인자를 전달하기 위한 전달체는 상호 연결된 기공이 분포된 인산칼슘 마이크로스피어와 원하는 기공도를 가지는 히알루론산 하이드로겔로 구성되어 있다. 인산칼슘 마이크로스피어의 기공도가 크면 성장인자가 마이크로스피어의 중앙부분과 기공 사이사이까지 깊고 넓게 자리잡게 되어 천천히 방출된다. 또한 히알루론산 하이드로겔의 가교결합도의 증가에 따라서 하이드로겔의 기공도가 낮아지고 강도가 커져 분해되는 속도가 작아지므로 히알루론산 하이드로겔 사이에 있는 인산칼슘 마이크로스피어의 노출 속도가 감소하여 전달체에 결합되어 있던 성장인자가 천천히 방출된다.
본 발명에서 가교결합도(degree of cross-linking)는 개별 히알루론산 중합체 분자들, 또는 단량체 사슬들이 연결되어 있는 영구적인 구조를 의미한다. 더욱이, 본 발명의 목적을 위해 가교결합도는 히알루론산 기반 조성물의 가교결합된 부분 내의 히알루론산 단량체 단위에 대한 가교결합제의 % 중량비로 정의된다. 이것은 가교결합제에 대한 히알루론산 단량체의 중량비(히알루론산 단량체:가교결합제)로서 측정된다.
본 발명에 사용되는 히알루론산은 특별히 제한되지는 않으나, 일반적으로 천연물질, 바람직하게는 척추동물 또는 미생물로부터 유래되는 것을 사용할 수 있다. 히알루론산의 분자량은 통상적으로 600,000 내지 7,000,000의 것이 생산되며, 본 발명에 사용되는 히알루론산은 점도나 분해도 등을 고려하여 분자량 1,000,000 내지 5,000,000 범위의 것을 사용하는 것이 좋다.
히알루론산은 조직으로부터 추출하거나 생합성할 수 있으며, 이와 관련한 많은 선행문헌이 공지되어 있다.(대한민국 특허등록 제 1993-0001320 호(1993.02.25), 및 동 제 1987-0001815 호(1987.10.13)). 예를 들어, 조직으로부터 추출하는 경우에는 닭의 볏, 관절의 활액, 사람 탯줄 조직, 소 기관지 등으로부터 추출할 수 있으며, 미생물로부터 얻는 경우에는 비용혈성 스트렙토코커스 속에 속하는 미생물을 배양하여 얻을 수 있다.
본 발명의 성장인자 전달체를 구성하는 히알루론산 하이드로겔은 가교결합되어 있다. 가교결합의 정도를 조절하여 하이드로겔 내의 기공율과 기공 크기를 조절하여 하이드로겔 구조를 변화시킴으로써 하이드로겔 내의 성장인자 유지 비율과 친화도를 조절하고, 하이드로겔의 분해속도를 제어하여 대량 침식에 의한 성장인자의 방출속도를 조절한다. 히알루론산 하이드로겔은 Polyoxyethylene bis(glycidyl ether), 1,2,3,4-Diepoxybutane, 1,2,7,8-Diepoxyoctane, Diethylene glycol diglycidyl ether, 1,4-Butanediol diglycidyl ether 등에 의해서 가교될 수 있으며, 바람직하게는 Polyoxyethylene bis(glycidyl ether) 또는 1,4-Butanediol diglycidyl ether를 이용한다.
본 발명에서 성장인자 전달체로서 역할을 하기에 바람직한 히알루론산 하이드로겔의 가교도 범위는 40%이하이다. 이는 히알루론산 하이드로겔의 분해속도를 일반적인 골 초기 재생기간에 맞추기 위해서이다. 일반적으로 골 초기 재생기간은 2개월 정도로 알려져 있다. 이러한 골 재생의 속도를 맞추기 위해서, 2 개월 정도에 지지체가 분해되는 것이 바람직하며, 만약에 3개월 이상 지지체가 분해되지 않고 남게 되면 오히려 골 재생 및 신생골 형성에 방해가 되는 것으로 알려져 있기 때문에 적절한 분해속도를 갖는 전달체가 필요하다.
