KR100803385B1

KR100803385B1 - 고추냉이 추출물을 포함하는 신경질환 예방용 조성물과 식품

Info

Publication number: KR100803385B1
Application number: KR1020050076893A
Authority: KR
Inventors: 박헌주; 배인경; 이상국; 손흥수
Original assignee: 롯데쇼핑주식회사
Priority date: 2005-08-22
Filing date: 2005-08-22
Publication date: 2008-02-13
Anticipated expiration: 2025-08-22
Also published as: KR20070022906A

Abstract

본 발명은 고추냉이 추출물을 포함하는 신경질환 예방용 조성물과 건강식품에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 고추냉이 추출물이 세포수준에서 야기된 산화적 손상으로부터 세포보호효과를 확인함으로서 여러 가지 만성질환을 예방 및 치료용 조성물에 적용할 수 있고, 이러한 효과를 가진 고추냉이 추출물을 츄잉껌, 캔디, 비스켓, 아이스크림, 음료 및 초콜렛 등의 음식물에 함께 배합함으로써, 청소년, 성인 및 노인층의 광범위한 계층까지 언제 어디서나 늘 간편하게 섭취할 수 있어서 지속적인 음용효과를 기대할 수 있는 고추냉이 추출물을 포함하는 신경질환 예방용 조성물과 건강식품에 관한 것이다.

고추냉이 추출물, 산화적 손상, 세포보호효과

Description

고추냉이 추출물을 포함하는 신경질환 예방용 조성물과 식품{Composition and food for prevention of disease to nerve system with extracts of Wasabia japonica}

도 1은 위상차 현미경에서 200 μM H₂O₂로 생쥐의 간세포에 산화적 손상을 일으키고 고추냉이 추출물 100 ∼ 200 ㎍/ml 농도에서 간세포 보호효능을 나타낸 것이고,

도 2는 200 μM H₂O₂로 생쥐의 간세포에 산화적 손상으로 인한 세포사멸을 유도하고 고추냉이 추출물 100 ∼ 200 ㎍/ml 농도에서 세포독성 보호효능을 나타낸 것이고,

도 3은 피오크로모사이토마[Pheochromocytoma-12(PC12)] 세포는 래트(rat)의 부신(adrenal gland)으로부터 분리된 갈색세포종으로 200 μM H₂O₂로 산화적 손상을 일으키고, 고추냉이 추출물 200 ∼ 300 ㎍/ml 농도에서 위상차 현미경으로 PC12 세포 보호효능을 나타낸 것이고,

도 4는 위상차 현미경에서 200 μM 하이포크산틴과 0.5 mU 크산틴 옥시다아제로 생쥐의 간세포에 산화적 손상을 일으키고 고추냉이 추출물 25 ∼ 200 ㎍/ml 농도에서 간세포 보호효능을 나타낸 것이고, 여기서 H-X라 함은 200 μM 하이포크산틴과 0.5 mU 크산틴 옥시다아제로 세포에 산화적 스트레스를 일으킨 경우이고,

도 5는 200 μM 하이포크산틴과 0.5 mU 크산틴 옥시다아제로 생쥐의 간세포에 산화적 손상으로 인한 세포사멸을 유도하고 고추냉이 추출물 25 ∼ 200 ㎍/ml 농도에서 세포독성 보호효능을 나타낸 것이다.

본 발명은 고추냉이 추출물을 포함하는 신경질환 예방용 조성물 및 식품에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 고추냉이 추출물이 생쥐의 래트(rat)의 PC12 세포에서 야기된 산화적 손상으로부터 세포보호효과를 확인함으로서 신경질환을 예방 및 치료용 조성물에 적용할 수 있고, 이러한 효과를 가진 고추냉이 추출물을 츄잉껌, 캔디, 비스켓, 아이스크림, 음료 및 초콜렛 등의 음식물에 함께 배합함으로써, 청소년, 성인 및 노인층의 광범위한 계층까지 언제 어디서나 늘 간편하게 섭취할 수 있어서 지속적인 음용효과를 기대할 수 있는 고추냉이 추출물을 포함하는 신경질환 예방용 조성물 및 식품에 관한 것이다.

질병의 90%는 활성산소에 의하여 발생하며 90년대 이후 의학계 최대의 과제는 활성산소의 공격에 어떻게 대응하느냐에 관한 것으로 활성산소는 질병이나 노화 를 촉진하는 인류 최대의 적이라 할 수 있다. 정상적인 산소는 체내에서 약 100초 이상 머무는데 비해 유해산소(활성산소)는 1백만 ∼ 1억분의 1초만 머물러도 세포막을 형성하는 주성분인 지질을 과산화지질로 만들어, 세포와 적혈구 파괴의 악영향을 미치며 세포는 하루 평균 1만회 이상의 유해산소 공격을 받고 있다. 또한, 생리적인 조건하에서 3 ∼ 10 %의 분자상 산소는 활성산소로 변하게 되며 대부분의 활성산소는 다양한 분자와 재빨리 반응하여 세포내 기능에 영향을 미치게 된다

여기서 활성산소라 함은 유리 래디컬(free radical)인 유해산소로 활동 주기가 대단히 짧은 분자이며, 전자의 짝을 잃어서 불안정한 구조로 되어 있다. 이러한 활성산소는 스스로를 안정화시키기 위하여 주변의 다른 분자로부터 전자를 빼앗게 되고, 이렇게 하여 자신의 전자를 빼앗긴 분자도 역시 유리 래디컬이 되어 근처의 다른 분자로부터 전자를 빼앗게 된다.

