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KR100655669B1 - 전기 영동용 버퍼 - Google Patents

전기 영동용 버퍼 Download PDF

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KR100655669B1
KR100655669B1 KR1020047014473A KR20047014473A KR100655669B1 KR 100655669 B1 KR100655669 B1 KR 100655669B1 KR 1020047014473 A KR1020047014473 A KR 1020047014473A KR 20047014473 A KR20047014473 A KR 20047014473A KR 100655669 B1 KR100655669 B1 KR 100655669B1
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electrophoresis
polymer
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polymer compound
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요시노부 바바
가즈노리 가따오까
마리 다부찌
유끼오 나가사끼
야스꼬 다나까
지에 구와하라
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도꾸리쯔교세이호징 가가꾸 기쥬쯔 신꼬 기꼬
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Abstract

HPLS-HPBS-PLZA (HPLS 는 친수성 폴리머 세그먼트를 나타내고, HPBS 는 소수성 폴리머 세그먼트를 나타내고, PLZA 는 에틸렌성 불포화 2중 결합을 갖는 중합성기를 나타냄) 로 표시되는 블록 코폴리머를 수성 매체 중에 분산시키고, 이어서 중합시킴으로써 형성된 중합 고분자 마이셀을 함유시킨 것을 캐필러리 전기 영동, 마이크로칩형 전기 영동의 버퍼로서 사용하고, 샘플을 도입한 후 소정 압력으로 소정 시간 가압한 후 영동 전기장에서 전기 영동함으로써 DNA 등의 고분자 화합물을 신속하게 높은 분해능으로 분리하는 것이 가능해진다.

Description

전기 영동용 버퍼{ELECTROPHORETIC BUFFER}
본 발명은, 고분자 화합물을 신속하게 높은 분리능으로 분리할 수 있는 영동용 버퍼 및 전기 영동법에 관한 것이다.
기존의 전기 영동용 버퍼는 한정된 사이즈에 대한 분리능에 대해서는 우수하지만, 점도가 높은 폴리머 (메틸셀룰로오스, 히드록실셀룰로오스, 폴리아크릴아미드 등) 를 사용하고 있기 때문에, 1) 마이크로 채널에 버퍼를 주입하는 데 시간이 걸리고, 2) 채널폭이 좁아짐에 따라 주입이 곤란하며, 3) DNA 의 사이즈에 따라 폴리머 농도를 바꿀 필요가 있어 광범위한 DNA 사이즈 분리에 대하여 분리도의 한계가 있으며, 4) 버퍼 점도가 온도에 민감하다는 등의 결점이 있었다. 따라서, 상기 1)∼4) 의 문제점을 갖지 않고 신속하게 높은 분리능으로 고분자 화합물을 분리할 수 있는 전기 영동용 버퍼가 요망되고 있다. 또한, 신속하게 높은 분리능으로 고분자 화합물을 분리할 수 있는 전기 영동법이 요망되고 있다.
본 발명은, 신속하게 높은 분리능으로 고분자 화합물을 분리할 수 있는 전기 영동용 버퍼 및 전기 영동법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
즉, 본 발명의 요지는,
[1] 일반식 (1) :
HPLS-HPBS-PLZA (1)
(식 중 HPLS 는 친수성 폴리머 세그먼트를 나타내고, HPBS 는 소수성 폴리머 세그먼트를 나타내고, PLZA 는 에틸렌성 불포화 2중 결합을 갖는 중합성기를 나타냄),
로 표시되는 블록 코폴리머를 수성 매체 중에 분산시키고, 이어서 중합시킴으로써 형성된 중합 고분자 마이셀을 함유하여 이루어지는 전기 영동용 버퍼,
[2] 상기 [1] 에 기재된 전기 영동용 버퍼의 존재 하에서, 고분자 화합물을 함유한 시료를 영동하는 것을 특징으로 하는 전기 영동법,
[3] (a) 1∼30㎸, 1∼60초에서의 전기적 주입 또는 0.2∼5kPa, 2∼60초의 가압 주입에 의해, 고분자 화합물을 함유한 시료를 캐필러리에 인젝트하고 고분자 화합물의 분리가 가능한 영동 전기장 밑으로 그 고분자 화합물을 이동시키는 공정, 및
(b) 0.2∼10kPa, 2∼60초로 가압한 후 영동 전기장에 의해 그 고분자 화합물을 영동시키는 공정,
을 포함하는 캐필러리 전기 영동법,
[4] 로딩 채널과, 그 로딩 채널에 교차하는 분리용 채널을 구비하고, 또한 그 로딩 채널의 일단에 시료 저장소가 배치되며, 그 로딩 채널의 다른 말단 (他端)에 아웃렛이 배치된 마이크로칩에 있어서,
(a) 고분자 화합물을 함유하는 시료를 그 시료 저장소에 제공하는 공정,
(b) 그 로딩 채널을 5.5∼7kPa 로 0.1∼5초 가압함으로써 그 시료 저장소 중 그 고분자 화합물을 로딩 채널과 분리용 채널의 교차부에 영동시키는 공정, 및
(c) 분리용 채널을 1∼10pKa 로 1∼5초 가압하고, 이어서 영동 전기장에 의해 그 고분자 화합물을 분리용 채널 내에서 영동시키는 공정,
을 포함하는 마이크로칩형 전기 영동법,
에 관한 것이다.
도면 중에서 사용하는 부호는 이하를 나타낸다.
1 : 100bp 의 DNA 의 피크
2 : 200bp 의 DNA 의 피크
3 : 300bp 의 DNA 의 피크
4 : 400bp 의 DNA 의 피크
5 : 500bp 의 DNA 의 피크
6 : 600bp 의 DNA 의 피크
7 : 700bp 의 DNA 의 피크
8 : 800bp 의 DNA 의 피크
9 : 900bp 의 DNA 의 피크
10 : 1 kbp 의 DNA 의 피크
11 : 1.1 kbp 의 DNA 의 피크
12 : 1.2 kbp 의 DNA 의 피크
13 : 1.3 kbp 의 DNA 의 피크
14 : 1.4 kbp 의 DNA 의 피크
15 : 1.5 kbp 의 DNA 의 피크
도 1 은 마이크로칩형 전기 영동에 있어서, 영동 조건을 검토한 결과를 나타내는 도면이다.
도 2 는 마이크로칩형 전기 영동에 있어서, 영동 조건을 검토한 결과를 나타내는 도면이다.
도 3 은 마이크로칩형 전기 영동에 있어서, 영동 조건을 검토한 결과를 나타내는 도면이다.
도 4 는 마이크로칩형 전기 영동에 있어서, 영동 조건을 검토한 결과를 나타내는 도면이다.
도 5 는 마이크로칩형 전기 영동에 있어서, 영동 조건을 검토한 결과를 나타내는 도면이다.
도 6 은 마이크로칩형 전기 영동에 있어서, 영동 조건을 검토한 결과를 나타내는 도면이다.
도 7 은 마이크로칩형 전기 영동에 있어서, 영동 조건을 검토한 결과를 나타내는 도면이다.
도 8 은 마이크로칩형 전기 영동에 있어서, 영동 조건을 검토한 결과를 나타내는 도면이다.
도 9 는 마이크로칩형 전기 영동에 있어서, 영동 조건을 검토한 결과를 나타 내는 도면이다.
도 10 은 마이크로칩형 전기 영동에 있어서, 영동 조건을 검토한 결과를 나타내는 도면이다.
도 11 은 마이크로칩형 전기 영동에 있어서, 영동 조건을 검토한 결과를 나타내는 도면이다.
도 12 는 마이크로칩형 전기 영동에 있어서, 영동 조건을 검토한 결과를 나타내는 도면이다.
도 13 은 마이크로칩형 전기 영동에 있어서, 영동 조건을 검토한 결과를 나타내는 도면이다.
도 14 는 마이크로칩형 전기 영동에 있어서, 영동 조건을 검토한 결과를 나타내는 도면이다.
도 15 는 마이크로칩형 전기 영동에 있어서, 영동 조건을 검토한 결과를 나타내는 도면이다.
도 16 은 마이크로칩형 전기 영동에 있어서, 영동 조건을 검토한 결과를 나타내는 도면이다.
도 17 은 마이크로칩형 전기 영동에 있어서, 영동 조건을 검토한 결과를 나타내는 도면이다.
