KR100691839B1

KR100691839B1 - 비피도박테리움 비피둠의 공배양을 통한 담즙산 활성효소 증가 방법 및 이를 이용한 담즙산 활성효소 증가제

Info

Publication number: KR100691839B1
Application number: KR20040102428A
Authority: KR
Inventors: 김홍렬; 쇼캣파베츠
Original assignee: 김홍렬
Priority date: 2004-12-07
Filing date: 2004-12-07
Publication date: 2007-03-12
Anticipated expiration: 2024-12-07
Also published as: KR20060063297A

Abstract

본 발명은 비피도박테리움 비피둠으로 이루어진 그룹에서 선택된 2이상의 종을 공배양(co-culturing)통해 담즙산 활성효소 생산을 증가시키는 방법 및 비피도박테리움 비피둠으로 이루어진 그룹에서 선택된 2이상의 종을 포함하고 담즙산 활성 효소 생산 증가제에 관한 것으로,

보다 상세하게는 비피도박테리움 비피둠 종을 공배양시켜 담즙산 활성효소 생산을 증가시키는 방법 및 비피도박테리움 비피둠으로 이루어진 그룹에서 선택된 2이상의 종을 포함하고 담즙산 활성 효소 생산을 증가제 또는 식품에 관한 것이다. 본 발명의 비피도박테리움 비피둠을 2이상 포함하는 담즙산 활성효소 증가제는 장내 정착성, 내산성 및 내담즙산성이 우수하여 발효유, 건강보조식품 및 의약품 등의 다양한 유산균제품에 사용될 수 있다.

비피도박테리움 비피둠, 담즙산 활성효소 증가제

Description

비피도박테리움 비피둠의 공배양을 통한 담즙산 활성효소 증가 방법 및 이를 이용한 담즙산 활성효소 증가제{The Methods of overproducing bile salt hydrolase by co-culturing of Bifidbacterium bifidum, and the composition thereof}

도 1는 각각의 균주와 공배양에서 담즙산이 pH에 주는 영향을 보여준다. Ox: 옥스갈; TCA:타우로콜릭산

도 2는 TYP를 포함하는 배지에서 담즙산(옥스갈 및 TCA)의 개시 농도의 전환 효율 퍼센티지를 나타낸다. 탈포합화의 정도는 배지내의 담즙산의 원래 농도의 퍼센티지로서 나타내었다.

도 3은 HPLC 분석에 의해 포합된 담즙산이 탈포합되어진 담즙산으로 사라지는 %을 보여준다. B.b: B. bifidum; CA:cholic acid; TCA:taurocholic acid

도 4는 플레이트 카운트 뿐만 아니라 성장(O.D 650nm)에서 여러 담즙산의 효과를 보여준다. 0.5%의 타우로콜릭산과 옥스갈이 첨가되어진 TYP 배지에서 각각의 B. bifidum(NRRL 1976, NRRL 1917, KCCM 12096) 및 이들의 조합(공배양)의 32시간에서의 담즙산의 독성도를 보인다.

본 발명은 비피도박테리움 비피둠의 공배양을 통한 담즙산 활성효소(bile salt hydrolase) 증가 방법 또는 2 이상의 비피도박테리움 비피둠 균주을 포함하여, 비피도박테리움 공배양(co-culturing)시키는 담즙산 활성효소 증가제 또는 이를 포함하는 식품 조성물에 관한 것이다.

유산균이 생균활성제(probiotics)로서 유용한 효과를 나타내기 위해서는 장에 도달하여 증식할 수 있어야 한다. 이를 위해서는 내산성 및 내담즙산성 뿐만 아니라 장내 정착성이 우수해야 한다. 기존의 유산균주 개발은 이러한 내산성, 내담즙산성 및 부착능에 관한 연구가 주류를 이루었다. 그러나 최근에 유산균 연구가 활발해지면서 유산균의 항암효과, 면역활성효과, 특정 유해균(대장균, 헬리코박터 파이로리 등)에 대한 저해효과, 혈압강하효과 및 혈중 콜레스테롤 저하능 등 유산균의 특수 기능에 관한 관심이 높아지고 있다.

