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KR100484441B1 - IVa2유전자가불활성화된결손재조합아데노바이러스 - Google Patents

IVa2유전자가불활성화된결손재조합아데노바이러스 Download PDF

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KR100484441B1 KR1019970701945A KR19970701945A KR100484441B1 KR 100484441 B1 KR100484441 B1 KR 100484441B1 KR 1019970701945 A KR1019970701945 A KR 1019970701945A KR 19970701945 A KR19970701945 A KR 19970701945A KR 100484441 B1 KR100484441 B1 KR 100484441B1
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Abstract

본 발명은 아데노바이러스로부터 유도된 신규한 바이러스 벡터, 이의 제조 방법 및 유전자 치료에서의 용도에 관한 것이다. 본 발명은 특히 IVa2 유전자가 최소한 불활성인 결손 재조합 아데노바이러스에 관한 것이다.

Description

IVa2 유전자가 불활성화된 결손 재조합 아데노바이러스
본 발명은 신규한 바이러스 벡터, 이의 제조 방법 및 유전자 치료에서 이의 용도에 관한 것이다. 본 발명은 또한 바이러스 벡터를 함유하는 약학 조성물에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 유전자 치료를 위한 벡터로서 재조합 아데노바이러스에 관한 것이다.
유전자 치료는 세포 또는 질병에 걸린 기관에 유전 정보를 도입시킴으로써 결손 또는 비정상( 돌연변이, 이상 발현등)을 교정하는 것으로 이루어진다. 이러한 유전 정보는 시험관 또는 기관으로부터 추출된 세포내로 도입될 수 있고 변형된 세포는 신체 또는 적당한 조직내 생체에 직접 재도입될 수 있다. 두 번째의 경우에, 다양한 기술이 현존하며, 이 중 하나가 DNA와 △EAE-덱스트란[참조문헌: Pagano et al., J. Virol. 1 (1967) 891], DNA와 핵 단백질[참조문헌: Kaneda et al., Science 243 (1989) 375], DNA와 지질[참조문헌: Felgner et al., PNAS 84 (1987) 7413]의 복합체, 리포좀의 사용[참조문헌: Fraley et al., J. Biol. Chem. 255 (1980) 10431]등을 포함하는 다양한 형질감염 기술이다. 최근, 유전자의 전이를 위한 벡터로서 바이러스의 사용이 이러한 물리적 형질감염 기술에 장래성 있는 대안으로서 나타났다. 이러한 관점에서, 다양한 바이러스가 특정 세포 군을 감염시키는 능력이 시험되어 왔다. 특히, 레트로바이러스( RSV, HMS, MMS등), HSV 바이러스, 아데노-수반 바이러스 및 아데노바이러스이다.
이러한 바이러스중, 아데노바이러스는 유전자 치료 사용에 유리한 몇 가지 특성을 가지고 있다. 특히, 이러한 바이러스는 꽤 넓은 숙주 스펙트럼을 가지고, 무활동 세포를 감염시킬 수 있고, 감염된 세포의 게놈에 통합되지 않으며 현재까지는 사람의 주요 병리와 관련되지 않았다. 아데노바이러스는 약 36 kb 크기의 선형 이본쇄 DNA를 갖는 바이러스이다. 이의 게놈은 특히 말단에 역반복 서열(ITR), 캡시드화 서열, 초기 유전자 및 후기 유전자를 포함한다( 도 1 참조). 주요 초기 유전자는 E1( E1a 및 E1b), E2, E3 및 E4 유전자이다. 주요 후기 유전자는 L1 내지 L5 유전자이다.
전술한 아데노바이러스의 주어진 특성중 후자는 이미 생체내에서 유전자 전달에 사용되어 왔다. 이러한 이유로 해서, 다양한 유전자( β-gal, OTC, a-1AT, 시토킨등)를 이입한 아데노바이러스로부터 유도된 다양한 벡터가 제조되어 왔다. 이러한 각각의 작제물에서, 아데노바이러스는 감염된 세포내 복제를 불가능하게 하도록 변형된다. 따라서, 종래 기술에 기술된 작제물은 이종 DNA 서열이 삽입된 레벨에서 E1( E1a 및/또는 E1b) 및 임의로 E3 영역이 결실된 아데노바이러스이다. [참조문헌: Levrero et al., Gene 101 (1991) 195; Gosh-Choudhury et al., Gene 50 (1986) 161]. 그럼에도 불구하고, 종래 기술에 기술된 벡터는 유전자 치료에 있어서 이의 이용을 제한하는 여러가지 단점을 가진다. 특히, 이러한 모든 벡터는 생체내 발현이 유전자 치료의 구성에 바람직하지 않은 다양한 바이러스 유전자를 포함한다. 또한, 이러한 벡터는 특정 적용에 필요할 수 있는 매우 큰 DNA 단편의 이입을 허용하지 않는다.
본 발명에 의해 이러한 단점이 극복 가능하다. 본 발명은 실제로 유전자 치료, 특히 생체내 유전자의 전이와 발현에 사용될 수 있는 신규한 재조합 아데노바이러스를 설명한다. 특히, 본 발명의 아데노바이러스는 바이러스 단백질의 생성, 바이러스의 전달, 병원성등의 위험을 제한하면서, 목적하는 유전자의 생체내 효과적 운반과 지속적 발현을 허용한다.
도 1: Ad5 아데노바이러스의 유전자 구성도.
Ad5의 완전한 서열은 데이타베이스로 입수할 수 있으며 당해 분야의 전문가로 하여금 어떠한 제한 부위도 선택하거나 창안할 수 있고 따라서 어떠한 게놈 영역도 분리해 낼 수 있게 한다.
도 2: CAV2 아데노바이러스 맨해튼 균주(Spibey 등에 따라, 상기 인용)의 제한 지도.
도 3: 플라스미드 pCO1에 함유된 HindIII 단편의 제한 지도.
도 4: 플라스미드 pCO2에 함유된 HindIII 단편의 제한 지도.
도 5: 플라스미드 pPY32의 작제 및 예시도.
도 6: 플라스미드 pPY55의 예시도.
도 7: 플라스미드 pE4Gal의 작제도.
도 8: 플라스미드 pCO6에 함유된 HindIII 단편의 제한 지도.
도 9: 플라스미드 pAC2의 제한 지도.
도 10: 플라스미드 pAC5의 제한 지도.
도 11: 플라스미드 pGY37-TK-IVa2의 제한 지도.
도 12: 플라스미드 pGY37-CMV-IVa2의 제한 지도.
종합적인 분자 생물학 기술
플라스미드 DNA의 예비 추출, 플라스미드 DNA의 세슘 클로라이드 구배에서의 원심분리, 아가로스 또는 아크릴아미드겔 상에서의 전기영동, 전기용출에 의한 DNA 단편의 정제, 페놀 또는 페놀-클로로포름을 사용한 단백질 추출, 에탄올 또는 이소프로판올을 사용한 생리식염수 매질에서의 DNA 침전, 이.콜라이에서의 형질전환 등과 같은 분자 생물학에 사용되는 통상의 방법은 당해 분야의 전문가에게 익히 공지되어 있으며 문헌[참조:Maniatis T. et al., "Molecular Cloning, a Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y., 1982; Ausubel F.M. et al.(eds), "Current Protocols in Molecular Biology", John Wiley & Sons, New York, 1987]에 광범위하게 기재되어 있다.
pBR322 및 pUC형 플라스미드 및 M13 시리즈의 파지는 시판되고 있다(Bethesda Research Laboratories).
연결을 위하여, DNA 단편은 공급자의 권장에 따라 아가로스 또는 아크릴아미드 겔 전기영동에 의하여 크기에 따라 분리하고, 페놀 또는 페놀/클로로포름 혼합물로 추출하며, 에탄올로 침전시킨 다음 파지 T4 DNA 리가제(Biolabs)의 존재하에 배양시킬 수 있다.
돌출 5' 말단의 충진은 공급자의 명세에 따라 이.콜라이의 DNA 폴리머라제 I(Biolabs)의 클레나우 단편을 사용하여 수행할 수 있다. 돌출 3' 말단의 파괴는 제조업자의 권장에 따라 사용되는 파지 T4 DNA 폴리머라제(Biolabs)의 존재하에서 수행된다. 돌출 5' 말단의 파괴는 S1 뉴클레아제를 사용한 조절된 처리로 수행된다.
합성 올리고데옥시뉴클레오타이드를 사용한 시험관 내 부위-지향성 돌연변이유발은 Amersham에 의해 배포된 키트를 사용하여 Taylor 등[참조문헌: Nucleic Acids Res. 13 (1985) 8749-8764]에 의하여 개발된 방법에 따라 수행될 수 있다.
소위 PCR 기술[참조문헌:Polymerase-catalyzed Chain Reaction, Saiki R. K. et al., Science 230(1985)1350-1354; Mullis K.B. and Faloona F.A., Meth. Enzym. 155(1987) 335-350]에 의한 DNA 단편의 효소 증폭은 제조업자의 명세에 따라 "DNA 열 사이클러"(Perkin Elmer Cetus)를 사용하여 수행할 수 있다.
뉴클레오타이드 서열의 증명은 Amersham에 의하여 배포된 키트를 사용하여 Sanger 등[참조문헌:Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74(1977) 5463-5467]에 의하여 개발된 방법에 의하여 수행될 수 있다.
사용된 세포주
하기 실시예에서, 하기 세포주이거나 이들이 사용될 수 있다:
-사람 배 신장 세포주 293[참조문헌:Graham et al., J. Gen. Virol. 36(1977) 59]. 본 세포주는 특히 이의 게놈에 사람 아데노바이러스 Ad5의 좌측 부분(12%)이 통합되어 있다.
-사람 세포주 KB: 사람 표피 암종으로부터 유도된 이러한 세포주는 ATCC(ref. CCL17) 및 이의 배양을 허용하는 조건에서 입수할 수 있다.
-사람 세포주 Hela: 사람 상피의 암종으로부터 유도된 이러한 세포주는 ATCC(ref. CCL2) 및 이의 배양을 허용하는 조건에서 입수할 수 있다.
-개 세포주 MDCK: MDCK 세포 배양 조건은 특히 Macatney 등(Science 44 (1988) 9)에 의하여 기술되었다.
-세포주 gm DBP6[참조문헌:Brough et al., Virology 190 (1992) 624). 본 세포주는 MMTV의 LTR 조절하에 있는 아데노바이러스 E2유전자를 함유하는 Hela 세포로 이루어진다.
