KR101013456B1

KR101013456B1 - 심플리실리움 라멜리콜라 ｂｃｐ 균주 배양용 배지 조성물 및 이의 배양방법

Info

Publication number: KR101013456B1
Application number: KR1020100117732A
Authority: KR
Inventors: 이재호; 신택수; 김봉수; 임재성; 우성균
Original assignee: 주식회사 그린바이오텍
Priority date: 2010-11-24
Filing date: 2010-11-24
Publication date: 2011-02-14
Anticipated expiration: 2030-11-24
Also published as: WO2012070891A2; WO2012070891A3

Abstract

본 발명은 심플리실리움 라멜리콜라 ＢＣＰ 균주 배양용 배지 조성물 및 이의 배양방법에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 특정 탄소원 및 질소원을 포함하는 심플리실리움 라멜리콜라 BCP 균주의 배양을 위한 배지 조성물 및 이를 이용한 심플리실리움 라멜리콜라 균주의 배양방법에 관한 것이다.

Description

심플리실리움 라멜리콜라 ＢＣＰ 균주 배양용 배지 조성물 및 이의 배양방법{Composition for the culturing of Simplicillium lamellicola BCP and culturing method using the composition}

본 발명은 심플리실리움 라멜리콜라 BCP 균주 배양용 배지 조성물 및 이의 배양방법에 관한 것이다.

균주 배양 시 어떠한 배지를 사용하느냐에 따라 균사 생장력이나 균총 모양이 달라질 수 있다. 균주를 배양하다 보면 균주들의 균사 생장력이 떨어지거나 균총의 선단부분이 불규칙하게 변하는 등의 변화를 나타내기도 하는데, 이는 배지의 조성이나 배양 조건이 달라진 데에 따른 경우가 많다. 경우에 따라서, 배지의 종류에 따라 균을 대량 증식시키는 데에도 어려움이 있을 수 있다.

따라서, 기존의 PDB(포테이토 덱스트로스 브로스, Potato dextrose broth)를 대체 가능하면서도 심플리실리움 라멜리콜라 BCP 균주의 배양을 최적화할 수 있는 배지 선정이 중요하다. 심플리실리움 라멜리콜라 BCP 균주의 배양에는 PDB가 주로 사용되어 왔으나, PDB는 복합배지로서 정확한 성분을 알 수 없는 문제점이 있다.

본 발명은 심플리실리움 라멜리콜라 BCP 균주의 배양을 위한 최적의 배지 조성물 및 이를 이용한 심플리실리움 라멜리콜라 BCP 균주의 배양방법을 제공하며, 구체적으로 본 발명은 수크로오스, 과당 및 덱스트린으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 하나 이상의 탄소원; 및 대두분(soybean meal) 및 트립톤(tryptone)으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 하나 이상의 질소원을 배지 성분으로 포함하는 심플리실리움 라멜리콜라 BCP(Simplicillium lamellicola BCP) 균주 배양용 배지 조성물 및 상기 조성물을 이용하여 심플리실리움 라멜리콜라 BCP을 배양하는 방법을 제공하는데 목적이 있다.

상기 문제점을 해결하기 위해, 본 발명에서는 최적 탄소원 및 질소원을 포함하는 배지 조성을 제공하고, 최적의 배양온도, 배양초기 pH, 배양시간을 설정함으로써, 심플리실리움 라멜리콜라 BCP 균주 배양용 배지 조성물 및 배양 조건을 최적화하였다.

본 발명은 심플리실리움 라멜리콜라 BCP 균주의 최적 배지 조성 및 배양 조건을 확립함으로써, 균질한 배지를 얻을 수 있고, 심플리실리움 라멜리콜라 BCP 균주의 포자 생산 수율을 2배 이상 높일 수 있으며, 포자 안정성을 크게 향상시킨다는 장점이 있다.

