KR101203024B1

KR101203024B1 - 디프룩토오스-디안히드리드 ⅲ 의 정제 방법

Info

Publication number: KR101203024B1
Application number: KR1020117030637A
Authority: KR
Inventors: 히로토 기쿠치; 히로아키 사쿠라이; 노리미츠 다카기; 츠토무 아리츠카; 요시히로 센바; 후사오 도미타; 고조 아사노
Original assignee: 니혼 텐사이 세이토 가부시키가이샤
Priority date: 2003-03-05
Filing date: 2004-03-02
Publication date: 2012-11-21
Anticipated expiration: 2024-03-02
Also published as: KR20050105933A; KR20120003976A; US7998710B2; EP1612274A1; KR101132994B1; EP1612274A4; US20060051845A1; JPWO2004078989A1; EP2450452A1; WO2004078989A1; JP4572167B2; JP2010233576A; JP5130326B2

Abstract

본 발명은 순도 90% 이상의 디프룩토오스-디안히드리드 III (di-D-fructofranose-1,2';2,3'dianhydride, 이하, DFA III) 을 R-Bx l0～60, 바람직하게는 40～55 의 농도로 갖는 DFA III 정제액에, 분말 활성탄을 5% 이하 첨가하여 교반한 후, 고액 분리 하고 (규조토 여과, 멤브레인 필터 여과, 한외 여과, 연속 원심 분리 등), 분리액을 농축시킨 후, 즉시 결정화하여 고순도의 DFA III 결정을 제조한다. 본 발명의 방법은 DFA III 결정을 효율적으로 공업 생산할 수 있을 뿐만 아니라, 얻어진 결정은 종래품과 달리, 냄새가 없다는 특징을 가지므로, 의약품이나 음식품 용도로 적합하다.

Description

디프룩토오스-디안히드리드 Ⅲ 의 정제 방법 {PROCESS FOR PURIFYING DIFRUCTOSE-DIANHYDRIDE III}

본 발명은 디프룩토오스-디안히드리드 III (α-D-푸룩토푸라노스(fructofuranose)-β-D-프룩토푸라노스-2',1:2,3'-디안히드리드) (이하, DFA III 이라고도 한다) 의 정제 방법에 관한 것이다. 더욱 상세하게는 DFA III 함유액으로부터 고순도의 DFA III 결정을, 특히 재결정 처리를 다수회 반복하지 않고 냄새까지도 제거되어 고도로 정제된 DFA III 결정을 매우 효율적으로 얻을 수 있는 공업적 방법에 관한 것이다.

디프룩토오스-디안히드리드 III (DFA III) 은 프룩토오스 2 분자가 1,2';2,3' 로 결합하고 있는 난소화성 2 당류로서 (디-D-프룩토푸라노스-1,2'; 2,3' 디안히드리드), 물에 대한 용해성이 높고, 자당의 90～95% 정도를 나타내지만, 그 감미도는 자당의 52% 정도이다.

DFA III 은 최근의 본 출원인에 속하는 연구자들의 연구에 의해, Ca 등 미네랄의 흡수 촉진 작용을 갖는 것으로 판명되어 (예를 들어, 특허문헌 1 참조), 향후 특히 고령자나 유아 등에 있어서, 의약상, 건강 식품, 특정 보건용 식품, 기타 음식품상, 유익한 물질로서 기대되고 있다. 따라서, 고순도의 DFA III 이, 특히 취급면에서나 가공 용이성면에서도, 결정화된 DFA III 의 제조가, 더구나 연구 시약용과 같이 소규모 고비용 생산이 아닌, 대규모 저비용 생산법의 개발이 요망되고 있다.

DFA III 은 지금까지, 이눌린 또는 이눌린 함유물 (예를 들어, 돼지감자, 우엉, 치커리 등의 추출액) 에, 세균 또는 그것이 생산하는 효소 프룩토실트랜스퍼라아제인 이눌린프룩토트랜스퍼라아제를 작용시켜 DFA III 함유액을 제조한 후, 이것을 다시 처리하여 고농도 DFA III 액을 얻고 있다.

예를 들어, DFA III 함유액을 활성탄 칼럼에 통과하여 DFA III 을 흡착시킨 후, 에탄올로 용리하여 DFA III 함량이 많은 분획을 회수하여 증발 건조하는 방법이 제안되어 있지만 (예를 들어, 특허문헌 2, 3 참조), 이 방법은 실험실적인 회수방법으로서, 공업적 대량 생산 방법이라고 하기는 어려운 것이다. 또한, 상기 효소 반응에 의해서 얻은 액을 이온 교환 수지에 의해서 정제하고, 이것을 농축 건조하는 방법도 제안되어 있지만 (예를 들어, 특허문헌 4 참조), DFA III 의 순도가 낮아 고순도의 DFA III 결정을 얻는 방법이라고 하기는 어려운 것이다. 더구나, 종래 방법으로 결정화한 DFA III 결정은 다른 불순물은 제거할 수 있어도, 냄새까지 제거할 수는 없어, 냄새의 잔류라는 결점은 불가피하였다. 확실히 재결정을 이용하면 냄새까지 일단 제거할 수 있지만, 재결정 처리를 다수회 반복할 필요가 있으며, 그 때마다 수율, 생산량이 저하되어 재결정법은 공업적인 방법이 아니다.

이와 같이, 냄새까지 제거한 고순도 DFA III 결정, 또한 이것을 공업적으로 대량 생산하는 데 성공한 예는 아직 보고되어 있지 않은 것이 현실이다.

특허문헌 1

JP-A 11-43438

특허문헌 2

JP-B 56-26400

특허문헌 3

JP-A 3-259090

특허문헌 4

JP-A 1-285195

상기한 바와 같이, 최근 DFA III 에 관해서 유용한 용도가 개발됨에 따라, DFA III 의 수요가 높아지고 있다. 그리고 의약 용도로 사용되는 경우는 물론 음식품 용도로 사용되는 경우에도, DFA III 이외의 당 및 각종 불순물을 제거한 고순도 DFA III 결정이 요망되고 있고, 특히 이들 용도에서는 불순물 중, 색 외에 냄새가 결정 중에 잔존하지 않는 것을 요망되고 있다. 그러나, 종래 방법으로는 결정으로부터 냄새를 제거하기가 매우 어렵기 때문에, 다수회 재결정 처리를 반복하지 않고 냄새까지도 제거하여 매우 고도로 정제된 결정화 DFA III 을 효율적으로 공업적으로 대량 생산할 수는 없으며, 당업계에서 이 문제점을 해결하는 것이 요망되고 있다.

본 발명은 상기한 바와 같이, 종래의 결정화 방법으로는 공업적으로 냄새를 제거할 수 없었지만 (바꾸어 말하면, 결정화하더라도 냄새가 잔존하고 있었지만), 본 발명 방법에서는 이를 최초로 가능하게 하였을 뿐만 아니라, 효율화, 공업적 대량 생산에도 최초로 성공한 것이다.

즉, 본 발명자들은 각 방면에서 연구한 결과, DFA III 함유액을 입상 활성탄 충전 칼럼에 통액하는 것이 아니라, DFA III 함유액에 소량의 분말상 활성탄을 첨가하여 교반한 후, 이것을 규조토 여과, 멤브레인 필터 여과 등의 고액 분리 처리를 실시하여 얻어진 액상부의 농축액을 결정화하였더니, 고순도의 DFA III 결정이 매우 효율적으로 얻어지는 것, 더구나 순도 95% 이상, 즉 95～99% 의 매우 순수한 DFA III 결정이 얻어지는 것을 처음으로 발견하였다. 또한, 이 연구 과정에서, DFA III 함유액을 크로마토그래피 처리하여 얻은 DFA III 분획은, 이것에 분말 활성탄을 첨가하여 고액 분리 한 후의 액상부는 직접 결정화할 수도 있는 것, 더구나 이들 방법으로 얻어진 결정에는 냄새가 없다는 것도 처음으로 발견하였다.

본 발명은 이들 유용한 새로운 발견에 근거하여 더욱 검토 연구한 결과 마침내 완성된 것으로, 종래에 이룰 수 없었던 냄새도 없고 고순도인 DFA III 결정 내지 과립상물의 공업적 대량 생산의 개발에 최초로 성공한 것으로, 매우 고가인 DFA III 을 저비용으로 정제, 결정화하는 것, 더구나 종래 겨우 실험실 규모로 행해지고 있었던 재결정을 다수회 반복하는 것에 의해 냄새를 제거하는 처리도 실시할 필요가 없게 한 것이다.

도 1 은 DFA III 결정의 제조 플로 차트의 일례를 나타낸다.
도 2 는 크로마토 처리에 의한 정제 플로 차트의 예를 나타낸다.
도 3 은 각종 이눌린 상품의 액체 크로마토그램이다.
도 4 는 MF (멤브레인 필터) 여과 시험의 결과를 나타낸다.

이하, 본 발명에 관해서 상세히 기술한다.

본 발명은 DFA III 함유액을 정제하여 고순도의 DFA III 결정을 효율적으로 공업 생산하는 것이다. DFA III 함유액으로서는 DFA III 을 함유하여 후기하는 조건을 만족하는 액상물을 전부 포함하는 것으로, 이눌린 또는 이눌린 함유액에 프룩토실트랜스퍼라아제를 작용시켜 얻은 DFA III 생성 반응액 외에, DFA III 화학 합성액이나 본 정제공정에서 생성하는 각종 정제도의 DFA III 을 함유하는 액체가 모두 포함된다.

예를 들어 이눌린 (및/또는 이눌린 함유액) 과 효소를 사용하여 DFA III 을 제조하는 경우, 이눌린은 프룩토오스가 다수 중합된 것으로, 주로 치커리 (또는 돼지감자, 우엉 등) 로부터 추출한 것이 사용되기 때문에, 중합도 및 순도가 다른 것이 시판되고 있을 뿐만 아니라, 이것을 효소에 의해서 분해하면, 생성된 반응액에는 DFA III 이외의 프룩토오스 중합물, 효소, 효소원으로서 사용한 미생물, 그 배양물, 색소, 냄새 등의 불순물이 포함되는 것이 불가피하고, 이 때문에 종래에는 순수한 DFA III 결정 또는 그 함유물을 공업적으로 저비용으로 효율적으로 얻을 수가 없었다.

효소 반응액의 청정법으로서는 이미 기술한 바와 같이, 이온 교환 수지 및 활성탄 칼럼을 사용하는 방법이 알려져 있지만 (특허문헌 4 및 2, 3), 처리, 조작이 번잡하고 효율적이지 못할 뿐만 아니라, 다른 프룩토오스 중합체를 제거하는 것이 매우 어렵기 때문에, 이들의 중합체가 잔존하게 되어 DFA III 순도가 낮다는 매우 커다란 결점을 피할 수 없고, 특히 냄새가 잔존하게 된다.

