KR100852078B1

KR100852078B1 - 심혈관계로의 유전자 전달을 위한 파라믹소바이러스 벡터

Info

Publication number: KR100852078B1
Application number: KR1020037006270A
Authority: KR
Inventors: 그리젠바흐우타; 페라리스테파노; 게더스던칸엠.; 알톤에릭더블유에프더블유; 하세가와마모루; 허우샤오강
Original assignee: 가부시키가이샤 디나벡크 겐큐쇼
Priority date: 2000-11-08
Filing date: 2001-11-08
Publication date: 2008-08-13
Anticipated expiration: 2021-11-08
Also published as: EP1334174A2; EP1662003A2; HK1070100A1; DE60118771T2; JP2002142770A; DK1334174T3; EP1334174B1; CA2428073C; WO2002038726A3; AU2002212733A1; EP1662003A3; ATE323149T1; CA2428073A1; ES2260301T3; CN1555417B; WO2002038726A2; KR20030074617A; US20040101965A1; DE60118771D1; CN1555417A

Abstract

본 발명은 심혈관계로 유전자를 전달하기 위한 파라믹소바이러스 벡터 및 그의 용도를 제공한다. 본 발명은 상기 파라믹소바이러스 벡터를 사용하여 외래 유전자 산물을 심혈관계로 효율적으로 전달할 수 있게 한다. 상기 파라믹소바이러스 벡터의 비내 또는 근육내 투여에 의해 도입된 유전자 산물들은 혈액에서 높은 수준으로 검출되었다. 소염성 시토킨인 IL-10의 발현을 위한 벡터의 투여는 폐 섬유증 동물 모델의 폐에서 콜라겐 침착을 억제하였다. 따라서, 본 발명의 벡터는 유전자를 심혈관계로 전달하기에 적합하다.

파라믹소바이러스, 센다이 바이러스, 심혈관, IL-10, 유전자 전달, 소염성, 비갑개

Description

심혈관계로의 유전자 전달을 위한 파라믹소바이러스 벡터{Paramyxovirus vector for gene transfer to the cardiovascular system}

본 발명은 심혈관계로 유전자를 전달하기 위한 파라믹소바이러스 벡터에 관한 것이다.

최근에, 유전자 요법이 각종 질병에서 연구되고 있다. 이 요법은 치료 효과를 갖는 유전자를 환자에게 외래적으로 도입시켜 생체 내에서 발현시키는 치료 방법이다. 유전자 요법에 사용되는 벡터의 예로는 DNA 자체, 리포솜에 함유된 DNA 또는 바이러스 벡터가 있다. 이들 벡터를, 직접적으로 투여하거나(생체 내 유전자 요법) 또는 환자에게 후속적으로 도입되는 세포를 형질 전환(생체 외 유전자 요법)시키는데 사용할 수 있다.

예를 들어, 유전자 요법에 의해 치료될 수 있는 질병에는 낭성 섬유증(CF, cystic fibrosis)과 같은 폐 섬유증(pulmonary fibrosis)이 포함된다. CF는 선천적 대사 장애를 일으키는 상염색체성 열성 유전병이다. CF는 코카서스인 사이에서 어린이 2,000 내지 2,500 명 당 한명 꼴로 빈번히 발생한다. CF 환자의 경우, 외분비선 이상으로 인해 폐, 호흡기도, 췌장, 간 및 소장을 포함한 많은 조직에서 점액성 분비물이 쌓인다. 항생제 및 폐 이식에 의한 폐 감염의 억제는 폐 감염이 특히 치명적인 이들 CF 환자에서 주된 치료를 구성한다. CF 환자의 폐에서, 호흡기도 조직은 만성 염증에 의해 점진적으로 파괴된다. 상기와 같은 조직에서, 전 염증성 시토킨(pro-inflammatory cytokine)과 소염성 시토킨 생산간의 균형이 붕괴되는 것으로 추정된다.

상기의 경우에 유전자 요법을 수행하는 효율적인 방식은 벡터를 질병 부위에 투여하여 치료 유전자를 국소적으로 발현시키는 것이다. 또한 상기 유전자 산물을 심혈관계를 통해 전신으로 전달하는 것도 가능하다. 특히, 유전자 요법용 벡터를 국소적으로 투여하는 것이 어렵거나 또는 바람직하지 못한 부작용이 일어날 가능성이 있는 경우, 특히 혈중 반감기가 짧은 생물학적 활성 물질(예를 들어, 시토킨)을 암호화하는 유전자의 경우에 상기 치료 유전자를 심혈관계 전체에서 발현시키는 것이 효과적인 치료 전략일 수 있다. 이와 관련하여, 혈류를 통해 전달되고 원격 부위에서 작용할 것이 예상되는 분비 단백질의 생산에 적합한 "공장"으로서 근육이 제시된다. 지금까지, 근육으로의 유전자 형질감염에 대한 연구는 주로 노출된(naked) DNA 및 아데노 관련 바이러스(AAV)를 사용하여 왔다. 그러나, 이들 벡터는 충분한 발현 수준을 달성하지 못한다. 따라서, 심혈관계에서 형질감염된 유전자 산물을 높은 수준으로 분비할 수 있게 하는 새로운 벡터의 개발이 요구된다.

발명의 요약

본 발명의 목적은 심혈관계로의 유전자 전달을 위한 파라믹소바이러스 벡터 및 그의 용도를 제공하는 것이다.

최근에 파라믹소비리다에(Paramyxoviridae) 과에 속하는 센다이 바이러스(Sendai virus)가 유전자 전달용 벡터의 개발에 이용되고 있다(Kato A. et al., EMBO J., 1997, 16, 578-598; WO97/16538 및 WO97/16539). 상기 센다이 바이러스 벡터는 독성이 낮으며, 형질감염된 유전자로부터 발현되는 단백질의 양이 대단히 많다. 또한, 상기 벡터는 벡터 내의 유전자가 숙주 게놈에 통합되지 않으므로 안전성이 탁월하다. 본 발명자들은 재조합 센다이 바이러스(SeV)를 심혈관계에서 형질감염된 유전자 산물의 효율적인 발현에 이용할 수도 있다는 생각을 하였다. 본 발명자들은 소염성 시토킨인 인터루킨-10(IL-10)을 발현시키기 위해 새로운 센다이 바이러스 벡터(SeV-IL10)를 제작하고 이를 사용하는 연구를 수행하였다.

SeV-IL10은 생체 외에서 COS7 세포를 형질감염시키는 경우 형질감염 후 16 시간째에 IL-10의 분비를 용량 의존적으로 증가시켰다. 최고 역가의 SeV-IL10(24-웰 플레이트에서 10⁶ pfu/웰)에 의한 IL-10의 분비 수준은 IL-10을 암호화하는 플라스미드의 리포솜-매개된 형질감염에 의해 달성된 크기의 2 자리수만큼 더 높았다. 따라서, 본 발명자들은 SeV-IL10 벡터를 사용하여 생체 내 형질감염 실험을 수행하였다.

SeV-IL10을 마우스의 호흡기도에 비내 점적을 통해 국소 투여하였다. 2 일 후에, 폐 균질액 및 기관지 폐포 세척액(BALF) 내로 분비된 IL-10의 수준을 측정하고 리포솜에 의해 매개된 플라스미드 DNA 형질감염에 의해 수득된 것과 비교하였다. SeV-IL10 투여에 의해 얻어진 IL-10 분비 수준은 폐 균질액에서 플라스미드 형질감염에 의해 얻어진 것보다 2 자리수만큼 더 높았고(SeV-IL10: 21457±5112 pg/㎎ 단백질; 플라스미드: 310±54 pg/㎎ 단백질), BALF에서는 3 자리수만큼 더 높았다(SeV-IL10: 153366±41823 pg/㎖; 플라스미드: 71±63 pg/㎖). 혈중 IL-10 수준을 추가로 검사하였다. SeV-IL10이 제공된 마우스에서, 상당량의 IL-10이 분비되었다.

또한, SeV-IL10을 분비성 단백질의 생산에 적합한 부위인 골격근 내로 주사하고 효과를 검사하였다. SeV-IL10 벡터(4 x 10⁸ pfu/근육)를 전경골근(tibialis anterior muscle)에 주사하고 IL-10 발현 수준을 2 일 후에 검사하였다. 근육 균질액 중의 발현 수준은 플라스미드 DNA 주사(50 ㎍ DNA)의 경우보다 1 내지 2 자리수만큼 더 높았다(SeV-IL10: 1067±32 pg/㎎ 단백질; 플라스미드: 50.9±11 pg/㎎ 단백질). IL-10은 플라스미드 주사의 경우 혈청 중에서 검출되지 않은 반면, SeV-IL10 벡터 주사 후 2 일째에는 혈청 IL-10 수준이 현저히 증가하였다(SeV-IL10: 393±132 pg/㎖; SeV-βgal: 0.31±0.26 pg/㎖). 이들을 모두 고려하면, 재조합 SeV를 사용한 폐 및 근육내로의 유전자 전달 효율은 매우 높았으며, 이는 SeV 벡터가 심혈관계에서 형질감염된 유전자의 산물을 높은 수준으로 발현할 수 있 음을 시사한다. 본 발명의 벡터는 심혈관계로의 유전자 전달에 의해 치유될 수 있는 각종 질병에 대한 유전자 요법용 벡터로서 유용하다. 특히, 상기 벡터는 유전자 요법을 CF 환자의 폐렴에 적용할 수 있게 한다.

본 발명은 재조합 SeV의 근육 내 투여에 의해 유전자를 효율적으로 전달할 수 있게 한다. 형질감염된 유전자의 발현 수준은 주사 후 2 일째에 높은 수준에 도달한다. 이러한 수준은 플라스미드 DNA 또는 AAV를 사용하여 얻어진 것보다 현저히 더 높다. 치료 유전자 산물의 SeV-매개된 생산은 높은 수준의 유전자 발현이 신속히 요구되는 임상적 상황에서 매우 효과적이다. 벡터 자체가 염증 효과를 가질 수도 있을 가능성을 배제시키기 어려운 경우, 염증의 악화를 피하기 위해 질병 부위로 직접 투여하는 것에 비해, 상기 부위에서 먼 근육내로 벡터를 투여하는 것이 유리하다. 따라서, 본 발명의 벡터의 근육내 투여가 보다 효과적인 치료를 가능하게 할 것으로 예상된다. 더욱이, 복제 능력이 결여된 SeV의 사용은 복제 능력이 있는 벡터를 사용하는 경우 관찰되는 염증 반응과 항체 반응들을 감소시킬 수 있다.

따라서, 본 발명은 심혈관계로의 유전자 전달을 위한 파라믹소바이러스 벡터 및 그의 용도에 관한 것이며, 보다 구체적으로

(1) 벡터 중에 포함된 유전자의 발현 산물을 혈류를 통해 투여 부위와 다른 부위로 전달하는, 심혈관계로 유전자를 전달하기 위한 파라믹소바이러스 벡터;

(2) 외래 유전자를 함유하는 (1)의 벡터;

(3) 외래 유전자가 시토킨 유전자인 (2)의 벡터;

(4) 시토킨이 소염성 시토킨인 (3)의 벡터;

(5) 소염성 시토킨이 인터루킨-10(IL-10)인 (4)의 벡터;

(6) 염증성 질병의 치료에 사용되는 (4) 또는 (5)의 벡터;

(7) 염증성 질병이 폐 섬유증인 (6)의 벡터;

(8) 비내 투여를 위한 (1) 내지 (7) 중 어느 하나의 벡터;

(9) 근육내 투여를 위한 (1) 내지 (7) 중 어느 하나의 벡터;

(10) 파라믹소바이러스가 센다이 바이러스인 (1) 내지 (9) 중 어느 하나의 벡터;

(11) (1) 내지 (10) 중 어느 하나의 벡터의 파라믹소바이러스의 게놈을 암호화하는 DNA;

(12) (1) 내지 (10) 중 어느 하나의 파라믹소바이러스 벡터 또는 상기 벡터를 포함하는 세포를 포함하는 조성물;

(13) 분비 단백질을 암호화하는 외래 유전자를 포함하는 파라믹소바이러스 벡터를 투여함을 포함하는, 상기 단백질을 심혈관계로 전달하는 방법;

(14) 분비 단백질이 소염성 시토킨인 (13)의 방법;

(15) 소염성 시토킨이 IL-10인 (14)의 방법;

(16) 투여가 비내 투여인 (13) 내지 (15) 중 어느 하나의 방법;

(17) 비내 투여가 비갑개(turbinate)에의 투여를 포함하는 (16)의 방법;

(18) 투여가 근육내 투여인 (13) 내지 (15) 중 어느 하나의 방법;

(19) 파라믹소바이러스가 센다이 바이러스인 (13) 내지 (18) 중 어느 하나의 방법;

(20) (13) 내지 (19) 중 어느 하나의 방법에 의한 염증 질병의 치료 방법; 및

(21) 염증 질병이 폐 섬유증인 (20)의 방법에 관한 것이다.

본 원에서 "파라믹소바이러스 벡터"는 파라믹소바이러스로부터 유래되고 숙주 세포로의 유전자 전달에 사용되는 벡터(또는 담체)로서 정의된다. 본 발명의 파라믹소바이러스 벡터는 리보뉴클레오단백질(RNP) 또는 감염력을 갖는 바이러스 입자일 수 있다. 여기에서, "감염력"은 세포 유착 및 막 융합 능력을 통한, 재조합 파라믹소바이러스 벡터 중에 함유된 유전자를 상기 벡터가 유착되어 있는 세포로 전달하는 상기 벡터의 능력으로서 정의된다. 바람직한 실시태양에서, 본 발명의 파라믹소바이러스 벡터는 외래 유전자를 발현 방식으로 전달한다. 상기 파라믹소바이러스 벡터는 복제 능력을 갖거나, 또는 복제 능력이 없는 결손 벡터일 수 있다. 본 원에서, "복제 능력"은 바이러스 벡터로 감염된 숙주 세포에서 감염성 바이러스 입자를 복제하고 생산하는 상기 바이러스 벡터의 능력으로서 정의된다.

본 원에서, "재조합" 파라믹소바이러스 벡터는 유전자 공학에 의해 제작된 것이거나 그의 증폭 산물로서 정의된다. 예를 들어, 재조합 파라믹소바이러스 벡터를 재조합 파라믹소바이러스 cDNA의 재구성에 의해 제조할 수 있다.