도 1은 배양 온도에 따른 심플리실리움 라멜리콜라 BCP의 포자 생산 수율 측정 결과를 도시한 것이다.
도 2는 배양 초기 pH에 따른 심플리실리움 라멜리콜라 BCP의 포자 생산 수율 측정 결과를 도시한 것이다.
도 3은 배양 시간에 따른 심플리실리움 라멜리콜라 BCP의 포자 생산 그래프이다.
도 4는 초기 접종 농도에 따른 심플리실리움 라멜리콜라 BCP의 포자 생산 그래프이다.
도 5는 과당(fructose) 농도에 따른 심플리실리움 라멜리콜라 BCP의 포자 생산 수율 측정 결과를 도시한 것이다.
도 6은 대두분(Soybean meal) 농도에 따른 심플리실리움 라멜리콜라 BCP의 포자 생산 수율 측정 결과를 도시한 것이다.
도 7은 PBD(Plackett-Burman Design)에 따라 배지 성분이 심플리실리움 라멜리콜라 BCP 균주의 포자 생산 수율에 미치는 주요인 효과 분석 결과를 도시한 것이다.
도 8은 배지 종류에 따른 심플리실리움 라멜리콜라 BCP의 배양 수율 변화를 나타낸 그래프이다.
도 9는 배지 종류에 따른 심플리실리움 라멜리콜라 BCP의 경시 안정성 변화를 나타낸 그래프이다.

본 발명은 심플리실리움 라멜리콜라 BCP 균주의 배양을 위한 최적의 배지 조성물 및 이를 이용한 심플리실리움 라멜리콜라 BCP 균주의 배양방법에 관한 것이다.

이와 같은 본 발명을 더욱 상세히 설명하면 다음과 같다.

본 발명은 수크로오스, 과당 및 덱스트린으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 하나 이상의 탄소원; 및 대두분(soybean meal) 및 트립톤(tryptone)으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 하나 이상의 질소원을 배지성분으로 포함하는 심플리실리움 라멜리콜라 BCP(Simplicillium lamellicola BCP) 균주 배양용 배지 조성물을 포함한다.

본 발명의 배지 조성물 중에는 탄소원이 1.0 내지 5.0 w/v%, 바람직하게 2 내지 4 w/v%, 보다 바람직하게 3 내지 3.5 w/v% 포함될 수 있다. 상기 범위 밖에서는 포자 생산 수율이 낮아질 우려가 있다.

본 발명의 배지 조성물 중에는 질소원이 0.5 내지 4.0 w/v%, 바람직하게 2 내지 4.0 w/v%, 보다 바람직하게 2.5 내지 3.0 w/v% 포함될 수 있다. 상기 범위 밖에서는 포자 생산 수율이 낮아질 우려가 있다.

본 발명의 배지 조성물은, 무기물원을 추가로 포함할 수 있다. 본 발명의 일 예에서, 이로 제한되지는 않으나, 황산마그네슘, 염화칼륨, 염화마그네슘, 염화나트륨, 황산철(ferrous sulfate), 염화칼슘, 이인산칼륨(dipotassium phosphate), 황산구리, 황산아연, 질산칼륨, 질산암모늄, 인산이수소칼륨, 요오드화칼륨 및 몰리브덴산나트륨으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 하나 이상이 바람직하다.

본 발명은 특히 과당, 대두분, 황산마그네슘을 배지성분으로 포함하는 심플리실리움 라멜리콜라 BCP 균주 배양용 배지 조성물을 제공한다.

상기 배지는 보다 바람직하게 1.0 내지 5.0 w/v%의 과당; 0.5 내지 4.0 w/v%의 대두분; 0.1 내지 1 w/v%의 황산마그네슘을 포함함으로써, 심플리실리움 라멜리콜라 BCP 균주의 포자 생산 수율을 높일 수 있다.

또한, 상기 배지에는 염화칼륨, 이인산칼륨 및 황산철과 같은 무기물원이 추가로 포함될 수 있으며, 상기 배지 중에는 0.1 내지 1 w/v%의 염화칼륨; 0.05 내지 0.5 w/v%의 이인산칼륨; 및 0.0001 내지 0.01 w/v%의 황산철이 포함될 수 있다.

본 발명은 상기 언급된 배지 조성물 중에서 심플리실리움 라멜리콜라 BCP 균주를 배양하는 방법을 제공한다.

상기 배지 조성에 따라 제조한 배지에 초기 농도 0.1 내지 5 w/v%, 보다 구체적으로 0.5 내지 2 w/v% 수준의 심플리실리움 라멜리콜라 BCP 균주 씨드를 접종한다. 상기 농도범위 밖에서는 생육이 다소 낮아질 우려가 있다.

배양 시, 배양 온도는 15 내지 37 ℃, 바람직하게 15 내지 33℃, 보다 바람직하게 20 내지 25℃로 할 수 있다. 배양 온도가 15℃ 이하인 경우, 생육 정도는 증가하나 생육 속도가 늦고 포자형성 수율이 크게 떨어질 우려가 있으며, 37℃ 이상인 경우 오염이 쉽게 일어나고 최종 배양산물의 양도 감소할 우려가 있다.

