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KR100361562B1 - 프로테이나제k에대해내성을갖는네이쎄리아메닝기티디스의표면단백질 - Google Patents

프로테이나제k에대해내성을갖는네이쎄리아메닝기티디스의표면단백질 Download PDF

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KR100361562B1
KR100361562B1 KR1019970706501A KR19970706501A KR100361562B1 KR 100361562 B1 KR100361562 B1 KR 100361562B1 KR 1019970706501 A KR1019970706501 A KR 1019970706501A KR 19970706501 A KR19970706501 A KR 19970706501A KR 100361562 B1 KR100361562 B1 KR 100361562B1
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데니스 마틴
조시 하멜
클레멘트 리옥스
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샤이어 바이오켐 인코포레이티드
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Abstract

본 발명은네이쎄리아 메닝기티디스생명체의 표면에 존재하며 고도로 보존되고 면역학적으로 접근할 수 있는 항원을 제공한다.네이쎄리아 메닝기티디스질환을 치료, 예방 및 진단하는데 유용한 면역요법, 예방 및 진단 방법과 조성물이 제공된다. 프로테이나제 K에 대해 내성을 나타내며 겉보기 분자량이 22 kDa인네이쎄리아 메닝기티디스표면 단백질, 이에 대응하는 누클레오티드 및 그로부터 유도된 아미노산 서열 (서열번호 1, 서열번호 3, 서열번호 5 및 서열번호 7: 서열번호 2, 서열번호 4, 서열번호 6 및 서열번호 8), 상기네이쎄리아 메닝기티디스22 kDa 표면 단백질을 생산하기 위한 재조합 DNA 방법, 그리고 상기네이쎄리아 메닝기티디스22 kDa 표면 단백질에 결합하는 항체가 제공된다.

Description

프로테이나제 Ｋ에 대해 내성을 갖는 네이쎄리아 메닝기티디스의 표면 단백질 {Proteinase K resistant surface protein of Neisseria meningitidis}
네이쎄리아 메닝기티디스는 전세계에 있어서 가장 중요한 사망 및 질병의 원인이다.네이쎄리아 메닝기티디스는 풍토병과 유행병 모두의 원인이 되는데, 주로 수막염 및 수막염균혈증의 원인이다 [Gold,Evolution of meningococcal disease,p. 69, Vedros N.A., CRC Press (1987); Schwartz et al.,Clin. Microbiol. Rev.,2, p. S118 (1989)]. 사실, 이 생명체는헤모필루스 인플루엔자(Haemophilus influenzae) b형 이후에, 미국에서 세균성 수막염을 일으키는 가장 흔한 원인중의 하나로서, 모든 원인의 대략 20%를 차지한다.네이쎄리아 메닝기티디스에 대항하는 주요 대항 메카니즘은 혈청의 용균활성이며, 세균에 의한 침임에 대항한 방어는 항 -수막염균혈증 항체가 혈청내에 존재하는 것과 관련되어 있다는 것이 잘 보고되어 있다 [Goldschneider et al.,J. Exp. Med.129, p. 1307 (1969); Goldschneider et al., J. Exp. Med.,129, p. 1327 (1969)].
네이쎄리아 메닝기티디스는 캡슐형 항원의 존재여부에 따라 혈청학적 그룹으로 분류된다. 현재로서는 13개의 혈청그룹이 알려져 있지만, 혈청그룹 A, B, C, Y 및 W-135가 가장 흔히 발견된다. 혈청그룹 내에서는, 외막 단백질 및 리포다당류에 기초하여 혈청타입, 서브타입 및 면역타입이 확인될 수 있다 [Frasch et al., Rev. Infect. Dis. 7, p. 504 (1985)].
현재 사용되고 있는 캡슐성 다당류 백신은 모든네이쎄리아 메닝기티디스분리균에 대해 효과적인 것은 아니며, 유아에게서는 방어 항체의 생산을 효과적으로 유도하지 못한다 [Frasch, Clin. Microbiol. Rev.2, p. S134 (1989); Reingold et al.,Lancet,p. 114 (1985); Zollinger, in Woodrow and Levine, New generation vaccines, p. 325, Marcel Dekker Inc. N.Y. (1990)]. 현재로서는 혈청그룹 A, C, Y 및 W-135의 캡슐성 다당류가 이 생명체에 대한 백신에 사용되고 있다. 이들 다당류 백신은 단기간으로는 효과적이지만, 면역화된 대상이 면역학적 기억을 발달시키지 못하기 때문에 그 내성 수준을 유지하기 위해서는 3년 주기로 백신을 다시 투여받아야 한다.
또한, 이들 다당류 백신은 이 질환의 주 희생자인 생후 2년 미만의 유아에 있어서는 원하는 방어력을 얻기에 충분한 수준의 용균성 항체의 생산을 유도하지 못한다. 혈청그룹 B 분리균에 대해서는 이들 생명체가 선진국에서의 수막염균혈증의 주원인의 하나임에도 불구하고 현재로서는 이에 대한 효과적인 백신이 없는 상태이다. 실제로, 혈청그룹 B 다당류는 좋은 면역원이 아닌데, 방어력을 갖지 못하는 낮은 특이성의 IgM에 의한 미약한 반응을 유도할 뿐이다 [Gotschlich et al.,J. Exp. Med., p. 129, 1349 (1969); Skevakis et al.,J. Infect. Dis ., 149, p. 387 (1984); Zollinger et al.,J. Clin. Invest., 63, p. 836 (1979)]. 더우기, 신생아 뇌 조직의 글리코단백질에는 아주 유사한 교차반응성 구조가 존재하는데 [Finne et al.,Lancet, p. 355 (1983)], 이에 의해 혈청그룹 B 다당류의 면역원성을 향상시키고자 하는 노력이 방해를 받고 있는 것일 수 있다.
보다 효과적인 백신을 얻기 위해서, 리포다당류, 필리(pili) 단백질 및 외막에 존재하는 단백질과 같은 다른 여러네이쎄리아 메닝기티디스표면 항원에 대한 연구가 행해지고 있다. 백신처리된 자원자 및 회복기 환자의 혈청에 이들 단백질성 표면 항원중 특정의 것에 대한 인간 면역 반응 및 세균성 항체가 존재한다는 것이 입증되어 있다 [Mandrell and Zollinger,Infect. Immun., 57, p. 1590 (1989); Poolman et al.,Infect. Immun., 40, p. 398 (1983); Rosenquist et al.,J. Clin. Microbiol., 26, p. 1543 (1988); Wedege and Froholm,Infect. Immun., 51,p. 571 (1986); Wedge and Michaelsen,J. Clin. Microbiol., 25, p. 1349 (1987)].
또한, 클래스 1, 2/3 및 5와 같은 외막 단백질에 대항하는 단클론성 항체가 용균작용을 나타내며, 동물에게서 실험실적 감염에 대해 방어작용을 나타낸다는 것이 보고되어 있다 [Brodeur et al.,Infec. Immun., 50, p. 510 (1985); Frasch et al.,Clin. Invest. Med., 9, p. 101 (1986); Saukkonen et al.,Vaccine, 7, p. 325 (1989)].
