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KR101201927B1 - 형광 검출 장치 및 형광 검출 방법 - Google Patents

형광 검출 장치 및 형광 검출 방법 Download PDF

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KR101201927B1
KR101201927B1 KR1020107018423A KR20107018423A KR101201927B1 KR 101201927 B1 KR101201927 B1 KR 101201927B1 KR 1020107018423 A KR1020107018423 A KR 1020107018423A KR 20107018423 A KR20107018423 A KR 20107018423A KR 101201927 B1 KR101201927 B1 KR 101201927B1
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flow cell
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히로노리 하야시
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미쯔이 죠센 가부시키가이샤
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Abstract

형광 검출 장치는, 시료가 흐르는 유로가 형성되는 플로우 셀체(flow cell體)와, 유로 중의 측정점을 통과하는 측정 대상물에 대하여 레이저광을 조사(照射)하는 레이저 광원부와, 레이저광이 조사된 측정 대상물의 형광을 수광(受光)하여 수광 신호를 출력하는 수광부와, 수광부로부터 출력한 수광 신호로부터, 형광 강도의 출력값을 출력하는 처리부를 가진다. 플로우 셀체의 표면에는 렌즈가 설치되고, 이 렌즈는, 측정 대상물의 측정점을 지나고, 측정 대상물의 이동 방향과 수직인 면으로 가상적으로 절단하였을 때, 렌즈의 단면이 측정점을 중심으로 하는 원형 형상의 일부를 이루고 있다.

Description

형광 검출 장치 및 형광 검출 방법{FLUORESCENT LIGHT DETECTION DEVICE AND FLUORESCENT LIGHT DETECTION METHOD}
본 발명은, 측정 대상물에 레이저광을 조사(照射)하고, 그때 발하는 형광을 측정하는 형광 검출 장치 및 형광 검출 방법에 관한 것이다.
의료, 생물 분야에서 이용되는 플로우 사이토미터(Flow Cytometer)에는, 레이저광을 조사하는 것에 의하여 측정 대상물의 형광 색소로부터 발하는 형광을 수광(受光)하여, 측정 대상물의 종류를 식별하는 형광 검출 장치가 짜 넣어져 있다. 특히, 근년, 단백질 등의 세포 내의 국소 정보를 조사하기 위하여, 형광 색소를 이용하여 형광 측정을 행하는 것이 시도되고 있다. 세포 내의 국소 정보를 조사(調査)하기 위해서는, 계측 분해능을 종래에 비하여 향상시키는 것이 필요하다.
요즈음 이용되는 플로우 사이토미터에서는, 하기 비특허 문헌 1에 나타나는 바와 같이, 플로우 셀(플로우 셀체(flow cell體))이 이용된다. 이 플로우 셀이란 단면이 사각형의 가늘고 긴 쿼츠(quartz)제의 중공(中空) 챔버(chamber)이고, 레이저광을 투과하고, 샘플 중의 세포에 레이저광을 조사하기 위한 부재이다. 이 플로우 셀을 통과한 레이저광은, 플로우 셀 중의 측정점을 통과하는 측정 대상물에 조사되고, 별도 설치된 검출계로 형광이 검출된다.
당해 문헌에서는, 이하의 내용이 기재되어 있다. 레이저광의 빔의 광 강도의 분포는 가우스분포이다. 이 빔을 타원형으로 집광?수속(收束)시켜, 강도를 높이는 것과 함께, 한 번에 복수의 세포가 조사되지 않는 것과 같은 광학계가 구성되어 있다. 레이저광은 세포가 흐르는 샘플 흐름에 도달하기 전에 2개의 원통형 집광 렌즈를 통과하고, 타원형의 빔이 된다. 첫 번째의 렌즈로 빔의 폭을 조정하고, 두 번째의 렌즈로 빔의 높이를 조정한다. 2개의 렌즈를 통과한 후, 타원형의 빔은, 단면이 사각형의 가늘고 긴 플로우 셀 내를 흐르는 세포에 조사된다. 샘플압을 낮게 하면 샘플 흐름은 좁아져, 레이저광이 중앙의 광 강도의 변동의 보다 적은 부분을 통과하기 때문에, 측정의 분해능이 향상한다라고 기재되어 있다.
