KR100404303B1

KR100404303B1 - 올티프라즈의 간섬유화 및 간경화 진행의 예방 및치료제로서의 용도 및 올티프라즈를 주성분으로 함유하는제약 조성물

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Publication number: KR100404303B1
Application number: KR10-2001-0010686A
Authority: KR
Inventors: 김상건; 강건욱
Original assignee: 김상건
Priority date: 2000-04-07
Filing date: 2001-03-02
Publication date: 2003-11-03
Anticipated expiration: 2021-03-02
Also published as: HUP0300221A2; AU780161B2; CA2404915A1; EP1292309A1; WO2001076604A1; AU3776701A; ZA200207867B; NO20024724L; CN1192775C; NO20024724D0; RU2258509C2; HUP0300221A3; MXPA02009695A; RU2002129873A; CN1420772A; KR20010091012A; JP2003530353A; BR0109747A; US20030191137A1; NZ521710A

Abstract

본 발명은 5-(2-피라지닐)-4-메틸-1,2-디티올-3-티온[5-(2-pyrazinyl)-4-methyl-1,2-dithiol-3-thione, 올티프라즈(oltipraz)]의 간섬유화 및 간경화 진행의 예방과 치료제로서의 용도 및 이 성분을 주성분으로 함유하는 간섬유화 및 간경화 진행의 예방과 치료용 제약 조성물을 제공한다.

본 발명의 올티프라즈는 필요에 따라 다른 약물과도 병용하여 간 섬유화 및 간경화 진행의 치료 및 예방용 약물로 사용이 가능하며, 비교적 저용량부터 간섬유화의 억제 효과를 나타낸다. 본 발명에서 제안하는 최적의 용량을 이용한 제제는 간 섬유화 및 간경화 진행의 치료 및 예방에 탁월한 효과를 가지고, 인체에 대한 독성이 적은 안전한 약제이다.

Description

올티프라즈의 간섬유화 및 간경화 진행의 예방 및 치료제로서의 용도 및 올티프라즈를 주성분으로 함유하는 제약 조성물{Prophylactic and Therapeutic Use of Oltipraz As an Antifibrotic and Anticirrhotic Agent in the Liver and Pharmaceutical Composition Containing Oltipraz}

본 발명은 5-(2-피라지닐)-4-메틸-1,2-디티올-3-티온 [5-(2-pyrazinyl)-4-methyl-1,2-dithiol-3-thione; 올티프라즈 (oltipraz)]의 간섬유화 및 간경화 진행의 예방 및 치료제로서의 용도 및 이 성분을 주성분으로 함유하는 제약 조성물에 관한 것이다.

간은 체외에서 들어온 물질 및 체내의 물질대사에서 중추적인 역할을 담당하며 지속적으로 효소 반응 및 에너지대사가 일어나는 생체 기관이다. 현재 한국내의 만성 질병 중에서 간염, 간경화 및 간암이 차지하는 비중은 순환기계 질환과 함께 가장 높은 것으로 나타나고, 질병으로 인한 사망 원인의 큰 비중을 차지하는 실정이다. 특히 선진국에 비하여 음주 인구가 상대적으로 높고 폭음에 의한 간 손상 발생원인이 높은 만큼 이에 대한 관심도 지대하다. 바이러스 감염이나 음주에 의한 지속적인 간조직의 손상은 간경화나 간암으로 발전되는 질환의 특징을 가진다. 간조직의 생리적 특성 및 중요성을 고려할 때 간 질환의 치료 및 예방은 대단히 중요하며 간 조직손상을 줄이고 궁극적으로 치료에 응용할 수 있는 치료 및 예방용 의약조성물의 개발이 요구된다.

여러 합성 화합물 및 생약제 등 다양한 물질들이 시험관내 또는 생체 내에서 간 보호 작용을 나타낸다. 실리마린이나 비테인이 여기에 속하는데 그 작용 기전은 시토킨의 억제나 글루타치온의 증가 등 여러 작용점이 관여한다고 알려져 있으나낮은 효력을 갖는 단점으로 치료 효과는 기대할 수 없는 문제점이 있다. 하지만 간 질환의 적절한 치료제가 없는 현실에서는 이상의 약물등이 실제 임상에서 사용되는 이유가 된다. 간 섬유화가 적응증으로 되어있는 말로틸레이트[malotilate] 유도체의 경우, 화합물로 유도한 간 독성을 방어하며 그 기전은 간내 제2상 포합효소의 유도능 및 시토크롬 P450 효소의 억제에 기인한다. 그러나 이 화합물도 시토크롬 효소계를 무차별적으로 억제한다는 점과 예방 효과 밖에는 기대할 수 없다는 단점을 지닌다.