도 18 은 마이크로칩형 전기 영동에 있어서, 영동 조건을 검토한 결과를 나타내는 도면이다.
도 19 는 마이크로칩형 전기 영동에 있어서, 영동 조건을 검토한 결과를 나 타내는 도면이다.
도 20 은 마이크로칩형 전기 영동에 있어서, 영동 조건을 검토한 결과를 나타내는 도면이다.
도 21 은 마이크로칩형 전기 영동에 있어서, 영동 조건을 검토한 결과를 나타내는 도면이다.
도 22 는 마이크로칩형 전기 영동에 있어서, 영동 조건을 검토한 결과를 나타내는 도면이다.
도 23 은 마이크로칩형 전기 영동에 있어서, 영동 조건을 검토한 결과를 나타내는 도면이다.
도 24 는 마이크로칩형 전기 영동에 있어서, 영동 조건을 검토한 결과를 나타내는 도면이다.
도 25 는 마이크로칩형 전기 영동에 있어서, 영동 조건을 검토한 결과를 나타내는 도면이다.
도 26 은 마이크로칩형 전기 영동에 있어서, 영동 조건을 검토한 결과를 나타내는 도면이다.
[실시예]
(발명을 실시하기 위한 최선의 형태)
본 발명의 전기 영동용 버퍼는, 일반식 (1) :
HPLS-HPBS-PLZA (1)
(식 중 HPLS 는 친수성 폴리머 세그먼트를 나타내고, HPBS 는 소수성 폴리머 세그먼트를 나타내고, PLZA 는 에틸렌성 불포화 2중 결합을 갖는 중합성기를 나타냄),
로 표시되는 블록 코폴리머를 수성 매체 중에 분산시키고, 이어서 중합시킴으로써 형성된 중합 고분자 마이셀을 함유하는 것을 하나의 큰 특징으로 한다.
본 발명의 전기 영동용 버퍼는, 종래의 캐필러리 전기 영동이나 마이크로칩형 전기 영동에 통상 사용되어 온 버퍼와 비교하여 저점도라는 특징이 있다. 그 때문에, 마이크로 채널이나 캐필러리에 버퍼를 부드럽게 주입할 수 있고, 버퍼 주입 시간을 단축할 수 있다는 이점이 있다. 또한 채널폭이 좁아져도 버퍼 주입이 용이하다. 본 발명의 버퍼는, 종래 고점도의 버퍼만으로 해석할 수 있다고 여겨지던 저염기 사이즈 (예를 들어 2∼200bp 등) 의 핵산에 대해서도 재현성 좋게 해석할 수 있다. 종래의 버퍼는 각 핵산의 사이즈에 따라 버퍼의 점도를 변경해야 하였지만, 본 발명의 버퍼는 핵산의 광범위한 사이즈에 대해 사용 가능하기 때문에, 동시에 다른 사이즈의 핵산의 해석이 가능하다. 또, 본 발명의 버퍼는 온도에 의한 점도변화의 문제에 좌우되는 일이 없고, 기온이나 실온에 의한 일간 오차를 잘 발생시키지 않는다는 이점이 있다.
또, 본 명세서에 있어서 고분자 화합물로는, 단백질, 펩티드, 아미노산, 당류, 다당류, 핵산 (예를 들어, DNA, RNA 등) 등을 들 수 있다. 상기 핵산은 한 가닥 사슬이어도 되고 두 가닥 사슬이어도 된다.
상기 일반식 (1) 중 HPLS-HPBS (친수성 폴리머 세그먼트 - 소수성 폴리머 세그먼트) 로 이루어지는 부분은, 그 자체가 수성 매체 중에서 고분자 마이셀을 형성 하는 것이라면 각각의 세그먼트를 구성하는 폴리머의 종류 (예를 들어 중합도, 원료 모노머 등) 에 상관없다. 따라서, 본 명세서에서 「폴리머」라는 말은 올리고머를 포함하는 개념으로 사용된다.
상기 일반식 (1) 중 HPLS-HPBS 부분에서는, 소수성 폴리머 세그먼트 말단 (HPLS 와의 결합의 반대측) 에 기 PLZA, 즉 에틸렌성 불포화 2중 결합을 갖는 중합성기가 공유 결합되어 있다. 이러한 관능기는 HPLS-HPBS 부분의 마이셀 형성능에 악영향을 미치지 않는 것이라면 어느 관능기이어도 된다.
한정되는 것은 아니지만, HPLS 를 구성하는 폴리머로는 폴리에틸렌글리콜, 폴리비닐알코올, 폴리(메트)아크릴산, 폴리비닐피리딘, 폴리아크릴아미드, 폴리디메틸아크릴아미드 및 폴리메틸비닐에테르 등을 들 수 있고, HPBS 를 구성하는 폴리머로는 폴리락티드, 폴리글리콜리드, 폴리(부티로락톤), 폴리(발레로락톤), 폴리프로필렌글리콜, 폴리(α-아미노산), 폴리(메타크릴산메틸), 폴리(메타크릴산에틸), 폴리스티렌, 폴리(α-메틸스티렌), 폴리이소프렌, 폴리부타디엔, 폴리에틸렌, 폴리프로필렌 및 폴리아세트산비닐을 들 수 있다.
이들 중에서 HPLS 로는 마이셀 형성능의 관점에서 폴리에틸렌글리콜이 특히 바람직하다. 또한, HPBS 로는, 마이셀 형성능의 관점에서 폴리락티드가 특히 바람직하다.
상기 PLZA 로는 수성 매체 중에서 중합할 수 있는 것이면 되고, 예를 들어 (메트)아크릴로일, 크로틸, 비닐카르보닐아미노(CH2 = CHCONH- ; 아크릴아미드기), 이소프로페닐카르보닐아미노[CH2 = C(CH3)CONH- ; 메타크릴아미드기], 비닐록시카르보닐(CH2 = CHOCO-), p-비닐벤질(CH2 = CH-C6H4-CH2-), p-이소프로페닐벤질(CH2 = C(CH3)-C6H4-CH2-), p-이소프로페닐페닐(CH2 = CH-CH 2-) 및 비닐(CH2 = CH-)기 등을 들 수 있다.
이들 중에서 PLZA 로는, 안정된 중합형성의 관점에서 (메트)아크릴로일이 특히 바람직하다.
일반식 (1) 로 나타내는 블록 코폴리머의 구체예로는, 메톡시-폴리에틸렌글리콜/폴리락티드-메타아크릴로일, 메톡시-폴리비닐알코올/폴리글리코시드-크로틸, 메톡시-폴리(메트)아크릴산/폴리부틸락톤-비닐록시카르보닐메톡시-폴리아크릴아미드/폴리스티렌-p-비닐벤질을 들 수 있다. 상기 구체예 중에서도 안정된 마이셀 형성의 관점에서 메톡시-폴리에틸렌글리콜/폴리락티드-메틸아크릴로일이 특히 바람직하다.
이들 일반식 (1) 로 나타내는 블록 코폴리머는, 그 자체가 이미 알려진 어떤 방법에 의해 제조된 것이면 되지만, 바람직하게는 각각 대응하는 모노머를 사용하여 이른바 리빙 아니온 중합에 의해 먼저 HPLS 를 형성하고, 그대로의 반응계에 HPBS 에 대응하는 모노머를 중합시키고, 다시 에틸렌성 불포화 2중 결합을 갖는 할로겐화물, 산무수물을 가하고 PLZA 기를 도입함으로써 제조할 수 있다. 이러한 중합법은, 각 세그먼트가 원하는 분자량을 갖는 블록 코폴리머를 제조하기에 적합하다. 구체적으로 블록 코폴리머의 분자량은, HPLS 는 500∼50,000, 바람직하 게는 3,000∼8,000 이고, HPBS 는 500∼80,000, 바람직하게는 3,000∼8,000 이다. 또, 이들 각 세그먼트의 분자량은 겔 투과형 크로마토그래피에 의해 측정할 수 있다.
이렇게 하여 제조되는 일반식 (1) 의 블록 코폴리머는, 수성 매체 (예를 들어 물 또는 적당한 완충제로 완충화한 수용액) 에 어떤 일정 농도로 분산됨으로써 고분자 마이셀을 형성할 수 있다.