본 원에서, 파라믹소바이러스는 파라믹소비리다에 과의 바이러스 또는 그의 유도체로서 정의된다. 본 발명을 예를 들어 파라믹소비리다에의 파라믹소바이러스, 예를 들어 센다이 바이러스, 뉴캐슬병 바이러스, 유행성 이하선염 바이러스, 홍역 바이러스, 호흡기 세포융합 바이러스(Respiratory syncytical virus), 우역 바이러스(rinderpest virus), 디스템퍼 바이러스(distemper virus), 원숭이 파라인플루엔자 바이러스(SV5), I, II 및 III 형 인간 파라인플루엔자 바이러스에 적용시킬 수 있다. 본 발명의 바이러스는 바람직하게는 파라믹소바이러스 속 바이러스 또는 그의 유도체일 수 있다. 본 발명을 적용할 수 있는 파라믹소바이러스 속 바이러스에는 1 형 인간 파라인플루엔자 바이러스(HPIV-1), 3 형 인간 파라인플루엔자 바이러스(HPIV-3), 3 형 소 파라인플루엔자 바이러스(BPIV-3), 센다이 바이러스(또한 1 형 마우스 파라인플루엔자 바이러스라고도 칭함), 10 형 원숭이 파라인플루엔자 바이러스(SPIV-10) 및 다수의 다른 파라믹소바이러스 속 바이러스들이 포함된다. 본 발명의 파라믹소바이러스는 센다이 바이러스가 가장 바람직하다. 이들 바이러스는 야생성 균주, 돌연변이 균주, 실험실 계대배양된 균주, 인공 제작된 균주 등일 수 있다. 불완전 바이러스, 예를 들어 DI 입자(Willenbrink W. and Neubert W. J., J. Virol., 1994, 68, 8413-8417), 합성된 올리고뉴클레오티드 등을 또한 본 발명의 바이러스 벡터의 제조를 위한 물질로서 사용할 수도 있다.

파라믹소바이러스의 단백질을 암호화하는 유전자로는 NP, P, M, F, HN 및 L 유전자가 있다. 여기에서, "NP, P, M, F, HN 및 L 유전자"는 각각 뉴클레오캡시드 단백질, 인단백질, 기질 단백질, 융합 단백질, 헤마글루티닌-뉴라미니다제 및 라지 단백질(large protein)을 암호화하는 유전자들을 나타낸다. 파라믹소바이러스 아과의 각 바이러스의 유전자들을 일반적으로 하기와 같이 기재한다. 일반적으로, NP 유전자를 또한 "N 유전자"로서 나타낼 수도 있다.

파라믹소바이러스 NP P/C/VM F HN - L

루블라바이러스(Rublavirus) NP P/V M F HN (SH) L

모르빌리바이러스(Morbillivirus) NP P/C/VM F H - L

예를 들어, 파라믹소비리다에의 레스피로바이러스(Respirovirus)로서 분류된 센다이 바이러스의 각 유전자에 대한 뉴클레오티드 서열 데이터베이스의 수탁 번호는 NP 유전자에 대해 M29343, M30202, M30203, M30204, M51331, M55565, M69046 및 X17218; P 유전자에 대해 M30202, M30203, M30204, M55565, M69046, X00583, X17007 및 X17008; M 유전자에 대해 D11446, K02742, M30202, M30203, M30204, M69046, U31956, X00584, X53056; F 유전자에 대해 D00152, D11446, D17334, D17335, M30202, M30203, M30204, M69046, X00152 및 X02131; HN 유전자에 대해 D26475, M12397, M30202, M30203, M30204, M69046, X00586, X02808, X56131; 및 L 유전자에 대해 D00053, M30202, M30203, M30204, M69040, X00587 및 X58886이다.

본 원에서, "유전자"는 RNA 및 DNA와 같은 핵산을 포함한 유전자 물질로서 정의된다. 일반적으로, 유전자는 단백질을 암호화하거나 암호화할 수 없다. 예를 들어, 유전자는 리보자임, 안티센스 RNA 등과 같은 기능성 RNA를 암호화하는 유전자일 수 있다. 유전자는 천연적으로 유도되거나 또는 인공적으로 구상된 서열을 가질 수 있다. 본 원에서 "유전자 전달"은 유전자가 매개된 전달로서 정의되 며 "심혈관계로의 유전자 전달"은 유전자 산물을 상기 계로 전달함을 포함한다. "분비 단백질"은 세포의 외부로 분비되는 단백질로서 정의된다. 상기 단백질은 외부로 분비될 수 있는 한 분명한 분비 신호를 반드시 가질 필요는 없다. 상기 분비 단백질은 천연적으로 유도되거나 또는 인공적으로 구상된 단백질일 수 있다. 분비 신호를 가함으로써 목적하는 단백질을 외부로 분비시키는 것도 가능하다. 인공적으로 구상된 단백질은 예를 들어 또 다른 단백질과의 융합 단백질, 도미넌트 네가티브 단백질(dominant negative protein)(수용체 또는 막결합 도미넌트 네가티브 수용체의 가용성 형태를 포함함), 세포 유착 분자의 결실 형태, 및 세포 표면 분자의 가용성 형태일 수 있다. 본 원에서 "DNA"는 단일 가닥 DNA 또는 이중 가닥 DNA를 포함한다.

본 원에서 시토킨은 세포로부터 분비되고 생리학적 기능들, 예를 들어 면역계의 조절, 항종양 기능, 항바이러스 기능 또는 세포분화 조절을 나타내는, 항체 이외의 모든 단백질 및 폴리펩티드로서 정의된다(Aggarwal B.B. and Pocsik E., "Cytokines: from clone to clinic", Arch. Biochem. Biophys., 1992, 292(2), 335-359). 림포카인 및 모노카인은 시토킨과 실질적으로 동일하며, 본 발명의 시토킨에 포함된다. 또한, 소염성 시토킨은 Th1 세포, NK 세포, 단핵세포 및 대식세포 중 임의의 것으로부터 분비되는 하나 이상의 시토킨(예: INF-γ, TNF-β, IL-2, IL-1, IL-6, IL-8 또는 TNF-α)의 합성을 억제하는 시토킨으로서 정의된다. 시토킨은 천연 단백질 또는 인위적으로 변경된 단백질일 수 있다. 소염성 시토킨으로는 IL-10, IL-4 및 IL-12가 있으며, 이들로 제한되지 않는다. 상기와 같은 시토킨들을 암호화하는 유전자를 그의 뉴클레오티드 서열을 기본으로 구상된 프라이머를 사용하여 PCR과 같은 공지된 방법에 의해 제조할 수 있다. 가장 바람직하게는, 본 발명의 소염성 시토킨은 IL-10이다.

본 발명은 심혈관계로의 유전자 전달을 위한 파라믹소바이러스 벡터 및 그의 용도를 제공한다. 본 발명자들은 외래 유전자를 암호화하는 파라믹소바이러스 벡터의 생체 내 투여에 의해 주사 부위에서 뿐만 아니라 혈액에서도 형질감염된 유전자의 산물을 과발현시키는데 성공하였다. 냄새맡기에 의해 마우스에게 비내 투여된 IL-10 발현용 센다이 바이러스 벡터(SeV-IL10)를 코 상피(비갑개)와 폐에 도입시켰다. 유전자 산물을 주사 부위에서 과발현시켰으며 IL-10 수준의 현저한 증가가 또한 혈액에서도 관찰되었다. 코 상피(비갑개) 내로의 관류에 의한 투여는 또한 혈중 IL-10 수준을 현저히 증가시켰다. 더욱 또한, 분비 단백질의 생산에 적합한 부위로 추정되는 골격근 내로의 SeV-IL10의 투여를 또한 검사하였다. SeV-IL10을 전경골(TA) 근에 투여하는 경우, IL-10의 발현 수준은 주사 부위인 근육에서뿐만 아니라 혈액에서도 현저히 증가하였다. 또한, SeV-IL10의 근육내 투여는 블레오마이신 투여에 의해 제조된 폐 섬유증 마우스 모델의 폐에서 콜라겐 침착을 현저히 억제하였다. 따라서, 폐 섬유증에 대한 SeV-IL10의 근육내 주사의 치료 효과가 입증되었다. 본 발명의 벡터는 치료 유전자 산물을 전체 심혈관계로 전달하는데 매우 유용하다. 예를 들어, 본 발명의 벡터를 사용하여 소염성 시토킨을 발현시킴으로써 다양한 염증성 질병에 대해 유전자 요법을 수행할 수 있다. 또한 상기 벡터를, 염증을 감소시키고 점액성 분비물의 축적을 억제하는 소염 작용을 갖 는 유전자를 사용하는 유전자 요법에 사용하는 것도 가능하다.

본 발명자들은 재조합 파라믹소바이러스 벡터의 근육내 투여에 의해 도입된 유전자가 주사 후 2 일째에 절정 수준으로 발현되었으며 상기가 1 주일에 걸쳐 지속적으로 발현됨을 입증하였다. 또한, 반복적인 투여는 유전자 발현을 증가시켰다. 이러한 특징은 재조합 파라믹소바이러스 벡터를 사용하는 유전자 요법에서 빠르고 지속적인 치료 효과를 얻는데 유리하다.

파라믹소바이러스 벡터를 바람직하게는 또한 안전성 면에서도 인간 유전자 요법의 임상 시험에 사용할 수 있다. 먼저, 형질감염된 DNA를 외래 유전자의 발현을 위해 핵으로 운반해야 하는 것은 고효율의 유전자 전달에 큰 방해가 된다. 그러나, 센다이 바이러스와 같은 경우에, 외래 유전자의 발현은 세포 튜불린 및 세포질 중의 RNA 폴리머라제(L 단백질) 모두에 의해 구동된다. 이는 센다이 바이러스가 숙주 세포의 게놈과 상호작용하지 않으며, 이는 종양형성과 같은 안전성 문제가 면제됨을 시사한다. 두 번째로, 센다이 바이러스는 인간은 아닌, 설치류에서 폐렴을 일으키는 병원체인 것으로 공지되어 있으며, 이는 야생형 센다이 바이러스의 비내 투여가 비인간 영장류에서 유해하지 않음을 보이는 연구에 의해 지지된다(Hurwitz J. L. et al., Vaccine, 1997, 15, 533-540). 이러한 특징은 센다이 바이러스 벡터가 인간 치료에 사용될 수 있음을 시사하며, 또한 센다이 바이러스가 외래 유전자의 산물을 심혈관계로 전달하는 것을 목표로 하는 유전자 요법에서 유망한 대안들 중 하나일 수 있음을 뒷받침한다.

본 발명의 벡터를 바람직하게는 특히 염증성 질병을 표적으로 하는, 소염성 시토킨을 사용하는 유전자 요법에 사용할 수 있다. 소염성 시토킨의 발현을 위한 본 발명의 파라믹소바이러스 벡터는 염증성 질병의 치료에 특히 유용하다. 즉, 상기 파라믹소바이러스 벡터의 사용에 의한 소염성 시토킨을 암호화하는 유전자의 도입은 염증을 억제하고 질병 증상을 완화시킬 수 있다. 상기 질병에는 예를 들어 폐 섬유증, 경화성 복막염, 전립선 비대, 다발성 경화증, 이식 후 거부, I 형 당뇨병, 만성 관절성 류머티즘, 염증성 장 질환, 건선, 전신 홍반성 루프스, 홍채염, 육아종병, 만성 신염, 경피증, 자궁근종, 켈로이드, 경화증, 및 염증을 수반하는 다른 질병들이 포함된다. 본 원에서, 질병의 치료는 질병의 치료와 예방을 포함한다.

심혈관계로의 유전자 전달에 사용되는 본 발명의 파라믹소바이러스 벡터는 임의의 특정한 종류로 제한되지 않는다. 예를 들어, 복제 능력을 갖고 자율적으로 전파될 수 있는 벡터를 사용하는 것이 바람직할 수 있다. 일반적으로, 야생형 파라믹소바이러스의 게놈은 짧은 3' 선두(leader) 영역에 이어서 N(뉴클레오캡시드), P(인), M(기질), F(융합), HN(헤마글루티닌-뉴라미니다제) 및 L(라지) 단백질을 암호화하는 6 개의 유전자를 함유하며, 다른 말단 상에 짧은 5' 추적자(trailer) 영역을 갖는다. 자율적으로 복제할 수 있는 본 발명의 벡터를 상술한 구조와 유사한 구조를 갖는 게놈을 구상함으로써 수득할 수 있다. 또한, 외래 유전자를 발현시키기 위한 벡터를 상기 벡터의 게놈에 외래 유전자를 삽입함으로써 수득할 수 있다. 본 발명의 파라믹소바이러스 벡터는 야생형 바이러스에 비해 변경된 바이러스 유전자 정렬을 가질 수 있다.

본 발명의 파라믹소바이러스 벡터는 야생형 바이러스에 함유된 유전자의 일부가 결실되어 있을 수 있다. 예를 들어, 센다이 바이러스 벡터의 재구성의 경우에 NP, P/C 및 L 유전자에 의해 암호화된 단백질들은 트랜스에 요구되는 것으로 생각되지만, 상기 유전자들은 상기 바이러스 벡터의 성분이 아닐 수도 있다. 하나의 실시태양에서, 단백질을 암호화하는 유전자를 수반하는 발현 벡터를 벡터 게놈을 암호화하는 또 다른 발현 벡터와 함께 숙주 세포에 동시 형질감염시켜 바이러스 벡터를 재구성시킬 수도 있다. 한편으로, 바이러스 게놈을 암호화하는 발현 벡터를 단백질을 암호화하는 유전자를 수반하는 숙주 세포 내로 형질감염시키고, 따라서 상기 숙주 세포에 의해 제공된 단백질을 사용하여 바이러스 벡터를 재구성시킬 수 있다. 이들 단백질의 아미노산 서열은 상기가 핵산 전달에 있어서 동등하거나 보다 큰 활성을 갖는 한 원래의 바이러스로부터 유도된 서열들과 동일할 필요는 없으며, 돌연변이되거나 또 다른 바이러스의 동종 유전자의 서열에 의해 치환될 수도 있다.

M, F 및 HN 유전자에 의해 암호화된 단백질은 파라믹소바이러스 벡터의 세포 대 세포 전파에 필수적인 것으로 생각된다. 그러나, 이들 단백질은 벡터가 RNP로서 제조되는 경우 필요하지 않다. 유전자 M, F 및 HN이 RNP에 함유된 게놈의 성분인 경우, 이들 유전자의 산물은 숙주 세포 내로 도입될 때 생산되며, 감염력을 갖는 바이러스 입자가 생산된다. 감염성 바이러스를 생산하는 RNP 벡터는 N, P, M, F, HN 및 L 유전자을 암호화하는 바이러스 게놈 RNA, 및 N, P 및 L 단백질을 함유하는 RNP를 포함한다. 상기와 같은 RNP를 세포 내로 도입시키는 경우, 단백질 N, P 및 L의 기능을 통해 바이러스 게놈이 발현되고 복제되며, 따라서 감염성 바이러스 벡터가 증폭된다.