또한, 활성탄 칼럼을 사용하는 방법은 DFA III 외에 다른 프룩토오스 중합체, 색소 등의 불순물을 비선택적으로 일단 활성탄에 흡착시킨 후, 에탄올을 사용하여 각종 분획을 용출하고, DFA III 풍부 분획을 모아 회수하는 것으로서, 소량의 분말상의 활성탄을 효소 반응액에 첨가하여 불순물을 흡착하고 (DFA III 은 그 대부분이 액 중에 잔류한다) 그 후에 분말상 활성탄을 제거하는 본 발명에 관한 청정화 방법과는 그 원리 자체가 다른 것은 물론, 조작방법, 조작효율, 정제도가 전혀 다르고, 또한 사용하는 활성탄의 종류, 입도, 사용량이 전혀 달라서 본 발명과는 전혀 다른 방법으로서, 본 발명의 특허성과는 관계가 없는 것이다. 양자는 방법 자체가 전혀 다른 것이다.

또, 특허문헌 4 (이온 교환 수지법) 의 실시예 4 에 있어서, 돼지감자 상등액을 셀라이트 여과하여 얻은 여과액을 활성탄 처리하는 공정이 기재되어 있지만, 이는 돼지감자 상등액 여과액은 불순물이 많아서 뒤에서 실시하는 이온 교환 수지 처리에 지장을 주기 때문에 이것을 원활하게 실시할 목적으로 실시하는 전처리 내지 최초의 단순한 부분 정제 공정으로서, 애당초 본 발명의 활성탄 처리와는 기술적 의의를 완전히 달리하는 것이다. 더구나, 사용하는 활성탄의 입도, 사용량에 관한 규정이 없을 뿐만 아니라, 처리대상으로서 특정 순도의 DFA III 을 특정 농도 함유하는 특정한 DFA III 함유액 (본 발명에서의 DFA III 정제액) 에 관한 기재조차 없고, (돼지감자 상등액 여과액이 본 발명에서 DFA III 정제액으로서 사용하는 특정한 DFA III 함유액이 아닌 것은 명백하다), 더욱이 본 발명에서는 활성탄에 의해서 청정화된 후에는 결정화 공정이 실시되는 데 비해, 이 방법에서는 이온 교환 수지 처리가 실시되고 있어 전혀 다를 뿐만 아니라, 애당초 결정화 자체가 실시되지 않는다. 더구나 탈취도 되어 있지 않다. 따라서 이 방법도 본 발명에 관한 방법과는 아무런 관계도 없는 것이다.

이와 같이 종래 기술과는 전혀 다른 본 발명을 실시하여 고순도의 DFA III 결정을 고수율로 제조하기 위해서는, 출발 조(粗)결정화 원료로서 순도 60% 이상, 바람직하게는 70% 이상의 DFA III 을 R-Bx 60 이상, 바람직하게는 70 이상의 농도로 함유하는 DFA III 조액(粗液)을 사용하는 것이 바람직하다. 이 특정한 DFA III 조액을 사용함으로써, 순도 95% 이상, 또는 99% 이상의 순수한 DFA III 결정을 회수율 35% 이상 (대 이눌린) 으로 효율적으로 대량 생산할 수 있다. DFA III 조액으로서는 DFA III 함유액, 크로마토그래피 처리하여 얻은 DFA III 분획, 결정 또는 조결정 시럽 중 적어도 하나가 사용된다.

이 DFA III 함유액은 프룩토오스 중합도가 10 이상, 바람직하게는 10～100, 더욱 바람직하게는 10～60 의 이눌린을 효소처리하면 얻을 수 있고, 또한 순도가 낮은 DFA III 함유액이더라도, 크로마토그래피 (이하, 크로마토라고도 한다) 처리하여 상기한 특정한 DFA III 분획을 분획하여 회수해도 된다. 필요하다면 농축, 원심 분리, 여과 그 밖의 통상적인 방법에 의해서 성분을 조정하여 상기한 조성을 갖는 DFA III 함유액을 조제해도 된다.

프룩토오스 단위를 전이촉매하여, DFA III 같은 올리고당을 합성하는 효소는 넓은 의미로 "프룩토실트랜스퍼라아제" 이다. 프룩토실트랜스퍼라아제는 크게 2 종류로 대별된다. (1) 프룩토오스 단위 (수크로오스 등의 2 당류 포함) 를 기질로 하고, 이것을 가수ㆍ전이하여 올리고당을 합성하는 효소 (경우에 따라 다당도 합성한다). (2) 이눌린이나 레반 등의 프룩탄을 기질로 하고, 이것을 가수ㆍ전이하여 올리고당을 합성하는 효소. 발명자들이 이눌린으로부터의 DFA III 제조에 사용한 것은 프룩토실트랜스퍼라아제 중에서도, 학명이 이눌린프룩토프랜스퍼라아제이며 (2) 의 종류에 속한다. 이눌린프룩토트랜스퍼라아제 (이하, 간단히 IFT 라고 한다) 를 생성하는 미생물로서는 아스로박터속(Arthrobacter), 클루이베로마이세스속(Kluyveromyces), 스트렙토마이세스속(Streptomyces), 엔테로박터속(Enterobacter)에 속하는 각종 세균, 효모, 방선균 등이 보고되어 있고, 이들을 적절히 사용할 수 있다. 이들 미생물을 배양하여, 정제 효소, 비정제 효소, 효소 함유물, 미생물 배양물 등의 형태로서 적절히 사용된다.

그 비한정예를 이하에 나타낸다: Arthrobacter sp.; Arthrobacter ureafaciens IFO 12140; Arthrobacter globiformis IFO 12137; Arthrobacter pascens IFO 12139; Bacillus sp.; Kluyveromyces marxianus var. marxianus: Streptomyces sp.; 및 Enterobacter sp.

이들 미생물 유래의 효소를 사용하는 경우, 분리정제한 효소 외에, 조정제 효소, 미생물 배양물, 동 처리물 (배양 상등액, 분리 균체, 균체 파쇄물 등) 도 사용할 수 있다. 또, DFA III 결정을 식품 용도에 사용하는 경우에는 효소로서 프룩토실트랜스퍼라아제, 특히 IFT 를 사용하는 것이 바람직하고, 상기 미생물 유래의 효소 외에, 이번에, 특허 생물 기탁 센터에 FERM BP-8296 으로서 기탁된 Arthrobacter sp. AHU 1753 주는 IFT 생산능이 우수하므로, 본 균주 유래의 효소는 바람직하게 사용할 수 있다.

또, 이눌린의 효소 분해에 의한 DFA III 의 생성은 DFA III 단독의 것이 생성되는 것이 가장 바람직하지만, 실제상으로는 DFA III 이외의 프룩토오스의 중합물이 여러 가지 생성된다. 그것이 효소 분해액의 순도 저하의 원인으로 되어 있다. 이 때문에, DFA III 을 결정화하기 위한 원료로서, 이눌린 이외의 불순물 혼입량이 될 수 있는 한 적은 것이나, 또한 DFA III 이외의 프룩토오스 중합체가 생성되지 않는 효소의 선택이 필요하다. 그리고, 이와 같이 DFA III 이 풍부한 DFA III 함유액이 얻어지면, 이것을 DFA III 조액으로서, 즉시 본 발명에 관한 청정 여과, 결정화 공정에 들어갈 수 있다.

이하, 결정 DFA III 의 제조 플로의 일례로서 도 1 에 나타낸 제조 플로 차트를 참조하면서 본 발명을 상세히 설명한다.

이눌린을 이눌린 분해 효소로 처리한 후, 효소를 실활시켜 DFA III 함유액 (효소 반응액) 을 얻는다. 이 때, 고순도 DFA III 결정을 효율적으로 제조하기 위해서는, 원료 이눌린으로서는 프룩토오스 중합도가 10 이상, 바람직하게는 10～60 의 것을 사용하는 것이 좋다. 효소로서는 이미 기술 것을 적절히 사용할 수 있고 (바람직한 예의 하나로는 아스로박터 sp. AHU 1753 주 (FERM BP-8296) 유래의 IFT 가 예시된다), 효소 처리 및 실활은 통상적인 방법에 따르면 된다. 이렇게하여, R-Bx (굴절계 브릭스) 10 이상, 바람직하게는 15 이상, 더욱 바람직하게는 20 이상, 보다 바람직하게는 20～30 이고, DFA III 순도 60% 이상, 바람직하게는 65% 이상, 더욱 바람직하게는 70% 이상, 더욱 바람직하게는 70～85% 의 DFA III 함유액을 얻는다. 화학 합성에 의해서도, 동일하게 DFA III 함유액을 제조할 수 있다. 또, 원료 이눌린으로서는 상기한 바와 같이 프룩토오스 중합도가 10 이상인 것이 바람직하지만, 불순물을 함유하는 이눌린, 예를 들어 프룩토오스 중합도가 5 정도인 것이더라도, 시럽의 부생량이 많아져 순환 처리하는 횟수나 양이 많아져 효율면에서는 약간 저하되지만, 이 제조로 충분히 처리할 수 있다.

상기에 의해서 얻은 DFA III 함유액 이외에, 이것과 동일한 성질을 갖는 크로마토 처리하여 얻은 DFA III 분획, 결정 또는 조결정 시럽의 적어도 하나로 이루어지는 DFA III 조액은 다음에 청정 여과한다. 청정 여과는 DFA III 조액의 활성탄 처리 및 고액 분리 처리를 가리키는 것이다. 활성탄 처리는 DFA III 조액에 분말 활성탄을 소량 첨가하고, 필요하다면 가열 및/또는 교반하여 DFA III 이외의 불순물을 활성탄에 흡착시키는 처리이다.

분말 활성탄으로서는 평균 입경이 15～50 마이크론, 바람직하게는 25～45 마이크론, 더욱 바람직하게는 약 35 마이크론; 최대 입경이 200 마이크론 이하, 바람직하게는 170 마이크론 이하, 더욱 바람직하게는 150 마이크론 이하, 예를 들어 147 마이크론 이하의 것이 사용된다. 그 첨가량은 고형분에 대하여 5% 이하, 바람직하게는 0.1～3%, 더욱 바람직하게는 0.5～1.5% 로 하는 것이 좋고, DFA III 조액의 조성에 따라 적절히 규정한다.