네이쎄리아 메닝기티디스외막 단백질에 기초한 항원 제제는 동물과 인간에게서 면역원성 작용을 나타내며, 이들중 어떤 것은 임상단계에서 테스트되고 있다 [Bjune et al.,Lancet,p. 1093 (1991); Costa et al.,NIPH Annals, 14, p. 215 (1991); Frasch et al.,Med. Trop., 43, p. 177 (1982); Frasch et al.,Eur. J. Clin. Microbiol., 4, p. 533 (1985); Frasch et al. in Robbins,Bacterial Vaccines,p. 262, Praeger Publications, N.Y. (1987); Frasch et al.,J. Infec. Dis., 158, p. 710 (1988); Moreno et al.,Infec. Immun., 47, p. 527 (1985); Rosenqvist et al.,J. Clin. Microbiol., 26, p. 1543 (1988); Sierra et al.,NIPH Annals, 14, p. 195 (1991); Wedege and Froholm,Infec. Immun., 51, p. 571 (1986); Wedege and Michaelsen,J. Clin. Microbiol., 25, p. 1349 (1987); Zollinger et al.,J. Clin. Invest., 63, p. 836 (1979); Zollinger et al.,NIPH Annals, 14, p. 211 (1991)]. 그러나, 외막 단백질은 종간(種間)의 항원성이 매우 다양하기 때문에 백신으로 사용하는 데에는 제한이 있다 [Frasch,Clin. Microb.,Rev. 2, p. S134 (1989)]. 실제로, 이들 제제중 대부분은 해당 항원을 추출한 혈청타입과 동일하거나 또는 관련된 혈청타입에서만 제한된 용균 항체를 유도한다 [Zollinger in Woodrow and Levine,New Generation Vaccines, p. 325, Marcel Dekker Inc. N.Y. (1990)]. 또한, 이들 백신에 의해 제공되는 어린이들에게서의 방어작용도 명백하게 확립되어야만 한다. 클래스 4와 같이 고도로 보존된네이쎄리아 메닝기티디스외막 단백질[Munkley et al.,Microb. Pathogen., 11, p. 447 (1991)] 및 립(lip) 단백질 [Woods et al.,Infect. Immun., 55, p. 1927 (1987)]은 용균 항체의 생산을 자극하지 못하기 때문에 흥미있는 백신 후보가 되지 못한다. 이들 백신 제제를 개량하기 위해서는, 광범위한 스펙트럼을 갖는 백신을 개발하기 위하여, 모든네이쎄리아 메닝기티디스균종의 표면에 존재하며, 고도로 보존되고 있고, 용균 항체를 생산할 수 있는 단백질이 필요하다.
현재 사용되는네이쎄리아 메닝기티디스의 실험실 수준의 진단은 통상 그램 (Gram) 균들의 도말 제제, 라텍스 응집제 또는 공동응집제, 그리고 풍부화 및 선택 배지를 이용한 배양 및 분리와 같은 기술들을 이용하여 행해진다 [Morello et al., in Balows,Manual of Clinical Microbiology, p. 258, American Society for Microbiology, Washington (1991)]. 탄수화물 분해 시험은네이쎄리아 메닝기티디스분리균의 동정을 확인하기 위해 통상 행해지는 방법이다. 상술한 방법의 대부분은 숙련된 작업자를 필요로 하며 시간이 오래 걸리는 공정들이다. 대부분의 주요 혈청그룹 (prevalent serogroup)에 의해 발현되는 캡슐성 항원에 대한 다가 혈청을 함유하는 시판응집 또는 공동응집 키트는네이쎄리아 메닝기티디스를 신속하게 동정하는데 사용되고 있다. 그러나, 이들 다가 혈청은 다른 세균 종에 대해 비특이적으로 교차반응을 일으키며, 이러한 이유로 하여 항상 그램균 및 배양조직과 함께 사용되어야만 했다. 따라서, 진단의 속도와 신뢰성을 향상시킬 수 있는 효과적인 대체 진단분석법이 요구되어 왔다.
본 발명은네이쎄리아 메닝기티디스 (Neisseria meningitidis)의 표면에 있는 고도로 보존되고(highly conserved) 면역학적으로 접근할 수 있는 (immunologically accessible) 항원에 관한 것이다. 이 독특한 항원은네이쎄리아 메닝기티디스질환의 치료, 예방 및 진단에 유용하게 사용될 수 있는 새로운 면역치료학적, 면역예방용 및 진단용 시약의 기초를 제공한다. 보다 구체적으로는, 본 발명은 겉보기 분자량이 22 kDa인 프로테이나제 K-내성네이쎄리아 메닝기티디스표면 단백질, 이의 누클레오티드 서열 및 그로부터 유도된 아미노산 서열 (아미노산 서열번호 1∼아미노산 서열번호 26),네이쎄리아 메닝기티디스22 kDa 표면 단백질의 생산을 위한 재조합 DNA 방법,네이쎄리아 메닝기티디스22 kDa 표면 단백질에 결합하는 항체, 그리고네이쎄리아 메닝기티디스질환의 진단, 치료 및 예방을 위한 방법 및 조성물에 관한 것이다.
도 1은네이쎄리아 메닝기티디스균주 608B의 22 kDa 표면 단백질의 핵산 및 그로부터 유도된 아미노산 서열을 도시한다 (서열번호 1; 서열번호 2). 아미노산 잔기는 통상의 세글자(three letter) 기호를 이용하여 표시하였다. 오픈 리딩 프레임은 염기 143의 출발 코돈으로부터 시작하여 염기 667의 중지 코돈까지 연장되어 있다. 박스는 추정 리보좀 결합 부위인 반면, 추정 -10 프로모터 서열에는 밑줄을 그어 표시하였다. 19 아미노산 시그널 펩티드에도 밑줄을 그었다.
도 2는네이쎄리아 메닝기티디스균 608B (B:2a:P1.2)의 외막 제제의 α-키모트립신 및 트립신 분해물을 보여주는 쿠마씨 블루-염색 14% SDS-PAGE 겔의 사진이다. 레인 1은 다음과 같은 분자량 마커를 포함한다: 포스포릴라제 b (97,400); 소 혈청 알부민 (66,200); 난알부민 (45,000); 카르본산 안히드라제 (31,000); 콩 트립신 억제제 (21,500); 및 리소짐 (14,400). 레인 2는 소화처리되지 않은 대조용 외막 제제를 포함한다. 레인 3은 α-키모트립신 처리된 제제 (단백질 1 mg당 효소 2 mg)를 포함하고, 레인 4는 트립신 처린된 제제를 포함한다.