RNP를 리포펙타민, 폴리양이온성 리포솜 등과 형성된 복합체로서 세포 내에 도입시킬 수 있다. 구체적으로, 다양한 형질감염 시약들, 예를 들어 DOTMA(Boehringer), Superfect(QIAGEN #301305), DOTAP, DOPE, DOSPER(Boehringer #1811169)를 사용할 수 있다. 클로로퀸을 첨가하여 엔도솜에서의 분해를 막을 수 있다(Calos M.P., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1983, 80, 3015). 복제성 바이러스의 경우에, 생산된 바이러스를 배양된 세포, 달걀 또는 동물(예: 마우스와 같은 포유동물)에 재감염시킴으로써 증폭시키거나 또는 계대시킬 수 있다.

대조적으로, 본 발명의 파라믹소바이러스 벡터는 M, F 및/또는 HN 유전자가 결여된 것들일 수 있다. 이러한 벡터는 결실된 유전자 산물을 외부적으로 제공함으로써 재구성시킬 수 있다. 상기와 같은 벡터는 여전히 숙주 세포에 유착될 수 있으며 야생형으로서 세포 융합을 일으킬 수 있다. 그러나, 원래의 것과 동일한 감염력을 갖는 딸 바이러스 입자들은 생산되지 않는데, 그 이유는 세포 내로 도입된 벡터 게놈에는 상기 유전자들 중 하나가 없기 때문이다. 따라서, 이들 벡터는 오직 단일의 유전자만을 전달할 수 있는 안전한 바이러스 벡터로서 유용할 수 있다. 예를 들어, 게놈으로부터 결실된 유전자는 F 및/또는 HN 유전자일 수 있다. 바이러스 벡터를 F 단백질에 대한 발현 벡터인 F 유전자가 결여된 재조합 파라믹소바이러스의 게놈을 암호화하는 발현 플라스미드와, NP, P/C 및 L 단백질에 대한 것을 숙주 세포에 동시 형질감염시킴으로써 재구성할 수 있다(WO00/70055 및 WO00/70070). 한편으로, F 유전자가 염색체에 통합된 숙주 세포를 사용할 수도 있다. 외부적으로 제공된 이들 단백질의 아미노산 서열은 야생형의 것과 동일할 필요는 없으며 상기가 동등하거나 또는 보다 높은 유전자 전달 활성을 갖는 한 돌연변이되거나 또 다른 바이러스의 동종 단백질에 의해 치환될 수 있다.

본 발명의 파라믹소바이러스 벡터의 외피 단백질은 원래의 벡터 게놈의 외피 단백질이 아닌 또 다른 단백질을 함유할 수 있다. 상기와 같은 단백질에 대한 제한은 없다. 이들은 소낭성 구내염 바이러스(vesicular stomatitis virus)의 G 단백질(VSV-G)과 같은 다른 바이러스의 외피 단백질을 포함할 수 있다. 따라서, 본 발명의 파라믹소바이러스 벡터는 원래의 바이러스와 상이한 바이러스로부터 유도된 외피 단백질을 갖는 가성 유형(pseudo type)의 바이러스 벡터를 포함한다.

또한, 본 발명의 파라믹소바이러스 벡터는 그의 외피 표면상에 특정 세포에서 표적화된 단백질, 예를 들어 유착 분자, 리간드 및 수용체, 또는 세포 외 영역에 이들 단백질과 세포 내 영역에 바이러스 외피 단백질로부터 유도된 폴리펩티드를 갖는 키메릭 단백질을 가질 수 있다. 상기는 특정 조직을 표적으로 하는 벡터를 생산할 수 있게 한다. 이러한 단백질은 바이러스 게놈 자체에 의해 암호화되거나, 또는 바이러스 게놈 이외의 유전자의 발현을 통해(예를 들어, 또 다른 발현 벡터 또는 숙주 세포 염색체) 바이러스 재구성 시에 공급될 수 있다.

본 발명의 벡터 중에 함유된 바이러스 유전자를 변경시켜 항원성을 감소시키거나 또는 RNA 전사 효율 또는 복제 효율을 향상시킬 수 있다. 구체적으로, 복제 인자의 유전자인 NP, P/C 및 L 유전자들 중 하나 이상을 변경시켜 전사 또는 복제 를 향상시키는 것도 가능하다. 헤마글루티닌 활성과 뉴라미니다제 활성을 갖는 구조 단백질인 HN 단백질을 변경시켜, 전자의 활성을 약화시킴으로써 혈중 바이러스 안정성을 향상시키고 후자의 활성을 변경시킴으로써 감염력을 조절하는 것도 또한 가능하다. 세포막 융합에 관련되는 F 단백질을 변경시켜 상기 융합 능력을 조절하는 것도 또한 가능하다. 더욱 또한, F 단백질 및 HN 단백질과 같이 세포 표면상에 가능한 항원 분자의 항원 제공 에피토프 등의 분석을 통해 약한 항원성을 갖도록 처리된 파라믹소바이러스 벡터를 제조하는 것도 가능하다.

또한, 보조 유전자가 결핍된 파라믹소바이러스를 본 발명의 벡터로서 사용할 수 있다. 예를 들어, SeV의 보조 유전자들 중 하나인 V 유전자를 파괴함으로써, 마우스와 같은 숙주에 대한 SeV의 병원성을 배양된 세포 유전자의 발현 및 복제를 손상시키지 않으면서 현저하게 감소시킨다(Kato, A. et al., J. Virol., 1997, 71, 7266-7272; Kato, A. et al., EMBO J., 1997, 16, 578-587; Curran, J. et al., WO01/04272, EP1067179). 상기와 같이 독성 약화된 벡터는 생체 내 또는 생체 외 유전자 전달을 위한 바이러스 벡터로서 특히 바람직하다.

본 발명의 바이러스 벡터는 게놈 RNA 중에 외래 유전자를 함유할 수 있다. 외래 유전자를 함유하는 재조합 파라믹소바이러스 벡터는 상기 유전자를 상술한 파라믹소바이러스 벡터의 게놈에 삽입함으로써 수득될 수 있다. 상기 외래 유전자는 혈액에서 발현되는 목적하는 단백질을 암호화하는 유전자일 수 있다. 상기는 천연 단백질, 또는 상기 단백질이 천연 단백질과 동등한 기능을 갖는 한 결실, 치환 또는 삽입된 변형 단백질을 암호화할 수 있다. 한편으로, 상기는 도미넌트 네 가티브 변이체와 같이 인공적으로 구상된 단백질일 수도 있다. 예를 들어, 유전자 요법 등을 목적으로, 표적 질병을 치료하기 위해 사용되는 유전자를 바이러스 벡터의 게놈을 암호화하는 DNA(바이러스 벡터 DNA)에 삽입시킬 수 있다. 외래 유전자를 센다이 바이러스 벡터 DNA에 삽입하는 경우, 6 배수의 뉴클레오티드를 포함하는 서열을 바람직하게는 전사 종지 서열(E)과 전사 개시 서열(S) 사이에 삽입시킨다(Calain P. and Roux L., J. Virol., 1993, 67(8), 4822-4830). 외래 유전자를 상기 각 바이러스 유전자(NP, P, M, F, HN 및 L 유전자)의 상부 및/또는 하부에 삽입할 수 있다. 상부 및 하부 유전자의 발현을 방해하지 않도록, E-I-S 서열(전사 종지 서열-중재 서열-전사 개시 서열) 또는 그의 일부를 상기 E-I-S 서열이 각각의 유전자 사이에 위치하도록 외래 유전자의 상부 또는 하부에 적절히 놓을 수 있다. 한편으로, 외래 유전자를 IRES로 삽입시킬 수 있다.

삽입된 유전자의 발현 수준을 상기 유전자의 상부에 부착된 전사 개시 서열의 유형에 의해 조절할 수 있다(WO01/18223). 또한 유전자의 삽입 위치 및 상기 유전자를 둘러싸는 서열에 의해 조절할 수 있다. 예를 들어, 센다이 바이러스에서, 삽입 위치가 바이러스 게놈의 음성 가닥 RNA의 3' 말단에 가까울수록(야생형 바이러스 게놈상의 유전자 배열에서 NP 유전자에 가까울수록), 삽입된 유전자의 발현 수준은 높아질 것이다. 외래 유전자의 고발현을 위해서, 상기를 바람직하게는 NP 유전자의 상부와 같은 음성 가닥 게놈의 상부 영역[음성 가닥상의 3' 플랭킹(flanking) 영역]에, 또는 NP와 P 유전자 사이에 삽입시킨다. 반대로, 상기 삽입 위치가 음성 가닥 RNA의 5' 말단에 가까울수록(야생형 바이러스 게놈상의 유전자 배열에서 L 유전자에 가까울수록) 상기 삽입된 유전자의 발현수준은 낮아질 것이다. 외래 유전자의 발현을 감소시키기 위해서, 상기를 음성 가닥상의 가장 5'인 위치, 즉 야생형 바이러스 게놈에서 L 유전자의 하부(음성 가닥상의 L 유전자의 5' 플랭킹 영역) 또는 L 유전자의 상부(음성 가닥상의 L 유전자의 3' 플랭킹 영역)에 삽입시킬 수 있다. 따라서, 외래 유전자의 삽입 위치를 유전자의 목적하는 발현 수준을 얻기 위해서, 또는 삽입물과 상기를 둘러싸고 있는 바이러스 유전자의 조합을 최적화하기 위해서 적합하게 조절할 수 있다. 예를 들어, 고역가의 바이러스 벡터에 의해 도입된 유전자의 과발현이 독성을 일으킬 수 있는 경우, 삽입 위치를 음성 가닥의 5' 말단에 가깝게 구상하거나 또는 적합한 치료 효과를 얻기 위해서 전사 개시 서열을 보다 낮은 효율을 갖는 것으로 치환시킴으로써 바이러스 역가를 조절할 뿐만 아니라 개별적인 벡터의 발현 수준을 감소시킬 수 있다.

외래 유전자를 쉽게 삽입시키기 위해서, 클로닝 부위를 삽입 위치로 구상할 수 있다. 예를 들어, 클로닝 부위는 제한 효소의 인식 서열일 수 있다. 바이러스 벡터 DNA에서 제한 부위를 외래 유전자의 삽입을 위해 사용할 수 있다. 상기 클로닝 부위는 다중 제한 효소들의 인식 서열들을 함유하는 다중 클로닝 부위일 수 있다. 본 발명의 벡터는 상기 삽입에 사용된 위치 이외의 위치에서 다른 외래 유전자를 가질 수도 있다. 상기와 같은 외래 유전자는 제한되지 않으나, 다른 소염성 시토킨 유전자이거나 또는 다른 종류의 유전자일 수 있다.

외래 유전자를 갖는 재조합 센다이 바이러스 벡터의 제작을 예를 들어 문헌[Hasan M.K. et al., J. Gen. Virol., 1997, 78, 2813-2820; Kato A. et al., EMBO J., 1997, 16, 578-587; Yu D. et al., Genes Cells, 1997, 2, 457-466]에 개시된 방법에 따라 하기와 같이 수행할 수 있다.

먼저, 목적하는 외래 유전자의 cDNA 뉴클레오티드 서열을 포함하는 DNA 샘플을 제조한다. 상기 DNA 샘플은 25 ng/㎍ 이상의 농도에서 단일 플라스미드로서 전기영동에 의해 식별될 수 있는 것이 바람직하다. 하기에, 외래 유전자를 NotI 부위를 사용하여 바이러스 게놈을 암호화하는 DNA에 삽입하는 경우를 예로서 개시할 것이다. NotI 인식 부위를 목적하는 cDNA 뉴클레오티드 서열에 포함시키는 경우, 상기 cDNA에 의해 암호화된 아미노산 서열이 변경되지 않도록 미리 부위-특이적인 돌연변이와 같은 방법을 사용하여 뉴클레오티드 서열을 변경시킴으로써 상기 NotI 부위를 결실시키는 것이 바람직하다. 상기 DNA 샘플로부터, 목적하는 유전자 단편을 PCR에 의해 증폭시키고 회수한다. 증폭된 DNA 단편의 양쪽 단부에 NotI 부위를 제공하고 또한 센다이 바이러스의 전사 종료 서열(E), 중재 서열(I) 및 전사 개시 서열(S)(EIS 서열)의 사본을 한쪽 단부에 가하기 위해서, 전방(forward side) 합성 DNA 서열(센스 가닥)과 리버스측(reverse side) 합성 DNA서열(안티센스 가닥)을 NotI 제한 효소 절단 부위 서열, 전사 종료 서열(E), 중재 서열(I), 전사 개시 서열(S) 및 목적하는 유전자의 부분 서열을 함유하는 프라이머들의 쌍으로서 제조한다.

예를 들어, NotI에 의한 절단을 보장하기 위해서, 전방 합성 DNA 서열을 임의의 2 개 이상의 뉴클레오티드(바람직하게는 NotI 인식 부위에서 기원하는 서열인 GCG 및 GCC를 제외한 4 개의 뉴클레오티드, 보다 바람직하게는 ACTT)가 상기 합성 DNA의 5'-쪽에 선택되고, NotI 인식 부위 "gcggccgc"가 그의 3' 쪽에 첨가되고, 임의의 목적하는 9 개의 뉴클레오티드 또는 9 + 6 배수 뉴클레오티드의 뉴클레오티드가 스페이서 서열로서 그의 3' 쪽에 첨가되고, 목적하는 cDNA의 개시 코돈 ATG를 포함하여 약 25 개의 뉴클레오티드에 상당하는 ORF가 그의 3'-쪽에 첨가된 형태로 배열한다. 3' 단부상에 최종 뉴클레오티드로서 G 또는 C를 갖도록 상기 전방 합성 DNA 서열로서 목적하는 cDNA로부터 약 25 개의 뉴클레오티드를 선택하는 것이 바람직하다.