고혈중 콜레스테롤은 오늘날, 주요 건강관리 문제를 포함하는 심장혈관계 질환에 있어서 위험인자로서 인식되고 있다. 유행성 질병학적 연구는 거의 예외없이, 다량의 불포화 지방 및 콜레스테롤을 소비하는 사람은 혈청 콜레스테롤 농도가 비교적 높고 관상동맥성 심장병으로 인한 사망률이 높다는 것을 증명하였다. 다른 인자도 또한 심장혈관계 질병의 진행에 기여할 수 있는 것을 인정하지만, 혈청 콜레스테롤의 농도와 관상질환 및 관상 사망률간의 인과관계가 있는 것으로 나타나고 있는데, 과콜레스테린혈증은 바람직하지 못한 양의 콜레스테롤을 순환계의 여러 부분(동맥경화증) 또는 연질조직(황색종증)에 축적시킨다.

HDL(고밀도지질단백질, high density lipoprotein)은 간 및 소장에서 합성되어 혈액을 타고 온몸을 순환하며 세포내에 있는 여분의 콜레스테롤을 회수하여 간으로 이동시키는 역할을 한다. HDL은 다른 조직에서 간으로 콜레스테롤을 운반한다. 따라서 HDL 이 많으면 혈관 등에서 콜레스테롤이 많이 제거될 것이라고 생각할 수 있다.

LDL(저밀도지질단백질, low density lipoprotein)은 콜레스테롤의 가장 많은 양을 운반하며 말초 세포로 콜레스테롤을 공급하기도 하지만 관상동먁경화증을 일으키는 가장 위험한 지질단백질이며, 비만자이다. 간에서 주로 생성되는 콜레스테롤은 LDL의 형태로 혈관 등 다른 조직으로 운반된다. 혈관의 동맥경화 부위에는 콜레스테롤이 많이 존재한다. 따라서 LDL 이 많으면 혈관으로 콜레스테롤이 많이 쌓여서 동맥경화가 촉진될 수 있다. 따라서 일반적으로 LDL 은 동맥경화를 일으키는 '나쁜 콜레스테롤', HDL 은 동맥경화를 막는 '좋은 콜레스테롤' 이라고 설명된다.

매거호름-라르센 등의 연구(Agerholm-Larsen L, Raben, Haulrik N, Hansen AS, Manders M, Astrup A., Eur J Clin Nutr. 2000 Apr; 54(4):288-97)의 보고에 따르면 엔테로코코스 패시움(Enterococcus faecium) 및 두 종의 스트렙토코코스 써모필러스(Streptococcus thermophilus)으로 발효되어진 요구르트가 LDL-콜레스테롤의 양을 감소시켰다는 보고가 있다. 앤드스 등의 연구(Anderson, James W. and S.E. Gilliland, Journal of American College of Nutrition, Vol. 18, No. 1, 43-50(1999))에 의하면 사람에서 분리되어진 락토바실러스 에시도필러스(L. acidophilus)를 포함하는 발효유가 LDL 콜레스테롤을 낮췄다는 보고하며, 콜레스테롤을 감소시키는 L. acidophilus가 관상동맥질환에 대한 위험을 6 내지 10% 감소시킬 수 있다고 보고하고 있다.

유산균에 의한 콜레스테롤 흡수의 저하 기작은 보통 세 가지로 설명되어 질 수 있다. 첫번째는 유산균이 장내에 정착 증식하면서 콜레스테롤을 흡착하여 배설시키는 것이고 두번째는 유산균이 담즙산을 흡착하여 배설시키는 것이다. 이런 경우 콜레스테롤은 담즙산의 전구체이므로 부족한 담즙산을 보충하기 위해 콜레스테롤을 이용하게 되어 결과적으로 장내 콜레스테롤 농도를 감소시킬 수 있다. 그리고 세번째 기작은 유산균이 포합담즙산을 탈포합시키는 작용이다.