고액 분리 처리로서는 하이프로 수퍼셀 (Hi-Flo Supercell; 와코쥰야쿠 제) 이나 규조토 여과 등의 여과 보조제를 사용하는 여과 (예를 들어, 세라믹 여과기에 의한 여과: 닛폰 폴 (주) 제 PR-12 형이 사용가능), 멤브레인 필터 (MF) 여과, 연속 원심 분리법, 분자 체법, 역침투막법, 경우에 따라서는 한외 여과 (UF) 막 중 적어도 하나가 적절히 이용된다. 고액 분리는 상압, 가압, 또는 감압의 적어도 어느 하나로 실시된다.

상기 중에서, 예를 들어, 한외 여과막 (UF 막) 을 사용하는 여과, 멤브레인 필터 (MF) 여과, 연속 원심 분리 처리에 의하면, 규조토 등의 여과 보조제를 사용하지 않고, 직접 고액 분리 할 수 있다. MF 막으로서는 예를 들어 세라믹막 (예를 들어, 츠키시마 기계 (주) 상품명 Dahlia) 등을 사용할 수 있고, 연속 원심 분리 (5,000～25,000rpm, 바람직하게는 8,000～15,000rpm; 6,500～10,000G, 바람직하게는 7,500～9,500G: 예를 들어 10,000rpm, 8,200G) 에 의하면, DFA III 결정 (결정입경 250～500㎛) 과 미세결정 (DFA III 이외의 결정, 주로 4, 5 당류: 결정 입경 100㎛ 이하) 을 분리할 수 있기 때문에, 조결정 시럽이나 결정 시럽의 고액 분리에도 적용할 수 있다.

고액 분리하여 얻은 여과액은 이것을 농축한다. 농축은 통상적인 방법에 의해서 행하지고, 예를 들어 증발 농축 캔 등이 사용된다. 얻어진 농축액은 조결정 모액으로서, 증발 결정화 또는 냉각 결정화 등 통상적인 방법에 따라서 조결정화 처리한다. 조결정화된 모액은 조결정과 조결정 시럽으로 분리되지만, 이것에는 원심 분리가 이용된다.

결정화된 모액으로부터 분리된 조결정 시럽 및 결정 시럽의 여과에는 원심 분리, 예를 들어 연속 원심 분리 (예를 들어, 알파ㆍ라발사 제) 를 사용한 고액 분리가 이루어진다. 시럽 중에는 미결정의 DFA III 이외의 프룩토오스 중합도가 다른 올리고당이 함유되어 있다. 프룩토오스 중합도가 높을수록, 결정화를 하기 쉽고, 결정의 입경이 작다는 것이 새롭게 판명되었다. 이 성질을 이용하여 DFA III 과 다른 올리고당을 분류할 수 있다. 그럼으로써 DFA III 이외의 올리고당이 제거되어 DFA III 이외의 올리고당의 순환 축적을 방지할 수 있고, DFA III 의 결정화 원료의 순도 저하를 억제할 수 있다. 이 DFA III 이외의 올리고당이 순환 축적되면 조결정 모액 (농축액) 의 순도가 저하되어 효율적 (공업적) 으로 결정화할 수 있는 순도 (조결정의 경우, 순도 60% 이상) 를 확보하기가 어려워진다. 특히, 조결정 모액 (농축액) 의 순도 저하를 막기 위해 시럽의 제조계 밖으로 배출하는 방법도 있지만 DFA III 의 손실이 되기 때문에 피하는 편이 좋다.

DFA III 함유액 (조액) 의 청정 여과 처리에 의해서 얻은 여과액은 통상적인 방법에 의해서 농축한다. 예를 들어, 설탕 등의 제조에서 사용되는 칼란드리아(calandria)형 농축 효용 캔에 의해 농축시켜 농축액을 얻는다. 농축액은 농도 R-Bx 60～85, 바람직하게는 65～80, 예를 들어 77 정도로 농축하면 된다.

농축액은 조결정화하지만, 결정 캔을 사용하는 증발 결정화, 냉각 결정화 등 상용되는 결정화 처리가 적절히 이용된다. 증발 결정 캔은 예를 들어 설탕 제조용으로서 사용되고 있는 결정 캔이면 된다. 냉각 결정 캔은 설탕 제조용으로서 사용되는 것과 동일한 형상의 가로형 또는 세로형의 결정화 장치(Crystallizer)가 사용된다. 이와 같이, 결정 캔에 공급되는 DFA III 을 함유한 액체를 조결정 모액 (농축액) 이라고 한다. DFA III 을 조결정화할 때, 결정 캔 내에 결정이 부착되지 않는 처치를 취하면 좋다. 예를 들어 교반기를 그것에 부설하면 결정률의 상승 효과가 있다. 원심 분리기는 설탕 제조용으로 사용되고 있는 것이면 된다. DFA III 조결정을 건조시키는 경우에는 상압의 경우, 50～100℃ 의 온도조건 하에서 실시한다. 또, 감압 건조도 가능하다.

조결정화 공정에 의해 결정이 석출된 모액 (농축액) 에 관해서, 고액 분리를 하여, 조결정 (DFA III 순도는 95～98% 정도로까지 도달한다) 과 조결정 시럽으로 분리한다. 고액 분리 처리는 앞서 서술한 방법으로 실시하면 되고, 예를 들어 상기한 바와 같이 원심 분리기 (500～6,000rpm, 바람직하게는 1,000～5,000rpm, 예를 들어 2,000～4,000rpm, 500G～3,000G, 바람직하게는 800～2,000G, 예를 들어 약 1,200G) 로 양자를 분리하고, 조결정 시럽은 고액 분리하거나 또는 하지 않고, 원하는 경우, 정제 공정으로 되돌려보내어, 조결정은 물 또는 온수에 재용해하여 재용해액으로 하고, 이것을 제품 결정화용의 결정 모액용의 DFA III 정제액으로서 사용한다.

재용해액 (DFA III 정제액: R-Bx 는 10～60, 바람직하게는 20～55, 더욱 바람직하게는 40～50, DFA III 순도는 90% 이상, 바람직하게는 90～98% 가 되고, 예를 들어 95～98% 정도로까지 도달한다) 은 상기 조결정의 조건과 동일하게, 청정 여과, 여과액의 농축, 농축액 (제품 결정 모액) 의 제품 결정화, 제품 결정 및 결정 시럽의 분리, 제품 결정의 건조, 포장, DFA III 결정 제품 (순도 98～99% 이상, 색이 없을 뿐만 아니라 냄새도 없는 고도로 정제된 결정) 을 제조한다. 또, 결정으로부터 분리한 시럽 (결정 시럽, 조결정 시럽) 은 원하는 경우, 고액 분리하거나 또는 여과하지 않고, DFA III 함유액으로부터 DFA III 의 제품 결정에 이르는 전체 정제 공정 (도 I 의 플로) 중 적어도 하나로 되돌려보낸다.

또한, 본 발명에서는 크로마토 분리법을 이용하여 DFA III 결정을 제조하는 것도 가능하다. 즉, DFA III 결정화 전체 정제 공정 (도 1) 에서 생성하는 각종 생성물을 크로마토 처리원액 (R-Bx: 40～75) 으로 하고 이것을 크로마토 처리하여 DFA III 을 정제하여 결정화하는 것이 가능하다. 그 크로마토 처리에 의한 정제 플로의 일례를 도 2 에 나타낸다.

크로마토 처리원액 (R-Bx: 40～75) 은 크로마토로 처리하여, DFA III 분획을 분리한다. 이미 기술한 재용해액 (DFA III 액) 과 동일한 정제도를 갖는 DFA III 풍부 분획은 DFA III 정제액으로 하고, 이것을 청정 여과, 농축, 결정화함으로써 제품 결정을 제조할 수 있고 (루트 A), 또는 상기 재용해액 (DFA III 액) 에 첨가하여 DFA III 정제액으로 하고, 이것을 결정화할 수도 있다 (루트 B). 또한, DFA III 풍부 분획과는 달리 DFA III 함량이 낮은 DFA III 비풍부 분획 및 극히 소량밖에 DFA III 을 함유하지 않는 비 DFA III 분획에 관해서는 전자는 제조 플로 (도 1 에 나타내는 바와 같은 DFA III 함유액으로부터 DFA III 제품에 이르는 전체 정제 공정) 의 적절한 장소에 되돌려보내면 되고 (루트 C), 후자에 관해서 정제 공정에 도입하거나, 경우에 따라서는 폐기한다 (루트 D).

DFA III 을 함유하는 액체 (순도 40% 이상) 를 크로마토 처리하는 경우, 처리액의 DFA III 분획은 순도 70～98% 의 것이 얻어지므로, DFA III 순도 85% 이상, 바람직하게는 90～95%, 경우에 따라서는 95～98% 의 DFA III 풍부 분획은 루트 A 에 따라서, 청정 여과, 농축, 제품 결정화할 수 있다. 따라서, 예를 들어 조결정화 공정을 거치지 않고 조결정용의 모액 (농축액) 을 크로마토 처리하여 DFA III 분획 (DFA III 풍부 분획) 을 분리하고, 이것을 DFA III 정제액으로서 활성탄 처리 여과 후, 이 농축액을 제품 결정 모액으로서 사용하는 것 이외에는 상기한 것과 동일하게 조작하여, 냄새도 없이 고도로 정제된 DFA III 결정제품을 얻을 수 있다. 물론, 이 분획을 재용해액에 첨가하여 DFA III 정제액으로서 사용하는 루트, 예를 들어 루트 B 라도 가능하다. 또한, 상기에서 분리한 DFA III 비풍부 분획은 루트 C 에 따라서, 정제 공정 (DFA III 함유액～DFA III 제품의 전체 정제 공정) 예를 들어 도 1 의 적절한 장소에 되돌려보내므로, 전체적으로 낭비나 손실을 발생시키지 않고, 본 플로를 순환시켜 철저하게 효율화할 수 있다.

또한, 매우 불순물 함량이 적은 이눌린, 예를 들어 프룩토오스의 중합도가 10 이상, 바람직하게는 10～60 이고, 다당류 (polysaccharide) 함량이 80% 이상, 바람직하게는 100% 의 이눌린을 원료로 하고, 그리고 프룩토트랜스퍼라아제로서 정제 효소를 사용하여 이것을 처리하고, 그리고 얻어진 DFA III 함유액을 크로마토 처리하고, 얻어진 DFA III 풍부 분획은 활성탄 청정 여과 등을 하지 않고, 직접, 농축시켜 결정화할 수 있다. 얻어진 DFA III 결정은 또한 냄새, 착색이 전혀 없는 매우 고순도의 결정이며, 고순도 이눌린 및/또는 정제 프룩토실트랜스퍼라아제를 사용함으로써, 청정 여과를 하지 않고, 더구나, 분리, 농축, 결정화의 각 처리는 불과 1 회로 냄새가 없는 고순도의 DFA III 결정을 매우 효율적으로 제조할 수 있다.