배양 시, pH는 3 내지 8로 조절하는 것이 적합하며, 바람직하게 pH 3.5 내지 6, 보다 바람직하게 pH 4 내지 5일 수 있다. pH 3 미만에서는 생육이 거의 불가능하고, 포자 생산 수율이 낮아질 우려가 있고, pH 8을 초과하는 경우 최종 배양산물의 양이 감소할 수 있다. 상기 pH는 배양 초기의 pH를 말하며, 배양 초기란 영양배지를 멸균하고 심플리실리움 균을 접종하기 전 상태에서 균을 접종한 직후까지를 말한다. pH 조정은 멸균 이전에 이루어지나 최종적인 pH 측정은 멸균 직후에 이루어지므로 최초로 균을 접종하여 생장하기 시작하는 시기의 pH를 배양 초기 pH로 잡는다.

배양시, 배양 기간은 500 내지 5000 L 배양기 기준으로, 20시간 이상, 구체적으로 30시간 내지 7일, 보다 구체적으로 50시간 내지 6일일 수 있다. 배양 기간이 20시간 미만인 경우, 포자 보다 균사가 많아 건조 시 수율이 낮아질 우려가 있고, 배양 기간이 7일을 초과하는 경우 배양 과정에서 생긴 물질이 미생물을 사멸시켜 수율이 낮아질 우려가 있다.

배양 시, 교반 속도 및 공기 투입율은 미생물의 생육에 맞추어 적절히 설정할 수 있으며, 배양 조건 및 상태에 따라 변동될 수 있다. 또한, 배양 시 생성되는 기포는 오염 등의 문제를 일으킬 수 있기 때문에 제거하는 것이 바람직하며, 예컨대 KONION GE-304 등과 같은 장치를 이용하여 소포를 실시할 수 있다. 초기 투입비율은 0.1 내지 1 w/v% 수준으로 할 수 있으며, 배양 중에 0.01 내지 0.1 w/v%의 수준으로 기포가 생길 때마다 투입하여 소포할 수 있다.

최초 배양 직후 -90 내지 -10℃, 구체적으로 -80 내지 -20 ℃, 보다 구체적으로 -70 내지 -30 ℃의 온도로 동결하여 동결건조를 실시할 수 있으나, 배양액의 양이 많아 한 번에 동결을 시키기 어려운 경우에는 최종 pH를 5 미만으로 조정함으로써 오염과 미생물의 번식을 억제할 수 있다.

이하, 본 발명에 따르는 실시예 및 본 발명에 따르지 않는 비교예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명하나, 본 발명의 범위가 하기 제시된 실시예에 의해 제한되는 것은 아니다.

< 실시예 1>

하기 표 1에 기재된 조성에 따라 생장 배지를 제조하였다:

배지 조성

조성 성분	함량(w/v%)	투입량(g/L)
과당(Fructose)	3.0	30
대두분(Soybean meal)	3.0	30
MgSO₄ㆍ7H₂O	0.5	5
KCl	0.5	5
K₂HPO₄	0.1	1
FeSO₄7H₂O	0.001	0.01

< 실험예 >

1. 균주 및 기본 배지 선정

심플리실리움 라멜리콜라 BCP 균주를 한국화학연구원으로부터 분양받아 사용하였다[기탁번호: KCTC0639BP]. 상기 균주 1 w/v%를 배지에 접종하여 하기와 같은 실험을 수행하였다.

기본 배지로서 CDB(Czapek-Dox Broth: sucrose 30 g/L, sodium nitrate 3.0 g/L, dipotassium phosphate 1.0 g/L, magnesium sulfuate 0.5 g/L, potassium chloride 0.5 g/L, ferrous sulfate 0.01 g/L, pH 7.3)를 선정하였다.

2. 물리적, 화학적 배양 조건 검토

CDB 배지(50ml, 250ml-삼각플라스크)에서 배양 온도, 배양 초기 pH, 배양 시간과 같은 물리적, 및 화학적 배양 조건이 심플리실리움 라멜리콜라 BCP 균주의 포자 생산량에 미치는 영향을 조사하였다.

