KR101041106B1

KR101041106B1 - 핵산과 단백질의 신규한 실시간 탐지방법

Info

Publication number: KR101041106B1
Application number: KR1020030084116A
Authority: KR
Inventors: 한면기
Original assignee: 한면기
Priority date: 2003-11-25
Filing date: 2003-11-25
Publication date: 2011-06-13
Anticipated expiration: 2023-11-25
Also published as: US20050214809A1; WO2005052127A2; EP1687450A2; CN1875117A; EP1687450A4; CA2541969A1; WO2005052127A3; CN1875117B; KR20050050390A

Abstract

본 발명은 핵산 반응의 실시간 탐지방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 핵산 프로브(probe)가 표적 핵산의 특이서열과 결합할 수 있는 조건에서 프로브와 표적 핵산의 복합체를 형성시키는 단계, 프로브 단편들이 표적 핵산으로부터 분리되어 다른 프로브가 상기 표적 핵산의 특이서열에 결합할 수 있도록 효소를 이용하여 특이서열에 결합된 상기 프로브를 절단시키는 단계 및 상기 절단된 프로브를 탐지하여 표적 핵산 분자를 탐지하는 단계를 포함하는 표적 핵산의 탐지방법, 및 핵산 증폭반응과 연계된 특정 단백질의 탐지방법에 관한 것이다. 본 발명에 의하면, 표적 핵산 및 표적 단백질을 실시간으로 빠른 속도와 민감도를 가지고 검출할 수 있다.

Description

핵산과 단백질의 신규한 실시간 탐지방법{Novel realtime detection of nucleic acids and proteins}

도 1은 표적 DNA를 검출하기 위하여, 형광 물질로 표지된 본 발명의 핵산 프로브의 이용을 나타낸 모식도이다. 상기 핵산 프로브는 FRET 쌍(형광 공여체와 수용체)이 RNase H 절단 부위에 인접하도록 프로브 내부에 표지되어 있다. 상기 핵산 프로브는 표적 DNA 내의 특이서열과 상보적이므로, 과량의 프로브를 RNase H와 함께 일정한 온도에서 반응시켰을 때, 프로브와 표적 DNA의 혼성화로 이중 가닥 복합물이 형성되고, 결과적으로 RNase H에 대한 절단 부위가 형성된다. RNase H는 상기 절단 부위를 절단하여 2개의 프로브 단편을 생성시킨다. 절단 후에 상기 단편들은 상기 반응온도에서 표적 DNA에 안정적으로 결합할 수 없으므로, 2개의 프로브 단편들은 표적 DNA로부터 분리된다. 절단된 프로브 단편이 표적 DNA로부터 분리된 결과, 형광물질로 표지된 또 다른 핵산 프로브가 상기 표적 DNA와 혼성화되며, 상기 절단 사이클 반응은 반복된다. 분리된 핵산 프로브 단편은 형광광도를 증가시키고, 이것을 형광계 또는 형광 플레이트 판독기로 실시간 모니터링한다.

도 2는 내열성(thermostable) RNase H에 의해서, 표적 DNA의 존재 하에 형성된 형광성 DNA-RNA 키메라(chimeric) 기질의 절단반응을 나타낸 동역학 그래프이 다. 음성 대조군, 0.2 pmol, 2 pmol, 및 20 pmol의 표적 DNA를 10 pmol의 형광성 프로브와 5 unit의 RNase H의 존재하에 50℃에서 반응시킨 후, 반응의 형광광도를 형광 마이크로플레이트 판독기로 모니터링하였다.

도 3은 10 pmol의 형광성 프로브와 5 unit의 내열성 RNase H 존재 하의 PCR 수행의 실시간 측정을 나타낸 그래프이다. PCR 반응은 음성 대조군, 1 ㎍ 및 1 ng의 표적 DNA 존재하에 실행한 후, 반응의 형광광도를 형광 마이크로플레이트 판독기로 모니터링하였다.

도 4는 회전환 증폭(rolling circle amplification; RCA) 반응의 실시간 측정을 나타낸 그래프이다. RCA 반응은 10 pmol의 형광성 기질, 5 unit의 내열성 RNase H, 및 3.32 x 10^-17M(A), 3.32 x 10^-19M(B)의 표적 핵산 또는 Bst DNA 중합효소가 없는 상태에서 수행한 음성대조군(C)의 존재 하에서 55℃에서 실행한 후, 반응의 형광광도를 형광 마이크로플레이트 판독기로 모니터링하였다.

도 5는 단일 염기쌍 불일치(single base pair mismatch)를 검출하기 위한 절단반응을 나타낸 그래프이다. 10 pmol의 프로브와 프로브의 절단가능 위치를 나타낸 염기쌍 불일치(■, ●, ▲, ▼, 및 ◆)가 있는 20 pmol의 표적 핵산과 반응시켰다. 프로브의 절단은 5 unit의 내열성 RNases H의 존재하에 50℃에서 실행한 후, 반응의 형광광도를 형광 마이크로플레이트 판독기로 모니터링하였다.

■ : 양성 대조군(CTCT),

● : TTCT,

▲ : CCCT,

▼ : CTTT,

◆ : CTCC.

본 발명은 핵산 반응의 실시간 탐지방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 핵산 프로브(probe)의 설계 및 특정 핵산의 서열탐지와 핵산증폭과 연계된 특정 단백질을 탐지하기 위하여 상기 프로브를 핵산 증폭작용에 이용하는 방법에 관한 것이다.

특정한(specific) 핵산과 단백질을 탐지하는 방법은 과학연구 분야에서 기본적으로 중요한 측면이 되고있다. 특정한 핵산이나 단백질을 탐지하고 동정할 수 있게 됨으로써, 연구자들은 어떤 유전적, 생물학적 마커(marker)가 사람의 건강상태를 나타내는 지표가 되는지를 판정할 수 있게 되었다. 상기 탐지와 동정을 통하여, 주변환경의 시료에서 병원체나 생물학전에 사용되는 균의 탐지 및 동정을 위한 키트 뿐만 아니라 체외에서(in vitro) 이용할 수 있는 진단키트의 개발이 가능하게 되었다. 이러한 체외진단과 관련된 산업의 생산품은 방법론적으로 임상화학, 미생물학, 핵산 테스트, 세포분석, 혈액학, 혈액은행, 항상성, 면역조직화학 등의 분야 에 속한다. 상기 생산품은 전염성 질병, 당뇨병, 암, 약물시험, 심장질환, 병원체의 환경검사 등 다양한 분야에 적용할 수 있다.

지금까지 진단관련 사업은 전통적인 면역화학적 검사방법이 주를 이루고 그 대상도 미생물에 국한되어 있었다. 그러나, 이런 방법들은 점차 더 빠르고 효과적인 분자수준의 진단으로 전환되고 있다. 또한, 방대한 양의 인간 게놈에 대한 정보가 축적되면서 분자수준의 새로운 검사방법이 개발되었다. 인간 게놈에 대한 연구로부터 얻어진 방대한 정보를 이용하여 다양한 상업적 진단방법들이 개발됨에 따라, 향후 수년 내에 핵산 검사 시장은 상당한 성장세를 보일 것으로 기대된다. 예를 들어, 수백만 가지의 단일 뉴클레오티드 다형성(single-nucleotide polymorphism; SNP)에 대한 정보가 축적되면서, 특정 유전적 배경을 가진 환자에게 가장 효과적인 약물을 예측할 수 있는 약물유전적 분석이 수년 내에 가능하게 될 것이다.

일반적으로, 핵산 검사는 핵산 증폭방법의 개발로 혁신적으로 변화되어 왔다. 이런 방법의 예로는, 중합효소 연쇄반응(polymerase chain reaction; PCR), 핵산가닥 전치증폭(strand displacement amplification; SDA), 리가아제 연쇄반응(ligase chain raction; LCR), 핵산서열기반 증폭(nucleic acid based amplification; NASBA), 회전환 증폭(rolling circle amplification; RCA) 등이 있다. 현재 사용중이거나 개발 중에 있는 수많은 임상용 진단검사는 상기 증폭방법이 제공하는 극도의 민감성에 기반을 두고 있다. 상기 검사방법은 진단검사에서 필요로 되는 특이도를 유지하면서도 수일에서 수주에 이르던 진단 시간을 수 시간으로 크게 감소시켰다.

이러한 핵산 증폭반응을 이용한 종래의 검출방법은 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 기술자에게는 공지된 것이라 할 것이다. 일반적으로, 이런 검출방법은 보통 핵산 증폭 후에 증폭된 핵산을 검출할 수 있는 전기영동 또는 프로브 및/또는 블로팅 기술의 이용과 같은 노동집약적인 처리과정이 필요하다. 이러한 과정의 구체적인 예로, 효소-결합 겔 측정법(enzyme-linked gel assays), 효소함유-비드에 기초한 검출(enzymatic bead based detection), 전자화학발광 측정(electrochemiluminescent detection), 형광상호 분광기(fluorescence correlation spectroscopy), 미세적정플레이트 샌드위치 혼성화 분석(microtiterplate sandwich hybridization assays) 등이 있고, 이들은 여러 문헌에서 자세하게 소개되고 있다. 그러나, 상기 방법은 이질적(heterogenous)이어서 추가적인 시료에 대한 조작이 필요하며, 시간이 오래 걸리고, 시료간에 서로 섞여 오염되기 쉽다. 따라서, 균일한(homogenous) 밀폐 튜브 내에서 표적을 증폭시키고, 동시에 그 산물을 탐지할 수 있다면, 시간 절약은 물론 검사의 자동화와 대량 시료의 동시 검사가 가능하고, 또한 시료간의 오염도 줄일 수 있으므로, 진단 분야에서 더욱 바람직한 형태가 될 것이다.