리버스측 합성 DNA서열에서, 임의의 2 개 이상의 뉴클레오티드(바람직하게는 NotI 인식 부위에서 기원하는 서열인 GCG 및 GCC를 제외한 4 개의 뉴클레오티드, 보다 바람직하게는 ACTT)가 상기 합성 DNA의 5'-쪽에 선택되고, NotI 인식 부위 "gcggccgc"가 그의 3' 쪽에 첨가되고, 올리고 DNA가 길이를 조절하기 위한 삽입 단편으로서 그의 더욱 3' 쪽에 첨가된다. 상기 올리고 DNA를 상기 NotI 인식 부위 "gcggccgc", 하기 개시하는 바이러스에서 기원하는 센다이 바이러스 게놈의 cDNA 및 EIS 뉴클레오티드 서열의 상보적인 서열을 포함한 전체 뉴클레오티드 수가 6의 배수가 되도록 구상한다(소위 "6의 법칙"; Kolakofski D. et al., J. Virol., 1998, 72, 891-899; Calain P. and Roux L., J. Virol., 1993, 67, 4822-4830; Calain, P. and Roux, L., J. Virol., 1993, 67, 4822-4830). 삽입된 단편의 3' 쪽에 더하여, 센다이 바이러스의 S 서열에 상보적인 서열, 바람직하게는 5'-CTTTCACCCT-3'(서열식별번호: 1), I 서열에 상보적인 서열, 바람직하게는 5'-AAG-3' 및 E 서열에 상보적인 서열, 바람직하게는 5'-TTTTTCTTACTACGG-3'(서열식별번 호: 2)을 가하고, 추가로 그의 3' 쪽에, 최종 뉴클레오티드로서 G 또는 C를 갖도록 길이를 조절한, 목적하는 cDNA 서열의 말단 코돈으로부터 역방향으로 세어 약 25 개의 뉴클레오티드에 상당하는 상보적인 서열을 선택하고 리버스측 합성 DNA의 3' 단부로서 첨가한다.

PCR을, 예를 들어 ExTaq 폴리머라제(Takara Shuzo)를 사용하여 통상적인 방법에 따라 수행할 수 있다. 바람직하게는, PCR을 Vent 폴리머라제(NEB)를 사용하여 수행하며, 상기와 같이 증폭된 목적하는 단편들을 NotI로 절단하고, 이어서 플라스미드 벡터 pBluescript의 NotI 부위에 삽입시킨다. 상기와 같이 수득된 PCR 산물의 뉴클레오티드 서열을 정확한 서열을 갖는 플라스미드를 선택하는 서열 결정 장치를 사용하여 확인한다. 상기 삽입된 단편을 NotI를 사용하여 상기 플라스미드로부터 절제하여 게놈 cDNA를 수반하는 플라스미드의 NotI 부위에 클로닝시킨다. 한편으로, 상기 단편을 상기 플라스미드 벡터 pBluescript의 매개 없이 NotI 부위에 직접 삽입하여 재조합 센다이 바이러스 cDNA를 수득하는 것도 또한 가능하다.

예를 들어, 재조합 센다이 바이러스 게놈 cDNA를 문헌[Kato A. et al., EMBO J., 1997, 16, 578-598; Hasan M. K. et al., J. Gen. Virol., 1997, 78, 2813-2820; Yu, D. et al., Genes Cells, 1997, 2, 457-466]의 방법에 따라 제작할 수 있다. 예를 들어, NotI 부위를 함유하는 18 bp의 스페이서 서열(5'-(G)-CGGCCGCAGATCTTCACG-3'; 서열식별번호: 3)을 선두 서열과 N 단백질을 암호화하는 서열의 5'-말단 사이에서 클로닝된 센다이 바이러스 게놈 cDNA(pSeV(+))의 인접한 유전자 좌에 삽입하고, 델타 간염 바이러스의 안티게놈 가닥으로부터 유래된 자가 절단성 리보자임 부위를 함유하는 플라스미드 pSeV18⁺b(+)를 수득한다(Hasan M. K. et al., J. General Virol., 1997, 78, 2813-2820). 외래 유전자 단편을 pSeV18⁺b(+)의 NotI 부위에 삽입시켜 목적하는 외래 유전자가 삽입되어 있는 재조합 센다이 바이러스 cDNA를 수득한다.

재조합 파라믹소바이러스 벡터 DNA를 생체 외에서 또는 세포에서 전사하고, RNP를 L, P 및 NP 단백질의 존재 하에서 재구성하여 RNP를 포함하는 바이러스 벡터를 제조한다. 본 발명은 바이러스 벡터의 게놈을 암호화하는 DNA를 전사함을 포함하는, 본 발명의 파라믹소바이러스 벡터의 제조 방법을 제공한다. 또한, 바이러스 벡터의 게놈을 암호화하는 DNA를 포함하는, 본 발명의 파라믹소바이러스 벡터의 제조를 위한 DNA를 제공한다. 본 발명은 본 발명의 파라믹소바이러스 벡터를 제조하기 위한 상기 벡터의 게놈을 암호화하는 DNA의 용도에 관한 것이다. 바이러스 벡터 DNA로부터의 바이러스의 재구성을 공지된 방법에 따라 수행할 수 있다(WO97/16539; WO97/16538; Durbin A. P. et al., Virol., 1997, 235, 323-332; Whelan S. P. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1995, 92, 8388-8392; Schnell M. J. et al., EMBO J., 1994, 13, 4195-4203; Radecke F. et al., EMBO J., 1995, 14, 5773-5784; Lawson N. D. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1995, 92, 4477-4481; Garcin D. et al., EMBO J., 1995, 14, 6087-6094; Kato A. et al., Genes Cells, 1996, 1, 569-579; Baron M. D. and Barrett T., J. Virol., 1997, 71, 1265-1271; Bridgen A. and Elliott R. M., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1996, 93, 15400-15404). 상기 방법들은 DNA로부터 파라인플루엔자 바이러스, 소낭성 구내염 바이러스, 광견병 바이러스, 홍역 바이러스, 우역 바이러스, 센다이 바이러스 벡터 등을 포함한 목적하는 파라믹소바이러스 벡터를 재구성할 수 있게 한다. F, HN 및/또는 M 유전자가 결핍된 바이러스 벡터 DNA를 제조하는 경우, 상기와 같은 결손 벡터를 사용하여 감염성 바이러스 입자를 제조하지 못한다. 그러나, 이들 결손 유전자, 다른 바이러스 외피 단백질을 암호화하는 유전자 등을 숙주 세포로 별도로 전달하고 이들을 상기 중에서 발현시킴으로써 감염성 바이러스 입자를 제조하는 것은 가능하다.

바이러스 벡터 DNA를 세포에 전달하는 방법은 하기의 것들을 포함한다: 1) 목적하는 세포에 의해 흡수될 수 있는 DNA 침전물의 제조 방법; 2) 목적하는 세포에 의해 흡수되기에 적합하고 또한 그다지 세포독성이지 않은 DNA를 포함하는, 양으로 하전된 복합체의 제조 방법; 및 3) 목적하는 세포막 상에 DNA 분자가 전기 펄스에 의해 통과하기 충분한 기공을 순간적으로 천공시키는 방법.

방법 2)에서, 다양한 형질감염 시약들, 예를 들어 DOTMA(Boehringer), Superfect(QIAGEN #301305), DOTAP, DOPE, DOSPER(Boehringer #1811169) 등을 사용할 수 있다. 방법 1)의 예는 세포 내로 들어간 DNA가 파고솜에 통합되고 충분량이 또한 핵에 통합되는, 인산 칼슘을 사용하는 형질감염 방법이다(Graham, F. L. and Van Der Eb, J., Virology, 1973, 52, 456; Wigler, M. and Silverstein, S., Cell, 1977, 11, 223). 첸과 오카야마(Chen and Okayama)는 전달 기법의 최적화를 연구하여, 최적의 DNA 침전물을 하기와 같은 조건 하에서 수득할 수 있음을 보 고하였다: 1) 세포를 2 내지 4% CO₂의 분위기 하에 35 ℃에서 15 내지 24 시간 동안 DNA와 함께 배양하고, 2) 선형 DNA보다 더 높은 침전물 형성 활성을 갖는 환상 DNA를 사용하며, 3) 상기 침전 혼합물 중의 최적의 DNA 농도는 20 내지 30 ㎍/㎖이다(Chen, C. and Okayama, H., 1987, Mol. Cell. Biol. 7: 2745). 방법 2)는 일시적인 형질감염에 적합하다. DEAE-덱스트란(Sigma #D-9885, M.W. 5 x 10⁵) 혼합물을 목적하는 DNA 농도비로 제조하여 형질감염을 수행하는 오래된 방법이 당해 분야에 공지되어 있다. 상기 복합체들의 대부분은 엔도솜 안에서 분해되므로, 클로로퀸을 가하여 형질감염 효율을 향상시킬 수 있다(Calos M. P., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1983, 80, 3015). 방법 3)을 전기천공(electroporation)이라 칭하며, 상기 방법은 세포 선택성이 없기 때문에 방법 1) 및 2)에 비해 보다 융통성이 있다. 방법 3)은 펄스 전류 지속 기간, 펄스 형태, 전장(electric field) 효능(전극간의 틈, 전압), 완충액의 전도도, DNA 농도 및 세포 밀도가 최적인 조건 하에서 효율적이라고 한다.

상술한 3 개의 범주 중에서, 형질감염 시약(방법 2)이 본 발명에 적합한데, 그 이유는 방법 2)가 쉽게 수행 가능하고, 다량의 세포를 사용하여 많은 시험 샘플들을 용이하게 검사할 수 있기 때문이다. 바람직하게는, Superfect 형질감염 시약(QIAGEN, 제품 번호 301305) 또는 DOSPER 리포솜 형질감염 시약(Boehringer Mannheim, 제품 번호 1811169)이 사용되나, 이들로 제한되는 것은 아니다.

구체적으로, cDNA로부터의 바이러스 벡터의 재구성을 하기와 같이 수행할 수 있다.

원숭이 신장 유래의 세포주 LLC-MK2를 24-웰 내지 6-웰 플라스틱 배양 플레이트 또는 100 ㎜ 직경의 배양 디쉬 등에서 10% 소태아 혈청(FCS) 및 항생제(100 단위/㎖의 페니실린 G 및 100 ㎍/㎖의 스트렙토마이신)를 함유하는 최소 필수 배지(MEM)를 사용하여 70 내지 80%의 콘플루언스(confluence)로 배양하고, 예를 들어 1 ㎍/㎖의 프소랄렌(psoralen)의 존재 하에서 20 분간 UV 조사 처리에 의해 불활성화시킨 T7 폴리머라제를 발현하는 재조합 우두 바이러스(vaccinia virus) vTF7-3을 사용하여 2 PFU/세포로 감염시킨다(Fuerst, T. R. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83:8122-8126, 1986; Kato, A. et al., Genes Cells 1: 569-579, 1996). 첨가된 프소랄렌의 양 및 UV 조사 시간은 적절하게 조정할 수 있다. 감염 후 1 시간째에 세포들을 Superfect(QIAGEN)와 함께 완전한 길이의 센다이 바이러스 게놈의 생산에 필요한 트랜스 작용 바이러스 단백질을 발현하는 플라스미드(24 내지 0.5 ㎍의 pGEM-N, 12 내지 0.25 ㎍의 pGEM-P 및 24 내지 0.5 ㎍의 pGEM-L, 보다 바람직하게는 1 ㎍의 pGEM-N, 0.5 ㎍의 pGEM-P 및 1 ㎍의 pGEM-L)(Kato, A. et al., Genes Cells, 1996, 1, 569-579)를 사용하여 리포펙션(lipofection) 방법 등에 의해 상술한 재조합 센다이 바이러스 cDNA 2 내지 60 ㎍, 보다 바람직하게는 3 내지 5 ㎍으로 형질감염시킨다. 상기 형질감염된 세포를 경우에 따라 각각 리팜피신(Sigma) 및 시토신 아라비노사이드(AraC) 100 ㎍/㎖, 보다 바람직하게는 단지 시토신 아라비노사이드(AraC)(Sigma) 40 ㎍/㎖만을 함유하는 무 혈청 MEM에서 배양하고, 상기 시약들의 농도를 상기 우두 바이러스로 인한 세포독성을 최소화하고 바이러스 회수율을 극대화하는데 최적인 것으로 정한다(Kato. A. et al., Genes Cells, 1996, 1, 569-579). 형질감염 후 약 48 내지 72 시간 동안 배양한 후에, 세포들을 회수하고, 3 주기의 동결과 해동을 반복하여 분쇄하고, LLC-MK2 세포에 형질감염시키고 배양한다. 세포를 3 내지 7 일간 배양한 후에, 배양액을 수거한다. 복제 능력이 없는 외피 단백질을 암호화하는 유전자가 결여된 바이러스 벡터를 재구성하기 위해서, 상기 벡터를 외피 단백질을 발현하는 LLC-MK2 세포에 형질감염시키거나, 또는 상기 외피 단백질에 대한 발현 플라스미드와 동시 형질감염시킬 수 있다. 한편으로, 외피 단백질을 발현하는 LLC-MK2 세포를 형질감염된 세포상에 겹쳐 놓고 배양하여 결실 바이러스 벡터를 전파시킬 수 있다(WO00/70055 및 WO00/70070). 배양 상등액 중에 함유된 바이러스 역가를 헤마글루틴화 활성(HA)을 측정("엔도-포인트 희석 방법(endo-point dilution method)"에 의해 분석할 수 있다)함으로써 결정할 수 있다(Kato. A. et al., Genes Cells, 1996, 1, 569-579; Yonemitsu Y. and Kaneda Y., Hemagglutinating virus of Japan-liposome-mediated gene delivery to vascular cells., Molecular Biology of Vascular Diseases. Methods in Molecular Medicine, Ed. by Baker A.H., Humana Press, 1999, 295-306). 우두 바이러스 vTF7-3의 가능한 오염을, 수득된 요막(尿膜) 샘플을 적합하게 희석(예를 들어 10⁶ 배)한 후에 달걀에서 재증폭시킴으로써 배제시킬 수 있다. 재증폭을 예를 들어 3 회 이상 반복할 수 있다. 상기와 같이 수득된 바이러스 모액을 -80 ℃에서 보관할 수 있다.

바이러스 재구성에 사용되는 숙주 세포의 유형은 바이러스 벡터가 상기 중에서 재구성될 수 있는 한 특별히 제한되지 않는다. 예를 들어, 배양 세포, 예를 들어 원숭이 신장 유래의 CV-1 세포 및 LLC-MK2 세포, 햄스터 신장 유래의 BHK 세포, 인간 유래의 세포 등을 사용할 수 있다. 센다이 바이러스 벡터를 다량으로 수득하기 위해서, 상기 벡터를 예를 들어 상술한 숙주 세포로부터 수득된 바이러스 벡터를 닭의 발육란에 감염시킴으로써 증폭시킬 수 있다. 달걀을 사용하여 바이러스 유체를 제조하는 방법은 이미 개발되어 있다(Nakanishi, et al.(eds.), 1993, "Shinkei-kagaku Kenkyu-no Sentan-gijutu Protocol III(High Technology Protocol III of Neuroscience Research), Molecular Neurocyte Physiology, Koseisha, Osaka, pp. 153-172). 구체적으로, 예를 들어 수정란을 부화기에 넣고 37 내지 38 ℃에서 9 내지 12 일간 배양하여 배를 성장시킨다. 센다이 바이러스 벡터를 달걀의 요막 공간에 접종하고, 수일간 배양시켜 바이러스를 증식시킨다. 배양 기간과 같은 조건들을 사용되는 재조합 센다이 바이러스의 유형에 따라 변화시킬 수 있다. 후속적으로, 상기 바이러스를 포함하는 요막액을 회수한다. 센다이 바이러스 벡터의 분리 및 정제를 표준 방법(Tashiro, M., "Virus Experiment Protocols", Nagai and Ishihama(eds.), Medicalview, 1995, 68-73)에 따라 수행할 수 있다.