이러한 마이셀을 형성하는 데에 있어서 알맞은 각 세그먼트의 분자량은, 친수성 폴리머쇄 및 소수성 폴리머쇄의 종류 및 이들 사슬의 조합에 의해 변동되므로 한정할 수 있는 것은 아니다. 그러나, 당업자라면 과도한 실험을 요하지 않고 블록 코폴리머를 현실적으로 조제하여 이들의 마이셀 형성능을 평가함으로써, 최적의 각 세그먼트의 분자량을 결정할 수 있다. 특히 바람직한 태양인 폴리에틸렌글리콜 (또는 폴리옥시에틸렌) 을 친수성 폴리머 세그먼트에 갖고 폴리락티드를 소수성 폴리머 세그먼트에 갖는 블록 코폴리머를 예로 하면, 전자의 분자량은 일반적으로 500∼50,000, 바람직하게는 3,000∼8,000, 특히 바람직하게는 5,500∼6,500 이고, 후자의 분자량은 일반적으로 500∼80,000, 바람직하게는 3,000∼8,000, 특히 바람직하게는 4,000∼4,500 이다.
본 발명에 따르면, 이상과 같이 하여 얻어지는 고분자 마이셀은, 반응혼합액의 상태 또는 반응혼합액으로부터 단리한 후 다시 수성 매체에 현탁시킨 상태로, 적당한 중합개시제의 존재하에서 소수성 폴리머 세그먼트의 말단에 공유 결합한 에틸렌성 불포화 2중 결합을 갖는 중합성기를 이용하여 중합시킴으로써 중합 고분자 마이셀을 제조할 수 있다. 중합개시제로는, 상기 중합성기를 수성 매체 중에서 중합시킬 수 있는 것이라면 그 종류에 상관없이 이용할 수 있으나, 일반적으로 라디칼 중합 개시제를 사용하는 것이 좋다. 이러한 개시제로는, 과산화물, 아조 화합물이나 레독스 개시제를 들 수 있다. 또, 상기 중합은 광이나 방사선을 사용하여 개시시킬 수도 있다.
본 발명의 전기 영동용 버퍼에는, 일반식 (1) 로 나타내는 블록 코폴리머에 저분자 중합성 모노머를 더 추가하여 중합시킴으로써 형성된 중합 고분자 마이셀도 또한 바람직하게 사용할 수 있다. 이 태양에서는, 일반식 (1) 로 나타내는 블록 코폴리머에 저분자 중합성 모노머 (예를 들어, 스티렌, (메트)아크릴산메틸, 아세트산비닐, α-c 메틸스티렌, 디알킬(메트)아크릴아미드, 메틸렌비스아크릴아미드, 에틸렌글리콜비스(메트)아크릴레이트 등) 를 가하여 중합함으로써 중합 고분자 마이셀을 효율적으로 제조할 수 있다는 이점이 있다.
이렇게 하여 얻어지는 중합 고분자 마이셀은, 전구 고분자 마이셀의 형상을 거의 그대로 유지하고, 또한 수성 매체 중의 어떠한 농도에서도 마이셀의 형태를 안정적으로 유지할 수 있어, 전기 영동용 버퍼에서 사용하기에 적합하다.
본 발명의 전기 영동용 버퍼에서의 본 발명의 중합 고분자 마이셀의 함유량은, 측정물질의 높은 분리능을 얻는 관점에서 1∼20㎎/㎖, 보다 바람직하게는 5∼10㎎/㎖ 이다.
상기 마이셀을 희석하기 위한 희석액으로는, 물, 트리스-글리신 버퍼, 트리스-글리신 버퍼, 트리스-붕산 버퍼, 트리스-염산 버퍼, 트리스-트리신 버퍼, 트리 스-인산-수소나트륨 버퍼, 트리스-붕산-EDTA 버퍼 등, 일반적으로 고분자 화합물의 전기 영동용 완충액으로 사용되는 완충액을 들 수 있다. 희석용 물 또는 완충 버퍼를 조제하기 위한 물은 초순수, 탈이온수, MilliQ 수 등 통상 전기 영동에 사용되는 물이 사용되지만, MilliQ 수가 특히 바람직하다.
피검 고분자 화합물이 단백질이나 펩티드인 경우, 상기 일반식 (1) 의 블록 코폴리머에 더하여 도데실황산나트륨(SDS) 이나 펩티드인 경우, TritonX-100, ε-아미노카프론산, 3-(C3-코라미드프로필)-디메틸아미노)-1-프로판, CHAPS, 6∼8M 우레아, 테트라메틸에틸렌디아민(TEMED), 헥실트리메틸암모늄브로마이드(HTAB) 등을 첨가할 수 있다.
본 발명의 전기 영동용 버퍼의 pH 는, 바람직한 전기 영동과 정상인 피크분리의 관점에서, 피검 고분자 화합물이 단백질인 경우 2∼9 가 바람직하고, 6.8∼8.6 이 보다 바람직하다. 피검 고분자 화합물이 펩티드인 경우 2∼11 이 바람직하고, 2.5∼3.1 이 보다 바람직하다. 피검물이 핵산인 경우, 바람직한 전기 영동과 정상인 피크분리의 관점에서 6.8∼9.2 가 바람직하고, 7.5∼8.5 가 보다 바람직하다.
본 발명의 전기 영동용 버퍼는, 본 발명의 중합 고분자 마이셀을 상기 기재된 희석용 버퍼로 적절히 희석하고, 다시 수산화 나트륨이나 상기 기재된 완충액으로 pH 를 조정함으로써 조제된다.
본 발명의 전기 영동법으로는, 상기 전기 영동용 버퍼의 존재 하에서 고분자 화합물을 함유한 시료를 영동하는 것을 특징으로 하는 방법을 들 수 있다. 여 기서, 전기 영동의 형태로는 특별히 한정되지 않고 여러 가지의 형태에 적용할 수 있지만, 그 중에서도 캐필러리 전기 영동, 마이크로칩형 전기 영동 또는 나노채널형 전기 영동에 특히 바람직하게 사용된다.
본 발명의 전기 영동법은, 보다 구체적으로는 캐필러리 전기 영동에 있어서,
(a) 고분자 화합물을 함유한 시료를 캐필러리에 인젝트하고 고분자 화합물의 분리가 가능한 영동 전기장 밑으로 그 시료를 이동시키는 공정, 및
(b) 캐필러리 내를 가압하고 이어서 영동 전기장에 의해 고분자 화합물을 영동시키는 공정,
을 포함한다.
시료를 캐필러리에 인젝트하고 고분자 화합물의 분리가 가능한 영동 전기장 밑으로 고분자 화합물을 이동시키는 공정은 보다 구체적으로는 전압법, 가압법, 낙차법에 의해 실시되는데, 장치의 종류나 캐필러리의 굵기 (내경) 나 길이 등에 따라 전압이나 가하는 압력의 크기 및 그에 제공하는 시간이 적절히 정해지지만, 분리를 고속으로 하고 높은 분리능을 얻어, 더 고감도인 검출을 달성하는 관점에서, 1∼30㎸, 1∼60초에서의 전기적 주입 또는 가압 주입, 바람직하게는 0.2∼5kPa, 보다 바람직하게는 1kPa 으로 가압 주입에 의해 고분자 화합물을 함유한 시료를 캐필러리에 인젝트하고 고분자 화합물의 분리가 가능한 영동 전기장 밑으로 그 시료를 이동시키는 것이 특히 바람직하다. 여기서, 상기 가압은 바람직하게는 2∼60초, 보다 바람직하게는 5∼10초, 특히 바람직하게는 7∼8초 실시하는 것이 바람직하다. 그 후, 높은 분리능을 유지한 상태로 고속 분리를 달성시키는 관점에서, 영동 전기장에 의해 고분자 화합물을 영동시키는 공정 전에 가압, 바람직하게는 0.2∼10kPa, 보다 바람직하게는 1kPa 로 가압하는 것이 바람직하다. 여기서, 상기 가압은 바람직하게는 2∼60초, 보다 바람직하게는 5∼10초, 특히 바람직하게는 7∼8초 실시하는 것이 바람직하다.
또, 본 명세서에 있어서 캐필러리 전기 영동에서의 압력단위 (kPa) 는 시료 주입구에서 가압하는 힘을 의미한다.