본 발명은 특히 적어도 하나의 특정 바이러스 유전자( IVa2)를 기능하지 않게 한 재조합 아데노바이러스의 작제에 있다. IVa2 유전자는 아데노바이러스 게놈의 좌측 영역에 위치한 작은 유전자이다. 이것은 특히 E2B 유전자의 말단과 부분적으로 중첩되어 이의 조작을 어렵게 한다. IVa2 유전자는 아데노바이러스의 복제 사이클에서 후기 유전자의 전사 활성자의 역할을 하는 것으로 보인다. 그래서 그것의 존재는 바이러스 입자의 형성을 위해 필요한 바이러스 단백질의 발현을 허용 또는 촉진한다.
본 출원인은 아데노바이러스 게놈에서 이러한 유전자를 불활성화시키는 것이 가능하다는 것을 보인다. 본 출원인은 이러한 불활성화가 유전자 치료 벡터로서 아데노바이러스의 특성, 즉 세포, 특히 사람 세포를 감염시키는 큰 힘과 원하는 유전자를 상기 세포로 효과적으로 전달하는 능력에 영향을 미치지 않는다는 것을 보여준다. 또한, 종래 기술과 비교하면, 본 발명에 설명된 벡터는 IVa2 유전자의 결실에 의한 불활성화로 인해 생긴 원하는 유전자를 이입하는 향상된 능력을 가지고 있고, 특히 본 발명에 따른 재조합 아데노바이러스에 존재할 수 있는 후기 유전자의 발현이 상당히 감소 또는 심지어 완전히 파괴되기 때문에 실질적으로 덜 면역원성이다.
따라서 본 발명의 벡터는 특히 수득된 역가에 특별히 영향 미침 없이 큰 크기( 8 kb이상이고 11 kb이상까지 커질 수 있는)의 원하는 유전자의 이입을 허용하고, 매우 적은 발현된 바이러스 영역을 가지기 때문에 면역원성, 병원성, 전달, 복제, 재조합등과 같은 유전자 치료에서 벡터로서 바이러스 사용시 내재하는 위험을 상당히 감소시키거나 억제한다는 점에서 특히 유리하다. 따라서 본 발명은 특히 원하는 DNA 서열의 생체내 전이 또는 발현에 적합한 바이러스 벡터를 제공한다.
본 발명의 첫번째 목적은 IVa2 유전자가 적어도 불활성화된 결손 재조합 아데노바이러스에 관한 것이다.
아데노바이러스가 감염된 세포내에서 자가 복제가 불가능할 때, 결손이라고 말한다. 일반적으로, 본 발명에 따른 아데노바이러스의 게놈은 적어도 감염된 세포에서 바이러스의 복제를 위해 필요한 서열이 결여되어 있다. 이러한 영역은 제거되거나( 전체 또는 부분적), 비기능화되거나, 다른 서열, 특히 이종 핵산 서열에 의해 치환될 수 있다.
앞서 지적한 바와 같이, 본 출원인은 바이러스의 목적하는 특성에 영향을 미치지 않고 아데노바이러스의 게놈에 IVa2 유전자를 불활성화시키는 것이 가능하다는 것을 보여준다. 특히, 본 발명의 벡터 제조를 위해, IVa2 유전자는 당해 분야의 숙련인에게 공지된 다양한 기술, 특히 억제, 치환, 결실 및/또는 하나 이상의 염기 첨가에 의해 불활성화될 수 있다. 이러한 변형은 시험관내( 분리된 DNA상) 또는 직접, 예를 들면 유전 공학 기술, 또는 돌연변이 유발제로 처리함으로써 수득될 수 있다. 유전자 변형(들)은 유전자의 암호화 영역, 또는 암호화 영역의 외측 및 예를 들면 유전자의 발현 및/또는 전사 조절을 위한 영역에 배치될 수 있다. 유전자의 불활성화는 구조적 또는 형태적 변형에 기인한 불활성 단백질의 생성, 생성의 결여, 변화된 활성을 갖는 단백질의 생성, 또는 감소된 수준 또는 제어의 바람직한 양식에 따른 천연 단백질의 생성에 의해 나타날 수 있다.
불활성화를 위해 사용될 수 있는 돌연변이 유발제중 예를 들면 강력한 조사( X-, r- 및 자외선등) 같은 물리적 작용제, 또는 DNA 염기의 다양한 작용 그룹과 반응할 수 있는 화학제, 예를 들면 알킬화제[에틸 메탄술포네이트(EMS), N-메틸-N'-니트로-N-니트로소구아니딘, N-니트로퀴놀린-1-옥사이드(NQC)], 이알킬화제, 삽입제등이 언급될 수 있다.
유전적 변형은 또한 유전자 붕괴, 예를 들면 Rothstein[ 참조문헌: Meth. Enzymol. 101 (1983) 202]에 의해 처음으로 기술된 방법에 따라 수득될 수 있다. 이 경우에, 암호화 서열의 전체 또는 일부가 바람직하게는 비기능 또는 돌연변이 서열에 의한 게놈 서열의 상동 재조합에 의한 치환을 허용하도록 교란된다.
바람직하게는, 본 발명의 아데노바이러스에서 IVa2 유전자는 돌연변이 및/또는 하나 이상의 염기의 결실에 의해 불활성화된다. 더 바람직하게는, IVa2 유전자는 부분 또는 전체 결실에 의해 불활성화된다.
특히, 결실은 고려된 유전자의 전부 또는 일부의 여타의 억제를 의미하는 것으로 이해된다. 이것은 특히, 유전자 암호화 영역의 전체 또는 일부 및/또는 유전자의 전사를 위한 프로모터 영역의 전부 또는 일부일 수 있다. 억제는 적절한 제한 효소에 의한 분해 및 실시예에 예시되는 바와 같이 통상의 분자 생물학 기술에 따른 연결에 의해 수행될 수 있다.
특히 바람직한 방법에서, 유전자의 불활성화는 다른 바이러스의 유전자, 특히 이웃 유전자가 아닌, 고려된 유전자에만 영향을 주도록 수행된다. 또한, 본질상 점돌연변이 같은 변이가 세포 메카니즘에 의해 교정 또는 감쇄될 수 있는 경우, 불활성화는 분리적으로 안정하고/하거나 비가역적인 것이 특히 바람직하다.
본 발명의 재조합 아데노바이러스에서, 특히 유리한 양식에 있어서, IVa2 유전자는 Ad5 아데노바이러스 서열상 뉴클레오타이드 4106 내지 5186번에 걸친 BssHII-BstEII 단편의 결실에 의해 불활성화된다. 이 서열은 문헌 및 또한 데이타베이스( Genebank No. M73260 참조)상에서 입수할 수 있다.
본 발명에 따른 재조합 아데노바이러스는 유리하게는 ITR 서열 및 캡시드화를 허용하는 영역을 포함한다.
역위 반복 서열(ITR)은 아데노바이러스의 복제 기원을 구성한다. 그들은 바이러스 게놈( 도 1 참조)의 3＇및 5＇말단에 위치하고, 당해 분야의 숙련인에게 공지된 통상의 분자 생물학 기술에 따라 쉽게 분리될 수 있다. 사람 아데노바이러스( 특히 Ad2 및 Ad5 혈청형) 및 개 아데노바이러스( 특히 CAV1 및 CAV2)의 ITR 서열의 뉴클레오타이드 서열이 문헌에 기술되어 있다. Ad5 아데노바이러스에 관하여 예를 들면, 좌편 ITR 서열은 게놈의 뉴클레오타이드 1 내지 103번을 포함하는 영역에 상응한다.
캡시드화 서열( 또한 Psi 서열로 지칭된)이 바이러스 게놈의 캡시드화에 필요하다. 따라서 이 영역은 본 발명에 따른 결손 재조합 아데노바이러스의 제조를 허용하기 위해 존재한다. 캡시드화 서열은 아데노바이러스의 게놈에서, 좌편( 5＇) ITR과 E1 유전자( 도 1)사이에 위치한다. 이것은 통상의 분자 셍물학 기술에 의해 분리 또는 인공적으로 합성될 수 있다. 사람 아데노바이러스( 특히 Ad2 및 Ad5 혈청형) 및 개 아데노바이러스( 특히 CAV1 및 CAV2)의 캡시드화 서열의 뉴클레오타이드 서열이 문헌에 기술되어 있다. Ad5 아데노바이러스에 관하여 예를 들면, 작용성 캡시드화 서열이 게놈의 뉴클레오타이드 194 내지 358번 사이에 존재한다.
제 1 특정 양태에서, 본 발명의 재조합 아데노바이러스는 E1 및 IVa2 유전자의 전부 또는 일부에 관한 결실을 포함한다.
다른 특정 양태에서, 본 발명의 재조합 아데노바이러스는 E4 및 IVa2 유전자의 전부 또는 일부에 관한 결실을 포함한다.
바람직한 양태에 따라, 본 발명의 재조합 아데노바이러스는 E1, IVa2 및 E3 유전자의 전부 또는 일부에 관한 결실을 포함한다.
특히 유리한 변형에서, 본 발명의 재조합 아데노바이러스는 E1, IVa2 및 E4 유전자의 전부 또는 일부에 관한 결실을 포함한다.
본 발명에 따른 유전자 치료에서 사용하기 특히 적당한 특성을 가진 재조합 아데노바이러스는 E1, IVa2, E3, E4 및 가능하게 L5 유전자의 전부 또는 일부에 관한 결실을 포함하는 것들이다. 이러한 벡터는 실제로 감염, 안전성 및 매우 높은 유전자 전이 능력과 관련된 특성을 합친다.
유리하게는, 본 발명의 재조합 아데노바이러스는 추가로, 세포, 기관 또는 유기체내 전이 및/또는 발현이 요구되는 이종 핵산 서열을 함유한다.
특히, 이종 DNA 서열은 하나 이상의 치료 유전자 및/또는 항원 펩티드를 암호화하는 하나 이상의 유전자를 함유할 수 있다.
이와 같이 전달될 수 있는 치료 유전자는 표적 세포내 전사 및 가능하게는 해독에 의해 치료 효과를 가진 생성물을 생성하는 여타의 유전자이다.