최근, 증폭반응이 일어나는 반응용기를 개방하지 않고도 실시간으로 증폭된 산물을 검출하는 DNA 진단방법이 몇 가지 개발되었다. 상기 방법은 푀르스터 공명 에너지전달(Forster resonance energy transfer; FRET)과 같은 분자간 에너지 전달 기전에 바탕을 두고 있다. 상기 방법은 혼성화 프로브(hybridization probe)를 이용하여 증폭된 산물을 검출한다. 가장 널리 공지된 핵산 검출을 위한 실시간 검출방법(real-time detection)은 PCR 반응의 검출에 이용된다. 이러한 방법들은 표적 물질과 혼성화되지 않은 경우 형광이 소멸되는 이차 구조를 형성하는 형광 혼성화 프로브(fluorescence hybridization probe)에 기초한다. 각 측정시점에서 각각의 증폭 산물에 프로브가 혼성화되면서 형광 신호가 증가한다(Taqman, molecular beacon, scorpin primers). 즉, 프로브가 증폭 산물에 혼성화되면서 펼쳐지거나(unfolding), 증폭 산물과 혼성화 상태에서 형광광도가 증가한다. 이 경우, 1개의 프로브에 대해서 1개의 증폭자 비율로 증폭자(amplicon)가 검출된다. 주어진 사이클에서 하나의 증폭자는 프로브의 혼성화에 의해 검출되는 하나의 프로브(예를들면, molecular beacon, Taqman probe 등)를 나타낸다.

또한, 실시간 검출 방법 중에 분자 비콘(molecular beacon)을 이용하여 증폭과 동시에 NASBA 산물을 검출하는 방법도 알려졌다(Leone, et al., Nucleic Acids Res., 26, 2150-2155, 1998). FRET에 기반을 둔 프로브는 형광 공여자(fluorescence donor)를 3'-말단에 그리고 소진제(quencher)를 5'-말단에 부착하여 표지(labelling)된다. 프로브가 표적에 붙지 않은 상태에서는 프로브가 헤어핀 구조로 구부러져 있기 때문에, 소진제가 공여자와 매우 가까운 거리에 위치하게 되므로, 공여자에서 발생하는 형광은 즉시 소멸된다. 산물이 증폭됨에 따라, 프로브는 증폭된 표적 DNA 서열과 혼성화되므로, 상기 구조는 소실되고 공여자는 소진제와 분리된다. 그 결과, 폐쇄-튜브내에서의 증폭을 실시간으로 측정할 수 있는 측정가능한 형광 신호가 발생한다.

한편, 형광 편광(fluorescence polarization)(Spears, et al., Anal. Biochem., 247, 130-137, 1997) 또는 FRET(Nadeau, et al., Anal. Biochem., 276, 177-187, 1999)를 이용하는 균일하며 동시적인 SDA 반응 및 검출반응도 알려져 있다. 두 가지 경우 모두, 내부 프라이머가 형광으로 표지되어 있어서, 표적 가닥(target strand)의 중앙 부위에 결합하도록 고안되었다. 형광 편광에서는 프로브는 제한효소에 의해 절단가능한 부위가 결여되어 있어서, 증폭 프라이머로 작용하지 않는다. 상기 프로브가 증폭 산물과 혼성화가 되면, 프로브의 평균 회전 상호작용 시간이 증가하게 되어 검색할 수 있게되는 근거를 제공하게 된다. FRET 측정법에서는 상부(upstream) 프라이머의 신장(extension)으로 프로브가 신장되고 전위(displacement)되게 된다. 이때, 전위된 프로브는 하부(downstream) 프라이머의 주형 역할을 하게 되므로, 이중 가닥의 절단 가능한 산물이 형성된다. 상기 산물은 양쪽 가닥에서 절단되므로, 형광광도가 증가하게 된다.

한편, 증폭된 RCA 산물은 종래부터 합텐(hapten) 또는 형광으로 표지된 뉴클레오티드의 유입이나 형광물질(fluor) 또는 효소로 표지된 상보적인 올리고뉴클레오티드의 혼성화에 의해 탐지되었다. 개방 환형 프로브(open circles probe), 기하급수적(exponential) RCA 및 앰플리플우오르(Amplifluor) 검출 프로브를 이용하여 한 시간 내에 하나의 균질의 폐쇄-튜브에서 10개의 표적물질을 감지할 수 있는 민감성과 10⁷배의 증폭이 가능함이 보고되었다. 실시간 측정기기를 이용하면 상기 반응은 정량적 분석이 가능한 바, 연구와 진단용으로 사용될 수 있다.

그러나, 상기 전술한 모든 실시간 기술은 몇몇의 단점이 있다.

첫째, 상기 기술들은 프로브가 공여자의 형광광도를 소진시키는 이차 구조를 형성해야 하므로, 비콘(beacon)의 융해온도가 정교하게 조절되어야 한다. 이러한 조절은 NASBA나 RCA와 같이 일정한 온도에서 반응시키는 경우에는 적용하기 곤란하다. 그리고, 상기 비콘은 표적과 결합하지 않을 때에는 헤어핀 구조를 유지하고, 표적과 결합하는 반응온도에서는 펼쳐지도록(unfolding) 고안해야만 한다. 이것은 프로브의 고안을 매우 어렵게 하며, 또한 반응온도에서 비콘이 펴질 때 프로브가 종종 배경 형광을 방출하기 때문에, 노이즈에 대한 신호와 관련된 문제를 유발한다.

둘째, 형광신호는 전적으로 표적의 증폭된 수량의 결과에만 의존한다. 따라서, 검출속도의 제한요소는 전적으로 증폭속도에 달려있다. 그러므로, 검출속도는 형광 프로브 그 자체의 탐지 한계에 의해 부득이 제한된다(일반적으로, fmol 수준). 보다 적은 양으로 실험할 때 충분히 탐지가능한 양의 증폭자가 생성되기까지 많은 시간이 요구된다.

따라서, 핵산탐지의 속도와 민감도를 증가시키기 위하여, 표적 핵산 및 탐지신호를 증폭시킬 수 있는 분석방법에 대한 요구가 계속해서 있어왔다.

단백질을 탐지하는 능력은 진단산업에서 매우 필수적이고 가장 큰 시장성을 가지고 있다. 단백질 탐지를 이용하면, 생물학전 무기에 대한 노출여부의 초기 검출에서부터 질병의 증상발현 전의 진단과 치료의 결과를 모니터링하는데 까지 여러 분야에 적용시킬 수 있다. 더불어, 다양한 게놈 염기서열 분석 프로젝트의 결과로, 단백질 산물의 특성이 아직까지 규명되지 아니한 새로이 동정된 ORF(open reading frame)가 알려지고 있다. 현재, 널리 사용되는 이차원 겔 전기영동(2-D gel electrophoresis)과 효소면역 측정법(ELISA)은 특이성과 민감도가 결여되는 문제가 있고, 반면에 질량분광기법(mass spectroscopy)은 매우 민감한 방법이지만 매우 정교한 기기가 필요하여 현재 일상적 측정이나 대량 처리방법으로 이용되지 않고 있지 못하고 있다. 그에 비하여, 특정 핵산서열의 검출을 위하여 개발된 방법은 탁월한 속도, 민감도 및 특이성을 제공한다. 현재, 특이성과 강한 결합력 때문에 단일클론항체(monoclonal antibody)가 단백질 선택을 위한 매개체로 가장 널리 쓰이고 있다. 최근에 개발된 앱타머(aptamer)가 이 분야에서 크게 기대되고 있지만, 현재 앱타머를 생산하는 것은 단일클론항체를 생산하는 확립된 방법과 비교할 때 장시간이 소요되고 부정확한 단점이 있다. 단백질 식별에 항체를 사용할 때 필요한 것은 항원 결합에 관련된 이차 신호를 생성하고 증폭하는 방법이다.

최근, 항원 탐지의 특이성과 핵산 증폭의 편리성과 신속성을 결합한 방법들이 고안되고 있다. 이 방법들은 특이적인 극소량의 단백질을 검출하는데 있어 매우 큰 가능성이 있다. 현재 증폭가능한 물질과 함께 특이한 결합능을 지닌 높은 민감도를 나타내는 단백질 검출 방법으로 5 가지가 있다. 이 방법은 면역 중합효소 연쇄반응(immuno-polymerase chain reaction; I-PCR), T7 RNA 중합효소에 의해 증폭되는 면역 검출법(immune detection amplified by T7 RNA polymerase; I-DAT), 근접의존성 DNA 연결법(proximity dependent DNA ligation; PDL), 면역 핵산가닥 전위증폭(immune strand displacement amplification; I-SDA) 및 면역 회전환 증폭(immune-rolling circle amplification: I-RCA)이다.