상기와 같은 과정이 연속됨으로서 세포가 손상을 받게 되고 질병으로 직결되게 된다. 활성산소의 피해는 직접, 간접적으로 암, 심장질환, 뇌질환과 같은 성인병과 위궤양, 고혈압, 피부의 노화, 만성 피로증후군, 동맥질환, 알레르기, 천식, 관절염, 파킨스씨병, 백내장, 당뇨병, 당뇨병성 망막증 등과 같은 질병과 노화의 주된 원인이 된다고 알려지고 있다.

본 발명에서 활성산소 생성계에 이용한 크산틴 옥시다아제[Xanthine oxidase (Xanthine : oxygen oxidoreductase, EC 1.2.3.2)]는 분자상의 산소를 수소(전자)수용체로 이용하여 크산틴(xanthine) 또는 하이포크산틴(hypoxanthine)을 요산 (uric acid)형으로 산화하는 반응을 촉매하며, 모든 퓨린(purine)의 마지막 산화과정에 속도조절 효소(rate-limiting enzyme)로 작용한다. 상기 크산틴 또는 하이포크산틴과 크산틴 옥시다아제 반응의 생성물인 요산은 통풍의 원인이 되기도 하는데, 이 효소의 저해효과는 유리 래디컬의 생성 억제와 더불어 생물학적으로 중요한 의의를 가진다. 이러한 크산틴 옥시다아제의 저해물질로는 다양한 탄닌류 및 관련 페놀성 물질들이 보고되어 있다.

최근 유리 래디컬 소거(free radical scavenger) 역할을 하는 것 중에서 여러 가지 천연물 성분의 개발에 대한 연구가 시도되고 있다. 이러한 연구의 결과, 현재 가장 주목받고 있는 성분들은 식물영양소인 피토뉴트리언트(Phytonutrients)로서, 세계적으로 수많은 논문이 발표되고 있는데, 자몽, 오렌지, 레몬, 탄제린 등에서 추출한 시트러스 바이오플라보노이드(citrus bioflavonoid)와 소나무 껍질과 포도씨에서 추출한 피크노제놀(pycnogenol)이라 불리는 성분 등이 보고되어 있다. 상기 성분외에도 토코페롤, 아스코르빈산과 그 유도체들, 카로티노이드, 플라보노이드계 화합물들, 인지질, 갈색화 반응생성물, 아미노산, 펩티드, 단백질들, 향신료 추출물 등이 있다.

한편, 향신료 추출물에 관한 연구는 1940 년대부터 시작된 이래로 최근 관심이 높아지고 있는 분야로서, 특히 로즈마리, 세이지 추출물은 FDA로부터 승인을 받았다. 항신료 추출물로는 상기 성분 외에도 육두구, 정향, 고추 등 많은 성분들이 알려져 있는데, 종류에 따라 정도의 차이는 있으나 유리 래디컬 소거(free radical scavenger)효능을 인정받고 있으며, 기타, 쌀겨에 함유된 오리자놀과 함께 구아이약 수지, 참기름에 들어있는 세시물, 세사몰린, 세사민 등이 많이 알려져 있고 봉선화추출물, 루틴, 소목을 포함한 각종 한약재나 식용식물에서도 이러한 효능이 있다고 보고되고 있다.

한편, 고추냉이[와사비아 자포니카(Wasabia japonica=W. koreana), 재팬 호오스래디쉬(Japanese horseradish)]는 십자화과에 속하는 식물로 일본산 고추냉이 [와사비아 자포니카(Wasabia japonica)]와 서양산 고추냉이[고추냉이무, 호오스래디쉬(Horseradish), 코코레리아 아모라시아(Cocholearia armoracia L.)]로 분류된다.

우리나라 울릉도 및 일본의 산과 계곡에 야생 또는 재배하는 다년생 초본으로 높이 30 cm 내외이고, 근경은 비후하며, 근생엽은 여러 겹으로 모여 나며 호생한다. 엽신은 심장형이고, 거치가 있으며 꽃은 5 ∼ 6 월에 줄기 끝에 백색의 십자화가 정생 또는 총생화서로 피고, 과실은 각과로 끝에 부리모양의 돌기가 있다. 생약으로는 근경을 사용하며 산규근[와사비애 리조마(Wasabiae Rhizoma)]이라 한다. 주요 성분으로는 근경에 시니그린(sinigrin), 아릴이소티오시아네이트(allylisothiocyanate), 부틸이소티오시아네이트(butylisothiocyanate) 등이 함유되어 있다.