이것은 특히 치료 효과를 가진 단백질 생성물을 암호화하는 유전자일 수 있다. 이런식으로 암호화된 단백질 생성물은 단백질, 펩티드, 아미노산등 일 수 있다. 이러한 단백질 생성물은 표적 세포에 대해 상동성일 수 있다( 즉 어떠한 병리도 제기하지 않는 표적 세포내에서 정상적으로 발현되는 생성물). 이 경우에, 단백질의 발현은 예를 들면 변형의 결과로써 세포내 불충분한 발현 또는 불활성 이거나 약한 활성 단백질의 발현을 완화시키거나, 단백질의 과발현을 가능하게 한다. 치료 유전자는 또한 증가된 안정성, 변형된 활성등을 가진 세포성 단백질의 돌연변이를 암호화할 수 있다. 단백질 생성물은 또한 표적 세포에 대해 이종일 수 있다. 이 경우에, 발현된 단백질은 예를 들면 질병과 대항하는 것을 가능하게 하는 세포내 부족한 활성을 보충 또는 제공할 수 있다.
본 발명의 목적을 위한 치료 생성물중에는 특히 효소, 혈액 유도체, 호르몬, 림포킨: 인터루킨, 인터페론, TNF등( FR 9203120), 성장 인자, 신경전달물질 또는 이의 전구체 또는 합성 효소, 영양 인자: BDNF, CNTF, NGF, IGF, GMF, aFGF, bFGF, NT3, NT5등; 아포리포단백질: ApoAI, ApoAIV, ApoE등( FR 93 05125), 디스트로핀 또는 미니디스트로핀( FR 9111947), 종양 억제자 유전자: p53, Rb, RaplA, DCC, k-rev등( FR 93 04745), 응고와 관련된 인자 암호화 유전자: 인자 Ⅶ, Ⅷ, Ⅸ등, 자기 불활화 유전자: 티미딘 키나제, 시토신 디아미나제등이 언급될 수 있다.
치료 유전자는 표적 세포내 발현이 유전자 발현 또는 세포성 mRNA의 전사를 제어하는 것을 가능하게 하는 안티센스 유전자 또는 서열일 수 있다. 이러한 서열은 유럽 특허 제 140 308 호에 설명된 기술에 따라 예를 들면, 표적 세포내에서, 세포성 mRNA에 상보적이고 이에 따라 단백질로의 해독을 차단하는 RNA내로 전사될 수 있다.
전술한 바와 같이, 이종 DNA 서열은 또한 사람에서 면역 반응을 발생시킬 수 있는 항원 펩티드를 암호화하는 하나 이상의 유전자를 함유할 수 있다. 이러한 특정의 실행적 양태에서, 본 발명은 사람을 특히 미생물 또는 바이러스에 대해 면역시키는 것을 가능하게 하는 백신의 생성을 허용한다. 이러한 것은 Epstein Barr 바이러스, HIV 바이러스, B형 간염 바이러스( EP 185 573), 위(pseudo)-광견병 바이러스에 특이적이거나, 또는 종양( EP 259 212)에 특이적인 항원 펩티드일 수 있다.
일반적으로, 이종 핵산 서열은 또한 감염된 세포에서 기능적인 전사를 위한 프로모터 영역을 포함한다. 이것은 이러한 영역이 감염된 세포에서 기능적일 때 고려된 유전자의 발현에 본질적으로 관여하는 프로모터 영역일 수 있다. 이것은 또한( 다른 단백질의 발현에 관여하거나, 또는 합성적)상이한 기원일 수 있다. 특히 이것은 진핵세포 또는 바이러스 유전자의 프로모터 서열일 수 있다. 예를 들면, 이것은 감염시키고자 하는 세포의 게놈으로부터 유도된 프로모터 서열일 수 있다. 또한, 이것은 사용된 아데노바이러스를 포함한 바이러스의 게놈으로부터 유도된 프로모터 서열일 수 있다. 이러한 관점에서, 예를 들면, E1A, MLP, CMV, RSV 유전자 등의 프로모터가 언급될 수 있다. 추가로, 이들 프로모터 영역은 활성화 서열, 조절 서열, 또는 우세한 또는 조직-특이성 발현을 허용하는 서열의 첨가에 의해 변형될 수 있다. 또한, 이종 핵산이 프로모터 서열을 함유하지 않을 때, 이러한 서열의 결손 바이러스 다운스트림의 게놈에 삽입될 수 있다.
추가로, 이종 핵산 서열은 또한 특히 치료 유전자의 업스트림에, 합성된 치료 생성물을 표적 세포의 분비로로 지향시키는 시그널 서열을 포함할 수 있다. 이러한 시그널 서열은 치료 생성물의 천연 시그널 서열일 수 있지만, 또한 여타 기능적 시그널 서열, 또는 합성 시그널 서열일 수 있다.
특히 유리한 양식에서, 본 발명의 벡터는 이종 프로모터의 조절하에서 기능적 E3 유전자를 추가로 포함한다. 바람직하게는, 벡터는 gp19K 단백질의 발현을 허용하는 E3 유전자의 영역을 갖는다. 사실 이러한 단백질은 아데노바이러스 벡터가 (ⅰ) 이의 작용을 제한하고 (ⅱ) 불리한 부작용을 가질 수 있는 면역 반응의 대상이 되는 것을 피할 수 있게 한다.
본 발명에 따른 재조합 아데노바이러스는 다양한 기원일 수 있다. 구조와 특성이 다소 다양하지만, 필적할 만한 유전자 구성을 보이는 각종 아데노바이러스 혈청형이 존재한다. 이러한 이유로 해서, 본원에 기술되어 있는 기술은 여타 유형의 아데노바이러스에 대해서도 당해 분야의 기술자에 의해 용이하게 재현될 수 있다.
더욱 상세히 말해서, 본 발명의 아데노바이러스는 사람, 동물 또는 혼합(사람과 동물) 기원일 수 있다.
사람 기원의 아데노바이러스와 관련하여, C 그룹으로 분류된 것들의 사용이 바람직하다. 더욱 바람직하게는, 각종 사람 아데노바이러스 혈청형 가운데 유형 2 또는 5 아데노바이러스(Ad2 또는 Ad5)의 사용이 본 발명의 구성에서 바람직하다.
전술한 바와 같이, 본 발명의 아데노바이러스는 동물 기원일 수 있거나, 동물 기원의 아데노바이러스로부터 유도된 서열을 함유할 수 있다. 본 출원인은 사실상 동물 기원의 아데노바이러스가 고효율로 사람 세포를 감염시킬 수 있고, 이들이 시험되는 사람 세포에서 증식할 수 없음을 보였다(특허 출원 FR 93 05954 참조). 또한 본 출원인은 동물 기원의 아데노바이러스가 사람 기원의 아데노바이러스에 의하여 결코 트랜스상보화되지 않으며, 이에 따라 감염성 입자의 형성을 유도할 수 있는 사람 아데노바이러스 존재하, 생체내 재조합 및 증식의 위험이 제거된다. 유전자 치료에서 벡터로서 바이러스의 사용시 내재하는 위험이 한층 적어지므로 따라서 동물 기원의 아데노바이러스 또는 아데노바이러스 영역을 사용하는 것이 특히 유리하다.
본 발명의 구성에 사용될 수 있는 동물 기원의 아데노바이러스는 개, 소, 쥐, [참조문헌: Mav1, Beard et al., Virology 75 (1990) 81], 양, 돼지 또는 조류 기원이거나 원숭이 기원(예: SAV)일 수 있다. 구체적으로 말해서, 조류 아데노바이러스 중에서 예를 들면 균주 Phelps(ATCC VR-432), Fontes(ATCC VR-280), P7-A(ATCC VR-827), IBH-2A(ATCC VR-828), J2-A(ATCC VR-829), T8-A(ATCC VR-830), K-11(ATCC VR-921) 또는 균주 ATCC VR-831 내지 835와 같이 ATCC로부터 입수할 수 있는 혈청형 1 내지 10이 언급될 수 있다. 소 아데노바이러스 중에서 공지되어 있는 각종 혈청형, 특히 ATCC VR-313, 314, 639-642, 768 및 769하에 ATCC(유형 1 내지 8)로부터 입수될 수 있는 것들이 사용될 수 있다. 또한, 쥐 아데노바이러스 FL(ATCC VR-550) 및 E20308(ATCC VR-528), 유형 5(ATCC VR-1343), 또는 유형 6(ATCC VR-1340) 양 아데노바이러스; 돼지 아데노바이러스(5359), 또는 원숭이 아데노바이러스, 예를 들면 특히 기탁 번호 VR-591-594, 941-943, 195-203 등의 ATCC로부터의 아데노바이러스가 언급될 수 있다.
바람직하게는, 동물 기원의 각종 아데노바이러스 중에서 개 기원의 아데노바이러스 또는 아데노바이러스 영역, 특히 모든 CAV2 아데노바이러스 균주[예를 들면, 맨해튼 또는 A26/61 균주(ATCC VR-800)]가 본 발명의 구성에 사용된다. 개 아데노바이러스는 다양한 구조 연구의 주체이다. 즉, CAV1 및 CAV2 아데노바이러스의 완전한 제한 지도는 당해 분야[참조문헌:Spibey et al., J. Gen. Virol, 70(1989) 165]에 기술되어 있고, Ela 및 E3 유전자, 및 ITR 서열이 클로닝되고 서열분석 되었다[참조문헌:Spibey et al., Virus Res. 14 (1989) 241; Linne, Virus Res. 23 (1992) 119, WO 91/11525].
본 발명에 따른 결손 재조합 아데노바이러스는 다양한 방법으로 제조될 수 있다.
제 1 방법은 시험관 내에서(연결에 의하여, 또는 플라스미드 형태로) 제조된 결손 재조합 바이러스로부터의 DNA를 즉, 결손 바이러스의 상보화에 필요한 모든 기능을 트랜스로 운반하는 컴피턴트 세포주 중으로 형질감염시키는 것으로 이루어진다. 이러한 기능은 바람직하게는 세포의 게놈 중에 통합되고, 이로하여 재조합의 위험을 감소시키고, 세포주에 증가된 안정성을 부여하게 된다. 이러한 세포주의 제조는 실시예에서 기술된다.
제 2 접근법은 시험관 내에서(연결에 의하여, 또는 플라스미드 형태로) 제조된 결손 재조합 바이러스로부터의 DNA 및 하나 이상의 헬퍼 바이러스 또는 플라스미드로부터의 DNA를 적당한 세포주 중으로 동시형질감염시키는 것으로 이루어진다. 이러한 방법에 따라, 재조합 아데노바이러스의 모든 결손 기능을 상보화할 수 있는 컴피턴트 세포주를 취할 필요는 없다. 이러한 기능 중 일부는 사실 헬퍼 바이러스(들)에 의하여 상보화된다. 이러한 헬퍼 바이러스는 그 자체로는 결손형이다. 이러한 방법에 따른 본 발명의 결손 재조합 아데노바이러스의 제조 또한 실시예에서 설명된다.