도 3a는네이쎄리아 메닝기티디스균 608B (B:2a:P1.2)의 외막 제제의 프로테이나제 K 소화물을 보여주는 쿠마씨 블루-염색 14% SDS-PAGE 겔의 사진이다. 레인 1, 3, 5 및 7은 소화처리되지 않은 대조군을 포함한다. 레인 2, 4, 6, 및 8은 프로테이나제 K (단백질 1 mg당 2 IU의 효소)로 소화처리된 외막 제제를 포함한다. 레인 1 내지 4는 pH 7.2에서 처리된 제제를 포함한다. 레인 5 내지 8은 pH 9.0에서 처리된 제제를 포함한다. 레인 1, 2, 5 및 6은 SDS의 부재하에 처리된 제제를 포함한다. 레인 3, 4, 7 및 8은 SDS의 존재하에 소화처리된 제제를 포함한다. 분자량 마커는 왼쪽에 (킬로달톤의 단위로) 표시하였다.
도 3b는 친화성 크로마토그래피에 의해 정제한 재조합 22 kDa 단백질의 이동 프로필을 보여주는 쿠마씨 블루-염색 14% SDS-PAGE 겔의 사진이다. 레인 1은 다음과 같은 분자량 마커를 포함한다: 포스포릴라제 b (97,400); 소 혈청 알부민 (66,200); 난알부민 (45,000); 카르본산 안히드라제 (31,000); 콩 트립신 억제제 (21,500); 및 리소짐 (14,400). 레인 2는 친화성 크로마토그래피에 의해 정제된 재조합 22 kDa 단백질 대조군 5㎍을 포함한다. 레인 3은 100℃에서 5분간 가열한, 친화성 크로마토그래피에 의해 정제된 재조합 22 kDa 단백질 5㎍을 포함한다. 레인 4는 100℃에서 10분간 가열한, 친화성 크로마토그래피에 의해 정제된 재조합 22 kDa 단백질 5㎍을 포함한다. 레인 5는 100℃에서 15분간 가열한, 친화성 크로마토그래피에 의해 정제된 재조합 22 kDa 단백질 5㎍을 포함한다.
도 4는네이쎄리아 메닝기티디스22 kDa 표면 단백질에 대해 특이적인 단클론성 항체의 반응성을 보여주는 블루-염색 14% SDS-PAGE 겔 및 그에 대응하는 웨스턴 면역블롯의 사진이다.네이쎄리아 메닝기티디스균 608B (B:2a:P1.2)의 외막 제제는 (A) 미처리군; (B) 프로테이나제 K 처리군 (단백질 1mg당 2 IU의 효소)이다. 레인 1은 분자량 마커를 포함하고 있으며, 외막 제제의 14% SDS-PAGE 겔 상에서의 특징적인 이동 프로필을 보여준다, 레인 2는 Me-2를; 레인 3은 Me-3을; 레인 4는 Me-5를; 레인 5는 Me-7을; 그리고 레인 6은 미처리된 대조 단클론성 항체를 포함한다. 분자량 마커는 포스포릴라제 b (97,400); 소 혈청 알부민 (66,200); 난알부민(45,000); 카르본산 안히드라제 (31,000); 콩 트립신 억제제 (21,500); 및 리소짐 (14,400)이다. Me-2, Me-3, Me-5, Me-6 및 Me-7에 대하여 도 4에 도시한 면역블롯 결과는 Me-1에 대해 얻어진 면역블롯 결과와 일치한다.
도 5는 본래의 (intact) 세균 세포에 대하여 단클론성 항체가 나타내는 결합 활성을 보여주는 그래프이다. 대표적인 단클론성 항체인 Me-5 및 Me-7에 대한 결과를 세로축에 "1분당의 계수 (counts for minute; "CPM")"로 표시하였다. 이 분석에서 사용된 각종 세균 균주를 가로축에 표시하였다. 음성 대조군으로서헤모필루스 인플루엔자포린(porin)-특이적 단클론성 항체를 사용하였다. 배경 계수는 500 CPM 미만인 것으로 기록되었으며 결합값으로부터 이 500 PPM을 차감되었다.
도 6은에세리키아 콜리BL21(DE3)의 농축 배양 상층액으로부터 재조합 22 kDa네이쎄리아 메닝기티디스표면 단백질을 정제한 것을 입증하는 쿠마씨 블루-염색 14% SDS-PAGE 겔 및 그에 대응하는 웨스턴 면역블롯의 사진이다. 도 6(A)는 쿠마씨 블루 및 은에 의해 염색된 14% SDS-PAGE 겔의 사진이다. 레인 1은 다음과 같은 분자량 마커를 포함한다: 포스포릴라제 b (97,400); 소 혈청 알부민 (66,200); 난알부민 (45,000); 카르본산 안히드라제 (31,000); 콩 트립신 억제제 (21,500); 및 리소짐 (14,400). 레인 2는네이쎄리아 메닝기티디스균 608B (혈청타입 B:2a:P1.2)로부터 추출한 외막 단백질 제제 (10 mg)를 포함한다. 레인 3은에세리키아 콜리BL21(DE3)의 농축 배양 상층액 (10 mg)을 포함한다. 레인 4는 친화성 크로마토그래피에 의해 정제된, 재조합 22 kDa네이쎄리아 메닝기티디스표면 단백질 (1 mg)을 포함한다. 도 6(B)는 친화성 크로마토그래피에 의해 정제된 재조합 22kDa네이쎄리아 메닝기티디스표면 단백질의 α-키모트립신, 트립신 및 프로테이나제 K 소화물에 대해 행한, 쿠마씨 블루 염색 14% SDS-PAGE 겔의 사진이다. 레인 1은 다음과 같은 분자량 마커를 포함한다: 포스포릴라제 b (97,400); 소 혈청 알부민 (66,200); 난알부민 (45,000); 카르본산 안히드라제 (31,000); 콩 트립신 억제제 (21,500); 및 리소짐 (14,400). 레인 2 내지 5는 정제된 재조합 22 kDa네이쎄리아 메닝기티디스표면 단백질 (2 mg)을 포함한다. 레인 7 내지 10은 소혈청 알부민 (2 mg)을 포함한다. 레인 2 및 7은 소화처리되지 않은 ("NT") 단백질을 포함한다. 레인 3 및 8은 α-키모트립신으로 처리된 ("C") 단백질 (단백질 1 mg당 효소 2 mg)을 포함한다. 레인 4 및 9는 트립신으로 처리된 ("T") 단백질 (단백질 1 mg당 효소 2 mg)을 포함한다. 레인 5 및 10은 프로테이나제 K로 처리된 ("K") 단백질 (단백질 1 mg당 효소 2 IU)을 포함한다. 도 6(C)는 단클론성 항체 Me-5를 이용하여 2회 반복히여 실시한 웨스턴 면역블롯 겔의 사진이다.
도 7은네이쎄리아 메닝기티디스균 608B (B:2a:P1.2)에 대한 단백질 A-정제된 항-네이쎄리아 메닝기티디스22 kDa 표면 단백질 단클론성 항체의 용균 활성을 보여주는 그래프이다. 세로축은 각종 농도의 단클론성 항체 (그래프의 가로축에 도시)에 노출된네이쎄리아 메닝기티디스균의 생존율을 나타낸다.