FCM의 원리 입문 강좌-V, http://www.bc-cytometry.com/FCM/fcmprinciple_5.html#5-1http://www.bc-cytometry.com/FCM/fcmprinciple_6-1.html (2007년 11월 28일 검색)
그러나, 상기 비특허문헌 1에 기재된 장치에서는, 단백질 등의 세포 내의 국소 정보를 조사할 정도로 측정 분해능을 향상할 수는 없다라고 한 문제가 있었다.
그래서, 본 발명은, 상기 문제점을 해결하기 위하여, 단백질 등의 세포 내의 국소 정보를 조사할 정도로 측정 분해능을 향상할 수 있는 형광 검출 장치 및 형광 검출 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은, 측정 대상물에 레이저광을 조사하고, 그때 발하는 형광을 측정하는 형광 검출 장치이고, 측정 대상물이 흐르는 유로가 형성된 플로우 셀체와, 유로 중의 측정점을 통과하는 측정 대상물에 대하여 레이저광을 조사하는 레이저 광원부와, 레이저광을 측정 대상물에 조사하도록 상기 측정점에 레이저광을 집속시키는 제1 렌즈와, 레이저광이 조사된 측정 대상물의 형광을 수광하여 수광 신호를 출력하는 수광부와, 상기 수광부로부터 출력한 수광 신호로부터, 형광 강도의 출력값을 출력하는 처리부,를 가지고,
상기 플로우 셀체의 표면에는, 레이저광의 광로를 횡단하도록 제2 렌즈가 설치되고, 이 제2 렌즈는, 측정 대상물의 상기 측정점을 지나는, 측정 대상물의 이동 방향과 수직인 면으로 가상적으로 절단하였을 때, 렌즈의 단면이 상기 측정점을 중심으로 한 원형 형상의 일부분을 이루고 있는 것을 특징으로 하는 형광 검출 장치를 제공한다.
여기서, 상기 제2 렌즈는, 상기 측정점을 초점 위치로 하는 구체(球體) 형상의 일부분을 이루는 구면 렌즈인 것이 바람직하다.
또한, 상기 플로우 셀체에 형성되는 상기 유로의 단면 형상은, 직사각형 형상이며, 상기 레이저광은, 광 축이 이 직사각형 형상의 한 변에 평행하게 되도록 조사되고, 상기 직사각형 형상의, 상기 레이저광의 광 축에 평행한 한 변의 길이에 대한, 이 한 변에 대하여 직교하는 다른 변의 길이의 비율이, 1 ~ 2.5인 것이 바람직하다.
그때, 상기 레이저광의 광 축에 평행한 한 변의 길이는, 측정 대상물의 평균 직경에 대하여 30배 이상 200배 이하의 길이인 것이 바람직하다.
또한, 상기 플로우 셀체와 상기 제2 렌즈는 같은 재료로 구성되어 있는 것이 바람직하다.
나아가, 상기 측정점과 상기 수광부의 사이의 형광의 광로 중의 상기 플로우 셀체의 표면에, 렌즈의 단면이 상기 측정점을 중심으로 한 원형 형상의 일부분을 이룬 제3 렌즈가 설치되어 있는 것도 바람직하다.
덧붙여, 측정 대상물은 예를 들어 세포이며, 상기 레이저광은, 상기 측정점에 있어서 세포 내의 일부분을 조사하고, 상기 수광부는, 세포 내의 단백질이 발하는 형광을 수광한다.
나아가, 상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은, 측정 대상물에 레이저광을 조사하고, 그때 발하는 형광을 측정하는 형광 검출 방법이고,
측정 대상물을, 플로우 셀체에 설치된 유로에 흐르게 하는 스텝과,
레이저광을 측정 대상물에 조사하도록 측정점에 레이저광을 집속시키는 제1 렌즈와, 측정 대상물의 측정점을 지나고, 측정 대상물의 이동 방향과 수직인 면으로 가상적으로 절단하였을 때, 단면이 상기 측정점을 중심으로 한 원형 형상의 일부분을 이루고 있는, 상기 플로우 셀체의 표면에 설치된 제2 렌즈,를 이용하여, 상기 유로 중의 측정점을 통과하는 측정 대상물에 대하여, 수속시킨 레이저광을 조사시키는 스텝과,
레이저광이 조사된 측정 대상물의 형광을 수광하여 수광 신호를 출력하는 스텝과,
출력한 상기 수광 신호로부터, 형광 강도의 출력값을 출력하는 스텝을 가지는 것을 특징으로 하는 형광 검출 방법을 제공한다.