이러한 관점에서, 본 출원은 또한 Ad5 아데노바이러스 게놈의 변형된 좌측 부분을 함유하는 플라스미드(플라스미드 pCO1 및 pCO2)의 작제를 기술한다. 이들 플라스미드는 유전자 치료용 벡터로서 결손 재조합 아데노바이러스의 작제에 특히 유용하다. 즉, 플라스미드 pCO1은 아데노바이러스 게놈의 좌측 영역, 즉 좌측 ITR부터 6316번 뉴클레오타이드까지를 함유하고, E1 유전자에 상응하는 382 내지 3446번 뉴클레오타이드 영역이 결실되어 있다. 이러한 플라스미드는 종래 기술에서 기술되고 있는 이러한 유형의 기타 플라스미드에 비하여, E1 유전자에 있어서 더 큰 결실을 함유하고, 이로하여 더 큰 클로닝능 및, 특히 더 적은 재조합 위험성을 제공하기 때문에 특히 유리하다. 플라스미드 pCO2는 플라스미드 pCO1으로부터 IVa2 유전자 부분에 상응하는 4106 내지 5186번 뉴클레오타이드 추가 영역을 결실시킴으로써 유도된다. 이러한 결실은 E2 유전자에 영향을 미치지 않는 장점이 있다. 플라스미드 pCO6는 플라스미드 pCO1으로부터 정지 코돈을 IVa2 유전자의 판독 프레임 중으로 삽입시킴으로써 유도된다. 더욱이, 플라스미드 pCO1, pCO2 및 pCO6는 해당 이종 핵산 서열의 이입을 허용하는 다수의 클로닝 부위를 함유한다. 이어서, 생성되는 작제물은 아데노바이러스 게놈의 우측 부분에 상응하는 DNA로 컴피턴트 세포주를 동시형질감염시킴으로써 결손 재조합 아데노바이러스를 제조하는 데 사용될 수 있다. 후자와 관련하여 이는 야생형 바이러스, 또는 E3 영역이 결실되어 있는 Add1324, 및 E4 영역이 결실되어 있는 Add1808[참조문헌:Weinberg et al., J. Virol. 57(1986) 833] 등(실시예 참조)과 같이 자체 결손형 바이러스의 게놈으로부터 유도될 수 있다. 사용될 수 있는 세포주 가운데 특히 사람 배 신장 세포주 293, KB 세포, Hela 세포, MDCK, GHK 등, 및 더욱 일반적으로는 결실 영역을 상보화하는 여타의 세포주(실시예 참조)가 언급될 수 있다.
이어서, 증식시킨 재조합 바이러스를 통상적인 바이러스학 기술에 따라 회수하고 정제한 다음 증폭시킨다.
즉, 플라스미드 pCO1는 382 내지 3446번 뉴클레오타이드에 걸친 E1 유전자에 결실을 지닌 결손 재조합 아데노바이러스의 작제를 허용한다.
플라스미드 pCO2는 382 내지 3446번 뉴클레오타이드에 걸쳐서 E1 유전자에 결실이 있고, 4106 내지 5186번 뉴클레오타이드에 걸쳐서 IVa2 유전자에 결실이 있는 결손 재조합 아데노바이러스의 작제를 허용한다.
플라스미드 pCO6은 382 내지 3446번 뉴클레오타이드에 걸쳐서 E1 유전자에 결실이 있고, IVa2 유전자가 정지 코돈의 판독 프레임 중으로의 삽입에 의하여 Ad5 아데노바이러스의 5141번 염기에 상응하는 Sph1 부위 수준에서 불활성화되는 결손 재조합 아데노바이러스의 작제를 허용한다.
본 발명은 또한 결손 재조합 아데노바이러스를 트랜스상보화하는 세포주의 작제를 허용하는 플라스미드 시리즈를 기술한다. 특히, 자체 프로모터의 조절하에 있는 IVa2 유전자를 소유하는 플라스미드 pAC5 및 각각 TK 및 CMV 프로모터의 조절하에 있는 IVa2 유전자를 함유하는 플라스미드 pGY37-TK-IVa2 및 pGY37-CMV-IVa2. 이들 플라스미드는 또한 이들의 진핵 세포 중 복제를 허용하는 EBNA1/OriP 서열을 함유한다. 이들 플라스미드는 따라서 조력자 바이러스를 사용할 필요없이 IVa2에 대하여 결손 재조합 아데노바이러스를 트랜스상보화하는 세포주의 작제를 허용한다.
본 발명은 또한 전술한 바와 같이 하나 이상의 결손 재조합 아데노바이러스를 포함하는 약학 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 약학 조성물은 국소, 경구, 비경구, 비내, 정맥내, 근육내, 피하, 안내 및 경피 투여용 등으로 제형될 수 있다.
바람직하게는, 약학 조성물은 주사 제형에 약학적으로 허용되는 부형제를 함유한다. 이들은 특정의 생리식염(인산일나트륨 또는 인산이나트륨, 염화나트륨, 염화칼륨, 염화칼슘 또는 염화마그네슘 등 또는 이러한 염의 혼합물) 멸균액 또는 등장액, 또는 상황에 따라 멸균수 또는 생리식염수의 첨가로 주사액의 구성을 허용하는 건조, 특히 동결건조 조성물 형태일 수 있다.
주사용에 사용되는 바이러스 용량은 각종 파라미터의 함수, 특히 사용되는 투여 양식, 해당 병리학, 발현될 유전자, 또는 목적하는 치료 지속기간의 함수로서 적용될 수 있다. 일반적으로, 본 발명에 따른 재조합 아데노바이러스는 104 내지 1014 pfu, 바람직하게는 106 내지 1010 pfu의 용량형으로 제형되고 투여된다. 용어 pfu("플라크 형성 단위")는 바이러스 용액의 감염력에 상응하며, 적절한 세포 배양액을 감염시키고, 일반적으로 5일 후 감염 세포의 플라크수를 측정함으로써 결정된다. 바이러스 용액의 pfu 역가 측정 기술은 문헌에 잘 문서화되어 있다.
삽입된 이종 DNA 서열에 따라, 본 발명의 아데노바이러스는 유전병(발육이상, 낭포성 섬유증 등), 신경퇴행성 질환(알쯔하이머, 파킨슨, ALS 등), 암, 혈액응고 장애 또는 이상지단백혈증과 관련된 병리, 바이러스 감염과 관련된 병리(간염, AIDS 등) 등을 포함한 다양한 병리의 치료 또는 예방에 사용될 수 있다.
본 발명은 설명적이고 비제한적인 하기 실시예를 참조로하여 더욱 구체적으로 기술된다.
실시예 1. 플라스미드 pCO1(도 3)의 작제.
A. 플라스미드 pCE의 작제.
Ad5 아데노바이러스 게놈의 좌측 말단에 상응하는 EcoRI - XbaI 단편을 먼저 벡터 pIC19H의 EcoRI 및 XbaI 부위 사이에 클로닝한다. 이는 플라스미드 pCA를 생성한다. 이어서, 플라스미드 pCA를 HinfI로 자르고, 그의 돌출 5' 말단을 이. 콜라이의 DNA 폴리머라제 I의 클레나우 단편으로 채운 후, EcoRI로 자른다. 이어서, Ad5 아데노바이러스 게놈의 좌측 말단을 포함하는, 이렇게 플라스미드 pCA로부터 생성된 단편을 벡터 pIC20H의 EcoRI 및 SmaI 부위 사이에 클로닝한다[참조문헌: (Marsh 등, Gene 32(1984) 481]. 이는 플라스미드 pCB를 생성한다. 이어서, 플라스미드 pCB를 EcoRI로 자르고, 그의 돌출 5' 말단을 이. 콜라이의 DNA 폴리머라제 I의 클레나우 단편으로 채운 후, BamHI로 자른다. 이어서, Ad5 아데노바이러스 게놈의 좌측 말단을 포함하는, 이렇게 플라스미드 pCB로부터 생성된 단편을 벡터 pIC20H의 NruI 및 BglII 부위 사이에 클로닝한다. 이는 다중 클로닝 부위가 뒤따르는 Ad5 아데노바이러스의 처음 382 염기쌍을 갖는 유리한 특성의 플라스미드 pCE를 생성한다.
B. 플라스미드 pCD'의 작제.
Ad5 아데노바이러스 게놈의 Sau3A(3346) - SstI(3645) 단편 및 SstI(3645) - NarI(5519) 단편을 먼저 연결하고 벡터 pIC20H의 ClaI 및 BamHI 부위 사이에 클로닝하여, 플라스미드 pPY53을 생성한다. Sau3A(3346) 및 TaqI(5207) 부위 사이의 Ad5 아데노바이러스 게놈의 일부를 포함하는, dam- 환경으로부터 제조된 플라스미드 pPY53의 SalI - Taq-I 단편을 벡터 pIC20H의 SalI 및 ClaI 부위 사이에 클로닝하여, 플라스미드 pCA'를 생성한다. 이어서, dam- 환경으로부터 제조된 Ad5 아데노바이러스 게놈의 TaqI(5207) - NarI(5519) 단편, 및 플라스미드 pCA'의 SalI - TaqI 단편을 연결하고, 벡터 pIC20H의 SalI 및 NarI 부위 사이에 클로닝한다. 이는 플라스미드 pCC'를 생성한다. 이어서, dam- 환경으로부터 제조된 Ad5 아데노바이러스 게놈의 NarI(5519) - NruI(6316) 단편, 및 플라스미드 pCC'의 SalI - NarI 단편을 연결하고, 벡터 pIC20R의 SalI 및 NruI 부위 사이에 클로닝한다. 이는 플라스미드 pCD'를 생성한다.
C. 플라스미드 pCO1의 작제.
플라스미드 pCD'를 XhoI로 부분 분해한 후, SalI로 완전 분해하여 Sau3A(3446) 부위 내지 NruI(6316) 부위까지의 Ad5 아데노바이러스 서열을 포함하는 제한 단편을 생성한다. 이 단편을 플라스미드 pCE의 SalI 부위로 클로닝한다. 이는 플라스미드 pCO1(도 3)을 생성하며, 이는 HinfI 부위(382)까지의 Ad5 아데노바이러스의 좌측부, 다중 클로닝 부위 및 Ad5 아데노바이러스의 Sau3A(3446) - NruI(6316) 단편을 포함한다.
실시예 2. 플라스미드 pCO2(도 4)의 작제.