상기 식물은 뿌리에 상처를 내거나 껍질을 벗기면 독특한 냄새와 매운맛을 나타내는데, 이러한 향미 때문에 서유럽에서는 적당히 가공하여 식욕증진이나 소화촉진 식품으로 사용하여 왔다.

상기한 톡특한 향미의 주요성분은 고추냉이 정유의 주요 휘발성 성분인 아릴 이소티오시아네이트로 밝혀졌다. 이러한 아릴이소티오시아네이트는 식물 내에 처음부터 존재하는 것이 아니라, 조직에 들어있는 티오글루코사이드의 일종인 시니그린이 불활성인 상태로 존재하다가 일단 조직을 절단하거나 상처를 입히면 조직 중에 들어있는 효소로서 미로설파타아제(myrosulfatase)와 티오글루코시다아제(thioglucosidase)의 복합효소인 미로시나제(myrosinase)의 작용으로 상기 시니그린이 가수분해되면서 글루코오즈와 황산수소 칼륨 및 아릴이소티오시아네이트가 생성된다.

아릴이소티오시아네이트는 맛과 향으로 인한 식욕 및 소화 촉진 작용 외에도 항균작용 등에 대한 보고가 있으며, 최근 향신료를 이용한 연구동향으로는 식품첨가물 뿐만 아니라 화장품 업계, 아로마 테라피(aroma therapy) 등 보다 넓은 영역에서 연구가 시도되어지고 있다.

예전부터, 고추냉이는 근경을 식욕증진, 신미건위, 방부, 살균에 사용하여 왔는데, 특히 일본에서는 민간에서 생선 및 조류고기의 중독에 즙을 내어 사용하고 있다.

한편, 고추냉이(와사비) 김치 제조방법이 개시되어 있고[한국특허등록 제10-0483249호], 고추냉이 저장용 그릇이 공지되어 있으며[한국실용신안등록 제20-0356802호], 양고추냉이로부터 추출한 양고추냉이 정유를 활성성분으로 함유하는 저장물 해충 방제제가 개시되어 있다[한국특허등록 제10-0391827호].

그러나, 상기 기술은 아직 범용화되지 못하고 있는 실정이며, 고추냉이를 이용한 대부분의 연구는 고추냉이 추출물의 항균효과, 고추냉이 근경의 아릴이소티오 시아네이트 함량 또는 그 성분에 관한 연구가 대부분이다.

특히, 오늘날 세포의 산화로 인한 질환에 대한 인식이 높아짐으로서 화학적 반응이 아닌 동물세포 등을 이용하여 산화적 손상(oxidative stress)를 유발하고 고추냉이 추출물을 이용하여 세포보호 효능에 관한 연구는 국내 외에 발표된 사례가 없으며, 또한, 이를 음료, 츄잉껌, 캔디, 비스켓 및 아이스크림 등의 음식물에 적용한 예 또한 없었다.

이에, 본 발명의 발명자들은 고추냉이 추출물이 산화적 스트레스에 대한 세포보호효과를 가짐을 확인하여 본 발명을 완성하였다.

따라서, 본 발명은 종래에 고추냉이는 향신료로서 식욕증진, 신미건위, 방부, 살균 등에 제한적으로 사용하던 기존의 방법을 탈피하여 고추냉이 추출물을 음식물에 첨가 배합함으로써, 고추냉이 자체가 지니고 있는 다양한 생리적 활성을 살릴 뿐만아니라, 여러 가지 만성질환을 유발하는 세포의 산화적 스트레스에 대한 보호효과를 도모할 수 있어 특히 신경질환의 예방 효과를 가지는 조성물로서 사용하고, 또한 다양한 음식물에 첨가 배합함으로써 간단하게 상용할 수 있도록 한 고추냉이 추출물을 포함하는 신경질환 예방용 조성물과 세포의 산화적 스트레스에 대한 보호작용을 나타내는 식품을 제공하는데 그 목적이 있다.

본 발명은 고추냉이 추출물을 포함하는 신경질환, 즉 알츠하이머 치매 예방용 조성물을 특징으로 한다.

또한, 본 발명은 고추냉이 추출물을 포함하는 것을 특징으로 하며 세포의 산화적 스트레스에 대한 보호작용을 나타내는 알츠하이머 치매 예방용 건강 식품을 포함한다.

이하 본 발명을 상세하게 설명한다.

본 발명은 고추냉이 추출물이 생쥐의 래트(rat)의 PC12 세포에서 야기된 산화적 손상으로부터 세포보호효과를 확인함으로서 신경질환 예방용 조성물에 적용할 수 있고, 이러한 효과를 가진 고추냉이 추출물을 츄잉껌, 캔디, 비스켓, 아이스크림, 음료 및 초콜렛 등의 음식물에 함께 배합함으로써, 청소년, 성인 및 노인층의 광범위한 계층까지 언제 어디서나 늘 간편하게 섭취할 수 있어서 지속적인 음용효과를 기대할 수 있는 고추냉이 추출물을 포함하는 신경질환 예방용 조성물 및 건강식품에 관한 것이다.