그때, 상기 제2 렌즈는, 상기 측정점을 초점 위치로 하는 구체 형상의 일부분을 이루는 구면 렌즈인 것이 바람직하다.
또한, 측정 대상물의 일부분이 수속한 레이저광에 의하여 조사되고, 수광되는 상기 형광은 측정 대상물의 상기 일부분이 발하는 빛인 것이 바람직하다.
본 발명의 형광 검출 장치는, 측정 대상물이 흐르는 유로가 형성된 플로우 셀체의 표면에, 렌즈가 설치되고, 이 렌즈는, 측정 대상물의 측정점을 지나고, 측정 대상물의 이동 방향과 수직인 면으로 가상적으로 절단하였을 때, 상기 렌즈의 단면이 상기 측정점을 중심으로 한 원형 형상의 일부분을 이루고 있다. 이 때문에, 종래에 비하여 NA(개구(開口) 수)를 높일 수 있어, 레이저광의 집광 빔의 직경을 작게 할 수 있다. 특히, 측정점을 초점 위치로 하는 구체 형상의 일부분을 이루는 구면 렌즈를 이용하는 것으로, 레이저광의 집광 빔의 직경을 효율 좋게 작게 할 수 있다.
또한, 상기 렌즈를 이용하여 형광을 검출하는 방법에 있어서도, 종래에 비하여 NA(개구 수)를 높일 수 있어, 레이저광의 집광 빔의 직경을 작게 할 수 있다. 특히, 측정점을 초점 위치로 하는 구체 형상의 일부분을 이루는 구면 렌즈를 이용하는 것으로, 레이저광의 집광 빔의 직경을 효율 좋게 작게 할 수 있다.
따라서, 단백질 등의 세포 내의 국소 정보를 조사할 정도로 측정 분해능을 향상할 수 있다.
도 1은 본 발명의 형광 검출 장치를 이용한 플로우 사이토미터의 개략 구성도이다.
도 2는 본 발명의 형광 검출 장치에 이용되는 레이저 광원부의 일례를 도시하는 개략 구성도이다.
도 3은 본 발명의 형광 검출 장치에 이용되는 수광부의 일례를 도시하는 개략 구성도이다.
도 4의 (a) 및 (b)는, 본 발명의 형광 검출 장치에 이용되는 플로우 셀체를 설명하는 도면이다.
도 5는 종래의 플로우 셀체를 레이저광이 통과하는 상태를 설명하는 도면이다.
이하, 본 발명의 형광 검출 장치 및 형광 검출 방법을 상세하게 설명한다.
도 1은, 본 발명의 형광 검출 장치를 이용한 플로우 사이토미터(10)의 개략 구성도이다.
플로우 사이토미터(10)는, 레이저광을 측정 대상으로 하는 세포 등의 시료(12)에 조사하고, 시료(12) 중의 단백질 등의 일부분으로부터 발하는 형광을 검출하여 신호 처리하는 신호 처리 장치(형광 검출 장치, 20)와, 신호 처리 장치(20)에서 얻어진 처리 결과로부터 시료(12) 중의 측정 대상물의 분석을 행하는 분석 장치(80)를 가진다.
신호 처리 장치(20)는, 레이저 광원부(22)와, 수광부(24, 26)와, 시료(12)의 형광 강도의 출력값을 출력하는 처리부(28)와, 소정의 강도로 레이저광을 조사시키고, 각 처리의 동작의 제어 관리를 행하는 제어부(29)와, 고속 흐름을 형성하는 시스액(sheath fluid)에 포함시켜 시료(12)를 흐르게 하는 관로(30)와, 관로(30)의 끝에 접속되고, 시료(12)의 플로우를 형성하는 플로우 셀체(31)를 가진다. 플로우 셀체(31)에는, 시료(12)의 유로 중에 레이저광의 조사점(측정점)이 형성된다. 플로우 셀체(31)의 출구 측에는, 회수 용기(32)가 설치되어 있다. 플로우 사이토미터(10)에는, 레이저광의 조사에 의하여 단시간 내에 시료(12) 중의 특정의 세포 등을 분리하기 위한 셀(cell)?소터(sorter)를 배치하여 따로따로 회수 용기에 분리하도록 구성할 수도 있다.