A. 플라스미드 pCD"의 작제.
먼저 플라스미드 pCA'으로부터 Ad5 아데노바이러스 게놈의 BssHII(4106) - BstEII(5186)에 상응하는 BssHII - BstEII 단편을 제거한다. 이는 플라스미드 pCB"를 생성하고, 이의 유리한 특성은 IVa2 유전자의 서열의 일부에 관한 결실을 갖는 것이다. dam-환경으로부터 제조된 Ad5 아데노바이러스 게놈의 TaqI(5207) - NarI(5519) 단편 및 플라스미드 pCB"의 SalI - TaqI 단편을 연결하고 벡터 pIC20H의 SalI 및 NarI 부위 사이에 클로닝한다. 이는 플라스미드 pCC"를 생성한다. 이어서, dam- 환경으로부터 제조된 Ad5 아데노바이러스 게놈의 NarI(5519) - NruI(6316) 단편 및 플라스미드 pCC"의 SalI - NarI 단편을 연결하고, 벡터 pIC20R의 SalI 및 NruI 부위 사이에 클로닝한다. 이는 플라스미드 pCD"를 생성한다.
B. 플라스미드 pCO2의 작제.
플라스미드 pCD"를 XhoI로 부분 분해한 후, SalI로 완전 분해하여 Sau3A(3446) 부위 내지 NruI(6316) 부위까지의 Ad5 아데노바이러스 서열을 포함하고 BssHII(4106) - BstEII(5186) 단편이 결손된 제한 단편을 생성한다. 이 단편을 플라스미드 pCE의 SalI 부위로 클로닝한다. 이는 플라스미드 pCO2(도 4)를 생성하며, 이는 HinfI(382) 부위 까지의 Ad5 아데노바이러스의 좌측부, 다중 클로닝 부위 및 Ad5 아데노바이러스의 Sau3A(3446) - NruI(6316) 단편을 포함하며, 이의 BssHII(4106) - BstEII(5186) 단편은 결실된다.
실시예 3. E1 유전자에서 결실을 갖는 재조합 아데노바이러스의 작제.
본 실시예는 382 내지 3446번 뉴클레오타이드에 걸친 E1 영역에서 결실을 갖는 결손 재조합 아데노바이러스의 작제를 설명한다. 이 아데노바이러스는 E1 유전자에서 더 큰 결실을 갖고, 더 큰 클로닝 능력을 제공하며, 특히 재조합의 더 적은 위험을 가지므로 특히 유리하다.
이 재조합 아데노바이러스는 인산칼슘의 존재하에, ClaI로 분해된 AdRSVβgal 바이러스로부터의 DNA 및 XmnI로 분해된 플라스미드 pCO1을 세포 293내로 동시형질감염시킴에 의한 생체내 재조합에 의해 수득될 수 있다. 이어서, 세포를 회수하여, 그의 상등액내에서 3회의 동결-해동 사이클에 의해 파괴한 다음, 4000rpm에서 10분 동안 원심분리한다. 이어서, 이렇게 수득된 상등액을 신선한 세포 배양액에서 증식시킨다. 이어서, 바이러스를 플라크로부터 정제하여, 그의 DNA를 Hirt 방법(전술됨)에 따라 분석한다. 이어서, 바이러스 스톡을 염화세슘 구배상에서 제조한다.
실시예 4. E1 및 IVa2 유전자에서 결실을 갖는 재조합 아데노바이러스의 작제.
본 실시예는 382 내지 3446번 뉴클레오타이드에 걸쳐서 E1 영역에서 결실 및 IVa2 영역에서 결실을 갖는 결손 재조합 아데노바이러스의 작제를 설명한다. 이 아데노바이러스는 실시예 3에 설명된 아데노바이러스와 비교할 때, IVa2 유전자에서 결실을 갖고, 더 큰 클로닝 능력을 제공하며, 특히, 생체내 바이러스 단백질의 생산의 더 적은 위험을 가지므로 특히 유리하다.
A. E1 기능(E1+)을 트랜스상보화하는 세포주내 결손 재조합 아데노바이 러스 Δ1-ΔIa2의 작제.
재조합 아데노바이러스를 하기의 3가지 절차에 따라 제조한다:
(a) ClaI로 분해된 AdRSVβgal 바이러스 DNA 및 XmnI로 분해된 플라스미드 pCO2를 인산칼슘의 존재하에 세포 E1+(293 또는 293 E4)로 동시형질감염시켜, 생체내 재조합시킨다.
(b) ClaI 및 XcaI로 분해된 AdRSVβgal 바이러스 DNA 및 XmnI으로 분해된 플라스미드 pCO2를 인산칼슘의 존재하에 세포 E1+(293 또는 293 E4)로 동시형질감염시켜, 생체내 재조합시킨다.
(c) 모두 XcaI로 분해된 AdRSVβgal 바이러스 DNA 및 플라스미드 pCO2를 먼저 시험관내 연결한 다음, 생성된 작제물을 인산칼슘의 존재하에 세포 E1+(293 또는 293 E4)로 형질감염시킨다.
(d) ClaI로 분해된 AdRSVβgal 바이러스 DNA, XmnI로 분해된 플라스미드 pCO2 DNA 및 헬퍼 바이러스 pAC2의 DNA를 인산칼슘의 존재하에 세포 E1+(293 또는 293 E4)로 동시형질감염시킨다.
(e) ClaI로 분해된 AdRSVβgal 바이러스 DNA, XmnI으로 분해된 플라스미드 pCO6 DNA 및 헬퍼 바이러스 pAC2의 DNA를 인산칼슘의 존재하에 세포 E1+(293 또는 293 E4)로 동시형질감염시킨다.
(플라스미드 pAC2 및 pCO6을 실시예 7에서 설명한다.)
이어서, 생성된 바이러스를 실시예 3에서와 같이 증식하고 정제한다.
B. IVa2 기능을 트랜스상보화하는 세포주내 아데노바이러스 ΔE1-ΔIVa2의 작제.
아데노바이러스 Ad5의 IVa2 영역을 발현하는 세포 클론에서, 아데노바이러스 ΔE1-ΔIVa2를 하기의 2가지 절차에 따라 제조할 수 있다:
(a) ClaI으로 분해된 AdRSVβgal 바이러스 DNA 및 XmnI으로 분해된 플라스미드 pCO2 DNA를 인산칼슘의 존재하에 세포로 동시형질감염시킨다.
(b) ClaI으로 분해된 AdRSVβgal 바이러스 DNA 및 XmnI으로 분해된 플라스미드 pCO6 DNA를 인산칼슘의 존재하에 세포로 동시형질감염시킨다.
실시예 5. E1, E3 및 IVa2 유전자에서 결실을 갖는 재조합 아데노바이러스의 작제.
본 실시예는 382 내지 3446번 뉴클레오타이드에 걸쳐서 E1 영역에서 결실, IVa2 유전자에서 결실, 및 E3 영역에서 결실을 갖는 결손 재조합 아데노바이러스의 작제를 설명한다. 이 아데노바이러스는 실시예 4에 설명된 아데노바이러스와 비교할 때, E3 영역에서 결실을 갖고, 더 큰 클로닝 능력을 제공하므로 특히 유리하다.
재조합 아데노바이러스를 하기의 3가지 절차에 따라 제조한다:
(a) ClaI로 분해된 Addl324 바이러스 DNA 및 XmnI으로 분해된 플라스미드 pCO2를 인산칼슘의 존재하에 세포 293으로 동시형질감염시켜, 생체내 재조합시킨다.
(b) ClaI 및 XcaI로 분해된 Addl324 바이러스 DNA 및 XmnI로 분해된 플라스미드 pCO2를 인산칼슘의 존재하에 세포 293으로 동시형질감염시켜, 생체내 재조합시킨다.
(c) 모두 XcaI로 분해된 Addl324 바이러스 DNA 및 플라스미드 pCO2를 먼저 시험관내 연결한 다음, 생성된 작제물을 인산칼슘의 존재하에 세포 293으로 동시형질감염시킨다.
이어서, 생성된 바이러스를 실시예 3에서와 같이 증식시키고 정제한다.
실시예 6. E1, E3, E4 및 IVa2 유전자에서 결실을 갖는 재조합 아데노바이러스의 작제.
본 실시예는 게놈에서 IVa2, E1, E3 및 E4 유전자가 결실된, 본 발명에 따른 결손 재조합 아데노바이러스의 제조를 설명한다. 이 아데노바이러스는 무엇보다도, 이종 유전자를 삽입하는 큰 능력을 소유한다. 더욱 더, 이들 벡터는 IVa2 영역 및 E4 영역의 결실로 인해 매우 안전하다. 후자는 실제로 후기 유전자의 발현의 조절에, 후기 예비메신저 RNA의 프로세싱, 숙주 세포의 단백질 발현의 소멸 및 바이러스 DNA의 복제의 효율에 관여한다. 따라서, 이들 벡터는 매우 감소된 전사 백그라운드 노이즈 및 바이러스 유전자 발현을 소유한다. 마지막으로, 특히 유리한 방식으로, 이들 벡터를 높은 역가로 생산할 수 있다.
바이러스 게놈의 우측 부분은 E3 및 E4 영역(섹션 B를 참조)에서, 또는 예를 들면, [참조문헌: G. Ketner, J. of Virology, 63 (1989) 631]에서 설명된 바이러스 dl808, dl1004, dl1007 또는 dl1010의 경우에서와 같이 E4 영역에서만 결실된다. 다른 방안에 따라, 우측 부분은 몇몇 영역에서, 예를 들면, 시험관내 작제되고 플라스미드 pPY55로부터 하기에 따라 제조된 바이러스 내에 존재하는 바와 같이 E3 및 E4 영역에서 결실을 포함할 수 있다.
A. E1, E3 및 E4 유전자에서 결실된 아데노바이러스의 작제.
A.1. 플라스미드 pPY55의 작제.
a) 플라스미드 pPY32의 작제.