예를 들어, F 단백질이 결여된 센다이 바이러스 벡터를 하기와 같이 제작할 수 있다(WO00/70055 및 WO00/70070).

(1) F 유전자가 결여된 센다이 바이러스 게놈 cDNA 및 F 유전자에 대한 발현 플라스미드의 제작

완전한 길이의 센다이 바이러스(SeV) 게놈 cDNA, pSeV18⁺b(+)(Hasan M. K. et al., J. General Virol., 1997, 78, 2813-2820)(pSeV18⁺b(+)를 또한 pSeV18⁺라 지칭할 수 있다)를 SphI 및 KpnI로 절단하고 생성된 단편(14673bp)을 회수하고 pUC18에 클로닝시켜 pUC18/KS를 수득한다. pUC18/KS를 F 유전자 결여 영역의 제작에 사용한다. F 유전자의 결실은 PCR-연결(ligation)의 조합에 의해 수행되며, F 유전자의 ORF(1698 bp, ATG에서 TGA까지)를 생성된 F 유전자-결실된 SeV 게놈 cDNA(pSeV18⁺/△F)에서 서열 5'-atgcatgccggcagatga(서열식별번호: 4)로 치환시킨다. 프라이머(전방: 5'-gttgagtactgcaagagc/서열식별번호: 5; 리버스: 5'-tttgccggcatgcatgtttcccaaggggagagttttgcaacc/서열식별번호: 6)를 사용하여 수득된 PCR 산물과 프라이머(전방: 5'-atgcatgccggcagatga/서열식별번호: 7; 리버스: 5'-tgggtgaatgagagaatcagc/서열식별번호: 8)를 사용하여 수득된 것들을 EcoT22I로 절단시키고 각각 F 유전자의 상부와 하부에 클로닝시켰다. 생성된 플라스미드를 SacI 및 SalI으로 절단하고, 상기 F 유전자 결실 부위를 함유하는 단편(4931 bp)을 회수하여 pUC18에 클로닝시켜 pUC18/dFSS를 수득한다. pUC18/dFSS를 DraIII으로 절단하고, 회수된 단편을 F 유전자를 함유하는 pSeV18⁺의 DraIII 단편으로 치환시키고 연결하여 pSeV18⁺/△F를 수득한다.

외래 유전자를 pUC18/dFSS의 F 유전자 결실 부위 중의 NsiI 또는 NgoMIV 부 위에 삽입할 수 있다. 이를 위해서, 외래 유전자를 함유하는 단편을 NsiI-꼬리가 있는 프라이머 또는 NgoMIV-꼬리가 있는 프라이머를 사용하여 증폭시킬 수 있다.

(2) SeV-F 단백질의 유도성 발현을 위한 헬퍼 세포의 제조

센다이 바이러스 F 유전자(SeV-F)의 Cre/loxP 유도성 발현 플라스미드를 하기와 같이 제작한다. SeV-F 유전자를 PCR에 의해 증폭시키고, Cre DNA 재조합효소의 기능을 통해 유전자 산물의 발현이 유도되도록 구상된 pCALNdLw 플라스미드(Arai T. et al., J. Virol., 1998, 72, 1115-1121)의 독특한 SwaI 부위에 클로닝시켜 pCALNdLw/F를 수득한다.

상기 F 유전자가 결실된 게놈으로부터 감염성 바이러스 입자를 회수하기 위해서, SeV-F 단백질을 발현하는 헬퍼 세포주를 확립시킨다. 원숭이 신장으로부터 유래되고 SeV 전파에 통상적으로 사용되는 LLC-MK2 세포를 사용할 수 있다. LLC-MK2 세포를 37 ℃, 5% CO₂ 하에 10% 열-불활성화되고 고정화된 소태아 혈청(FBS), 페니실린 G 나트륨 50 U/㎖ 및 스트렙토마이신 50 ㎍/㎖을 함유하는 MEM에서 배양시킨다. SeV-F 유전자 산물의 세포독성으로 인해, 상기 유전자를 상기 pCALNdLw 내로 클로닝시키고, 여기에서 클로닝된 유전자의 발현이 Cre DNA 재조합효소에 의해 유도될 수 있다. 상기 pCALNdLw/F를 표준 프로토콜에 따라 인산칼슘 방법(포유동물 형질감염 키트(Stratagene))에 의해 LLC-MK2 세포를 형질감염시키는데 사용한다.

10-㎝ 플레이트에서 40% 콘플루언스로 증식된 LLC-MK2 세포를 pCALNdLw/F 10 ㎍으로 형질감염시키고 37 ℃, 5% CO₂ 하에 10% FBS를 함유하는 MEM 10 ㎖ 중에서 24 시간 동안 배양시킨다. 이어서, 세포를 분산시키고 배양 배지 10 ㎖에 재현탁시키고 5 개의 10-㎝ 디쉬 상에 도말하며, 이때 세포 현탁액 5 ㎖을 하나의 디쉬에, 2 ㎖을 2 개의 디쉬에, 0.2 ㎖을 2 개의 디쉬에 도말한다. 세포를 10% FBS + 1200 ㎍/㎖의 G418(GIBCO-BRL) 함유 MEM 10 ㎖ 중에서 14 일간 배지를 매 2 일마다 바꾸면서 배양하고, 안정한 형질감염체를 선택한다. G418에 내성인 배지에서 증식된 세포를 클로닝 고리를 사용하여 회수한다. 각 클론의 세포를 상기가 10-㎝ 디쉬에서 100% 콘플루언스로 증식할 때까지 추가로 배양시킨다.

F 단백질의 발현을 유도하기 위해서, 세포를 6 ㎝ 디쉬에서 100% 콘플루언스로 증식시키고 문헌[Saito et al., Nucleic Acids Res., 1995, 23, 3816-3821; Arai T. et al., J. Virol., 1998, 72, 1115-1121]의 방법에 따라 moi=3에서 AxCANCre 아데노바이러스로 감염시킨다.

(3) F 유전자 결실된 SeV 바이러스의 재구성 및 전파

외래 유전자가 삽입되어 있는 pSeV18⁺/△F를 하기와 같이 LLC-MK2 세포에 형질감염시킨다. 세포를 100 ㎜ 페트리 디쉬 상에 5 x 10⁶ 세포/디쉬로 도말하고, 24 시간 동안 배양하고, 이어서 프소랄렌과 긴 UV(365 ㎚)로 20 분간 처리한, T7 RNA 폴리머라제를 발현하는 재조합 우두 바이러스로 실온에서 1 시간 동안 감염시킨다(Fuerst T. R. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1986, 83, 8122-8126)(moi=2 내지 3; 바람직하게는 moi=2). UV 노출을 5 개의 15 와트 전구가 장 착된 UV 스트라타링커 2400(제품 번호 400676 (100 V), Stratagene, La Jolla, CA, USA)을 사용하여 수행할 수 있다. 세포를 3 회 세척한 후에, 플라스미드 pSeV18⁺/△F-GFP, pGEM/NP, pGEM/P 및 pGEM/L(Kato A. et al., Genes Cells, 1996, 1, 569-579)을 각각 12 ㎍/디쉬, 4 ㎍/디쉬, 2 ㎍/디쉬 및 4 ㎍/디쉬의 비로 OptiMEM(GIBCO)으로 재현탁시키고 SuperFect 형질감염 시약(1 ㎍ DNA에 대해서 5 ㎕ SuperFect(QIAGEN))과 혼합한다. 상기 혼합물을 실온에서 10 분간 배양하고, 이어서 3% FBS의 최종 농도로 OptiMEM 3 ㎖로 재현탁시키고 상기 세포에 가한다. 배양기에서 3 시간 배양 후에, 세포를 무 혈청 MEM으로 2 회 세척하고, 40 ㎍/㎖의 시토신 β-D-아라비노푸라노사이드(AraC, Sigma) 및 7.5 ㎍/㎖의 트립신(GIBCO)을 함유하는 MEM에서 70 시간 동안 추가로 배양시킨다. 이어서 세포를 수거하고 OptiMEM에서 10⁷ 세포/㎖로 재현탁시킨다. 세포를 3 회 동결 해동시키고, 이어서 리포펙션 시약 DOSPER(Boehringer mannheim)(10⁶ 세포/DOSPER 25 ㎕)와 혼합하고, 실온에서 15 분간 배양하고, LLC-MK2/F7 세포(이는 상술한 바와 같이 선택된 F 유전자 발현 헬퍼 세포의 클론들 중 하나이다)에 형질감염시킨다(12 웰 플레이트에서 10⁶ 세포/웰). 세포를 40 ㎍/㎖의 AraC 및 7.5 ㎍/㎖의 트립신을 함유하는 무 혈청 MEM에서 배양하고 배양 상등액을 수거한다.

결실 바이러스 벡터의 제조에서, 바이러스 게놈으로부터 결핍된 외피 유전자가 다른 2 가지 유형의 벡터를 동일한 세포에 전달한다. 이 경우에, 하나의 벡터 에서 외피 단백질 결손물을 서로 상보적인 다른 벡터의 발현에 의해 공급하고, 이에 의해 감염성 바이러스 입자가 형성되고 복제 주기가 활성화되어 바이러스 벡터가 증폭된다. 즉, 2 가지 유형 이상의 벡터를 서로의 외피 단백질에 상보적이도록 함께 세포에 접종하는 경우, 각 외피 유전자가 결손된 바이러스 벡터들의 혼합물을 대규모로 저렴하게 생산할 수 있다. 외피 유전자의 결손으로 인해, 이들 바이러스는 완전한 바이러스에 비해 보다 작은 게놈 크기를 가지며, 따라서 상기는 긴 외래 유전자를 품을 수 있다. 또한, 이들 원래의 비감염성인 바이러스는 세포 외에서 희석되고 그의 동시 감염을 보유하기 어렵기 때문에, 상기는 멸균성으로 되며, 이는 환경으로의 그의 방출을 다루는데 유리하다.

벡터를 외래 유전자로서 특정 질병에 대한 치료 유전자를 사용하여 제조하는 경우, 유전자 요법을 상기 벡터의 투여에 의해 수행할 수 있다. 본 발명의 바이러스 벡터는 질병의 치유를 도울 수 있는 외래 유전자, 환자에게 결여되거나 불충분한 내생 유전자 등의 발현을 직접적인 투여 또는 간접적인 투여(생체 외)를 통해서 가능하게 한다. 외래 유전자는 제한되지 않으며, 심혈관계로 바람직하게 분비되는 분비 단백질을 암호화하는 것들이 포함될 수 있다. 체액 인자들, 예를 들어 각종 시토킨, 호르몬, 성장 인자 등이 그 예이다. 소염성 시토킨 유전자를 염증성 질병의 치료를 위한 외래 유전자로서 사용하는 것이 바람직하다.

회수된 파라믹소바이러스를 실질적으로 순수하도록 정제할 수 있다. 정제를 공지된 정제 및 분리 방법, 예를 들어 여과, 원심분리, 컬럼 크로마토그래피적 정제 등, 또는 이들의 조합에 의해 수행할 수 있다. 본 발명에 사용된 "실질적으 로 순수한"이란 용어는 바이러스가, 상기가 존재하는 샘플의 성분으로서 주요 비율을 차지함을 의미한다. 전형적으로는, 실질적으로 순수한 바이러스 벡터를 샘플 중에 포함된 전체 단백질에 대한 바이러스 유도된 단백질의 비가 50% 이상, 바람직하게는 70% 이상, 보다 바람직하게는 80% 이상, 훨씬 더 바람직하게는 90% 이상임을 확인함으로써 검출할 수 있다. 구체적으로, 파라믹소바이러스를 예를 들어 셀룰로즈 설페이트 에스테르 또는 가교결합된 폴리사카라이드 설페이트 에스테르를 사용하는 방법(일본 특허 출원 공고 공보(JP-B) 제 Sho 62-30752 호; JP-B Sho 62-33879; JP-B Sho 62-30753), 퓨코스(fucose) 설페이트 함유 폴리사카라이드 및/또는 그의 분해 산물에의 흡착을 사용하는 방법(WO97/32010) 등에 의해 정제시킬 수 있다.

본 발명의 파라믹소바이러스 벡터를 목적하는 약학적으로 허용 가능한 담체와 함께 조성물로서 제조할 수 있다. 본 원에서, "약학적으로 허용 가능한 담체"는 벡터와 함께 투여될 수 있으나, 상기 벡터에 의한 유전자 전달을 방해하지 않는 물질로서 정의된다. 예를 들어, 파라믹소바이러스 벡터를 염수, 인산염 완충 염수(PBS) 등으로 적합하게 희석하여 조성물을 제조할 수 있다. 본 발명의 파라믹소바이러스 벡터를 달걀 등에서 증식시키는 경우, 상기 조성물은 요막액을 포함할 수 있다. 본 발명의 파라믹소바이러스 벡터를 포함하는 조성물은 생리학적으로 허용 가능한 매질, 예를 들어 탈이온수, 5% 덱스트로즈 수용액 등을 함유할 수 있으며, 더욱 또한 다른 안정화제 및 항생제를 함유할 수 있다. 본 발명의 조성물을 약학 조성물로서 사용할 수 있다. 따라서, 본 발명은 또한 약제로서 상기 벡 터 또는 상기 조성물의 용도에 관한 것이다.

