KR100816957B1 - 녹차와 유용미생물을 이용한 기능성 발효녹차미생물제 및 그 제조방법과 그것을 이용한 돼지의 사육방법과 그로부터 얻어진 돈육 - Google Patents

Abstract

본 발명은 녹차와 유용미생물을 이용한 발효녹차미생물제 및 그 제조방법과 그것을 이용한 돼지의 사육방법과 그로부터 얻어진 돼지고기에 관한 것으로, 녹차를 건조하여 분쇄한 분말에 곡물부산물인 탈지미강과 소맥피를 소정의 비율로 혼합시킨 혼합물에 유익유산균 2종을 접종하고 혐기적 및 호기적으로 3일간 고체발효과정을 진행시킨 후, 효모균 1종과 고초균 (Bacillus) 2종을 접종하고, 35~40℃ 조건에서 건조시켜 가축용 발효녹차미생물제를 제조하는 한편, 제조된 발효녹차미생물제를 이용하여 돼지를 사육하므로써 증체량과 사료요구율이 개선시켜 주며, 단백질 함량이 높고, 지방 함량이 낮으며 육색이 좋고, 저콜레스테롤의 연하고 부드러운 돼지고기를 얻을 수 있도록 한 것이다.

본 발명의 녹차와 유용미생물을 이용한 발효녹차미생물제의 제조방법은 다음과 같은 공정으로 이루어진 특징을 갖는다.

본 발명에 따른 녹차와 유용미생물을 이용한 발효녹차미생물제의 제조방법에서는 먼저, 건조한 녹차잎을 분쇄하고, 곡물부산물인 탈지미강과 소맥피를 각각 중량비 3 : 5 : 2의 비율로 혼합하고, 유익유산균인 락토바실러스 에시도필러스 (Lactobacillus acidophilus) KCTC 3111, 락토바실러스 플랜타륨 (Lactobacillus plantarum) KCTC 3104균을 접종하여 37℃ 조건에서 3일간 유산균을 이용한 발효과정을 진행시켜 발효녹차 고체배양물을 만든다.

이와 같이 얻어진 발효녹차 배양물에, 사카로마이세스 세레비지아 (Saccharomyces cerevisiae) KCTC 7915균, 바실러스 서브틸러스 (Bacillus subtilis) KCTC 3239균, 바실러스 코아굴란스 (Bacillus coagulans) KCTC 1015균을 접종하여 35∼40℃ 조건에서 2일간 건조과정을 거쳐 발효녹차미생물제를 얻을 수 있도록 한 것이다.

본 발명에 따른 녹차발효미생물제를 정해진 사육기간동안 돼지에게 사료총량을 기준으로 시판 배합사료에 0.1~1중량％로 첨가된 사료를 무제한 급여하여 사육함으로써 동일 사육기간동안 증체량 및 사료요구율을 현저하게 향상시켜 생산성을 높일 수 있도록 하고, 상기 발효녹차미생물제를 이용하여 사육한 돼지를 도축하였을 때, 단백질 함량이 높고, 지방 함량이 낮으며 육색이 좋고, 저콜레스테롤의 연하고 부드러운 돼지고기를 얻을 수 있도록 한 것이다.

녹차, 유용미생물, 발효녹차미생물제, 돼지, 면역

Description

녹차와 유용미생물을 이용한 기능성 발효녹차미생물제 및 그 제조방법과 그것을 이용한 돼지의 사육방법과 그로부터 얻어진 돈육 {FUNCTIONAL FERMENTED GREEN TEA MICROORGANISMS USING GREEN TEA AND USEFUL AND MANUFACTURING PROCESS OF THE SAME AND BREEDING METHOD OF PIG USING THE SAME AND PORK ACQUIRED THEREFORE}

도 1은 본 발명의 녹차와 유용미생물을 이용한 발효녹차미생물제의 제조공정도이다.

본 발명은 녹차와 유용미생물을 이용한 발효녹차미생물제와 그 제조방법과 그것을 이용한 돼지의 사육방법과 그로부터 얻어진 돈육에 관한 것으로, 보다 상세하게는 녹차를 건조하여 분말화 한 후, 곡물부산물인 탈지미강과 소맥피를 소정의 비율로 혼합시킨 혼합물에 유산균 2종을 접종하고, 혐기 및 호기발효과정을 통하여 유산균 고체발효 생산물을 만든 후, 효모균 1종, 고초균 2종을 접종하여 35~40℃ 조건에서 2일간 건조과정을 진행시켜 가축용 사료첨가제인 발효녹차미생물제를 제조하는 것이다.

또, 본 발명은 발효녹차미생물제를 이용하여 정해진 사육기간동안 돼지에게 사료총량을 기준으로 시판 배합사료에 0.1％∼1중량％로 첨가된 사료를 무제한 급여하여 사육함으로써, 동일 사육기간동안 증체량 및 사료요구율을 현저하게 향상시켜 생산성을 높일 수 있도록 하고, 단백질 함량이 높고, 지방 함량이 낮으며 육색이 좋고, 저콜레스테롤의 연하고 부드러운 돼지고기를 얻을 수 있도록 한 것이다.

최근 양돈산업은 사육규모가 대규모화됨에 따라 설사, 폐렴 등의 여러 가지 질병발생도 증가되면서 양돈 사료내 항생제의 첨가와 화학적 치료제의 사용으로 인하여 생산성이 향상되었다. 그러나 최근 전 세계적으로 항생제 사용에 대한 규제가 강화되고 있어서 그 대안으로 비항생제적 생물학적 방법에 관한 미생물제가 항생제 대체물로 사용되고 있다.

특히, 2006년 5월부터 배합사료내 항생물질의 첨가 종류가 대폭 축소되었으며, 또한 항생제는 가축의 성장촉진 목적이 아닌 치료목적으로 사용되도록 그 규제가 강화되어 항생제를 대신할 수 있는 대안이 절실히 필요한 실정이다. 더 나아가 최근 국민의식의 변화, 안전축산물의 요구, 고급축산물 또는 브랜드화 요구 및 축산환경개선, 질병의 예방 측면에서 천연기능성 물질 및 유용미생물을 이용한 미생물제 및 발효사료 등의 중요성이 다시 부각되고 있는 실정이다.

미생물제는 항생제의 대체 물질로서 동물의 장내 미생물 균총의 균형을 유지시켜 동물에게 이로운 영향을 미칠 수 있는 살아있는 미생물 사료 첨가제이며, 유익한 미생물의 장내 우점을 유도하여 동물의 건강을 증진시키고 동물의 성장을 촉진 시킬 수 있다고 알려져 있다 (Fuller, 1989). 미생물제의 사료내 첨가가 설사 방지와 더불어 자돈의 생산성을 증진 시키는 효과가 있으며 (Pollman 등, 1980; Collington 등, 1988), 자돈뿐만 아니라 육성·비육돈에서도 성장능력 개선에 효과가 있다고 보고되었다 (Baird, 1977). 또한 미생물제의 첨가는 장내 효소의 활성시켜 사료내 영양소의 이용율을 향상시킬 수 있었으며 (Collington 등, 1988; Scheuermann, 1993), 면역 능력을 향상시켜 동물의 건강을 증진시킬 수 있다고 보고되어 있다 (Kato 등, 1983; Fuller, 1989).

최근 건강 지향적인 식품에 대한 소비자들의 관심과 요구 증대에 의해 기능성 식품의 개발이 매우 활발하게 이루어 지고 있다. 최근 들어 식물성 식품을 건강식품의 소재로 활용하기 위한 연구가 많이 이루어지고 있으며 (Park 등, 2002), 또한 식물의 추출성분에 대한 식품관련 산업과 의학분야에서 실용화 시도와 연구 대상으로 많은 관심이 집중되고 있다 (Yoon 등, 1977).