I-PCR은 유행성이하선염(mumps)-IgG(McKee, A., et al., Journal of Immunological Methods, 261, 167-175, 2002), 보툴리누스 독소(Botulinus toxin)(Wu, H.C., et al., Letters in Applied Microbiology, 32, 321-325, 2001), 종양사멸인자(tumor necrosis factor)(Saito, K., et al., Clinical Chemistry, 45:5, 665-669, 1999), 및 B형 간염바이러스의 표면항원(hepatitus B surface antigen)(Maia, M., et al., Journal of Virological Methods, 52, 273-286, 1995)의 검출에 이용된다. 이 방법은 이중 가닥 DNA를 검출하고자 하는 항체와 결합시킨다. 항체와 결합 후에, 실험자가 정의한 방법에 따른 PCR을 실행하여 표적 핵산을 지수적으로(exponentially) 증폭시키고 그 양을 정량한다. 증폭된 산물의 농도는 최초 핵산의 농도와 직접적으로 연관되며, 간접적으로는 항체가 결합된 초기 단백질의 농도와 연관된다.

I-DAT는 이중가닥의 올리고(oligo)가 이차 항체에 결합한다는 점에서 I-PCR과 유사하지만, 상기 올리고에는 T7 RNA 중합효소 프로모터 부위가 포함되어 있다. 일정한 온도(isothermal) 조건에서 여러 개의 T7 효소가 연속적이고 순서에 따라 프로모터에 결합하여 RNA 분자를 합성한다(Zhang, H., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 98:10, 5497-5502, 2001). 이와 같은 방식으로, 초기의 주형(template) 양에 비례하여 증폭된다.

PDL은 항원을 검출하는 매개체로서 항체 대신에 핵산을 사용한다는 점이 다른 방법들과 차이가 난다(Fredriksson, S., et al., Nature Biotechnology, 20, 473-477, 2002). 이 방법에서 사용되는 프로브를 앱타머(aptamer)라 부르는데, 상기 앱타머는 시험관 내(in vitro)에서 표적 분자와 높은 결합력을 갖는 물질을 선택하는 과정에서 얻어진다. PDL은 관심 있는 단백질의 각각 다른 부분에 결합할 수 있는 두 개의 앱타머와 혼성화 서열로 작용할 수 있는 세번째 뉴클레오티드 가닥이 필요하다. 각 앱타머는 5'-말단 부분부터 부착부위(binding region), PCR을 위한 프라이머 부위 및 혼성화 서열과 상보적인 구역의 순서로 구성되어있다. 일단 부착하게 되면, 하나의 앱타머의 3'-말단과 또 다른 앱타머의 5'-말단이 혼성화 가닥에 붙어서 이웃하는 근접구조를 형성하고, 이러한 구조로 인해 두개의 말단이 어닐링(annealing) 된다. 일단 이어지면, 두개의 내포된 프라이머 부위를 이용하여 PCR을 수행한다.

벡톤 딕킨슨(Becton Dickinson)에 의해 개발된 I-SDA는, 일정한 온도에서 특정 서열을 증폭하는 플랫폼(platform)으로, 상기 방법 또한 검출 항체에 연결된 2 가닥의 DNA를 필요로 한다. SDA는 2개의 효소, 즉 엑소뉴클리아제가 결여된 중합효소와 제한 엔도뉴클리아제(restriction endonuclease)의 활성에 의존한다. 티오(thio)-dNTP의 존재 하에 2개의 프라이머와 중합효소의 엑소-절편을 사용하여 제한효소 인식 부위를 생성한다. 그 결과, 2 가닥의 헤미포스포티오에이트(hemiphosphorthioate) 제한효소 인식부위가 생성되고, 이 부분은 상보적인 티올화 가닥(thiolated strand)의 절단 없이 제한효소에 의해 닉(nick)이 생성된다(Walker, G.T., et al., Nucleic Acids Res., 20, 1691-1696, 1992). 제한 효소가 분리되면, 엑소-중합효소가 닉이 있는 프라이머로부터 DNA 합성을 시작하여 이전에 합성된 가닥을 전위시키면서 표적을 지수적(exponential)으로 증폭시킨다. 닉 생성(nicking), 가닥 전위(strand displacement) 및 프라이머 혼성화 사이클이 계속 반복되면서 대량의 목적하는 표적 서열이 생성된다.

I-RCA는 일정한 온도 조건에서 선형 역동학적으로 환형의 올리고뉴클레오디드 프라이머를 복제하는데 사용될 수 있다(Fire, A., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92, 4641-4645, 1995; Liu, D., et al., J. Am. Chem. Soc., 118, 1587-1594, 1996). 상기 과정에서 환형의 주형이 단일가닥 프라이머와 혼성화된다. 여기에 단일 가닥 전위 DNA 중합효소와 dNTP를 첨가하면, 수 분내에 수 백개의 직렬로 연결된 주형의 복제형이 생성된다 (Schweitzer, B. and Kingsmore, S., Curr. Opin. Biotech., 12, 21-27, 2001; Lizardi, P., et al., Nat. Genet., 19, 225-232, 1998). I-RCA에 있어서, 프라이머의 5'-말단은 2차 항체에 결합되고, 최종적으로 신장된 산물은 프라이머의 3'-말단에 결합된다(Schweitzer, B., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Aug 27;97(18), 10113-10119, 2000).

또한, 상기 기술한 방법들에 대한 실시간 검출방법(real-time detection)이 개발되었으며, 이들 검출방법은 측정되는 시각에 각 증폭된 핵산산물과 프로브가 혼성화되는 결과 형광 신호의 증가를 탐지하는 것에 기초한다. 그러므로, 상기 방법들은 단백질 검출의 민감도를 크게 향상시켰지만, 프로브 디자인, 반응의 속도의 최적화 및 신호 증폭을 최대화하는데 한계점이 있어 실시간 핵산 검출방법에 있어서, 상기에서 설명한 바와 동일한 단점을 갖고 있다.

그러므로, 상기에서 살펴본 바와 같이, 예전부터 정확하고 민감하게 검출할 수 있는 실시간 단백질 검출 측정법에 대한 요구가 있어왔으며, 측정속도와 자동화 가능성을 개선할 필요가 있어왔다.

이에, 본 발명자들은 FRET로 표지되고 DNA와 RNA의 혼성 핵산으로 이루어진 프로브와 표적 핵산을 혼성화시킨 후, 상기 프로브의 내부 RNA를 RNase H로 절단시켜 프로브 단편의 양을 측정함으로써 정확하고 민감하게 표적 핵산을 실시간으로 정량할 수 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 실시간으로 균질적 체제(homogenous format)에서 특정 핵산을 탐지하는 방법을 제공하는 것이다.

또한, 본 발명의 또 다른 목적은 실시간으로 핵산 증폭 반응과 연계하여 특정 단백질을 탐지하는 방법을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 (1) 표적 핵산을 포함하는 시료를 수득하는 단계; (2) R₁--X--R₂ 구조를 갖는 핵산 프로브를 제조하는 단계로서, 이때 R₁과 R₂는 핵산 염기서열이고, X는 RNA 또는 DNA인 것을 특징으로 하는 단계; (3) 단계 1에서 수득한 표적 핵산과 단계 2에서 제조한 프로브를 혼성화시켜 표적 핵산-프로브 복합체를 형성시키는 단계; (4) 단계 3에서 형성된 표적 핵산-프로브 복합체에 절단시약을 처리하여 R₁과 R₂를 포함한 프로브 단편을 표적 핵산으로부터 분리시키는 단계; (5) 상기 단계 3과 단계 4를 반복하는 단계; 및 (6) 상기 단계 3 내지 단계 5를 통해 분리된 프로브 단편의 양을 측정하는 단계를 포함하는 표적 핵산의 실시간 탐지방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 (1) 표적 단백질을 포함하는 시료를 수득하는 단계; (2) 고체 지지물 위에 단계 1의 표적 단백질을 고정하는 단계; (3) R₁--X--R₂ 구조를 갖는 핵산 프로브를 제조하는 단계로서, 이때 R₁과 R₂는 핵산 염기서열이고, X는 RNA 또는 DNA인 것을 특징으로 하는 단계; (4) 단계 3에서 제조한 프로브 염기서열에 상보적인 핵산 염기서열이 부착되어 있는 항체를 제조하는 단계; (5) 단계 2의 고정된 표적 단백질에 단계 4에서 제조된 항체를 결합시켜 핵산-항체 복합체를 제조하는 단계; (6) 단계 3에서 제조된 프로브와 단계 5의 핵산-항체 복합체를 혼성화시켜 핵산-프로브 복합체를 형성시키는 단계; (7) 단계 6에서 형성된 핵산-프로브 복합체에 절단시약을 처리하여 R₁과 R₂를 포함한 프로브 단편을 핵산으로부터 분리시키는 단계; (8) 상기 단계 6과 단계 7을 반복하는 단계; 및 (9) 상기 단계 6 내지 단계 7을 통해 분리된 프로브 단편의 양을 측정하는 단계를 포함하는 표적 단백질의 탐지방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 프로브의 한쪽 말단, 양 말단 또는 내부를 1 또는 2 개의 형광 발색단으로 형광 표지하는 것을 특징으로 하는 바람직한 실시예를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 프로브가 DNA, RNA 또는 키메릭(chimeric) DNA/RNA로 이루어지는 것을 특징으로 하는 바람직한 실시예를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 프로브가 부분적으로 또는 완전히 메틸화(methylation)된 것을 특징으로 하는 바람직한 실시예를 제공한다.

또한, 본 발명은 핵산 증폭반응에 의해 증폭된 표적 핵산의 탐지 또는 핵산 증폭반응과 연계된 표적 단백질의 탐지방법을 제공하며, 이때 상기 핵산 증폭반응이 PCR, RCA, SDA 또는 NASBA인 것을 특징으로 하는 바람직한 실시예를 제공한다.

