KR100817024B1

KR100817024B1 - 핵산 또는 약물을 간에 특이적으로 전달하는 복합체 및이를 포함하는 약학적 조성물

Info

Publication number: KR100817024B1
Application number: KR1020060110402A
Authority: KR
Inventors: 김미현; 김수인; 신덕향; 박만훈
Original assignee: 재단법인 목암생명공학연구소
Priority date: 2006-11-09
Filing date: 2006-11-09
Publication date: 2008-03-26
Anticipated expiration: 2026-11-09
Also published as: US20100239657A1; US20080138394A1; US8318199B2

Abstract

본 발명은 아포리포프로테인 A-Ⅰ(apolipoprotein A-Ⅰ)과 양이온성 리포좀(cationic liposome) 또는 중성 리포좀(neutral liposome)으로 구성된 복합체 및 이를 포함하는 약학적 조성물에 관한 것으로, 본 발명의 복합체는 DNA, RNA, 항암제, 항바이러스제, 활성 폴리펩타이드 등의 치료용 약물을 간에 특이적으로 전달할 수 있으므로, 이를 포함하는 약학적 조성물은 핵산 또는 치료용 약물의 간 선택적 전달에 이용할 수 있으며, 간 관련 질환의 치료에 효과적으로 사용할 수 있다.

Description

핵산 또는 약물을 간에 특이적으로 전달하는 복합체 및 이를 포함하는 약학적 조성물{COMPOSITE FOR SPECIFICALLY TRANSPORTING A NUCLEIC ACID OR A DRUG TO LIVER AND PHARMACEUTICAL COMPOSITION COMPRISING THE SAME}

도 1a는 성인의 혈청으로부터 아포리포프로테인 A-Ⅰ(Apo A-Ⅰ)을 분리한 후 전기영동한 결과이고,

도 1b는 Apo A-Ⅰ을 적외선 염료로 표지화하여 생쥐의 꼬리에 정맥 투여한 후 3시간 동안, 생쥐 전신에서의 Apo A-Ⅰ의 생체 내 분포도를 촬영 및 분석한 결과이고,

도 1c는 Apo A-Ⅰ을 생쥐에 투여한 후, 간에서의 Apo A-Ⅰ의 흡수율을 측정한 결과이고,

도 2a는 본 발명의 복합체의 Apo A-Ⅰ을 ¹³¹I로 표지화(Dc-Apo*/RLuc)하여 생쥐에 정맥 투여한 후, 전신에서 복합체의 위치를 감마-카메라로 확인한 결과이고,

도 2b는 본 발명의 복합체(Dc*-Apo/RLuc) 및 도텝(DOTAP)/콜레스테롤만으로 이루어진 복합체(Dc*/RLuc)를 로다민(rhodamine)으로 각각 표지화하여 정맥 투여한 후, 시간대별로 각 복합체의 생체 내 분포를 확인한 결과이고,

도 2c는 루시페라제(luciferase) 발현 플라스미드를 포함하는 본 발명의 복합체(Dc-Apo/RLuc) 또는 도텝/콜레스테롤만으로 이루어진 복합체(Dc/RLuc)를 정맥 주사로 투여한 후, 심장, 폐, 신장 및 간 조직에서 발현된 루시페라제에 의한 생체발광 수준을 측정한 결과이고,

도 3a는 HBV 특이적 siRNA(siHBV)로 이루어진 본 발명의 복합체(Dc-Apo/siHBV), HBV와 관련되지 않은 siRNA를 포함하는 복합체(Dc-Apo/siCont) 및 siHBV를 포함하며 도텝/콜레스테롤만으로 이루어진 복합체(Dc/siHBV)를 각각 정맥 투여하고 2일, 4일, 6일 및 8일이 경과한 시점에서 각각 HBV 발현 정도를 측정한 결과이고,

도 3b는 HBV 감염 생쥐에 각각 0.5, 1 또는 2 ㎎/㎏의 복합체(Dc-Apo/siHBV)를 정맥 투여하고, 4일 후에 혈청 HBV 표면 항원(HBsAg) 수준을 측정한 결과이고,

도 4a는 루시페라제(luciferase) 발현 플라스미드인 pEGFPLuc를 생쥐에 투여하고, 루시페라제에 대한 siRNA를 포함하는 복합체(Dc-Apo/siLuc) 및 임의의 siRNA를 포함하는 복합체(Dc-Apo/siCont)를 각각 생쥐에 투여한 후, 생체 내에서 루시페라제의 발현 수준을 측정한 결과이고,

도 4b는 도 4a의 결과를 그래프로 나타낸 것이다.