PDA에서 7 ~ 10일간 자란 균총의 5×5㎟ 절편 5개를 접종하였다. 포자 생산 수율을 조사하기 위해서, 배양액 내 포자의 수를 400배 현미경 하에서 호모사이토미터를 이용하여 계수하였다. 배양액 내의 배양액의 물성은 대체로 균질적이었으나 전체적으로 작은 균체 덩어리가 다수 형성되었으며 현미경으로 관찰한 결과 이 덩어리에 많은 포자가 뭉쳐있는 것이 관찰되었다. 그래서 배양이 끝난 후 균질기로 10초간 마쇄하여 포자를 균질하게 풀어 준 후에 보르텍스 믹서(vortex mixer)로 충분히 현탁시킨 다음 포자 수를 계수하였다. 시험은 3회 반복 시험하였다.

(1) 배양 온도에 따른 영향 측정

배지 제조 시 초기 pH는 7.3이었고, 배양 온도는 20, 22, 25, 27, 30℃로 달리하여 5일간 배양(120 rpm)한 다음, 위에 설명한 방법에 따라 배양액 내 포자 수를 계수하였다.

심플리실리움 라멜리콜라 BCP은 20℃ 이하의 저온에서는 포자 형성 수율이 다소 떨어졌고, 22℃가 최적 온도였으며, 25℃ 이후부터 포자 형성 수율이 떨어지는 경향을 나타내었다 [도 1].

(2) 배양 초기 pH 에 따른 영향 측정

배양 온도는 22℃로 고정하였고, 배지의 pH는 HCl과 NaOH를 사용하여 각각 4, 5, 6, 7, 8로 조정하여 5일간 배양(120 rpm)한 다음, 배양액 내 포자 수를 계수하였다.

배지의 초기 pH가 심플리실리움 라멜리콜라 BCP의 포자 생산 수율에 미치는 영향을 검토한 결과 7.0 이상의 염기성 pH에서는 포자 생산 수율이 낮았고 pH 4.0 ~ 5.0에서 우수하였으며 6.0 이상에서는 낮아졌다. 최적 pH는 4.5로 판단되었다[도 2].

(3) 배양 시간에 따른 영향

상기 두 실험에서 결정된 최적 온도 22℃와 최적 초기 pH 4.5 조건으로 1L 플라스크(working volume 200 ml)에서 3회 반복으로 9일간 배양(150 rpm)하면서 24시간 간격으로 5 ml씩 시료를 채취하여 배양액 내 포자 수를 계수하였다.

배양 시간에 따른 포자 생산 추이를 조사한 결과 3일째까지는 포자가 거의 형성되지 않다가 3일 이후부터 급속히 형성되기 시작하여 5일째 거의 최대 수준에 도달하였으며, 8일까지 일정 수준을 유지하였다(도 3).

3. 배지 최적화 조건 실험

(1) 탄소원에 따른 영향 측정

탄소원이 포자 생산 수율이 미치는 영향을 조사하기 위하여 CDB 배지의 탄소원으로 쓰이고 있는 수크로오스(sucrose)를 각각 다른 탄소원 1.5%(w/v)로 대체 첨가하여 제조하였다. 이 실험에서 시험한 탄소원은 가용성 전분(soluble starch), 덱스트린(dextrin), 말토오스(maltose), 락토오스(lactose), 만니톨(mannitol), 갈락토오스(galactose), 과당(fructose), 글루코오스(glucose), CMC였다. 배양조건은 온도 22℃, 초기 pH 4.5, 120 rpm으로 고정하여 5일간 배양하였다. 최종 배양액에서 포자 수를 계수하였고 배양액의 물성도 조사하였다. 시험은 3회 반복 시험하였다.

탄소원이 포자 생산 수율에 미치는 영향을 조사한 결과 기본 배지인 CDB의 수크로오스 보다 우수한 효과별로 보인 탄소원은 과당이었고, 나머지 탄소원들은 수크로오스 보다 포자 생산 수율이 낮았을 뿐만 아니라 배양액의 물리적인 특성도 불리하였다(표 2). 가용성 전분은 균사덩어리가 매우 크게 형성되었고 말토오스, 락토오스, 갈락토오스도 비교적 큰 균사덩어리가 매우 많이 형성되었던 반면, 포자수는 낮았다. 글루코오스는 균사덩어리가 비교적 적은 편이었지만 포자수가 낮았다. 덱스트린은 배양액이 덩어리가 거의 없이 매우 균질적이었으나, 포자수가 비교적 낮은 편이었다. 과당은 기본 배지 CDB 보다는 덜 균질적이었지만, 포자수가 CDB 약 47% 증가하였고, 균사 덩어리도 거의 볼 수 없었다. 만니톨과 CMC에서는 곰팡이 생장이 일어나지 않았다. 이것은 이 형태의 탄소원을 심플리실리움 라멜리콜라 BCP이 이용하지 못하기 때문으로 생각되었다.