레이저 광원부(22)는, 파장이 다른 3개의 레이저광, 예를 들어 λ1=405nm, λ2=533nm 및 λ3=650nm 등의 레이저광을 출사(出射)하는 부분이다. 레이저광은, 플로우 셀체(31)의 유로 중의 소정의 위치에 집속하도록 렌즈계가 설치되고, 이 집속 위치가 시료(12)의 측정점으로 되어 있다.
도 2는, 레이저 광원부(22)의 구성의 일례를 도시하는 도면이다.
레이저 광원부(22)는, R 광원(22r), G 광원(22g), B 광원(22b)과, 다이크로익 미러(Dichroic mirror, 23a1, 23a2)와, 렌즈계(23c)와, 레이저 드라이버(34r, 34g 및 34b)와, 파워 스플리터(35)를 가지고 구성된다.
R 광원(22r), G 광원(22g), B 광원(22b)은, 350nm ~ 800nm의 가시광의, 레이저광을 출사하는 부분이고, R 광원(22r)은, 주로 적색의 레이저광(R)을 소정의 강도로 출사한다. G 광원(22g)은, 녹색의 레이저광(G)을 소정의 강도로 출사한다. B 광원(22b)은, 청색의 레이저광(B)을 소정의 강도로 출사한다.
다이크로익 미러(23a1, 23a2)는, 특정의 파장 대역의 레이저광을 투과하고, 다른 파장 대역의 레이저광을 반사한다.
렌즈계(23c)는, 레이저광(R, G 및 B)으로 이루어지는 레이저광을 관로(30) 중의 측정점에 집속시킨다. 레이저 드라이버(34r, 34g 및 34b)는, R 광원(22r), G 광원(22g) 및 B 광원(22b)의 각각을 구동한다.
파워 스플리터(35)는, 공급된 신호를 레이저 드라이버(34r, 34g 및 34b)에 각각 분배한다.
이들 레이저광을 출사하는 광원으로서 예를 들어 반도체 레이저가 이용된다.
다이크로익 미러(23a1)는 레이저광(R)을 투과하고 레이저광(G)을 반사하는 미러이며, 다이크로익 미러(23a2)는 레이저광(R 및 G)을 투과하고 레이저광(B)을 반사하는 미러이다.
이 구성에 의하여 레이저광(R, G, B)이 합성되어, 측정점을 통과하는 시료(12)를 조사하는 조사광으로 된다.
레이저 드라이버(34r, 34g 및 34b)는, 처리부(28) 및 제어부(29)에 접속되어, 레이저광(R, G, B)의 출사의 강도가 조정되도록 구성된다.
R 광원(22r), G 광원(22g) 및 B 광원(22b)은, 레이저광(R, G 및 B)이 형광 색소를 여기(勵起)하여 특정의 파장 대역의 형광을 발하도록, 미리 정해진 파장 대역으로 발진한다. 레이저광(R, G 및 B)에 의하여 여기되는 형광 색소는 측정하려고 하는 생체 물질 등의 시료(12)에 부착되어 있고, 측정 대상물로서 플로우 셀체(31)의 측정점을 통과할 때, 측정점에서 레이저광(R, G 및 B)의 조사를 받아 특정의 파장으로 형광을 발한다.
수광부(24)는, 플로우 셀체(31)를 사이에 두고 레이저 광원부(22)와 대향하도록 배치되어 있고, 측정점을 통과하는 시료(12)에 의하여 레이저광이 전방 산란 하는 것에 의하여 시료(12)가 측정점을 통과하는 취지의 검출 신호를 출력하는 광전 변환기를 구비한다. 이 수광부(24)로부터 출력되는 신호는, 처리부(28)로 공급되고, 처리부(28)에 있어서 시료(12)가 관로(30) 중의 측정점을 통과하는 타이밍을 알리는 트리거 신호로서 이용된다.