본 발명은 아포리포프로테인 A-Ⅰ(apolipoprotein A-Ⅰ)과 양이온성 리포좀(cationic liposome) 또는 중성 리포좀(neutral liposome)의 복합체 및 이를 포함하는 약학적 조성물에 관한 것이다.

간 질환은 B형 간염 바이러스(Hepatitis B virus, HBV) 또는 C형 간염 바이러스(Hepatitis C virus, HCV)를 비롯한 감염성 간 질환과 간에 유해한 물질, 유전적 요인 또는 환경에 기인한 비감염성 간 질환이 있다. 초기 상태의 간 질환은 다양한 생물학적 자극으로 인하여 만성 간염(chronic hepatitis), 간경변(liver cirrhosis) 또는 간세포암(hepatocellular carcinoma, HCC)으로 발전할 수 있다. 대부분의 심각한 간질환은 HBV 또는 HCV의 감염에 의해 발생하는 것으로 알려져 있는데, HBV의 경우 백신이 개발되어 있지만 치료제로 사용 중인 알파 인터페론(IFN-α) 또는 라미부딘(lamivudine)은 치료율이 낮을 뿐 아니라 부작용이 심각한 것으로 알려져 있다. HCV의 경우에는 백신이 개발되어 있지 않기 때문에 예방이 어려우며, 주요한 치료법 중 하나는 알파 인터페론 또는 리바비린(ribavirin)과 함께 병용하여 치료하는 것이다. 그러나, 이 치료법 역시 제한된 효율 및 낮은 반응율을 가지고 있다. 따라서, HBV 또는 HCV의 감염을 치료할 새로운 치료법의 개발이 시급한 실정이다.

한편, RNA 간섭(RNA interference, 이하, RNAi라고 함)은 모든 진핵세포에 이중 가닥 RNA(dsRNA)를 도입함으로써 내인성과 외인성 유전자의 발현이 억제되는 진화적으로 보존되어 있는 과정이다. RNAi는 긴 이중가닥 RNA(dsRNA)를 21-23 뉴클레오티드의 작은 간섭 RNA(short interfering, siRNA)로 연속적으로 절단하는 다 이서(Dicer)라 부르는 RNase Ⅲ-유사 엔도뉴클레아제에 의해 형성된다(Bernstein et al., Nature, 409: 363, 2001). 형성된 siRNA는 ATP 존재하에서 siRNA를 푸는 RNA-유도성 침묵화 복합체(RNA-induced silencing complex, RISC)에 삽입된다(Hammond et al., Nature, 404: 293, 2000). RNA-유도성 침묵화 복합체에 삽입된 안티센스 RNA는 상보적 RNA를 인지하고 세포 내 세포질에서 그의 분해를 유도한다.

최근, HBV 또는 HCV의 치료제를 개발하기 위해 이 두 가지 바이러스의 유전자에 대한 siRNA 선별 및 효능 검증 실험이 다양하게 수행되고 있다(Blight et al., Science 290: 1972, 2000; Shin et al., Virus Res 119: 146, 2006). 이에 따라 이들 siRNA의 우수한 항바이러스성 활성이 세포 배양 뿐만 아니라, 동물 모델에서도 확인이 되었지만, 간 특이적 전달 방법의 부재가 치료제로서의 실용화에 문제가 되고 있다. siRNA가 치료제로 사용되기 위해서는 경구 투여나 주사를 통한 처방이 가능해야 하고, 다른 장기에 대한 부작용을 최소화하기 위해서 질병 부위에 대한 특이성을 지녀야 한다. 이와 관련하여 안정한 핵산-지질 입자(stable nucleic acid-lipid particles; SNALP)로 siRNA를 싸서 정맥 주사를 통해 HBV 복제 효과를 관찰한 실험이 있었으나(Morrissey, et al., Nat Biotechnol 23: 1002, 2005; Zimmermann et al., Nature 441: 111, 2006), 이들의 경우에는 siRNA를 화학적으로 변형(modification)하였고, 간 특이적 전달체를 도입하지 않았기 때문에 비특이적 전달(non-specific delivery)로 인하여 siRNA가 다른 조직에 미치는 영향과 체내의 전달 기작(mechanism)에 대해서는 자세히 연구되지 않았다.