본 발명은 고추냉이 추출물을 만성질환의 원인이 되는 세포의 산화적 스트레스에 대한 보호효과를 갖는 성분으로 사용하여 만성질환, 특히 신경질환에 대한 예방 효과를 가지는 조성물로 사용하고. 이를 식품에 적용하고자 하는 고추냉이 추출물의 새로운 용도에 관한 것이다.

특히 본 발명에서는 단순한 화학반응이 아닌 생쥐의 간세포주 (Hepa 1c1c7 murine hepatoma cell line)를 이용하여 H₂O₂ 및 크산틴 옥시다아제와 하이포크산틴 의 반응에 따라 생성된 활성산소로 산화적 손상(oxidative stress)을 유발한 후, 고추냉이 추출물을 이용하여 그 효능을 평가한 결과, H₂O₂로 인한 세포의 산화적 손상의 경우 100 ㎍/ml 농도에서 세포보호효과를 나타나기 시작하였으며, 크산틴 옥시다아제와 하이포크산틴의 반응에 따른 손상의 경우 25 ㎍/ml 농도에서부터 탁월한 세포보호 효능이 나타남을 확인하였다.

또한, 본 발명에서 이용한 PC12 세포는 래트(rat)의 부신 피오크로모사이토마(pheochromocytoma)에서 유래한 것으로 카테콜아민(catecholamines)을 생합성, 저장, 분비하며, 타이로신 하이드록실라제[tyrosine hydroxylase (EC 1.14.16.2)]를 생합성한다 [Greene, L.A. and Rein, G. (1977) Short-term regulation of catecholamine biosynthesis in a nerve growth factor responsive clonal line of rat pheochromocytoma cells. J. Neurochem. 30: 549-555].

특히, PC12 세포는 신경세포의 분화 및 크로마핀(chromaffin) 세포의 기능, 학습-습관화 반응(learning-habituation) 등의 연구의 모델로도 이용되고 있다 [Greene, L.A. and Tischler, A.S. (1982) PC12 pheochromocytoma cultures in neurobiological research: In Advance in cellular neurobiology. vol. 3. (ed. Feroroff S.), 373. Academic Press, New York.]. 본 발명에서는 PC12 세포에 H₂O₂로 산화적 스트레스로 신경세포 손상을 유발하고 고추냉이 추출물에 의한 보호효능을 확인하였다.

본 발명의 고추냉이 추출물로는 일본산 고추냉이 또는 서양산 고추냉이를 모 두 사용사능하며, 물, 탄소수 1 ∼ 6 의 저급알코올, 또는 이들의 혼합물을 추출용매로 사용하여 추출한 것을 사용할 수 있다.

본 발명에서는 일본산 고추냉이를 사용하여 그 효능을 측정하였으며, 고추냉이를 용매로 에탄올을 사용하고, 초음파를 조사하여 추출하는 방법을 사용한다. 즉, 본 발명에서 고추냉이 추출물을 얻는 방법을 더욱 상세히 설명하면 다음과 같다.

먼저 시료인 고추냉이의 근경을 액체질소로 순간 동결하여 분쇄기로 분말로 만든후 에탄올을 넣고 초음파로 20 ∼ 40분 동안 2 ∼ 3회 반복 추출한 다음, 도요여지(Toyo filter) No.2로 여액을 얻어 감압농축기 (Rotary vacuum evaporator)로 45 ∼ 55 ℃에서 감압농축시키고 농축물은 동결건조하여 연두색의 고추냉이 건조분말을 얻고, 이를 -70 ℃의 온도에서 보관하는 방법을 사용하였다.

상기와 같은 제조방법으로 제조된 고추냉이 추출물이 H₂O₂ 및 하이포크산틴과 크산틴 옥시다아제로 유도한 산화적 스트레스에 대한 보호효능이 우수함을 확인하고, 이를 츄잉검, 캔디, 비스켓, 아이스크림, 음료, 초콜렛 등에 적용할 수 있는 바, 이렇게 음식물에 함께 배합함으로써, 청소년, 성인 및 노인층의 광범위한 계층까지 언제 어디서나 늘 간편하게 섭취할 수 있어서 지속적인 음용효과를 기대할 수 있는 것이다.

본 발명에서와 같이, 고추냉이 추출물을 음식물에 적용하는 경우에는 전체 조성물에 대하여 고추냉이 추출물을 필수적으로 0.1 ∼ 1.0 중량% 함유하도록 사용 하는 것이 바람직하다. 만일 그 함량을 0.1 중량% 미만으로 하면 본 발명이 목적으로하는 효과를 얻을 수 없어 바람직하지 않고, 반면에 상기 범위를 초과하여 과량으로 첨가하면, 비경제적이면서 완성제품의 맛, 색깔에 영향을 미칠 수 있기 때문에 바람직하지 않다.