녹차의 주요 생리활성물질은 polyphenol의 일종인 catechin으로 녹차 polyphenol 함량의 약 70％ 이상을 차지하며 (Khokhar and Magnusdottir, 2002), 종류로는 flavonoiddhk 이의 유도물질인 flavanol, flavanones, antocyanindins, flavones, poliyphenolic acid 등이 있다 (Graham, 1992). 녹차의 유용성분은 항산화작용 (Kim 등, 2004; Robak and Gryglewski, 1998)과 항균력 (Shi, 2002), 콜레스테롤 저하효과 (Yang and Koo, 1997; Jin 등, 2004)가 있고, 최근 인체 연구에서 암 예방 효과가 있음이 증명되었고 (Yang and Landau, 2002), 또한 LDL 및 총콜레스테롤 수준을 줄인다고 보고되었다 (Davies 등, 2003).

일반적으로, 돼지고기는 쇠고기에 비해 값이 저렴하면서도 양질의 단백질을 함유하고 있기 때문에 소비자들에게 인기가 높은 식품이다. 한편, 최근 소득수준의 향상됨에 따라 소비자들의 육류 선호도는 양보다는 질적인 부분에 관심이 높아지고 있고, 모든 축산물에 대한 수입자유화가 이루어짐에 따라 수입물결은 더욱 거세지고 세계는 점점 단일 시장화 되고 있는 실정이다. 이에 따라 축산물 생산에 있어 생산비의 절감과 함께 품질의 고급화로 값싼 수입산 육류와 차별화를 시키는 것이 시급하며, 수입산 육류와의 경쟁에서 살아남기 위해서는 값이 저렴하고 품질이 우수하며 위생적이며, 안전한 브랜드 육의 생산이 절실히 요구되고 있다.

본 발명에 활용한 녹차는 중국과 한국, 일본 등에서 기원전 2,700년경부터 기호차로서 음용되어 왔을 뿐만 아니라, 최근에는 녹차에 함유된 여러 성분들의 약리적인 메카니즘이 점차 밝혀짐에 따라 그 가치가 재인식되고 있으며, 특히 녹차에 있어서 주요성분의 하나인 폴리페놀류 (EC, EgC, ECg, EgCg)의 항종양, 항산화 생체내 활성산소에 의한 산화방지, 혈당저하, 혈액에 콜레스테롤 저하 및 식품의 부패예방 등 인체에 건강상 다양한 기능성 작용을 하는 것으로 알려져 있다. 또한, 녹차는 환경호르몬 억제 효과, 대장균 O-157 및 식중독균 억제효과, 다이어트 효과, 피부미용 효과, 알코올과 담배해독 해소작용 등 영양 및 기호식품으로 널리 알려져 있다. 녹차는 비알콜성 음료로서 영양 및 기호식품일 뿐만 아니라 인간의 질병 예방 및 치료는 물론 생리조절과 영양공급의 관점에서 볼 때 신체조절기능을 가진 식품이기도 하다. 현대 생명과학기술의 발전에 따라 녹차의 약리효과가 더욱 분명해지고 있다. 혈관강화작용은 catechin류에 대해서 다양한 생리활성이 연구되고 있으며, 이중에 catechin에 대한 활성, 즉 혈압강하작용, 항산화작용, 암 발생 억제효과, HIV 역전사효소 억제작용, cholesterol 재흡수 억제 및 충치예방 등 여러 가지 약리효과에 대한 보고가 있으며, 혈소판응집 저해활성도 보고 등 그 효과와 효능이 과학적으로 증명되고 있어 천연물질로서 이용가능성이 높다.

또, 본 발명에 활용한 유익유산균인 락토바실러스 플랜타륨 (Lactobacillus plantarum)균과 락토바실러스 에시도필러스 (Lactobacillus acidophilus)균 등은 전분소화효소, 단백질분해효소를 생성하여 사료의 소화흡수를 도와주고, 항생물질(Bacteriocin)을 생산하여 장내유해균의 소화관내 부착되어 정착되는 것을 방지하고, 유기산 생성을 통한 질병예방 등에 효과가 있으며, 사카로마이세스 세레비지아(Saccharomyces cerevisiae)균은 양질의 효모단백질과 미지성장인자 (UGF)의 공급원 및 기호성 증진, 소화이용율 촉진효과 등의 효과가 있으며, 바실러스 서브틸러스 (Bacillus subtilis.)균과 바실러스 코아굴란스 (Bacillus coagulans)균은 발효능력이 뛰어나고, 장내유해균에 대한 길항작용, 다량의 소화효소를 생산하는 능력이 우수하다.

따라서 본 발명자들은 상기와 같은 점을 착안하여 유용미생물을 활용하여 생물학적 과정을 통한 기능성 발효녹차미생물제를 제조하고, 발효녹차미생물제를 일반배합사료에 첨가하여 돼지에게 급여하는 방식으로 사육하여 동일 사육기간동안에 증체량과 사료요구율이 현저하게 향상되도록 하고, 상기 발효녹차미생물제를 이용하여 사육한 돼지를 도축하였을 때, 단백질 함량이 높고, 지방 함량이 낮으며 육색이 좋고, 저콜레스테롤의 연하고 부드러운 돼지고기를 얻을 수 있도록 한 것이다.

본 발명의 목적은 녹차와 유용미생물을 이용하여 항병성 및 향균성이 우수한 기능성 발효녹차미생물제 및 그 제조방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 녹차와 유용미생물을 이용한 발효녹차미생물제를 사료에 첨가하여 돼지에게 급여하는 방식으로 사육함으로써 동일 사육기간동안 증체량 및 사료효율을 현저하게 향상시킬 수 있도록 하고, 생산성을 높일 수 있도록 한 발효녹차미생물제를 이용한 돼지의 사육방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 녹차와 유용미생물을 이용한 발효녹차미생물제를 이용하여 사육한 돼지로부터 단백질 함량이 높고, 지방 함량이 낮으며 육색이 좋고, 저콜레스테롤의 연하고 부드러운 돼지고기를 얻을 수 있도록 하는 것이다.

상기와 같은 목적을 달성하기 위하여, 본 발명에 따른 녹차와 유용미생물을 이용한 기능성 발효녹차미생물제의 제조방법은 건조된 녹차의 잎을 분쇄하여 분말화하고, 녹차분말과 곡물부산물인 탈지미강과 소맥피를 각각 중량비 3 : 5 : 2의 비율로 혼합하는 단계와;

상기한 녹차분말, 탈지미강, 소맥피를 각각 중량비 3 : 5 : 2의 비율로 혼합한 혼합물에 유익유산균인 락토바실러스 에시도필러스 (Lactobacillus acidophilus) KCTC 3111, 락토바실러스 플랜타륨 (Lactobacillus plantarum) KCTC 3104균을 각각 1×10¹⁰/ml로 골고루 분사·접종하여 전체혼합물의 함수율이 40％로 되게 하여 37℃ 조건에서 3일간 혐기 및 호기적 유산균 발효과정을 진행시켜 고체발효생산물을 제조하는 단계와;

상기 제조된 발효녹차 고체배양물에 사카로마이세스 세레비지아 (Saccharomyces cerevisiae) KCTC 7915균, 바실러스 서브틸러스 (Bacillus subtilis) KCTC 3239균, 바실러스 코아굴란스 (Bacillus coagulans) KCTC 1015균을 각각 1×10¹²/ml로 골고루 분사·접종하여 35∼40℃ 조건에서 2일간 건조시키는 단계를 포함한다.

상기 다른 목적을 달성하기 위하여, 상기 제조방법에 의하여 제조된 발효녹차미생물제를 이용하여 정해진 사육기간동안 돼지에게 사료총량을 기준으로 시판 배합사료에 0.1~1중량％로 첨가시킨 혼합사료를 무제한 급여하여 사육함으로써 동일 사육기간동안 증체량 및 사료요구율을 현저하게 향상시켜 생산성을 높일 수 있도록 하고, 단백질 함량이 높고, 지방 함량이 낮으며 육색이 좋고, 저콜레스테롤의 연하고 부드러운 돼지고기를 얻을 수 있는 특징을 갖는다.

상기 또 다른 목적은, 녹차가 지닌 기능성 물질과 발효에 사용한 유용한 균주들이 장내 유해성 균을 억제하고, 돼지의 세포성 면역과 체액성 면역을 증가시켜주는 특징을 갖는다.