간에서 생성된 프리 담즙산(free bile acid)은 소장에서 타우린 또는 글라이신과 결합하여 포합담즙산(conjugated bile acid)이 된다. 포합담즙산은 지질 용해도가 높아 소장에서 콜레스테롤 등의 지질 흡수를 용이하게 한다. 그러므로 포합담즙산이 많은 경우 혈중으로 흡수되는 콜레스테롤양이 많아져 혈중 콜레스테롤 농도가 높아진다. 그러나 탈포합된 담즙산(deconjugated bile acid)은 낮은 용해도를 가지며, 콜레스테롤의 용해도를 저하시키는 작용을 한다. 따라서 포합담즙산을 탈포합시키는 담즙산 활성효소(bile salt hydrolase; BSH)를 갖는 균주는 지질 용해도를 낮추어 소장에서 콜레스테롤의 흡수를 저하시킨다. 비피도박테리움은 사람의 장내 세균집단의 중요한 부분을 차지하고, 비피도 박테리움을 건강을 증진시키는 효과 때문에 발효 유제품에 주로 첨가된다. 비피도박테리움의 가장 중요한 대사작용은 인간의 장내에서 자연적으로 일어나는 담즙산의 탈포합(deconjugation)이다. 담즙산 활성효소(Bile salt hydrolase; BSH)는 장간순환(enterohepatic circulation) 동안에 담즙산 탈포합에 관여하는 중요한 효소이다. 이 담즙산 활성효소는 여러 젖산균에서 발견이 되었고, 담즙산활성효소 활성이 콜레스테롤를 저하시키는 성질을 가진 생균활성 균주를 선택하는데 필요하다는 것이 제시되었다. 탈포합시킬 수 없는 균주는 배양액으로부터 의미있는 정도로 콜레스테롤을 제거할 수 없었다.

높은 혈중 및 식이 콜레스테롤 수준은 관상동맥 심장 질환에 주요한 위험요인이며, 대장암에도 주요한 요인이 된다.

따라서, 부작용 없으면서도 한국인 체질에 맞는 콜레스테롤 저하 기능을 갖는 균주를 개발하여 이를 이용한 의약품 또는 식품을 개발하는 것이 시급한 실정이다.

이에, 본 발명자들은 공배양이 장내에서 담즙산 활성효소를 증가시키는 것을 발견하고, 상기 균주가 2이상 포함되어 담즙산 활성효소를 증가키는 본 발명에 따른 증가제를 발효유, 건강보조식품 그리고 의약품에 사용할 수 있음을 밝힘으로써 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 담즙산 활성효소를 증가시키는 비피도박테리움 비피둠 균주 공배양 방법 및 상기 균주 2종 이상을 유효성분으로 함유하여 장내에서 담즙산 활성효소를 증가시키는 증가제 또는 이를 포함하는 식품 조성물을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 비피도박테리움 비피둠으로 이루어진 그룹에서 선택된 2이상의 종을 공배양(co-culturing)통해 담즙산 활성효소 생산을 증가시키는 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 비피도박테리움 비피둠으로 이루어진 그룹에서 선택된 2이상의 종을 포함하여 공배양이 유도되는, 담즙산 활성 효소 생산 증가제를 제공한다.

또한, 본 발명은 비피도박테리움 비피둠으로 이루어진 그룹에서 선택된 2이상의 종을 포함하여 공배양이 유도되는, 담즙산 활성 효소 생산 증가용 식품을 제공한다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은 장내 정착성, 내산성 및 내담즙산성이 우수하고, 혈중 콜레스테롤 저하능을 갖는 균주로 비피도박테리움 균주를 이용하는 것이고, 상기 균주는 비피도박테리움 비피둠인 것이 바람직하다.

본 발명에 사용되어진 세 종의 기원과 종류는 표 1에 보였다. NRRL-1976, NRRL-1917는 미국의 ARS 컬쳐 콜렉션(NRRL)에서 제공되였고, 한국종균협회로부터 KCCM 12096이 제공되었다. 저장 배양은 -70℃로 유지되었다. 세균은 연속적으로 시험에 사용되어지기 전에 적절한 배지에서 세 번 배양되었다. 젖산균은 TYP 배지(16g의 박토드립톤/리터, 16g의 효모 추출액/리터, 16g의 해양 염/리터 [pH 7.5])에서 키워졌다.