또한, PCT 출원 제 WO 2005/007196 호는 하나 이상의 siRNA 분자를 캡슐화한 안정한 핵산-지질 입자의 제조방법 및 핵산-지질 입자를 피검체에 전달/투여하는 방법에 대하여 개시하고 있지만, 이 방법 역시 특정 조직으로의 전달 특이성이 없어, 특정 부위의 질환에 대한 치료 용도로 사용하기는 어렵다는 단점이 있다.

이에, 본 발명자들은 간 특이성을 지닌 아포리포프로테인 A-Ⅰ과 양이온성 또는 중성 리포좀의 복합체를 이용하면 siRNA 등의 핵산 또는 치료용 약물을 간에 특이적으로 전달할 수 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

따라서, 본 발명의 목적은 핵산 또는 치료용 약물을 간에 특이적으로 전달할 수 있는 복합체를 제공하는 것이다.

또한, 본 발명의 다른 목적은 상기 복합체의 제조방법을 제공하는 것이다.

또한, 본 발명의 또 다른 목적은 상기 복합체를 유효성분으로 함유하는 약학적 조성물을 제공하는 것이다.

상기 목적에 따라, 본 발명은 아포리포프로테인(apolipoprotein) A-Ⅰ(이하, Apo A-Ⅰ으로 표시함)과 양이온성 리포좀(cationic liposome) 또는 중성 리포좀(neutral liposome) 형성물질을 포함하는 복합체를 제공한다.

본 발명의 복합체는 50 내지 400 nm, 바람직하게는 100 내지 250 nm의 입경 을 갖는 나노입자일 수 있으며, 상기 Apo A-Ⅰ은 혈청으로부터 공지의 방법으로 얻을 수 있다.

양이온성 리포좀 형성물질은 도텝 (DOTAP; 1,2-Dioleoyl-3-Trimethylammonium-Propane), DC-콜레스테롤(DC-Cholesterol; 3β-[N-(N',N'-Dimethylaminoethane)-carbamoyl]Cholesterol), DDAB( Dimethyldioctadecylammonium Bromide) 및 이들의 혼합물일 수 있고, 중성 리포좀 형성물질은 DOPE(L-alpha-Dioleoyl Phosphatidylethanolamine), 콜레스테롤(Cholesterol) 및 이들의 혼합물일 수 있으나, 이것만으로 한정되는 것은 아니다.

상기 복합체는 치료용 약물을 추가로 포함할 수 있으며, 치료용 약물로서는 핵산, 항암제, 항바이러스제 및 활성 폴리펩타이드 등을 예시할 수 있으나, 이것 만으로 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 복합체에 포함시킬 수 있는 핵산은 플라스미드, PCR 산물을 포함하는 DNA; siRNA, 라이보자임(ribozyme)을 포함하는 RNA 및 이들의 화학적 변형을 거친 유도체일 수 있으며, 바람직하게는 B형 간염 바이러스 또는 C형 간염 바이러스에 특이적인 siRNA일 수 있다.

또한, 본 발명의 복합체에 포함시킬 수 있는 항암제로는 카보플라틴, 시스플라틴, 옥살리플라틴, 헵타플라틴, 에토포시드, 세무스틴, 하이드록시카바미드, 시트아라빈, 플루다라빈, 독소루비신, 에피루비신, 이다루비신, 피라루비신, 플루오로우라실(5-FU), 플루옥스우리딘, 마이토마이신, 블레오마이신, 클로파지민, 인터 페론, 스트렙토조신, 겜시타빈, 에노시타빈, 카페시타빈, 우르소데옥시콜린산, 소라페니브(sorafenib), 테가퍼(Tegafur), 홀뮴(holmium) 및 홀뮴-키토산 복합체 등을 예시할 수 있고, 항바이러스제로는 아타자나비르(Atazanavir), 리바비린(Ribavirin), 자나미비르(Zanamivir), 아시클로비르(Acyclovir), 엔테카비르(Entecavir), 다이다노신(Didanosin), 네비라파인(nevirapine), 발아시클로비르(Valaciclovir), 넬피나비르(Nelfinavir), 에파비렌즈(Efavirenz), 간시클로비르(Ganciclovir), 라미부딘(Lamivudine), 팜시클로비르(Famciclovir), 스타부딘(Stavudine), 아바카비르(Abacavir), 인디나비르(Indinavir), 오셀타미비르(Oseltamivir), 이노시플렉스(Inosiplex) 및 아데포비르(Adefovir) 등을 예시할 수 있으나, 이것만으로 한정하는 것은 아니다.