십자화과에 속하는 채소류에 천연으로 존재하는 황함유화합물인 디티올디티온 [dithiolthione]의 몇몇 치환체들은 간 보호 효과가 있는 것으로 알려졌으며 이 중 올티프라즈는 1980년대 초에 주혈흡충(schistosomiasis) 치료제로 사용된 약으로 다음 구조식을 갖는다.

이 약물은 생체의 여러 조직에서 세포내 티올(thiol) 함량을 증가시키고 글루타치온 풀[(glutathione(GSH) pool]의 유지에 관련된 효소 외에 친전자성 물질의 해독화 과정에 관여하는 효소의 발현을 유도증가시킨다. 올티프라즈에 의하여 그 활성이 증가하는 효소로서는 NAD(P)H 퀴논 리덕타제(quinone reductase), 마이크로소말 에폭사이드 하이드롤라제(microsomal epoxide hydrolase), 글루타치온 S-트랜스페라제[glutathione S-transferase (GST)] 및 UDP-GT 등을 들 수 있으며, 이중 GST는 사염화탄소나 아세트아미노펜(acetaminophen)과 같은 독성물질에 의한 간독성을 방어한다 (Ansher SS, Dolan P and Bueding E. Chemoprotective effects of two dithiolthiones and of butylhydroxyanisole against carbon tetrachloride and acetaminophen toxicity. 1983 Hepatology 3, 932-935).

또한, 올티프라즈는 벤조[a]피렌, NDEA 및 우라실 머스타드(uracil mustad)에 의한 발암 과정을 억제하고 아플라톡신 B1(aflatoxin B1)에 의한 간암 발생, 아족시메탄 (azoxymethane)에 의한 대장암 발생도 억제하는 것으로 나타났다 (Bolton MG, Munoz A, Jacobson LP, Groopman JD, Maxuitenko YY, Roebuck BD and Kensler TW. Transient intervention with oltipraz protects against aflatoxin-induced hepatic tumorigenesis. 1993 Cancer Res. 53, 3499-3504).

올티프라즈의 발암 억제 기전으로 다음과 같은 몇 가지를 들 수 있다. 첫째 중요한 체내 항산화물질인 환원형 GSH의 조직내 수준을 증가시킨다. 둘째, phase I 효소 (예, cytochrome P450)를 억제하여 발암물질의 활성화를 억제한다. 셋째, phase II 대사효소 (예, GST, UDP-GT)를 유도하여 발암물질의 해독화 과정을 촉진시킨다. 넷째, 시험관내에서 인간의 면역 억제 바이러스 type I의 복제를 억제한다. 다섯째, 세포내 티올을 증가시켜 반응성 중간체를 제거하고 DNA 수복 과정을 증대시킨다. 이미 올티프라즈는 생체 대부분의 조직에서 GSH 수준을 증가시켜 방사선이나 제노바이오틱스(xenobiotics)에 의하여 생성되는 유리 라디칼을 제거하거나 방사선 손상에 대한 생체 적응 반응으로써 세포의 항상성 유지에 기여하여 방사선 보호 효과를 나타내는 것으로도 보고된 바 있다.

구체적으로 설명하면, 암은 체세포의 유전자에 변화와 이상이 발생하고 이로 인하여 비정상적으로 세포 증식이 발생하는 현상이다 (Cancer Biology, 3rd ed. Raymond W. Ruddon, pp. 61-95, 497-507, Oxford Press). 화합물에 의한 암예방 효과는 항돌연변이성/암세포로의 변환 또는 암세포의 증식 억제 효과에 의존한다. 올티프라즈는 암예방제로 연구되어 왔다 (Ansher et al., 1983; Bolton et al., 1993). 올티프라즈의 암예방 기전은 시토크롬 P450 3A의 억제뿐만 아니라 제2상 해독화 효소의 유도와 관련되는 것으로 인정된다. 세포와 동물에서 올티프라즈를 처치할 때 글루타치온 S-트랜스페라제 (GST)의 발현이 증가(Clapper et al., 1994; Davidson et al., 1990)하는 현상은 독성물질에 의한 조직손상의 억제 및 발암억제와 관련된다 (Kensler et al., 1987; Maxuitenko et al., 1998). 올티프라즈는 방사선에 의한 조직 손상에 길항하여 간조직의 보호 효과를 나타내고(Kim et al., 1997), GST 유도는 세포 적응 반응을 의미한다는 것이 선행 연구에 의해 알려져 있다. 올티프라즈는 독성물질로부터 간조직을 보호하기도 한다(Ansher et al., 1983). 아플라톡신 (Aflatoxin) B1에 의해 유도되는 발암성을 올티프라즈가 억제하는 현상은 시토크롬 P450 3A에 의한 발암물질의 대사 활성화를 억제하는 데 기인한다. 최근 임상 연구에 따르면 올티프라즈는 간암 발병의 위험성이 있는 사람들의 혈장에서 아플라톡신 B1의 수치를 낮추는데 효과적임이 밝혀졌다. 아플라톡신 B1에 의해 유도되는 동물에서의 발암성도 또한 올티프라즈에 의해 감소되었다.