본 발명의 전달체의 또 다른 구성성분은 인산칼슘이다. 본 발명에서는 성장인자의 전달속도를 조절하기 위해 기공이 있는 마이크로스피어 형태의 인산칼슘을 사용한다. 인산칼슘 마이크로스피어의 기공도는 제조과정에서 임의로 조절하여 마이크로스피어에 담지된 성장인자의 친화도를 조절할 수 있다. 본 발명에서는 이러한 원리를 이용하여 성장인자의 전달속도를 조절한다. 인산칼슘 마이크로스피어의 기공도는 소결온도를 조절하는 과정을 통해 제어할 수 있으며, 바람직하게는 1050℃ ~ 1250℃의 온도범위에서 소결한다.
또한, 본 발명에서는 성장인자의 전달역할을 효율적으로 수행할 수 있도록 인산칼슘 마이크로스피어의 직경을 조절할 필요가 있다. 특히, 면역 초기반응 중 대식세포에 의한 식세포 작용(Phagocytosis)을 막아 단기간에 분해되지 않고 성장인자의 전달 역할을 할 수 있도록 하기 위해 인산칼슘 마이크로스피어의 최소 직경은 45um로 하였으며, 인체의 해면골의 기공 크기가 인체의 부위에 따라 다르지만 대체로 직경이 100 ~ 300um인 것을 고려하여 인산칼슘 마이크로스피어의 최대 직경은 75um로 한정하였다.
인산칼슘 마이크로스피어는 제1인산칼슘 (Monocalcium phosphate: Ca(H2PO4)2), 제2인산칼슘 (Dicalcium phosphate: CaHPO4), 2수소인산칼슘 (Calcium dihydrogen phosphate: Ca(H2PO4)2), 제3인산칼슘 (Tricalcium phosphate: Ca3(PO4)2), 제10인산칼슘 (Octacalcium phosphate : Ca8H2(PO4)6.5H2O) 등으로 만들어질 수 있으며, 본 발명에서 제작하는 인산칼슘 마이크로스피어는 생체에 이식되는 성장인자의 전달체로서 생분해 가능하고, 골 흡수세포(osteoclast)에 의해 흡수되며, 뼈 구성성분으로 흡수되어 뼈 재생에 유용하게 쓰일 수 있는 장점을 지닌 베타형 제3인산칼슘 (β-tricalcium phosphate; β-TCP, Ca3(PO4)2)를 사용하는 것이 바람직하다.
또한, 골 재생에 관련된 성장인자에는 일반적으로 형질전환 성장인자 군 (Transforming growth factor family: TGF family), 상피세포 성장인자 (Epidermal growth factor: EGF), 섬유아세포 성장인자 (Fibroblast growth factor: FGF), 혈관 내피세포 성장인자 (Vascular endothelial growth factor: VEGF) 등이 있다. 이 중에 형질전환 성장인자 군 (TGF family) 중에서 골 재생의 중요 요인인 골형성 단백질 (Bone morphogenetic protein: BMP)계열, 구체적으로는 BMP-2, BMP-3, BMP-3b, BMP-4, BMP-5, BMP-6, BMP-7, BMP-8, BMP-9, BMP-10, BMP-11, BMP-12, BMP-13, BMP-14, BMP-15, BMP-16, BMP-17, BMP-18 등을 예로 들 수 있다.
도 1은 성장인자의 등전점과 주변 환경의 pH에 따른 성장인자의 총 전하(net charge)의 모식도이다. 도 1에서와 같이, 등전점(iso-electric point)이 8~10인 골 재생에 관련된 성장인자들은 pH 7 정도의 생체 내에서 전기적으로 양전기를 띄기 때문에 히알루론산의 하이드록시기(-OH)와 카르복실기(-COOH), 인산칼슘의 인산기(-PO4)등의 음성전하를 지니는 전달체의 작용기에 전기적 결합에 의해 담지되고, 히알루론산 하이드로겔과 인산칼슘 마이크로스피어의 구조에 따라 전달체에서 성장인자의 방출속도가 제어된다.