한편, 수광부(26)는, 레이저 광원부(22)로부터 출사되는 레이저광의 출사 방향에 대하여 수직 방향이고, 또한 플로우 셀체(31)의 유로 중의 시료(12)의 이동 방향에 대하여 수직 방향으로 배치되어 있으며, 측정점에서 조사된 시료(12)가 발하는 형광을 수광하는 광전 변환기를 구비한다.
도 3은, 수광부(26)의 일례의 개략의 구성을 도시하는 개략 구성도이다.
도 3에 도시하는 수광부(26)는, 시료(12)로부터의 형광 신호를 집속시키는 렌즈계(26a)와, 다이크로익 미러(26b1, 26b2)와, 밴드 패스 필터(26c1 ~ 26c3)와, 광전자 배증관 등의 광전 변환기(27a ~ 27c)를 가진다.
렌즈계(26a)는, 수광부(26)에 입사한 형광을 광전 변환기(27a ~ 27c)의 수광면에 집속시키도록 구성되어 있다.
다이크로익 미러(26b1, 26b2)는, 소정의 범위의 파장 대역의 형광을 반사시키고, 그 이외는 투과시키는 미러이다. 밴드 패스 필터(26c1 ~ 26c3)로 필터링하여 광전 변환기(27a ~ 27c)로 소정의 파장 대역의 형광을 받아들이도록 다이크로익 미러(26b1, 26b2)의 반사 파장 대역 및 투과 파장 대역이 설정되어 있다.
밴드 패스 필터(26c1 ~ 26c3)는, 각 광전 변환기(27a ~ 27c)의 수광면의 전면(前面)에 설치되고, 소정의 파장 대역의 형광만이 투과하는 필터이다. 투과하는 형광의 파장 대역은, 형광 색소가 발하는 형광의 파장 대역에 대응하여 설정되어 있다.
광전 변환기(27a ~ 27c)는, 예를 들어 광전자 증배관을 구비한 센서이며, 광전면에서 수광한 빛을 전기 신호로 변환하는 센서이다.
제어부(29)는, 소정의 강도로 레이저광을 조사시키고, 처리부(28)에 있어서의 각 처리의 동작의 제어 관리를 행하는 부분이다.
처리부(28)는, 소정의 신호 처리를 행하여 형광 강도의 출력값을 분석 장치(80)로 출력하는 부분이다.
분석 장치(80)는, 처리부(28)로부터 공급되는 출력값을 이용하여, 플로우 셀체(31)의 측정점을 통과하는 시료(12) 중에 포함되는 생체 물질의 종류 등을 특정하고, 시료(12) 중에 포함되는 생체 물질의 분석을 행하는 장치이다. 이렇게 하여, 분석 장치(80)는, 예를 들어, 시료(12) 중에 포함되는 생체 물질의 종류의 히스토그램이나 각종 특성을 단시간에 구한다.
관로(30)의 하단(下端)은 플로우 셀체(31)가 접속되어 있다. 플로우 셀체(31)는, 본 발명의 특징으로 하는 부분이다. 도 4의 (a)는, 플로우 셀체(31)의 개략 사시도이며, 도 4의 (b)는, 플로우 셀체(31)를 레이저광이 투과하는 상태를 설명하는 도면이다.
플로우 셀체(31)는, 직육면체를 이룬 투명 부재이며, 석영 등에 의하여 만들어져 있다. 플로우 셀체(31)의 측면으로부터 레이저광이 입사되고, 플로우 셀체(31)의 내부를 통과하여, 플로우 셀체(31)에 설치된, 관로(30)로부터 세로 방향으로 연장되는 유로(31b)의 중심에서 집속하도록 되어 있고, 이 집속 위치가 측정점(P)으로 되어 있다. 이 측정점(P)은, 레이저 광원부(22)의 렌즈계(23c)의 초점 위치이다.
여기서, 레이저광이 입사하는 플로우 셀체(31)의 측면에는, 측정점(P)을 초점 위치로 하는 구체의 일부분의 형상을 이루는 구면 렌즈(31a)가 설치되어 있다. 즉, 레이저광의 광로를 횡단하도록 구면 렌즈(31a)가 설치되어 있다. 구면 렌즈(31a)의 구 형상의 중심, 즉, 구면 렌즈(31a)의 곡률 중심 위치는, 시료(12)의 측정점(P)과 일치하고 있다. 도 4의 (b) 중의 23c는, 도 2에 도시하는 레이저 광원부(22)의 렌즈계(집속 렌즈)이다. 구면 렌즈(31a)는, 플로우 셀체(31)와 같은 재료, 예를 들어 석영 등에 의하여 만들어져 있다.