구체적으로, 본 발명의 조성물은

(1) 본 발명의 파라믹소바이러스 벡터 또는 상기 벡터를 함유하는 세포를 포함하는, 심혈관계로의 유전자 전달을 위한 조성물로, 상기 벡터의 유전자 산물을 혈류를 통해 주사 부위와 다른 부위로 도입시키는 조성물;

(2) 벡터가 외래 유전자를 함유하는 (1)의 심혈관계로의 유전자 전달을 위한 조성물;

(3) 외래 유전자가 시토킨 유전자인 (2)의 조성물;

(4) 시토킨이 소염성 시토킨인 (3)의 조성물;

(5) 소염성 시토킨이 IL-10인 (4)의 조성물;

(6) 염증성 질병의 치료에 사용되는 (4) 또는 (5)의 조성물;

(7) 염증성 질병이 폐 섬유증인 (6)의 조성물;

(8) 비내로 투여되는 (1) 내지 (7) 중 어느 한 조성물;

(9) 근육내로 투여되는 (1) 내지 (7) 중 어느 한 조성물; 및

(10) 파라믹소바이러스가 센다이 바이러스인 (1) 내지 (9) 중 어느 한 조성물

을 포함한다.

상기 파라믹소바이러스 벡터, 또는 상기 벡터를 포함하는 조성물을 투여하여 상기 벡터 내에 포함된 외래 유전자를 형질 도입시킨다. 본 발명은 하기의 방법들을 제공한다:

(1) 유전자를 함유하는 파라믹소바이러스 벡터 또는 상기 벡터를 함유하는 세포를 투여함을 포함하는, 상기 유전자의 발현 산물을 혈류를 통해 투여 부위와 다른 부위로 전달하는 방법;

(2) 유전자가 외래 유전자인 (1)의 방법;

(3) 외래 유전자가 시토킨 유전자인 (2)의 방법;

(4) 시토킨이 소염성 시토킨인 (3)의 방법;

(5) 소염성 시토킨이 IL-10인 (4)의 방법;

(6) 염증성 질병의 치료에 사용되는 (4) 또는 (5)의 방법;

(7) 염증성 질병이 폐 섬유증인 (6)의 방법;

(8) 벡터를 비내로 투여하는 (1) 내지 (7) 중 어느 한 방법;

(9) 벡터를 근육내로 투여하는 (1) 내지 (7) 중 어느 한 방법; 및

(10) 파라믹소바이러스가 센다이 바이러스인 (1) 내지 (9) 중 어느 한 방법.

투여 부위는 제한되지 않으며, 비내 투여(IN)(흡입에 의한 투여 및 카테터를 통한 투여), 폐내 투여 또는 근육내 투여(IM)를 포함할 수 있다. 상기 벡터를 생체 내 또는 생체 외에서 단일 부위 또는 다중 부위로 투여할 수 있다. 또한, 상기 벡터를 단지 1 회 또는 수회 투여할 수 있다.

본 발명의 파라믹소바이러스 벡터에 의해 전달되는 유전자는 상기가 분비 단백질을 암호화하는 한 제한되지 않으나, 다양한 시토킨 또는 호르몬을 암호화하는 유전자일 수 있다. 이들 단백질은 그들의 각 계열의 구성원 및 또한 동형을 포함할 수 있다. 상기 파라믹소바이러스 벡터는 전체 심혈관계에서 혈중 반감기가 짧 은 생물학적으로 활성인 물질(예를 들어, 시토킨) 등의 치료 유전자를 발현시키는데 특히 유용하다. 심혈관계에서 천연 시토킨의 반감기는 일반적으로 매우 짧다. 예를 들어, 천연 IL-10은 투여 후에 단지 초기 30 분 동안만 유효하다(Gerard et al., J. Exp. Med., 1993, 177(2), 547). 본 발명의 파라믹소바이러스 벡터의 사용은 장시간 동안 반감기가 짧은 생물학적으로 활성인 물질, 예를 들어 시토킨의 혈액으로의 연속적인 공급을 가능하게 한다.

특히, 시토킨은 세포 증식 및 분화와 관련된 광범위한 기능을 갖는다. 예를 들어, IL-1은 T 세포 활성화, IL-2 수용체의 발현, 시토킨 유전자 및 기타 유전자들의 유도, 세포 증식의 조절 및 호르몬 분비의 조절을 포함한 다양한 기능들을 갖는다. IL-1은 골수 및 림프구 세포주로부터 세포 성장 및 분화 인자의 방출을 자극한다. 또한, IL-1은 골수에서 다능성 전구세포(pluripotent progenitor)의 증식을 유도하고 조혈을 촉진시킨다. 상기는 암 요법에 유효하게 사용된다. 또한, IL-1은 혈관형성과 섬유모세포의 활성화에 관련되며 또한 상처의 치유에 유용하다.

IL-2는 T-, NK- 및 LAK 세포의 활성화, 특정 유형의 세포의 성장 촉진, 면역글로불린 및 IFN-γ의 생산 촉진, 단핵세포로부터의 IL-6 생산의 유도 등과 관련된다. IL-2는 종양 및 면역결핍성 질병의 치료, 또는 골수 이식 후 NK 세포의 활성화에 유효하게 사용된다. IL-3은 비만 세포 증식, 조혈 전구세포로부터의 혈액 세포의 생산 등과 관련된다. 상기는 다른 시토킨들(예를 들어, IL-6)과 제휴하여 다양한 혈액 세포들의 분화를 조절하는 작용을 한다. IL-3은 예를 들어 재생 불 량성 빈혈의 치료에 유효하게 사용될 수 있다.

IL-4는 정지 B 세포에서 MHC 클래스 II 유전자의 발현 증가, 활성화된 T 세포의 증식 및 작동 세포 기능의 촉진과 관련된다. IL-4는 또한 비만 세포 증식, 흉선에서 세포 성숙의 촉진, 혈액 세포의 증식 등과 관련된다. IL-4는 IL-1의 존재 하에서 항원 제공을 향상시키고 대식세포에서 식작용을 향상시킨다. IL-4는 골수 이식 후에 세포 및 체액 면역계의 기능 재구성에 관여하고, IgM를 증가시켜 면역결핍을 치유하고, 급성 림프모세포성 백혈병에서 말단 분화를 유도하고, 충실성 종양 및 B 세포 림프종의 성장을 억제하고, IL-1, TNF 및 IL-6 등의 생산 억제를 통해 염증을 억제시킨다. 또한, IL-4는 T 세포 의존성 자가면역 질병, 예를 들어 자가면역 당뇨병 및 알러지성 뇌척수염, 및 T 세포 의존성 면역 기능과 관련된 다른 질병들의 치료에 유용한 것으로 예상된다(Rapoport et al., J. Exp. Med., 1993, 178, 87-99; Racke et al., J. Exp. Med., 1994, 180, 1961).

IL-5는 IgA 생산의 자극 및 호산성 백혈구의 성장 촉진에 유효하며, 주혈흡충증(Sanderson, "International Conference on the Clinical Impact of Interleukins" at the Royal College of Pysicians in London, 1989 April)과 종양(Kolb et al., Br. J. Cancer, 1979, 40, 410; Pretlow et al., Cancer Res., 1983, 43, 2997; Iwasaki et al., Cancer, 1986, 58, 1321)의 치료에 사용되는 것으로 공지되어 있다. 또한, IL-6은 각종 세포의 증식 유도 또는 억제를 비롯하여 많은 기능들을 갖는 것으로 보고되고 있다. IL-7은 특정 유형의 B 세포 및 T 세포의 증식을 유도한다. IL-9는 적혈구 분화, T 세포 생존, B 림프구로부터의 면 역글로불린 생산 및 비만 세포로부터의 IL-6 생산의 자극과 관련된다.

IL-10은 활성화된 Th2 세포, B 세포, 각질세포, 단핵세포 및 대식세포에 의해 생산된다(Moore et al., Annu. Rev. Immunol., 1993, 11, 165). IL-10은 B 세포의 증식과 분화의 자극에 유효하다. 또한, IL-10은 Th1-세포, NK-세포, 단핵세포 및 대식세포에 의한 시토킨 생산(예를 들어 IFN-γ, TNF-β 및 IL-2)을 억제한다(Fiorentino et al., J. Exp. Med., 1989, 170, 2081-2095; Fiorentino et al., J. Immunol., 1991, 146, 3444; Hsu et al., Int. Immunol., 1992, 4, 563; D'Andrea et al., J. Exp. Med., 1993, 178, 1041; de Waal Malefyt et al., J. Exp. Med., 1991, 174, 915; Fiorentino et al., Int. Immunol., 1991, 147, 3815). 따라서, IL-10은 Th1-세포 반응의 억제를 통해 이식 후 거부반응 및 T 세포 매개된 자가면역 질병, 예를 들어 I 형 당뇨병 및 다발성 경화증의 예방에 유효하다. IL-10은 전 염증성 시토킨(예를 들어 IL-1, IL-6, IL-8 및 TNF-α)의 분비를 억제한다. 따라서, IL-10을 류마티스성 관절염 및 건선을 포함한 염증성 질병의 치료에 사용할 수 있다. IL-10은 종양 괴사 인자의 분비를 억제하고 패혈성 쇽을 억제하기 때문에, 패혈증의 치료에 유용할 수 있다. IL-10은 또한 주혈흡충 및 간 섬유증으로 인한 육아종 형성의 억제에 유용할 수 있다. 인터페론-α 및 β는 파필로마 바이러스, 간염 바이러스, 헤르페스 바이러스 등에 대해 바이러스 억제 기능을 가지며, 털세포 백혈병, 골수종(myeloma) 및 조혈 기관에서의 다른 종양의 치료에 유용할 수 있다.

상술한 시토킨을 심혈관계로 전달하기 위해서, 상기 시토킨들을 발현하는 본 발명의 파라믹소바이러스 벡터를 적합하게 사용할 수 있다. 하나의 바람직한 실시태양에서, 상기 파라믹소바이러스 벡터는 소염성 시토킨을 암호화하는 유전자를 함유한다. 소염성 시토킨으로는 예를 들어 IL-10, IL-4 및 IL-12가 있을 수 있다. 소염성 시토킨을 발현하는 본 발명의 파라믹소바이러스 벡터는 유용한 소염 약물일 수 있다.

본 발명의 벡터를 다양한 질병의 유전자 요법에 적용할 수 있다. 상기와 같은 유전자 요법에는 염증을 수반하는 질병, 예를 들어 폐 섬유증, 경화성 복막염, 전립선 비대, 다발성 경화증, 이식 후 거부, I 형 당뇨병, 류머티스성 관절염, 염증성 장 질환, 건선, 전신 홍반성 루프스, 홍채염, 육아종병, 만성 신염, 경피증, 자궁근종, 켈로이드, 경화증, 및 염증을 수반하는 다른 질병들의 치료가 포함될 수 있다. 상기 벡터는 또한 다양한 질병 동물 모델의 창조 및 또한 상기 질병 모델 등의 치료 방법의 개발 또는 평가에 유용할 수 있다.

예를 들어, 본 발명의 벡터를 바람직하게는 폐 섬유증의 유전자 요법에 사용할 수 있다. 폐 섬유증은 만성 간질성 폐렴(이때, 많은 경우 상기 질병의 원인은 분명하지 않으나, 만성 감염성 질병 또는 비정상적인 자가면역계에 의해 야기된 폐 섬유증을 수반한다)을 포함한 폐의 섬유증을 갖는 질병이다. 구체적으로, 상기 질병은 폐렴 및 낭성 섬유증(CF)을 포함한다.

본 발명의 파라믹소바이러스 벡터를 유효 용량의 벡터를 표적 조직의 세포에 전달할 수 있기에 충분한 용량으로 투여할 수 있다. 본 발명에서, "유효 용량"은 적어도 부분적으로 목적하는 치료 효과 또는 예방 효과를 가져오도록 유전자를 표 적 조직의 세포로 도입시킬 수 있는 용량으로서 정의된다. 목적하는 유전자를 함유하는 파라믹소바이러스 벡터의 유효 용량의 투여는 형질감염된 세포가 유전자 산물을 생산할 수 있게 한다. 바람직하게는, 목적하는 유전자를 함유하는 파라믹소바이러스 벡터의 유효 용량의 투여로 투여된 조직 또는 혈액에서 형질감염된 유전자의 현저한 수준의 발현이 탐지될 수 있다. "현저한 수준"은 형질감염된 유전자의 발현(전사물 또는 번역된 산물의 양)이 탐지될 수 있는 수준으로서 정의된다. 예를 들어, 형질감염된 유전자의 내생적인 대응물이 존재하는 경우, 상기 형질감염된 유전자의 최대 수준은 상기 내생적인 것의 발현 수준보다 상당히 더 높아야 한다. 상기 형질감염된 유전자의 발현은 투여 부위 또는 혈액에서 내생 유전자의 발현 수준보다 대략적으로 1.2 배 이상, 바람직하게는 약 1.5 배 이상, 보다 바람직하게는 약 2 배 이상, 훨씬 더 바람직하게는 약 10 배 이상 및 가장 바람직하게는 약 20 배 이상 더 높을 수 있다. 그러나, 상기 형질감염된 유전자의 발현 수준은 그의 유효 수준과 독성 수준을 고려함으로써 결정되어야 한다.

세포 내로 형질감염된 유전자의 발현 수준을 당해 분야의 숙련가들에게 공지된 분석에 의해 측정할 수 있다. 전사물을 노던 하이브리드화, RT-PCR, RNA 보호 분석 등에 의해 탐지하고 정량분석할 수 있다. 노던 하이브리드화, RT-PCR 등에 의한 탐지를 동일 반응계에서 수행할 수 있다. 번역된 산물을 검출하기 위해서, 웨스턴 블로팅, 면역침강, RIA, ELISA, 풀 다운 분석(pull down assay) 등을 항체를 사용하여 채택할 수 있다. 형질감염된 유전자 산물의 용이한 검출을 위해서, 발현시킬 단백질에 표지를 달거나 또는 정보제공 유전자(reporter gene)를 벡터 중 에 함유시킬 수 있다. 상기 정보제공 유전자는 β-갈락토시다제, 클로람페니콜 아세틸트랜스퍼라제(CAT), 알칼리성 포스파타제 또는 녹색 형광 단백질(GFP)을 암호화하는 것들일 수 있으나, 이들로 제한되지 않는다.

투여에 사용되는 벡터의 용량은 질병, 체중, 연령, 성별, 증상, 투여 목적, 및 도입되는 유전자 등에 따라 다양할 수 있으나, 당해 분야의 숙련가에 의해 적합하게 결정될 수 있다. 약학적으로 허용 가능한 담체와 함께, 바람직하게는 약 10⁵ 내지 약 10¹¹ pfu/㎖, 보다 바람직하게는 약 10⁷ 내지 약 10⁹ pfu/㎖, 가장 바람직하게는 약 1 x 10⁸ 내지 약 5 x 10⁸ pfu/㎖ 범위의 용량을 갖는 벡터를 접종하는 것이 바람직하다. 파라믹소바이러스 벡터를 함유하는 조성물의 접종 주체로는 모든 포유동물, 예를 들어 인간, 원숭이, 마우스, 래트, 토끼, 양, 소, 개 등을 포함한다.