이하, 본 발명의 바람직한 실시예를 보다 상세하게 설명한다.

실시예 1

본 발명에서 발효녹차미생물제 제조를 위한 유용균의 선발을 위하여 다음 표 1과 같이 실험하였다.

[표 1] 유익균주 선발을 위한 실험설계

본 실험은 사료첨가용 미생물제의 조건중 가축의 장내에서 생존성이 높게 유지되어야 할 필요성이 있어 위산 및 담즙산에 강한 균주의 선택을 위하여 내산성, 내담즙산, 내열성에 대한 능력을 평가하였다.

상기 실시예 1의 발효녹차미생물제의 제조를 위한 유용균의 선발을 위해 한국생명공학연구소에서 분양받은 11종의 균주와 순천대학교 동물자원학과에서 보유한 15종의 균주, 총 26종의 균주를 공시균주로 선정하였다. 공시균주는 돼지와 닭 의 장에서 분리된 것, 성장하는 동안 항생물질이나 미생물의 생육 저지물질을 내는 것, 강력한 소화물질을 내는 것 등의 기준으로 선정하였다.

상기 실시예 1의 내산성 실험은 대상 균주 26종의 균주를 멸균된 50 ml 배지에 각각의 균을 접종한 뒤, 30℃ 또는 37℃에서 24시간 배양하였다.

인공위액을 이용하여 (1,000U pepsin/ml 첨가) pH 4로 조절된 MRS배지 (Difco, USA), NB배지(Nutrient Broth, Difco), YM broth배지 (Difco)를 각각 50 ml씩을 실험구로 조제하고, 대조구로써 pH 6∼7인 MRS배지 (Difco, USA), NB배지 (Nutrient Broth, Difco), YM broth배지 (Difco)를 각각 50 ml씩을 조제하였다. 상기 실시예 1을 위하여 상기 조제된 배지에 대상 균주 26종의 배양액 1 ml를 각각의 실험구(pH 4) 및 대조구(pH 6∼7) 배양배지 50 ml에 넣고, 2시간 동안 30℃ 또는 37℃에서 진탕배양 및 정치배양시킨 뒤, 이중 0.1 ml를 취해 0.85％ NaCl로 연속 희석시켜 petridish에서 배양하여 생균수를 측정하였다. 인공위액의 조제는 Kobayashi 등 (1974)의 방법을 변형한 것으로 배양액의 pH를 1N HCl로 4로 조정하고, pepsin을 1,000 U/ml되도록 첨가하였다.

또, 담즙산에 대한 저항성 검사를 위하여 멸균된 100 ml의 각 배지에 각각의 균을 접종하고, 37℃에서 48시간 (Saccharomyces 속은 30℃, 24시간)동안 배양한 후, 균주 배양액 1 ml를 실험구로서 0.22 ㎛로 여과하여 제균된 돼지 담즙산 (sigma)이 0.3％ 첨가한 NB배지 100 ml와 대조구로서 돼지 담즙산이 첨가되지 않은 NB배지 100ml에 각각 접종하고, 37℃ (Saccharomyces 속은 30℃)에서 24시간 배양하였다. 그 후, 1 ml를 취해 0.85％ NaCl로 연속 희석(10-fold serial dilution)시켜 평판배지 (NA, petridish)에 도말하여 성장한 colony의 수를 측정하였다.

또한, 내열성 검사는 내산성 및 내담즙성이 확인된 균주를 대상으로 내열성 검사를 실시하였다. 내열성 실험은 Lactobacillus, Enterococcus 속은 MRS broth에서 배양하고, Bacillus 속은 NB배지에서, Saccharomyces 속은 YM broth에서 배양시킨 배양액 100 ml를 멸균된 시험관에 10 ml 분주하고, Lactobacillus 속, Enterococcus 속 균주는 80℃ water bath에서 15분, Saccharomyces 속 균주는 70℃에서 5분 동안 반응시켰다. 그 후, 생존한 내열성 균주를 확인하기 위하여 1 ml 취해 0.85％ NaCl로 연속 희석 (10-fold serial dilution)시켜 MRS, NA, YM 평판배지 (petridish)에 도말하여 성장한 colony의 수를 측정하였다.

실험예 1

- 실시예 1의 발효녹차미생물제 제조를 위한 유익균주 선발 실험 -

상기 표 1과 같이 유산균 14종, 바실러스균 8종, 효모균 4종 등 총 26종의 균주를 이용하여 내산성, 내담즙산, 내열성 실험을 통한 유익균주의 선발실험 결과는 다음 표 2∼표 6에 나타내었다.

[표 2] 유산균의 내산성실험 결과

[표 3] 유산균의 내담즙산성 실험 결과

[표 4] 바실러스와 효모균의 내산성 실험 결과

[표 5] 바실러스와 효모균의 내담즙산성 실험 결과

상기 표 2내지 표 5에서 알 수 있는 바와 같이, 14종의 유산균에서 Lactobacillus acidophilus 균주 중 KCTC 3111, KCTC 3146, KCTC 3150균이 각각 66.9％, 61.9％, 57.29％의 생존율로 위산에 매우 강한 균주로 평가되었고, Lactobacillus casei KCTC 3109 균주의 경우, 생존율 62.5％, Lactobacillus plantarum KCTC 3104 균주의 경우, 생존율 54.2％, Enterococcus faecium KCTC 2022 균주의 경우, 생존율 55.3％를 나타내어 산에 견디는 능력이 우수한 것으로 평가되었다.

또한, Lactobacillus acidophilus KCTC 3111, KCTC 3150 균주가 각각 43.2％와 44.6％로 높은 생존율을 보였으며, Lactobacillus casei KCTC 3109 균주가 생존율 42.1％, Lactobacillus plantarum KCTC 3104 균주가 생존율 41.3％, Enterococcus faecium KCTC 2022 균주가 생존율 41.0％를 나타내어 담즙산에 견디는 능력이 높은 균주로 평가되었다. 또한, 바실러스에 대한 내산성 실험에서는 Bacillus subtilis KCTC 3239 균주가 42.4％의 생존율로 가장 높게 나타났으며, Bacillus coagulans 의 경우, KCTC 1015 균주가 42.98％로 산에 강한 균주로 평가되었다.

효모균에 대한 내산성 실험 결과는 Saccharomyces cerevisiae KCTC 7915와 KCTC 7928 균주가 각각 38.18％과 37.69％로 인공위액에 대한 생존율이 높게 나타났다.

또한, 바실러스에 대한 내담즙산성 실험에서는 Bacillus subtilis KCTC 3239 균주가 34.25％의 생존율로 가장 높게 나타났으며, Bacillus coagulans의 경우, KCTC 1015 균주가 31.25％의 생존율을 나타내었으며, 인공위액에 강한 균주가 담즙산에도 강한 균주로 평가되었다. 효모균의 경우, Saccharomyces cerevisiae KCTC 7915와 KCTC 7928 균주가 각각 34.71％과 34.52％로 생존율이 높게 나타났다.

상기 실험예 1에서 동물체내 위산과 담즙산에 강한 균주를 선발하기 위해 인공위액과 담즙산을 이용한 내산성, 내담즙산성 실험에서 유산균 6종과 바실러스균 2종 및 효모균 2종 등 총 10종의 균주를 선발하였다.

상기 선발된 10종의 균주를 이용하여 내열성에 대한 평가를 한 결과를 다음 표 6에 나타내었다.

본 실험을 위하여 Lactobacillus 속, Enterococcus 속 균주와 Bacillus 속 균주는 80℃ water bath에서 15분, Saccharomyces 속 균주는 70℃에서 5분 동안 반응시켜 생존율을 평가하였다

[표 6] 선발균주의 내열성 실험 결과

상기 표 6에서 알 수 있는 바와 같이, 내산성과 내담즙성을 통한 선발균주들의 열에 대한 생존율은 35~54％ 수준이였으며, Lactobacillus acidophilus 균의 경우, KCTC 3111의 균주가 51.41％로 열에 견디는 능력이 가장 우수하였고, Lactobacillus casei KCTC 3109 균주가 생존율 40.28％, Lactobacillus plantarum KCTC 3104 균주가 생존율 44.63％, Enterococcus faecium KCTC 2022 균주가 생존율 45.05％, Bacillus subtilis KCTC 3239 균주가 54.44％, Bacillus coagulans KCTC 1015 균주가 50.94％, Saccharomyces cerevisiae 의 경우, KCTC 7915와 KCTC 7928 균주가 각각 50％과 54.31％로 생존율을 보여 내산성과 내담즙성에 의한 선발된 선발균주들은 열에도 견디는 능력이 우수한 것으로 평가되었다.