본 발명은 상기 비피도박테리움 비피둠 균주 2종 이상을 포함하여 장내에서 공배양을 통해 담즙산 활성효소의 활성을 높이는 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 비피도박테리움 비피둠으로 이루어진 그룹에서 선택된 2이상의 종을 포함하여 공배양이 유도되고, 담즙산 활성 효소 생산 증가제를 제공한다.

Stamler등( Arch. Pathol. Lab. Med., 1988, 112:1032-1040)은 혈중 콜레스테롤이 감소하면 심장질환을 예방 또는 치료할 수 있다 하였고, Sindelka등( Physiol. Res.,2002, 51:85-91)은 혈중 콜레스테롤이 비만, 당뇨병 및 고혈압에도 관련이 있다고 하였다. 따라서 콜레스테롤 저하제는 콜레스테롤을 저하시킴으로써 콜레스테롤과 관련된 질병의 예방 또는 치료제로 사용할 수 있고, 특히 비만, 당뇨병, 고혈압 및 심장질환의 예방 또는 치료에 유용하게 사용할 수 있다.

일반적으로 비피도박테리움 비피둠은 임상투여시에 경구 투여가 가능하며 일반적인 의약품 제제의 형태로 사용될 수 있다. 비피도박테리움 비피둠 균주는 실제 임상투여시에 경구의 여러 가지 제형으로 투여될 수 있는데, 제제화 할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 비피도박테리움 비피둠 균주에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트(Calcium carbonate), 수크로스(Sucrose) 또는 락토오스(Lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스티레이트 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구를 위한 액상제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제,보존제 등이 포함될 수 있다.

비피도박테리움 비피둠 균주는 독성이 없는 안정한 균주이며, 유효용량은 1 x 10 ⁸ ∼ 40 x 10 ⁸ 균수/kg이고, 바람직하기로는 10 x 10 ⁸ ∼ 20 x 10 ⁸ 균수/kg 이며, 하루 1~3 회 투여될 수 있다.

또한, 본 발명은 비피도박테리움 비피둠으로 이루어진 그룹에서 선택된 2이상의 종을 포함하여 공배양이 유도되어, 담즙산 활성 효소 생산 증가용 식품을 제공한다. 본 발명의 콜레스테롤 저하용 식품은 콜레스테롤 관련 질병의 예방 또는 치료제로 사용할 수 있고, 특히 비만, 당뇨병,고혈압 및 심장질환의 예방 또는 치료에 유용하게 사용할 수 있다.

본 발명에 따른 비피도박테리움 비피둠으로 이루어진 그룹에서 선택된 2이상의 종을 포함하여 공배양이 유도되는, 담즙산 활성 효소 생산을 증가시키는 담즙산 활성 효소 생산 증가용 식품으로 사용할 경우, 상기 균주를 그대로 첨가하거나 다른 식품 또는 식품 성분과 함께 사용되고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 상기 식품의 종류에는 특별한 제한은 없다.

상기 균주를 첨가할 수 있는 식품의 예로는 육류, 소세지, 빵, 쵸코렛, 캔디류, 스넥류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 차, 드링크제, 알콜 음료 및 비타민 복합제 등이 있고, 발효유, 요구르트, 치즈, 우유 음료 또는 분유로 제조하는 것이 바람직하고, 발효유, 요구르트, 음료수, 분유, 식품첨가물, 또는 건강보조식품인 것이 더욱 바람직하다.

유효 성분의 혼합양은 그의 사용 목적(예방, 건강 또는 치료적 처치)에 따라 적합하게 결정될 수 있다. 일반적으로, 본 발명의 비피도박테리움 비피둠 균주를 식품 또는 음료의 제조시에 상기 특정식품 소재 1 g(또는 ㎖) 당 본 발명의 균을 1 x 10 ⁷ 내지 10 x 10 ⁸ 개(균수) 첨가하고, 바람직하게는 1 x 10 ⁸ 내지 5 x 10 ⁸ 개의 양으로 첨가한다. 본 발명의 균주의 유효용량은 상기 약학적 조성물의 유효용량에 준해서 사용할 수 있으나, 건강 및 위생을 목적으로 하거나 또는 건강 조절을 목적으로 하는 장기간의 섭취의 경우에는 상기 범위 이하일 수 있으며, 유효성분은 안전성 면에서 아무런 문제가 없기 때문에 상기 범위 이상의 양으로도 사용될 수 있음은 확실하다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