도 8은네이쎄리아 메닝기티디스MCH88 주의 22 kDa 표면 단백질의 핵산 및 그로부터 유도된 아미노산 서열을 도시한다 (서열번호 3; 서열번호 4). 아미노산 잔기는 통상의 세글자 기호를 이용하여 표시하였다. 오픈 리딩 프레임은 염기 116의 출발 코돈으로부터 시작하여 염기 643의 중지 코돈까지 연장되어 있다.
도 9는네이쎄리아 메닝기티디스Z4063 주의 22 kDa 표면 단백질의 핵산 및 그로부터 유도된 아미노산 서열을 도시한다 (서열번호 5; 서열번호 6). 아미노산 잔기는 통상의 세글자 기호를 이용하여 표시하였다. 오픈 리딩 프레임은 염기 208의 출발 코돈으로부터 시작하여 염기 732의 중지 코돈까지 연장되어 있다.
도 10은네이쎄리아 고노로에 (Neisseria gonorrhoeae)b2 주의 22 kDa 표면 단백질의 핵산 및 그로부터 유도된 아미노산 서열을 도시한다 (서열번호 7; 서열번호 8). 아미노산 잔기는 통상의 세글자 기호를 이용하여 표시하였다. 오픈 리딩 프레임은 염기 241의 출발 코돈으로부터 시작하여 염기 765의 중지 코돈까지 연장되어 있다.
도 11은 4종의네이쎄리아균의 DNA 서열로부터 구축된 보존 서열(서열번호 29)을 도시하고 있으며, 각 균주에 특이한 누클레오티드의 치환 또는 삽입을 표시하고 있다.
도 12는 4종의네이쎄리아균의 단백질 서열로부터 구축된 보존 서열(서열 번호 30)을 도시하고 있으며, 각 균주에 특이한 아미노산 잔기의 치환 또는 삽입을 표시하고 있다.
도 13은 토끼에서의 재조합 222 kDa 단백질에 대응하는 면역반응을 상호반응형(reciprocal) ELISA 역가로 표시하여 시간경과에 따라 보여주고 있다. 플라스미드 pN2202 또는 대조 플라스미드 pWKS30을 포함하고 있는이. 콜리JM109 주로부터 얻은 외막 제제를 토끼에게 주사하였다. 코팅 항원으로서네이쎄리아 메닝기티디스균 608B (B:2a:P1.2)로부터 얻은 외막제제를 이용하는 ELISA에 의해 특이적 체액성반응의 발달을 분석하였다.
도 14는마카카 파시쿨라리스(Macaca fascicularis)(cynomolus) 원숭이에서의 재조합 22 kDa 단백질에 대응하는 면역반응을 상호반응형 ELISA 역가로 표시하여 시간경과에 따라 보여주고 있다. 매 주사당 친화성 크로마토그래피로 정제한 22 kDa 단백질 100 ㎍ (K28) 및 200 ㎍ (I276)을 2마리의 원숭이 각각에게 주사하였다. 대조 원숭이 (K65)에게는 동일한 방법에 따라 비관련 재조합 단백질 150 ㎍을 이용하여 면역화하였다. 코팅 항원으로서네이쎄리아 메닝기티디스균 608B (B:2a:P1.2)로부터 얻은 외막 제제를 이용하는 ELISA에 의해 특이적 체액성 반응의 발달을 분석하였다.
도 15는 본 발명의 합성 펩티드들(서열번호 2) 및네이쎄리아 메닝기티디스608B (B:2a:P1.2)주의 22 kDa 단백질에서의 이들의 각 위치를 보여주는 그래프이다.
도 16은네이쎄리아 메닝기티디스22 kDa 표면 단백질; 22 kDa,네이쎄리아 메닝기티디스22 kDa 표면 단백질 유전자; AmpiR, 암피실린-내성 코딩 영역; ColE1, 복제 오리진; cI857, 박테리오파지 λ cI857 온도-민감성 리프레서 (repressor) 유전자; λPL, 박테리오파지 λ 전사 프로모터; T1 전사 터미네이터를 코딩하는 유전자를 포함하는 플라스미드 pNP2204의 지도이다. 전사 방향은 화살표로 표시하였다.BglII 및BamH1은 22 kDa 유전자를 p629 플라스미드에 삽입하기 위해 사용된 제한 부위이다.
발명의 상세한 설명
네이쎄리아 메닝기티디스의 외막의 구조를 연구하던 도중에, 본 발명자들은 매우 특이한 특성을 갖는 22 킬로달톤의 신규한 저분자량 단백질을 동정하였다. 이 외막 단백질은트리티라키움 알붐림버(Tritirachium albumLimber) 곰팡이에서 유래한 세린 프로테아제인 프로테이나제 K와 같은 단백분해효소를 이용한 광범위한 처리에 대해서 강한 내성을 갖는다. 프로테이나제 K는 높은 효능, 광범위한 최적 pH 및 낮은 펩티드 결합 특이성을 갖기 때문에 [Barrett, A. J. and N.D. Rawlings,Biochem. Soc. Transactions(1991) 19: 707-715] 자연에는 프로테이나제 K에 대해 내성을 갖는 단백질이 매우 희귀하고, 따라서 이런 이유로 본 발명의 단백질이 프로테이나제 K에 대해 강한 내성을 나타내는 것은 매우 놀라운 일이다. 소수의 보고에서만 프로테이나제 K에 의한 효소분해에 대해 내성을 갖는 원생동물 유래의 단백질이 보고되어 있을 뿐이다. 프로테이나제 K에 대해 내성을 갖는 단백질은렙토스피라(Leptospira) 종 [Nicholson, V.M. and J.F. Prescott,Veterinary Microbiol. (1993) 36:123-138],미코플라스마(Mycoplasma)종 [Butler, G.H. et al.Infec. Immun.(1991) 59:1037-1042],스피로플라스마 미룸(Spiroplasma mirum) [Bastian, F.O. et al.J. Clin. Microbiol.(1987) 25:2430-2431] 및 바이러스와 프리온 [Onodera, t. et al.Microbiol. Immunol.(1993) 37:311-316; Prisomer, S.B. et al.Proc. Nat. Acad. Sci. USA(1993) 90:2793-2797]에서 발견되었다. 여기에서 본 발명자들은네이쎄리아 메닝기티디스감염의 예방, 치료 및 진단을 개선할 수 있는 수단으로서 상기 단백질을 사용하는 것을 기술한다.
즉 본 발명의 한 측면에 따르면, 본 발명자들은 고도로 보존되고 면역학적으로 접근할 수 있는네이쎄리아 메닝기티디스표면 단백질, 그의 단편, 유사체 및 유도체를 제공한다. 본 명세서에서 사용된 "네이쎄리아 메닝기티디스표면 단백질"은 천연에 존재하는네이쎄리아 메닝기티디스유전자에 의해 코딩되는 모든네이쎄리아 메닝기티디스표면 단백질을 의미한다. 본 발명에 따른네이쎄리아 메닝기티디스단백질은 천연으로부터 유래된 것일수도 있고, 그의 단편이나 재조합 단백질을 생산하기 위한 목적을 갖고 분자 생물학을 응용하여 얻은 것일 수도 있다.