본 발명의 복합체에 포함시킬 수 있는 활성 폴리펩타이드로는 EGF(epidermal growth factor), EPO(erythropoietin), 혈액응고 인자 VIII, IX, VIIa, FSH(follicle stimulating hormone), GCSF(granulocyte colony-stimulating factor), GM-CSF(granulocyte-macrophage colony stimulating factor), 인슐린, 인슐린 유사 성장인자(insulin-like growth factor), 인터페론 α, β 및 γ, 인터루킨-1, 2, 11, 12 및 15, PTH(parathyroid hormone), PDGF(platelet-derived growth factor), hGH(human growth hormone), tPA(tissue plasminogen activator), VEGF(vascular endothelial growth factor) 및 이들의 혼합물을 예시할 수 있으나, 이것만으로 한정하는 것은 아니다.

또한, 본 발명은 Apo A-Ⅰ과 핵산 또는 치료용 약물의 복합체를 제공한다. 이러한 복합체에 사용가능한 치료제는 상기에서 설명한 바와 같다.

아울러, 본 발명은 상기 복합체의 제조방법을 제공한다.

본 발명의 복합체의 제조방법은 (1) 리포좀 형성물질을 유기용매에 용해시켜 리포좀을 형성한 후 유기용매를 제거하는 단계; (2) 얻어진 리포좀을 덱스트로즈 용액에 용해시킨 후 초음파 처리(sonication)하여 리포좀 입자를 포함하는 현탁액을 제조하는 단계; 및 (3) 상기 현탁액에 apo A-I 용액을 첨가한 후, 방치하여 Apo A-Ⅰ과 리포좀의 복합체를 형성하는 단계를 포함한다. 이 때, Apo A-I과 리포좀의 복합체에 핵산 또는 치료용 약물을 삽입시키는 단계를 추가로 포함할 수 있다.

상기 또 다른 목적에 따라, 본 발명은 상기 복합체를 포함하는 핵산 또는 치료용 약물의 간 특이적 전달용 조성물을 제공한다.

본 발명에 의한 조성물은 일반적인 의약품 제제의 형태로 사용될 수 있으며, 이러한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁용제, 유제, 동결건조제제, 좌제가 포함된다. 상기 비수성용제 또는 현탁용제로는 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등을 사용할 수 있으며, 상기 좌제의 기제로는 위텝솔, 마크로골, 트윈 61, 카카오지, 라우린지, 글리세롤, 젤라틴 등을 사용할 수 있다.

또한, 본 발명에 의한 조성물의 인체에 대한 투여량은 환자의 나이, 몸무게, 성별, 투여 형태, 건강 상태 및 질환 정도에 따라 달라질 수 있으며, 몸무게가 70 ㎏인 성인 환자를 기준으로 할 때, 일반적으로는 0.1 ~ 1000 ㎎/일, 바람직하게는 1 ~ 500 ㎎/일이며, 일정시간 간격으로 1일 1회 내지 수회에 분할 투여할 수도 있 다.

이하 본 발명을 실시예에 의하여 더욱 상세하게 설명한다. 단, 하기 실시예들은 본 발명을 예시하는 것으로 본 발명의 내용이 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.

실시예 1: 정제된 apo A-Ⅰ의 간 특이성 확인

HBV(hepatitis B virus), HCV(hepatitis C virus) 또는 HIV(human immunodeficiency virus)와 같은 바이러스 병원균에 감염되지 않은 건강한 일반 성인의 혈청으로부터 알려진 제조방법(Lerch, et al., Vox Sang 71: 155, 1996)을 이용하여 인간 내인성 Apo A-Ⅰ(28 kDa)을 분리하였다. 이를 SDS-PAGE(Sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis)로 정제한 후(도 1a), 정제된 apo A-I의 순도를 쿠마시 블루(Coomassie blue) 염색으로 확인하였으며, 염소 항-인간 apo A-Ⅰ 항체(goat anti-human apo A-I antibody (Academy Biomedical Company)를 이용하여 정제된 단백질이 apo A-I임을 웨스턴 블롯(western blot) 분석으로 확인하였다.

정제된 Apo A-Ⅰ(0.6 ㎎)을 IRDye 800 CW 생체내 영상제(in vivo imaging agents)(LI-COR)를 사용하여 적외선 염료(infrared dye)로 염색하고, 염색반응에 사용되지 않은 염료는 덱스트란 제염 컬럼(dextran desalting column)(Pierce)으로 제거하였다.