시험균주 및 배양조건

본 발명에 사용되어진 세 종의 기원과 종류는 표 1에 보였다. NRRL-1976, NRRL-1917는 미국의 ARS 컬쳐 콜렉션(NRRL)에서 제공되였고, 한국종균협회로부터 KCCM 12096이 제공되었다. 저장 배양은 -70℃로 유지되었다. 세균은 연속적으로 시험에 사용되어지기 전에 적절한 배지에서 세 번 배양되었다. 젖산균은 TYP 배지(16g의 박토드립톤/리터, 16g의 효모 추출액/리터, 16g의 해양 염/리터 [pH 7.5])에서 키워졌다. 1%의 접종균이 사용되었고, 배양은 혐기성 조건(10% H₂, 10% CO₂ 및 80% N₂)에서 24시간동안 37℃에서 수행되었다. 각각 균주의 접종 배양은 약 10⁹ CFU/ml의 세포 농도 및 650nm에서 흡광도가 2.00으로 지수적 성장기의 끝에서 취하여졌다. 공배양(co-culturing)은 각각 세포 현탁액의 1ml을 취하여 흡광도가 650nm에서 약 2.00 으로 혼합되어졌다.

담즙산 활성효소 역가의 정량 분석

정성적으로 담즙산 활성효소 아가 플레이트 시험이 TYP 배지에서 수행되었다. NRRL-1976, NRRL-1917, KCCM 12096 및 이들의 공배양은 각각 0.5%의 타우로콜릭산 나트륨(taurocholic acid) 및 옥스갈(oxgall)을 포하하는 TYP 아가 플레이트에서 배양되었다. 옥스갈은 인간의 장내의 환경과 유사한 조건을 만들어주기 위하여 배지에 사용되었고, 타우로콜릭산은 포합된 담즙의 원천으로 사용되었다. 배양은 시험 균주의 오버나이트 배양안에 함침되어진 멸균된 필터 디스크를 TYP 아가 플레이트에 놓음으로서 측정하였다. 배양접시는 72시간동안 37℃로 혐기적으로 배양되었고, 그 후에 침전영역(precipitation zone)의 지름이 측정되었다. 아무것도 첨가되지 않은 TYP 아가 플레이트가 대조구로 이용되었다. 각각의 균주는 3번씩 시험되었고, 가장 큰 침전영역을 보이는 균주가 선택되었다.

표 1에서 보여지듯이, B. bifidum 균주 1976과 공배양(NRRL 1976, NRRL 1917의 KCCM 12096 공배양)에서 가장 침전 지역을 보여서, TCA 및 옥스갈의 탈포화합 효과가 가장 큰 것으로 나타났다. 무균 여과지 주변의 침전 및 성장 지역은 mm 단위로 측정되었고, 효소의 분비양 및 각각의 균주의 탈포합화의 측정값으로 간주되었다. 공배양을 하였을 경우에 각각의 균주들이 생산하는 것보다 3 내지 4배 많은 양으로 담즙산 활성효소(bile salt hydrolase)가 생산되었다.

HPLC에 의한 담즙산 활성효소 역가의 측정

담즙산 활성효소의 역가 측정은 HPLC 방법을 이용하였다. TYP 브로스 배양으로부터 담즙산을 회수하기 위해, 원심분리(5℃에서 10분간 10,000g)을 통하여 10ml의 시료로부터 세포를 제거하였다. 0.45-mm 폴리설폰 필터를 통하여 여과한 후에, 0.9% NaCL 속의 0.2 M NaOH 8ml이 1ml의 여과물에 첨가되고, 혼합해주었다. 상기 용액은 셉-파카(Sep-Paka) C-18 카트리지를 통해서 통과되어졌고, 셉-파카 카트리지는 10ml의 물로 한번, 10%의 아세톤으로 한번 세척하고, 다시 10ml의 물로 세척하였다. 포합 또는 자유 담즙산은 카트리지로부터 5ml의 메탄올을 사용하여 용출되었다. 메탄올에 의한 용출액은 질소가스하에서 60℃에서 증발되어져 건조되었다. 잔유물은 1ml의 이동상에 용해되었고 0.45-mm 폴리설폰 여과지를 통해 HPLC 분석적에 여과되었다. 담즙산 활성효소의 역가는 타우로콜릭산과 옥스갈 또는 둘다가 배지로부터 사라지는 것에 기초하여 측정되었다.