본 발명의 성장인자 전달속도를 조절하는 전달체의 구성성분인 히알루론산 하이드로겔은 상호 연결된 기공분포를 가지는데, 예를 들면 1,000,000Da이상의 고분자량 히알루론산을 pH 7.0 정도의 증류수에 1중량% 내지 20중량%가 되도록 녹인 후, 폴리옥시에틸렌 비스글리시딜 에테르(Polyoxyethylene bis(glycidyl ether)), 다이에폭시부탄(1,2,3,4-Diepoxybutane), 다이에폭시옥탄 (1,2,7,8-Diepoxyoctane), 다이에틸렌 글리콜 다이글리시딜 에테르(Diethylene glycol diglycidyl ether), 또는 부탄디올 다이글리시딜 에테르(1,4-Butanediol diglycidyl ether)와 같은 가교결합제를 1 중량% 내지 40 중량% 넣어서 충분히 반응시키면 1 내지 40% 범위의 가교결합도를 가지는 히알루론산 하이드로겔이 얻어진다.
가교결합도를 다르게 한 히알루론산 하이드로겔은 기공율이 다르며, 그 물성에 따라 분해속도가 상이하므로 결합되어 있던 성장인자의 방출속도가 다르게 나타나게 된다. 가교결합도에 따른 히알루론산 하이드로겔의 분해속도(degradation rate)를 나타낸 표 1에서 보는 바와 같이, 가교결합도에 따라 히알루론산 하이드로겔의 분해속도가 현저하게 다르다는 것을 확인할 수 있다.
Figure 112012025113964-pat00001
본 발명의 성장인자 전달속도를 조절하는 전달체의 또 다른 구성성분인 인산칼슘 마이크로스피어는 생체 친화성이 높고, 생체분해 및 흡수가 가능한 β-TCP를 예로 들어 설명한다. 먼저 β-TCP 분말을 합성한 후, 스프레이 드라이하여 구형의 입자를 얻은 후 이 입자를 1050℃ ~ 1250℃의 온도 범위에서 2시간 정도 소결하면 다공성의 β-TCP 마이크로스피어를 제조할 수 있다. 소결한 β-TCP 마이크로스피어는 등방형의 구형 입자로서, 소결온도에 따라 기공도에 차이가 나타난다. 즉, 표 2에서와 같이, 소결온도가 증가함에 따라 β-TCP 마이크로스피어의 기공도는 서서히 감소하고 그에 따라 흡수율도 감소한다.
소결온도에 따른 β-TCP 마이크로스피어의 표면 기공구조를 도 2에 나타냈다. 이에 따르면, 소결온도의 상승에 따라 표면 입자 사이의 응집력이 강해지면서 외부와 연결된 기공의 크기와 분포가 급격하게 감소한다는 것을 확인할 수 있다. 따라서 소결온도의 증가에 따라 BMP-2와 같은 담지 가능한 성장인자의 양 및 성장인자와의 친화력이 감소하는 경향을 보이는데, 이러한 성질을 활용하여 성장인자의 방출속도를 임의로 조절할 수 있는 전달체를 제조하는 것이 가능하다.
(실시예)
이하, 본 발명을 실시예를 통해 더욱 상세하게 설명한다. 그러나 본 발명이 이들 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.