표지화된 apo A-I (200 ㎍)을 6 내지 8주령 암컷 무모 생쥐(Charles River) 에 정맥 투여한 후, 생쥐 전신에서의 Apo A-Ⅰ의 생체 내 분포도를 측정하기 위하여 각 측정 시점 10분 전에 2% 이소플루란(isoflurane)으로 마취하고 이미징 시스템(IVIS 200 imaging system)(Xenogen) 및 생체영상 소프트웨어(Living Image Software)(Xenogen)로 생쥐의 전신을 촬영 및 분석하였다(도 1b). 도 1b에 표시된 결과에서 볼 수 있듯이, Apo A-Ⅰ은 간에 특이적으로 전달되었으며, 3시간 이후에도 생체 내에서 안정하게 존재하였다.

또한, Apo A-Ⅰ의 최대 흡수율을 정량하기 위하여 생체영상 소프트웨어(Xenogen)를 이용하여 생쥐의 간 영역에서 광자의 세기를 측정하였다(도 1c). 도 1c에 표시된 결과에서 볼 수 있듯이, Apo A-Ⅰ의 흡수율은 처리 후 40 내지 150분 사이에 45%에 이르렀다.

실시예 2: Apo A-Ⅰ과 리포좀 형성물질을 이용한 복합체의 제조

Apo A-Ⅰ, 도텝 및 콜레스테롤을 이용하여 하기와 같은 방법으로 복합체를 제조하였다.

우선, 동일 몰비로 도텝(Avanti Polar Lipids)과 콜레스테롤(Sigma)을 클로로폼(chloroform)에서 배합하여 리포좀을 형성하였다. 리포좀 형성 후에, 질소 가스를 이용하여 유기 용매를 제거하고, 이후 약 2시간 동안 진공 건조(vacuum desiccation)를 통해 잔여 유기 용매를 완전히 제거하였다. 건조된 필름 형태의 리포좀을 5% 덱스트로즈 용액에 녹인 후, 수조 초음파기(bath sonicator)를 이용하여 초음파 처리(sonication)함으로써 작고 균일한 도텝/콜레스테롤 리포좀 입자(이 하, Dc로 표시함)를 포함하는 현탁액을 제조하였다. 상기 Dc 현탁액에 10% apo A-I 용액을 10:1의 중량비로 첨가하고, 4 ℃에서 밤새 방치하여 Apo A-Ⅰ과 Dc의 복합체(이하, Dc-Apo로 표시함)를 제조하였다.

DNA를 포함한 Dc 및 Dc-Apo 복합체에 대하여 크기를 분석한 결과, 평균 지름 이 각각 226.4± 7.4 ㎚ 및 188.5± 4.8 ㎚의 나노입자인 것으로 분석되었다.

실시예 3: HBV의 siRNA를 포함하는 복합체의 제조

40 ㎍의 B형 간염 바이러스(hepatitis B virus, HBV) 특이적 siRNA(서열번호 1: 5′-GAGGACUCUUGGACUCUCAdTdT-3′(센스); 서열번호 2: 5′-UGAGAGUCCAAGAGUCCUCdTdT-3′(안티센스))를 실시예 2에서 제조된 400 ㎍의 Dc-Apo와 5% 덱스트로즈 용액 하에서 30분간 혼합하여 복합체(Dc-Apo/siHBV)를 제조하였다. 입자의 크기와 전하는 제타사이저 (Zetasizer) 3000(Malvern Instruments)을 이용하여 측정하였다.

실시예 4: 루시페라제(luciferase)의 siRNA를 포함하는 복합체의 제조

루시페라제 특이적 siRNA(서열번호 3: 5′-CUUACGCUGAGUACUUCGAdTdT-3′(센스); 서열번호 4: 5′-UCGAAGUACUCAGCGUAAGdTdT-3′(안티센스))를 실시예 3과 동일한 방법으로 Dc-Apo와 혼합하여 복합체(Dc-Apo/siLuc)를 제조하였다.

실시예 5: 루시페라제 발현 DNA를 포함하는 복합체의 제조

루시페라제 발현 DNA가 삽입된 0.3 ㎎의 플라스미드 phRL-CMV(Promega)를 실시예 3과 동일한 방법으로 3 ㎎의 Dc-Apo와 혼합하여 복합체(Dc-Apo/RLuc)를 제조하였다.

비교예 1: 루시페라제 발현 DNA를 포함하는 리포좀-핵산 복합체의 제조

Dc-Apo 대신에 Dc를 사용한 것을 제외하고는 실시예 5와 동일한 방법으로 리포좀-핵산 복합체(Dc/RLuc)를 제조하였다.