크로마토 분리법으로서는 그 분리 장치는 고정상 방식 (원패스 방식), 연속 방식 (유사 이동상 방식), 반연속 방식 (고정상 방식과 연속 방식의 조합) 을 적용할 수 있다. 그 장치의 충전 이온 교환 수지로서는 크로마토용의 Na 형, K 형, Ca 형 등의 강산성 이온 교환 수지가 사용된다. 그 수지는 균일 입경의 스티렌디비닐벤젠계 수지 등이 사용되고 있다. 이온 교환 수지의 메이커로부터 여러 가지의 크로마토용 수지가 판매되고 있는데, 당액에 적용할 수 있는 것이면 어느 것이나 사용할 수 있다. 크로마토 처리는 결정 모액의 DFA III 순도가 낮은 경우, 그 순도를 올리는 데에도 적절히 사용된다.

본 발명은 또한, DFA III 순도가 70% 미만인 DFA III 함유액 (조결정 모액) 에 관해서도, 공업적으로 결정시킬 수 있다.

본 발명에서는 DFA III 순도가 70% 미만인 DFA III 함유액의 정제도를 높이기 위해서, DFA III 함유액을, 효모 처리, 청정 여과 처리 또는 크로마토그래피 처리의 적어도 하나로 처리함으로써 DFA 함유액의 DFA III 순도를 대폭 상승시킬 수 있다.

본 발명은 DFA III 함유액을 효모 처리, 청정 여과 처리, 크로마토 처리의 적어도 하나로부터 선택되는 처리에 의해서 정제하는 방법에 관한 것이고, 본 방법을 이용함으로써 고순도의 DFA III 결정을 효율적으로 공업 생산할 수 있는 것이다. DFA III 함유액으로서는 DFA III 을 함유하여 후기하는 조건을 만족하는 액상물을 모두 포함하는 것으로서, 프룩토오스의 중합체, 예를 들어 이눌린 또는 이눌린 함유액에 프룩토실트랜스퍼라아제를 작용시켜 얻은 DFA III 생성 반응액 이외에, 각종 DFA III 생합성액, DFA III 화학 합성액이나 본 정제 공정에서 생성되는 각종 정제도의 DFA III 을 함유하는 액체, 또는 시판중인 DFA III 을 용해한 액체 등 DFA III 을 함유하는 액체가 모두 포함된다.

예를 들어 이눌린 (및/또는 이눌린 함유액) 과 효소를 사용하여 DFA III 을 제조하는 경우, 이눌린은 글루코오스 1 개에 프룩토오스가 다수 중합된 것으로, 주로 돼지감자 (또는 치커리, 우엉 등) 로부터 추출한 것이 사용되기 때문에, 중합도 및 순도가 다른 것이 시판되고 있을 뿐만아니라, 이것을 효소에 의해서 분해하면, 생성된 반응액에는 DFA III 이외의 프룩토오스 중합물, 효소, 효소원으로서 사용한 미생물, 그 배양물, 색소, 냄새 등의 불순물이 포함되는 것은 불가피하고, 이 때문에, 종래에는 정제된 DFA III, 나아가서는 순수한 DFA 결정 또는 그 함유물을 공업적으로 저비용으로 효율적으로 얻을 수는 없었다.

DFA III 함유액으로부터 DFA III 을 결정화할 때, 공업적, 경제적으로 결정가능한 DFA III 의 순도는 60% 가 한도이다 (바람직하게는 70% 보다 높은 것이 좋다). 바꾸어 말하면, DFA III 순도가 60～70% 이하인 DFA III 함유액으로부터 공업적, 경제적으로 DFA III 을 결정화할 수 없고, 종래 순도 70% 이하의 DFA III 함유액 (순도 60% 이하의 DFA III 함유액의 경우는 더더욱) 은 공업적 결정화에 채산성이 부족하기 때문에 사용할 수 없었던 것이다.

본 발명은 이러한 현상을 감안하여, 종래 공업적으로 사용할 수 없었던 DFA III 순도가 낮은 DFA III 함유액으로부터 DFA III 을 고도로 정제하는 방법을 개발하여, 예를 들어 순수한 DFA III 결정이 얻어질 정도로 고순도로 정제된 DFA III 을 효율적으로 얻기 위해서, 각 방면에서 연구한 결과, DFA III 함유액을 크로마토그래피 처리 (이하, 크로마토 처리라고도 한다), 청정 여과 처리, 효모 처리의 적어도 하나로 처리하는 것을 골자로 하는 신규방법을 개발한 것이다.

DFA III 함유액으로서는 상기한 바와 같이, DFA III 생합성액, 화학 합성액, 시판 DFA III 용해액 기타 DFA III 을 함유하지만 DFA III 순도가 낮은 DFA III 함유 액체를 모두 사용할 수 있다.

본 발명에서는 DFA III 함유액으로서는 고순도 DFA III 함유액을 사용할 수 있음은 물론, 상기한 바와 같이 순도가 낮은 DFA III 함유액도 사용할 수 있어, 효모 처리, 청정 여과 처리, 크로마토 처리의 적어도 하나의 처리에 의해서, 종래 경제적 내지 공업적 이유에 의해서 사용할 수 없었던 순도가 낮은 DFA III 함유액 (순도 70% 이하인 것, 60% 이하인 것도 가능) 도 원료로서 사용가능해져 효율적으로 DFA III 을 정제하는 것이 비로소 가능해졌다.

먼저, 효모 처리는 DFA III 함유액과 효모를 접촉시키면 되고, 양자를 혼합하여 필요하다면 교반하여 인큐베이트해도 되고, 통기하면서 배양해도 된다. 효모로서는 빵 효모, 청주 효모, 맥주 효모, 포도주 효모, 기타 각종 효모를 적절히 사용할 수 있고, 드라이 효모, 압착 효모, 기타 각종 시판품도 충분히 사용할 수 있다. 효모에 의해서, 2 당류, 단당류가 분해되거나 균체 내에 도입되므로, 효모 처리는 주로 2 당류 및/또는 단당류를 계 밖으로 제거하는 데 유용하다.

청정 여과 처리는 DFA III 함유액의 분말 활성탄 처리의 청정 등을 목적으로 하는 처리와, 고액 분리를 목적으로 하는 처리가 포함된다. 고액 분리 처리는 원심 분리, 여과, 규조토 등의 여과 보조제를 사용하는 여과, 멤브레인 필터를 사용하는 방법, 세라믹막을 사용하는 방법, 한외 여과막을 사용하는 방법, 기타 고체와 액체를 분리하는 방법을 전부 포함하는 것이다.

그리고, 크로마토 처리는 크로마토용의 이온 교환 수지를 사용하여, 고정상, 연속상 (의사 이동상), 반연속 등 각 방식에 의해서 적절히 실시할 수 있고, 2 당류와 다른 당류를 분리하는 것이다. 따라서, 크로마토 처리에 의하면, 2 당류인 DFA III 과 다른 당류를 효율적으로 분리할 수 있다.

이와 같이, 2 당류로서는 DFA III 만이 함유되어 있는 경우에는 크로마토 처리가 DFA III 의 정제에 매우 유효하다. 그러나, 크로마토 처리에서는 DFA III 과 다른 2 당류를 분리하는 것은 쌍방 모두 2 당류이기 때문에 매우 곤란하다. 따라서, 예를 들어 이눌린을 이눌린 분해 효소 처리하여 얻은 DFA III 함유액 중에 2 당류인 DFA III 외에 이또한 2 당류인 자당도 함유되는 경우, 크로마토 처리로서는 DFA III 과 자당 (다른 2 당류) 의 분리가 매우 어려워진다. 따라서, 이러한 경우에는 다른 처리를 조합함으로써 DFA III 의 정제를 효율적으로 실시할 수 있고, 예를 들어 전처리로서 효모 처리를 하여 DFA III 이외의 2 당류를 계 밖으로 제거한 후, 크로마토 처리를 실시하면 된다.

이와 같이, 본 발명에서는 DFA III 함유액에 따라, 효모 처리, 고액 분리 처리, 크로마토 처리 중, 가장 적합한 처리를 실시하면 되고, 필요한 경우에는 이들 처리를 적절히 병용하거나 조합하거나, 또는 각 처리나 복수의 처리를 더욱 반복함으로써, 종래 공업적으로 사용할 수 없었던 저순도 DFA III 함유액도 효율적으로 정제하는 것이 비로소 가능해졌다.

예를 들어, DFA III 생합성액에 관해서는 프룩토오스의 중합체를 원료로서 사용하고, 이것에 프룩토실트랜스퍼라아제를 작용시켜 제조할 수 있다.

그 경우, 원료로서 사용하는 프룩토오스의 중합체로서는 상기한 바와 같이 이눌린 등의 천연 중합체 외에, 생합성 및/또는 화학 합성한 중합체의 어느 것이나 사용할 수 있지만, 프룩토오스의 중합도는 2 이상, 바람직하게는 10 이상이고, 10～60 이 더욱 바람직하다. 또한, 중합체에 있어서의 다당류의 함량은 70% 이상이 바람직하게, 더욱 바람직하게는 100% 이다. 그러나, 본 발명에서는 순도가 낮은 DFA III 함유액도 효율적으로 정제할 수 있기 때문에, 이러한 고급 프룩토오스 중합체 외에, 저급의 것도 적절히 가능하다.

또, 본 발명에 있어서, 프룩토오스 중합체는 프룩토오스만이 중합된 호모 폴리머 외에, 다른 당을 포함하는 헤테로폴리머의 어느 것이나 되고, 예를 들어 이눌린은 프룩토오스 중합체에 글루코스가 1 분자 결합된 일종의 헤테로폴리머이다. 또한, 프룩토오스 중합체에는 프룩토오스 중합체 함유물도 포함된다.

이들 프룩토오스의 중합체 중, 천연 유래물로서는 이눌린이 유리하게 사용되지만, 생합성 또는 화학 합성한 것도 사용되고, 예를 들어 다음과 같이 하여 생합성한 것도 사용가능하다.

예를 들어, 수크로오스에 프룩토오스 합성 효소 (예를 들어, 이눌린 합성 효소) 를 작용시켜 이눌린을 생합성할 수 있다. 이눌린 합성 효소로서는 수크로오스: 수크로오스 1-프룩토실트랜스퍼라아제 (SST) 및 β-(2-1)프룩탄: β-(2-1)프룩탄 l-프룩토실트랜스퍼라아제 (FFT) 등이 사용된다. 또한, 아스페르길루스 시도위 (Aspergillus sydowy) IFO 4284, IFO 7531 이나 스트렙토코커스 뮤탄스 (Streptococcus mutans) 등의 미생물이 생성하는 효소가 이눌린 유사물을 생산하는데, 이눌린 유사물도 프룩토오스의 중합체 및/또는 그것의 함유물이므로, 본 발명에서의 DFA III 함유액의 원료로서 사용할 수 있다.