실시예 2

본 발명에서 유용미생물을 선발하기 위하여 실시한 예1에서 내산성, 내담즙산성, 내열성 실험을 통하여 선발된 10종의 균주를 이용하여 녹차성분 (녹차추출액)에 대한 안정성을 평가하였다.

상기 실시예 2의 녹차성분에 대한 안정성 평가를 위하여 녹차재료는 전남 보성군에서 재배된 녹차를 사용하였으며, 녹차추출액은 녹차시료 100 mg을 취하여 증류수 100 ml를 가해 80℃ water bath에서 30분간 가온하여 추출하였다. 추출한 녹차액을 멸균된 MRS, NA, YM 배지에 2 ml씩 각각 첨가하여 평판배지 (한천배지, petridish)를 제조하였다. 각 녹차추출액을 함유한 평판배지에 내산성, 내담즙성, 내열성이 확인된 10종의 균주를 접종하고, 37℃, 48시간 (Saccharomyces 속은 30℃, 24시간) 배양하였다. 그 후 녹차추출액이 첨가되지 않은 각 평판배지에 positive control과 비교하여, 발육이 유지되어 녹차추출액에 저항성이 있으면 resistant (+), 발육이 미약하면 intermediate (W), 발육이 억제되어 저항성이 없으면 susceptible (-)로 판정하였다.

실험예 1

- 실시예 2의 선발균주의 녹차추출액에 대한 저항성 실험 -

다음 표 7과 같이 유산균 6종, 바실러스균 2종, 효모균 2종 등 총 10종의 선발균주를 이용하여 녹차추출액에 대한 저항성 실험결과를 나타내었다.

표 7에서 알 수 있는 바와 같이, 선발균주들의 녹차성분에 대한 내성은 Lactobacillus acidophilus KCTC 3111 균주, Lactobacillus plantarum KCTC 3104 균주와 Bacillus subtilis KCTC 3239 균주, Bacillus coagulans KCTC 1015 균주, Saccharomyces cerevisiae KCTC 7915 균주 등 5종의 선발균주는 녹차추출액에 대하여 저항성이 있는 것으로 평가되었다.

[표 7] 선발균주의 녹차추출액에 대한 저항성 실험 결과

실시예 3

본 발명에서 발효녹차미생물제 제조를 위하여 녹차첨가수준 결정하고자 다음과 같이 실험하였다.

상기 실시예 3을 위하여 멸균된 glucose 배지액 100 ml에 상기 선정된 5종의 균주를 혼합접종하고, 여기에 녹차를 각각 10％, 20％, 30％, 40％, 50％로 첨가수준을 달리하여 24시간 배양한 후, 2시간 간격으로 시료를 채취하여 각 녹차첨가 수준별 총균주의 증식성을 경시적으로 분석하였다.

실험예 1

- 실시예 3의 최적 녹차첨가수준 결정 실험 -

다음 표 8과 같이 실시 예 2의 실험 1에서 선발된 5종의 균주를 이용하여 녹차첨가 수준에 따른 총균주의 증식성 결과를 나타내었다.

[표 8] 녹차첨가 수준별 총균주의 증식성 실험 결과

상기 표 8에서 알 수 있는 바와 같이, 녹차첨가 수준별 총균수는 녹차 10％, 20％, 30％ 처리구에서 높은 증식율을 보였으며, 녹차 40％, 50％ 첨가수준에서는 증식율이 현저하게 낮아지는 경향을 볼 수 있었다. 24시간 배양이후, 경시적인 복합균주의 증식은 큰 차이를 보이지 않았다.

본 실험의 발효녹차 첨가제의 제조를 위한 최적 녹차 첨가 수준범위를 10％∼30％로 판단하고, 녹차를 최대로 첨가할 수 있는 30％ 수준을 적정첨가 수준으로 평가하였다.

실시예 4

본 발명에서 발효녹차미생물제 제조를 위하여 녹차와 부형제의 적정 혼합비를 결정하고자 다음과 같이 실험하였다.

상기 실시예 4을 위하여 곡물부산물인 탈지미강과 소맥피를 이용하여 녹차와 부형제의 적정 배합에 의한 복합균주의 증식성을 조사하였다. 본 실험의 녹차와 부형제의 최적에 배합조건을 결정하기 위하여 녹차 중량 30％와 탈지미강 중량 70％를 배합한 처리구, 녹차 중량 30％와 소맥피 중량 70％로 배합한 처리구, 녹차 중량 30％와 탈지미강 중량 50％와 소맥피 중량 20％로 배합한 처리구, 녹차 중량 30％와 탈지미강 중량 20％와 소맥피 중량 50％로 배합한 처리구, 녹차 중량 30％와 탈지미강 중량 40％와 소맥피 중량 30％로 배합한 처리구로 한 5처리로 실험설계하여 각처리구에 선정된 5종의 복합균주를 접종하고, 3일간 정치 및 교반방법으로 혐기와 호기성 발효를 시켜 총균주의 증식성 검사를 실시하였다.

실험예 1

- 실시예 4의 발효녹차미생물제의 제조를 위한 부형제의 최적배합 결정 실험 -

다음 표 9와 같이 녹차와 부형제의 적정배합비를 결정하기 위하여 배합비에 따른 균주의 증식성 결과를 나타내었다.

[표 9] 부형제의 최적배합 결정 실험 결과

상기 표 9에서 알 수 있는 바와 같이, 녹차와 부형제의 최적배합 조건을 결정하기 위한 복합균주의 증식성 조사는 녹차 30％, 탈지강 50％, 소맥피 20％로 배합한 처리구와 녹차 30％와 탈지강 40％, 소맥피 30％로 배합한 처리구에서 복합균주의 총균수가 가장 높았으며, 녹차 30％와 소맥피 70％로 배합한 처리구가 가장 낮은 결과를 보였다. 본 실험에서 소맥피의 배합비율이 높을수록 복합균주의 증식성이 낮아지는 경향을 보였다.

실시예 5

본 발명자들은 상기 실시예 1, 실시예 2, 실시예 3, 실시예 4에서 얻은 결과를 바탕으로 발효녹차미생물제를 제조하였다.

상기 각 실시예에 따라 건조된 녹차의 잎을 분쇄한 녹차분말 30 kg과 탈지미강 50 kg, 소맥피 20 kg을 균일하게 혼합하고, 락토바실러스 에시도필러스 (Lactobacillus acidophilus) KCTC 3111, 락토바실러스 플랜타륨 (Lactobacillus plantarum) KCTC 3104균을 각각 1×10¹⁰/ml로 희석하여 상기 혼합물에 골고루 분사·접종하여 전체 혼합물의 함수율이 40％로 되게 하여 37℃ 조건으로 제어된 발효기내에서 3일간 혐기 및 호기적 유산균 발효과정을 진행시켜 달콤한 향과 시큼한 향이 나는 적갈색의 배양물을 제조한다.

또, 상기 제조된 발효녹차 배양물에 사카로마이세스 세레비지아 (Saccharomyces cerevisiae) KCTC 7915균, 바실러스 서브틸러스 (Bacillus subtilis) KCTC 3239균, 바실러스 코아굴란스 (Bacillus coagulans) KCTC 1015균을 각각 1×10¹²/ml로 골고루 분사·접종하여 35~40℃ 조건에서 2일간 건조시켜 함수율 15％의 발효녹차미생물제를 제조하였다.

본 발명자들은 상기와 같은 실시예에서 발효녹차미생물제를 100 kg을 제조하였다.