또한, 본 발명은 핵산 절단반응이 제한 엔도뉴클리아제, 엑소뉴클리아제, DNase 또는 RNase에 의해서 촉매되는 것을 특징으로 하는 바람직한 실시예를 제공한다.

이하, 본 발명을 보다 상세히 설명한다.

본 발명은 (1) 표적 핵산을 포함하는 시료를 수득하는 단계; (2) R₁--X--R₂ 구조를 갖는 핵산 프로브를 제조하는 단계로서, 이때 R₁과 R₂는 핵산 염기서열이고, X는 RNA 또는 DNA인 것을 특징으로 하는 단계; (3) 단계 1에서 수득한 표적 핵산과 단계 2에서 제조한 프로브를 혼성화시켜 표적 핵산-프로브 복합체를 형성시키는 단계; (4) 단계 3에서 형성된 표적 핵산-프로브 복합체에 절단시약을 처리하여 R₁과 R₂를 포함한 프로브 단편을 표적 핵산으로부터 분리시키는 단계; (5) 상기 단계 3과 단계 4를 반복하는 단계; 및 (6) 상기 단계 3 내지 단계 5를 통해 분리된 프로브 단편의 양을 측정하는 단계를 포함하는 표적 핵산의 탐지방법을 제공한다.

구체적으로, 본 발명은 상기에서 기술한 각 단계들을 포함하는 표적 핵산의 탐지방법을 제공한다. 상기 단계의 반복을 통해, 표적 핵산과 혼성화된 상기 프로브는 재순환하게 된다. 즉, 반응 혼합액 내에 존재하는 과량의 절단되지 아니한 프로브와 함께 표적 분자와 혼성화된다. 이와 같은 방식으로, 프로브로부터의 신호가 증폭되므로, 민감도와 속도 모두가 현저히 증가된다.

본 발명에서, 단계 1의 표적 핵산은 DNA 또는 RNA인 것이 바람직하다.

또한, 본 발명의 핵산 프로브는 DNA, RNA 또는 DNA/RNA 키메라 프로브인 것이 바람직하므로, 단계 2의 R₁과 R₂는 DNA, RNA, 메틸화된 DNA 및 RNA로 구성된 군으로부터 선택되는 것이 바람직하다. 다음은 본 발명의 실시예에서 사용된 핵산 프로브의 구조이다:

R₁--X--R₂

이때, R₁과 R₂는 핵산 염기서열이고, X는 RNA 또는 DNA로 구성된 특정 효소로 절단될 수 있는 염기서열이다. 상기 핵산 프로브 내의 R₁과 R₂는 1-20개의 염기들을 무관하게 포함하고, X는 1-80개의 염기들을 포함하는 것이 바람직하며, 1-10의 염기들을 포함하는 것이 더욱 바람직하다.

본 발명의 핵산 프로브 내의 R₁과 R₂는 DNA 서열 또는 RNA 서열인 것이 가능하다. 또한, 핵산 프로브의 R₁은 RNA 또는 DNA이고, R₂는 RNA 또는 DNA 구조를 포함하는 것도 가능하다. 또 다른 가능한 경우로, X는 DNA 또는 RNA이다. 또한, 비특이적 절단을 막기 위해서, R₁, R₂ 및 X는 전체적으로 메틸화되어 있거나 또는 부분적으로 메틸화되어 있을 수 있다는 것을 유의하여야 한다.

본 발명의 프로브들은 하나 또는 그 이상의 탐지 가능한 마커(marker)에 의해 표지(labelling)될 수 있다. 탐지용 마커는 검출될 수 있는 어떤 종류의 분자 또는 시약이라도 무방하다. 그러한 마커의 예로, 방사선 동위원소, 형광성 분자, 형광성 항체, 효소, 단백질(비오틴, GFP) 또는 화학발광 촉매제가 있다. 따라서, 단계 2의 핵산 프로브는 방사선 동위원소, 형광성 분자, 형광성 항체, 효소, 비오틴(biotin), GFP(green fluorescence protein) 및 화학발광 촉매제로 구성된 군으로부터 선택되는 것에 의하여 표지되는 것이 바람직하다. 상기 탐지용 마커는 단 일 형광이나 형광쌍(공여체 및 수용체)으로 표지된 것이 보다 바람직하다. 단일 또는 이중 표지의 선택은 사용된 절단 효소의 효율과 관찰되는 소진(quenching) 효율에 따라 달라진다.

이때, 탐지 가능한 범위에서 형광을 나타낼 수 있는 물질 또는 부분을 표시하기 위하여, 하기에서 "형광 표지(fluorescent label)" 또는 "형광 발색단(fluorophore)"이라는 용어를 사용한다. 본 발명에서 사용할 수 있는 형광 발색단의 예로는, 단실(dansyl) 및 JOE(6-carboxy-4'5'-dichloro-2'7'-dimethoxyfluorescein)를 포함하는 플루오레신 유도체(fluorescein derivatives), 에오신 유도체(eosin derivatives), 로다민 유도체(rhodamine derivatives), 알렉사(Alexa) 및 보디피(Bodipy)가 있다. 본 발명에서 사용될 수 있는 다른 형광 표지들은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게는 공지된 것이라 할 것이다.

본 발명의 단계 2에서, 형광물질은 핵산 프로브의 양 말단 또는 내부에 위치하는 것이 바람직하며, 공여체 및 수용체 형광 발색단이 0 내지 20 개 염기쌍 정도 상대적으로 떨어진 위치에서 프로브에 부착되어 있는 것이 더욱 바람직하다. 공여체 및 수용체 형광 발색단이 0 내지 7 개 염기쌍 정도 떨어져 있는 것이 가장 바람직하다. 표지 위치는 프로브 자체 내에서 뿐만 아니라 프로브의 5'-말단과 3'-말단을 포함한 프로브의 어떤 위치에도 가능하나, 프로브(X)의 절단 부위와 직접 인접된 부위인 것이 바람직하다. 또한, 프로브 내에 절단 부위가 유지되는 한, 즉 프로브가 절단되지 않는 경우에는 프로브의 "X" 부위 내에서 표지가 이루어질 것이 다.

본 발명의 단계 3의 이중 가닥의 표적 핵산-프로브 복합체를 형성하기 위하여, 표적 핵산 분자와 프로브를 혼성화시킬 수 있는 조건하에서 표적 핵산 분자와 과량의 프로브 분자를 하나의 반응 용기에서 함께 혼합한다.

그 후, 혼성화된 표적 핵산-핵산 프로브 복합체는 단계 4에서 혼성화된 프로브 내에 미리 결정된 염기서열을 특이적으로 절단 시약에 의하여, 효소학적으로 절단될 수 있다. 미리 결정된 절단서열은 프로브의 "X" 부위에 있는 것이 바람직하고, 프로브의 R₁과 R₂ 부위는 DNA이고 프로브의 "X" 부위는 RNA인 구조인 것이 더욱 바람직하다.

구체적으로, 표적 핵산 분자와 표지된 프로브를 적당한 완충액과 절단 효소를 포함하는 반응액에 혼합시켜 결합시킨다. 상기 반응액을 절단 효소의 최적 반응온도, 구체적으로 30 내지 72℃ 범위에서 반응시킨다. 5분 내지 120분 동안 상기 반응을 유지시켜 프로브가 표적에 연결되도록 한 뒤, 프로브를 절단한다. 프로브의 혼성화와 절단 단계를 반복하는 순환 반응이 이루어질 것이다.

본 발명에서 단계 4의 절단시약은 효소를 매개로 한 절단이 이루어지는 것이 바람직하나, 기타 공지된 절단시약이 사용되어도 무방하다. 이때, DNase, RNase, 헬리카제(helicase), 엑소뉴클리아제 및 엔도뉴클리아제 같은 효소들에 의해 촉매 되는 RNA 또는 DNA의 절단을 표시하기 위하여, "효소매개 절단(enzyme-mediated cleavage)"이라는 용어를 사용한다. 본 발명의 바람직한 실시예에 있어서, 혼성화된 프로브의 닉(nick) 생성 및 절단은 엔도뉴클레아제 또는 엑소뉴클레아제인 리보뉴클리아제에 의해서 수행되는 것이 보다 바람직하다. 리보뉴클리아제는 이중 가닥 DNA-RNA 혼성화 가닥으로부터 리보 핵산(ribonucleic acid)에서 닉을 생성하고 절단시키는 이중 가닥 리보뉴클리아제인 것이 더욱 바람직하다. 본 발명의 실시예에서 사용된 리보뉴클리아제는 RNase H이다. 기타 다른 사용한 효소로는 엑소뉴클리아제 Ⅲ와 역전사 효소들이 있다. 아울러, 내열성(thermostable) 효소가 사용되는 것이 바람직하다. 본 발명의 바람직한 실시예에 있어서, 혼성화된 프로브의 닉 생성 및 절단은 내열성 RNase H로 수행된다. 상기에서 서술된 효소들은 이하에서 기술된 방법에 따르거나 수정되어 실행되어도 무방하다.