Ad5 아데노바이러스 게놈의 우측 말단에 상응하는, 플라스미드 pFG144의 AvrII - BcII 단편[참조문헌: F.L. Graham 등. EMBO J. 8(1989) 2077-2085]를 먼저 dam- 환경으로부터 제조된 벡터 pIC19H의 XbaI 및 BamHI 부위에 클로닝한다. 이는 플라스미드 pPY23을 생성한다. 플라스미드 pPY23의 하나의 유리한 특성은 벡터 pIC19H의 다중 클로닝 부위로부터 수득된 SalI 부위가 유일하게 남아있으며, Ad5 아데노바이러스의 게놈의 우측 말단 옆에 위치되는 것이다. 이어서, 부위 35614에 위치된 HaeIII 부위로부터, Ad5 아데노바이러스의 게놈의 우측 말단을 포함하는 플라스미드 pPY23의 HaeIII - SalI 단편을 벡터 pIC20H의 EcoRV 및 XhoI 부위 사이에 클로닝하며, 이는 플라스미드 pPY29를 생성한다. 이 플라스미드의 하나의 유리한 특성은 벡터 pIC20H의 다중 클로닝 부위로부터 수득된 XbaI 및 ClaI 부위가 클로닝으로부터 생성된 EcoRV/HaeIII 접합부 옆에 위치되는 것이다. 추가로, 이 접합은 dam+ 환경에서 메틸화될 수 있게 된 ClaI 부위에 바로 인접한 뉴클레오타이드 환경을 변형한다. 이어서, Ad5 아데노바이러스의 게놈의 XbaI(30470) - MaeII(32811) 단편을 dam- 환경으로부터 제조된 플라스미드 pPY29의 XbaI 및 ClaI 부위 사이에 클로닝하여, 플라스미드 pPY30을 생성한다. 부위 30556내 SstI 부위에서 우측 말단까지의 Ad5 아데노바이러스의 게놈의 서열에 상응하는, 플라스미드 pPY30의 SstI 단편을 벡터 pIC20H의 SstI 부위 사이에 최종적으로 클로닝하여, 플라스미드 pPY31을 생성하며, 이의 HindIII 부위 사이에 위치된 삽입물의 제한효소 지도를 도 5에 나타낸다.
플라스미드 pPY31을 BglII로 부분 분해시킨 후, BamHI로 완전 분해시킨 다음 재연결한 후 플라스미드 pPY32를 수득한다. 따라서, 플라스미드 pPY32는 플라스미드 pPY31의 BamHI 부위 및 부위 30818에 위치된 BglII 부위 사이에 놓여있는 Ad5 아데노바이러스의 게놈에 관한 결실에 상응한다. 플라스미드 pPY32의 HindIII 단편의 제한효소 지도를 도 5에 나타낸다. 플라스미드 pPY32의 한 특성은 유일한 SalI 및 XbaI 부위를 소유하는 것이다.
b) 플라스미드 pPY47의 작제.
Ad5 아데노바이러스 게놈의 BamHI(21562) - XbaI(28592) 단편을 먼저 dam- 환경으로부터 제조된 벡터 pIC19H의 BamHI 및 XbaI 부위 사이에 클로닝하여, 플라스미드 pPY17을 생성한다. 따라서, 이 플라스미드는 Ad5 아데노바이러스 게놈의 HindIII(26328) - BglII(28133) 단편을 포함하며, 이는 벡터 pIC20R의 HindIII 및 BglII 부위 사이에 클로닝되어, 플라스미드 pPY34를 생성할 수 있다. 이 플라스미드의 한 특성은 다중 클로닝 부위로부터 수득된 BamHI 부위가 Ad5 아데노바이러스 게놈의 HindIII(26328)의 바로 근처에 위치되는 것이다.
이어서, 플라스미드 pPY17로부터 수득된 Ad5 아데노바이러스의 게놈의 BamHI(21562) - HindIII(26328) 단편을 플라스미드 pPY34의 BamHI 및 HindIII 부위 사이에 클로닝하여, 플라스미드 pPY39를 생성한다. 이어서, BamHI(21562) 및 BglII(28133) 부위 사이의 Ad5 아데노바이러스의 게놈의 일부를 포함하는, dam- 환경으로부터 제조된 플라스미드 pPY39의 BamHI - XbaI 단편을 dam- 환경으로부터 제조된 벡터 pIC19H의 BamHI 및 XbaI 부위 사이에 클로닝한다. 이는 플라스미드 pPY47을 생성하며, 이의 한 유리한 특성은 다중 클로닝 부위로부터 수득된 SalI 부위가 HindIII 부위(도 6)의 근처에 위치되는 것이다.
c) 플라스미드 pPY55의 작제.
dam- 환경으로부터 제조되고, BamHI(21562) 부위에서 BglII(28133) 부위까지 뻗어있는 Ad5 아데노바이러스 게놈 부분을 포함하는 플라스미드 pPY47의 SalI - XbaI 단편을 플라스미드 pPY32의 SalI 및 XbaI 부위 사이에 클로닝하여, 플라스미드 pPY55를 생성한다. 이 플라스미드는 적어도 E3 영역에 관하여(Ad5 아데노바이러스의 게놈의 부위 28133 및 30818에 위치된 BglII 부위 사이의 결실) 및 전체 E4 영역에 관하여(Ad5 아데노바이러스의 게놈의 MaeII(32811) 및 HaeIII(35614) 부위 사이의 결실) 결실된 재조합 아데노바이러스를 생산하기 위해 직접적으로 사용될 수 있다(도 6).
A.2. 플라스미드 pE4Gal의 작제.
이를 위하여, Ad5로부터의 연결 ITR, 캡시드화 서열, 그의 자체 프로모터의 제어하의 E4 유전자 및, 이종 유전자로서 RSV 바이러스의 LTR 프로모터의 제어하의 LacZ 유전자를 갖는 플라스미드를 작제한다(도 7). pE2Gal로 명명된 이 플라스미드는 하기의 단편(도 7 참조)의 클로닝 및 연결에 의해 수득된다:
- 플라스미드 pFG144로부터 유도된 HindIII - SacII 단편[참조문헌: Graham 등, EMBO J. 8 (1989) 2077]. 이 단편은 직렬로 Ad5로부터의 ITR 서열 및 캡시드화 서열: HindIII(34920) - SacII(352) 단편을 갖는다;
- SacII (염기쌍 3827의 레벨에 위치된) 및 PstI (염기쌍 4245의 레벨에 위치된) 부위 사이의 Ad5로부터의 단편;
- PstI (bp 32) 및 SalI (bp 34) 부위 사이의 pSP72(Promega)의 단편;
-[참조문헌: Stratford-Perricaudet 등, JCI 90 (1992) 626]에 설명된 플라스미드 pAdLTR GalIX의 XhoI - XbaI 단편. 이 단편은 RSV 바이러스의 LTR의 제어하의 LacZ 유전자를 갖는다.
- 플라스미드 pSP72의 XbaI (bp 40) - NdeI (bp 2379) 단편;
- Ad5내 NdeI (bp 31089) - HindIII (bp 34930) 단편; Ad5 게놈의 우측 말단으로부터 위치되는 이 단편은 자체 프로모터의 제어하의 E4 영역을 포함한다. 이는 플라스미드 pSP72의 NdeI (2379) 부위 및 제 1 단편의 HindIII 부위에서 클로닝된다.
이 플라스미드는 다양한 단편을 플라스미드 pSP72의 지시된 영역으로 클로닝하여 수득된다. 이는 동등한 단편으로 이해된다[lacuna].
A.3. 세포 293으로의 동시형질감염.
하기의 단계에 따른, 생체내 재조합에 의해 아데노바이러스를 수득한다:
(i) 모두 BamHI로 분해된, Ad-dl324 바이러스로부터의 DNA [ 참조문헌: Thimmappaya 등, Cell 31 (1982) 543] 및 플라스미드 pPY55를 먼저 시험관내 연결한 다음, 플라스미드 pEAGal와 함께 세포 293내로 동시형질감염시킨다.
(ii) EcoRI로 분해된 Ad-dl324 바이러스로부터의 DNA 및 BamHI로 분해된 플라스미드 pPY55를 플라스미드 pE4Gal와 함께, 세포 293내로 동시형질감염시킨다.
(iii) 모두 BamHI로 분해된, Ad5 아데노바이러스로부터의 DNA 및 플라스미드 pPY55를 연결한 다음, 플라스미드 pE4Gal와 함께 세포 293내로 동시형질감염시킨다.
(iv) EcoRI로 분해된 Ad5 아데노바이러스로부터의 DNA 및 BamHI로 분해된 플라스미드 pPY55를 pEAGal와 함께, 세포 293내로 동시형질감염시킨다.
단계 (i) 및 (ii)는 E1, E3 및 E4 영역에 관하여 결실된 재조합 아데노바이러스를 생성할 수 있게 하고; 단계 (iii) 및 (iv)는 E3 및 E4 영역에 관하여 결실된 재조합 아데노바이러스를 생성할 수 있게 한다. 더욱 더, 예를 들면, 세포주 293과 같이 E1 영역을 발현하는 세포주 및 또한, Ad5 아데노바이러스 E4 영역의 적어도 개방 판독 프레임 ORF6 및 ORF6/7을 발현하는 세포주로부터 유도된 세포주를 또한 사용할 수 있다(FR93/08596을 참조). 그러한 세포주의 사용은 플라스미드 pE4Gal의 사용을 피할 수 있게 한다.
B. IVa2, E1, E3 및 E4 유전자에서 결손된 아데노바이러스의 작제.
본 아데노바이러스는, 플라스미드 pCO2(실시예 2), 및 적어도 E4 영역에 관하여 결실된 아데노바이러스의 우측 부분, 예를 들면, 플라스미드 pPY55를 사용한 후 수득된 아데노바이러스(섹션 A를 참조)를 세포 293내로 동시형질감염시킨 후에, 재조합에 의해 수득된다.
인산 칼슘을 이용하여 동시형질감염시킨 후, 세포를 회수하고, 그의 상등액내에서 3회의 동결-해동 사이클로 파괴한 다음 4000rpm에서 10분 동안 원심분리한다. 이어서, 이렇게 수득된 상등액을 신선한 세포 배양액에서 증식시킨다. 이어서, 플라크로부터 바이러스를 정제하고, 그의 DNA를 Hirt 방법(전술됨)에 따라 분석한다. 이어서, 염화세슘 구배 상에 바이러스 스톡을 제조한다.
실시예 7. E1,E4, IVa2 유전자에서 결실을 갖는 재조합 아데노바이러스의 작제.
A. 플라스미드 pCO6의 작제(도 8).
A.1. 플라스미드 pGY38의 작제.
염기 3924 내지 6316 범위의 Ad5 아데노바이러스 게놈의 서열 및 특히 IVa2 유전자(염기 4094 내지 5719)를 포함하는 플라스미드 pCO1의 MunI - NruI 단편을 시판되는 벡터 pSL1180의 MunI 및 NruI 부위 사이에 클로닝한다. 이는 플라스미드 pGY38을 생성한다.
A.2. 플라스미드 pGY39의 작제.