심플리실리움 라멜리콜라 BCP의 포자 생산 수율과 배양 특성에 미치는 탄소원의 영향

탄소원 (1.5 w/v%)	포자 밀도 (conidia/ml)	배양액의 특성
가용성 전분(Soluble starch)	3.2E+6	균사덩어리 형성 (+++)
덱스트린(Dextrin)	4.2E+7	균질적(+++)
말토오스(Maltose)	6.3E+6	균사덩어리 형성(++)
락토오스(Lactose)	1.9E+7	균사덩어리 형성(++)
만니톨(Manitol)	생장하지 않음	-
갈락토오스(Galactose)	7.5E+6	균사덩어리 형성(++)
과당(Fructose)	2.7E+8	균질적(+)
글루코오스(Glucose)	3.4E+6	균사덩어리 형성(+)
CMC	생장하지 않음	-
수크로오스 (Czapek-Dox broth, 대조)	1.7E+8	균질적(++)

(2) 과당( Fructose ) 농도에 따른 영향 측정

상기 탄소원 실험에서 포자 생산 수율이 제일 높고 배양액의 물성도 우수했던 과당에 대하여 농도에 따른 포자 생산 수율을 조사하였다. CDB 기본 배지에서 탄소원으로 쓰이고 있는 수크로오스를 빼고 과당으로 대체하여 1.0 w/v%부터 1.0 w/v% 단위로 5.0 w/v%까지 과당 함량을 높여가며 배지를 제조하였다. 배양조건은 온도 22℃, 초기 pH 4.5, 120 rpm으로 고정하여 5일간 배양하였다. 최종 배양액에서 포자 수를 계수하였다. 시험은 3회 반복 시험하였다.

위의 탄소원 시험 결과에 따라 과당의 최적 농도를 조사하였다. 1.0 w/v%부터 1.0 w/v% 간격으로 5.0 w/v%까지 시험한 결과, 3.0 ~ 5.0 w/v%까지 높은 포자 생산 수율을 보여주었고 그 이전에는 감소하는 경향을 보였다(도 5). 과당의 탄소원 농도 변이를 고려하여 최적 조건은 3.0%로 정하였다.

(3) 질소원에 따른 영향 측정

질소원이 포자 생산 수율이 미치는 영향을 조사하기 위하여 CDB 배지의 질소원으로 쓰이고 있는 NaNO₃를 3 w/v%를 없애고 각각 다른 질소원을 1.0 w/v% 첨가하여 제조하였다. 탄소원은 앞의 실험에서 결정된 과당 3 w/v%로 수크로오스 3 w/v%를 대체하였다. 이 실험에서 시험한 질소원은 대두분, 이스트 추출물, 트립톤(tryptone), 펩톤(peptone), 비프 추출물(beef extract), (NH₄)₂SO₄, NH₄Cl, NH₂CO₂, NH₃NO₃였다. 배양조건은 온도 22℃, 초기 pH 4.5, 120 rpm으로 고정하여 5일간 배양하였다. 최종 배양액에서 포자 수를 계수하였다.

질소원이 포자 생산 수율에 미치는 영향을 조사한 결과, 기본 배지인 CDB의 질산나트륨보다 우수한 효과별로 보인 질소원은 대두분(soybean meal) 및 트립톤이었다(표 3). 전반적으로 암모니아 형태의 질소원은 심플리실리움 라멜리콜라 BCP이 잘 이용하지 못하는 것으로 나타났다.