(실시예 1~9)
1. β-TCP 마이크로스피어의 제조
증류수 67ml에 녹인 무정형의 β-TCP 분말 슬러리 10g을 150℃에서 스프레이 드라이하여 얻은 평균 입경 2㎛의 구형에 가까운 β-TCP 분말을 얻었다. 이 분말을 알루미나 도가니에 10mm 두께로 넣은 후 600℃의 전기로에서 1시간 동안 1차 소결한 후, 다시 1050 ~ 1250℃의 온도에서의 2차 소결 과정을 거쳐 구형의 β-TCP 마이크로스피어를 제조한 후 체 거름을 통해 분급하였다. 분급된 β-TCP 마이크로스피어 중에 45μm 내지 75μm의 크기를 갖는 β-TCP 마이크로스피어를 선별하여 초음파 세척기로 30분 동안 세척한 후, 70℃에서 1시간 건조하여 최종적으로 β-TCP 마이크로스피어를 얻었다. 이렇게 하여 제조한 β-TCP 마이크로스피어의 소결온도에 따른 표면 기공구조를 도 2에 나타내었다.
도 2는 성장인자 전달속도를 조절하기 위하여 기공율을 조절한 β-TCP 마이크로스피어의 표면 주사전자현미경 이미지로서, 도 2의 표면 기공구조를 보면, 소결 온도 상승에 따라 표면 입자 사이의 응집력이 강해지면서 외부와 연결된 기공의 크기와 분포가 급격하게 감소함을 확인할 수 있다.
2. 성장인자 전달체의 제조
1000kDa의 히알루론산 분말 1g에 100ml의 증류수를 넣고 1000rpm에서 1시간 용해한 후, 가교 결합제로 부탄디올 다이글리시딜 에테르(1,4-Butanediol diglycidyl ether) 1 내지 40중량%을 넣어준 다음, pH 조건을 9.0으로 하였다. 그 후, 와동기계로 1시간 섞어준 후, 25℃에서 10시간 반응시켜 가교된 히알루론산 하이드로겔을 얻었다.
이렇게 얻어진 히알루론산 하이드로겔을 동결 건조 후 분쇄하여 500μm 이하의 크기를 갖는 파우더를 체거름으로 분리한 후 얻어진 히알루론산 하이드로겔 파우더 5g과 위에서 제조한 β-TCP 마이크로스피어 5g을 500rpm에서 1시간 혼합, 교반하여 10g의 성장인자 전달체를 제조하였다. 도 3은 본 발명의 실시예에 의해 히알루론산 하이드로겔과 인산칼슘 마이크로스피어로 제작한 성장인자 전달체의 모식도를 나타낸 것이다.
이렇게 제조된 성장인자 전달체의 기공율과 수분 흡수율을 표 2에 나타내었다.
Figure 112012025113964-pat00002
표 2을 보면, 성장인자 전달체는 소결온도와 가교결합도에 따라 기공율과 수분 흡수율이 상이하게 나타나고, 기공율과 수분 흡수율은 성장인자의 방출 및 전달 속도에 영향을 준다는 것을 확인할 수 있다.
골형성 성장인자 BMP-2 담지 및 BMP-2 방출 시험
상기 실시예 1, 3, 6 및 9에 따라 제조한 히알루론산 하이드로겔과 β-TCP 마이크로스피어로 이루어진 성장인자 전달체 100mg을 주사기에 충진한 후, 골 형성 성장인자 BMP-2 용액 100μl를 빨아들여 흡수시켰다. 그 후 다른 주사기를 일자 커넥터로 연결하고, 5회 정도의 혼합과정을 통해 잘 섞어주어 성장인자를 담지하였다.
골 형성 성장인자 BMP-2를 담지한 상기 전달체 100mg를 포스페이트 버퍼용액 1ml을 넣어주고 1, 4, 6, 14 일 동안 BMP-2가 방출된 버퍼용액을 샘플로 채취하였다. 채취한 샘플을 시판중인 BMP-2 ELISA kit로 항원-항체반응을 이용하여 BMP-2의 양을 측정하였으며, 그 결과를 도 4에 나타내었다.