올티프라즈는 HBV DNA를 포함하는 플라스미드로 감염시킨 2.2.15 세포에서HBV의 복제를 억제하는 것으로 보고되었다. 따라서 이 약제는 B형 간염 바이러스의 유전자 전사를 억제하고 p53 단백질의 발현을 증가시킨다 (Chi et al., 1998). 올티프라즈는 또한 인간면역억제 바이러스 (HIV)의 복제를 억제한다 (Prochaska et al., 1995).

이상의 작용기전을 가지는 올티프라즈는 실제 중국인을 대상으로 수행된 간암 발생 억제에 대한 대규모 임상 시험에서 약한 보호 효과가 나타났으며, 독성물질에 의한 간 독성을 중등도 이상 억제하는 효과를 갖는 것으로 잘 알려져 있다.

또한, 올티프라즈는 쥐 및 개에 대한 독성 시험에서 그 안전성이 입증된 바 있다 (Fund Appl Toxicol 1997 Jan; 35(1):9-21).

간 섬유화는 간염 등 만성 간질환에 수반되는 생체 적응 반응의 일부로서 손상된 간 조직이 정상적인 간세포로 복구되는 것이 아니라 콜라겐과 같은 섬유조직으로 변형되는 상태를 칭한다. 간 섬유화는 조직손상의 복구 과정에서 발생하는 생체 적응 반응이지만 생체내 물질의 대사 및 담즙 분비 등 간의 고유 기능을 전혀 수행할 수 없는 섬유조직으로 간이 대체된다는 점에서 간 기능의 저하가 필연적으로 나타난다. 간섬유화 현상이 지속적으로 반복될 때에는 간경화로 발전되어 사망에까지 이르게 한다는 점에서 적절한 치료제의 개발은 신약 개발의 중요한 과제가 된다. 그러나 현재까지는 간 섬유화의 기전 자체가 명확하게 밝혀져 있지 않으므로 적당한 치료약물이 개발되지 않은 실정이다.

최근 간조직 내의 대식 쿠퍼세포와 이토세포에서 유리되는 시토킨인 전환 성장 인자-베타[transforming growth factor-beta (TGF-β)]가 간 섬유화의 중요 매개물로 밝혀졌다. 또한, TGF-β의 항체, 안티센스 RNA, 세포 TGF-β 수용체 변형을 통하여 TGF-β의 작용을 차단하였을 때에는 간 섬유화 과정이 현저하게 억제된다고 보고된 바 있다. 그러나 이러한 연구는 실험적 차원에서 수행된 것일 뿐이며 현재까지 실제로 임상적으로 활용되는 약물은 없는 실정이다.

따라서, 본 발명의 목적은 간섬유화 및 간경화의 진행을 치료하는 효과를 극대화시키고, 또한 예방에도 사용할 수 있는 의약물을 제공하는 것이다.

도 1a는 정상동물의 간 조직 사진 (H E 염색),

도 1b는 올티프라즈 단독 투여군의 간 조직 사진 (H E 염색),

도 1c는 DMN 투여군의 간 조직 사진 (H E 염색)이고,

도 1d는 DMN과 올티프라즈 동시 투여군의 간 조직 사진 (H E 염색)이다.

도 2a는 DMN 투여군의 간 조직 사진 (Van Gieson 염색),

도 2b는 DMN과 올티프라즈 동시 투여군의 간 조직 사진 (Van Gieson 염색),

도 2c는 DMN 투여군의 간 조직 사진 (Masson's Trichrome 염색), 그리고

도 2d는 DMN과 올티프라즈 동시 투여군의 간 조직 사진(Masson's Trichrome 염색)이다.