본 명세서에서 사용된 "고도로 보존된 (highly conserved)"은네이쎄리아 메닝기티디스표면 단백질을 코딩하는 유전자 및 단백질 그 자체가 공지된네이쎄리아 메닝기티디스종의 50% 이상에서 존재하고 있음을 의미한다. 바람직하게는, 유전자 및 그의 단백질이 공지된네이쎄리아 메닝기티디스종의 99% 이상에서 존재하는 것을 의미한다. 실시예 2 및 4는 당업자가네이쎄리아 메닝기티디스표면 단백질이 "고도로 보존된" 것인지 결정하기 위하여 여러 다양한 표면 단백질을 테스트할 수 있는 방법을 기술하고 있다.
본 명세서에서 사용된 "면역학적으로 접근할 수 있는 (immunologically accessible)"은네이쎄리아 메닝기티디스표면 단백질이 생명체의 표면에 존재하고 있으며 항체에 접근할 수 있는 것을 의미한다. 실시예 2는 당업자가네이쎄리아 메닝기티디스표면 단백질이 "면역학적으로 접근할 수 있는" 것인지의 여부를 결정하기 위하여 여러 다양한 표면 단백질을 테스트할 수 있는 방법을 기술하고 있다. 면역학적 접근가능성은 응집분석법, ELISA, RIA, 면역블롯팅 분석법, 도트-효소 분석법(dot-enzyme assay), 표면 접근가능성 분석법, 전자 현미경을 비롯한 다른 방법들, 또는 이들 분석법을 혼용하여 결정할 수 있다.
본 명세서에서 사용된네이쎄리아 메닝기티디스표면 단백질의 "단편 (fragments)"은 하나 이상의 펩티드 에피토프를 갖는 폴리펩티드, 또는 그의 유사체 및 유도체를 포함한다. 이 종류의 펩티드는 통상의 액상 또는 고상 펩티드 합성 기술을 이용하여 합성하거나 분자생물학의 응용을 통하여 얻을 수 있다.
본 명세서에서 사용된네이쎄리아 메닝기티디스표면 단백질의 "유사체 (analogues)"는 천연에 존재하는 서열중의 하나 또는 그 이상의 아미노산 잔기가 또다른 아미노산 잔기로 치환되어 있으면서 이 단백질의 전체적인 기능 및 방어적 특성은 보존되어 있는 단백질, 또는 그의 단편을 포함한다. 이러한 유사체는 예를 들면 천연에 존재하는네이쎄리아 메닝기티디스표면 단백질을 돌연변이시키거나 또는 재조합 DNA 기술을 이용하여 제조하거나, 또는 합성법에 의해 얻을 수 있다. 이런 방법은 당업계에 주지되어 있다.
예를 들어, 이러한 유사체는 도 10에 도시한 바와 같이,네이쎄리아 고노로에주 b2로부터 유래된 22 kDa 단백질의 유전자로부터 생산할 수 있는 재조합 단백질로부터 선택된다. 또다른 유사체는네이쎄리아 락타미카로부터 대응 유전자를 분리하므로써 얻을 수 있다.
본 명세서에 사용된네이쎄리아 메닝기티디스표면 단백질의 "유도체 (derivative)"는 인체내에서 면역원성을 갖도록 하기 위하여, 예를 들어 디니트로페놀에 의해 공유결합적으로 변형된 단백질 또는 그의 단편이다. 본 발명의 유도체에는 또한 본 발명의 아미노산 유사체의 유도체도 포함된다.
본 발명의 실시예를 따라하므로써, 당업자는 특정 단편, 유사체 또는 유도체가네이쎄리아 메닝기티디스질환의 진단, 예방 또는 치료에 유용한 것인지의 여부를 과도하게 부담스러운 실험없이도 결정할 수 있다.
본 발명은 또한네이쎄리아 메닝기티디스표면 단백질, 단편, 유사체 및 유도체의 폴리머 형태를 포함한다. 이들 폴리머 형태에는 예를 들면, 아비딘/비오틴. 글루테르알데히드 또는 디메틸수베르이미데이트와 같은 교차결합제에 의해 교차결합된 하나 또는 그 이상의 폴리펩티드가 포함된다. 이러한 폴리머 형태에는 또한 재조합 DNA 기술에 의해 생성시킨 다중시트론성 mRNA로부터 생산된, 둘 또는 그 이상의 직렬식의(tandem) 또는 역전된 인접네이쎄리아 메닝기티디스서열을 갖고 있는 폴리펩티드가 포함된다.
본 발명은 실지적으로 순수한 (substantially pure)네이쎄리아 메닝기티디스표면 단백질을 제공한다. 상기 용어 "실지적으로 순수한"은 본 발명에 따른네이쎄리아 메닝기티디스표면 단백질이네이쎄리아 메닝기티디스유래의 다른 단백질을 포함하지 않는 것을 의미한다. 실지적으로 순수한네이쎄리아 메닝기티디스표면 단백질 제제는 여러 가지 통상의 방법, 예를 들어 실시예 3 및 11에 기재된 방법에 따라 얻을 수 있다.
또다른 측면에 따르면, 본 발명은 또한 도 1(서열번호 2)의 아미노산 서열을 갖는네이쎄리아 메닝기티디스의 22 kDa 표면 단백질, 그의 단편, 유사체 및 유도체를 제공한다.
또다른 측면에 따르면, 본 발명은 또한 도 8(서열번호 4) 및 도 9 (서열번호 6)의 아미노산 서열을 갖는네이쎄리아 메닝기티디스의 22 kDa 표면 단백질, 그의 단편, 유사체 및 유도체를 제공한다. 이러한 단편은 도 15 (서열번호 9 내지 서열번호 26)에 열거한 펩티드로부터 선택될 수 있다.
또다른 측면에 따르면, 본 발명은 또한 도 10(서열번호 8)의 아미노산 서열을 갖는네이쎄리아 고노로에의 22 kDa 표면 단백질, 그의 단편, 유사체 및 유도체를 제공한다. 위에서 알 수 있는 바와 같이, 또한 도 1(서열번호 2)의 아미노산 서열을 갖는네이쎄리아 메닝기티디스의 22 kDa 단백질에 대한 모든 언급은네이쎄리아 고노로에또는네이쎄리아 락타미카와 같은네이쎄리아속의 다른 종에서 분리한 유전자로부터 분리하거나 제작한 모든 22 kDa 단백질을 포함한다.