실시예 6

상기 실시예 5에서 제조된 발효녹차미생물제가 세균성 병원균에 대하여 번식억제력이 있는지를 조사하기 위하여 가축의 장내에서 설사를 유발하는 우점균인 대장균 (E. coli) KCTC 2618을 사용하여 억제력을 평가하였다.

대장균 (E. coli) KCTC 2618을 Nutrient Broth (Difco) 배지에 37℃조건에서 24시간 배양한 다음, 배양액 1 ml과 상기 실시예 5에서 제조된 발효녹차미생물제 1 g을 취하여 새로운 멸균된 Nutrient Broth (Difco)배지 100 ml에 접종하고, 37℃조건에서 24시간 진탕배양하여, 2시간 간격으로 배양액내 대장균 (E. coli) KCTC 2618의 밀도를 분석하였다.

대장균 밀도분석을 위한 선택배지는 대장균(E. coli)용 petrifilm plate (3M, St. Paul USA)을 사용하였다.

실험예 1

- 실시예 6의 발효녹차미생물제의 대장균 번식억제력 실험 -

상기한 발효녹차미생물제의 대장균 (E. coli) KCTC 2618의 번식억제력 실험에 대한 결과를 다음 표 10에 나타내었다.

[표 10] 발효녹차미생물제의 대장균 번식억제력 실험 결과

상기 표 10에서 알 수 있는 바와 같이, 돼지의 설사 유발 대장균 E. coli KCTC 2618 균주와 발효녹차미생물제를 NB배지에서 혼합배양하여 배양시간에 따라 대장균의 균수를 조사한 결과, 혼합배양을 시작한 후, 4시간까지는 대장균의 수가 증가하다가 6시간이후부터 급속히 감소되어 배양 10시간 경과 후에는 대장균의 생존율이 99％이상 억제되는 것으로 나타났다. 또한 대장균만을 배양한 대조구에서는 시간이 경과 할수록 E. coli KCTC 2618 균주의 균수가 급속하게 증가되는 것으로 나타났다. 이러한 결과로 볼때, 발효녹차미생물제를 가축의 사료에 첨가할 시, 가축의 설사 등의 병해에 상당량 감소시킬 수 있을 것으로 판단된다.

실시예 7

상기 실시예 5에서 제조된 발효녹차미생물제를 이용하여 돼지사양시험을 실시하였다.

본 시험에 사용된 돼지는 평균 체중 70~75 kg인 2원교잡종 랜드레이스 (L)×요크셔 (Y) 비육돈 총 90두이며, 6두씩 15돈방으로 각각 나누어 수용하고, 대조구 (3돈방), 항생제구 (3돈방), 발효녹차미생물제 0.1％ 첨가구 (3돈방), 발효녹차미생물제 0.5％ 첨가구 (3돈방), 발효녹차미생물제 1.0％ 첨가구 (3돈방)로 한 5처리구 3반복으로 6주간 사양시험을 실시하였다.

본 시험의 시험사료는 표 11과 같이 항생제를 첨가하지 않고, NRC (1994)의 영양소 요구량에 맞추어 대조구 사료를 배합하였다. 항생제 첨가구는 대조구 사료에 chlotetracline 0.003％를 첨가하였으며, 발효녹차미생물제는 대조구 사료에 각각 0.1％, 0.5％ 및 1.0％씩 첨가하여 배합하였다. 전 시험기간 동안 사료는 무제한 급이와 물은 자유 섭취도록 하였다.

[표 11] 시험사료의 성분

본 시험의 시험기간은 2005년 10월 29일부터 12월 10일까지 6주간에 걸쳐 전남 보성군 조성면 신월리 소재의 조성양돈영농조합법인내 비육농장에서 사양시험을 실시하였다.

실험예 1

- 실시예 7의 각각의 처리구에 속한 돼지의 증체량, 사료섭취량 및 사료요구율에 대한 측정 -

상기 시험에 있어, 체중 측정은 개시부터 시험 종료시까지 2주마다 각 처리구별로 총 체중을 측정하였다. 사료섭취량은 개시부터 시험 종료시까지 2주마다 처리구별로 체중 측정 전에 사료의 잔량을 측정하여 사료섭취량을 구하였고, 사료요구율은 사료섭취량을 증체량으로 나누어서 구하였다.

상기한 비육돈 시험의 증체량, 사료섭취량 및 사료요구율에 대한 결과를 다음 표 12에 나타내었다.

[표 12] 시험구별 증체량, 사료섭취량, 사료요구율 결과

상기 표 12에서 알 수 있는 바와 같이, 0~2주령의 각 처리구별 증체량은 발효녹차미생물제 0.1％ 첨가구가 14.83 kg으로 가장 높았으며, 대조구가 12.28 kg으로 가장 낮았으며, 2~4주령에서는 발효녹차미생물제 0.5％ 첨가구가 16.44 kg으로 가장 높았으며, 대조구가 13.28 kg으로 가장 낮아 통계적인 유의차를 보였다 (P＜0.05). 0~6주령의 전사양시험 동안의 증체량은 항생제구, 발효녹차미생물제 0.1％ 첨가구가 가장 높았으며, 대조구가 가장 낮았으나 통계적인 유의차는 보이지 않았다.

사료섭취량에서는 4~6주령에서는 항생제 첨가구가 56.67 kg으로 가장 높았으며, 발효녹차미생물제 0.5％ 첨가구가 48.89 kg으로 가장 낮아 통계적인 유의차를 보였다 (P＜0.05). 전사양시험기간인 0~6주령간의 사료섭취량은 항생제 첨가구가 152.06 kg으로 가장 높았으며, 대조구가 139.44 kg으로 가장 낮았으나 통계적인 유의차를 보이지 않았다.

사료요구율을 보면, 0~2주령에서는 대조구가 3.35로 가장 높았으며, 발효녹차미생물제 0.1％ 첨가구가 2.88으로 가장 낮았으나 통계적인 유의차를 보이지 않았다. 2~4주령에서는 대조구가 3.56으로 가장 높았으며, 발효녹차미생물제 0.5％ 첨가구가 3.16으로 가장 낮았으나 통계적인 유의차는 보이지 않았다. 4~6주령에서는 발효녹차미생물제 0.1％가 4.59으로 가장 높았으며, 대조구가 3.76으로 가장 낮았다. 0~6주령간의 사료요구율은 항생제 첨가구가 3.60 으로 가장 높았으며, 발효녹차미생물제 0.5％ 첨가구가 3.42으로 가장 낮았다.

따라서 본 발명자들은 생산성을 고려하여 볼 때, 발효녹차미생물제는 시판 양돈용 배합사료에 사료총량 기준 0.5~1.0중량％ 첨가시에 돼지의 증체량과 사료요구율을 현저하게 개선시킬 것으로 평가되었다.

실험예 2

- 실시예 7의 각각의 처리구에 속한 돈육의 수분, 조단백질, 조지방, 조회분 분석 -

상기 분석에 있어, 사양시험 종료 직후 각 처리구에서 평균체중에 가까운 돼지들로 반복당 3두씩 15두를 선발하였다. 선발된 돼지로부터 등심 부위를 적출하여 만육기로 분쇄한 것을 분석시료로 하여 수분, 조단백질, 조지방 및 조회분 등 AOAC (1995) 방법에 따라 분석하였다.

상기한 각 처리구별 돈육의 수분, 조단백질, 조지방, 조회분의 분석 결과를 다음 표 13에 나타내었다.

표 13에서 알 수 있는 바와 같이, 조단백질은 발효녹차미생물제 1.0％ 첨가구가 22.58％으로 가장 높았으며 처리구간의 통계적인 유의차를 보였다 (P＜0.05). 조회분은 대조구가 1.87％으로 가장 높았으며, 발효녹차미생물제 1.0％ 첨가구가 1.27％으로 가장 낮아 처리구간의 통계적인 유의차를 보였다 (P＜0.05). 조지방은 항생제 첨가구가 2.87％으로 가장 높았으며, 발효녹차미생물제 1.0％ 첨가구가 1.75％으로 가장 낮았으나 통계적인 유의차를 보이지 않았다.