이와 같이, 플로우 셀체(31)의 레이저광의 입사면에 구면 렌즈(31a)를 설치하는 것은, 레이저광의 집광 빔의 직경을 작게 하여, 측정 분해능을 향상시키기 위함이다.
플로우 셀체(31)에 구면 렌즈(31a)를 설치하는 것으로, 렌즈계(23c)를 통과한 레이저광을 측정점(P)으로 집속시킬 때, 구면 렌즈(31a)에 입사하는 레이저광의 입사각은 0도로 된다. 이 때문에, NA(개구 수)는, 구면 렌즈(31a)를 설치하지 않는 경우에 비하여, 향상한다.
구체적으로는, 플로우 셀체(31)를 통과하는 레이저광의 집광 빔의 NA는, (매질의 굴절률) × sinθ로 나타내진다. 여기서, θ는 레이저광의 플로우 셀체(31)로의 입사 각도이다. 이때, 구면 렌즈(31a)에서는, 렌즈계(23c)를 통과한 레이저광은 항상 입사 각도 0도로 입사하기 때문에 θ는 변화하지 않고, 구면 렌즈(31a)를 통과하였을 때 NA는 매질의 굴절률× sinθ의 값이 된다. 한편, 도 5에 도시하는 종래 예와 같이, 구면 렌즈(31a)가 없는 경우, 레이저광이 플로우 셀체(31)의 측면에 입사하는 입사 각도는, 레이저광의 광 축의 부분을 제외하고, 0도는 아니다. 이 때문에, 플로우 셀체(31)를 통과하는 집광 빔에 있어서의 NA는 스넬의 법칙으로부터 sinθ로 된다. 이상에서, 본 발명에서는, 플로우 셀체(31)를 레이저광이 통과할 때, 플로우 셀체(31)의 경계면에서 NA가 종래와 같이 저하하지 않도록, 구면 렌즈(31a)를 설치한다.
구면 렌즈(31a)를 설치하는 것에 의하여, 하기 식에 따라, 종래에 비해 NA를 증대시킬 수 있다. 이것에 의하여 집광 빔의 직경을 작게 할 수 있다. 하기 식은, 레이저광이 가우시안 분포를 상정한 식이다.
집광 빔의 직경 ε= 4×λ×f/(πD)=0.64λ/NA
여기서, λ는 레이저광의 파장, f는 렌즈 초점 거리, D는 렌즈계(23c)의 개구 직경이다.
이와 같이, 레이저광이 입사하는, 플로우 셀체(31)의 측면에 구면 렌즈(31a)를 설치하는 것으로, 집광 빔의 직경을 작게 할 수 있다. 이것에 의하여, 단백질 등의 세포 내의 국소 정보를 조사할 정도로 측정 분해능을 향상할 수 있다.
덧붙여, 본 실시예의 구면 렌즈(31a)는, 직방체 형상을 한 플로우 셀체(31)의 하나의 측면에 설치하지만, 수광부(26)의 형광의 측정 분해능을 향상시키기 위하여, 형광이 통과하고 수광부(26)에 이르는 플로우 셀체(31)의 다른 측면에 구면 렌즈(31a)를 설치하여도 무방하다. 이 경우에 있어서도, 측정점(P)의 위치에 구면 렌즈(31a)의 초점 위치가 오도록 배치한다.
본 발명에서는, 레이저광의 집광 빔의 사이즈를 작게 하기 위하여, NA를 종래보다 높게 한다. 이 때문에, 구면 렌즈(31a)를 플로우 셀체(31)의 측면에 설치하지만, NA를 높게 하는 것에 의하여, 하기 식에 나타나지는 바와 같이, 초점 심도가 얕아진다. 이것에 의하여 측정 분해능의 저하가 염려된다.
초점 심도 z=0.64/(NA)2
그래서, 본 발명에서는, 플로우 셀체(31)에 형성되는 유로(31b)의 단면 형상이 이하와 같이 제한되는 것이 바람직하다.