본 발명에 따른네이쎄리아 메닝기티디스의 22 kDa 표면 단백질은 다음의 특성 (1) 내지 (10) 중 하나 또는 그 이상의 특성에 의해 더 특성화될 수 있다:
(1) SDS-PAGE 겔에서 측정한 겉보기 분자량이 22 kDa이다;
(2) SDS-PAGE 상에서의 전기영동 이동성은 환원제 처리에 의해서도 변하지 않는다;
(3) 약 pI 8 내지 pI 10 범위의 등전점(pI)을 갖는다;
(4) α-키모트립신, 트립신 및 프로테이나제 K와 같은 단백분해효소에 의한 분해에 대해 높은 내성을 갖는다;
(5) 과요오드산염 산화에 의해서도네이쎄리아 메닝기티디스의 22 kDa 표면 단백질에 대한 항체의 특이적 결합능이 상실되지 않는다;
(6) 고도로 보존된 항원이다;
(7) 본래의(intact)네이쎄리아 메닝기티디스생명체 표면에서 항체에 접근할 수 있다;
(8) 용균성 항체의 생산을 유도할 수 있다;
(9) 실험실적 감염에 대한 방어를 제공할 수 있는 항체의 생산을 유도할 수 있다;
(10) 동물 숙주에 투여했을 때,네이쎄리아 메닝기티디스감염에 대한 방어를 제공할 수 있는 면역학적 반응의 발달을 유도할 수 있다.
본 발명은 또한, 처음으로,네이쎄리아 메닝기티디스의 22 kDa 표면 단백질을 코딩하는 DNA 서열 (서열번호 1; 번호 3; 번호 5 및 번호 7)을 제공한다. 본 발명의 바람직한 DNA 서열은 다음 (a) 내지 (g)로 이루어진 군에서 선택된 것이다:
(a) 도 1의 DNA 서열 (서열번호 1);
(b) 도 8의 DNA 서열 (서열번호 3);
(c) 도 9의 DNA 서열 (서열번호 5);
(d) 도 10의 DNA 서열 (서열번호 7);
(e) 상기 DNA 서열의 유사체 또는 유도체;
(f) 상기 DNA 서열중 어느 하나와 중첩되는 (degenerate) DNA 서열; 및
(g) 상기 DNA 서열중 어느 하나의 단편;
상기 서열은네이쎄리아 메닝기티디스의 22 kDa 표면 단백질의 면역학적 활성을 나타내는 산물을 코딩한다.
이러한 단편들은 바람직하게는 도 15에 도시한 펩티드 (서열번호 9 내지 서열번호 26)이다.
바람직하게는 본 발명은 또한 처음으로네이쎄리아 메닝기티디스의 22 kDa 표면 단백질을 코딩하는 DNA 서열 (서열번호 1)을 제공한다. 보다 바람직한 DNA 서열은 다음 (a) 내지 (d)로 이루어진 군에서 선택된 것이다:
(a) 도 1의 DNA 서열 (서열번호 1);
(b) 상기 DNA 서열의 유사체 또는 유도체;
(c) 상기 DNA 서열중 어느 하나와 중첩되는 (degenerate) DNA 서열; 및
(d) 상기 DNA 서열중 어느 하나의 단편;
상기 서열은네이쎄리아 메닝기티디스의 22 kDa 표면 단백질의 면역학적 활성을 나타내는 산물을 코딩한다.
네이쎄리아 메닝기티디스의 22 kDa 표면 단백질을 코딩하는 유전자의 유사체 및 유도체는 실시예 4에 설명되는 조건하에서 22 kDa 표면 단백질-코딩 유전자에 하이브리드화된다.
본 발명에 있어서,네이쎄리아 메닝기티디스의 22 kDa 표면 단백질의 단편, 유사체 및 유도체가 동물 숙주에 투여되었을 때네이쎄리아 메닝기티디스감염에 대한 방어를 제공할 수 있는 면역학적 반응의 발달을 유도할 수 있다면, 이들은네이쎄리아 메닝기티디스의 22 kDa 표면 단백질에 대한 "면역학적 활성"을 갖는 것이다. 당업자라면 실시예 6에 기재된 방법에 따라 실시하므로써 특정 DNA 서열이네이쎄리아 메닝기티디스의 22 kDa 표면 단백질의 면역학적 활성을 나타내는 산물을코딩하는 지의 여부를 결정할 수 있다.
본 발명의네이쎄리아 메닝기티디스표면 단백질은 다음 단계:
(a)네이쎄리아 메닝기티디스균의 배양액을 분리하는 단계;
(b) 상기 균 배양액으로부터 외막 단백질을 분리하는 단계; 및
(c) 상기 외막 단백질로부터 항원을 분리하는 단계
를 포함하는 방법에 의해 분리할 수 있다.
특히, 상기 단계 (c)는네이쎄리아 메닝기티디스외막 단백질 추출물을 프로테이나제 K로 처리하는 단계 및 이온교환 및 겔 크로마토그래피와 전기영동과 같은 통상의 분리기술을 이용하여 단백질을 분획화하는 단계를 더 포함할 수 있다.
또는 그리고 바람직하게는, 본 발명의네이쎄리아 메닝기티디스표면 단백질은 본 발명의 실시예 3에 기술된 것과 같은 분자생물학 기술을 이용하여 제조할 수 있다. 분자생물학 기술은 실질적으로 순수한 재조합네이쎄리아 메닝기티디스22 kDa 표면 단백질을 제조하는데 특히 적합하다.
본 발명의 다른 측면에 따르면, 다음 단계: (1) 재조합네이쎄리아 메닝기티디스22 kDa 표면 단백질을 코딩하는 DNA 서열, 그의 단편, 유사체 또는 유도체, 그리고 이 DNA 서열에 작동가능하게 연결된(operatively linked) 하나 또는 그 이상의 발현 조절 서열 (expression control sequences)을 포함하는 재조합 DNA 분자에 의해 형질전환된 단세포 숙주 생명체를 배양하는 단계; 및 (2) 실질적으로 순수한 단백질, 단편, 유사체 또는 유도체를 회수하는 단계를 포함함을 특징으로 하는, 재조합네이쎄리아 메닝기티디스22 kDa 표면 단백질, 그의 단편, 유사체 및 유도체를 제조하는 방법이 제공된다.
당업계에 주지된 바와 같이, 숙주세포에서 형질감염 유전자의 발현 수준을 높이기 위해서는, 해당 유전자가, 선택된 발현 숙주내에서 기능을 발휘하는 전사 및 해독 발현 조절 서열에 작동가능하도록 연결되어야만 한다. 바람직하게는 발현 조절 서열 및 해당 유전자는 세균 선택 마커 및 복제 오리진을 더 포함하는 하나의 발현 벡터내에 포함되게 된다. 발현 숙주가 진핵세포인 경우에는, 발현 벡터는 발현 숙주내에서 유용한 발현 마커를 더 포함하여야만 한다.