도 3은 랫트에 DMN을 투여하였을 때 간조직 중 TGF-β1 mRNA 발현에 대한 올티프라즈의 억제 효과를 보여주는 사진이다.

도 4는 랫트에서 LPS에 의하여 증가하는 TNF-알파 생성에 대한 올티프라즈의 억제 효과를 보여준다.

본 발명자들은 간섬유화의 치료 효능이 있는 의약의 개발을 위해 부단히 연구를 거듭한 결과, 상기 설명한 올티프라즈가 간섬유화 및 간경화 진행의 치료 및 예방에 탁월한 효과를 갖는다는 것을 구명하여 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서, 본 발명은 5-(2-피라지닐)-4-메틸-1,2-디티올-3-티온 및 제약상 허용되는 부형제를 함유하는, 간섬유화 및 간경화 진행의 예방 및 치료를 위한 제약 조성물을 제공한다.

본 발명자들은 올티프라즈가 TGF-β의 생성을 억제함으로써 간섬유화를 억제하는 작용이 있는 것을 최초로 발견하였다.

상기한 바와 같이 올티프라즈가 간독성을 방어하고 발암 과정을 억제하는 것으로 알려졌지만, 올티프라즈가 본원에서 밝힌 바와 같은 간섬유화 및 간경화에 대한 치료 및 예방 효과를 갖는다는 것은 어느 문헌에도 보고되거나 제안된 바 없다.

간섬유화는 여러 원인으로 인하여 간조직에 만성적으로 심각한 손상이 있을때 발생하는 간경화의 전단계이다. 간경화증은 부분적으로는 발암성과 관련되고 간암의 위험이 간경화를 가진 환자에게 현저히 증가하기도 한다. 그럼에도 불구하고, 간경화의 병리적인 기전은 간암과는 뚜렷하게 구별된다. 즉, 간섬유화는 만성적으로 간조직에 심각한 손상이 있을 때 발생하는데 그 원인 인자로는 바이러스, 기생충, 음주, 화학물질과 약물이 포함된다. 간섬유화는 쿠퍼세포와 성상세포 등 간조직 중 비실질세포의 활성화로 인한 세포외 기질(예, type I, III 및 IV 콜라겐)의 과잉생산으로 발생된다. 특히, 섬유화에서는 간조직 중 성상세포의 활성화가 일어나 근섬유모세포로 세포의 전이가 발생하고, 이러한 활성화된 세포는 세포외 기질을 다량으로 생산하게 된다. 따라서, 간섬유화 및 간경변증은 바이러스성 간염 또는 간암과는 구별되는 병리현상이며, 이를 예방하거나 치료하는 방법도 구별된다. 그러나, 현재 임상적으로 유용한 간경화 치료제는 없는 실정이다.

본 발명은 간암 등에 효과가 있는 것으로 알려진 올티프라즈가 간암 등의 병리학적인 기전과는 뚜렷하게 구별되는 병리학적 기전을 갖는 간섬유화 및 간경화에 대해 치료 및 예방 효과를 갖는다는 예상치 못한 효과를 최초로 밝혀낸 것으로, 이와 같은 사실은 이하에서 설명하는 바와 같이 본원 발명에서 실시된 실험에서 구체적으로 입증되었다.

올티프라즈는 디메틸니트로사민 (dimethylnitrosamine, DMN)에 의해 증가된 간 섬유화 지표인 피브로시스 스코어(fibrosis score)와 노들 스코어(Knodell score)를 감소시키고, 이는 대표 조직검경 사진의 결과와도 일치한다. 또한 올티프라즈의 투여는 간독성 지표인 ALT, AST, 빌리루빈(bilirubin) 및 감마-글루타밀 트랜스펩티다제[gamma-glutamyl transpeptidase (gamma-GT)] 수치를 유의적으로 억제한다. 이는 올티프라즈가 간 섬유화를 개선 혹은 지연시키는 작용을 증명한다. 올티프라즈에 의한 간 섬유화 억제 기전은 TGF-β 발현의 차단으로 나타나며, RT-PCR법으로 정량한 결과에 따르면 올티프라즈는 디메틸니트로사민 (dimethyl nitrosamine)에 의한 TGF-βmRNA 발현의 증가를 완전히 억제한다. 이 결과는 올티프라즈가 간 섬유화 발생 또는 진행을 억제할 수 있는 약물임을 보여준다. 특히 올티프라즈는 간섬유화의 억제에 강력한 효과를 나타내고 간내 해독화 효소인 GST의 유도효과, GSH 증가 작용 및 라디칼 포합 작용을 갖기 때문에 항섬유화 효능을 지닌 우수한 의약물이 될 수 있다. 올티프라즈는 저용량으로도 충분한 약리효과가 나타날 것으로 예상된다.