즉, 플로우 셀체(31)에 설치된 유로(31b)의 단면 형상은, 도 4의 (b)에 도시하는 바와 같이 직사각형 형상이며, 레이저광은, 광 축이 이 직사각형 형상의 한 변에 평행하게 되도록 조사된다. 이 때, 유로(31b)의 직사각형 형상의, 레이저광의 광 축에 평행한 한 변의 길이 L1에 대한, 이 한 변에 대하여 직교하는 다른 변의 길이 L2의 비율이, 1 ~ 2.5이다. 이와 같은 비율의 직사각형 형상의 유로(31b)를 형성하는 것으로, 레이저광의 광 축 방향에 있어서 시료(12)가 통과하는 위치를 규제할 수 있다. 이 때문에, NA를 높게 하는 것으로 얕아진 초점 심도의 문제를, 유로(31b)의 직사각형 형상의 비율을 1 ~ 2.5로 하고, 시료(12)가 흐르는 위치를 규제하는 것에 의하여, 해결할 수 있다. 또한, 측정하는 시료(12)의 평균 사이즈(직경)에 대하여 길이 L1를 30 ~ 200배로 하는 것이 바람직하다.
플로우 사이토미터(10)는 이상과 같이 구성된다.
이와 같은 플로우 셀체(31)를 가지는 플로우 사이토미터(10)에서는, 시료(12)에 레이저광을 조사하고, 그때 발하는 형광을 측정하는, 이하의 형광 검출 방법이 행하여진다.
시료(12)를, 플로우 셀체(31)에 설치된 유로에 시스액을 이용하여 흐르게 한다. 그리고, 플로우 셀체(31)의 표면에 설치된 구면 렌즈(31a)를 이용하여 수속시킨 레이저광을, 유로 중의 측정점을 통과하는 시료(12)에 대하여 조사시킨다. 구면 렌즈(31a)는, 시료(12)의 측정점을 지나고, 시료(12)의 이동 방향과 수직인 면으로 가상적으로 절단하였을 때, 단면이 측정점을 중심으로 한 원형 형상의 일부분을 이루고 있는 렌즈이다. 이때, 레이저광이 조사된 시료(12)가 발하는 형광을 수광하여 수광 신호를 출력한다. 출력한 수광 신호로부터, 형광 강도의 출력값을 출력한다.
덧붙여, 구면 렌즈(31a)는, 측정점을 초점 위치로 하는 구체 형상의 일부분을 이루고 있다.
덧붙여, 본 실시예에서는, 플로우 셀체(31)에 구면 렌즈(31a)를 설치하였지만, 본 발명에 있어서는, 이것에 한정되지 않는다. 플로우 셀체(31)의 레이저광이 입사하는 표면에는, 시료(12)의 측정점(P)을 지나고, 시료(12)의 이동 방향과 수직인 면으로 가상적으로 절단하였을 때, 단면이 원형 형상의 일부를 이루고 있는 렌즈를 이용하면 된다. 예를 들어 실린더리컬 렌즈(cylinderical lens)여도 무방하다.
이상, 본 발명의 형광 검출 장치 및 형광 검출 방법에 관하여 상세하게 설명하였지만, 본 발명은 상기 실시예에 한정되지 않고, 본 발명의 주지를 일탈하지 않는 범위에 있어서, 여러 가지의 개량이나 변경을 하여도 무방한 것은 물론이다.