캐필러리 전기 영동에 사용되는 캐필러리에 있어서, 내경, 외경, 전체길이, 유효길이는 특별히 한정되는 것이 아니라, 통상 사용되는 사이즈의 것을 사용할 수 있다. 유효길이에 관해, 고속의 해석을 가능하게 하는 관점에서 짧은 유효길이의 캐필러리를 사용할 수 있다. 여기서, 캐필러리의 유효길이란 시료 주입구에서 검출부까지의 거리를 말한다.
캐필러리 전기 영동에서의 영동 전기장은, 양호한 분리능을 얻고 이동시간을 단축하는 관점에서 바람직하게는 20V/㎝∼10㎸/㎝ 이고, 보다 바람직하게는 50V/㎝∼5㎸/㎝ 이며, 특히 바람직하게는 100V/㎝∼1㎸/㎝ 인 것이 바람직하다.
마이크로칩형 전기 영동에서는, 로딩 채널과, 그 로딩 체널에 교차하는 분리용 채널을 구비하고, 또 그 로딩 채널의 일단에 시료 저장소가 배치되며, 그 로딩 채널의 다른 말단에 아웃렛이 배치된 마이크로칩이 사용된다.
본 발명의 전기 영동법은, 마이크로칩형 전기 영동에서는 구체적으로는
(a) 고분자 화합물을 함유하는 시료를 시료 저장소에 제공하는 공정,
(b) 그 시료 저장소 중의 고분자 화합물을 가압에 의해 로딩 채널과 분리용 채널의 교차부에 영동시키는 공정, 및
(c) 그 분리용 채널을 가압하고, 이어서 그 분리용 채널 내에서 고분자 화합물을 영동시키는 공정,
을 포함한다.
시료 저장소에 시료를 제공하는 공정은, 보다 구체적으로는 시료 저장소에 바람직하게는 1∼10㎕, 보다 바람직하게는 2∼5㎕ 의 시료를 로딩함으로써 달성된다.
시료 저장소 중 시료를 로딩 채널과 분리용 채널의 교차부에 영동시키는 공정은, 보다 구체적으로는 충분한 검출감도를 얻는 관점에서, 아웃렛에 영동용 완충액을 세팅하지 않은 조건 하에서 시료를 시료 저장소로부터 가압, 바람직하게는 3∼7kPa, 보다 바람직하게는 5∼7kPa, 특히 바람직하게는 5.5∼7kPa 로 가압함으로써 로딩 채널과 분리용 채널의 교차부에 시료를 영동시키는 것이 바람직하다. 여기서, 상기 가압은 바람직하게는 0.1∼5초, 보다 바람직하게는 0.5∼2초, 특히 바람직하게는 1초 실시하는 것이 바람직하다.
또, 본 명세서에 있어서, 마이크로칩형 전기 영동에서의 압력단위 (kPa) 는 분리용 채널의 압력부하구에서 가압하는 힘을 의미한다.
분리용 채널 내에서 시료를 영동시키는 공정은, 보다 구체적으로는 보다 고속으로 고분리능을 얻는 관점에서 분리용 채널을 가압, 바람직하게는 1∼10kPa, 보다 바람직하게는 3.5∼10kPa, 특히 바람직하게는 5∼7kPa 로 가압하고, 이어서 시료를 영동전압에 의해 영동시키는 것이 바람직하다. 여기서, 상기 가압은 바람 직하게는 0.1∼5초, 보다 바람직하게는 0.5∼2초, 특히 바람직하게는 1초 실시하는 것이 바람직하다.
마이크로칩의 재질로는, 예를 들어 석영유리, 붕규산유리, 소다유리, 폴리메틸메타크릴레이트, 폴리카보네이트, 디메틸실록산 등을 들 수 있다. 그 중에서도, 시료의 흡착이 적고 칩 가공이 용이한 관점에서 유리, 또는 폴리메틸메타크릴레이트가 바람직하다. 또한, 캐필러리와 같이 내벽을 가공처리한 것도 사용된다.
마이크로칩형 전기 영동에 있어서는, 마이크로칩의 크기는 예를 들어 세로 10∼120㎜, 가로 10∼120㎜, 두께 500∼5000㎛ 이다.
마이크로칩에서의 로딩 채널 및 분리용 채널의 각 형상은 특별히 한정되는 것은 아니다. 또, 상기 채널이 한 장의 칩 위에 3∼96개 설치된, 동시에 다채널을 해석할 수 있는 칩을 사용할 수도 있다. 다채널의 배열법은 병행, 방사선형, 원형 등이 있지만, 그 형상은 특별히 한정되는 것은 아니다.
상기 채널의 폭은, 마이크로칩의 크기, 사용목적 등에 따라 적절히 설정될 수 있다. 구체적으로는, 채널 폭은 충분한 해석감도를 얻는 관점에서, 0.1㎛ 이상, 바람직하게는 10㎛ 이상이고, 충분한 해석정밀도를 얻는 관점에서 100㎛ 이하, 바람직하게는 50㎛ 이하인 것이 바람직하다. 또한, 상기 채널의 깊이는 마이크로칩의 크기, 사용목적 등에 따라 적절히 설정될 수 있다. 구체적으로는, 충분한 해석감도를 얻는 관점에서 0.1㎛ 이상, 바람직하게는 10㎛ 이상이고, 충분한 해석정밀도를 얻는 관점에서 100㎛ 이하, 바람직하게는 50㎛ 이하인 것이 바람 직하다. 또한, 상기 분리용 채널의 길이는 마이크로칩의 크기, 해석대상인 화합물에 따라 적절히 선택할 수 있지만, 유효길이를 보다 길게 하는 것이 바람직하다. 유효길이는, 채널교차부에서 고분자 화합물의 검출점 (분리용 채널 상에 배치) 까지의 거리를 말한다. 충분한 분리능을 얻는 관점에서, 0.1㎜ 이상, 바람직하게는 10㎜ 이상이고, 고속분리의 관점에서 100㎜ 이하, 바람직하게는 50㎜ 이하인 것이 바람직하다.
또, 상기 저장소의 크기는 시료의 용량에 따라 적절히 설정할 수 있다. 구체적으로는 시료 도입의 핸들링 및 전극 굵기의 관점에서, 지름 0.05㎜ 이상, 바람직하게는 3㎜ 이하인 것이 바람직하다.
마이크로칩형 전기 영동에서의 영동 전기장은, 양호한 분리능을 얻고 이동시간을 단축하는 관점에서, 20V/㎝∼50㎸/㎝ 이고, 보다 바람직하게는 50V/㎝∼5㎸/㎝ 이고, 특히 바람직하게는 100V/㎝∼1㎸/㎝ 인 것이 바람직하다.
마이크로칩형 전기 영동에 있어서, 인젝션할 때의 시료의 양 (농도) 은, 양호한 분리능을 얻는 관점에서 시료가 펩티드 또는 단백질인 경우 0.1ng/㎖∼1g/㎖ 이고, 바람직하게는 10ng/㎖∼100㎎/㎖ 이고, 보다 바람직하게는 0.1㎍/㎖∼10㎎/㎖ 인 것이 바람직하다. 상기 시료가 당 또는 다당인 경우, 인젝션할 때의 시료의 양 (농도) 은, 양호한 분리능을 얻는 관점에서, 시료가 펩티드 또는 단백질인 경우, 0.1㎍/㎖∼10g/㎖ 이고, 바람직하게는 1㎎/㎖∼5g/㎖ 이고, 보다 바람직하게는 100㎎/㎖∼1g/㎖ 인 것이 바람직하다. 상기 시료가 핵산인 경우, 인젝션할 때의 시료의 양 (농도) 은 양호한 분리능을 얻는 관점에서, 시료가 펩티드 또는 단 백질인 경우 0.1ng/㎖∼500㎍/㎖ 이고, 바람직하게는 10ng/㎖∼100㎍/㎖ 이고, 보다 바람직하게는 100ng/㎖∼50㎍/㎖ 인 것이 바람직하다.
나노채널형 전기 영동이란, 나노미터 사이즈, 1nm∼1㎛, 바람직하게는 10∼500㎚, 보다 바람직하게는 50∼100㎚ 의 채널폭으로 이루어지는 유로가 형성된 칩을 사용하여 실시되는 전기 영동을 말한다. 여기에는 상기에 기재된 나노 사이즈의 구조체가 마이크로미터 사이즈의 채널에 형성되어 있는 것을 포함한다. 나노 사이즈의 구조체 형상은 특별히 한정되지 않으며, 예를 들어 사각, 동그라미, 삼각 등인 것을 사용할 수 있고, 구조체의 설치 간격도 특별히 한정되지 않는다. 이들이 형성된 나노채널 칩이 사용된다. 캐필러리 전기 영동의 경우와 마찬가지로 동시에 다채널 해석 가능한 칩도 포함된다.