TLC 분석방법

초기 정체기(stationary phase)에 있는 세포를 수확하여 0.9% NaCl를 이용하여 두 번 세척하고, 650nm에서 흡광도를 10으로 맞추었다. 이 세포 현탁액에 0.5% 인간 담즙산 혼합액; 10% 타우로콜릭산, 10% 데옥시콜릭산, 5% 담즙산 및 옥스갈 각각 10㎕을 넣어주었다. 그리고 시료가 0시간 및 60분에 채취되었다. 100 마이크로리터의 상기 샘플이 동량의 에틸아세테이트에 의해 추출되었고, 상을 분리하기 위해 원심분리되어졌다. 에틸아세테이트 상의 2 마이크로리터가 고성능 TLC판에 올려지고, 벤젠:이소프로판올:아세트산(30:1:30)으로 전개되었다. 상기 플레이트를 전개후에 건조되어지고, 95% 메탄올 용액속의 5% 황산으로 스프레이한 다음, 120℃에서 5분간 오븐에서 구웠다. 각각 균주의 활성도는 고성능 TLC판을 반응물의 스팟의 정도에 의해 측정되었다.

성장 동안에 담즙산의 탈포합화 분석

각각 0.5mg/100ml의 타우로콜릭산 나트륨 및 옥스갈이 첨가되어진 TYP 브로스(100ml)에 B. bifidum을 준비한다. 새롭게 준비되어진 B. bifidum NRRL-1976, NRRL-1917 및 KCCM-12096, 이 세 균주의 조합을 1% 배지에 접종하고 1분간 혼합해주었다. 각각의 배양으로부터 무균적으로 10ml을 연속적으로 떼어내어서 무균의 나사-마개를 가진 시험관으로 옮겨준다. 그리고 24, 32 및 48시간동안 37℃에서 항온 배양한다. 24, 32, 48시간 분석되어진다. 성장은 TYP 아가에서 플레이트 카운트로 측정된다. 시료는 또한 pH, OD(650nm) 및 담즙산에 대해 측정되어진다.

포합된 담즙산의 독성에 대한 분석

각각의 B. bifidum(NRRL-1976, NRRL-1917, KCCM 12096, 및 이들의 공배양)이 포합된 담즙산, TCA 및 옥스갈의 독성에 대항하는 능력을 시험했다. 정체기의 배양 접종원(1%)을 TCA 및 옥스갈이 각각 0.5% 첨가되어진 TYP 배양 브로스에 첨가되었따. 37℃ 혐기적조건에서 0, 24, 48, 72시간후에 시료가 수확되어져서 분석되었다. 희석되어진 분량이 TYP 아가 플레이트에 도말되어지고, 혐기적 조건 37℃에서 0, 24, 48, 72시간 동안 배양되었고, 생균수를 측정하였다.

표 2에서 보여주듯이 B. bifidum 12096이 담즙산에 가장 민감하였으며, 공배양 및 각각의 다른 균주보다 덜 자랐다.

담즙산 내성에 배양의 비교

상기 각각의 배양(공배양을 포함)을 0.5% 담즙산(TCA 및 옥스갈)가 있는 TYP 배지에서 생존 능력을 비교하였다. 혐기적 조건 37℃에서 0, 24, 48 및 72시간 동안 배양하였고, 650nm에서 흡광도의 증감을 통해서 각각의 배양에서 각각의 담즙상의 효과를 측정하였다.

표 2에서 보여주듯이, B. bifidum(12096)이 가장 담즙산에 대해 가장 민감하였고, B. bifidum 1976, 1917에 비하여 적게 생장하였다. 이 세균주의 공배양의 결과 담즙산에 대하여 상당히 높은 내성을 보였다.