[표 13] 시험구별 돈육의 수분, 조단백질, 조지방, 조회분 분석 결과 (％)

실험예 3

- 실시예 7의 각각의 처리구에 속한 돈육의 산패도 (TBA) 분석 -

상기 분석에 있어, 산패도는 2M phosphoric acid와 20％ trichloroacetic acid을 solution으로 하여 50 ml에 분석시료 20 g을 섞고, 추출한 혼합물에 대한 슬러리는 40 ml 증류수 (DW)로 희석하고 흔들어서 균질화하여 그 중, 50 ml는 Whatman NO 1. 여과지로 여과한 다음, 여과액 5 ml는 시험튜브로 옮기고 2-thiobarbituric acid (DW안에 0.005 M) 5 ml를 첨가한다. 그 다음 튜브를 장치하고, 그 혼합물은 전도에 의해 혼합되고, 암실에서 15시간동안 실내온도를 유지한 후, 결과색을 spectronic -20D⁺ 이용하여 530 nm에서 흡강도를 측정하여 분석하였다 (Vernon 등, 1970).

상기한 각 처리구별 돈육의 산패도 (TBA) 분석 결과를 다음 표 14에 나타내었다.

[표 14] 시험구별 돈육의 산패도 (TBA) 분석 결과 (μmol/100g)

상기 표 14에서 알 수 있는 바와 같이, 신선한 돈육의 산패도는 발효녹차미생물제 0.1％ 첨가구가 1.42 μmol/100g으로 가장 높았으며, 대조구가 1.02 μmol/100g으로 가장 낮았으나 통계적인 유의차를 보이지 않았다. 3주시의 처리구별 산패도는 대조구가 4.46 μmol/100g으로 가장 높았으며, 발효녹차 0.5％ 첨가구가 3.94 μmol/100g으로 가장 낮아 처리구간의 통계적인 유의차를 보였다 (P＜0.05).

실험예 4

- 실시예 7의 각각의 처리구에 속한 돈육의 육색 분석 -

상기 분석에 있어, 등심 표면에 Croma meter (Minolta Co. Cr 301, Japan)를 사용하여 명도를 나타내는 L값, 적색도를 나타내는 a값과 황색도를 나타내는 b값을 측정하였다. 이때의 표준색은 L-값이 97.10, a-값이 -0.17 및 b-값이 1.99인 백색 표준판을 사용하였다.

상기한 각 처리구별 돈육의 육색 분석 결과를 다음 표 15에 나타내었다.

[표 15] 시험구별 돈육의 육색 분석 결과

상기 표 15에서 알 수 있는 바와 같이, 명도 (L)은 발효녹차미생물제 0.5％ 첨가구가 55.56으로 가장 높았으며, 항생제 첨가구가 49.03으로 가장 낮았으며, 적색도 (a)은 발효녹차미생물제 0.5％ 첨가구가 10.18으로 가장 높았으며, 항생제 첨가구가 8.72으로 가장 낮았다. 황색도 (b)은 발효녹차미생물제 0.5％ 첨가구가 5.71으로 가장 높았으며, 항생제 첨가구가 4.00으로 가장 낮았다.

실험예 5

- 실시예 7의 각각의 처리구에 속한 돈육의 콜레스테롤 (cholesterol) 함량 분석 -

상기한 각 처리구별 돈육의 콜레스테롤 함량 분석 결과를 다음 표 16에 나타내었다.

표 16에서 알 수 있는 바와 같이, 대조구와 항생제 첨가구에 비해 상대적으로 발효녹차미생물제 0.5％ 첨가구가 78.02 ㎍/g으로 가장 낮게 분석되었다.

[표 16] 시험구별 돈육의 콜레스테롤 함량 분석 결과 ( ㎍/g)

실험예 6

- 실시예 7의 각각의 처리구에 속한 돈육의 관능검사 -

상기 검사에 있어, 곽 등 (1992)이 실시했던 방법으로 순천대학에서 학생들을 대상으로 각 처리구별로 등심부위를 일정한 간격으로 나누어 학교 앞에서 바로 고기를 익혀 시식하는 방법을 택했으며 1에서 5점까지의 점수 (1: 매우나쁘다, 2: 나쁘다, 3: 보통이다, 4: 좋다, 5: 매우 좋다)인 5점 측도법으로 다즙성, 연도 및 향미를 검사하였다.

상기한 각 처리구별 돈육의 육색 분석 결과를 다음 표 17에 나타내었다.

[표 17] 시험구별 돈육의 관능검사 결과

상기 표 17에서 알 수 있는 바와 같이, 다즙성은 발효녹차미생물제 1.0％ 첨 가구가 4.47으로 가장 높았으며, 대조구가 3.50으로 가장 낮아 처리구간의 통계적인 유의차를 보였다 (P＜0.05). 연도는 항생제 첨가구가 5.00으로 가장 높았으며, 대조구가 3.73으로 가장 낮았으며, 향미는 발효녹차미생물제 1.0％ 첨가구가 4.50으로 가장 높았으며, 대조구가 3.77으로 가장 낮아 처리구간의 통계적인 유의차를 보였다 (P＜0.05).

따라서 발효녹차미생물제를 이용하여 돼지를 사육하는 경우, 단백질이 높고, 지방이 낮으며 육색이 우수한 저콜레스테롤의 연하고 부드러운, 맛이 좋은 고급육의 생산이 가능할 것으로 평가되었다.

실험예 7

- 실시예 7의 각각의 처리구에 속한 돼지의 비장무게 측정 -

상기 실험에 있어, 사양시험 종료 후, 각처리구별 돼지 6두씩을 도축하고, 도축한 도체에서 비장을 적출하여 비장의 무게를 전자저울을 이용하여 측정하였다. 측정한 측정값의 평균값과 통계오차 (standard error)를 계산하였다.

상기 실험에 있어, 비장은 림프구가 모인 말초 림프기관으로 혈액을 통해 침입한 병원체를 인식하고 포획하여 림프구에 전달하는 역할을 한다. 비장에 있는 림프구는 비장을 떠나 림프액과 혈액을 순환한다. 즉 비장을 떠나 순환하는 림프구의 수가 많으면 비장의 무게가 감소하는 이유의 하나가 된다. 그리고 림프액과 혈액을 순환하는 림프구가 증가하면 그만큼 외부에서 침입한 병원체를 보다 빨리 쉽게 인식하여 적절한 면역반응을 유도할 수 있다.

상기한 각 처리구별 돼지의 비장무게 측정 결과를 다음 표 18에 나타내었다.

[표 18] 시험구별 돼지의 비장무게 측정 결과

상기 표 18에서 알 수 있는 바와 같이, 비장무게는 대조구와 항생제 첨가구에 비해 발효녹차미생물제 0.1％, 발효녹차미생물제 0.5％, 발효녹차미생물제 1.0％ 첨가구가 무게가 감소한 것으로 나타났다. 따라서 발효녹차미생물제의 첨가로 순환 림프구의 수가 증가한 것으로 평가되었다.

이에 따라 발효녹차미생물제를 첨가하여 사육하는 경우, 외부에서 침입한 병원체에 대하여 적절한 면역반응을 유도할 수 있는 것으로 평가되었다.

실험예 8

- 실시예 7의 각각의 처리구에 속한 돼지의 비장세포 증식 유도실험 -

상기 실험에 있어, 실험예 7에서 적출한 비장을 핀셋을 이용해 단일세포로 만든 다음에 NycoPrep™ 1.077A을 이용하여 죽은 세포와 적혈구를 제거하고 Trypan blue 시약을 이용해 혈구계산반으로 생세포수를 측정하였다. 비장세포 (5×10⁵개)를 96 well microplate에 분주하고 여기에 LPS (1, 3 및10 ㎍/㎖), Con A (0.1, 0.3 및 1.0 ㎍/㎖)를 농도별로 첨가하여final volume 200 ㎕가 되도록 한 다음에 3일간 5％ CO₂ 배양기에서 배양한 후 세포 증식 정도를 측정하였다. 세포 증식은 Cell Titer 96^® Aqueous One Solution Cell Proliferation Assay를 사용하였으며, 배양액 100 ㎕를 버리고 남은 배양액 100 ㎕에 cell titer 15 ㎕씩 첨가하여 4~8시간 동안 배양한 다음 Microplate reader (OPTImax, Molecular Devices, USA)를 이용하여 490 nm에서 흡광도를 측정하였다.