본 발명의 고추냉이 추출물을 포함하는 간, 신경질환 예방 및 치료용 조성물은 임상 투여시에 경구 또는 비경구로 투여, 예를 들어 정맥 내, 피하, 복강 내 또는 국소 적용할 수 있으며, 일반적인 의약품 및 건강식품의 형태로 사용될 수 있다.

경구 투여용 제형, 예를 들면 정제, 트로키제(troches), 로렌지(lozenge), 수용성 또는 유성현탁액, 조제분말 또는 과립, 에멀젼, 하드 또는 소프트 캡슐, 시럽 또는 엘릭실제(elixirs)로 제제화된다. 정제 및 캡슐 등의 제형으로 제제하기 위해 락토오스, 사카로오스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아밀로펙틴, 셀룰로오스 또는 젤라틴과 같은 결합제; 디칼슘 포스페이트와 같은 부형제; 옥수수 전분 또는 고구마 전분과 같은 붕괴제; 스테아린산 마그네슘, 스테아린산 칼슘, 스테아릴푸마르산 나트륨 또는 폴리에틸렌글리콜 왁스와 같은 윤활유가 함유된다. 캡슐제형의 경우는 상기에서 언급한 물질 이외에도 지방유와 같은 액체 담체를 함유한다.

또한, 본 발명의 고추냉이 추출물을 포함하는 간, 신경질환 예방 및 치료용 조성물은 비경구로 투여할 수 있으며, 비경구 투여는 피하주사, 정맥주사, 근육 내 주사 또는 흉부 내 주사 주입방식에 의한다. 비경구 투여용 제형으로 제제화하기 위해서는 고추냉이 추추물을 안정제 또는 완충제와 함께 물에서 혼합하여 용액 또는 현탁액으로 제조하고 이를 앰플 또는 바이알의 단위 투여형으로 제제한다.

또한, 상기 유효성분의 투여 용량은 일반적으로 성인 환자 체중 1 kg 당 1 ∼ 50 mg/일이고, 바람직하기로는 5 ∼ 20 mg/일이며, 의사 또는 약사의 판단에 따라 일정 시간 간격으로 1 ∼ 수회, 바람직하기로는 하루 2 ∼ 3 회 분할투여할 수 있다.

또한, 본 발명은 고추냉이 추출물을 유효성분으로 하는 건강보조제를 포함한다. 상기 건강보조제는 고추냉이 추출물을 음료, 차류, 향신료, 껌, 과자류 등의 식품소재에 첨가하거나, 캡슐화, 분말화, 현탁액 등으로 제조한 식품으로, 이를 섭취할 경우 건강상 특정한 효과를 가져오는 것을 의미하나, 일반 약품과는 달리 식품을 원료로 하여 약품의 장기복용시 발생할 수 있는 부작용 등이 없는 장점이 있다.

이하, 본 발명을 실시예에 의거하여 더욱 구체적으로 설명하겠는 바 다음 실시예에 의하여 본 발명이 한정되는 것은 아니다.

참고예 : 동물세포주 배양

본 발명에 사용된 동물세포주인 생쥐(mouse)유래의 간세포(Hepa 1c1c7 cell line)는 미국의 분양기관(American Type Culture Collection, ATCC CRL 2026)으로부터 구입하였으며, 2 mM 글루타민(glutamine), 100 U/ml 페니실린 G(penicillin G), 100 ㎍/ml 스트렙토마이신(streptomycin), 10 % 피탈 보바인 시럼(fetal bovine serum) 등을 포함하는 알파-엠이엠(α-MEM, minimum essential medium alpha modification) 배지를 첨가하여 37 ℃의 5% CO₂/95% 공기 환경으로 조절한 CO₂ 배양기(incubator)내에서 계대배양하면서 실험에 이용하였다.

PC12 세포는 래트(rat)의 부신(adrenal gland)로부터 분리된 갈색세포종으로 10% horse serum, 5% fetal calf serum, 100 units/ml penicillin 및 100 ㎍/ml streptomycin을 포함한 RPMI 1640을 사용하여 37 ℃, CO₂ 배양기 (5%)에서 배양하였다.

제조예 : 고추냉이 추출물의 분리

본 발명에서 사용한 공시재료[일본산 고추냉이, Wasabia japonica]를 강원도 철원군에 소재한 재배 농가로부터 구입하여 세척 건조하고, 대략 2 × 2 × 2(가로× 세로× 두께, cm) 크기로 절단하여 액 체질소로 급속동결 후 즉시 분쇄기로 분쇄한 분말상의 고추냉이를 사용하였으며, 추출용 용매인 에탄올은 1급 시약을 사용하였고, 나머지 기타 시약은 미국 시그마(Sigma), 프로메가(Promega), 퀴아젠(Qiagen) 제품 및 특급시약을 이용하였다.

즉, 시료인 고추냉이 분말 500 g에 에탄올 5 L를 넣고 초음파로 30 분간 3회 반복 추출한 다음, 도요여지(Toyo filter) No.2 로 여액을 얻어 감압농축기 (Rotary vacuum evaporator)로 50 ℃에서 감압농축시키고, 농축물은 동결 건조하여 연두색의 고추냉이 건조분말을 얻었다. 이후 시료를 -70 ℃에서 보관하면서 사 용하였다.