본 발명의 DNA 서열을 발현시키기 위해 매우 다양한 발현 숙주/벡터 조합이 이용될 수 있다. 진핵 숙주에 적합한 발현 벡터에는, 예를 들어 SV40, 소 유두종 바이러스, 아데노바이러스 및 시토메갈로바이러스로부터 유래된 발현 조절 서열을 포함한다. 세균 숙주에 사용할 수 있는 발현 벡터에는 col E1, pCR1, pBR322, pMB9 및 이들의 유도체와 같이이. 콜리에서 얻는 것을 예시할 수 있는 공지의 세균성 플라스미드, RP4와 같이 보다 넓은 숙주 범위를 갖는 플라스미드, ㎚989와 같은 매우 다양한 파지 람다 유도체로 예시될 수 있는 파지 DNA, 및 M13과 필라멘트성 단일가닥의 DNA 파지와 같은 기타 다른 DNA 파지가 포함된다. 효모 세포에 유용한 발현 벡터는 2 mu 플라스미드 및 그의 유도체이다. 곤충 세포에 유용한 벡터는 pVL 941이다.
또한, 본 발명의 DNA 서열을 발현시키기 위하여, 매우 다양한 발현 조절 서열중 어느 것이라도 이들 벡터에 사용될 수 있다. 이러한 유용한 발현 조절 서열에는 상술한 발현 벡터의 구조 유전자와 연관된 발현 조절 서열을 포함한다. 유용한발현 조절 서열의 예에는, 예를 들어, SV40 또는 아데노바이러스의 초기 및 후기 프로모터들, lac 시스템, trp 시스템, TAC 또는 TRC 시스템, 파지 람다의 주요 오퍼레이터 및 프로모터 영역, fd 코트 단백질의 조절 영역, 3-포스포글리세레이트 키나제 또는 다른 글리콜분해 효소에 대한 프로모터, 상기 포스파타제의 프로모터들, 예를 들어 Pho5, 효모 알파-교배 시스템의 프로모터 및 원핵세포 및 진핵 세포 또는 이들의 바이러스의 유전자의 발현을 조절하는 것으로 알려진 기타 다른 서열, 및 이들의 여러 조합이 포함된다.네이쎄리아 메닝기티디스22 kDa 표면 단백질의 발현 조절 서열은이. 콜리에서네이쎄리아 메닝기티디스22 kDa 표면 단백질을 발현시키는데 특히 유용하다 (실시예 3).
상술한 벡터에 의해 형질전환된 숙주 세포는 본 발명의 또다른 측면을 구성한다. 본 발명의 DNA 서열을 발현시키는데에는 매우 다양한 단세포성 숙주 세포가 이용될 수 있다. 이들 숙주에는이.콜리, 슈도모나스, 바실러스, 스트렙토마이세스, 진균, 효모와 같은 주지의 진핵 및 원핵 숙주들,스포도프테라 프루기페르다(SF9)와 같은 곤충 세포, CHO 및 생쥐 세포 같은 동물 세포, COS 1, COS 7, BSC 1, BSC 40 및 BMT 10과 같은 아프리카 그린 원숭이 세포, 및 조직배양된 인간 세포 및 식물 세포들이 포함된다. 바람직한 숙주 생명체에는이.콜리및바실러스 서브틸리스와 같은 세균, 그리고 조직배양된 포유동물 세포가 포함된다.
물론 모든 벡터와 발현 조절 서열이 본 발명의 DNA 서열을 발현하는데 모두 동등하게 기능을 발휘하지는 않는다는 것을 이해하여야만 한다. 마찬가지로 모든 숙주가 동일한 발현 시스템에 대해 동일하게 기능을 발휘하지는 않는다. 그러나 당업자라면 과도한 실험적 부담없이 본 발명의 범위를 벗어나지 않으면서 여러 벡터, 발현 조절 서열 및 숙주 중에서 적절한 선택을 할 수 있다. 예를 들어, 벡터를 선택함에 있어서는 숙주를 고려하여야 하는데, 이는 벡터가 그 안에서 복제되어야만 하기 때문이다. 벡터의 복제 수(copy number), 복제 수를 조절할 수 있는 능력, 및 당해 벡터에 의해 코딩되어 있는 다른 단백질, 예를 들어 항생제 마커의 발현도 또한 고려되어야만 한다.
발현 조절 서열을 선정함에 있어서도, 여러 가지 인자들을 고려하여야만 한다. 예를 들어, 서열의 상대적 강도, 조절가능성, 및 본 발명의 DNA 서열과의 상용성 등을, 특히 가능성있는 이차 구조와 관련하여 고려하여야 한다. 단세포 숙주는 선정된 벡터, 본 발명의 DNA 서열에 의해 코딩되는 산물의 독성, 분비 특성, 단백질을 정확하게 폴딩시킬 수 있는 능력, 배양 및 발효 요건들, 본 발명 DNA 서열에 의해 코딩되는 산물을 숙주로부터 정제하는 것의 용이성 등의 인자를 고려하여 선정되어야만 한다.
이들 변수의 범위내에서, 당업자는 본 발명의 DNA 서열을 발효 또는 대규모 동물 배양에서 발현시킬 수 있는 각종 벡터/발현 조절 서열/숙주 조합을 선정할 수있다.
본 발명의 DNA 서열에 의해 코딩되는 폴리펩티드는 여러 다양한 통상의 방법을 이용하여 발효 또는 세포배양액으로부터 분리할 수 있다. 당업자는 본 발명의 범위를 벗어나지 않으면서 가장 적합한 분리 및 정제 기술을 선정할 수 있다.
본 발명의네이쎄리아 메닝기티디스표면 단백질은네이쎄리아 메닝기티디스감염에 의해 유발되는 질병을 예방, 치료 및 진단하기 위한 예방학적, 치료학적 및 진단용 조성물에 사용하기에 유용하다.
본 발명의네이쎄리아 메닝기티디스표면 단백질은네이쎄리아 고노로에,또는네이쎄리아 락타미카감염에 의해 유발되는 질병을 예방, 치료 및 진단하기 위한 예방학적, 치료학적 및 진단용 조성물에 사용하기에 유용하다.
본 발명의네이쎄리아 메닝기티디스표면 단백질은네이쎄리아 메닝기티디스질환에 대한 방어적 반응의 발달 및 항체의 생성에 특히 적합하다.
본 발명의네이쎄리아 메닝기티디스표면 단백질은네이쎄리아 고노로에,또는네이쎄리아 락타미카질환에 대한 방어적 반응의 발달 및 항체의 생성에 특히 적합하다.
특히 본 발명은 도 1에 도시한 아미노산 서열 (서열번호 2)을 갖는 것으로서 면역원 및 백신으로 사용할 수 있는네이쎄리아 메닝기티디스22 kDa 표면 단백질, 또는 그의 단편, 유사체 또는 유도체를 제공한다.
특히 본 발명은 도 1 (서열번호 2), 도 8 (서열번호 4), 도 9 (서열번호 6), 또는 도 10 (서열번호 8)의 아미노산 서열을 갖는 것으로서 면역원 및 백신으로 사용할 수 있는네이쎄리아 메닝기티디스22 kDa 표면 단백질, 또는 그의 단편, 유사체 또는 유도체를 제공한다.