도 4의 결과를 보면, 성장인자 전달체의 소결온도와 가교결합도에 따라 성장인자의 방출 및 전달 속도에 차이가 있다는 것을 알 수 있다. 실시예 9의 전달체에 담지된 골 형성 성장인자는 14일 동안 거의 전부 방출된 반면, 실시예 6의 전달체에 담지된 성장인자는 14일 동안 40%정도만 방출된 것을 알 수 있다. 또한 실시예 1과 3에 따른 전달체에 담지된 골 형성 성장인자는 10%미만 정도밖에 방출이 되지 않았다.
이러한 결과로부터, BMP-2가 변형이나 손상 없이 전달체에 담지 되었음을 확인할 수 있고, 성장인자 전달체의 소결온도와 가교결합도에 따라 성장인자의 방출 및 전달 속도가 상이하게 나타나는 것을 확인함으로써 성장인자의 방출 및 전달 속도를 임의로 조절할 수 있다는 것을 알 수 있다.
한편, 도 5는 가교결합도에 따라 기공크기가 상이한 것을 나타내는 히알루론산 하이드로겔의 주사전자현미경 이미지(A: 20% 가교결합도, B: 10% 가교결합도)로서, 히알루론산 하이드로겔은 가교결합도에 따라 기공도와 기공 크기에 차이가 나타나는데, 도 5에서 보는 바와 같이, 가교결합도 20%(A)인 경우 약 180um의 기공크기를 지니고, 가교결합도 10%(B)인 경우에는 약 240um의 기공크기를 가지는 것을 확인할 수 있다.
이상에서는 본 발명을 특정의 바람직한 실시예를 통해 설명하였으나, 본 발명은 상기한 실시예에 한정되지 아니하며 본 발명의 정신을 벗어나지 않는 범위 내에서 당해 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에 의해 다양한 변경과 수정이 가능할 것이다.

Claims (12)

  1. 상호 연결된 기공 분포를 이루고, 가교제에 의해 가교된 히알루론산 하이드로겔; 및
    상기 히알루론산 하이드로겔의 상기 기공 내에 분포하며, 45㎛~75㎛의 크기를 가지는 인산칼슘 마이크로스피어로 구성되는 성장인자 담지용 히알루론산-인산칼슘 복합체.
  2. 제 1항에 있어서,
    상기 히알루론산의 분자량은 1,000,000 내지 5,000,000 범위인 것을 특징으로 하는 성장인자 담지용 히알루론산-인산칼슘 복합체.
  3. 제 1항에 있어서,
    상기 히알루론산의 가교도는 40%이하인 것을 특징으로 하는 성장인자 담지용 히알루론산-인산칼슘 복합체.
  4. 제 1항에 있어서,
    상기 히알루론산의 가교제는 폴리옥시에틸렌 비스글리시딜 에테르(Polyoxyethylene bis(glycidyl ether), 다이에폭시부탄(1,2,3,4-Diepoxybutane), 다이에폭시옥탄(1,2,7,8-Diepoxyoctane), 다이에틸렌 글리콜 다이글리시딜 에테르(Diethylene glycol diglycidyl ether), 부탄디올 다이글리시딜 에테르(1,4-Butanediol diglycidyl ether) 중에서 선택되는 것을 특징으로 하는 성장인자 담지용 히알루론산-인산칼슘 복합체.
  5. 제 1항에 있어서,
    상기 인산칼슘 마이크로스피어를 구성하는 인산칼슘은 제1인산칼슘 (Monocalcium phosphate: Ca(H2PO4)2), 제2인산칼슘 (Dicalcium phosphate: CaHPO4), 2수소인산칼슘 (Calcium dihydrogen phosphate: Ca(H2PO4)2), 제3인산칼슘 (Tricalcium phosphate: Ca3(PO4)2), 제10인산칼슘 (Octacalcium phosphate : Ca8H2(PO4)6.5H2O) 중에서 선택되는 것을 특징으로 하는 성장인자 담지용 히알루론산-인산칼슘 복합체.