10: 플로우 사이토미터
12: 시료
20: 신호 처리 장치
22: 레이저 광원부
22r: R 광원
22g: G 광원
22b: B 광원
23a1, 23a2, 26b1, 26b2: 다이크로익 미러
23c. 26a: 렌즈계
24, 26: 수광부
26c1, 26c2, 26c3: 밴드 패스 필터
27a ~ 27c: 광전 변환기
28: 처리부
29: 제어부
30: 관로
31: 플로우 셀체
31a: 구면 렌즈
31b: 유로
32: 회수 용기
34r, 34g, 34b: 레이저 드라이버
80: 분석 장치

Claims (11)

  1. 측정 대상물에 레이저광을 조사(照射)하고, 그때 발하는 형광을 측정하는 형광 검출 장치이고,
    측정 대상물이 흐르는 유로가 형성된 플로우 셀체(flow cell體)와,
    상기 유로 중의 측정점을 통과하는 측정 대상물에 대하여 레이저광을 조사하는 레이저 광원부와,
    레이저광을 측정 대상물에 조사하도록 상기 측정점에 레이저광을 집속시키는 제1 렌즈와,
    레이저광이 조사된 측정 대상물의 형광을 수광(受光)하여 수광 신호를 출력하는 수광부와,
    상기 수광부로부터 출력한 수광 신호로부터, 형광 강도의 출력값을 출력하는 처리부,를 가지고,
    상기 플로우 셀체의 표면에는, 레이저광의 광로를 횡단하도록 제2 렌즈가 설치되고, 이 제2 렌즈는, 측정 대상물의 측정점을 지나는, 측정 대상물의 이동 방향과 수직인 면으로 가상적으로 절단하였을 때, 렌즈의 단면이 상기 측정점을 중심으로 한 원형 형상의 일부분을 이루고 있는 것을 특징으로 하는 형광 검출 장치.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 제2 렌즈는, 상기 측정점을 초점 위치로 하는 구체(球體) 형상의 일부분을 이루는 구면 렌즈인 형광 검출 장치.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    상기 플로우 셀체에 형성되는 상기 유로의 단면 형상은, 직사각형 형상이며, 상기 레이저광은, 광 축이 이 직사각형 형상의 한 변에 평행하게 되도록 조사되고,
    상기 직사각형 형상의, 상기 레이저광의 광 축에 평행한 한 변의 길이에 대한, 이 한 변에 대하여 직교하는 다른 변의 길이의 비율이, 1 ~ 2.5인 형광 검출 장치.
  4. 제3항에 있어서,
    상기 레이저광의 광 축에 평행한 한 변의 길이는, 측정 대상물의 평균 직경에 대하여 30배 이상 200배 이하의 길이인 형광 검출 장치.
  5. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    상기 플로우 셀체와 상기 제2 렌즈는 같은 재료로 구성되어 있는 형광 검출 장치.
  6. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    상기 측정점과 상기 수광부의 사이의 형광의 광로 중의 상기 플로우 셀체의 표면에, 렌즈의 단면이 상기 측정점을 중심으로 한 원형 형상의 일부분을 이룬 제3 렌즈가 설치되어 있는 형광 검출 장치.
  7. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    측정 대상물은 세포이며,
    상기 레이저광은, 상기 측정점에 있어서 세포 내의 일부분을 조사하고,
    상기 수광부는, 세포 내의 단백질이 발하는 형광을 수광하는 형광 검출 장치.
  8. 측정 대상물에 레이저광을 조사하고, 그때 발하는 형광을 측정하는 형광 검출 방법이고,
    측정 대상물을, 플로우 셀체에 설치된 유로에 흐르게 하는 스텝과,
    레이저광을 측정 대상물에 조사하도록 측정점에 레이저광을 집속시키는 제1 렌즈와, 측정 대상물의 측정점을 지나고, 측정 대상물의 이동 방향과 수직인 면으로 가상적으로 절단하였을 때, 단면이 상기 측정점을 중심으로 한 원형 형상의 일부분을 이루고 있는, 상기 플로우 셀체의 표면에 설치된 제2 렌즈,를 이용하여, 상기 유로 중의 측정점을 통과하는 측정 대상물에 대하여, 수속(收束)시킨 레이저광을 조사시키는 스텝과,
    레이저광이 조사된 측정 대상물의 형광을 수광하여 수광 신호를 출력하는 스텝과,
    출력한 상기 수광 신호로부터, 형광 강도의 출력값을 출력하는 스텝,을 가지는 것을 특징으로 하는 형광 검출 방법.
  9. 제8항에 있어서,
    상기 제2 렌즈는, 상기 측정점을 초점 위치로 하는 구체 형상의 일부분을 이루는 구면 렌즈인 형광 검출 방법.
  10. 삭제
  11. 제8항 또는 제9항에 있어서,
    측정 대상물의 일부분이 수속한 레이저광에 의하여 조사되고, 수광되는 상기 형광은 측정 대상물의 상기 일부분이 발하는 빛인, 형광 검출 방법.
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