하기의 뉴클레오타이드 서열 및 그의 상보적인 본쇄를 통상의 분자 생물학의 기술에 의해 인공적으로 합성한다:
[서열1]
Figure pct00001
각각의 본쇄는 그의 3' 말단에 SphI 제한효소 부위를 갖는다. 이 서열을 플라스미드 pGY38의 SphI 부위로 클로닝한다: 이는 Ad5 아데노바이러스의 염기 5141에 상응하는 SphI 부위에서, IVa2 유전자의 암호화부에 정지 코돈을 도입한다. 이는 플라스미드 pGY39를 생성한다. 이러한 플라스미드에서, 이렇게 변형된 IVa2 유전자는 불활성화된다: 이는 야생형 IVa2 단백질의 처음 102 아미노산에 상응하는 불활성 단백질을 암호화한다.
A.3. 플라스미드 pCO6의 작제.
플라스미드 pGY39의 MunI - NruI 단편을 플라스미드 pCO1의 MunI 및 NruI 부위 사이에 클로닝한다. 이는 HinfI 부위(382)까지의 Ad5 아데노바이러스의 좌측 부분, 다중 클로닝 부위, Ad5 아데노바이러스의 Sau3A(3446) - SphI(5141) 단편, IVa2 유전자의 암호화 서열에 정지 코돈을 제공하는 올리고뉴클레오타이드, 및 Ad5 아데노바이러스의 SphI(5141) - NruI(6316) 단편을 포함하는 플라스미드 pCO6(도 8)을 생성한다.
B. 플라스미드 pAC2의 작제(도 9).
B.1. 플라스미드 pSPITR의 작제.
하기의 단편을 클로닝한다:
- 플라스미드 pFG144[참조문헌: Graham 등, EMBO J. 8, 1989, 2027]으로부터 유도된 HindIII(34930) - SacII (357) 단편(이 단편은 직렬로 Ad5 아데노바이러스의 ITR 서열 및 캡시드화 서열을 포함한다),
- 부위 SacII(Ad5내 염기 3827의 레벨에 위치된) 및 PstI(염기 4245의 레벨에 위치된) 사이의 Ad5 아데노바이러스 단편.
이어서, 시판되는 플라스미드 pSP72의 HindIII 및 PstI 부위 사이에 이들 단편을 연결시켜 플라스미드 pSPITR을 수득한다.
B.2. 플라스미드 pAC2의 작제.
염기 4029 내지 6316 범위의 Ad5 아데노바이러스 게놈의 서열, 및 특히 IVa2 유전자 및 그의 프로모터를 포함하는 플라스미드 pCO1의 DraI - NruI 단편을 벡터 pIC20H의 EcoRV 부위로 클로닝한다[참조문헌: J.L. March 등, (1984) Gene, 32, 481-485] . 이는 플라스미드 pAC1를 생성한다. 플라스미드 pAC1의 BglII - BamHI 단편을 플라스미드 pSPITR의 BamHI내로 클로닝하여, 플라스미드 pAC2를 생성한다(도 9).
C. 플라스미드 pAC5의 작제(도 10).
C.1. 플라스미드 pAC3의 작제.
시판되는 플라스미드 pMEP4(Invitrogen)의 EcoRI - XbaI 단편을 플라스미드 pAC1의 EcoRI 및 XbaI 부위 사이에 연결한다. 이는 플라스미드 pAC3을 생성하며, 이의 한 특성은 ECNA1-OriP 서열 및 IVa2 유전자를 포함하는 것이다.
C.2. 플라스미드 pAC5의 작제.
시판되는 플라스미드 pMSCV의 SalI - XhoI 단편을 벡터 pIC20H의 SalI 부위로 클로닝한다. 이는 Neo 유전자를 포함하는 플라스미드 pAC4를 생성한다. 플라스미드 pAC3의 XbaI - NruI 단편을 플라스미드 pAC4의 XbaI 및 NruI 부위 사이에 클로닝한다. 이는 플라스미드 pAC5(도 10)를 생성하며, 이의 중요한 특성은 그의 자체 프로모터의 제어하의 Neo 유전자 및 IVa2 유전자를 포함하는 것이다. 추가로, 이 플라스미드는 EBNA1/OriP 서열을 포함하므로 진핵 세포내에서 복제할 수 있다.
D. 플라스미드 pGY37-TK-IVa2의 작제(도 11).
D.1. 플라스미드 pGY32의 작제.
하기의 뉴클레오타이드 서열 및 그의 상보적인 본쇄를 통상의 분자 생물학의 기술에 의해 인공적으로 합성한다:
[서열 2]
Figure pct00002
이는 그의 5' 말단에 SalI에 대한 제한효소 부위 및 그의 3' 말단에 Eco47III에 대한 제한효소 부위를 갖는다. 이 서열을 Ad5 아데노바이러스 서열의 염기 5411에 상응하는 IVa2 유전자의 개시부의 SalI 부위 및 Eco47III 부위 사이에 플라스미드 pAC1내로 삽입한다. 이는 플라스미드 pGY32를 생성하며, 이의 중요한 특성은 IVa2 유전자의 ATG앞의 Kozak 공통염기서열의 업스트림에 다중 클로닝 부위(BamHI, AflII, HincII)를 갖는 것이다. 추가로, 이러한 작제에서, IVa2 유전자의 인트론은 억제된다.
D.2. 플라스미드 pGY33-TK의 작제.
플라스미드 pX4B[참조문헌: B. Wasylyk 등, N.A.R. (1987), 15, 13, 5490]의 TK 프로모터의 BamHI(-110) - HincII(+35) 단편 및 SalI 및 BamHI 부위로 경계지워지는 다중 클로닝 부위를 연결한 다음, 플라스미드 pGY32의 SalI 및 HincII 부위 사이에 클로닝한다. 이는 플라스미드 pGY33-TK를 생성하며, 이의 유리한 특성은 TK 프로모터의 제어하의 인트론이 없는 IVa2 유전자를 포함하는 것이다.
D.3. 플라스미드 pGY34의 작제.
하기의 단편을 제조한 다음 연결한다:
- 시판되는 플라스미드 pMEP4(5.5kb)의 XbaI - PvuI 단편 (이 단편은 EBNA1/OriP 서열 및 앰피실린 내성 유전자의 5' 말단을 포함한다),
- 시판되는 플라스미드 pMEP4(0.8kb)의 PvuI - AlwNI 단편 (이 단편은 앰피실린 내성 유전자의 3' 말단 및 복제 기원의 부분을 포함한다),
- 플라스미드 pIC20H(0.8kb)의 XbaI 및 AlwNI 단편 (이 단편은 복제 기원의 말단을 포함한다).
이는 EBNA1/OriP 서열을 포함하는 플라스미드 pGY34를 생성한다.
D.4. 플라스미드 pGY36의 작제.
시판되는 플라스미드 pUT614(Cayla)의 BamHI 단편을 벡터 pIC20H의 BamHI 부위로 클로닝한다. 이는 Zeo 유전자를 포함하는 플라스미드 pPY9를 생성한다. 플라스미드 pPY9의 XbaI - EcoRV 단편을 벡터 pIC20R의 XbaI 및 NruI 부위 사이에 클로닝하여, 플라스미드 pGY35를 생성한다. 이어서, dam- 환경에서 제조된 플라스미드 pGY35의 XbaI 단편을 플라스미드 pGY34의 XbaI 부위로 클로닝한다. 이는 플라스미드 pGY36을 생성한다.
D.5. 플라스미드 pGY37-TK-IVa2의 작제(도 11).
플라스미드 pGY33-TK의 BglII - SapI 단편을 플라스미드 pGY36의 BglII 및 SapI 부위 사이로 클로닝한다. 이는 플라스미드 pGY37-TK-IVa2(도 11)를 생성하며, 이의 중요한 특성은 TK 프로모터의 제어하의 인트론이 없는 Zeo 유전자 및 IVa2 유전자를 포함한다. 더욱 더, 이 플라스미드는 EBNA1/OriP 서열을 포함하므로 진핵 세포내에서 복제할 수 있다.
E. 플라스미드 pGY37-CMV-IVa2의 작제 (도 12).
E.1. 플라스미드 pGY33-CMV의 작제.
시판되는 플라스미드 pCI(Promega)의 BglII - AflII 단편을 플라스미드 pGY32의 BamHI 및 AflII 부위 사이에 클로닝한다. 이는 플라스미드 pGY33-CMV를 생성하며, 이의 목적하는 특성은 CMV 프로모터의 제어하의 인트론이 없는 IVa2 유전자를 갖는 것이다.
E.2. 플라스미드 pGY37-CMV-IVa2의 작제(도 12).
플라스미드 pGY33-CMV의 BglII - SapI 단편을 플라스미드 pGY36의 BglII 및 SapI 부위 사이에 클로닝한다. 이는 플라스미드 pGY37-CMV-IVa2(도 12)를 생성하며, 이의 중요한 특성은 CMV 프로모터의 제어하의 인트론이 없는, Zeo 유전자 및 IVa2 유전자를 갖는 것이다. 더욱 더, 이 플라스미드는 EBNA1/OriP 서열을 포함하므로 진핵 세포내에서 복제할 수 있다.
F. Ad5 아데노바이러스의 IVa2 영역을 발현하는 세포 클론의 작제.
IVa2 기능을 트랜스상보화하는 다양한 유형의 세포주를 E1+ 세포(세포 293 또는 293 E4)내에서 작제한다.
(a) 플라스미드 pAC5를 인산칼슘의 존재하에 세포 293내로 형질감염시키며, 복제성 플라스미드 pAC5를 갖는 세포 클론을 게네티신(Sigma, 400㎍/㎖)의 존재하에 선별한다.
(b) 플라스미드 pGY37-TK-IVa2를 인산칼슘의 존재하에 세포내로 형질감염시키며, 복제성 플라스미드 pGY37-TK-IVa2를 갖는 세포 클론은 플레오마이신(Cayla, 세포 293에 대한 15㎍/㎖ 및 세포 293 E4에 대한 30㎍/㎖)의 존재하에 선별한다.
(c) 플라스미드 pGY37-CMV-IVa2를 인산칼슘의 존재하에 세포내로 형질감염시키며, 복제성 플라스미드 pGY37-CMV-IVa2를 갖는 세포 클론은 플레오마이신(Cayla, 세포 293에 대한 15㎍/㎖ 및 세포 293 E4에 대한 30㎍/㎖)의 존재하에 선별한다.