콜레스테롤의 정량적 측정

균체에 흡착된 콜레스테롤 농도 측정은 루델 및 모리스의 방법(Rudel, L.L., & Morris, M.D. (1973). Journal of Lipid research 14, 364-366)을 약간 변형하여 실시하였다. 시료액 1ml에 95% 에탄올 3ml과 50% 수산화칼륨 2ml을 첨가하였다. 시험관의 내용물을 혼합하여 준 후에 60℃ 항온수조에서 10분간 가열하였다. 냉각후에 5ml의 헥산을 각각의 시험관에 넣어주고 충분히 혼합하여 준 후, 증류 1ml을 넣어주고 상온에서 상이 분리되어지도록 정치하였다. 헥산층의 3ml의 분획하여 깨끗한 시험관에 옮긴후 질소가스 아래에서 헥산을 증발시켰다. 4ml의 O-프탈알데하이드를 각각의 시험관에 넣어주고 상온에서 10분을 기다린 후, 포화된 황산 2ml을 첨가하여 주고, 10분후에 570nm에서 흡광도를 측정하였다. 흡광도를 콜레스테롤의 흡광도 표준과 비교하였다.

표 1에서는 보여주듯이 콜레스테롤과 타우콜릭산을 포함하는 TYP 배지에서 배양한 결과을 보여준다. 이 결과는 TCA가 의미있는 정도의 콜레스테롤 제거에 필요조건임을 보여준다. 타우콜릭산에서는 각각의 균주간에 큰 의미있는 차이가 보이지 않았으나 공배양인 경우에는 큰 차이를 보였다. B. bifidum 1976, 1917 및 12096, 그리고 이들의 공배양에서 24시간 후에 콜레스테롤이 제거된 비율이 각각 55, 43, 45 및 65%(공-배양)이었고, 32시간 후에는 각각 60, 45, 50 및 80%(공-배양)이었다. 일부의 콜레스테롤이 세척 완충용액에 각각 29, 28, 25, 및 35%에 재용해 되었으며, 상당한 정도의 콜레스텔로이 세포내에 24시간 후에 세포내에 유지(각각 20, 19, 12, 및 29%) 되었다. 이것으로 보아서 배양액으로부터 콜레스테롤의 제거는 탈포합된 담즙산와 콜레스테롤의 공침전에 의해서 제거되는 것으로 볼 수 있다. 콜레스테롤의 침전은 세포의 담즙산 활성효소의 활성으로 인하여 타우콜릭산으로부터 콜릭산의 모이어티가 떨어져 나와서 침전되는 것으로 보였다(도 1 및 도 2 참조). 타우콜릭산이 B.bifidum에서 가장 효율적인 담즙산이었다.

담즙산의 탈포합화 속도를 측정하기 위하여 HPLC를 이용해 분석되어졌다(도 1 및 2 참조) 타우콜릭산 나트륨은 모든 균주에 의해서 모두 탈포합화 되었으며, 균주 72시간 동안 타투콜릭 나트륨의 플레이트 검정 시험에서 균주 1976은 81%, 균주 1917은 71%, 균주 12096은 65% 탈포합하였으나, 공-배양한 경우에는 95-98% 탈포합화 되었다. 균주 1976에 대한 옥스갈 하이드롤라아제 활성은 78.4%이었고, 균주 1917에 대해서는 58.8%이었고, 균주 12096에 대해서는 74.8%이었다. 반면에 공-배양한 경우에는 옥스갈 하이드롤라아제 활성도가 85%이었다. 때문에 콜레스테롤의 시험관내에서의 제거는 세포의 담즙산 활성효소에 연관되어져 있으며, 콜레스테롤의 침전을 일으키는 탈포합된 담즙산을 분비하는 것으로 보인다.

표 1은 상층액, 세척액, 세포에서 측정되어진 콜레스테롤의 퍼센티지이다. 모든 실험은 3배수로 시행되었고, 적어도 두 경우가 시행되었다. 평균±표준편차가 표시되어졌고, 성장하는 세포는 0.1mg/ml의 콜레스테롤과 타우로콜릭산 5mg/ml 또는 5mg/ml을 포함하는 MRS 배지에서 24시간 동안 항온배양 되었다.