본 발명자들은 DMN을 투여한 랫트 간 섬유화 모델에서 올티프라즈를 여러 용량으로 투여한 후 치료 효과를 관찰하였다. 그 결과 DMN 투여군의 경우 혈장내 알라닌 아미노트랜스페라제(alanine aminotransferase) 및 아스파테이트 아미노트랜스페라제(aspartate aminotransferase) 활성이 각 4배 증가한 데 비하여 올티프라즈를 처치할 때 혈장내 ALT 및 AST 활성증가가 용량의존적으로 억제되었다. 혈장내 감마-글루타밀 트랜스펩티다제 (gamma-GT) 활성과 빌리루빈 함량은 간기능의 대표적인 지표로 사용된다. 올티프라즈는 DMN을 투여한 랫트에서 증가된 gamma-GT 활성을 70%-80% 억제하였다. 반면, DMN 투여시 빌리루빈 함량이 대조군에 비하여 8배 증가하였으며 올티프라즈를 DMN과 동시투여할 때 혈장내 빌리루빈은 65% 억제되었다. 또한 조직 검경에 의한 피브로시스 스코어(fibrosis score), 노들 스코어(Knodell score) 평가 소견에 따르면 DMN에 의한 간 섬유화의 진행은 올티프라즈에 의해서 현저히 억제되었다. 이러한 약리작용은 일차적으로 올티프라즈에 의한 TGF-β 생성 억제에 의한 것으로 생각되며 항산화효소의 유도발현 및 GSH의 증가가 올티프라즈에 의한 항섬유화 작용에 일부 기여할 것으로 추정한다.

올티프라즈는 간 섬유화 및 간경화 진행을 억제하며 치료 또는 예방효과를 나타내는 효과적인 약제로서 임상적으로 사용이 가능한 제제이다. 본 발명의 의약물은 실제로 사용할 때 바람직하게는 약제학적인 분야에서 통상적인 방법에 따라 경구투여에 적합한 단위투여형의 제제로 제형화시켜 투여한다. 이러한 목적에 적합한 경구투여용 제형에는 경질 및 연질캅셀제, 정제, 산제 등이 포함된다. 이러한 경구투여용 제제에는 약물학적 활성 성분인 올티프라즈 이외에 하나 또는 그 이상의 약제학적으로 불활성인 통상적인 담체, 예를 들면 전분, 락토스, 카복시메틸셀룰로오즈, 카올린 등의 부형제, 물, 젤라틴, 알코올, 글루코즈, 아라비아 고무, 트라가칸타 고무 등의 결합제, 전분, 덱스트린, 나트륨 알기네이트 등의 붕해제, 탈크, 스테아르산, 마그네슘 스테아레이트, 유동 파라핀 등의 활탁제와 같은 추가의 첨가제 성분들이 포함될 수 있다.

본 발명에 따른 조성물의 1일 투여 용량은 투여하고자 하는 대상의 간 손상 정도, 간염 발병시기, 연령, 건강상태, 합병증 등의 다양한 요인에 따라 달라지지만 성인을 기준으로 할 때 일반적으로는 올티프라즈 10 내지 1000mg, 바람직하게는 50 내지 300 mg을 1일 1 내지 2회 분할하여 투여한다. 그러나 간 손상의 정도가 심한 환자나 간암 절제 후 재발방지용으로는 본 발명의 의약물을 상기 범위를 벗어나는 대용량까지 증량하여 투여할 수 있다. 본 발명에 따르는 의약물은 올티프라즈의 우수한 간 섬유화 및 간경화의 진행 억제를 통하여 치료효과를 제공하며 약물에 의한 독성 및 부작용도 거의 없어 치료목적 뿐만 아니라 예방목적으로 장기간 복용시에도 안심하고 사용할 수 있는 약제이다.

본 발명은 하기 실시예에 의해 더욱 상세히 설명되나, 본 발명이 이들 실시예에 의해 제한되는 것은 아니다.