나노채널형 전기 영동에서의 채널은, 사이즈가 나노미터라는 특징을 갖는 채널 형상이 곡률을 구부린 것, 사행형, 지그재그형 또는 그들이 조합 등 여러 가지 설계가 가능하다. 이로써, 미소 스케일 내에 많은 채널을 형성할 수 있다. 또, 이로써 한번에 다수의 샘플을 처리할 수 있어 하이 스루풋화가 가능하다. 또한 나노 사이즈의 구조체가 마이크로미터 사이즈의 채널로 형성되는 경우, 그 형상을 자유롭게 바꿀 수 있고, 그 설치 간격도 자유롭게 바꿀 수 있다는 이점이 있다. 동시에 다채널의 측정이 가능하다.
나노채널형 전기 영동에서도 마이크로칩형 전기 영동과 마찬가지로 로딩 채널, 그 로딩 채널에 교차하는 분리용 채널, 그 로딩 채널의 일단에 시료 저장소, 그 로딩 채널의 다른 말단에 아웃렛이 배치된 것을 포함하지만, 형상은 특별히 한 정되는 것이 아니다.
나노채널형 전기 영동에 사용되는 나노채널 칩의 재질로는, 마이크로칩과 동일한 것이 사용된다. 예를 들어, 석영유리, 붕규산유리, 소다유리, 폴리메틸메타크릴레이트, 폴리카보네이트, 디메틸실록산 등을 들 수 있다.
나노채널형 전기 영동에서의 나노채널 칩의 크기는 마이크로칩과 동일한 것이 적용된다. 예를 들어 세로 10∼120㎜, 가로 10∼120㎜, 두께 500∼5000㎛ 이다. 나노채널 칩의 채널 깊이, 채널 길이, 저장소의 크기 등은 마이크로칩에 준한다.
또한 본 발명은, (a) 1∼30㎸, 1∼60초에서의 전기적 주입 또는 0.2∼5kPa, 보다 바람직하게는 1kPa 의 가압 주입에 의해 고분자 화합물을 함유한 시료를 캐필러리에 인젝트하고, 고분자 화합물의 분리가 가능한 영동 전기장 밑으로 그 시료를 이동시키는 공정, 및
(b) 0.2∼10kPa, 보다 바람직하게는 1kPa 에서 가압한 후, 영동 전기장에 의해 고분자 화합물을 영동시키는 공정,
을 포함하는 캐필러리 전기 영동법에 관한 것이다. 여기서, 상기 가압은, 2∼60초, 바람직하게는 5∼10초, 보다 바람직하게는 7∼8초 실시하는 것이 바람직하다.
상기 캐필러리 전기 영동법에 의해 시료 주입 시간이 보다 짧아도 되는 고감도 검출이 가능한 광범위한 사이즈 (2bp∼15kbp) 의 핵산에 대해 동시 해석하는 것이 가능하고, 또한 고속 분석을 달성할 수 있다.
가압 조건 이외의 기타 조건에 대해서는 상기 캐필러리 전기 영동의 조건에 준한다.
상기 캐필러리 전기 영동법에는 여러 가지의 전기 영동용 버퍼를 사용할 수 있고, 본 발명의 전기 영동용 버퍼를 조합하여 사용할 수도 있다.
또한 본 발명은, 로딩 채널과, 그 로딩 채널에 교차하는 분리용 채널을 구비하고, 또한 그 로딩 채널의 일단에 시료 저장소가 배치되며, 그 로딩 채널의 다른 말단에 아웃렛이 배치된 마이크로칩에 있어서,
(a) 고분자 화합물을 함유하는 시료를 그 시료 저장소에 제공하는 공정,
(b) 그 로딩 채널을 3∼7kPa, 바람직하게는 5∼7kPa, 보다 바람직하게는 5.5∼7kPa 로 가압함으로써, 그 시료 저장소 중 그 시료를 분리 채널에 도입하는 공정, 및
(c) 분리용 채널을 1∼10kPa, 바람직하게는 3.5∼10kPa, 보다 바람직하게는 5∼7kPa 가압하고, 이어서 그 시료를 영동시키는 공정,
을 포함하는 마이크로칩형 전기 영동법에 관한 것이다. 여기서, 상기 가압은 0.1∼5초, 바람직하게는 0.5∼2초, 보다 바람직하게는 1초 실시하는 것이 바람직하다.
상기 마이크로칩형 전기 영동법에 의해 시료 주입 시간이 보다 짧아도 되는 고감도 검출이 가능한 광범위한 사이즈 (2bp∼15kbp) 의 핵산에 대해 동시 해석하는 것이 가능하고, 또한 고속 분석을 달성할 수 있다.
가압 조건 이외의 기타 조건에 대해서는 상기 마이크로칩형 전기 영동의 조 건에 준한다.
상기 마이크로칩형 전기 영동법에는 여러 가지 전기 영동용 버퍼를 사용할 수 있고, 본 발명의 전기 영동용 버퍼를 조합하여 사용할 수도 있다.
핵산의 검출을 위한 형광 시약은, 에티듐브로마이드〔510/595 (여기파장/형광파장, 이하 동일)〕, 에티듐호모다이머-1(Ethidium homodimer-1)〔528/617〕, 아크리딘오렌지(Acridine orange)〔502/526〕, 티아졸오렌지(TO : Thiazole orange)〔509/525〕, YO-PRO-1〔491/509〕, YO-PRO-3〔612/631〕, TO-PRO-1〔515/531〕, TO-PRO-3〔642/661〕, YO-YO-1〔491/509〕, TO-TO-1〔514/533〕, YO-YO-3〔612/631〕, TO-TO-3〔642/660〕, 사이버 그린 I(SYBR Green I)〔494/521〕, SYBR 사이버 그린〔254/520〕, SYBR Gold〔300, 495/537〕, 올리그린(Oli Green)(ssDNA 용)〔500/520〕, 리보그린(Ribo Green)(RNA 용)〔500/525〕, FITC〔494/519〕, 6-FAM〔488/535〕, HEX〔515/559〕, cy5〔649/670〕, cy3〔550/570〕등이 있다. 이들은 캐필러리 전기 영동장치 Beckman P/ACE〔488/520 (여기파장/검출파장, 이하 동일)〕, 마이크로칩형 전기 영동장치 Bioanalyzer (Agilent Technologies사 제조)〔635/670∼700〕, cosmo-i SV1100(히타치전자사 제조)〔472/585〕, cosmo-i SV2100(히타치전자사 제조)〔635/660〕 등을 사용하여 검출된다.
전기 영동에 제공한 단백질의 검출법으로는, 예를 들어 UV 파장광에 의한 흡수, UV 리니어 이미징 검출, 형광, 레이저, 램프, LED 등에 의한 검출, 전기화학적 검출, 화학 발광 검출 등을 들 수 있다. 구체적으로는, 단백질 또는 펩티드인 경우 200㎚ 에서의 흡수를 측정하는 것 ; 예를 들어 SYPRO Orange 와 단백질 또는 펩티드를 반응시키고 460∼550㎚ 에서 여기시켜 550∼650㎚ 에서 형광을 측정하는 것, 또는 단백질과 형광 마커 (Agilent Technologies No.5065-4430) 와 반응시키고 ; 630∼650㎚ 에서 여기시켜 670∼700㎚ 에서 형광을 측정하는 것, 및 전기화학적 측정, 화학 발광 측정 등에 의해 단백질 또는 펩티드를 검출할 수 있다.
캐필러리 전기 영동에서는, 예를 들어 캐필러리의 아웃렛에 UV 파장광을 발할 수 있는 장치와 그 UV 파장광의 검출기를 설치해도 되고, 또는 형광파장을 발할 수 있는 장치와 그 형광파장을 검출할 수 있는 검출기를 설치해도 된다.
마이크로칩형 전기 영동에서는, 예를 들어 분리용 채널 상에 배치된 검출점에 UV 파장광의 검출기를 설치해도 되고, 또는 형광파장을 발할 수 있는 장치와 그 형광파장을 검출할 수 있는 검출기를 설치해도 된다. 또 동시에 다채널을 검출할 수 있다.