또, 생합성법 등 프룩토오스 중합체의 제조공정에서, 글루코오스가 부생하는 경우에는 글루코오스이소머라아제 등 글루코스를 프룩토오스로 변환시키는 효소를 사용하여 글루코스를 프룩토오스로 변환시키거나, 또는 글루코오스옥시다아제 등 글루코오스를 글루콘산으로 변환시키는 효소를 사용하여 글루코오스를 다른 물질로 변환시켜 글루코오스량을 저하시켜 이눌린 (또는 이눌린 유사물) 의 수율을 높일 수 있다. 또한, DFA III 함유액에 효모를 첨가하고, 통기 교반 배양 등의 효모 처리를 하여 DFA III 이외의 불순물을 효모로 소비시켜 크로마토 처리 전의 DFA III 함유액의 순도를 높여도 된다.

이하, DFA III 함유액으로서, 프룩토오스의 중합체를 프룩토실트랜스퍼라아제 처리하여 얻은 것을 예로 들고 설명하겠지만, 프룩토오스의 중합체로서는 이눌린을 예로 들고 설명한다.

프룩토오스 단위를 전이 촉매하여, DFA III 같은 올리고당을 합성하는 효소는 넓은 의미로 "프룩토실트랜스퍼라아제" 이다. 프룩토실트랜스퍼라아제는 크게 2 종류로 대별된다: (1) 프룩토오스 단위 (수크로오스 등의 2 당류 포함) 를 기질로 하고, 이것을 가수ㆍ전이하여 올리고당을 합성하는 효소 (경우에 따라 다당도 합성한다). (2) 이눌린이나 레반 등의 프룩탄을 기질로 하고, 이것을 가수ㆍ전이하여 올리고당을 합성하는 효소. 발명자들이 이눌린으로부터의 DFA III 제조에 사용한 것은 프룩토실트랜스퍼라아제 중에서도, 학명이 이눌린프룩토트랜스퍼라아제이고, (2) 의 종류에 속한다. 이눌린프룩토트랜스퍼라아제 (이하, 간단히 IFT 라고 한다) 를 생성하는 미생물로서는 아스로박터속, 클루이베로마이세스속, 스트렙토마이세스속, 엔테로박터속에 속하는 각종 세균, 효모, 방선균 등이 보고되어 있고, 이들을 적절히 사용할 수 있다. 이들 미생물을 배양하여, 정제 효소, 비정제 효소, 효소 함유물, 미생물 배양물 등의 형태로서 적절히 사용된다.

또, 이눌린의 효소 분해에 의한 DFA III 의 생성은 DFA III 단독의 것이 생성되는 것이 가장 바람직하지만, 실제상으로는 DFA III 이외의 프룩토오스의 중합물이 여러 가지 생성된다. 그것이 효소 분해액의 순도 저하의 원인으로 되어 있다. 이 때문에, 크로마토그래피 처리를 실시하는데, 원하는 경우에는 DFA III 을 결정화하기 위한 원료로서, 이눌린 이외의 불순물 혼입량이 될 수 있는 한 적은 것이나, 또한 DFA III 이외의 프룩토오스 중합물이 생성되지 않는 효소의 선택이 필요하다. 그리고, 이와 같이 정제된 DFA III 함유액이 얻어지면, 이것을 DFA III 조액으로서, 즉시 본 발명에 관한 청정 여과, 결정화 공정에 들어갈 수 있다.

이눌린을 이눌린 분해 효소로 분해한 DFA III 함유액의 DFA III 순도의 일례를 후기하는 A～D 사의 제품에 대해서 나타내면 다음과 같다:

A 사 제품: 75%; B 사 제품: 59%; C 사 제품: 52%; D 사 제품: 78%.

그리고, D 사 제품을 이눌린 효소 분해하여 결정화할 때의 시럽의 DFA III 순도의 일례를 나타내면 다음과 같다:

조결정 시럽 53%; 제품 결정 시럽 95%

상기한 IFT 처리 등의 효소처리에 의해서 얻은 DFA III 함유액은 물론, 그 밖의 방법으로 조제한 각종 DFA III 함유액은 크로마토그래피 처리 (이하, 크로마토 처리라고도 한다), 효모 처리, 청정 여과 처리의 적어도 하나로 처리하고, 불순물을 제거하고 정제하여 각종 정제도의 DFA III 을 얻을 수 있다.

그 경우, 정제도가 높은 DFA III 함유액으로부터는 정제도가 높은 DFA III (즉시 고순도 결정화 공정에 들어갈 수 있을 정도로 정제도가 높은 것) 이 얻어지고, 정제도가 낮은 DFA III 함유액으로부터는 정제도가 낮은 DFA III 이 생성되지만, 크로마토 처리나 다른 처리를 반복하는 것만으로도 정제도를 높일 수 있다. 따라서, 본 발명에 의하면, 각종 정제도의 DFA III 함유액을 자유롭게 사용하여 원하는 정제도의 DFA III 을 얻을 수 있다.

크로마토 처리에 의해서 DFA III 함유액으로부터 불순물이 제거되고 고도로 정제된다. 또한, 정제도가 낮은 분획은 다시 또는 그 이상의 횟수로 크로마토 처리하거나, 다른 방법으로 정제할 수 있다.

DFA III 함유액은 그대로 크로마토 처리해도 되지만, 농축 처리 등의 농도를 높이는 처리에 의해 더한층의 효율화가 도모된다. 농축 처리로서는 예를 들어 농축 캔에 의한 농축 (예를 들어, 50～80℃, 140mmHg 이하) 을 들 수 있지만, 기타 각종 농축 처리가 적절히 가능하다.

본 발명의 바람직한 예의 하나로서, 다음과 같은 정제 방법이 예시된다. 먼저, 원료로서 시판되고 있는 또는 수크로오스로부터 생합성한 이눌린을 사용하여, 이것에 IFT 를 접촉시켜 효소 처리하고, 얻어진 DFA III 함유액을 크로마토 처리하고, 오염된 불순물을 제거하여 DFA III 의 정제를 실시하는 것이다. 그리고 그 동안 원한다면 효모 처리 등의 각종 정제를 적절히 실시할 수 있다.

본 발명에 의하면, 순도가 낮은 DFA III 함유액이더라도 크로마토 처리, 효모 처리, 청정 여과 처리의 적어도 한개로 처리함으로써, 정제된 DFA III 정제액을 효율적으로 공업 생산할 수 있으므로, 정제된 DFA III 은 각종 용도에 널리 이용할 수 있고, 본 발명에 의하면 DFA III 함유액을 즉시 결정화할 수 있는 정도로까지 고도로 정제할 수 있다. 따라서 순도가 95 w/w% 이상이라는 매우 고순도의 DFA III 의 결정, 결정 파쇄물, 또는 과립상물을 제조할 수 있어, 의약이나 보충물 등으로서 각종 용도에 광범위하게 이용할 수 있다.

또한, 본 발명은 이눌린프룩토트랜스퍼라아제 (간단히 IFT 라고도 한다) 를 비롯한 프룩토실트랜스퍼라아제의 효율적 대량 생산 방법도 포함하는 것이다.

본 발명에서는 이눌린의 첨가에 의해서 활성을 저하시키지 않고, 본 효소의 생산량이 비약적으로 증대하는 것을 처음으로 발견한 것으로, 200 리터 이상의 대용량 탱크에서의 대량 배양에서도 IFT 를 대량 생산할 수 있다.

본 효소를 생성하는 미생물 (균체 외에 본 효소를 분비하는 것, 및/또는 균체 내에 본 효소를 축적하는 것을 불문한다) 을 배양하여 배양물로부터 본 효소를 취득함에 있어서, 이눌린을 첨가한 배지를 사용하여 배양을 실시할 필요가 있다. 이눌린의 첨가량은 0.1～10%, 바람직하게는 0.5～5% 이고, 예를 들어 이눌린을 약 1% 첨가한 배지를 사용할 수 있다.

또한, 추가로 배지에는 효모 추출물을 미량 영양원으로서 첨가하면 바람직하다. 그 때, 효모 추출물을 0.02～2.0%, 바람직하게는 0.1～1.5% 첨가하면 되고, 예를 들어 효모 추출물을 약 0.5% 첨가한 배지를 사용할 수 있다.

본 발명을 실시하기 위해서는 상기한 바와 같이 이눌린을 첨가한 배지 (바람직하게는 더욱 효모 추출물을 첨가한 배지) 에서 본 효소 생산균을 배양하면 된다. 그 때, 그 밖의 배지조성 및 배양조건 등에 특별한 한정은 없고, 사용하는 균에 따라 적절히 실시하면 되지만, 배양시의 통기량에 관해서는 0.5vvm 이상, 바람직하게는 1～2vvm 으로 하는 것이 좋다.

상기한 본 발명에 관한 배양 방법에 의하면 본 효소는 대량 생산할 수 있어, 종래법에서는 효소 조제량이 1～많아야 수십 유니트 (효소 단위)/㎖ (배양액) 이었던 것이, 본 방법에서는 고활성 (수백 유니트 (효소 단위)/㎖ (배양액) 이상) 으로 하는 것이 처음으로 가능하게 되었다는 현저한 효과가 나타난다.

더구나, 상기 현저한 효과는 실험실이나 소규모 생산 레벨에서 발휘되는 것은 물론, 용량이 50 리터 이상, 예를 들어 100 리터 이상의 대형 발효 탱크를 사용하는 대형 미생물 배양 장치를 사용한 경우에도 발휘된다는 특징을 갖고, 200 리터 용량의 단지 발효기 (jar fermenter) 의 사용도 확인되어 있고, 그 이상의 대용량 발효 탱크, 예를 들어 300～500 리터 용량의 발효탱크도 사용할 수 있다.

이와 같이 본 발명은 효소의 대량 생산을 최초로 가능하게 한 것이며, 더구나 효소 활성을 조금도 저하시키는 경우가 없는 것으로, 그 포인트를 예시하면 다음과 같다.

(배양 장치에 관해서)

(1) 대형 미생물 배양 장치를 도입한 것.

프룩토실트랜스퍼라아제의 조제는 실험실 레벨에서는 성공하였으므로, 용이하게 생각되는 발전 항목이기도 하지만, 이들의 유도 효소는 배양 장치를 대형으로 함으로써, 활성치가 실험실 레벨보다 현저히 저하되는 경우가 많이 있다. 200 리터 용량 이상의 탱크 도입으로, 사실 활성치가 상승한 것은 새로운 중대 발견이다.