  6. 제 1항에 있어서,
    상기 성장인자는 상피세포 성장인자(Epidermal growth factors; EGF), 헤파린 결합성 EGF 유사 성장인자(Heparin-binding EGF-like growth factor; HB-EGF), 섬유아세포 성장인자 (Fibroblast growth factors; FGF), 혈관 내피세포 성장인자 (Vascular endothelial growth factor: VEGF), 골형성 단백질 (Bone morphogenetic protein: BMP)계열 중 BMP-2, BMP-3, BMP-3b, BMP-4, BMP-5, BMP-6, BMP-7, BMP-8, BMP-9, BMP-10, BMP-11, BMP-12, BMP-13, BMP-14, BMP-15, BMP-16, BMP-17, BMP-18 에서 선택된 적어도 1종인 것을 특징으로 하는 성장인자 담지용 히알루론산-인산칼슘 복합체.
  7. 인산칼슘 분말을 1050~1250℃에서 소결하여 45㎛~75㎛ 범위의 크기를 가지는 구형의 인산칼슘 마이크로스피어를 얻는 단계; 및
    가교제로 가교시킨 히알루론산 하이드로겔과 상기 인산칼슘 마이크로스피어를 혼합하여 성장인자 담지용 히알루론산-인산칼슘 복합체를 얻는 단계를 포함하는 성장인자 담지용 히알루론산-인산칼슘 복합체의 제조방법.
  8. 제 7항에 있어서,
    상기 히알루론산의 분자량은 1,000,000 내지 5,000,000 범위인 것을 특징으로 하는 성장인자 담지용 히알루론산-인산칼슘 복합체의 제조방법.
  9. 제 7항에 있어서,
    상기 히알루론산의 가교도는 40%이하인 것을 특징으로 하는 성장인자 담지용 히알루론산-인산칼슘 복합체의 제조방법.
  10. 제 7항에 있어서,
    상기 히알루론산의 가교제는 폴리옥시에틸렌 비스글리시딜 에테르(Polyoxyethylene bis(glycidyl ether), 다이에폭시부탄(1,2,3,4-Diepoxybutane), 다이에폭시옥탄 (1,2,7,8-Diepoxyoctane), 다이에틸렌 글리콜 다이글리시딜 에테르(Diethylene glycol diglycidyl ether), 부탄디올 다이글리시딜 에테르(1,4-Butanediol diglycidyl ether) 중에서 선택되는 것을 특징으로 하는 성장인자 담지용 히알루론산-인산칼슘 복합체의 제조방법.
  11. 제 7항에 있어서,
    상기 인산칼슘 마이크로스피어를 구성하는 인산칼슘은 제1인산칼슘 (Monocalcium phosphate: Ca(H2PO4)2), 제2인산칼슘 (Dicalcium phosphate: CaHPO4), 2수소인산칼슘 (Calcium dihydrogen phosphate: Ca(H2PO4)2), 제3인산칼슘 (Tricalcium phosphate: Ca3(PO4)2), 제10인산칼슘 (Octacalcium phosphate : Ca8H2(PO4)6.5H2O) 중에서 선택되는 것을 특징으로 하는 성장인자 담지용 히알루론산-인산칼슘 복합체의 제조방법.
  12. 제 7항에 있어서,
    상기 성장인자는 상피세포 성장인자 (Epidermal growth factors; EGF), 헤파린 결합성 EGF 유사 성장인자(Heparin-binding EGF-like growth factor; HB-EGF), 섬유아세포 성장인자 (Fibroblast growth factors; FGF), 혈관 내피세포 성장인자 (Vascular endothelial growth factor: VEGF), 골형성 단백질 (Bone morphogenetic protein: BMP)계열 중 BMP-2, BMP-3, BMP-3b, BMP-4, BMP-5, BMP-6, BMP-7, BMP-8, BMP-9, BMP-10, BMP-11, BMP-12, BMP-13, BMP-14, BMP-15, BMP-16, BMP-17, BMP-18 에서 선택된 적어도 1종인 것을 특징으로 하는 성장인자 담지용 히알루론산-인산칼슘 복합체의 제조방법.
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