비교예 2: HBV 특이적 siRNA를 포함하는 리포좀-핵산 복합체의 제조

Dc-Apo 대신에 Dc를 사용한 것을 제외하고는 실시예 3과 동일한 방법으로 리포좀-핵산 복합체(Dc/siHBV)를 제조하였다.

비교예 3: siRNA를 포함하는 복합체의 제조

HBV 특이적 siRNA 또는 루시페라제 특이적 siRNA와 서열 상동성이 없는 서열번호 5(5′-GCACCUAUAACAACGGUAGdTdT-3′) 및 서열번호 6(5′-CUACCGUUGUUAUAGGUGCdTdT-3′)으로 구성된 이중가닥 RNA를 사용한 것을 제외하고는 실시예 3과 동일한 방법으로 복합체(Dc-Apo/siCont)를 제조하였다.

실시예 6: 복합체에 의한 간 선택적인 핵산의 전달

핵산을 포함하는 복합체의 체내에서의 움직임을 관찰하기 위하여, 클로라민 T 방법(chloramine T method)을 이용하여 실시예 5에서 제조된 복합체(Dc-Apo/RLuc)의 Apo A-Ⅰ을 0.6 mCi의 ¹³¹I로 표지화(Dc-Apo*/RLuc)한 후, 복합체 200 μCi을 생쥐(Charles River)에 정맥 투여하고, 전신에서의 방사선 세기를 감마-카메라(Medical Imaging Electronics)로 측정하여 복합체(Dc-Apo*/RLuc)의 위치를 확인하였다(도 2a). 도 2a에 표시된 결과에서 볼 수 있듯이, 투여 후 40분부터 복합체가 간 조직에 축적되고 있음이 뚜렷하게 나타난다.

또한, 형광 염료인 로다민(rhodamine)을 리사민 로다민 B-디아실 포스파티딜에탄올아민(lissamine rhodamine B-diacyl phosphatidylethanolamine)(Avanti Polar Lipids)을 이용하여 실시예 5의 복합체 및 비교예 1의 복합체에 삽입하고, 로다민으로 표지화된 실시예 5의 복합체(Dc*-Apo/RLuc) 및 비교예 1의 복합체(Dc*/RLuc)를 각각 생쥐에 정맥 투여한 후, IVIS 200 이미징 시스템(imaging system)(Xenogen)을 이용하여 시간에 따른 복합체의 생체 내 분포를 확인하였다(도 2b). 도 2b의 결과에서 볼 수 있듯이, 비교예 1의 복합체에 비하여 Apo A-Ⅰ이 혼합된 실시예 5의 복합체가 더욱 뚜렷하게 간 특이적인 이동을 나타내었다. 생쥐의 팔다리에서도 형광 신호가 탐지된 것은 로다민과 적혈구 세포의 중복된 방출파장 때문이다.

또한, 본 발명의 복합체가 생체 내에서 핵산을 간세포의 세포질이나 핵으로 안정하게 전달 및 방출시키는지를 확인하기 위하여, 실시예 5의 복합체(Dc-Apo/RLuc) 또는 비교예 1의 복합체(Dc/RLuc)를 각각 200 μCi씩 생쥐(Charles River)에 정맥 투여한지 24시간 후, 심장, 폐, 신장 및 간 조직을 적출 및 파쇄하여 각 파쇄물 내에서 발현된 루시페라제에 의한 생체발광 수준을 레닐라 루시퍼라제 분석 키트(renilla luciferase assay kit)(Promega)를 사용하여 측정함으로써 발현된 루시페라제의 농도를 측정하였다(도 2c). 도 2c에서 볼 수 있는 바와 같이, 루시페라제는 실시예 5의 복합체 투여 후 생쥐의 간에서 가장 많이 검출되었다. 이와 달리, 비교예 1의 복합체를 투여한 생쥐에서는 폐와 신장에서 보다 많은 루시페라제가 검출되었다. 이러한 결과는, Apo A-Ⅰ이 간에 특이적으로 핵산을 전달할 수 있을 뿐만 아니라, 발현시키고자 하는 핵산을 효과적으로 세포 내로 방출시켜 원하는 단백질로 발현될 수 있다는 것을 나타낸다.