(배양 방법에 관해서)

(2) 효소의 유도 물질인 이눌린의 최적 첨가량을, 대형 미생물 배양 장치에 맞춰 결정한 것.

(3) 효소의 생산량 증가, 및 안정성 상승의 요소로서, 효모 추출물을 발견하고, 그 최적 첨가량을 대형 미생물 배양 장치에 맞춰 결정한 것.

(4) 효소의 생산량 증가의 요소로서, 배양 중의 공기의 통기량을 알아내고, 그 최적량을 대형 미생물 배양 장치에 맞춰 결정한 것.

사용하는 미생물로서는 아스로박터속, 클루이베로마이세스속, 스트렙토마이세스속, 엔테로박터속, 바실루스속, 미크로박테륨속에 속하는 미생물 외에, 각종 세균, 효모, 사상균, 방선균 등을 적절히 사용할 수 있다.

본 발명에서 사용할 수 있는 미생물의 비한정예를 이하에 나타낸다: Arthrobacter ureafaciens, 동 (IFO 12140), 동(ATCC 21124), A. pascens (IFO 12139), 동 T13-2, A. globiformis (IFO 12137), 동 C11-1, A. nictinovorans GS-9, A. ilicis OKU 17B, Arthrobacter sp., 동 H65-7, 동 AHU 1753 (FERM BP-8296), 동 MCI-2493; Kluyveromyces marxianus (ATCC 12424), 동 CBS 6556, K. marxianus var. marxianus, 동 (IFO 1735); Streptomyces fumigatus, S. rochei, 동 E87, Streptomyces sp., 동 MCI-2524; Pseudomonas fluorescens, 동 No. 949; Bacillus Circulans, 동 OKUMZ. 31B, 동 MCI-2554, Bacillus sp., 동 Snu-7; Aureobacterium sp., 동 MCI-2494; Microbacterium sp., 동 AL-210; Enterobacter sp., 동 S45; Aspergillus fumigatus; Penicillium purpurogenum.

본 효소를 생산함에 있어서는 예를 들어 상기한 바와 같은 본 효소 생산균을 사용하고, 이미 기술한 특정한 배양조건 외에는 통상적인 방법에 따라서 배양을 하고, 배양물 중으로부터 효소 제조의 통상적인 방법에 따라서 본 효소를 추출 정제하면 된다. 예를 들어, 얻어진 배양물을 원심 분리하여 제균하고, 얻어진 여과액에 황산암모늄 (65% 포화) 을 첨가하여 염석하고, 석출된 침전물을 원심 분리에 의해 취득하여 소량의 물에 현탁시킨 후, 투석하여 조효소액을 얻을 수 있다. 그리고 원한다면, 통상적인 방법에 따라서 예를 들어 비정제 효소를 크로마토그래피 처리 등 기지의 정제 방법을 1 종 또는 2 종 이상 조합하여 정제 효소로 할 수 있다.

또, 본 효소 생산균이 상기한 바와 같이 본 효소를 균체 밖으로 분비하는 타입이 아니라, 균체 내에 축적하는 타입인 경우에는 배양물로부터 균체를 분리하고, 얻어진 균체를 초음파 처리 등 상용되는 균체 파괴 처리에 대하여 균체를 파괴하고, 그 후에 상기한 바와 같이 하여 효소를 분리, 정제하면 된다.

더구나, 본 발명에서는 소규모로 본 효소를 생산할 수 있는 것은 물론, 특히 상기한 배양 조건에 의하면, 200 리터 이상, 나아가서는 500 리터 이상의 대용량 발효 탱크를 사용하더라도, 아무런 폐해도 일어나지 않고, 효소력가를 저하시키지 않고, 고활성의 효소를 대량 생산할 수 있다는 공업상 특히 우수한 효과를 나타낸다.

본 발명에서는 효소로서는 분리 정제한 효소 외에, 조정제 효소, 미생물 배양물, 동 처리물 (배양 상등액, 분리 균체, 균체 파쇄물 등) 도 사용가능하다. 또, DFA III 결정을 식품 용도로 사용하는 경우에는 효소로서 프룩토실트랜스퍼라아제, 특히 IFT 를 사용하는 것이 바람직하고, 상기 미생물 유래의 효소 외에, 이번에, 특허 생물 기탁 센터에 FERM BP-8296 으로서 기탁된 Arthrobacter sp. AHU 1753 주는 IFT 생산능이 우수하므로, 본 효소 생산균으로서 바람직하게 사용가능하다.

이렇게 하여 대량 생산된 효소는 효소 자체로서 시약이나 연구용으로 이용되는 것 이외에, 다수의 응용이 가능하고, 그 하나로서, 본 효소를 이눌린에 작용시킴으로써, 각종 올리고당을 합성할 수 있다. 예를 들어 프룩토오스의 중합도가 l0 이상, 바람직하게는 10～60 의 이눌린에 프룩토실트랜스퍼라아제를 작용시킴으로써 DFA III 함유액을 제조할 수 있지만, 그 때, 이눌린프룩토트랜스퍼라아제 (탈중합) 로서, 아스로박터 SP (Arthrobacter sp.) AHU 1753 주 (FERM BP-8296) 유래의 정제 효소, 비정제 효소, 효소 함유물, 균체, 균배양물, 동 처리물의 적어도 하나를 사용할 수 있다.

이렇게하여, 효율적으로 또한 저비용으로 DFA III 함유액을 제조하는 것이 가능해졌으므로, 예를 들어 이것에 분말 활성탄을 예를 들어 고형분에 대하여 5% 이하 첨가하여 청정화한 후, 고액 분리하여, 분리된 액상부를 농축한 후, 즉시 결정화하고, 필요하다면 이들의 조작을 반복하거나, 크로마토그래피 처리를 조합하거나 하고, 더욱 정제하면 냄새도 제거되어 매우 고순도의 결정 DFA III 을 얻을 수 있다.

이하, 실시예를 들고 본 발명을 더욱 상세하게 설명한다.

[실시예]

실시예 1

이눌린의 프룩토오스 중합도 (분자량 분포)

시판중인 이눌린을 구입하여 프룩토오스 중합도를 조사하였다. 하기 조건으로 액체 크로마토그래피 분석 장치를 사용한 크로마토그램을 도 3 에 나타낸다.

1) 이눌린의 분석 샘플

a) A 사 제품

b) B 사 제품

c) C 사 제품

d) D 사 제품

상기 샘플에 관련되는 카탈로그의 표시를 하기 표 1 에 나타낸다.

샘플	a	b	c	d
화학 구조 중합 범위 평균 중합도 생산 다당류 함량	GFn	GFn 18 설탕으로부터 효소 합성	GFn 2～60 10～12 치커리 추출 약 70%	GFn 10～60 20～25 이눌린의 분리 100%
GFn : G : 글루코오스 F : 푸룩토오스 n : 중합도

2) 분석조건

칼럼: Dionex, CarboPac PAl, 4 ×250mm I. D.

가드 칼럼: Dionex, CarboPac PAl Guard

칼럼 온도: 실온

용리액: 그래디언트

O 분 100분

비율(%) 비율(%)

1N NaOH 15 15

1M NaOAc 0 45

(1M 아세트산나트륨)

물 85 40

커브 No. - 2

검출기: Dionex, Pulsed Electrochemical Detector

검출 모드: Integrated Amperometry

펄스 전압:

E1: +0.05V (40Om 초),

E2: +0.75V (20Om 초),

E3: -0.15V (400m sec)

유속: 1.O㎖/분

레인지: 1μC

주입량: 각 0.1% 수용액을 5μl 주입

분석 사이클: 120분

3) 결과

각 크로마토그램의 유출 시간에 의한 피크치를 비교한다. 체류 타임의 경과에 따라서 각 피크는 중합도 (분자량) 가 높아진다.

(C 사 제품) 유출 시간 약 6.5분 에서 약 40분 사이에 약 40 개의 피크가 존재하고 있다. 이 피크의 상태로부터 유출 시간 6.5 분으로부터 14.5분 의 것이 많기 때문에 중합도가 낮은 다당류의 비율이 많다.

(D 사 제품) 유출 시간 약 14.5분 에서 약 46분 사이에 약 40 개의 피크가 존재하였다. 이러한 이유에서 비교적 중합도가 높은 다당류가 많다.

(B 사 제품) 유출 시간 약 7.9분 에서 약 30분 사이에 약 30 개의 피크가 있었다. 유출 시간 14.5분 이상의 비율이 많지만 14.5분 미만의 다당류도 포함된다.

(A 사 제품) 유출 시간 약 9분 에서 약 41분 사이에 40 개의 피크가 있었다. D 사 제품과 동일한 경향의 피크를 나타내었지만, 유출 시간 6.5 에서 14.5분 사이에도 다소 피크가 여기저기서 관찰되었다.

이들 결과와 카탈로그로 추찰하면 체류 시간 6.5분 의 중합도가 2 로, 14.5분 의 피크가 중합도 10 으로 예상된다.

실시예 2

(1) IFT 효소 생산량 및 이눌린으로부터의 DFA III 의 반응 수율

상기 시판품 4 종의 이눌린을 사용하고, 후기하는 프룩토실트랜스퍼라아제를 사용하여 효소 반응을 실시하고, DFA III 의 생성률을 조사하였다. 이눌린을 80℃ 의 온수에서 완전히 용해시킨 후, 60℃ 까지 냉각시킨다. 거기에 IFT 를 5000 유니트/kg 이눌린을 첨가하여 60℃, 24 시간 교반하면서 반응시킨다. 반응액의 IFT 효소 생산량을 하기와 같이 측정하였다. 또한, 반응액을 실활 (80℃) 시키고, 활성탄 (태합 활성탄 S) 및 규조토 (라디오라이트 700) 로 청정 여과하고, 청정 반응액을 액체 크로마토그래피 (이하 HPLC 라고 적는다. 칼럼: Shodex Sugar KS-801, 300 ×8mm I.D., 유속 1 ㎖/분, 칼럼 온도 80℃) 를 사용하여 DFA III 을 정량하였다. IFT 의 효소 생산량 및 DFA III 의 생성 수율의 결과를 표 2 에 나타냈다.

그 결과로부터 알 수 있는 바와 같이, 효소 생산량 및 DFA III 의 반응 수율 모두 D 사 제품이 가장 좋았다. 도 3 및 표 2 의 결과로부터 프룩토오스 중합도가 높은 분포의 것일수록, 즉 A 사 제품 및 D 사 제품은 중합도 10 이상의 것으로 예상되는데, 이들이 DFA III 수율이 좋았다. 또, 이눌린은 분자량 (중합도) 이 높아지면 용해성이 나빠 핸들링이 어려워지기 때문에 DFA III 의 공업 생산에는 중합도 100 정도가 한계이다.