이중 가닥 프로브-표적 핵산 복합체의 절단 또는 닉 생성은 표적과 혼성화된 프로브가 적어도 2 개 이상의 단편을 형성하게 한다. 이들 프로브 단편의 생성에 의하여, 표적 핵산-프로브 복합체에 있어서, 혼성화된 프로브 서열 크기가 줄어들게 되므로, 결합력이 감소될 것이다. 이와 같은 프로브 크기의 변화에 의하여, 반응이 일어난 온도에서 혼성화된 프로브 단편이 표적으로부터 융해 또는 이탈이 촉진되므로, 다른 프로브가 표적에 결합할 수 있게 된다. 그 결과, 생성된 단일 가닥 프로브 단편이 하기의 검출방법에 의해 측정되고, 표적 핵산 분자를 정량하게 된다.

프로브 단편의 측정은 다양한 검출방법을 사용하여 수행될 수 있다. 본 발명에서, 단계 6에서 분리된 프로브 단편의 측정은 실시간 또는 반응이 종료된 후에 측정하는 것이 바람직하고, 형광광도의 변화 또는 화학발광의 측정으로 이루어지는 것이 바람직하다.

측정과 검출방법은 프로브 또는 반응액 내로 유입된 표지 또는 탐지 마커의 형태에 따라 달라질 것이다. 프로브 단편을 탐지하는 한 방법은 푀르스터(Forster) 공명에너지 전달(FRET)쌍(형광 공여체와 수용체)으로 프로브를 표지하는 것이다. 상기 프로브가 완전하다면, 공여체의 형광은 그 수용체가 매우 근접하여 위치하기 때문에 즉시 소진(quenching)될 것이다. 프로브가 절단되는 경우, 2 개 형광 발색단이 물리적으로 분리되게 되고, FRET를 상실함으로써 소멸되었던 공여체의 형광광도가 회복된다. 그러므로, 상기 프로브의 절단과 그 결과 발생하는 프로브의 단편의 융해 및 이탈은 공여체의 형광광도를 증가시키고, 이것을 모니터링할 수 있다. 형광광도의 증가를 모니터링함에 의하여, 상기 각 단계들의 반응을 실시간으로 모니터링할 수 있으므로, 실시간으로 표적 분자의 존재를 탐지할 수 있다.

또한, 프로브의 R₁과 R₂ 부위의 비특이적 절단이 아니라, 단지 프로브의 X 부위에서만 특이적으로 절단되는 경우만을 측정하도록 프로브를 변형시킬 수 있다. 예를 들면, 프로브가 DNA-RNA-DNA로 이루어진 키메라 프로브라면, 프로브의 DNA 부위만를 메틸화시켜 상기 반응에서 DNase에 의한 비특이적 절단을 차단할 수 있으므 로, 검색의 특이성 및 정확도가 증가된다. 또 다른 예로는, 프로브가 완전히 RNA로만 구성된 경우이다. R₁과 R₂RNA는 단지 "X" RNA 부위만이 절단될 수 있도록 메틸화시킬 수 있다. 그 밖에 프로브의 다른 변형은 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자에게 공지된 것이라 할 것이다.

또한, 단계 3 및 단계 4는 표적 핵산의 증폭반응으로 이루어지고, 그 증폭산물을 탐지하는 것이 바람직하고, 상기 표적 핵산의 증폭반응은 중합효소 연쇄반응(polymerase chain reaction; PCR), 회전환 증폭(rolling circle amplification; RCA), 핵산가닥 전치 증폭(strand displacement amplification; SDA) 및 핵산서열기반 증폭(nucleic acid sequence based amplification; NASBA)으로 구성된 군으로부터 선택되는 것이 보다 바람직하다.

또한, 본 발명은 (1) 표적 단백질을 포함하는 시료를 수득하는 단계; (2) 고체 지지물 위에 단계 1의 표적 단백질을 고정하는 단계; (3) R₁--X--R₂ 구조를 갖는 핵산 프로브를 제조하는 단계로서, 이때 R₁과 R₂는 핵산 염기서열이고, X는 RNA 또는 DNA인 것을 특징으로 하는 단계; (4) 단계 3에서 제조한 프로브 염기서열에 상보적인 핵산 염기서열이 부착되어 있는 항체를 제조하는 단계; (5) 단계 2의 고정된 표적 단백질에 단계 4에서 제조된 항체를 결합시키는 단계; (6) 단계 4의 항체에 부착된 핵산과 단계 3에서 제조된 프로브를 혼성화시켜 핵산-프로브 복합체를 형성시키는 단계; (7) 단계 6에서 형성된 핵산-프로브 복합체에 절단시약을 처리하여 핵산 프로브의 R₁과 R₂를 포함한 프로브 단편을 핵산으로부터 분리시키는 단계; (8) 상기 단계 6과 단계 7을 반복하는 단계; 및 (9) 상기 단계 6 내지 단계 7을 통해 분리된 프로브 단편의 양을 측정하는 단계를 포함하는 표적 단백질의 검출 방법을 제공한다.

본 발명의 표적 단백질은 호르몬, 항원, 항체 및 독소(toxin)로 구성된 군으로부터 선택되며, 이에 한하지 아니하고 각종 단백질에 적용될 수 있음은 당해 기술분야의 통상의 지식을 가진 자에게 자명하다. 바람직하게는, 본 발명의 탐지방법이 항체 또는 항원의 탐지를 위한 면역측정법(immunoassay)에 사용될 수 있다. 또한, 특정 단백질을 특이적으로 인식하는 항체에 탐지 프로브와 상보적인 핵산 서열을 부착시킬 수 있다. 이때, 항체는 단일클론항체인 것이 바람직하며, 특정 단백질에 항체가 부착하게 되면, 상기 상보적인 서열은 프로브와 혼성화될 수 있다. 이어서, 프로브 복합체는 연속적으로 절단됨에 따라 표적 단백질의 존재를 탐지할 수 있다.

혼성화 서열이 항체의 부착에 의하여 입체적으로 방해받지 않도록, 상보적 서열의 부착은 핵산의 5'-말단에 접착될 수 있는 연결자(linker) 핵산의 제조를 필요로 한다. 상기 연결자 서열은 보다 연장될 수 있지만, 통상적으로 1 내지 10개의 뉴클레오티드이다. 아울러, 상보적인 핵산의 서열은 하나 이상의 프로브가 각항체에 결합할 수 있도록 연속적으로 반복되도록 제조할 수 있고, 그 결과 각각의 부착된 항체로부터의 신호가 증폭된다.

항체를 탐지하기 위하여, DNA를 연결시키는 것은 2 가지 방법이 주로 사용된다. 첫 번째 방법은, 숙시니미딜-4-(N-말레이미도메틸)시클로핵산-1-카르복실레이트(Succinimidyl-4-(N-Maleimidomethl)Cyclohexane-1-Carboxylate; SMMCC), 술포숙시니미딜-4-(N-말레이미도메틸)시클로핵산-1-카르복실레이트(Sulfo Succinimidyl-4-(N-Maleimidomethl)Cyclohexane-1-Carboxylate; Sulfo-SMCC), n-숙시니미딜-3-(2-피리딜티오)프로피오네이트(n-Succinimidyl-3-(2-Pyridylthio)Propionate; SPDP), N-숙시니미딜-6-(3'-(2-피리딜디티오)-프로피온아미도)헥사노에이트(N-Succinimidyl-6-(3'-(2-pyridyldithio)-propionamido)hexanoate; NHS-Ic-SPDP), 또는 술포숙시니미딜-3-(2-피리딜티오)프로피오네이트(SulfoSuccinimidyl-6-(3'-(2-pyridyldithio)-propionaamido)hexanoate; Sulfo-NHS-Ic-SPDP) 등을 사용하여 5'-말단이 티올(thiol)로 변형된 DNA를 항체의 유리 아미노 그룹들에 연결시키는 것이다. 상기 시약들은 그들 간격을 띄우는 그룹(spacer)의 길이와 물에 대한 용해도 정도가 다르다. 만약 필요하다면, 추가적인 조작을 위하여 DNA를 방출시키는 티올화(thiolation) 시약으로 연결 부위를 절단할 수 있다. 두 번째 방법은, 사량체(tetrameric) 단백질인 스트렙아비딘(strepavidin)에 의해서 항체-DNA 사이의 연결 부위를 제공함에 의해서, 상기 단백질은 비오틴(biotin)과 충분히 비가역적인 결합을 형성한다. 항체의 유리 아미노 그룹들은 비오틴-n-하이드록시숙시니미드(biotin-n-hydroxysuccinimide)와 반응하여 비오틴으로 표지된다. DNA의 비오틴화는 5'-비오틴 포스포아마다이트(5'-biotin phoshporamidite)의 사용 또는 5'-말단의 아미노기 표지 뒤에, 비오틴-n-하이드록시숙시니미드와 반응시켜 이루어진 다. DNA, 스트랩아비딘 및 항체의 결합(conjugate)은 1 몰당량의 항체를 DNA-스트랩아비딘 결합체에 첨가하여 제조된다. 4℃에서 1시간 동안 반응시킨 후, 항체-DNA 결합체를 슈퍼덱스(Superdex) 200 겔 컬럼으로 정제하는 경우, 결합체가 초기에 용출된다. 시료를 1.5-2% 아가로스 겔에서 비변성(non-denaturing)으로 전기영동하고, 사이버그린(SyberGreen) Ⅱ로 염색하여 분석한다.