도 1은 24-웰 플레이트 중의 SeV-IL10-형질감염된 COS7 세포에서의 IL-10의 용량 의존성 발현을 나타낸다. COS7 세포를 지시된 용량에서 SeV-IL10으로 감염시키고 16 시간 후에 배양 배지 내로 분비된 IL-10의 농도를 측정하였다. 대조군으로서, 세포를 IL-10 발현용 플라스미드 DNA로 형질감염시켰다. 각 그룹에 대해, n은 6이다.

도 2는 SeV-IL10이 비내 제공된 마우스의 폐에서 IL-10의 발현을 나타낸다. SeV-IL10(6.8 x 10⁷ pfu/100 ㎕)을 냄새맡기에 의해 비내 투여하였다. 투여 후 2 일째에, 상기 마우스를 희생시키고 폐 균질액 중의 IL-10의 발현 수준을 정량분석하였다. IL-10 발현 플라스미드가 제공된 대조용 마우스에서 IL-10의 발현은 310±54 pg/㎎ 단백질(평균±SEM)이었다.

도 3은 SeV-IL10이 비내 제공된 마우스의 BALF 내로의 IL-10의 분비를 나타낸다. SeV-IL10(6.8 x 10⁷ pfu/100 ㎕)을 냄새맡기에 의해 비내 투여하였다. 투여 후 2 일째에, 상기 마우스를 희생시키고 BALF 중의 IL-10의 발현 수준을 측정하였다. IL-10 발현 플라스미드가 제공된 대조용 마우스에서 IL-10의 발현은 71±63 pg/㎖(평균±SEM)이었다.

도 4는 SeV-IL10이 비내 제공된 마우스의 혈액 내로의 IL-10의 분비를 나타낸다. SeV-IL10(6.8 x 10⁷ pfu/100 ㎕)을 냄새맡기에 의해 비내 투여하였다. 투여 후 2 일째에, 상기 마우스를 희생시키고 혈청 중의 IL-10 수준을 측정하였다.

도 5는 냄새맡기 또는 관류에 의해 센다이 바이러스 벡터가 투여된 비갑개 및 폐에서의 형질감염된 유전자의 발현을 나타낸다. SeV-luc(7 x 10⁷ pfu/100 ㎕)를 냄새맡기 또는 관류에 의해 코 상피(비갑개)에 투여하고, 48 시간 후에, 마우스를 희생시키고 폐 및 비갑개에서의 루시페라제의 발현을 검사하였다(n=3).

도 6은 냄새맡기 또는 관류에 의해 SeV-IL10이 투여된 비갑개 및 폐에서의 IL-10의 발현을 나타낸다. SeV-IL10(7 x 10⁷ pfu/100 ㎕ 및 7 x 10⁸ pfu/100 ㎕) 을 냄새맡기 또는 관류에 의해 코 상피(비갑개)에 투여하고, 48 시간 후에, 마우스를 희생시키고 폐 및 비갑개에서의 IL-10의 발현을 검사하였다(n=6).

도 7은 냄새맡기 또는 관류에 의해 SeV-IL10이 투여된 혈액 내로의 IL-10의 분비를 나타낸다. SeV-IL10(7 x 10⁷ pfu/100 ㎕ 및 7 x 10⁸ pfu/100 ㎕)을 냄새맡기 또는 관류에 의해 코 상피(비갑개)에 투여하고, 48 시간 후에, 마우스를 희생시키고 혈청 중의 IL-10 수준을 검사하였다(n=6).

도 8은 SeV-βgal을 전경골(TA) 근에 주사한 후에 β-갈락토시다제의 용량 의존성 발현을 나타낸다. 마우스들의 각각의 TA 근에 증가량의 SeV-βgal, 또는 β-갈락토시다제 정보제공 유전자를 발현하는 플라스미드 DNA 또는 AAV를 주사하거나, 또는 주사하지 않은 채로 두었다(UT). 바이러스 용량 및 DNA의 양은 각 TA에 주사된 양을 나타낸다. 주사 후 2 일째에, 마우스를 희생시키고 근육 균질액에서의 β-갈락토시다제의 발현 수준을 측정하였다. 데이터를 평균±SEM으로 나타낸다. 각각의 그룹에 대해서, n은 6 내지 12이다. DNA-주사된 그룹과 AAV-주사된 그룹의 비교에서 ^**p<0.01이다.

도 9는 SeV-βgal을 전경골(TA) 근에 주사한 후에 β-갈락토시다제 발현의 시간에 따른 추이를 나타낸다. 마우스들의 각각의 TA 근에 SeV-βgal(3.5 x 10⁷ pfu/근육) 또는 대조군으로서 SeV-루시페라제(3.5 x 10⁷ pfu/근육)를 주사하였다. 주사 후에, 지시된 시간에 마우스를 희생시키고 근육 균질액에서의 β-갈락토시다 제의 발현 수준을 측정하였다. 대조용 바이러스를 주사한 마우스를 주사 후 2 일째에 희생시켰다. 데이터를 평균±SEM으로 나타낸다. 각각의 그룹에 대해서, n은 6이다. 주사 후 4 일째의 값과의 비교에서 ^*p<0.05이다.

도 10은 근육내로의 센다이 바이러스 벡터의 반복적인 주사 효과를 나타낸다. 마우스들의 각 TA 근에 SeV-βgal(3.5 x 10⁷ pfu/근육)을 주사하고 후속적으로 지시된 시점들에서 SeV-루시페라제(3.5 x 10⁷ pfu/근육)를 주사하였다. 두 번째 주사 후 2 일째에 마우스를 희생시키고, 근육 균질액에서의 루시페라제 발현을 검사하였다. 각 마우스에서 루시페라제의 발현 수준을 오직 SeV-루시페라제만을 1 회 주사한 마우스, 또는 주사하지 않은 마우스와 비교하였다. 데이터를 평균±SEM으로 나타낸다. 각각의 그룹에 대해서, n은 6 내지 10이다. 비처리된 마우스에 대한 값들의 비교에서 ^*p<0.05이다.

도 11은 센다이 바이러스 벡터의 근육내 주사 후 전신적인 항-SeV 항체의 존재에 대한 검사 결과를 나타낸다. 마우스들의 각 TA 근에 SeV-βgal(3.5 x 10⁷ pfu/근육)을 주사하였다. 주사 후에, 마우스를 지시된 시간에 희생시키고, 혈청 중의 SeV에 특이적인 항체들의 존재를 검사하였다. 데이터를 평균±SEM으로 나타낸다. 각각의 그룹에 대해서, n은 6이다.

도 12는 SeV-IL10의 근육내 주사 후 근육에서 IL-10의 발현을 나타낸다. 마우스들의 각 TA 근에 지시된 용량의 SeV-IL10을 주사하고, 2 일 후에, 마우스를 희 생시키고 근육 균질액 중의 IL-10 수준을 측정하였다. 대조군으로서, IL-10 발현용 플라스미드 DNA(pCI-IL10) 또는 SeV-βgal을 주사하였다.

도 13은 SeV-IL10의 근육내 주사 후에 혈액으로의 IL-10의 분비를 나타낸다. 마우스들의 각 TA 근에 지시된 용량의 SeV-IL10을 주사하고 2 일 후에 혈청 중의 IL-10 수준을 측정하였다. 대조군으로서, IL-10 발현용 플라스미드 DNA(pCI-IL10) 또는 SeV-βgal을 주사하였다. IL-10 발현용 플라스미드 DNA를 주사한 마우스 혈청 중의 IL-10 수준은 검출 한계 이하였다(n=4 내지 6).

도 14는 SeV-IL10의 근육내 주사 후에 근육 중의 IL-10의 과발현을 나타낸다. 마우스들의 각 TA 근에 SeV-IL10(3.5 x 10⁷ 또는 3.5 x 10⁸ pfu/근육) 또는 IL-10 발현용 플라스미드 DNA 또는 AAV(IL10 AAV)를 주사하였다. 비처리된 마우스를 또한 검사하였다. 주사 후 2 일째에, 마우스를 희생시키고 근육 균질액 중의 IL-10 수준을 검사하였다. 데이터를 평균±SEM으로 나타낸다. 각각의 그룹에 대해서, n은 6이다. 모든 다른 그룹들과의 비교에서 ^*p<0.05이다.

도 15는 SeV-IL10의 근육내 주사 후에 혈액으로의 IL-10의 분비를 나타낸다. 마우스들의 각 TA 근에 SeV-IL10(3.5 x 10⁷ 또는 3.5 x 10⁸ pfu/근육) 또는 IL-10 발현용 플라스미드 DNA 또는 AAV(IL10 AAV)를 주사하였다. 비처리된 마우스를 또한 검사하였다. 2 일 후에, 마우스를 희생시키고 혈청 중의 IL-10 수준을 측정하였다. 데이터를 평균±SEM으로 나타낸다. 각각의 그룹에 대해서, n은 6이다. 모든 다른 그룹들과의 비교에서 ^*p<0.05이다.

도 16은 폐 섬유증 마우스 모델에서 SeV-IL10의 근육내 주사 효과를 나타낸다. 마우스들의 각 TA 근에 SeV-IL10, 또는 대조군으로서 사용된 루시페라제 발현용 SeV 및 β-갈락토시다제 발현용 SeV를 주사하였다. 주사 후 2 일째에, 마우스에게 블레오마이신(0.075 U/100 ㎕) 또는 염수를 기관 내(intratracheal) 주사하였다. 블레오마이신 주사 후 11 일째에, 마우스를 희생시키고 폐 중의 콜라겐 침착을 히드록시프롤린 분석에 의해 검사하였다. 각각의 그룹에 대해 n은 15 내지 21이다. SeV-루시페라제/β-gal이 주사된 대조군과의 비교에서 ^*p<0.05이다.

본 발명을 하기 실시예를 참고로 상세히 예시하지만, 본 발명이 이들로 제한되는 것으로 해석해서는 안 된다. 여기에 인용된 모든 참고문헌들은 본 발명에 참고로 삽입된다.

실시예 1: 센다이 바이러스 벡터의 생체 내 투여

복제 능력이 있는 IL-10, β-갈락토시다제 또는 루시페라제를 암호화하는 유전자를 함유하는 재조합 센다이 바이러스 벡터(각각 SeV-IL10, SeV-βgal 및 SeV-루시페라제)를 문헌[Kato A. et al., EMBO J., 1997, 16, 578-587 및 Yu D. et al., Genes Cells, 1997, 2, 457-466]에 개시된 방법에 따라 제작하였다. 상기 벡터들을 달걀에서 전파시키고, 바이러스를 함유하는 요막액을 본 발명의 재조합 센다이 바이러스 벡터를 포함하는 조성물로서 사용될 때까지 -80 ℃에서 보관하였다.

센다이 바이러스 벡터를 하기와 같은 예로 투여하였다.

1. 비내 투여

마우스를 메토판 흡입에 의해 마취시키고, 벡터를 냄새맡기에 의해 투여하였다. 달리 나타내지 않는 한, 총 100 ㎕ 부피의 SeV-IL10 또는 대조용 바이러스 SeV-βgal 7 x 10⁶ 내지 7 x 10⁸ pfu의 용량을 마우스의 코에 접종하고 10 내지 20 초의 기간에 걸쳐 일시주사로서 냄새맡게 하였다. 상기 방법에 의해 폐와 코에 바이러스가 침착되었다.

2. 관류

마우스를 히프놈/히프노발(hipnom/hipnoval)로 마취시켰다. SeV-IL10 또는 대조용 바이러스 SeV-βgal을 코 상피 상에 직접 얇은 카테터를 통해 상기 바이러스를 달리 나타내지 않는 한 총 100 ㎕ 부피의 7 x 10⁷ 또는 7 x 10⁸ pfu로 투여함으로써 10 분의 기간에 걸쳐 코 상피(비갑개)에 선택적으로 적용하였다. 상기 과정 동안, 마우스를 그의 머리를 아래로 하여 뒤집어진 자세로 유지시켰다. 따라서 과잉의 바이러스는 코로부터 떨어졌다. 상기 방법에 의해 코에 바이러스가 우세하게 침착되었고, 폐에는 매우 적은 바이러스가 도달하였다.

3. 근육내 투여

달리 나타내지 않는 한, C57BL/6 마우스에 양쪽 전경골(TA) 근에 SeV-IL10 또는 대조용 SeV-βgal 7 x 10⁷ 내지 7 x 10⁸ pfu를 주사하였다(각 근육 당 50 ㎕, n=6 내지 11). 용량 의존성 반응을 SeV-βgal(7 x 10⁴ 내지 7 x 10⁸ pfu/동물)을 사용하여 시험적인 실험으로 관찰하였다.

실시예 2: 조직 용해질, 혈청 및 기관지 폐포 세척액(BALF)의 제조

마우스를 바이러스 투여 후 48 시간째에 희생시켰다. 조직 용해질, 혈청 및 BALF를 하기와 같이 제조하였다.

1. 조직 용해질

TA 근, 폐 및 비갑개를 절제하고 0.25 M 트리스-HCl(pH 8) 용액 300 ㎕ 중에 균질화시켰다. 세포를 3 주기의 동결-해동에 의해 용해시켰다. 샘플들을 14,000 rpm에서 10 분간 원심분리시키고, 상등액을 후속의 분석을 위해 -80 ℃에서 보관하였다. 각 샘플의 단백질 농도를 변형된 폴린-로우리(Folin-Lowry) 단백질 분석에 의해 측정하였다.

2. 혈청

혈액 샘플을 심장으로부터 채혈하고, 37 ℃에서 2 시간 동안 배양하여 혈병을 형성시켰다. 이어서 샘플들을 4,000 rpm에서 10 분간 원심분리시키고, 수득된 혈청을 새로운 튜브로 옮기고 후속의 분석을 위해 -80 ℃에서 동결시켰다.

3. BALF

마우스 기관(trachea)을 노출시키고 카테터를 삽입하였다. 폐를 0.5 ㎖ PBS로 3 회 세척하였다. BALF를 수거하고 4,000 rpm에서 5 분간 원심분리시키고, 후속의 분석을 위해 -80 ℃에서 동결시켰다.

실시예 3: 인터루킨-10 (IL-10) ELISA

인간 IL-10에 대한 ELISA를 R&D로부터 구입한 키트를 사용하여 제조사의 지시에 따라 수행하였다. 조직 용해질 중의 IL-10의 양을 단백질 농도에 의해 표준화하고, 데이터를 시토졸 단백질 ㎎ 당 IL-10 pg의 양으로 계산하였다.