이하 실험예를 참조하여 본 발명을 상세히 설명한다.

실험예

실험예 1

<올티프라즈의 항섬유화 작용-1>

랫트에 디메틸니트로사민[dimethylnitrosamine(DMN)]을 4주간 연속투여시 혈장내 알라닌 아미노트랜스페라제(alanine aminotransferase) 및 아스파테이트 아미노트랜스페라제(aspartate aminotransferase) 활성이 4배 증가하였다. 올티프라즈를 50mg/kg 용량으로 전처치시 혈장내 ALT 및 AST 활성증가가 50% 억제되었다(표 1).

혈장내 감마-글루타밀 트랜스펩티다제[gamma-GT] 활성과 빌리루빈 함량은 간기능의 대표적인 지표로 사용된다. 올티프라즈는 DMN을 투여한 랫트에서 증가되는 gamma-GT 활성을 70%-80% 억제하였다. 반면 DMN 투여시 빌리루빈 함량이 대조군에 비하여 8배 증가하였으며 올티프라즈를 50 mg/kg 용량으로 DMN과 동시투여할 때 혈장내 빌리루빈 증가는 65% 억제되었다.

ALT, AST, gamma-GT, 빌리루빈 수치

군	ALT	AST	gamma-GT	빌리루빈
대조군	49 ± 2	113 ± 6	0.2 ± 0.1	0.2 ± 0.01
DMN	190 ± 12*	412 ± 39*	12.1 ± 4.1*	0.9 ± 0.2*
DMN + 올티프라즈50 mg/kg	116 ± 4^#	246 ± 32^#	2.6 ± 0.5^#	0.3 ± 0.03^#

각 수치는 평균 ±표준오차로 표시하였고 사용 동물수는 8 내지 16이었다. 각 군간 유의성은 뉴먼쿨법에 의한 다중분석으로 표시하였다. 유의성 표시는 대조군에 비하여 * p<0.05,DMN 처치군에 비하여^#p<0.05로 표시하였다.

실험예 2

<올티프라즈의 항섬유화 작용-2>

DMN에 의하여 유도된 간 섬유화에 미치는 올티프라즈의 효과를 동물 실험 모델에서 조직병리학적으로 관찰하였다. 랫트에 DMN을 일주일에 3회씩 4주간 투여한 동물군에서 간의 현저한 섬유화가 관찰되었고, 올티프라즈(5-50 mg/kg, 일주일에 3회씩 4주간, 경구투여)를 DMN과 동시투여할 때 간조직의 섬유화가 DMN 단독에 비하여 감소하였다. 간조직 섬유화의 조직병리학적 지표는 반 기슨(Van Gieson) 염색과 메이슨 트리크롬(Masson's trichrome) 염색법에 따라 간조직의 괴사와 섬유화 정도를 병리학적으로 평가하였다 (도 1 및 2).

도 1a는 정상동물의 간 조직 사진 (H E 염색)이고, 도 1b는 올티프라즈 단독 투여군의 간 조직 사진 (H E 염색)이고, 도 1c는 DMN 투여군의 간 조직 사진(H E 염색)이고, 도 1d는 DMN과 올티프라즈 동시 투여군의 간 조직 사진 (H E 염색)이다. 도 2a는 DMN 투여군의 간 조직 사진 (Van Gieson 염색)이고, 도 2b는 DMN과 올티프라즈 동시 투여군의 간 조직 사진 (Van Gieson 염색)이고, 도 2c는 DMN 투여군의 간 조직 사진 (Masson's Trichrome 염색)이고, 도 2d는 DMN과 올티프라즈 동시 투여군의 간 조직 사진(Masson's Trichrome 염색)이다.

올티프라즈를 50 mg/kg의 용량으로 투여할 때 DMN에 의하여 유도된 섬유화가 효과적으로 개선되었다 (표 2). 섬유화의 정도는 간 손상정도 및 섬유화정도를 나타내는 Knodell 수치로 평가하였다. DMN + 올티프라즈 투여군은 DMN 단독 투여군에 비하여 Knodell 수치를 저하시켜 간 손상 및 섬유화를 개선하였다.