통상적으로 표적 단백질은 고체 지지물 위에 고정된다. 고체 지지물에 표적 단백질을 고정하는 방법은 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자에게 공지되어 있다. 반응액에서 항체를 고정화된 표적 단백질과 반응시켜, 표적 단백질에 항체를 부착시킨다. 결합되지 않은 항체를 제거하기 위해서, 표적 단백질에 결합된 항체와 상보적인 DNA를 수회 세척한다. 그 후, 결합된 항체-표적 단백질 복합체는 적절한 완충액과 효소를 포함하는 상기에서 기술된 프로브와 반응시키면, 절단이 가능하다. 절단의 탐지는 상기 표적 핵산의 검출에서 사용한 방법과 동일한 방법으로 수행할 수 있다. 따라서, 절단의 탐지는 표적 단백질의 존재를 나타낸다. 본 발명의 바람직한 실시예에서는 FRET 프로브를 사용하며, 그 결과 표적 단백질의 존재를 나타내는 절단에 의하여 형광광도가 증가한다.

또한, 본 발명은 핵산을 증폭하고, 그 증폭 산물을 탐지하는 핵산의 탐지방법을 제공하는 바, 구체적으로는 (1) 핵산이 증폭되고, 핵산 프로브(probe)가 핵산의 특이서열과 결합할 수 있는 조건에서 프로브와 핵산의 복합체를 형성시키는 단 계; (2) 프로브 단편들이 핵산으로부터 분리되어 다른 프로브가 상기 핵산의 특이서열에 결합할 수 있도록 특이서열에 결합된 프로브를 효소를 이용하여 절단시키는 단계; 및 (3) 상기 절단된 프로브를 탐지하여 표적핵산 분자를 탐지하는 단계를 포함하는 핵산 증폭반응에 대한 실시간적이고 동질적인 체계로 표적 DNA 및 RNA를 탐지하며, 핵산 증폭 반응과 연계된 특정 단백질의 탐지하는 방법을 제공한다.

상기 단계의 반복을 통하여, 증폭된 산물과 혼성화되는 상기에서 기술된 프로브의 재순환이 가능해진다. 즉, 증폭된 표적 분자는 반응 혼합액에 존재하는 절단되지 아니한 과량의 프로브와 혼성화된다. 상기 방법에 의하여, 최초 표적 핵산 분자의 증폭과 프로브로부터 검출 신호의 증폭이 동시에 일어나고, 상기 증폭에 의하여 신속하면서도 민감도가 높은 핵산탐지 및 단백질의 탐지가 가능해진다.

본 발명에 쉽게 이용할 수 있는 핵산 증폭반응은 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자에게 공지되어 있다. 즉, 상기 표적 핵산의 증폭은 중합효소 연쇄반응(polymerase chain reaction; PCR), 회전환 증폭(rolling circle amplification; RCA), 핵산가닥 전치 증폭(strand displacement amplification; SDA) 또는 핵산서열기반 증폭(nucleic acid sequence based amplification; NASBA)을 포함하지만 상기 방법에 국한되지 아니한다. 상기 핵산 증폭 산물은 DNA 또는 RNA이다.

일반적으로, 표적 핵산의 증폭 및 상기에서 기술한 프로브의 절단에 의한 탐지를 동시에 가능하도록, 반응 혼합액에 표적 핵산, 프로브, 핵산 증폭 반응의 구 성물 및 절단 효소가 포함된다. 각 증폭반응은 완충액 조건, 프라이머, 반응온도 및 프로브 절단 조건 등을 각각 개별적으로 최적화시키는 것이 필요하다. 본 발명의 바람직한 실시예에서는, 증폭된 산물의 탐지를 위하여, 키메라 형태의 FRET 프로브와 RNase H를 사용한다. 핵산 증폭반응과 연계하여 본 발명의 탐지방법을 사용하면 표적 핵산을 탐지하는 민감도와 속도가 현저하게 개선될 것이다.

또한, 본 발명은 항체 검출의 특이성과 함께 핵산 증폭반응의 속도와 민감도를 향상시킨 표적 단백질 분자를 검출하기 위한 방법을 제공한다. 구체적으로, (1) 항원의 결합을 검출할 수 있도록 핵산 증폭반응에 의해 증폭된 핵산을 항체에 결합시키는 단계; (2) 상기 항체와 표적 단백질을 특이하게 결합시켜 복합체를 형성시키는 단계; (3) 상기 복합체에 핵산 프로브(probe)가 핵산의 특이서열과 결합할 수 있는 조건에서 프로브와 핵산의 복합체를 형성시키는 단계; (4) 프로브 단편들이 핵산으로부터 분리되어 다른 프로브가 상기 핵산의 특이서열에 결합할 수 있도록 특이서열에 결합된 프로브를 효소를 이용하여 절단시키는 단계; 및 (5) 상기 절단된 프로브를 탐지하여 표적단백질 분자를 탐지하는 단계를 포함하는 특정 단백질의 탐지하는 방법을 제공한다.

본 발명의 이런 특징에서, 상기 전술한 방법에 의해 프로브의 고안, 절단 및 탐지가 핵산 증폭반응에 연계되어 표적 단백질의 탐지에 적용시킬 수 있다. 본 발명의 바람직한 실시예에서는, RCA 반응에 연계된 항체와 함께 RNase H로 절단할 수 있는 FRET 프로브를 사용한다. 본 발명을 항체와 연계된 핵산 증폭반응에 적용시 키는 경우의 장점으로는 표적 단백질의 특이적 탐지에 있어서, 속도와 민감도의 현저히 증진를 제공한다는 점이다.

본 발명의 또 다른 특징은, 절단가능한 프로브가 표적 DNA에서 단일 뉴클레오티드 다형성(single nucleotide polymorphism; SNP)의 존재를 탐지하는데 사용될 수 있다는 점이다. 상기 탐지는 프로브 자체의 절단 또는 핵산 증폭반응과 결합하여 수행된다. 일반적으로, 프로브의 절단되는 부위에 불일치가 존재한다면, 그 프로브는 RNase H에 의해서 절단되지 않는다. 따라서, 이러한 경우에, 절단되지 않는다는 것은 표적 DNA안에 SNP가 존재한다는 것을 나타낸다. 반대로, 프로브는 SNP에 완전히 상보적으로 제조될 수 있다. 이러한 경우에, 절단된 프로브가 탐지되었다는 것은 SNP의 부존재를 나타내고, 절단된 프로브가 탐지되지 않았다는 것은 SNP의 존재를 나타낸다.

지금까지 본 발명을 일반적인 방식으로 기술하였다. 이하, 본 발명을 보다 잘 이해하도록, 보다 구체적인 실시예에 의해 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예는 본 발명의 이해와 설명을 돕기 위하여 예시하는 것일 뿐, 본 발명이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

<실시예 1> 형광 프로브와 RNase H를 사용한 표적 DNA의 탐지 측정

퍼셉티브 바이오시스템 엑스페디트(PerSeptive Biosystems Expedite) 핵산 합성 시스템을 사용하여 서열번호 1로 기재되는 형광으로 표지된 절단 가능한 프로 브 24-mer 올리고뉴클레오티드(5'-TATGCCATTT-r(GAGA)-TTTTTGAATT-3')와 서열번호 2로 기재되는 상기 프로브에 상보적인 표적핵산 24-mer 올리고뉴클레오티드를 합성하여 제조하였다. 서열번호 1로 기재되는 올리고뉴클레오티드가 합성되는 동안, FAM(fluorescein succinimidyl ester) 및 TAMRA(tetramethylrhodamine succinimidyl ester)을 서열번호 1의 10번과 15번 위치에 삽입시켰다. 서열번호 1의 1번부터 10번 및 15번부터 24번은 데옥시리보뉴클레오티드(DNA)이고, 11과 14번 사이의 4개는 리보뉴클레오티드(RNA)로서, 서열 앞에 첨자"r"로 표시하였다. RNA에 결합된 시알일(sialyl) 보호 그룹들을 1 M의 테트라부틸암모니움 플로라이드(tetrabutylammonium fluoride) 용액에 하룻밤동안 처리하여 제거하였다. 그 후, 증류수를 첨가한 용액에 동일한 부피의 1 M의 TEAA(triethylammonium acetate)를 상기 용액에 첨가하였다. 그 후, 올리고뉴클레오티드를 세파덱스(Sephadex) G-25 컬럼(Pharmacia 사)을 이용해 상기 뉴클레오티드를 증류수를 사용하여 탈염(desalting)하였다. 이후, 분획별로 수집하여 최종적인 시료를 변성용(7 M의 요소 첨가) 20% 폴리아크릴아미드 겔에서 전기 영동을 한 후, 겔에서 적절한 올리고뉴클레오티드 밴드를 잘라낸 후, S&S ELUTRAP 전기-분리 시스템(Electro-Separation System)(Schleicher & Schuell)을 사용하여 전기적으로 용출시켰다.

서열번호 2로 기재되는 올리고뉴클레오티드는 C18 컬럼을 사용하여 정제하였다. C-18컬럼을 10 ㎖ MeOH로 세척한 후 2 ㎖의 2M TEAA로 다시 세척한 후, 상기에서 제조한 올리고뉴클레오티드를 컬럼에 로딩(loading) 시킨후 15 ㎖의 증류수로 세척하였다. 이후, 2 ㎖의 2%(v/v) TFA(trifluoroacetic acid) 용액을 컬럼에 통과시킨 다음, 15 ㎖의 증류수로 컬럼을 세척한 후, 2 ㎖의 20%(v/v) 아세토니트릴로 용출시켰다.