표 2는 첨가되는 담즙산의 독성을 알아보기 위해 0.5g/100ml 담즙산(B) ,타우로콜릭산(TCA), 콜릭산(CA), 옥스갈(OX)이 첨가되어진 TYP 배지에서 각각의 균주 및 공배양(co-culturing) B. bifidium의 생존 및 평균 (± 표준편차)을 보여준다.

표 3은 비피도박테리움이 TCA 하이드롤라아제 및 옥스갈 하이드롤라아제 활성을 보이는지 플레이트 시험 분석을 보여준다.

[표 1] 상층액, 세척액, 세포에서 측정되어진 콜레스테롤의 퍼센티지

*각기 다른 분획에서의 콜레스테롤의 양은 배지내에 개시 농도에 대한 퍼센티지로 표현되었다.

† 콜레스테롤 용액과 담즙산(옥스갈 또는 타우로콜릭산)은 세포없이 항원배양되었고, 그 후에 각기 다른 분획에서의 콜레스테롤의 양을 측정하였다.

[표 2] 첨가되는 담즙산의 독성을 알아보기 위해 0.5g/100ml 담즙산(B) ,타우로콜릭산(TCA), 콜릭산(CA), 옥스갈(OX)이 첨가되어진 TYP 배지에서 각각의 균주 및 공배양(co-culturing) B. bifidum의 생존 및 평균

[표 3] 비피도박테리움이 TCA 하이드롤라아제 및 옥스갈 하이드롤라아제 활성을 보이는지 플레이트 시험 분석

Dp: 침전되어지는 영역의 지름; g: 성장을 나타냄.; p: TCA 하이드롤라이제 활성이 있음.; 각각의 값은 콜릭산(탈포합 활성도;TCA 및 옥스갈을 0.5%의 농도로 포함하는 TYP 배지에서 0, 24, 32, 48시간동안의 세균집단의 성장을 관찰하여 얻어짐)의 침전을 나타낸다. TCA-타우로콜릭산(포합된 담즙산), 옥스갈-(탈수소화된 담즙산) 침전을 보이지 않는 네가티브 분석.

상기에서 살펴본 바와 같이, 본 발명의 비피도박테리움 비피둠으로 이루어진 그룹에서 선택된 종의 공배양은 담즙산 활성효소 생산을 증가시켰다. 상기 담즙산 활성효소에 의하여 콜레스테롤이 탈포합화 됨으로써 콜레스테롤 흡수가 방해되어 음식물 섭취에 의한 혈중 콜레스테롤 증가를 크게 감소시킬 수 있었고, 경구투여시 독성이 나타나지 않고 분자생물학적 시험에서도 병원성 인자 등이 확인되지 않아 안전하게 콜레스테롤 저하효능을 특징으로 하는 발효유, 건강보조식품 및 의약품 등에 유용하게 사용될 수 있다.

Claims

비피도박테리움 비피둠 NRRL-1976, NRRL-1917 및 KCCM-12096으로 이루어진 그룹에서 선택된 두(2) 종을 공배양(co-culturing)하여 담즙산 활성효소 생산 증가시키는 방법.
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비피도박테리움 비피둠 NRRL-1976, NRRL-1917 및 KCCM-12096으로 이루어진 그룹에서 선택된 두(2) 종을 포함하여 비피도박테리움 비피둠이 공배양되도록 하는 담즙산 활성 효소 생산 증가제.
비피도박테리움 비피둠 NRRL-1976, NRRL-1917 및 KCCM-12096으로 이루어진 그룹에서 선택된 두(2) 종을 포함하여 비피도박테리움 비피둠이 공배양되도록 하는 담즙산 활성 효소 생산 증가제를 포함하는 캡슐제제.
비피도박테리움 비피둠NRRL-1976, NRRL-1917 및 KCCM-12096으로 이루어진 그룹에서 선택된 두(2) 종을 포함하여 비피도박테리움 비피둠이 공배양되도록 하는 담즙산 활성 효소 생산 증가용 식품.
제 5 항에 있어서, 상기 식품은 발효유, 요구르트, 음료수, 우유 음료, 식품첨가물 및 건강보조식품으로 구성되는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 식품.