나노채널형 전기 영동에서는, 마이크로칩형 전기 영동의 경우와 같은 검출기, 검출방법이 적용된다. 또한 나노채널형 전기 영동에서는, 동시 다채널 검출할 때 마이크로칩형 전기 영동의 경우보다도 다수의 샘플을 동시에 검출할 수 있다.
검출할 때 단백질, 펩티드, 아미노산 등의 동정을 실시하는 경우에는, UV 흡수, 분자량 마커, 표품과의 이동시간 비교, 매스스펙트럼의 해석 등에 의해 실시할 수 있다.
본 발명의 전기 영동법에 의하면 신속하게 높은 분리능을 얻을 수 있기 때문에, 유전자의 해석 PCR 해석, 암의 유전자 진단 해석, SSCP 에 의한 SNPs 해석, VNTR 해석, PCR-RFLP 해석, 마이크로 새틀라이트 해석, 기타, 치매증, 근육디스트로피(muscular dystrophy), 심장병, 심근경색, 다운증, 감염증, 당뇨병, 페닐케톤뇨증 등의 각종 질환 해석에 대한 응용, 프로테오솜 해석 또는 글라이코솜 해석에서의 단백질 또는 당쇄의 하이 스루풋 스크리닝 해석에 유용하고, 의료진료장치에 대한 응용 및 생체기능, 질환 발증 기구 등의 해명에 대한 응용이 기대된다.
중합 고분자 마이셀의 조제
에틸렌글리콜 130mmol, 6.5㎖ 를 건조 THF 30㎖, 2-메톡시에탄올 0.16㎖, 나프탈렌칼륨 1mmol 과 함께 25℃ 에서 2일간 중합시키고, 다시 3,6-디메틸 1,4-디옥산-2,5-디온 32mmol, 31㎖ 와 함께 25℃ 에서 2시간 중합한 후, 무수메타크릴산 20mmol, 3.6㎖ 에 의해 정지 반응시켰다. 냉이소프로판올 600㎖ 중에서 재침 정제, 원심분리로 침전시켜 생성물을 회수하였다. 이것을 벤젠 100㎖ 에 용해하고 동결 건조시킨 후 2.5g 의 코폴리머를 회수한다. 얻어진 코폴리머 2.5g 을 1000㎖ 의 물에 녹이고, 오일욕으로 80℃ 로 유지하여 교반하면서 6시간 가열하고, 가열 후 그대로 하룻밤 방치하여 마이셀 용액을 회수하였다. 얻어진 마이셀 용액 10000㎖ 를 30분 후 60℃ 로 유지하면서 20시간 열중합시킨다. 이 용액을 회수하여 한외 여과막을 사용하여 소정 농도로 농축하고, 식 (2) :
Figure 112004041696172-pct00001

(겔 투과형 크로마토그래피에 의해 구한 분자량은 PEO/PLA = 6100/4000)
에 의해 표시되는 중합 고분자 마이셀을 얻었다.
전기 영동용 버퍼의 조제
100㎎/㎖ 의 식 (2) 에 의해 표시되는 중합 고분자 마이셀 (초순수로 조제, pH 2.94) 을 0.1N 수산화 나트륨을 사용하여 pH 를 8.8 로 조정하여 사용하였다.
본 실시예의 전기 영동은 히타치 마이크로칩형 전기 영동 장치 {cosmo-i(SV1100)} 를 사용하여 실시하였다. 전기 영동용 버퍼로서, 10㎎/㎖ 의 식 (2) 에 의해 표시되는 중합 고분자 마이셀 (pH8.8) 을 사용하였다 (이하에서는 고분자 마이셀이라 함). 대조예의 영동용 버퍼로서 0.7% 히드록시프로필메틸셀룰로오스를 사용하였다 (이하에서는 종래 폴리머라 함).
전기 영동법으로는, 이하의 3 종류의 방법에 의해 전기 영동하였다 :
통상법
로딩 채널 및 분리용 채널에 영동용 버퍼를 충전한 후, 시료 저장소에 시료 10㎕ 를 채우고 나머지 저장소에 영동용 버퍼를 채우는 로딩 채널에 전압을 10㎕, 300V, 60초 걸어 시료 저장소의 시료를 로딩 채널에 로드한다. 계속하여 분리 용 채널에 스퀴징 전압을 130V 걸면서 890V 의 분리전압을 180초 로드한다 :
PP 법
로딩 채널 및 분리용 채널에 영동용 버퍼를 충전한 후, 시료 저장소에 시료 2㎕ 를 로드하고, 검출 측 아웃렛 이외의 저장소에는 영동용 버퍼를 채우지 않은 상태로 1∼5.5kPa, 1초의 압력을 시료 저장소에 로드함으로써, 시료를 로딩 채널에, 보다 자세하게는 로딩 채널과 분리용 채널의 교차부에 도입한다. 계속하여 분리용 채널의 아웃렛과 반대 측으로부터 1∼7kPa, 1초의 압력을 분리용 채널에 걸어 시료의 분리용 채널의 하류로 이동시킨다 ;
PP 법의 개량법
상기 PP 법에 있어서, 로딩 채널에 샘플을 도입할 때의 압력이 5.5∼7kPa, 1초이고, 분리용 채널에 거는 압력이 1∼10kPa, 1초이다. 또는, 로딩 채널에 샘플을 도입할 때의 압력이 1∼5.5kPa, 1초이고, 분리용 채널에 거는 압력이 7∼10kPa, 1초이다. 여기서, PP 법에서는 시료를 로딩 채널과 분리용 채널의 교차부에 적량, 구체적으로는 0.2㎕ 도입하지만, PP 법의 개량법에서는 과잉량, 구체적으로는 0.5㎕ 도입한다.
또, 이하에서는 로딩 채널 (구체적으로는 로딩 채널과 분리용 채널의 교차부) 에 샘플을 주입할 때의 압력을 전자의 압력, 분리용 채널을 가압하여 교차부의 샘플을 분리용 채널의 하류부 (검출부 측) 로 이동시키는 압력을 후자의 압력이라 한다.
본 실시예에서 사용한 PP 법 및 그 개량법에서의 전자 및 후자의 압력의 세 기는
L : 0.1㎤ 에어주입 ≒ 1∼2kPa,
LM : 0.2∼0.4㎤ 에어주입 ≒ 2∼3kPa,
M : 0.5㎤ 에어주입 ≒ 3∼3.5kPa,
MH : 0.6∼0.9㎤ 에어주입 ≒ 3.5∼5.5kPa,
H : 1㎤ 에어주입 ≒ 5.5∼7kPa,
HH : 1∼1.5㎤ 에어주입 ≒ 7∼10kPa,
로 하였다.
예 1 (고분자 마이셀 + 통상법)
고분자 마이셀을 영동용 버퍼로서 사용하고, 100bp, 800bp 의 2개의 DNA 마커의 분리를 통상법에 근거하여 전기 영동하였다. 그 결과, 영동시간 180s 이내에서는 피크의 출현은 없었다 (도 1).
예 2 (고분자 마이셀 + PP 법)
예 1 을 PP 법에 근거하여 실시하였다. 전자의 P 의 강도는 M, 후자의 P 의 강도는 L 로 하였다. 그 결과, 영동시간 180s 이내에 2개의 피크가 보였다 (도 2).
예 3 (고분자 마이셀 + PP 법)
예 2 의 전자의 P 의 강도를 M, 후자의 P 의 강도를 M 으로 하였다. 그 결과, 100bp 의 이동시간이 가속되었다 (도 3).
예 4 (고분자 마이셀 + PP 법)
예 2 의 전자의 P 의 강도를 M, 후자의 P 의 강도를 H 로 하였다. 그 결과, 영동시간이 단축되었다 (도 4).
예 5 (고분자 마이셀 + 통상법)
고분자 마이셀을 영동용 버퍼로서 사용하고, 100bp, 500bp, 800bp 의 3개의 DNA 의 분리를 통상법에 근거하여 실시하였다. 그 결과, 영동시간 180s 이내에서는 피크의 출현은 없었다 (도 5).
예 6 (고분자 마이셀 + PP 법)
예 5 를 PP 법에 근거하여 실시하였다. 전자의 P 의 강도를 L, 후자의 P 의 강도는 LM 으로 하였다. 그 결과, 영동시간 120s 이내에 3개의 피크가 보였다 (도 6).