형광 마이크로플레이트 판독기(fluorescence microplate reader)(Bio-Rad, I-cycler)를 사용하여 형광광도의 증가에 의한 프로브의 절단을 모니터링하였다. 음성 대조군, 0.2 pmol, 2 pmol, 및 20 pmol의 표적 DNA(서열번호 2)를 각각 50 ㎕의 1 X RNase H 완충액에서 10 pmol 형광 프로브 및 5 unit의 RNase H와 함께 50℃에서 반응시켰다(도 2).

초기 상대적인 형광의 배경크기를 보정하여 그래프로 나타낸 결과, 매우 빠르고 명료하게 표적 DNA의 양에 비례하는 반응이 일어남을 관찰하였다. 즉, 5분 이내에 0.2 pmol의 표적 DNA는 배경(음성 대조군)과 쉽게 구별되었다(도 2). 상기 결과로써, 표적 핵산을 검출하는데 있어 본 발명에 의한 표적 핵산의 탐지방법이 유용함을 확인하였다. 상기 방법에 의하면, 모든 시료에서 거의 즉시(5분 이하), 통계상 유의한 차이를 나타내는 것을 관찰할 수 있었다.

<실시예 2> RNase H를 이용한 PCR 반응의 실시간 측정

형광 마이크로플레이트 판독기를 사용하여 형광 방출의 증가에 의하여, 프로브의 절단을 모니터링하였다. 상기 실시예 1의 10 pmol의 형광 프로브와 5 unit의 내열성(thermostable) RNase H의 존재하에, 1 ㎍ 및 1 ng의 표적 DNA로 PCR(polymerase chain reaction)을 수행하였다. 이때, 50 ㎕ 의 Taq 중합효소 완 충액에서, 10 pmol의 정방향 프라이머(서열번호 3) 및 역방향 프라이머(서열번호 4), 0.2 mM dNTP 및 2.5 unit의 Taq 중합효소를 사용하였다. 그 결과, 본 발명의 핵산 탐지방법에 의해 실시간으로 PCR 반응(95℃에서 15분; 50℃에서 30초; 72℃에서 30초)을 탐지할 수 있었다. 상기 두가지 표적 DNA에 대한 반응을 추적한 결과, 전형적인 실시간 PCR 반응이 나타났으며, 유사한 투여량에 따른 특성들을 보여주었다(도 3). 따라서, RNase H 및 형광 프로브의 사용은 실시간 PCR에 대한 또 다른 대안 방법이 될 수 있다. 구체적으로, 통상 사용되는 실시간 PCR 방식에는 Taq 중합효소가 지닌 5 →3 뉴클레아제 활성이 필요하나, 본 발명의 경우 벤트(vent) 중합효소 또는 pfu 중합효소와 같은 5 →3 뉴클레아제 활성이 없는 다른 DNA 중합효소들도 실시간 PCR 방식에 사용될 수 있다. PCR 방식 사용시, Taq 중합효소와 같이 복제교정 활성(proof-reading activity)이 없는 효소 대신, 복제교정 활성이 있는 pfu 중합효소를 사용할 경우 PCR의 오류를 줄일 수 있어서 더욱 정확한 결과를 얻을 수 있다.

<실시예 3> DNA를 검출하기 위한 절단 프로브/회전환 동시 증폭 측정

표지 안된 올리고뉴클레오티드는 퍼셉티브 바이오시스템 엑스페디트(PerSeptive Biosystems Expedite) 핵산 합성 시스템을 사용하여, 서열번호 5로 기재되는 60-mer 올리고뉴클레오티드, 서열번호 6으로 기재되는 80-mer 올리고뉴클레오티드, 및 서열번호 7로 기재되는 15-mer 올리고뉴클레오티드를 합성하여 제조하였고, 올리고뉴클레오티드를 C18 컬럼을 사용하여 정제하였다. 구체적 으로, C-18컬럼을 5 ㎖의 MeOH로 세척한 후, 2 ㎖의 2M TEAA로 세척하고, 상기 올리고뉴클레오티드를 컬럼에 로딩시킨후 15 ㎖의 증류수로 세척하였다. 이후, 2 ㎖의 2%(v/v) TFA 용액을 넣은 다음, 15 ㎖의 증류수로 컬럼을 세척한 후, 2 ㎖의 20% 아세토니트릴로 용출시켰다.

회전환 증폭(rolling circle amplification) 기질을 제조하기 위하여, 환형으로 제조가능한 올리고뉴클레오티드 800 μM 용액을 37℃에서 60분 동안 10 U의 T4 폴리뉴클레오티드 키나아제(kinase)가 포함되어 있는 1 X T4 DNA 리가아제 완충액에서 활성화시킨 후, 상기 용액을 65℃에서 20분 동안 키나아제를 불활성화시켰다. 400 nM의 상기 올리고뉴클레오티드를 포함한 상기 용액을 16℃에서 16시간 동안 2000 U의 T4 리가아제를 포함하는 1 X T4 DNA 리가아제 완충액에서 200 nM의 주형 올리고뉴클레오티드에 어닐링(annealing)하여 연결(ligation)시켰다.

형광 마이크로플레이트 판독기를 사용하여, 형광광도의 증가에 의하여 프로브의 절단을 모니터링하였다. 형광광도는 기준선을 보정하여, 웰(well) 인자들을 실험적 플래이트 방법을 사용하여 수집하였다. 형광광도 데이터를 지정된 시간동안 1분 간격으로 수집하였다. 55℃에서 20 mM의 Tris-HCl, pH 8.8, 10 mM의 KCl, 10 mM의 (NH₄)₂SO₄, 2 mM의 MgSO₄, 0.1%의 트리톤 X-100, 2 mM의 스퍼민(spermine), 500 μM의 데옥시뉴클레오티드 트리포스페이트(deoxynucleotide triphosphates), 8 U의 Bst DNA 중합효소, 5 U의 내열성(thermostable) RNase H, 328 nM의 프라이머, 및 10 pmol의 절단 프로브로 구성된 시료를 사용하여 모든 형광광도의 측정을 수행하였다.

회전환 증폭은 많은 양의 단일가닥 DNA를 빠르게 생산할 수 있는 등온(isothermal) 기술이다. 이 과정에서 환형이 가능한 올리고뉴클레오티드를 주형에 어닐링하고 연결시켜서 환형 DNA 합성의 기질을 제조하였다. 프라이머, dNTP 및 단일가닥 전위 DNA 중합효소를 첨가하여, 환형 기질의 다수의 반복 복제로 구성된 단일가닥 산물을 제조하였다. 절단 가능한 프로브에 대한 하나 또는 그 이상의 결합 부위가 환형 기질의 서열 내에 표시되어 있다. 산물이 생성됨에 따라, 결합 부위가 증가하게 되어 프로브의 결합이 가능하게 되고, RNase H에 의한 RNA 부분의 절단이 가능하게 된다. 이후, 프로브가 분리되고 사이클은 반복된다. 프로브가 분리된 후, 2개의 형광으로 표지된 DNA 단편들은 각각 확산되어 분리되며, 이에 따라 플루오레신(fluorescein)과 TAMRA 소진제(quencher) 사이의 거리가 멀어지므로 플루오레신의 형광광도가 증가되고, 이를 모니터링하였다. 최종적인 결과는 순환형 탐지 주기(cyclic detection phase)가 환형 기질의 DNA 증폭과 연계되는 과정이라 할 수 있다. 환형이 가능한 기질은 주형에 비해 과량으로 존재하기 때문에, 상기 방법의 민감도는 반응에 존재하는 주형의 양에 의해서 결정될 수 있다.

도 4는 50 ㎕의 반응액에 3.32 X 10^-17M(A) 및 3.32 X 10^-19M(B )의 농도의 표적 DNA가 존재할 때의 결과를 보여주며, 이는 각각 1000 분자(A)와 10 분자(B)의 주형에 상응하는 농도이다. 도 4의 플롯 C는 Bst DNA 중합효소가 없는 상태에서 수행된 음성 대조군이다. 그 결과, 회전환 증폭과 절단 가능한 프로브 탐지를 조합하여 사용하는 경우, 10 분자의 표적 DNA를 최소 60분 내에 탐지할 수 있음을 확인하였다.

<실시예 4> 형광성 프로브와 RNase H를 이용한 단일 뉴클레오티드 다형성 탐지

본 발명자들은 RNases H가 표적 서열의 RNA 혼성화 부위 내의 단일 염기쌍 불일치(single base pair mismatch)가 있는 프로브의 표적 서열을 절단할 수 있는가를 실험하였다(도 5). 불일치가 있는 4 가지 표적 DNA 올리고뉴클레오티드를 합성하였으며, 상기 올리고뉴클레오티드들은 하나의 불일치를 제외하고 프로브에 정확하게 상보적이다(서열번호 8, 5-AATTCAAAAA TCTT AAATGGCATA-3; 서열번호 9, 5-AATTCAAAAA TCCC AAATGGCATA-3; 서열번호 10, 5-AATTCAAAAA TTTC AAATGGCATA-3; 및 서열번호 11, 5-AATTCAAAAA CCTC AAATGGCATA-3). 예를 들면, 서열번호 8의 올리고뉴클레오티드 1C 에서 1T로의 치환은 프로브 상에서 첫 번째 5'-말단 RNA 뉴클레오티드에 대한 상보적인 서열이 C 에서 T로 변경되었다는 것을 의미한다. 각각의 불일치가 있는 표적 뉴클레오티드 20 pmol을 50 ㎕의 RNases H 완충액에서 10 pmol의 형광 프로브와 5 unit의 내열성(thermostable) RNase H와 함께 50℃에서 25분 동안 반응시킨 후, 형광광도를 모니터링하였다.