상기 실험에 있어, 생체로 침입한 병원체는 혈액을 통해 들어온 것은 혈관을 따라 순환하다가, 비장에서 대식세포와 같은 항원제시세포에게 포획된다. 비장은 말초 림프기관으로 주로 T세포, B세포 및 대식세포 등으로 구성되어 있으며, 항원제시세포는 항원의 침입을 T세포와 B세포에게 알려 세포성 면역반응과 체액성 면역반응을 유도한다 (Ezekowitz 등, 1998). 따라서 발효녹차미생물제가 세포성 면역반응과 체액성 면역반응에 관여하는 비장세포에 어떤 영향을 미치는지를 검색하는 것이 필요하다.

병원체를 인식한 각 면역반응의 처음 시작은 세포증식반응으로 시작하기 때문에 발효녹차미생물제의 효과를 비장세포의 증식유도 반응으로 측정하였다.

상기한 각 처리구별 돼지의 비장세포 증식 유도실험 결과를 다음 표 19와 표 20에 나타내었다.

[표 19] 시험구별 돼지의 비장세포 중 T세포 증식 실험 결과 (O.D. at 490 nm)

T세포는 면역반응 중에서 세포성 면역반응을 담당하는 중요한 세포이기 때문에 발효녹차미생물제 첨가가 세포성 면역증강 효과에 미치는 영향을 알 수 있다.

상기 표 19에서 알 수 있는 바와 같이, 비장세포 중에서 T세포만을 특이적으로 증식시키는 Con A(Concanavalin A)로 자극하여 비장세포의 증식반응을 측정한 결과, Con A로 자극하지 않은 경우에 대조구, 항생제 첨가구, 발효녹차미생물제 0.1％ 첨가구, 발효녹차미생물제 0.5％ 첨가구에서는 유의한 증가는 보이지 않았지만, 발효녹차미생물제 1.0％ 첨가구는 0.69±0.14 O.D. at 490 nm으로 통계학적으로 유의하게 비장세포의 증식반응이 감소하였다 (P＜0.05).

0.1 ㎍/㎖ Con A로 자극하였을 경우, 발효녹차미생물제 1.0％ 첨가구는 1.02±0.21 O.D. at 490 nm으로 통계학적으로 유의하게 비장세포의 증식반응이 증가하였다 (P＜0.05).

0.3 ㎍/㎖ Con A로 자극하였을 경우, 대조구는 0.88±0.08 O.D. at 490 nm에 비해 발효녹차미생물제 1.0％ 첨가구에서는 0.97±0.19 O.D. at 490 nm로 통계학적으로 유의한 증가가 나타났다 (P＜0.05).

1.0 ㎍/㎖ Con A로 자극하였을 경우, 대조구는 0.92±0.07 O.D. at 490 nm에 비해 발효녹차미생물제 0.1％ 첨가구 1.00±0.05 O.D. at 490 nm, 발효녹차미생물제 0.5％ 첨가구 1.11±0.11 O.D. at 490 nm 및 발효녹차미생물제 1.0％ 첨가구 1.03±0.12 O.D. at 490 nm로 비장세포 증식반응이 유의하게 증가하였다 (P＜0.05).

따라서 발효녹차미생물제의 첨가는 비장세포의 Con A 자극에 대한 증식반응이 유의하게 증가되는 것으로 볼 때, 돼지의 세포성 면역 증가에 효과가 있는 것으로 평가되었다.

또, B세포는 면역반응 중에서 항체를 생산하는 체액성 면역반응을 담당하는 중요한 세포이기 때문에 발효녹차미생물제 첨가가 체액성 면역증강 효과에 미치는 영향을 알 수 있다.

[표 20] 시험구별 돼지의 비장세포 중 B세포 증식 실험 결과 (O.D. at 490 nm)

상기 표 20에서 알 수 있는 바와 같이, B세포만을 특이적으로 증식시키는 LPS(Lipopolysaccharide)로 자극하여 발효녹차미생물제의 비장세포 증식반응에 대한 효과를 측정한 결과, LPS로 자극하지 않은 경우에 대조구, 항생제 첨가구, 발효녹차미생물제 0.1％ 첨가구, 발효녹차미생물제 0.5％ 첨가구는 유의한 증가는 보이지 않았지만, 발효녹차미생물제 1.0％ 첨가구는 0.69±0.14 O.D. at 490 nm으로 통계학적으로 유의하게 비장세포의 증식반응이 감소하였다 (P＜0.05).

1.0 ㎍/㎖ LPS로 자극하였을 경우, 대조구는 0.88±0.13 O.D. at 490 nm에 비해 발효녹차미생물제 0.5％ 첨가구는 1.02±0.12 O.D. at 490 nm로 통계학적으로 유의하게 비장세포의 증식반응이 증가하였다 (P＜0.05).

3.0㎍/㎖와 10.0 ㎍/㎖ LPS로 자극하였을 경우, 대조구와 항생제구에 비해 발효녹차미생물제 0.1％, 0.5％, 1.0％ 첨가구에서 통계학적으로 유의하게 비장세포의 증식반응이 증가하였다 (P＜0.05).

따라서 발효녹차미생물제의 첨가는 비장세포의 LPS 자극에 대한 증식반응이 대조구에 비해 통계학적으로 유의하게 증가되는 것으로 볼 때, 돼지의 체액성 면역 증가에 효과가 있는 것으로 평가되었다.

실험예 9

- 실시예 7의 각각의 처리구에 속한 돼지의 비장세포의 사이토카인 (IL-6, TNF-α) 분비량 측정 실험 -

상기 실험에 있어, 돼지 비장세포를 LPS (10 ㎍/㎖)와 con A (1.0 ㎍/㎖)를 첨가하여 24시간 배양 한 후, 배양 상층액을 수거하여 상층액에 포함된 IL-6, TNF- α의 양을 효소 항체법 (enzyme-linked immunsorbent assay : ELISA)을 이용하여 측정하였다.

즉, 일차항체 (capture Ab)를 PBS에 희석하여 plate에 100 ㎕씩 넣고 4℃에서 하룻밤 둔 다음 washing용액 (0.05％ Tween 20/PBS)으로 세척한 다음, block solution (1％ BSA, 5％ sucrose, 0.05％ NaN₃)으로 2시간 동안 blocking하였다. 그리고 배양 상층액을 넣은 다음, 3시간 후에 washing용액으로 세척하고 이차 항체 (dection Ab)를 첨가하였다. 다시 2시간 후에 washing용액으로 세척한 다음, Streptavidin-HRP를 첨가하였다.

한 시간 후에 다시 washing용액으로 세척한 다음, 기질 (2, 2 '-azino-bis, 0.1M citric acid, H₂O₂)를 넣어 발색시켜서 Microplate reader를 이용하여 405 nm에서 흡광도를 측정하고 표준곡선을 이용하여 환산하였다. 이때 각 사이토카인의 측정 한계치는 7.8 pg/㎖이었다.

상기 실험예 8에서 Con A 또는 LPS 자극에 대해 비장세포의 증식반응이 일어나면, 비장세포는 여러 가지 종류의 사이토카인을 분비한다.

따라서, 비장세포의 증식반응이 일어날 때 분비되는 사이토카인을 분석하면 면역반응을 구분할 수 있다.

비장세포가 분비하는 싸이토카인 중에서 IL-6는 간세포가 피브리노젠과 같은 몇 가지 혈장 단백질을 합성하도록 유도하며 B세포를 활성화시켜 항체 활성을 증가시키는 B세포 성장인자로 작용한다 (Devries, 1999).

또한, 비장세포의 증식반응이 일어날 때, 비장세포가 분비하는 또 다른 사이토카인인 TNF-α는 내피세포에 대해 새로운 수용체를 발현하도록 하여 백혈구가 부착성을 가지게 하고, 호중구를 활성화시켜 준다 (Schall 등, 1994).