실험예 1 : 생쥐 간세포(Hepa 1c1c 7 cell)에서의 H ₂ O ₂ 로 유발된 산화적 스트레스에 대한 고추냉이 추출물의 세포보호효과

6 웰 플레이트(well plate)의 각 웰(well)에 동일한 수(4.0 × 10⁴ cells)의 생쥐의 간세포(Hepa 1c1c7 cells)를 분주하고, 24시간 전 배양한 다음에 상기 참고예를 통해 제조된 고추냉이 추출물을 100, 200 ㎍/ml 농도로 첨가하고 동시에 200 μM H₂O₂를 가하여 30 분간 37 ℃의 5% CO₂ 인큐베이터(incubator)에서 반응을 시켰다. 반응액을 모두 제거한 다음 포스페이트 버퍼드 생리식염수(phosphate buffered saline)로 세척한 후 생리식염수를 가하여 MTT(3-(4,5-dimethyl-thiazo-2-yl)-2,5-diphenyltetrazoliumbromide)를 최종농도 0.5 mg/ml로 첨가한 다음 위상차현미경을 이용하여 변화된 세포형태를 사진촬영한 후 4시간 동안 37 ℃의 5% CO₂ 인큐베이터에서 반응을 시켜 MTT부터 형성된 포마쟌(formazan)을 디메틸설폭사이드(dimethylsulfoxide)에 녹여 마이크로플레이트 리더(microplate reader)로 570 nm에서 흡광도를 측정하여 H₂O₂에 의한 산화적 손상에 대한 고추냉이 추출물의 세포보호효과를 측정하였다.

첨부도면 도 1에 나타난 바와 같이 H₂O₂만 처리한 경우 생쥐 간세포(Hepa 1c1c 7 cell)가 산화적 스트레스에 의해 세포독성을 일으켜 50% 이상 사멸하였다.

반면, 고추냉이 추출물을 첨가한 군은 농도의존적으로 세포 형태의 변화가 적었으며 세포수도 회복함을 알 수 있었다. 이는 고추냉이 추출물에 의한 세포의 산화적 스트레스에 대한 보호효과로 해석할 수 있다.

첨부도면 도 2의 MTT를 이용한 세포독성 시험에서도 도 1과 동일하게 고추냉이 추출물 첨가량이 높아질수록 생쥐 간세포주(Hepa 1c1c7 cell)의 생육률이 증가됨을 알 수 있었다.

실험예 2 : 래트(rat)의 부신(adrenal gland) 유래 피오크로모사이토마(pheochromocytoma)인 신경세포 (PC12)에서의 H ₂ O ₂ 로 유발된 산화적 스트레스에 대한 고추냉이 추출물의 세포보호효과

6 웰 플레이트(well plate)의 각 웰(well)에 동일한 수(4.0 × 10⁴ cells)의 랫(rat)의 부신 피오크로모사이토마 (pheochromocytoma) 유래 신경세포 (PC12)를 분주하고, 24시간 전 배양한 다음에 상기 참고예를 통해 제조된 고추냉이 추출물을 200, 300 ㎍/ml 농도로 첨가하고 실험예 1과 동일하게 실험한 다음 위상차현미경을 이용하여 변화된 세포형태를 사진 촬영하였다.

첨부도면 도 3에 나타난 바와 같이 H₂O₂만 처리한 경우 래트(rat)의 PC12 세포가 산화적 스트레스에 의해 세포독성을 일으켜 대부분의 세포가 사멸하였으며 고 추냉이 추출물을 첨가한 군은 농도의존적으로 세포 형태의 변화가 적었으며 세포수도 회복함을 알 수 있었다. 이는 고추냉이 추출물에 의한 세포의 산화적 스트레스에 대한 보호효과로 해석할 수 있다.

실험예 3 : 하이포크산틴과 크산틴 옥시다아제로 유도된 산화적 스트레스에 대한 고추냉이 추출물의 세포보호효과

상기 실험예 1과 동일하게 6웰 플레이트의 각 웰에 동일한 수(6.0 × 10⁴ cells)의 생쥐의 간세포(Hepa 1c1c7 cells)를 분주하고, 24 시간 전 배양한 다음 상기 참고예를 통해 제조된 고추냉이 추출물을 25, 50, 100, 200 ㎍/ml 농도로 첨가하고, 동시에 200 μM 하이포크산틴과 0.5 mU 크산틴 옥시다아제를 가하여 30분간 37 ℃의 5% CO₂ 인큐베이터)에서 반응시켰다. 상기 반응액을 모두 제거한 다음 포스페이트 버퍼드 생리식염수로 조심스럽게 세척한 후 다시 생리식염수을 가하여 MTT 최종농도가 0.5 mg/ml가 되도록 첨가한 다음, 위상차현미경을 이용하여 변화된 세포형태를 사진촬영하고 4시간 동안 37 ℃의 5% CO₂ 인큐베이터에서 반응시켜 MTT로부터 형성된 포마쟌을 디메틸설폭사이드에 녹여 마이크로플레이트 리더로 570 nm에서 흡광도를 측정하여 하이포크산틴과 크산틴 옥시다아제의 반응으로 일어난 산화적 손상에 대한 고추냉이 추출물의 세포보호효과를 측정하였다.