그 결과, 하나의 뉴클레오티드가 불일치되는 경우에도 RNases H가 프로브를 절단시키지 못하고, 그에 상응하는 형광광도의 증가를 가져오지 않았다. 즉, 상기 반응이 현저하게 특이적이라는 사실을 알 수 있었다. 따라서, 본 발명의 핵산탐지 방법 자체 또는 핵산 증폭반응과 결합하여 본 발명의 핵산 탐지방법을 사용한다면, 단일 뉴클레오티드 다형성(single nucleotide polymorphism; SNP)을 검출할 수 있는 매우 강력한 도구가 될 수 있음을 확인하였다.

상기에서 살펴본 바와 같이, 본 발명에서 핵산 반응의 실시간 탐지는 표적 핵산 및 표적 단백질을 실시간으로 빠른 속도와 민감도를 가지고 검출할 수 있다. 따라서, 항원 또는 항체를 검출하기 위한 면역 측정법 뿐만 아니라, 본 발명에 의한 프로브는 단일 뉴클레오티드 다형성을 용이하게 검색할 수 있으며, DNA 칩이나 단백질 칩의 분석에 있어서도 유용하게 응용될 수 있다.

<110> HAN, Myun Ki <120> Novel realtime detection of nucleic acids and proteins <130> 3p-10-48 <160> 11 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> fluorescent labeled cleavage probe <220> <221> misc_feature <222> (11)..(14) <223> ribonucleotide <400> 1 tatgccattt gagatttttg aatt 24 <210> 2 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthesized target nucleic acid <400> 2 aattcaaaaa tctcaaatgg cata 24 <210> 3 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for real-time PCR <400> 3 taggagttac actgagcctt a 21 <210> 4 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for real-time PCR <400> 4 taatggtaac ccttgtcttt ga 22 <210> 5 <211> 60 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligonucleotide template for rolling circle amplification assay <400> 5 atctgactat gcttgtacct ggttatttag cactcgtttt taatcagctc actagcacct 60 60 <210> 6 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> circularizable oligonucleotide for rolling circle amplification assay <400> 6 ctaaataacc aggtacaata tgccatttga gatttttgaa ttggtcttag aacgccattt 60 tggctgatta aaaacgagtg 80 <210> 7 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligonucleotide primer for rolling circle amplification assay <400> 7 tggcgttcta agacc 15 <210> 8 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mismatch target DNA oligonucleotide <400> 8 aattcaaaaa tcttaaatgg cata 24 <210> 9 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mismatch target DNA oligonucleotide <400> 9 aattcaaaaa tcccaaatgg cata 24 <210> 10 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mismatch target DNA oligonucleotide <400> 10 aattcaaaaa tttcaaatgg cata 24 <210> 11 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mismatch target DNA oligonucleotide <400> 11 aattcaaaaa cctcaaatgg cata 24

Claims

(1) DNA인 표적 핵산이 포함된 시료를 수득하는 단계;

(2) R₁--X--R₂ 구조를 갖는 핵산 프로브를 제조하는 단계로서,

여기서 R₁과 R₂는 DNA 또는 메틸화된 DNA이고, X는 1 내지 10개의 염기서열로 구성되는 RNA이며, 여기서 상기 핵산 프로브는 X의 절단부위와 인접하면서 0 내지 7개의 염기쌍의 거리로 떨어지는 FRET(Forster resonance energy transfer) 쌍으로 표지하는 단계;

(3) 단계 (1)에서 수득한 표적 핵산과 단계 (2)에서 제조한 프로브를 혼성화시켜 표적 핵산-프로브 복합체를 형성시키는 단계;

(4) 단계 (3)에서 형성된 표적 핵산-프로브 복합체에 RNase H를 처리하여 R₁과 R₂를 포함한 프로브 단편을 표적 핵산으로부터 분리시키는 단계;

(5) 상기 단계 (3)과 단계 (4)를 반복하는 단계; 및

(6) 상기 단계 (3) 내지 단계 (5)를 통해 분리된 프로브 단편의 양을 측정하는 단계를 포함하고, 상기에서 단계 (3) 및 단계 (4)는 표적 핵산의 증폭반응과 함께 수행되어 그 증폭 산물을 탐지하는 표적 핵산의 탐지방법.
제 1항에 있어서, 단계 (2)의 X는 4개의 염기서열로 구성되는 것을 특징으로 하는 표적 핵산의 탐지방법.
제 1항 또는 제 2항에 있어서, 단계 (2)의 FRET쌍은 4개의 염기쌍의 거리로 떨어지는 것을 특징으로 하는 표적 핵산의 탐지방법.
제 1항에 있어서, 단계 (2)의 FRET 쌍은 형광 공여체가 FAM(fluorescein succinimidyl ester)이고, 형광 수용체가 TAMRA(tetramethylrhodamine succinimidyl ester)인 것을 특징으로 하는 표적 핵산의 탐지방법.
제 1항에 있어서, 상기 표적 핵산의 증폭반응은 중합효소 연쇄반응(polymerase chain reaction), 회전환 증폭(rolling circle amplification), 핵산가닥 전치 증폭(strand displacement amplification) 및 핵산서열기반 증폭(nucleic acid sequence based amplification)으로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 표적 핵산의 탐지방법.
제 1항에 있어서, 단계 (4)의 RNase H는 내열성 RNase H인 것을 특징으로 하는 표적 핵산의 탐지방법.
제 1항에 있어서, 단계 (6)의 분리된 프로브 단편의 측정은 실시간 또는 반응이 종료된 후에 측정하는 것을 특징으로 하는 표적 핵산의 탐지방법.
(1) DNA인 표적 핵산이 포함된 시료를 수득하는 단계;

(2) R₁--X--R₂ 구조를 갖는 핵산 프로브를 제조하는 단계로서,

여기서 R₁과 R₂는 DNA 또는 메틸화된 DNA이고, X는 1 내지 10개의 염기서열로 구성되는 RNA이며, 여기서 상기 핵산 프로브는 X의 절단부위와 인접하면서 0 내지 7개의 염기쌍이 떨어지는 FRET(Forster resonance energy transfer) 쌍으로 표지하는 단계;

(3) 단계 (1)에서 수득한 표적 핵산과 단계 2에서 제조한 프로브를 혼성화시켜 표적 핵산-프로브 복합체를 형성시키는 단계;

(4) 단계 (3)에서 형성된 표적 핵산-프로브 복합체에 RNase H를 처리하여 R₁과 R₂를 포함한 프로브 단편을 표적 핵산으로부터 분리시키는 단계;

(5) 상기 단계 (3)과 단계 (4)를 반복하는 단계; 및

(6) 상기 단계 (3) 내지 단계 (5)를 통해 분리된 프로브 단편의 양을 측정하는 단계를 포함하는 단일 뉴클레오티드 다형성(single nucleotide polymorphism; SNP)의 존재를 탐지하는 방법.
제 8항에 있어서, 단계 (2)의 X는 4개의 염기서열로 구성되는 것을 특징으로 하는 단일 뉴클레오티드 다형성(SNP)의 존재를 탐지하는 방법.
제 8항 또는 제 9항에 있어서, 단계 (2)의 FRET 쌍은 4개의 염기쌍이 떨어지는 것을 특징으로 하는 단일 뉴클레오티드 다형성(SNP)의 존재를 탐지하는 방법.
제 8항에 있어서, 단계 (2)의 FRET 쌍은 형광 공여체가 FAM(fluorescein succinimidyl ester)이고, 형광 수용체가 TAMRA(tetramethylrhodamine succinimidyl ester)인 것을 특징으로 하는 단일 뉴클레오티드 다형성(SNP)의 존재를 탐지하는 방법.
제 8항에 있어서, 단계 (3) 및 단계 (4)는 표적 핵산의 증폭반응으로 이루어지는 것을 특징으로 하는 단일 뉴클레오티드 다형성(SNP)의 존재를 탐지하는 방법.
제 12항에 있어서, 상기 표적 핵산의 증폭반응은 중합효소 연쇄반응(polymerase chain reaction)인 것을 특징으로 하는 단일 뉴클레오티드 다형성(SNP)의 존재를 탐지하는 방법.
제 8항에 있어서, 단계 (4)의 RNase H는 내열성 RNase H인 것을 특징으로 하는 단일 뉴클레오티드 다형성(SNP)의 존재를 탐지하는 방법.
제 8항에 있어서, 단계 (6)의 분리된 프로브 단편의 측정은 실시간 또는 반응이 종료된 후에 측정하는 것을 특징으로 하는 단일 뉴클레오티드 다형성(SNP)의 존재를 탐지하는 방법.
제 8항에 있어서, 하기의 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 단일 뉴클레오티드 다형성(SNP)의 존재를 탐지하는 방법;

(7) 단계 (6)에서 측정된 프로브의 단편의 양을 통하여

ⅰ)절단된 핵산 프로브 단편이 탐지되면 핵산 프로브의 X와 혼성화하는 표적 핵산 부위 내에 단일 뉴클레오티드 다형성(SNP)가 없는 것으로 판단하고,

ⅱ)절단된 핵산 프로브 단편이 탐지되지 않으면 핵산 프로브의 X와 혼성화하는 표적 핵산 부위 내에 단일 뉴클레오티드 다형성(SNP)가 있는 것으로 판단하는 단계.
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