더 정확하게는, 각각의 세가지 경우에, 5㎝ 직경의 디쉬내 세포를 인산칼슘의 존재하에 1 내지 5㎍의 플라스미드로 형질감염시킨다. 세포를 형질감염시킨 후에, 이들을 세척한 다음, 송아지 태 혈청(최종 7%)으로 보충된 배양 배지(MEM, Sigma)를 첨가하고, 세포를 24시간 동안 배양시킨다. 다음 날, 세포를 게네티신 또는 플레오마이신의 존재하에 선별한다. 게네티신 또는 플레오마이신을 3일 마다 교환하고, 선별성 클론이 약 3주 후에 나타난다. 모든 비-형질감염 세포가 사멸한 후, 형질감혐된 세포만이 분열하여, 세포 클론을 형성한다. 세포 클론이 육안으로 볼 수 있을 정도로 충분하게 클 때, 이들을 "24 슬롯" 배양 평판의 배양 웰내로 독립적으로 옮긴다. 이어서, 각각의 클론을 게네티신 또는 플레오마이신의 존재하에 먼저 "12 슬롯", 이어서 "6 슬롯" 배양 평판의 웰 내에서 점진적으로 증식한 후, 세포 배양 디쉬에서 증식시킨다.
G. E1-IVa2-E4의 유전자에서 결실을 갖는 재조합 아데노바이러스의 작제.
G.1. IVa2 유전자를 갖는 헬퍼 바이러스의 동시형질감염에 의한 아데노바이러스 ΔE1-ΔIVa2-ΔE4의 작제.
예를 들면, 하기의 2가지 절차에 따라 아데노바이러스 ΔE1-ΔIVa2-ΔE4를 제조할 수 있다:
(a) ClaI로 분해된 ΔE1-ΔE4 바이러스의 DNA(예를 들면, 참조문["최소의 E4 기능 단위를 발현하는 293-유도된 세포주로부터의 아데노바이러스 E1 및 E4 영역의 유효한 이중 트랜스상보화", [참조문헌: P. YEH 등, J. Virology, in press])에 설명된 AdRSVβgal-dl1004, AdRSVβgal-dl1007 또는 AdRSVβgal-dl1014), XmnI로 분해된 플라스미드 pCO2 DNA 및 헬퍼 바이러스 pAC2 DNA를 인산칼슘의 존재하에 293 E4 세포내로 동시형질감염시킨다.
(b) ClaI로 분해된 ΔE1-ΔE4 바이러스의 DNA, XmnI로 분해된 플라스미드 pCO6 DNA 및 헬퍼 바이러스 pAC2 DNA를 인산칼슘의 존재하에 293 E4 세포내로 동시형질감염시킨다.
G.2. IVa2 및 E4 기능을 트랜스상보화하는 세포주내 아데노바이러스 ΔE1-ΔIVa2-ΔE4의 작제.
Ad5 아데노바이러스의 IVa2 및 E4 영역을 발현하고 플레오마이신에 내성인 세포주에서, 하기 2가지 절차에 따라 아데노바이러스 ΔE1-ΔIVa2-ΔE4를 제조할 수 있다:
(a) ClaI로 분해된 ΔE1-ΔE4 바이러스의 DNA 및 XmnI로 분해된 플라스미드 pCO2 DNA를 인산칼슘의 존재하에 세포내로 동시형질감염시킨다.
(b) ClaI로 분해된 ΔE1-ΔE4 바이러스의 DNA 및 XmnI로 분해된 플라스미드 pCO6 DNA를 인산칼슘의 존재하에 세포내로 동시형질감염시킨다.
서열 리스트
(1) 종합 정보
(i) 출원인 :
(A) 명칭: 롱 프랑 로라 소시에테 아노님
(B) 거리명: 아브뉴 레이몽-아롱 20
(C) 도시명: 앙토니
(E) 국가명: 프랑스
(F) 우편번호: 92165
(G) 전화 : 40.91.69.22.
(H) 팩스: (1) 40.91.72.96
(ii) 발명의 명칭 : 바이러스 벡터 및 유전자 치료에서의 용도
(iii) 서열수 : 2
(iv) 컴퓨터 판독 형태 :
(A) 매체형 : 테이프
(B) 컴퓨터 : IBM PC 호환 기종
(C) 운용 체계 : PC-DOS/MS-DOS
(D) 소프트웨어 : PatentIn 발매 # 1.0, 버전 #1.30 (EPO)
(2) 서열 1에 대한 정보 :
(i) 서열 특성 :
(A) 길이 : 22 염기쌍
(B) 유형 : 뉴클레오타이드
(C) 본쇄형 : 일본쇄
(D) 위상 : 선형
(ii) 분자형 : cDNA
(xi) 서열 열거 : 서열 1:
[서열 1]
Figure pct00003
(2) 서열 2에 대한 정보 :
(i) 서열 특성 :
(A) 길이 : 61 염기쌍
(B) 유형 : 뉴클레오타이드
(C) 본쇄형 : 일본쇄
(D) 위상 : 선형
(ii) 분자형 : cDNA
(xi) 서열 열거 : 서열 2:
[서열2]
Figure pct00004

Claims (28)

  1. 뉴클레오티드 4106번 내지 5186번 단편의 결실 또는 뉴클레오티드 382 내지 3446번 단편의 결실에 의해 Iva2 유전자가 비활성화된, 비활성화 Iva2 유전자를 함유하는 복제 결손 재조합 아데노바이러스.
  2. 제1항에 있어서, IVa2 유전자가 하나 이상의 염기의 결실에 의해 비활성화되는 재조합 아데노바이러스.
  3. 제2항에 있어서, IVa2 유전자가 부분적 결실에 의해 비활성화되는 재조합 아데노바이러스.
  4. 제3항에 있어서, IVa2 유전자가 4106번 내지 5186번 뉴클레오티드 단편의 결실에 의해 비활성화되는 재조합 아데노바이러스.
  5. 제1항 내지 4항중 어느 한 항에 있어서, ITR 및 캡시드화 영역을 포함하는 재조합 아데노바이러스.
  6. 제5항에 있어서, 이종 핵산 서열을 함유하는 재조합 아데노바이러스.
  7. 제1항에 있어서, E1 및 IVa2 유전자에 관한 결실을 갖는 결손 재조합 아데노바이러스.
  8. 제1항에 있어서, 382번 뉴클레오티드로부터 3446번 뉴클레오티드에 이르는 E1 유전자 내의 결실, 및 4106번 뉴클레오타이드로부터 5186번 뉴클레오타이드에 이르는 IVa2 유전자 내의 결실을 함유하는 복제 결손 재조합 아데노바이러스.
  9. 제1항에 있어서, E4 및 IVa2 유전자에 관한 결실을 갖는 복제 결손 재조합 아데노바이러스.
  10. 제1항에 있어서, E1, IVa2 및 E3 유전자에 관한 결실을 갖는 복제 결손 재조합 아데노바이러스.
  11. 제1항에 있어서, E1, IVa2 및 E4 유전자에 관한 결실을 갖는 복제 결손 재조합 아데노바이러스.
  12. 제1항에 있어서, E1, IVa2, E3 및 E4 유전자에 관한 결실을 갖는 복제 결손 재조합 아데노바이러스.
  13. 제1항에 있어서, E1, IVa2, E3, L5 및 E4 유전자에 관한 결실을 갖는 복제 결손 재조합 아데노바이러스.
  14. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 사람, 동물 또는 혼합 기원인 아데노바이러스.
  15. 제14항에 있어서, 사람 기원의 아데노바이러스가 그룹 C로 분류된 것인 아데노바이러스.
  16. 제15항에 있어서, 그룹 C 아데노바이러스가 유형 2 또는 5 아데노바이러스(Ad 2 또는 Ad 5)인 아데노바이러스.
  17. 제14항에 있어서, 동물 기원의 아데노바이러스가 개, 소, 쥐, 양, 돼지, 새, 및 원숭이 기원의 아데노바이러스인 아데노바이러스.
  18. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 이종 프로모터의 제어하에 gp19K 단백질을 암호화하는 E3 유전자 부분을 추가로 포함하는 아데노바이러스.
  19. 제6항에 있어서, 이종 핵산 서열이 치료 유전자 및/또는 항원 펩티드를 암호화하는 유전자를 함유하는 아데노바이러스.
  20. 제6항에 있어서, 이종 핵산 서열이 감염된 세포, 기관 또는 유기체에서 작용성인 전사를 위한 프로모터 영역을 추가로 함유하는 아데노바이러스.
  21. 제6항에 있어서, 이종 핵산 서열이 추가로 분비 서열을 포함하는 아데노바이러스.
  22. 제1항에 있어서, 382번 뉴클레오타이드로부터 3446번 뉴클레오타이드에 걸쳐 결실을 포함하는 결손 재조합 아데노바이러스.
  23. 제3도에 나타난 특성, 및 Sau3A(3446) 위치로부터 NruI(6316) 위치까지의 Ad5 아데노바이러스 서열의 제한 영역을 함유하는 플라스미드 pCOl.
  24. 제4도에 나타난 특성, 및 Sau3A(3446) 위치로부터 Nrul(6316) 위치까지의 Ad5 아데노바이러스 서열의 제한 영역을 함유하고, Bss HII(4106)로부터 Bst EII(5186) 영역이 결실된 플라스미드 pCO2.
  25. 제8도에 나타난 특성, 및 Ad5 아데노바이러스의 Hinfl 위치(382)까지의 좌측부, 다중 클로닝 위치, Ad5 아데노바이러스의 Sau3A 위치(3446)로부터 Sphl 위치(5141)까지의 절편, IVa2 유전자의 암호화 서열내의 종결 코든을 제공하는 올리고튜클레오티드 및 Ad5 아데노바이러스의 Sphl(5141)로부터 Nru1(6316)까지의 절편을 함유하는 플라스미드 pCO6.
  26. 제10도에 나타난 특성, 및 Neo 유전자, EBNA1/OriP 서열 및 자체의 프로모토의 조절하에 있는 Ad5 아데노바이러스의 IVa2 유전자를 함유하는 플라스미드 pAC5.
  27. 제11도에 나타난 특성, 및 Zeo 유전자, EBNA1/OriP 서열 및 CMV 프로모터의 조절하에 있고 인트론이 없는 Ad5 아데노바이러스의 IVa2 유전자를 함유하는 플라스미드 pGY37-TK-IVa2.
  28. 제12도에 나타난 특성, 및 Zeo 유전자, EBNA1/OriP 서열 및 CMV 프로모터의 조절하에 있고 인트론이 없는 Ad5 아데노바이러스의 IVa2 유전자를 함유하는 플라스미드 pGY37-CMV-IVa2.
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