첨부도면 도 4에 나타난 바와 같이 하이포크산틴과 크산틴 옥시다아제만 처 리한 경우 생쥐 간세포(Hepa 1c1c 7 cell)가 산화적 스트레스에 의해 세포독성을 일으켜 70 % 이상 사멸하였다.

반면, 고추냉이 추출물을 첨가한 군은 농도의존적으로 세포 형태의 변화가 적었으며 세포수도 회복함을 알 수 있었다. 이는 고추냉이 추출물에 의한 산화적 스트레스에 대한 세포보호효과로 해석할 수 있으며, 도 5의 MTT를 이용한 세포독성 시험에서도 도 4과 동일하게 고추냉이 추출물 첨가량이 높아질수록 생쥐 간세포주(Hepa 1c1c7 cell)의 생육률이 100 ㎍/ml 농도에서 80% 이상, 200 ㎍/ml에서는 세포형태나 수 모두, 무처리 대조구와 동일한 결과를 나타냄을 확인할 수 있다.

상기한 결과로부터 생쥐 간세포(Hepa 1c1c 7 cell) 뿐 만 아니라 래트(rat)의 PC12 세포에서도 산화적 스트레스에 대한 고추냉이 추출물의 강한 세포 보호효과를 확인할 수 있었으며, 특히 H₂O₂에 의한 직접적인 산화적 스트레스보다 효소계를 이용한 산화적 손상에 고추냉이 추출물이 보다 효과적으로 방어함을 알 수 있었다.

실험예 4 : 독성실험

1) 실험용 쥐에 대한 경구 투여 급성 독성실험

6주령의 특정병원부재(SPF) SD계 래트(rat)를 사용하여 급성독성실험을 실시하였다. 군당 2 마리씩의 동물에 고추냉이 추출물을 0.5% 메틸셀룰로즈 용액에 현탁하여 1 g/kg/1 ㎖의 용량으로 단회 경구투여하였다. 시험물질 투여 후 동 물의 폐사여부, 임상증상, 체중변화를 관찰하고 혈액학적 검사와 혈액생화학적검사를 실시하였으며, 부검하여 육안으로 복강장기와 흉강장기의 이상여부를 관찰하였다. 시험결과, 시험물질을 투여한 모든 동물에서 특기할 만한 임상증상이나 폐사된 동물은 없었으며, 체중변화, 혈액검사, 혈액생화학 검사, 부검소견 등에서도 독성변화는 관찰되지 않았다. 이상의 결과 실험된 화합물은 모두 랫트에서 500 mg/kg까지 독성변화를 나타내지 않으며 경구 투여 최소치사량(LD50)은 500 mg/kg이상인 안전한 물질로 판단되었다.

2) 실험용 쥐에 대한 비경구 투여 독성실험

상기 경구 투여 독성실험과 동일한 래트를 사용하여, 본 발명의 고추냉이 추추물을 2 mg 씩 근육주사 방법으로 투여하였다. 실험용 쥐 한 마리에는 2주 간격으로 2번, 다른 한 마리의 실험쥐에는 2 주 간격으로 2회 투여 후, 1 개월의 간격을 둔 다음 다시 2 주 간격으로 3회 투여를 실시하였다.

처음 주사 후 6 개월간 질병 유무(clinical sign), 체중, 체온 등 외관(physical examination), 혈액세포의 이상(haematology), 배설물의 이상(urinalysis)을 관찰하였으나 모두 정상치의 값을 나타내었다.

실시예 1 : 츄잉껌(A)의 제조

껌베이스 20 중량%

설탕 76.5 중량%

고추냉이 추출물(제조예) 0.5 중량%

후르츠향 1 중량%

물 2 중량%

상기 조성 및 함량과 통상적인 방법으로 츄잉껌을 제조하였다.

실시예 2 : 츄임껌(B)의 제조

껌 베이스 25 중량%

솔비톨 72 중량%

고추냉이 추출물(제조예) 0.5 중량%

페퍼민트 후레버 2.5 중량%

실시예 3 : 캔디(A)의 제조

설탕 54.5 중량%

물엿 45 중량%

고추냉이 추출물(제조예) 0.4 중량%

오렌지향 0.1 중량%

상기 조성 및 함량과 통상적인 방법으로 캔디를 제조하였다.