(2) 효소 생산량 (효소 활성) 의 측정법

2㎖ 용량 튜브에 10% 이눌린 용액 0.5㎖ 와 0.1M 시트르산/NaOH 버퍼 (pH5.5) 0.45㎖ 를 넣고, 60℃ 의 온수욕에서 약 5 분간 가온하였다. 거기에, 조효소액 50μl 를 첨가하여 60℃ 에서 10 분간 반응시켰다. 비등수 중에 5 분간 유지함으로써 반응을 정지시켰다. HPLC 에 의해 생성된 DFA III 을 정량하였다. 1 유니트 은 1 분간에 1μmol 의 DFA III 을 생성하는 효소량으로 하였다.

DFA III 의 효소 반응 생성률
이눌린의 종류	효소 생산량 (유니트s/㎖)	DFA III 의 반응수율 (%)
a) A 사 제품 b) B 사 제품 c) C 사 제품 d) D 사 제품	96.2 80.3 68.9 102.4	71.3 57.8 53.8 76.5

실시예 3

이눌린으로부터 DFA III 의 제조

(1) 상기 D 사 제품 200kg 을 80℃ 의 온수 1000kg 에서 용해시키고, 60℃ 까지 냉각시킨다. 그 용액에 하기 효소 생산으로 얻어진 IFT 5000유니트s/kg 이눌린을 첨가하고, 60℃ 에서 24 시간 교반하여 DFA III 의 함유액을 생성시킨다. 이 반응완료액을 80℃ 로 올려 효소를 실활시킨다. 이 실활액에 고형분당 1% 의 비율로 태합 활성탄 S (후타무라 화학공업 제: 평균 입경 약 35 마이크론, 147 마이크론 이하) 를 첨가하여 60℃, 10 분간 교반한다. 이 완료액을 규조토 (쇼와 화학공업 제 라디오라이트 700) 여과를 실시하였다. 즉 세라믹 제의 통 (닛폰 폴 (주) 제 PR-12 형 세라믹 튜브) 의 외면에 상기 규조토를 프리코트해 두고, 통 내에 활성탄 함유 반응액을 가압통과시켜 가압 여과하고, 통 안으로 여과액을 회수하였다.

(2) 이 여과액을 농축 캔으로 농축 (60～70℃ 120mmHg 이하) 시킨다. 최종농도 R-Bx 77 까지 농축시킨 후, 그 모액을 결정화 공정으로 옮겼다. 결정은 냉각 결정화법을 실시하였다. 60℃ 의 농축액을 냉각 캔 외부에 냉각 외투 및 교반기가 형성된 캔에서, 23 시간에 걸쳐 15～20℃ 로 냉각시킨다. 결정이 석출된 모액을 분리기 (3000rpm, 1200G) 로 조결정과 시럽으로 분리한다. 그 조결정 (DFA III 순도 97%) 을 재용해하고, 얻어진 재용해액 (DFA III 정제액) 을 상기 조건과 동일하게 활성탄 처리, 규조토 여과를 하여 농축, 결정화 및 분리하고, 제품 결정 (DFA III 순도 99%) 을 얻는다. 얻어진 결정을 50℃ 에서 통풍건조시키고, DFA III 7.2kg (수분 0.1%) 이 얻어졌다. 이 결정은 착색도 없고 냄새도 인정되지 않았다.

(3) 상기 (1) 에서, 규조토 여과 대신에 멤브레인 필터 (MF) 여과를 실시하였다.

즉, 효소 반응완료액 (약 R-Bx20) 을 실활시키고, 이것에 대합 활성탄 S 를 고형분당 1% 첨가하여 60℃ 에서 10 분간 교반한다. 이것을, 0.14㎛ 의 멤브레인 필터 (츠키시마 기계 (주) 제: 세라믹막 TSK-TAMI Dahlia) 를 사용하여 여과하였다. 농축률은 10 배로 하였다. 결과를 도 4 에 나타낸다. 그 결과를 통해 알 수 있는 바와 같이, 투과액량의 저하도 관찰되지 않고 순조롭게 여과할 수 있음을 확인하였다. 투과액은 투명하였다.

(4) 상기 (1) 및 (2) 에서, DFA III 함유액 (효소 반응 완료액: 농도 R-Bx 60, DFA III 순도 78.6%, 기타 21.4% (주로 4 당류 및 5 당류)) 에 대해서, 이하에 의해서 크로마토 처리를 실시하여 하기 분획을 얻었다 (표 3). 이렇게 하여, 통액량 O.600～0.70OL/L-R 분획을 회수하여 DFA III 분획 (순도 97.3%) 을 얻었다. 이렇게 하여 크로마토 분획하여 얻은 DFA III 분획은 DFA III 풍부 분획으로서, 청정 여과한 후에 농축시켜 제품 결정 모액으로서 사용할 수 있는 것 이외에, 조결정 재용해액 (DFA III 정제액) 으로서 또는 첨가하여 사용할 수 있는 것도 확인되었다. 또한, DFA III 순도 76.8% 분획은 예를 들어 DFA III 비풍부 분획으로서 루트 C 에 이용할 수 있음도 확인되었다.

분획 (L/L-R)	순도 (%)	회수율 (%)
0.500～0.599 0.600～0.700	76.8 97.3	61.4 32.9

(크로마토그래피 조건)

크로마토용 수지: Na 형 강산성 수지 (Organo: CR-1310 형)

칼럼: 22 ×525mm, 200㎖

크로마토그래피 처리원액:

DFA III 효소 반응액을 실활시킨 후 분말 활성탄으로 청정 여과한 액.

R-Bx 60, DFA III 순도 78.6%,

공급량 2.5% L/L-R

통과 조건: 70℃, SV ＝ 0.6 (2.0㎖/분)

용리액: 물

회수 분획: 5㎖/분획

실시예 4

프룩토실트랜스퍼라아제 제조

(1) 아스로박터 SP (Arthrobacter sp.)

AHU 1753 주 (FERM BP-8296) 를 하기 배양조건으로 배양하여 효소액을 제조하였다.

(2) 배지 1: 1% 글루코스, 1% 폴리펩톤, 0.5% 효모 추출물, 0.5% 염화나트륨, pH 7.0. 500㎖ 용량의 진탕 판구 플라스크에, 배지 (1OO ㎖) 를 조제하여 고압 증기 살균하였다.

배지 2: 1% 이눌린, 0.2% 질산나트륨, 0.05% 염화나트륨, 0.05% 황산마그네슘, 0.05% 인산 2 수소칼륨, 0.01g/L 황산 제 2 철, 0.5% 효모 추출물, pH 7.0. 200L 용량의 단지 발효기 (히타치 제작소 제, 모델 FF-02) 에, 배지 (100 L) 를 조제하여 고압 증기 살균하였다.

(3) 배양 (효소 생산)

전 배양; 보존 사면 배지에서, Arthrobacter sp. AHU 1753 주의 1 백금이(白金耳)량 균체를, 무균적으로 (배지 1) 에 접종하였다. 그리고, 27℃, 24 시간, 진탕 배양하였다. 진탕 조건: 15 cm 스트로크(stroke), 120rpm.

본 배양: 전 배양에서 조제한 배양액 (1% 전 배양액 또는 본 배양액, 플라스크 10 개분, 1L 분) 을, 무균적으로 (배지 2) 에 접종하였다. 그리고, 단지 발효기를 27℃ 에서, 17 시간, 운전하였다. 통기량: 1vvm (100L/분); 교반수: 300rpm.

(4) 균체 회수, 및 기타 (3) 에서 조제한 배양액을, 원심 분리기를 이용하여 균체와 상등액(2000G, 4℃, 20분)으로 분리하고, 상등액을 DFA III 효소액으로 하였다. 효소액을 인산으로 pH5.5 로 조정 후, -20℃ 에서 보존하였다.

(결과)

이 조작에 의해, IFT 를

농도: 300 유니트/㎖ (배양액), (실험실 레벨의 3배)

전량: 4.5 ×10⁷, 유니트량, (공업 생산에 대응할 수 있는 충분한 양)

시간: 17 시간 (실험실 레벨보다 단시간)

으로 제조할 수 있었다.

(배양 조건)

ㆍ전 배양: 27℃, 24 시간, 진탕 배양

ㆍ본 배양: 전 배양액을 본 배양액에 접종 (본 배양액량에 대하여 1% 의 전 배양액량) 하여 27℃, 24 시간 진탕 배양한다.

(효소액의 조정)

본 배양액을 원심 분리 (2000G, 4℃, 20 분) 하여 상등액을 효소액으로서 사용한다.

실시예 5

DFA III 효소 반응액의 효모 처리

이눌린 (C 사 제품) (200 kg) 을 80℃ 의 온수 1kg 에 용해하고, IFT 5000유니트s/kg 이눌린을 첨가하여 60℃ 에서 12 시간 교반하여 DFA III 함유액을 생성시켰다.

이 반응종료액을 80℃ 로까지 가온하여 효소를 실활시킨 후, 이 실활 반응 완료액을 30℃ 로 냉각시키고, 그 후에 효모 (닛폰 사탕무 제당 (주) 제: 닛텐 효모) 100g (수분 66%) 을 첨가하여 30℃ 에서 12 시간 통기 배양하였다.

얻어진 효모 반응액을 여과 (세라믹막 등) 하여 그 여과액을 농축시켜, Bx 50～70 정도까지로 하여 이것을 크로마토 분리 처리의 크로마토 원액으로 하였다.

실시예 6

DFA III 과립상물의 제조

DFA III 결정을 유발로 미분쇄한 후, DFA III 100 에 대하여 물 10 을 첨가하여 균일하게 혼합하였다. 이것을 압출 조립기 (후지 파우달 (주) 제, FINERYUZER, 형식 EXR-60, 처리능력 40～150kg/hr) 로 조립하여 70℃ 의 송풍 정온 항온기 (야마토 과학 (주) 제, 형식 DN 910) 를 이용하여 3 시간 건조시켜 과립상 DFA III 을 제조하였다.

숙련된 패널리스트 20 명에 의해, 결정 DFA III 과 미분쇄 DFA III, 과립상 DFA III 의 관능시험을 실시하였다. 얻어진 결과를 하기 표 4 에 나타냈다. 표 4 에 나타내는 바와 같이, 미분쇄 DFA III 은 결정 DFA III 보다 감미가 강해져서, 입에서 잘 녹고 감미의 산뜻함도 향상되어 결과적으로 바람직하다는 결과가 얻어졌다. 또한 과립상 DFA III 에서는 미분쇄 DFA III 에 대하여 감미의 강함은 변하지 않았지만, 입에서 잘 녹고 감미의 산뜻함이 향상되어 종합평가도 높았다.