실시예 7: 복합체에 의한 간 선택적인 RNA의 전달 Ⅰ

pHBV-MBRI(Shin et al., Virus Res 119:146, 2006)를 제한효소인 SpeI 및XbaI로 처리한 후, pCpG-mcs(InvivoGen) 벡터의 같은 제한 효소 부위에 클로닝하여 HBV-복제 플라스미드인 pCpGHBV-MBRI를 제조하였다. 제조된 플라스미드 10 ㎍을 8~9주령 암컷 C57BL/6 생쥐(Charles River)의 꼬리 정맥 혈관에 유체역학적(hydrodynamic)으로, 즉 순간적인 강한 압력을 가함으로써 투여하여 급성 HBV 감염 생쥐를 준비하였다. 마더 클론(mother clone)인 pHBV-MBRI와 비교하여, 골격-변형 pCpGHBV-MBRI 플라스미드는 플라스미드 골격이 비특이적인 면역 반응을 유도하지 않기 때문에 생체 내에서 오래 지속되는 향상된 수준의 바이러스 항원을 발현하도록 제작되었다. 플라스미드 투여 8시간 후에, 실시예 3의 복합체(Dc- Apo/siHBV), 비교예 3의 복합체(Dc-Apo/siCont) 및 비교예 2의 복합체(Dc/siHBV)를 상기 HBV 감염 생쥐에 2 ㎎/㎏(40 ㎍ siRNA/생쥐)씩 정맥 투여하였다. 또한, 대조군으로서 HBV에 특이적인 나출(naked) siRNA 또는 5% 덱스트로즈를 정맥 투여하였다. 복합체를 투여하고 2일, 4일, 6일 및 8일이 경과한 시점에서 각각 생쥐들로부터 혈액을 채취하였다. 채취된 혈액으로부터 혈청 HBV 표면 항원(HBsAg) 및 ELISA 키트(DiaSorin)를 이용하여 ELISA를 수행함으로써 HBV의 발현 정도를 평가하였다(도 3a). 도 3a의 결과에 표시된 바와 같이, 실시예 3의 복합체(Dc-Apo/siHBV)를 1회 투여한 생쥐에서, 혈청 HBsAg의 현저하고 일관된 감소를 확인하였다. 즉, 비교예 3의 복합체(Dc-Apo/siCont)를 투여한 경우에 비하여 2, 4, 6, 8일에 각각 65.1% (P = 0.014), 63.4% (P = 0.047), 74.9% (P = 0.015) 및 72.8% (P = 0.034)의 평균 HBV 발현 저해를 나타내었으며, 비교예 2의 복합체(Dc/siHBV)를 투여한 군에서는 HBV 저해가 나타나지 않았다.

한편, siRNA를 포함하는 복합체의 처리량에 따른 siRNA 활성을 측정하기 위하여, 상기 HBV 감염 생쥐에 실시예 3의 복합체(Dc-Apo/siHBV)를 각각 0.5, 1 및 2 ㎎/㎏의 양(생쥐 한 마리당 10 ㎍, 20 ㎍ 또는 40㎍의 siRNA)으로 각각 정맥 투여하고, 투여 4일 후에 혈액을 채취하여 혈청 바이러스 항원 수준을 측정하였다(도 3b). 대조군으로 비교예 3의 복합체(Dc-Apo/siCont) 및 5% 덱스트로즈를 동량으로 정맥 투여하였다. 도 3b에서 보는 바와 같이, 실시예 3의 복합체를 투여한 경우에 투여량에 따라 덱스트로즈 투여군 또는 비교예 3의 복합체 처리군에 비하여 현저하게 HBV 발현량이 감소하였다. 이러한 결과는, 본 발명에 의한 복합체가 HBV 특이 적 siRNA의 간 특이적 전달을 효과적으로 매개하며 전달된 siRNA를 안정하게 세포 내에 방출시킴으로써, 생체 내에서 siRNA에 의한 바이러스 유전자의 발현을 강력하게 억제할 수 있다는 것을 나타낸다.

실시예 8: 복합체에 의한 간 선택적인 RNA의 전달 Ⅱ

루시페라제를 발현하는 DNA를 포함하는 플라스미드 pEGFPLuc(Clontech) 10 ㎍을 6-7주령의 암컷 Balb/c 생쥐(Charles River) 4마리에 유체 역학적으로 투여하고, 24시간 후 실시예 4의 복합체(Dc-Apo/siLuc) 및 비교예 3의 복합체(Dc-Apo/siCont)를 1 ㎎/㎏씩 생쥐에 정맥 투여하였다. 또한, 대조군으로서 5% 덱스트로즈를 정맥 투여하였다.