심플리실리움 라멜리콜라 BCP의 포자 생산 수율과 배양 특성에 미치는 질소원의 영향

질소원 (1.0 w/v%)	포자 밀도 (conidia/ml)
대두분(Soybean meal)	5.0E+8
이스트 추출물(Yeast extract)	2.8E+8
트립톤(Tryptone)	1.4E+8
펩톤(Peptone)	7.5E+7
비프 추출물(Beef extract)	1.2E+6
(NH₄)₂SO₄	1.3E+4
NH₄Cl	<1.0E+4(검출한계 이하)
NH₂CO₂	<1.0E+4(검출한계 이하)
NH₃NO₃	1.2E+7
NaNO₃ (Czapek-Dox broth, 대조)	1.2E+8

(4) 대두분( Soybean meal ) 농도에 따른 영향 측정

상기 질소원 실험에서 포자 생산 수율이 제일 높았고 배양액의 물성도 우수했던 대두분에 대하여 농도에 따른 포자 생산 수율을 조사하였다. 기본 배지 CDB에서 탄소원은 과당 3 w/v%를 사용하였고 질소원은 대두분을 0.5 w/v%부터 4.0 w/v%까지 1.0 w/v%씩 증가시켜 배지를 제조하였다. 배양조건은 온도 22℃, 초기 pH 4.5, 120 rpm으로 고정하여 5일간 배양하였다. 최종 배양액에서 포자 수를 계수하였다. 시험은 3회 반복 시험하였다.

위 질소원 실험에서 우수한 질소원으로 선발된 대두분의 최적 농도를 알아보기 위하여 0.5 w/v%부터 1.0 w/v% 단위로 4.0 w/v%까지 농도 시험을 시행한 결과 3.0 ~ 4.0 w/v%에서 최대 포자 생산 수율을 보였다(도 6). 그러나, 2.0 w/v% 이하에서는 급격히 포자 생산 수율이 감소하는 것으로 나타났다. 대두분의 질소원 농도 변이 및 원료비용 등을 고려하여 최적 조건은 3.0 w/v%로 정하였다.

(5) 무기물원에 따른 영향

CDB에서 무기물원으로 함유되어 있는 이인산칼륨(Dipotassium phosphate), 황산마그네슘(magnesium sulfuate), 염화칼륨(potassium chloride), 황산철(ferrous sulfate)을 빼고 9가지 무기물(magnesium sulfate, sodium chloride, potassium chloride, ferrous sulfate, calcium chloride, cupric sulfate, magnesium chloride, Zinc sulfate, barium chloride)을 한 가지씩 0.1 w/v% 첨가하여 포자 생산 수율에 미치는 영향을 시험하였다. 탄소원은 과당 3.0 w/v%, 질소원은 대두분 3.0 w/v%를 첨가하였다. 배양조건은 배양온도 25℃, 초기 pH 4.5, 120 rpm으로 하여 5일간 배양하였다. 최종 배양액에서 포자 수를 계수하였고 시험은 3회 반복하였다.

각종 무기물원이 포자 생산 수율에 미치는 영향을 조사한 결과, 단일 무기물이 포자 생산 수율을 증가시키는 효과는 나타나지 않았다(표 4). 이것은 여러 무기물이 동시에 일정양이 필요하거나 어느 한 가지가 절대적으로 필요하지는 않다는 것을 의미할 수 있다.

심플리실리움 라멜리콜라 BCP의 포자 생산 수율과 배양 특성에 미치는 무기물원의 영향

무기물원 (0.1 w/v%)	포자 밀도 (conidia/ml)
황산마그네슘(Magnesium sulfate)	1.0E+8
염화나트륨(Sodium chloride)	2.3E+7
염화칼륨(Potassium chloride)	1.8E+8
황산철(Ferrous sulfate)	1.6E+7
염화칼슘(Calcium chloride)	8.2E+7
황산동(Cupric sulfate)	5.6E+7
염화마그네슘(Magnesium chloride)	1.2E+8
황산아연(Zinc sulfate)	5.6E+7
염화바륨(Barium chloride)	<1.0E+4

이 실험으로 필요한 무기물원을 결정하기 어렵기 때문에 CDB에서 주로 사용되는 무기물원을 중심으로 주요인 효과를 찾아내는 PBD 기술을 적용하여 주로 필요한 무기물원을 선정하고자 하였다.

(6) PBD( Plackett - Burman Design )

상기 실험에서 탄소원으로 선발된 과당과 질소원으로 선발된 대두분을 포함하여 기존의 질소원 질산나트륨과 기본 배지 CDB의 무기물 4가지(magnesium sulfate, dipotassium phosphate, potassium chloride, ferrous sulfate) 중에서 포자 생산 수율에 크게 영향을 미치는 요인을 찾아내기 위하여 PBD(Plackett-Burman Design)에 따라 시험하였다. PBD란 사용된 배지성분이 생장에 어떤 영향을 주는지를 알 수 있는 통계적 처리 방법이며, 이것은 배지 성분 중 주효과를 나타내는 성분들을 찾아낼 수 있다.