각 가공 처리를 한 DFA III 의 관능 시험
결정 DFA III 에 대한 미분쇄 DFA III 의 평가
감미 ＋1.2	입에서 녹는 느낌 ＋1.4	감미의 산뜻함 ＋0.5	종합 평가 ＋1.7
미분쇄 DFA III 의 평가에 대한 과립상의 DFA III 의 평가
감미 ＋0.1	입에서 녹는 느낌 ＋0.5	감미의 산뜻함 ＋0.2	종합 평가 ＋0.5

감미 입에서 녹는 느낌

＋2: 달다 ＋2: 좋다

＋1: 약간 달다 ＋1: 약간 좋다

0: 보통 0: 보통

－1: 약간 달지 않다 －1: 약간 나쁘다

－2: 달지 않다 －2: 나쁘다

감미의 산뜻함 종합 평가

＋2: 산뜻하다 ＋2: 좋다

＋1: 약간 산뜻하다 ＋1: 약간 좋다

0: 보통 0: 보통

－1: 약간 산뜻하지 못하다 －1: 약간 나쁘다

－2: 산뜻하지 못하다 －2: 나쁘다

이상의 점에서, 입에서 녹는 느낌이나 감미의 산뜻함 등, 식미나 식감에 있어서 경원되는 면이 있던 결정 DFA III 은 미분쇄후, 더욱 과립화됨으로써 이러한 점들을 개선할 수 있음이 확인되었다.

또, 결정화 조건은 DFA III 냉각 결정화시의 R-Bx: 65 이상이었다 (50℃ 에서의 용해도로 판단하였다).

실시예 7

프룩토실트랜스퍼라아제의 대량 생산

(1) 아스로박터 SP (Arthrobacter sp.) AHU 1753 주 (FERM BP-8296) 를 하기 배양조건으로 배양하여 효소액을 제조하였다.

(2)《배지 1》: l% 글루코오스, 1% 폴리펩톤, 0.5% 효모 추출물, 0.5% 염화나트륨, pH7.0. 500㎖ 용량의 진탕 판구 플라스크에, 100㎖ 를 조제하여 고압 증기 살균하였다.

《배지 2》: 1% 이눌린, 0.2% 질산나트륨, 0.05% 염화나트륨, 0.05% 황산마그네슘, 0.05% 인산 2 수소칼륨, 0.01g/L 황산 제 2 철, 0.5% 효모 추출물, pH7.0. 200L 용량의 단지 발효기 (히타치 제작소 제, 모델 FF-02) 에, 100L 를 조제하여 고압 증기 살균하였다.

(3) 배양 (효소 생산)

전 배양: 보존 사면 배지에서, Arthrobacter sp. AHU 1753 주의 1 백금이량 균체를 무균적으로 배지 1 에 접종하였다. 그리고, 27℃, 24 시간, 진탕 배양하였다. 진탕 조건: 15 cm 스트로크, 120rpm.

본 배양: 전 배양으로 조제한 배양액 (1% 전 배양액 또는 본 배양액, 플라스크 10 개분, 1L 분) 을 무균적으로 배지 2 에 접종하였다. 그리고, 단지 발효기를 27℃ 에서, 17 시간, 운전하였다. 통기량: 1vvm (150L/분); 교반수: 300rpm.

(4) 균체 회수 및 기타: (3) 에서 조제한 배양액을, 원심 분리기를 이용하여 균체와 상등액(2000G, 4℃, 20분)으로 분리하고, 상등액을 DFA III 효소액으로 하였다. 효소액을 인산으로 pH5.5 로 조정 후, -20℃ 에서 보존하였다.

(결과)

이 조작에 의해, IFT 를

농도: 300유니트/㎖ (배양액) (실험실 레벨의 3 배)

전량: 4.5 ×10⁷, 유니트량 (공업 생산에 대응할 수 있는 충분한 양)

시간: 17 시간 (실험실 레벨보다 단시간)

으로 제조할 수 있었다.

(배양 조건)

ㆍ전 배양: 27℃, 24 시간, 진탕 배양

(효소액의 조정)

본 배양액을 원심 분리 (2000G, 4℃, 20 분) 하여 상청을 효소액으로서 사용한다.

본 발명에 의해서, 종래 효율적으로 공업 생산할 수 없었던 고순도의 DFA III 결정의 공업 생산에 최초로 성공하였다. 더구나, 본 발명에 의하면, 특정한 활성탄 처리와 DFA III 함유액의 순도 향상의 유기적 결합에 의해서, 순도 99w/w% 에 도달하는 매우 고순도의 정제된 DFA III 결정을 효율적으로 공업 생산할 수 있을 뿐만 아니라, 종래법에서는 재결정을 다수회 반복하지 않으면 제거할 수 없었던 결정 중의 냄새도 공업적이면서 효율적으로 제거하는 데에 최초로 성공하였다는 현저한 효과도 나타낸다.

이와 같이, 본 발명에 관한 DFA III 결정은 단순히 순도가 높을 뿐만 아니라, 냄새가 없다는 매우 현저한 효과를 나타내므로, 의약 용도나 음식품 용도에 사용하기에 특히 적합하고, 예를 들어 칼슘 흡수제로서 자유롭게 사용할 수 있는 특징도 나타낸다.

독립 행정 법인 산업 기술 종합 연구소 특허 생물 기탁 센터

FERMBP-8296

20030218

Claims

순도 90% 이상의 디프룩토오스-디안히드리드 III (이하, DFA III 이라고 한다) 을 R-Bx 10～60 의 농도로 함유하는 DFA III 정제액 [이눌린에 아스로박터 SP (Arthrobacter sp.) AHU 1753 주 (FERM BP-8296) 유래의 이눌린프룩토트랜스퍼라아제 (탈중합) (inulin fructotransferase (depolymerizing)) 를 작용시켜 제조한 DFA III 정제액을 제외] 에 평균 입경이 15～50 마이크론이고, 최대 입경이 200 마이크론 이하인 분말 활성탄을 고형분에 대하여 0.1～5% 첨가하여 청정화한 후, 고액 분리하고, 분리된 액상부를 농축시킨 후, 즉시 결정화하는 것을 특징으로 하는 DFA III 의 정제 방법.
제 1 항에 있어서, 순도 90% 이상의 DFA III 을 R-Bx 40～55 의 농도로 함유하는 DFA III 정제액을 사용하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 1 항에 있어서, 분말 활성탄을 고형분에 대하여 0.1～3% 첨가하여 사용하는 것을 특징으로 하는 방법.
삭제
제 1 항에 있어서, 고액 분리하는 방법이, 여과 보조제를 사용하는 여과, 멤브레인 필터를 사용하는 방법, 한외 여과막을 사용하는 방법에서 선택되는 적어도 하나인 것을 특징으로 하는 방법.
DFA III 함유액으로부터 DFA III 제품에 이르는 전체 정제 공정에서의 중간 생성물의 적어도 하나를 크로마토그래피 처리하여 얻어진 DFA III 분획 중, 순도 85% 이상의 DFA III 을 함유하는 DFA III 풍부 분획에 대해서는, 이것을 DFA III 정제액으로서 단독으로 사용하거나 또는 DFA III 정제액에 첨가하고, 상기 DFA III 정제액 또는 DFA III 풍부 분획을 첨가한 DFA III 정제액 [이눌린에 아스로박터 SP (Arthrobacter sp.) AHU 1753 주 (FERM BP-8296) 유래의 이눌린프룩토트랜스퍼라아제 (탈중합) (inulin fructotransferase (depolymerizing)) 를 작용시켜 제조한 DFA III 정제액을 제외] 에 평균 입경이 15～50 마이크론이고, 최대 입경이 200 마이크론 이하인 분말 활성탄을 고형분에 대하여 0.1～5% 첨가하여 청정화한 후, 고액 분리하고, 분리된 액상부를 농축한 후, 즉시 결정화하는 것을 특징으로 하는 DFA III 의 정제방법.
제 6 항에 있어서, 순도 90% 이상의 DFA III 을, R-Bx 10～60 의 농도로 함유하는 DFA III 분획에 첨가하는 DFA III 정제액으로서 사용하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 6 항에 있어서, 분말 활성탄을 고형분에 대하여 0.1～3% 첨가하여 사용하는 것을 특징으로 하는 방법.
삭제
제 6 항에 있어서, 고액 분리 하는 방법이, 여과 보조제를 사용하는 여과, 멤브레인 필터를 사용하는 방법, 한외 여과막을 사용하는 방법에서 선택되는 적어도 하나인 것을 특징으로 하는 방법.
순도 60% 이상의 DFA III 을 R-Bx 10～60 의 농도로 함유하는 DFA III 조액 [이눌린에 아스로박터 SP (Arthrobacter sp.) AHU 1753 주 (FERM BP-8296) 유래의 이눌린프룩토트랜스퍼라아제 (탈중합) (inulin fructotransferase (depolymerizing)) 를 작용시켜 제조한 DFA III 조액을 제외] 에 평균 입경이 15～50 마이크론이고, 최대 입경이 200 마이크론 이하인 분말 활성탄을 고형분에 대하여 0.1～5% 첨가하여 청정화한 후, 고액 분리하고, 분리된 액상부를 농축시킨 후, 즉시 결정화하는 것을 특징으로 하는 DFA III 의 정제 방법.
순도 60% 이상의 DFA III 을 R-Bx 10～30 의 농도로 함유하는 DFA III 조액 [이눌린에 아스로박터 SP (Arthrobacter sp.) AHU 1753 주 (FERM BP-8296) 유래의 이눌린프룩토트랜스퍼라아제 (탈중합) (inulin fructotransferase (depolymerizing)) 를 작용시켜 제조한 DFA III 조액을 제외] 에 평균 입경이 15～50 마이크론이고, 최대 입경이 200 마이크론 이하인 분말 활성탄을 고형분에 대하여 0.1～5% 첨가하여 청정화한 후, 고액 분리하고, 분리된 액상부를 농축시킨 후, 즉시 결정화하는 것을 특징으로 하는 DFA III 의 정제 방법.
제 11 항 또는 제 12 항에 있어서, DFA III 조액이, DFA III 함유액, 크로마토그래피 처리하여 얻은 DFA III 분획, 결정 또는 조결정 시럽의 적어도 하나인 것을 특징으로 하는 방법.
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제 11 항 또는 제 12 항에 있어서, 고액 분리하는 방법이, 여과 보조제를 사용하는 여과, 멤브레인 필터를 사용하는 방법, 한외 여과막을 사용하는 방법에서 선택되는 적어도 하나인 것을 특징으로 하는 방법.