올티프라즈에 의한 간조직의 섬유화 억제 효과

군	섬유화 수치	Knodell 수치
대조군	0	0
DMN	3.7±0.5	16.1±2.9
DMN + 올티프라즈 5 mg/kg	3.1±0.4*	11.1±1.7*
DMN + 올티프라즈 15 mg/kg	2.9±0.8*	12.1±1.9*
DMN + 올티프라즈 50 mg/kg	2.5±0.9**	8.0±1.6**

각 수치는 평균 ±표준오차로 표시하였고 사용 동물수는 8 내지 16이었다. 각 군간 유의성은 뉴먼쿨법에 의한 다중분석으로 표시하였다. * p<0.05, ** p<0.01. 섬유화정도는 0=정상, 1=약한 섬유조직 발견, 2=경등도 섬유조직 발견, 3=뚜렷한 섬유조직 발견, 4=심한 섬유화 진행으로 표시하였다. 간 조직 말단의 가교상 형성 (최고=10), 엽내 세포 소실 (최고=4), 간내 염증 (최고=4), 섬유화(최고=4)의 합산 점수로 Knodell 수치를 표시하였다.

실험예 3

<올티프라즈의 항섬유화 약리 작용 기전>

TGF-β1은 조직손상에 의한 섬유화에서 발현이 증가되는 대표적인 시토킨이다. DMN 단독 또는 DMN과 올티프라즈를 동시에 투여한 동물에서 TGF-β1 mRNA 발현을 RT-PCR 분석법으로 관찰하였다. DMN을 4주간 투여한 동물군에서는 불가역적인 과도한 섬유화로 인하여 TGF-β1 mRNA의 발현을 관찰할 수 없었으므로, DMN을 단회 투여후 증가되는 TGF-β1 mRNA 발현을 관찰하였다. DMN을 투여한 18 시간 후에 올티프라즈를 투여하였으며 TGF-β1 mRNA 발현은 올티프라즈를 투여한 24 시간 후에 관찰하였다. 랫트에 DMN을 투여하였을 때 간조직 중 TGF-β1 mRNA가 현저히 증가하였다. 올티프라즈를 100 mg/kg의 용량으로 투여하였을 때 DMN에 의하여 유도되는 TGF-β1 mRNA 발현이 완전히 억제되었다. GAPDH mRNA 발현은 DMN 단독 또는 올티프라즈와의 동시투여에 의하여 변하지 않았다. 따라서 올티프라즈는 TGF-β1의 발현을 감소하는 약리 기전에 의하여 간섬유화를 억제하는 것으로 나타났다 (도 3).

실험예 4

<올티프라즈의 TGF-β생성 억제의 작용점 평가>

대식세포에서 과다하게 발현되는 TGF-β생성을 올티프라즈가 직접적으로 억제하는지의 여부를 관찰하고, TGF-β생성 억제와 관련된 분자적인 약리 기전을 평가하기 위하여 대식세포주인 RAW264.7 세포를 사용하여 실험을 수행하였다. TGF-β발현이 증가된 RAW264.7 세포에 올티프라즈를 직접적으로 첨가하였을 때 약물농도 의존적으로 TGF-β의 발현이 억제됨을 발견하였다. 이러한 결과는 올티프라즈가 간조직 내의 대식세포인 쿠퍼 세포에서 TGF-β의 생성을 억제함으로써 항섬유화 작용을 나타낼 가능성을 제시한다. 나아가 TGF-β의 발현 증가는 EGTA와 타이로신 키나제(tyrosine kinase) 억제제인 제니스타인(genistein)에 의하여 억제되었다. 이러한 결과는 올티프라즈에 의한 TGF-β 생성이 세포내 칼슘양의 조절 또는 프로테인 키나제(protein kinase)의 활성 변화를 통한 효과일 가능성을 제시한다 (표 3).