PBD는 하기 표 5와 같이 12개의 실험군과 3개의 기준군을 사용하고 12개의 실험군에는 +run 은 200% 의 배지 성분을, -run 은 20%의 배지 성분으로 하여 12개 run을 각각 배지별로 +6개, -6개씩 무작위화 하여 만든 배지와 중심값인 0값으로 이뤄진 배지(기준군)를 3개 만들어 그 값을 기준으로 한다. 1~12번까지는 +와 - 의 무작위화한 배지 조성에 의한 것이고, 1315번은 중심값에 의한 배지 조성이다. 이 각 run에 대하여 얻어진 포자 밀도값에 대하여 표준 편차 의해 그 실행치의 증가가 그 값에 어떤 효과를 보여주는지를 알 수 있게 된다. 주효과는 각 성분에 대한 +run의 표준편차 값에서 -run 값을 뺀 것으로 나타내는데 +표준편차 값이 높은 것일수록 주요 효과를 나타내는 배지 성분이 되며, 이 성분의 증가가 세포의 성장에 절대적인 도움이 된다는 것을 의미한다.

이 연구에 적용한 Plackett-Burman Design(PBD)

Run	Fructose	Soybean meal	Magnesium sulfate	Sodium nitrate	Dipotassium phosphate	Potassium chloride	Ferrous sulfate
1	+(30)	-(3.0)	+(5.0)	-(0.3)	-(0.1)	-(0.5)	+(0.01)
2	+(30)	+(30)	-(0.5)	+(3.0)	-(0.1)	-(0.5)	-(0.001)
3	-(3.0)	+(30)	+(5.0)	-(0.3)	+(1.0)	-(0.5)	-(0.001)
4	+(30)	-(3.0)	+(5.0)	+(3.0)	-(0.1)	+(5.0)	-(0.001)
5	+(30)	+(30)	-(0.5)	+(3.0)	+(1.0)	-(0.5)	+(0.01)
6	+(30)	+(30)	+(5.0)	-(0.3)	+(1.0)	+(5.0)	-(0.001)
7	-(3.0)	+(30)	+(5.0)	+(3.0)	-(0.1)	+(5.0)	+(0.01)
8	-(3.0)	-(3.0)	+(5.0)	+(3.0)	+(1.0)	-(0.5)	+(0.01)
9	-(3.0)	-(3.0)	-(0.5)	+(3.0)	+(1.0)	+(5.0)	-(0.001)
10	+(30)	-(3.0)	-(0.5)	-(0.3)	+(1.0)	+(5.0)	+(0.01)
11	-(3.0)	+(30)	-(0.5)	-(0.3)	-(0.1)	+(5.0)	+(0.01)
12	-(3.0)	-(3.0)	-(0.5)	-(0.3)	-(0.1)	-(0.5)	-(0.001)
13	0(16.5)	0(16.5)	0(2.75)	0(1.75)	0(0.55)	0(2.75)	0(0.0055)
14	0(16.5)	0(16.5)	0(2.75)	0(1.75)	0(0.55)	0(2.75)	0(0.0055)
15	0(16.5)	0(16.5)	0(2.75)	0(1.75)	0(0.55)	0(2.75)	0(0.0055)

* 괄호안의 값은 각 성분의 함량(g/L)

최적 탄소원 과당과 최적 질소원 대두분 외에 어느 무기물원이 심플리실리움 라멜리콜라 BCP의 포자 생산 수율을 향상시키는데 필요한지를 알아보기 위하여 PBD 기술을 적용하였다. 그 결과, 과당, 대두분, 황산마그네슘, 염화칼륨의 함량은 더 높여주는 것이 포자 생산 수율에 유리한 것으로 나타났고, 반대로 질산나트륨의 함량은 줄이는 것이 유리한 것으로 나타났다(도 7). 이인산칼륨, 황산철은 포자 생산 수율에 큰 영향을 미치지는 않는 것으로 나타났다.