다시 24시간 후, 생쥐에 2% 이소플루란(isoflurane)을 처리하여 마취시키고 200 ㎖의 D-루시페린(D-luciferin) 용액을 복강 투여하였다. 10분 후, 전신에서 발산되는 광입자 신호를 IVIS 200 이미징 시스템(imaging system)(Xenogen)을 이용하여 측정함으로써 생체 내의 루시페라제 발현 정도를 평가하였다(도 4a 및 4b).

도 4a 및 도 4b에서 볼 수 있는 바와 같이, 비교예 3(Dc-Apo/siCont)의 복합체가 투입된 경우에는 덱스트로즈만을 투여한 군에 비해 루시페라제 발현에 큰 변화가 없는 반면, 실시예 4의 복합체(Dc-Apo/siLuc)를 투여한 경우에는 1일 만에 루시페라제 단백질 농도를 대조군에 비해 약 70%까지 감소시켰다. 이러한 결과는 siRNA를 포함하는 본 발명의 복합체가 간에서 siRNA를 입자로부터 안정하게 방출시킴으로써 효과적으로 RNAi 과정을 개시한다는 것을 나타낸다.

본 발명의 나노 입자는 DNA 또는 RNA를 간에 특이적으로 전달할 수 있어, 이를 포함하는 약학적 조성물은 DNA 및 RNA 분자의 간 선택적 전달에 이용할 수 있으며, 표지 지향적 유전자 치료제로서 간 관련 질환의 치료에 효과적으로 사용할 수 있다.

서열목록 전자파일 첨부

Claims

삭제
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제
아포리포프로테인 A-Ⅰ과 양이온성 또는 중성 리포좀을 포함한 간 표적 복합체를 포함하는, 핵산 또는 치료용 약물의 간 특이적 전달용 조성물.
제 11항에 있어서,

핵산이 플라스미드, DNA 또는 RNA인 것을 특징으로 하는 조성물.
제 12항에 있어서,

RNA가 B형 간염 바이러스 또는 C형 간염 바이러스에 특이적인 siRNA인 것을 특징으로 하는 조성물.
제 11항에 있어서,

치료용 약물이 항암제, 항바이러스제 또는 활성 폴리펩타이드인 것을 특징으로 하는 조성물.
제 14항에 있어서,

항암제가 카보플라틴, 시스플라틴, 옥살리플라틴, 헵타플라틴, 에토포시드, 세무스틴, 하이드록시카바미드, 시트아라빈, 플루다라빈, 독소루비신, 에피루비신, 이다루비신, 피라루비신, 플루오로우라실(5-FU), 플루옥스우리딘, 마이토마이신, 블레오마이신, 클로파지민, 인터페론, 스트렙토조신, 겜시타빈, 에노시타빈, 카페시타빈, 우르소데옥시콜린산, 소라페니브(sorafenib), 테가퍼(Tegafur), 홀뮴(holmium), 홀뮴-키토산 복합체 및 이들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 조성물.
제 14항에 있어서,

항바이러스제가 아타자나비르(Atazanavir), 리바비린(Ribavirin), 자나미비르(Zanamivir), 아시클로비르(Acyclovir), 엔테카비르(Entecavir), 다이다노신(Didanosin), 네비라파인(nevirapine), 발아시클로비르(Valaciclovir), 넬피나비르(Nelfinavir), 에파비렌즈(Efavirenz), 간시클로비르(Ganciclovir), 라미부딘(Lamivudine), 팜시클로비르(Famciclovir), 스타부딘(Stavudine), 아바카비르(Abacavir), 인디나비르(Indinavir), 오셀타미비르(Oseltamivir), 이노시플렉스(Inosiplex), 아데포비르(Adefovir) 및 이들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 조성물.
제 14항에 있어서,

활성 폴리펩타이드가 EGF(epidermal growth factor), EPO(erythropoietin), 혈액응고 인자 VIII, IX, VIIa, FSH(follicle stimulating hormone), GCSF(granulocyte colony-stimulating factor), GM-CSF(granulocyte-macrophage colony stimulating factor), 인슐린, 인슐린 유사 성장인자(insulin-like growth factor), 인터페론 α, β 및 γ, 인터루킨-1, 2, 11, 12 및 15, PTH(parathyroid hormone), PDGF(platelet-derived growth factor), hGH(human growth hormone), tPA(tissue plasminogen activator), VEGF(vascular endothelial growth factor) 및 이들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 조성물.
삭제