예 7 (고분자 마이셀 + PP 법)
예 5 를 PP 법에 근거하여 실시하였다. 전자의 P 의 강도를 L, 후자의 P 의 강도는 M 으로 하였다. 그 결과, 100bp, 500bp 의 이동시간이 가속되었다 (도 7).
예 8 (고분자 마이셀 + PP 법)
고분자 마이셀을 영동용 버퍼로서 사용하고, 100bp - 1000bp 의 10개의 DNA 의 분리를 PP 법에 근거하여 실시하였다. 전자의 P 의 강도를 M, 후자의 P 의 강도는 L 로 하였다. 그 결과, 영동시간 180s 이내에 10개의 피크가 보였다 (도 8).
예 9 (고분자 마이셀 + PP 법)
예 8 을 PP 법에 근거하여 실시하였다. 전자의 P 의 강도를 M, 후자의 P 의 강도는 LM 으로 하였다. 그 결과, 영동시간 90s 이내에 10개의 피크가 보였다 (도 9).
예 10 (고분자 마이셀 + PP 법)
예 8 을 PP 법에 근거하여 실시하였다. 전자의 P 의 강도를 M, 후자의 P 의 강도는 H 로 하였다. 그 결과, 영동시간 거의 60s 이내에 10개의 피크가 보였다 (도 10).
예 11 (고분자 마이셀 + PP 법의 개량법)
예 8 을 PP 법에 근거하여 실시하였다. 전자의 P 의 강도를 M, 후자의 P 의 강도는 HH 로 하였다. 그 결과, 마찬가지로 영동시간 60s 이내에 10개의 피크가 보이고, 가속되었다 (도 11).
예 12 (고분자 마이셀 + PP 법)
고분자 마이셀을 영동용 버퍼로서 사용하고, 100∼800bp, 8개의 DNA 의 분리를 PP 법에 근거하여 실시하였다. 전자의 P 의 강도를 M, 후자의 P 의 강도를 MH 로 하였다 (도 12).
60s 이내에 8개의 피크가 보였다.
예 13 (고분자 마이셀 + PP 법)
고분자 마이셀을 영동용 버퍼로서 사용하고, 1∼15bp 의 15개 (5kbp : high) 의 DNA 의 분리를 PP 법에 근거하여 실시하였다. 전자의 P 를 M, 후자를 L 로 하였다 (도 13). 그 결과, 180s 이내에 5개의 피크가 보였다.
예 14 (고분자 마이셀 + PP 법)
예 13 에 대해서 PP 법, 전자를 M, 후자를 M 으로 하였다. 그 결과, 영동시간이 단축되었다 (도 14).
예 15 (고분자 마이셀 + PP 법)
예 13 에 대해서 PP 법, 전자를 M, 후자를 H 에 근거하여 실시하였다. 그 결과, 영동간격이 단축되었다 (도 15).
예 16 (고분자 마이셀 + PP 법의 개량법)
예 13 에 대해서 PP 법, 전자를 M, 후자를 HH 로 하였다. 그 결과, 7kbp 까지 더 검출할 수 있었다 (도 16).
예 17 (고분자 마이셀 + PP 법의 개량법)
예 13 에 대해서 PP 법, 전자를 H, 후자를 L 로 하였다. 그 결과, 180s 이내에 8개의 피크가 보였다 (도 17).
예 18 (고분자 마이셀 + PP 법의 개량법)
예 13 에 대해서 PP 법, 전자를 H, 후자를 M 으로 하였다. 그 결과, 180s 이내에 15개의 피크를 검출하였다 (도 18).
예 19 (고분자 마이셀 + PP 법의 개량법)
예 13 에 대해서 PP 법, 전자를 H, 후자를 H 로 하였다. 그 결과, 100s 이내에 15개의 피크가 보였다 (도 19).
예 20 (백그라운드)
본 영동에 있어서, DNA 가 없는 고분자 마이셀 버퍼와 형광시약만의 백그라 운드를 조사하였다. 그 결과, 고분자 마이셀에 의한 피크는 검출되지 않기 때문에, 일련의 피크 검출은 본 고분자 마이셀을 영동버퍼하여 사용한 경우의 각 DNA 의 피크로 생각되었다 (도 20).
종래의 영동용 버퍼에 PP 법을 실시한 것과 고분자 마이셀을 사용한 영동용 버퍼에 PP 법을 실시한 것을 비교하여, 본 고분자 마이셀의 유효성을 조사하였다. 종래 폴리머 (0.7% HPMC(히드록시프로필메틸셀룰로오스) 를 영동용 버퍼로 한 경우와 비교하였다.
예 21 (종래 폴리머 + 통상법)
100bp, 800bp 의 2개의 DNA 마커의 분리를, 종래의 폴리머 용액 (0.7% HPMC(히드록시프로필메틸셀룰로오스) 을 영동용 버퍼로 하여 통상법에 근거하여 실시하였다 (도 21).
예 22 (종래 폴리머 + PP 법)
예 21 를 이전에 출원된 전기 영동법에 의해 실시하였다. 전자를 M, 후자의 P 를 LM 으로 하였다. 그 결과, 영동시간의 단축을 나타내었다 (도 22).
예 23 (종래 폴리머 + PP 법)
예 22 에 있어서 전자를 M, 후자의 P 를 MH 로 하였다. 그 결과, 피크가 넓어졌다 (도 23).
예 24 (종래 폴리머 + 통상법)
100bp - 800bp 의 8개의 DNA 마커의 분리를, 종래의 폴리머 용액 (0.7% HPMC(히드록시프로필메틸셀룰로오스) 을 영동용 버퍼로 하여 통상법에 근거하여 실 시하였다 (도 24).
예 25 (종래 폴리머 + PP 법)
예 24 를 PP 법에 의해 실시하였다. 전자를 M, 후자의 P 를 LM 으로 하였다. 그 결과, 전자의 피크가 가속되었지만 피크 간격이 넓어졌다 (도 25).
예 26 (종래 폴리머 + PP 법)
예 25 에 대해서 전자를 M, 후자의 P 를 MH 로 하였다. 그 결과, 피크가 넓어졌다 (도 26).
이상에 의해, 종래의 폴리머 용액을 영동용 버퍼로 한 경우에는, PP 법을 사용한 경우 DNA 의 이동시간이 향상되지만, DNA 의 경우에는 그 고속분리에는 한계가 있었다. 한편, 고분자 마이셀의 경우에는 더 높은 압력을 가하는 것은 가능하며 (예 1 ∼ 20), 이로써 본 고분자 마이셀의 유용성이 나타났다.
본 고분자 마이셀은 단독으로는 캐필러리, 마이크로칩 전기 영동에 있어서 DNA 분리의 효과는 나타내지 않지만, PP 법과 함께 사용함으로써 DNA 의 사이즈 분리 효과를 발휘하였다. 그리고, PP 법을 개량한 전기 영동법을 사용함으로써 종래의 고분자 폴리머 용액 (예를 들어 셀룰로오스 유도체나 폴리아크릴아미드 용액을 사용하여 기존의 전기 영동법) 에 의한 최고의 검출 속도 (10kbp 를 대략 80s) 를 더 웃도는 영동 시간 (10kbp 를 대략 60s, 15kbp 를 대략 100s) 을 달성하였다.
본 발명의 전기 영동법에 의하면 신속하게 높은 분리능을 얻을 수 있기 때문 에, 유전자의 해석 PCR 해석, 암의 유전자 진단 해석, SSCP 에 의한 SNPs 해석, VNTR 해석, PCR-RFLP 해석, 마이크로 새틀라이트 해석, 기타, 치매증, 근육 디스트로피, 심장병, 심근경색, 다운증, 감염증, 당뇨병, 페닐케톤뇨증 등의 각종 질환 해석에 대한 응용, 프로테오솜 해석 또는 글라이코솜 해석에서의 단백질 또는 당쇄의 하이 스루풋 스크리닝 해석에 유용하고, 의료진료장치에 대한 응용 및 생체기능, 질환 발증 기구 등의 해명에 대한 응용이 기대된다.