심플리실리움 라멜리콜라 BCP 균주의 액체배양 배지 조성

성분	농도 (g/L)	함량(w/v%)
과당	30.0	3
대두분	30.0	3
MgSO₄ㆍ7H₂O	5.0	0.5
KCl	5.0	0.5
K₂HPO₄	1.0	0.1
FeSO₄ㆍ7H₂O	0.01	0.001

상기 실험 결과를 종합하여 하기 표 7과 같은 최적 배지 조성을 정하였다. PBD 결과에서 양을 늘리는 것이 유리하다고 판단되었던 황산마그네슘(magnesium sulfate)과 염화칼륨(potassium chloride)의 양은 CDB의 함량 기준 0.05 w/v% 보다 높게 0.5 w/v%로 정하였다. 대신 함량을 줄이는 것이 유리하다고 판단되었던 질산나트륨(sodium nitrate)은 배지 조성에서 제거하였다. PBD에서 주효과가 크게 나타나지 않았던 이인산칼륨(dipotassium phosphate), 황산철(ferrous sulfate)은 CDB와 동일한 함량으로 정하였다. 과당과 대두분의 함량은 PBD 결과에 따르면 함량을 늘리는 것이 포자 생산 수율을 올리는데 유리한 것으로 나타났지만 농도별 결과에 따라 농도를 올릴 경우 억제 효과가 나타날 우려가 있었으므로 앞서 실험에서 결정된 최적 농도로 정하였다.

최적 배지 조성

성분	함량(g/L)	함량(w/v%)
과당	30.0	3
대두분	30.0	3
황산마그네슘(Magnesium sulfate)	5.0	0.5
염화칼륨(Potassium chloride)	5.0	0.5
이인산칼륨(Dipotassium phosphate)	1.0	0.1
황산철(Ferrous sulfate)	0.01	0.001

상기 표 7의 최적 배지 조성과 PDB(포테이토 덱스트로스 배지)로 심플리실리움 라멜리콜라 BCP를 배양한 결과를 도 8 및 도 9에 나타내었다.

Claims

과당, 덱스트린 및 수크로오스로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 하나 이상의 탄소원; 및
대두분(soybean meal) 및 트립톤(tryptone)으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 하나 이상의 질소원
을 배지성분으로 포함하는 것을 특징으로 하는 심플리실리움 라멜리콜라 BCP(Simplicillium lamellicola BCP) 균주 배양용 배지 조성물.
제 1 항에 있어서,
황산마그네슘, 염화칼륨, 염화마그네슘, 염화나트륨, 황산철, 염화칼슘, 이인산칼륨, 황산구리, 황산아연, 질산칼륨, 질산암모늄, 인산이수소칼륨, 요오드화칼륨 및 몰리브덴산나트륨으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 하나 이상의 무기물원을 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 심플리실리움 라멜리콜라 BCP 균주 배양용 배지 조성물.
제 1 항에 있어서,
상기 배지에 1.0 내지 5.0 w/v%의 탄소원 및 0.5 내지 4.0 w/v%의 질소원이 함유되는 것을 특징으로 하는 심플리실리움 라멜리콜라 BCP 균주 배양용 배지 조성물.
제 1 항에 있어서,
상기 배지는 1.0 내지 5.0 w/v%의 과당; 0.5 내지 4.0 w/v%의 대두분; 0.1 내지 1 w/v%의 황산마그네슘을 필수 배지성분으로 포함하는 것을 특징으로 하는 심플리실리움 라멜리콜라 BCP 균주 배양용 배지 조성물.
제 4 항에 있어서,
0.1 내지 1 w/v%의 염화칼륨; 0.05 내지 0.5 w/v%의 이인산칼륨; 및 0.0001 내지 0.01 w/v%의 황산철을 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 심플리실리움 라멜리콜라 BCP 균주 배양용 배지 조성물.
제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항의 배지 조성물에서 심플리실리움 라멜리콜라 BCP 균주를 배양하는 방법.
제 6 항에 있어서,
상기 배지에 0.1 내지 5 w/v%의 심플리실리움 라멜리콜라 BCP를 접종하는 것을 특징으로 하는 심플리실리움 라멜리콜라 BCP 균주를 배양하는 방법.
제 6 항에 있어서,
배양 온도가 15 내지 37℃인 것을 특징으로 하는 심플리실리움 라멜리콜라 BCP 균주를 배양하는 방법.
제 6 항에 있어서,
배양 pH가 3 내지 8인 것을 특징으로 하는 심플리실리움 라멜리콜라 BCP 균주를 배양하는 방법.
제 6 항에 있어서,
배양 기간이 20시간 이상인 것을 특징으로 하는 심플리실리움 라멜리콜라 BCP 균주를 배양하는 방법.