대식세포주에서 올티프라즈에 의한 TGF-β 발현 억제

	대조군	올티프라즈30 μM	올티프라즈100 μM	EGTA1 mM	제니스타인100 μM
TGF-β 발현억제율 (%)	0	30	60	80	80

실험예 5

<올티프라즈에 의한 TNF-알파 생성 억제 작용>

TNF-알파는 대식세포에서 유리되는 대표적 시토킨으로 박테리아 등의 외인성 세균을 사멸시켜 세포를 보호하는 역할을 한다. 그러나, TNF-알파가 과다하게 유리되는 경우 염증반응이 증폭되어 세포사멸을 유도하게 된다. 이것은 일반적으로 TNF-알파의 항체 또는 생성 억제제가 전신염증성 질환의 치료제로 연구되는 이유이기도 하다. 본 실험에서는 올티프라즈가 쿠퍼 세포의 활성을 억제하는지를 확인하기 위하여 내독소 (LPS)를 투여한 랫트에서 증가되는 TNF-알파 생성에 미치는 영향을 관찰하였다. 올티프라즈를 랫트에 투여하였을 때 LPS에 의하여 증가하는 TNF-알파 생성이 약물농도에 의존적으로 억제되었다. 올티프라즈가 TNF-알파 생성을 억제하는 현상은 올티프라즈가 간조직의 염증 반응을 억제하며 그 작용 세포가 쿠퍼 세포일 가능성을 시사한다. 간 염증 반응의 억제는 TGF-β 생성 억제와 함께 올티프라즈의 간 세포 보호 효과의 기전으로 인정된다 (도 4, *, **; LPS 투여 동물군에 비하여 유의성 있음; p<0.05, p<0.01).

실시예 1

올티프라즈 25mg

유당 50mg

전분 10mg

스테아린산 마그네슘 적량

상기의 성분을 혼합하고 통상의 정제 제조 방법에 따라서 타정하여 정제를 제조한다.

실시예 2

올티프라즈 100mg

유당 50mg

전분 10mg

스테아린산 마그네슘 적량

실시예 3

올티프라즈 250mg

유당 50mg

전분 10mg

스테아린산 마그네슘 적량

실시예 4

올티프라즈 25mg

유당 30mg

전분 28mg

탈크 2mg

스테아린산 마그네슘 적량

상기의 성분을 혼합하고 통상의 방법으로 캅셀제 제조 방법에 따라서 젤라틴 경질 캅셀에 충진하여 캅셀제를 제조한다.

실시예 5

올티프라즈 100mg

유당 30mg

전분 28mg

탈크 2mg

스테아린산 마그네슘 적량

상기의 성분을 혼합하고 통상의 캅셀제 제조 방법에 따라 젤라틴 경캅셀에 충진하여 캅셀제를 제조한다.

실시예 6

올티프라즈 250mg

이성화당 10g

설탕 30mg

나트륨 CMC 100mg

레몬향 적량

정제수적량 가하여 전체 100ml

상기의 성분을 통상의 현탁제 제조 방법에 따라 현탁제를 제조하고 100ml 용량의 갈색병에 충진하고 멸균하여 현탁제를 제조한다.

실시예 7

올티프라즈 500mg

이성화당 20g

설탕 20g

나트륨 알지네이트 100mg

오렌지향 적량

정제수가하여 전체 100ml

실시예 8

올티프라즈 250mg

유당 30mg

전분 20mg

스테아린산 마그네슘 적량

상기의 성분을 긴밀히 혼합하고 폴리에틸린이 코팅된 포에 충진하고 밀봉하여 산제를 제조한다.

실시예 9

연질캅셀제 1정중 함량

올티프라즈 100mg

폴리에틸렌글리콜 400 400mg

농글리세린 55mg

정제수 35mg

폴리에틸렌글리콜과 농글리세린을 혼합한 다음 정제수를 투입하고 이 혼합물을 약 60°C로 유지한 상태에서 올티프라즈를 넣고 교반기로 약 1,500 rpm으로 교반하면서 균일하게 혼합한 후 서서히 교반하면서 실온으로 냉각하고 진공펌프를 사용하여 기포를 제거하고 연질캅셀의 내용물로 한다.

연질캅셀의 피막은 일반적으로 널리 알려진 젤라틴, 가소제의 소프트 처방으로 하여 1캅셀당 젤라틴 132mg, 농글리세린 52mg, 디솔비톨액 70% 6mg 및 착향제로에틸바닐린 적량, 코팅기제로 카르나우바납을 사용하여 통상의 조제방법으로 제조한다.

본 발명에 의하면, 올티프라즈를 포함하는, 간섬유화 및 간경화 진행의 예방과 치료에 우수한 효과를 갖는 간섬유화 및 간경화 진행의 예방과 치료용 제약 조성물이 제공된다.

Claims

5-(2-피라지닐)-4-메틸-1,2-디티올-3-티온 및 제약상 허용되는 부형제를 함유하는, 간섬유화 및 간경화 진행의 예방 및 치료를 위한 제약 조성물.
제1항에 있어서, 제약 조성물이 캅셀제, 정제, 연질캅셀제, 현탁화제, 시럽제, 주사제 또는 산제로 이루어지는 군 중에서 선택된 제제로 제형화된 것인 제약 조성물.
제1항에 있어서, 상기 제약 조성물이 경구 투여를 위한 것인 제약 조성물.