내재성 발열원으로 뇌의 시상하부에 작용하여 열이 생기도록 하고, 간세포에 작용하여 혈청단백질의 합성을 자극하며, 골수 간세포의 분열을 억제하기도 한다 (Arai 1990; Beuther 1995).

따라서 발효녹차미생물제 첨가에 따른 돼지의 비장세포가 증식할 때 분비하는 IL-6와 TNF-α의 분비량에 미치는 효과를 알아보기 위해 비장세포가 분비하는 IL-6, TNF-α의 분비량을 측정한 실험을 하였다.

상기한 각 처리구별 돼지의 비장세포의 사이토카인 (IL-6, TNF-α) 분비량 측정 결과를 다음 표 21과 표 22에 나타내었다.

[표 21] 시험구별 돼지의 비장세포의 IL-6 분비량 측정 결과 (pg/㎖)

상기 표 21에서 알 수 있는 바와 같이, 발효녹차미생물제 첨가에 따른 비장세포가 증식할 때 분비하는 IL-6의 분비량에 미치는 효과를 알아보기 위해 비장세포가 분비하는 IL-6의 분비량을 측정한 결과, Con A 또는 LPS로 자극하지 않은 경우, 대조구와 항생제 첨가구는 유의한 증가는 보이지 않았지만, 발효녹차미생물제 0.1％ 첨가구 22.88±19.45pg/㎖, 발효녹차미생물제 0.5％ 첨가구 18.50±18.13pg/㎖ 및 발효녹차미생물제 1.0％ 첨가구 16.00±11.65pg/㎖로 통계학적으로 유의하게 IL-6의 생산량이 증가하였다 (P＜0.05).

또, 비장세포의 증식반응을 가장 높게 유도하는 Con A 1.0 ㎍/㎖로 자극하였을 때, 대조구는 36.63±21.29 pg/㎖에 비해 발효녹차미생물제 0.5％ 첨가구 125.38±85.71 pg/㎖로 IL-6의 분비량이 통계학적으로 유의하게 증가하는 것으로 나타났다 (P＜0.05).

또, 비장세포의 증식반응을 가장 높게 유도하는 LPS 10.0 ㎍/㎖로 자극하였을 경우, 대조구와 항생제 첨가구에 비해 발효녹차미생물제 0.1％ 첨가구 88.50±37.42 pg/㎖ 및 발효녹차미생물제 1.0％ 첨가구 81.00±59.46 pg/㎖로 통계학적으로 유의하게 IL-6의 분비량이 증가하는 것으로 나타났다 (P＜0.05).

따라서 발효녹차미생물제의 첨가에 따른 Con A와 LPS 자극에 대한 비장세포의 증식반응이 일어날 때 분비되는 IL-6의 분비량도 증가되는 평가되었다.

[표 22] 시험구별 돼지의 비장세포의 THF-α 분비량 측정 결과 (pg/㎖)

상기 표 22에서 알 수 있는 바와 같이, 발효녹차미생물제 첨가에 따른 비장세포가 증식할 때 분비하는 TNF-α의 분비량에 미치는 효과를 알아보기 위해 비장세포가 분비하는 TNF-α의 분비량을 측정한 결과, Con A 또는 LPS로 자극하지 않은 경우, 항생제 첨가구 97.50±79.24 pg/㎖, 발효녹차미생물제 1.0％ 첨가구 91.25±42.07 pg/㎖으로 가장 높게 분비되는 것으로 나타났다.

또, 비장세포의 증식반응을 가장 높게 유도하는 Con A 1.0 ㎍/㎖로 자극하였을 때, 대조구와 항생제 첨가구에 비해 모든 발효녹차미생물제 첨가구에서 통계학적으로 유의하게 TNF-α의 분비량이 증가하는 것으로 나타났다 (P＜0.05).

또, 비장세포의 증식반응을 가장 높게 유도하는 LPS 10.0 ㎍/㎖로 자극하였을 경우, 대조구에 비해 모든 발효녹차미생물제 첨가구에서 통계학적으로 유의하게 TNF-α의 분비량이 증가하는 것으로 나타났다 (P＜0.05).

따라서 발효녹차의 공급이 Con A와 LPS 자극에 대한 비장세포의 증식반응이 일어날 때 분비되는 TNF-α의 분비량도 증가되는 평가되었다.

따라서 발효녹차미생물제를 이용하여 돼지를 사육할 경우, 돼지 비장세포의 사이토카인 (IL-6, TNF-α) 분비량이 증가되어 혈장 단백질 합성, 항체활성 증가, 백혈구와 호중구의 활성화 등에 의한 돼지의 면역성이 향상되는 것으로 평가되었다.

이와 같이 본 발명을 적용하면, 발효녹차미생물제를 이용하여 돼지를 사육하는 경우, 돼지의 증체량과 사료요구율을 현저하게 개선시켜 돼지의 생산성을 높혀주는 효과가 있고, 단백질 함량이 높고, 지방 함량이 낮으며 육색이 좋고, 저콜레스테롤과 고기의 연도를 좋아지게 하는 효과가 있다.

또한, 녹차가 지닌 기능성 물질과 발효에 사용한 유용한 균주들이 장내 유해성 균을 억제하고, 돼지의 세포성 면역과 체액성 면역을 증가시켜주는 효과가 있다.

또한, 돼지 비장세포의 사이토카인 (IL-6, TNF-α) 분비량이 증가되어 혈장 단백질 합성, 항체활성 증가, 백혈구와 호중구의 활성화 등에 의한 돼지의 면역성을 향상시켜주는 효과가 있다.

Claims (4)

1. 건조된 녹차의 잎을 분쇄하여 분말화하고, 녹차분말과 곡물부산물인 탈지미강과 소맥피를 각각 중량비 3 : 5 : 2의 비율로 혼합하는 단계와;

   상기 녹차분말, 탈지미강, 소맥피를 각각 중량비 3 : 5 : 2의 비율로 혼합한 혼합물에 유익유산균인 락토바실러스 에시도필러스 (Lactobacillus acidophilus) KCTC 3111, 락토바실러스 플랜타륨 (Lactobacillus plantarum) KCTC 3104균을 각각 1×10¹⁰/ml로 골고루 분사·접종하여 전체 혼합물의 함수율이 40％로 되게 하여 37℃ 조건에서 3일간 혐기 및 호기적 유산균 발효과정을 진행시켜 고체발효생산물을 제조하는 단계와;

   상기 제조된 발효녹차 고체배양물에 사카로마이세스 세레비지아 (Saccharomyces cerevisiae) KCTC 7915균, 바실러스 서브틸러스 (Bacillus subtilis) KCTC 3239균, 바실러스 코아굴란스 (Bacillus coagulans) KCTC 1015균을 각각 1×10¹²/ml로 골고루 분사·접종하여 35~40℃ 조건에서 2일간 건조시키는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 기능성 발효녹차미생물제의 제조방법.
2. 제 1항의 제조방법에 의해 얻어지는 기능성 발효녹차미생물제.
3. 제 1항에 의해 제조된 기능성 발효녹차미생물제를 정해진 사육기간동안 돼지 에게 사료총량을 기준으로 시판 배합사료에 0.1~1중량％로 첨가된 사료를 무제한 급여하여 사육함으로써 동일 사육기간동안 증체량 및 사료요구율을 현저하게 향상시켜 주며, 돼지의 세포성 면역과 체액성 면역을 향상시켜 생산성을 높일 수 있도록 한 것을 특징으로 하는 기능성 발효녹차미생물제를 이용한 돼지의 사육방법.
4. 제 1항에 의해 제조된 기능성 발효녹차미생물제를 정해진 사육기간동안 돼지에게 사료총량을 기준으로 시판 배합사료에 0.1~1중량％로 첨가된 사료를 무제한 급여하는 방식으로 사육하여 단백질 함량이 19.7~22.5 ％/g, 지방 함량이 1.7~2.7 ％/g, 콜레스테롤 함량이 78~81.8 ㎍/g인 것을 특징으로 하는 기능성 발효녹차미생물제로 사육하여 얻어지는 돈육.

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