실시예 4 : 캔디(B)의 제조

말티톨 53.6 중량%

환원물엿 45 중량%

고추냉이 추출물(제조예) 0.5 중량%

천연허브향 0.14 중량%

실시예 5 : 비스켓의 제조

박력1급 88 kg

중력1급 76.4 kg

정백당 16.5 kg

식염 2.5 kg

포도당 2.7 kg

팜쇼트닝 40.5 kg

암모 5.3 kg

중조 0.6 kg

중아황산나트륨 0.55 kg

쌀가루 5.0 kg

비타민 B1 0.003 kg

비타민 B2 0.003 kg

밀크향 0.16 kg

물 71.1 kg

전지분유 4 kg

대용분유 1 kg

제일인산칼슘 0.1 kg

살포염 1 kg

분무유 25 kg

고추냉이 추출물(제조예) 1.7 kg

상기 조성 및 함량과 통상적인 방법으로 비스켓을 제조하였다.

실시예 6 : 아이스크림의 제조

유지방 10.0 중량%

무지유고형분 10.8 중량%

설탕 12.0 중량%

물엿 3.0 중량%

유화안정제(스팬,span) 0.5 중량%

향료(스트로베리) 0.15 중량%

물 63.05 중량%

고추냉이 추출물(제조예) 0.5 중량%

실시예 7 : 음료의 제조

꿀 522 mg

치옥토산아미드 5 mg

니코틴산아미드 10 mg

염산리보플라빈나트륨 3 mg

염산피리독신 2 mg

이노시톨 30 mg

오르트산 50 mg

고추냉이 추출물(제조예) 1,003 mg

물 200 ml

상기 조성 및 함량과 통상적인 방법으로 음료를 제조하였다.

실시예 8 : 초콜렛의 제조

설탕 34.5 중량%

코코아 버터 34 중량%

코코아 매스 15 중량%

코코아 파우다 15 중량%

레시틴 0.5 중량%

바닐라향 0.5 중량%

고추냉이 추출물(제조예) 0.5 중량%

제제화 예

상기에서 확인된 바와 같이, 고추냉이 추출물은 산화적 스트레스에 대한 세포보호효과를 가지므로 간, 신경질환 예방 및 치료용 조성물로 제제화할 수 있다.

1) 시럽제의 제조

본 발명의 고추냉이 추출물 0.5 %(중량/부피)로 함유하는 시럽은 다음과 같은 방법으로 제조하였다.

고추냉이 추출물 2 g, 당 25.4g 을 온수 80 g에 용해시켰다. 이 용액을 냉각시킨 후, 여기에 글리세린 8.0 g, 사카린 0.8 g, 향미료 0.04 g, 에탄올 4.0 g, 소르빈산 0.4 g 및 증류수로 이루어진 용액을 제조하여 혼합하였다. 이 혼합물에 물을 첨가하여 100 ㎖가 되게 하였다.

2) 정제의 제조

유효성분 15 mg이 함유된 정제는 다음과 같은 방법으로 제조하였다.

고추냉이 추출물 250 g을 락토오스 175.9 g, 감자전분 180 g 및 콜로이드성 규산 32 g과 혼합하였다. 이 혼합물에 10% 젤라틴 용액을 첨가시킨 후, 분쇄해서 14 메쉬체를 통과시켰다. 이것을 건조시키고 여기에 감자전분 160 g, 활석 50 g 및 스테아린산 마그네슘 5 g을 첨가해서 얻은 혼합물을 정제로 만들었다.

3) 주사액제의 제조

유효성분 10 mg을 함유하는 주사액제는 다음과 같은 방법으로 제조하였다.

고추냉이 추출물 1 g, 염화나트륨 0.6 g 및 아스코르빈산 0.1 g을 증류수에 용해시켜서 100 ㎖을 만들었다. 이 용액을 병에 넣고 20 ℃에서 30 분간 가열하여 멸균시켰다.

상술한 바와 같이, 본 발명은 고추냉이 추출물이 H₂O₂ 또는 하이포크산틴과 크산틴 옥시다아제로 유발된 산화적 스트레스에 대한 세포보호효과를 확인하였다.

본 발명에 의하면, 고추냉이 추출물을 세포의 산화적 스트레스에 의해 유발되는 세포의 산화적 손상을 억제할 수 있으므로, 세포의 산화적 손상에 의한 각종 만성질환에 대한 예방 및 치료효과를 가지는 조성물로 적용할 수 있다.

또한, 본 발명의 고추냉이 추출물을 츄잉껌, 캔디, 비스켓, 아이스크림, 음료, 초콜렛 등의 다양한 음식물의 재료와 함께 배합하여 각종 기능성 식품으로 제조할 경우 청소년, 성인 및 노인층의 광범위한 계층까지 언제 어디서나 늘 간편하게 섭취할 수 있어서 지속적인 음용효과를 기대할 수 있다.

Claims

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고추냉이 에탄올 추출물을 유효성분으로 포함하는 활성산소에 의하여 야기되는 산화적 스트레스에 대한 신경세포 보호용 건강식품.
제 2 항에 있어서, 상기 식품은 츄잉껌, 캔디, 비스켓, 아이스크림, 음료 및 초콜렛 중에서 선택된 것을 특징으로 하는 신경세포 보호용 건강식품.