실시예 4: 정보제공 유전자 분석

루시페라제 분석을 프로메가(Promega)로부터 구입한 키트를 사용하여 제조사의 지시에 따라 수행하였다. β-갈락토시다제 분석을 클론테크(Clontech)로부터 구입한 키트를 사용하여 제조사의 지시에 따라 수행하였다. 이들 분석을 조직 용해질을 사용하여 수행하였으며, 데이터를 단백질 농도에 의해 표준화시켰다.

실시예 5: 통계적 분석

모든 데이터들을 평균값±표준 오차(SEM)로 나타내었다. 평방편차를 만-휘트니(Mann-Whitney) 시험에 의해 분석하고, p<005인 데이터를 유의수준으로서 간주하였다.

실시예 6: COS7 세포에의 IL-10 발현 센다이 바이러스 벡터의 형질감염

COS7 세포를 상이한 용량(24 웰 플레이트에서 10⁴ 내지 10⁶ pfu/웰)으로 SeV-IL10으로 형질감염시켰다. 형질감염 16 시간 후에, 배양 상등액 중의 분비된 IL-10의 양을 검사하였다. IL-10 발현 플라스미드(pCI-IL10)(80 ㎍/㎖, 100 ㎕)를 일시적으로 형질감염시키고(리포펙션에 의해), IL-10 발현을 SeV-IL10의 것과 비교하였다. SeV-βgal을 대조군으로서 사용하였다.

SeV-IL10으로 형질감염된 세포에서, 분비된 IL-10의 양은 용량-의존 방식으로 증가하였다(도 1). 최고 역가(10⁶ pfu/웰)에서 SeV-IL10로 감염된 세포로부터 분비된 IL-10의 양은 리포펙션에 의해 IL-10을 암호화하는 플라스미드로 형질감염된 세포의 양에서의 2 자리수만큼 더 많았다(SeV-IL10: 333±47 ng/㎖/㎎ 단백질; 플라스미드: 6.8±1.4 ng/㎖/㎎ 단백질).

실시예 7: 냄새맡기에 의한 마우스 내로의 센다이 바이러스 벡터의 비내 투여

비내 점적을 통한 마우스 기도로의 바이러스 벡터(6.7 x 10⁷ pfu/100 ㎕)의 국소 투여에 이어서, 형질감염 후 2 일째에 폐 균질물 및 BALF 중의 IL-10의 분비를 측정하고 플라스미드 DNA로 리포솜 매개된 형질감염에 따른 IL-10 분비와 비교하였다. 혈청 중의 IL-10의 농도를 또한 측정하였다.

폐 균질물에서, 분비된 IL-10의 양은 플라스미드 형질감염에 의해 수득된 양보다 2 자리수만큼 더 많았다(SeV-IL10: 21457±5112 pg/㎎ 단백질; 플라스미드: 310±54 pg/㎎ 단백질)(도 2). 더욱 또한, BALF에서, 감염 2 일 후의 분비된 IL- 10의 양은 플라스미드 형질감염에 의해 수득된 양보다 3 자리수만큼 더 많았다(SeV-IL10: 153366±41823 pg/㎖; 플라스미드: 71±63 pg/㎖)(도 3). 투여 2 일 후에, 혈청 중의 IL-10 수준은 대조용 바이러스 감염된 마우스 중에서보다 SeV-IL10 감염된 마우스에서 현저하게 더 높았다(SeV-IL10: 393±132 pg/㎖; SeV-βgal: 0.31±0.26 pg/㎖)(도 4).

실시예 8: 냄새맡기 또는 관류에 의한 센다이 바이러스 벡터의 비내 투여

바이러스 벡터에 실시예 7에서와 같이 비내 점적(냄새 맡기)에 의해 투여하거나, 또는 관류에 의해 코 상피(비갑개)에 직접 투여하고, 형질감염된 유전자의 발현을 비교하였다. 마우스를 냄새맡기 또는 관류에 의해 코 상피(비갑개)에 SeV-luc(7 x 10⁷ pfu/100 ㎕)로 감염시키고, 48 시간 후에 희생시키고, 폐 및 비갑개에서의 루시페라제 발현을 검사하였다(n=3). 냄새맡기에 의해 감염된 마우스에서, 루시페라제 유전자의 현저한 발현이 폐와 비갑개 모두에서 관찰되었다. 대조적으로, 관류에 의해 감염된 마우스에서, 루시페라제 발현은 비갑개로 제한되었으며, 폐에서는 거의 검출되지 않았다(도 5).

이어서, SeV-IL10(7 x 10⁷ 및 7 x 10⁸pfu/100 ㎕)을 냄새맡기 또는 관류에 의해 코 상피(비갑개)에 투여하고, 마우스를 48 시간 후에 희생시키고, 폐와 비갑개 중의 IL-10 발현을 검사하였다(n=6). 상당량의 IL-10이 냄새맡기에 의해 바이러스 벡터가 투여된 마우스의 폐에서 검출되었다. 관류에 의해 감염된 쥐의 비갑 개 균질물에서도 현저한 발현이 또한 탐지되었지만, 폐 균질물에서는 단지 미량 수준의 IL-10 발현이 탐지되었다(도 6).

혈청 중의 분비된 IL-10 수준을 SeV-IL10이 투여된 상기 마우스에서 측정하였다. SeV-IL10(7 x 10⁷ 및 7 x 10⁸pfu/100 ㎕)을 냄새 맡기 또는 관류에 의해 코 상피(비갑개)에 투여하고, 마우스를 48 시간 후에 희생시키고, 혈청 중의 IL-10 발현을 검사하였다(n=6). 냄새맡기에 의해 투여된 마우스의 혈청에서 높은 수준의 IL-10 분비가 관찰되었다. 관류에 의해 투여된 마우스의 혈청에서, IL-10 분비는 냄새맡기에 의해 투여된 마우스의 수준보다 낮았지만, 여전히 현저한 수준의 IL-10 분비가 관찰되었다(도 7). SeV-luc(7 x 10⁷ pfu/100 ㎕)로 감염시킨 대조용 마우스에서, 현저한 IL-10의 분비는 존재하지 않았다.

실시예 9: 마우스로의 센다이 바이러스 벡터의 근육내 투여

SeV-βgal을 마우스의 TA 근에 주사하고, 2 일 후의 βgal의 발현 수준을 β-갈락토시다제 분석에 의해 검사하였다. βgal의 발현이 용량 의존 방식으로 증가하였다(도 8). 최고 역가(3.5 x 10⁸ pfu)의 SeV-βgal의 투여에 의해 수득된 발현 수준(βgal 61,672 pg/단백질 ㎎)은 최적 용량에서 노출된 DNA 및 AAV(βgal AAV)에 의해 달성된 수준에 비해 각각 300 배 및 7 배 더 높았다.

SeV-βgal 투여 후 βgal 발현의 시간에 따른 추이를 검사하였다. SeV-βgal(3.5 x 10⁷ pfu/근육) 또는 대조용 SeV-luc(3.5 x 10⁷ pfu/근육)를 TA 근에 주사하고 마우스를 상이한 시점들에서 희생시키고, 근육 균질물에서의 βgal 발현을 측정하였다. 결과는 형질감염된 유전자의 발현이 주사 후 2 일째에 최대 수준에 도달하였으며, 이어서 28 일 후에 주사 전 수준인 기본 수준으로 감소함을 나타내었다(도 9).

센다이 바이러스 벡터의 반복적인 투여에 의해 얻은 발현 수준을 검사하였다. 마우스의 각 TA 근을 SeV-βgal(3.5 x 10⁷ pfu/근육)로 감염시키고, 지시된 시간에서 SeV-luc(3.5 x 10⁷ pfu/근육)로 추가 감염시켰다. 마우스를 두 번째 주사 2 일 후에 희생시키고, 근육 균질물 중의 루시페라제 발현을 검사하였다. 상기 루시페라제 수준을 SeV-luc를 1 회 주사한 마우스의 수준 또는 SeV-luc를 주사하지 않은 마우스의 수준과 비교하였다. 반복적인 주사에 의해 발현 수준이 낮아졌으나, 여전히 현저한 발현 수준의 증가가 두 번째 주사 후에도 관찰되었다(도 10). 발현 수준의 현저한 증가를 여전히 초기 주사 28 일 후에 반복적인 주사에 의해 얻을 수 있었다(발현 수준은 단일 투여에 의해 성취된 수준의 1/65로 감소하였다).

SeV의 근육내 투여에 의해 유도된 전신적 항-SeV 항체의 증가를 검사하였다. 마우스의 각 TA 근을 SeV-βgal(3.5 x 10⁷ pfu/근육)로 감염시키고, 지시된 시점들에서 마우스를 희생시키고, 혈청 중의 SeV-특이적 항체들을 검출하였다. 도 11 에 나타낸 바와 같이, 용량 의존성 항체 반응이 전신적으로 명백히 관찰되었다. 또한, SeV 용량 의존성인 TA의 염증이 관찰되었다. SeV 투여에 의해 야기된 TA의 항체 반응 및 염증은 반복적인 주사 후에 감소된 발현의 이유가 될 수 있다.

실시예 10: IL-10 발현 센다이 바이러스 벡터의 근육내 투여

SeV-IL10을 TA 근에 투여하고, IL-10 분비 효율을 검사하였다(4 x 10⁸ pfu/근육). 주사 후 2 일째에, 근육 균질물을 제조하고 IL-10 발현을 측정하였다. 결과를 리포솜에 의해 매개된 플라스미드 DNA 형질감염에 의해 수득된 것과 비교하였다. 또한, 혈청 중의 IL-10 수준을 측정하였다.

주사 2 일 후의 근육 균질물 중의 IL-10 발현 수준은 플라스미드 DNA 주사(50 ㎍ DNA/TA)에 의해 수득된 것보다 1 또는 2 자리수만큼 더 높은 것으로 밝혀졌다(SeV-IL10: 1067±32 pg/㎎ 단백질; 플라스미드: 50.9±11 pg/㎎ 단백질)(도 12). 혈청 중의 IL-10 수준은 SeV-IL10 투여 후 2 일째에 증가한 반면, IL-10은 플라스미드 DNA가 투여된 마우스의 혈청에서 검출되지 않았다(도 13).

상기 실험과 유사하게 수행된 별도의 실험에서, SeV-IL10 주사 2 일 후의 근육 균질물 중의 IL-10 수준은 IL-10을 발현하는 노출된 플라스미드 DNA의 형질감염에 의해 수득된 것보다 160 배 더 높았다(도 14). 대조적으로, IL-10을 발현하는 AAV(IL-10 AAV)를 투여한 마우스에서, IL-10은 주사 후 2 일째에 근육 균질물에서 검출되지 않았다. IL-10은 플라스미드 DNA로 형질감염되었거나 AAV로 감염된 마 우스의 혈청에서 검출되지 않은 반면, SeV-IL10을 주사한 마우스 혈청 중의 IL-10 수준은 주사 2 일 후에 797±383 pg/㎖로 증가하였다(도 15). 이러한 데이터는 재조합 SeV가 근육내 투여를 통해 유전자를 효율적으로 전달할 수 있음을 가리킨다.

실시예 11: 폐 섬유증 마우스 모델에서 SeV-IL10 투여 효과

블레오마이신으로 유발된 폐렴과 섬유증이 있는 마우스 모델에서 SeV-IL10의 효과를 검사하였다. SeV-IL10, 또는 대조군으로서 SeV-βgal 및 SeV-luc(각각 7 x 10⁸ pfu/마우스)를 TA 근에 투여하였다. 근육내 투여 후 2 일째에 블레오마이신(0.075 u/100 ㎕; 염수 100 ㎕ 중에 함유된 0.075 단위) 또는 염수를 기관 내 주사하였다. 블레오마이신 주사 후 11 일째에, 마우스를 희생시키고, 폐 중의 콜라겐 침착을 6-히드록시프롤린의 양을 측정함으로써 문헌[Pettipher E.R., Br. J. Pharmacol., 1993, 110, 423-427]에 개시된 방법에 따라 히드록시프롤린 분석에 의해 측정하였다.

SeV 단독 투여는 호흡기도에서 콜라겐 침착을 증가시키는 것으로 밝혀졌다[도 16; 좌측으로부터 첫 번째(SeV-βgal + SeV-luc + 블레오마이신) 및 세 번째 (블레오마이신) 컬럼 비교]. 그러나, SeV-IL10의 투여는 콜라겐 침착을 현저하게 감소시켰다[좌측으로부터 첫번째(SeV-βgal + SeV-luc + 블레오마이신) 및 두번째 (SeV-IL10 + 블레오마이신) 컬럼 비교]. 따라서, SeV-IL10의 근육내 투여는 폐 섬유증에 대해 치료 효과를 갖는 것으로 입증된다.

본 발명은 심혈관계에서 외래 유전자를 높은 수준으로 발현할 수 있게 한다. 본 발명은 또한 다양한 염증성 질병, 예를 들어 낭성 섬유증으로 대표되는 폐 섬유증에 대한 유전자 요법의 기본적인 기술을 제공한다.

SEQUENCE LISTING <110> DNAVEC Research Inc. <120> PARAMYXOVIRUS VECTOR FOR GENE TRANSFER TO THE CARDIOVASCULAR SYSTEM <130> D3-A0008P <140> <141> <150> JP 2000-339942 <151> 2000-11-08 <160> 8 <170> PatentIn Ver. 2.0 <210> 1 <211> 10 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Artificially Synthesized Sequence <400> 1 ctttcaccct 10 <210> 2 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Artificially Synthesized Sequence <400> 2 tttttcttac tacgg 15 <210> 3 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Artificially Synthesized Sequence <400> 3 cggccgcaga tcttcacg 18 <210> 4 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Artificially Synthesized Sequence <400> 4 atgcatgccg gcagatga 18 <210> 5 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Artificially Synthesized Primer Sequence <400> 5 gttgagtact gcaagagc 18 <210> 6 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Artificially Synthesized Primer Sequence <400> 6 tttgccggca tgcatgtttc ccaaggggag agttttgcaa cc 42 <210> 7 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Artificially Synthesized Primer Sequence <400> 7 atgcatgccg gcagatga 18 <210> 8 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Artificially Synthesized Primer Sequence <400> 8 tgggtgaatg agagaatcag c 21

Claims

인터루킨-10 유전자를 포함하고, 상기 유전자의 발현 산물이 투여 부위로부터 혈류를 통해 심혈관계로 전달되는, 심혈관계로의 유전자 전달용 파라믹소바이러스 벡터 또는 상기 벡터를 포함하는 세포를 유효 성분으로 포함하는, 근육내 투여용 및 염증성 질병 치료용 약제.
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제 1 항에 있어서, 염증성 질병이 폐 섬유증인 약제.
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