Claims (12)

  1. 일반식 (1) :
    HPLS-HPBS-PLZA (1)
    (식 중 HPLS 는 친수성 폴리머 세그먼트를 나타내고, HPBS 는 소수성 폴리머 세그먼트를 나타내고, PLZA 는 에틸렌성 불포화 2중 결합을 갖는 중합성기를 나타냄),
    로 표시되는 블록 코폴리머를 수성 매체 중에 분산시키고, 이어서 중합시킴으로써 형성된 중합 고분자 마이셀을 함유하여 이루어지는 전기 영동용 버퍼.
  2. 제 1 항에 있어서, 상기 블록 코폴리머에 저분자 중합성 모노머를 더욱 추가하여 중합시킴으로써 형성된 중합 고분자 마이셀을 함유하여 이루어지는 전기 영동용 버퍼.
  3. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, HPLS 를 구성하는 폴리머가 폴리에틸렌글리콜, 폴리비닐알코올, 폴리(메트)아크릴산, 폴리비닐피리딘, 폴리아크릴아미드, 폴리디메틸아크릴아미드 및 폴리메틸비닐에테르로 이루어지는 군에서 선택하여 이루어지고, HPBS 가 폴리락티드, 폴리글리콜리드, 폴리(부티로락톤), 폴리(발레로락톤), 폴리프로필렌글리콜, 폴리(α-아미노산), 폴리(메타크릴산메틸), 폴리(메타크릴산에틸), 폴리스티렌, 폴리(α-메틸스티렌), 폴리이소프렌, 폴리부타디엔, 폴리 에틸렌, 폴리프로필렌 및 폴리아세트산비닐로 이루어지는 군에서 선택되어 이루어지는 전기 영동용 버퍼.
  4. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, HPLS 가 폴리에틸렌글리콜이고, HPBS 가 폴리락티드, 폴리글리콜리드, 폴리(부티로락톤), 폴리(발레로락톤), 폴리프로필렌글리콜 및 폴리(α-아미노산) 으로 이루어지는 군에서 선택되어 이루어지는 전기 영동용 버퍼.
  5. 제 1 항에 기재된 전기 영동용 버퍼의 존재 하에서, 고분자 화합물을 함유한 시료를 영동하는 것을 특징으로 하는 전기 영동법.
  6. 제 5 항에 있어서, 전기 영동의 형태가, 캐필러리 전기 영동, 마이크로칩형 전기 영동 또는 나노칩형 전기 영동인 전기 영동법.
  7. 제 5 항에 있어서,
    전기 영동의 형태가,
    (a) 1∼30㎸, 1∼60초에서의 전기적 주입 또는 가압 주입에 의해, 고분자 화합물을 함유한 시료를 캐필러리에 인젝트하고 고분자 화합물의 분리가 가능한 영동 전기장 밑으로 그 고분자 화합물을 이동시키는 공정, 및
    (b) 캐필러리 내를 가압한 후 영동 전기장에 의해 고분자 화합물을 영동시키 는 공정,
    을 포함하는 캐필러리 전기 영동인 전기 영동법.
  8. 제 5 항에 있어서,
    전기 영동의 형태가,
    로딩 채널과, 상기 로딩 채널에 교차하는 분리용 채널을 구비하고, 또한 상기 로딩 채널의 일단에 시료 저장소가 배치되며, 상기 로딩 채널의 다른 말단에 아웃렛이 배치된 마이크로칩에 있어서,
    (a) 고분자 화합물을 함유한 시료를 상기 시료 저장소에 제공하는 공정,
    (b) 상기 로딩 채널을 가압함으로써, 상기 시료 저장소 중 상기 고분자 화합물을 로딩 채널과 분리용 채널의 교차부에 영동시키는 공정, 및
    (c) 분리용 채널을 가압하고, 이어서 영동 전기장에 의해 상기 고분자 화합물을 분리용 채널 내에서 영동시키는 공정,
    을 포함하는 마이크로칩형 전기 영동인 전기 영동법.
  9. 제 1 항 또는 제 2 항에 기재된 전기 영동용 버퍼의 존재 하에서 전기 영동이 수행되고,
    (a) 1∼30㎸, 1∼60초에서의 전기적 주입 또는 0.2∼5kPa, 2∼60초의 가압 주입에 의해, 고분자 화합물을 함유한 시료를 캐필러리에 인젝트하고, 고분자 화합물의 분리가 가능한 영동 전기장 밑으로 상기 시료를 이동시키는 공정, 및
    (b) 0.2∼10kPa, 2∼60초로 가압한 후 영동 전기장에 의해 상기 고분자 화합물을 영동시키는 공정,
    을 포함하는 캐필러리 전기 영동법.
  10. 제 1 항 또는 제 2 항에 기재된 전기 영동용 버퍼의 존재 하에서 전기 영동이 수행되고,
    로딩 채널과, 상기 로딩 채널에 교차하는 분리용 채널을 구비하고, 또 상기 로딩 채널의 일단에 시료 저장소가 배치되며, 상기 로딩 채널의 다른 말단에 아웃렛이 배치된 마이크로칩에 있어서,
    (a) 고분자 화합물을 함유하는 시료를 그 시료 저장소에 제공하는 공정,
    (b) 상기 로딩 채널을 5.5∼7kPa 에서 0.1∼5초 가압함으로써 그 시료 저장소 중의 그 고분자 화합물을 로딩 채널과 분리용 채널의 교차부에 영동시키는 공정, 및
    (c) 분리용 채널을 1∼10kPa 로 0.1∼5초 가압하고, 이어서 영동 전기장에 의해 그 고분자 화합물을 분리용 채널 내에서 영동시키는 공정,
    을 포함하는 마이크로칩형 전기 영동법.
  11. 삭제
  12. 제 5 항 내지 제 8 항 중 어느 한 항에 있어서, 추가로, 영동한 고분자 화합물을 검출하는 공정을 포함하는 전기 영동법.
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Families Citing this family (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US9121821B2 (en) * 2006-09-04 2015-09-01 National Institute Of Advanced Industrial Science And Technology Process for analyzing sample by capillary electrophoresis method
JP2009186445A (ja) * 2008-02-08 2009-08-20 Arkray Inc キャピラリー電気泳動法によるヘモグロビンの分析方法およびそれに用いる試薬
US20100155242A1 (en) * 2006-09-04 2010-06-24 Arkray, Inc. Method of Analyzing a Sample by Capillary Electrophoresis
KR20100058499A (ko) * 2007-08-17 2010-06-03 하이모 가부시키가이샤 전기영동용 프리캐스트 겔, 그 제조방법 및 그 사용방법
JP5821358B2 (ja) * 2011-07-20 2015-11-24 ソニー株式会社 核酸抽出方法及び核酸抽出用カートリッジ
CA2994005A1 (fr) * 2018-02-05 2019-08-05 Hydro-Quebec Copolymeres d'unites ester et ether, leurs procedes de fabrication et leurs utilisations
CA3070332A1 (en) * 2019-04-30 2020-10-30 Microtech Medical (Hangzhou) Co., Ltd. Biosensors coated with co-polymers and their uses thereof
US12111280B2 (en) * 2019-04-30 2024-10-08 Microtech Medical (Hangzhou) Co., Ltd. Biosensing systems having biosensors coated with co-polymers and uses thereof
CN118477710B (zh) * 2024-07-12 2024-12-13 杭州聚致生物科技有限公司 一种用于dna分离分析的微流控电泳芯片

Family Cites Families (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5290418A (en) * 1992-09-24 1994-03-01 Applied Biosystems, Inc. Viscous electrophoresis polymer medium and method
US5482608A (en) 1993-01-19 1996-01-09 Hewlett Packard Company Capillary electrophoresis flow control system
JPH10110019A (ja) * 1996-10-08 1998-04-28 Kazunori Kataoka 安定化高分子ミセルおよび生理活性物質のキヤリヤーとしてのその使用
JPH10195152A (ja) 1996-12-27 1998-07-28 Kazunori Kataoka コア−シエル型ミクロスフイアーおよびその製造方法
JPH11118761A (ja) * 1997-10-15 1999-04-30 Yokogawa Analytical Systems Inc キャピラリ電気泳動によるイオン類分析方法及び装置
US6375817B1 (en) * 1999-04-16 2002-04-23 Perseptive Biosystems, Inc. Apparatus and methods for sample analysis
US6726821B1 (en) * 1999-12-02 2004-04-27 Hymo Corporation Polyacrylamide precast gels for electrophoresis, process for producing the same and electroporesis method by using the gels

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