네이쎄리아 메닝기티디스22 kDa 표면 단백질을 면역원 또는 백신으로 사용하기 위하여 표준 면역학적 기술을 이용할 수 있다. 특히, 적절한 숙주에 제약학적으로 유효한 양의네이쎄리아 메닝기티디스22 kDa 표면 단백질을 주사하여 단클론성 또는 다가 항-네이쎄리아 메닝기티디스항체를 생성하거나, 또는네이쎄리아 메닝기티디스질환에 대한 방어적 면역학적 반응의 발달을 유도할 수 있다. 숙주에 주사하기 전에,네이쎄리아 메닝기티디스표면 단백질을 적절한 부형제를 이용하여 제제화할 수 있으며, 따라서 본 발명은 하나 또는 그 이상의네이쎄리아 메닝기티디스표면 항원 또는 그의 단편을 함유하는 제약학적 조성물을 제공한다. 바람직하게는, 항원은네이쎄리아 메닝기티디스22 kDa 표면 단백질 또는 그의 단편, 유사체 또는 유도체이며, 하나 또는 그 이상의 제약학적으로 허용되는 부형제와 함께 사용된다. 본 명세서에 사용된 "제약학적으로 유효한 양 (pharmaceutically effective amount)"는네이쎄리아 메닝기티디스감염을 치료 또는 예방하기에 충분한 역가의 항-네이쎄리아 메닝기티디스항체를 자극할 수 있는, 하나 또는 그 이상의네이쎄리아 메닝기티디스표면 항원의 양을 의미한다.
본 발명의네이쎄리아 메닝기티디스표면 단백질은 또한네이쎄리아 메닝기티디스감염의 진단 테스트를 위한 기초를 형성한다. 여러 진단방법을 사용할 수 있다. 예를 들어, 본 발명은네이쎄리아 메닝기티디스항원을 포함하거나 또는 포함하는 것으로 추측되는 생물학적 시료로부터네이쎄리아 메닝기티디스항원을 검출하기 위한 방법으로서, 하기 단계 (a) - (c) :
(a) 환자로부터 생물학적 시료를 분리하는 단계;
(b) 항-네이쎄리아 메닝기티디스22 kDa 표면 단백질 항체 또는 그의 단편을 상기 생물학적 시료와 함께 보온하여 혼합물을 형성하는 단계; 및
(c)네이쎄리아 메닝기티디스항원의 존재를 나타내는, 혼합물중에 존재하는특이적으로 결합된 항체 또는 결합 단편을 검출하는 단계
를 포함함을 특징으로 하는 방법을 제공한다.
상기한 진단방법에서 사용할 수 있는 바람직한 항체는 Me-1 및 Me-7이다.
또는,본 발명은네이쎄리아 메닝기티디스항원에 대해 특이적인 항체를 포함하거나 또는 포함하는 것으로 추측되는 생물학적 시료로부터 상기 항체를 검출하기 위한 방법으로서, 하기 단계 (a) - (c) :
(a) 환자로부터 생물학적 시료를 분리하는 단계;
(b) 본 발명의네이쎄리아 메닝기티디스표면 단백질 또는 그의 단편을 상기 생물학적 시료와 함께 보온하여 혼합물을 형성하는 단계; 및
(c)네이쎄리아 메닝기티디스항원에 대해 특이적인 항체의 존재를 나타내는, 혼합물중에 존재하는 특이적으로 결합된 항원 또는 결합 단편을 검출하는 단계
를 포함함을 특징으로 하는 방법을 제공한다. 당업자라면 이 진단 테스트가 단백질에 특이적인 항체가 생명체내에 존재하는지를 결정하기 위하여, 효소-연결 면역흡착 분석법 (ELISA), 방사면역분석법 또는 라텍스 응집 분석법을 비롯하여 어려 형태를 취할 수 있다는 것을 이해할 것이다.
본 발명의 DNA 서열은네이쎄리아 메닝기티디스세균을 포함하는 것으로 추측되는 생물학적 시료중에 상기 세균이 존재하는 지의 여부를 검출하는데 사용하기 위한 DNA 탐침을 설계하는데 이용될 수 있다. 본 발명의 이 검출방법은 다음 단계 (a) - (c) :
(a) 환자로부터 생물학적 시료를 분리하는 단계;
(b) 본 발명의 DNA 서열을 갖는 DNA 탐침을 상기 생물학적 시료와 함께 보온하여 혼합물을 형성하는 단계; 및
(c)네이쎄리아 메닝기티디스세균의 존재를 나타내는, 혼합물중에 존재하는 특이적으로 결합된 DNA 탐침을 검출하는 단계를 포함한다.
바람직한 DNA 탐침은 도 1 (서열번호 1), 도 8 (서열번호 3), 도 9 (서열번호 5) 또는 도 10 (서열번호 7)에 도시한 염기쌍 서열, 또는 도 11의 컨센서스 서열 (서열번호 29)을 갖는다.
보다 바람직한 DNA 탐침은 도 1에 도시한 525 염기쌍 서열 (서열번호 1)을 갖는다.
본 발명의 DNA 탐침은 또한네이쎄리아 메닝기티디스감염을 진단하는 방법으로서, 예를 들어 폴리머라제 사슬 반응 (polymerase chain reaction)을 이용하여 시료로부터 순환네이쎄리아 메닝기티디스핵산을 검출하는데 이용될 수 있다. 이 탐침은 통상의 기술을 이용하여 합성할 수 있으며, 고상에 고정화시키기거나, 또는 검출가능한 표지를 이용하여 표지화할 수 있다.
본 응용에 바람직한 DNA 탐침은 도 1 (서열번호 1), 도 8 (서열번호 3), 도 9 (서열번호 5) 또는 도 10 (서열번호 7)에 도시한 서열, 또는 도 11의 컨센서스 서열 (서열번호 29)인네이쎄리아 메닝기티디스22 kDa 표면 단백질 유전자중 적어도 6개의 인접 (contiguous) 누클레오티드에 상보적인 서열을 갖는 올리고머이다.
본 응용에 있어 보다 바람직한 DNA 탐침은 도 1 (서열번호 1)에 도시한네이쎄리아 메닝기티디스22 kDa 표면 단백질 유전자중 적어도 6개의 인접 누클레오티드에 상보적인 서열을 갖는 올리고머이다.
환자로부터네이쎄리아 메닝기티디스를 검출하기 위한 또다른 진단방법은 다음 단계 (a) - (c):
(a) 본 발명의 항체 또는 그의 단편을 검출가능한 표지로 표지화하는 단계;
(b) 상기 표지화된 항체 또는 표지화된 단편을 환자에게 투여하는 단계; 및
(c)네이쎄리아 메닝기티디스세균의 존재를 나타내는, 환자 체내에 존재하는 특이적으로 결합된 표지화 항체 또는 표지화 단편을 검출하는 단계를 포함한다.
항-네이쎄리아 메닝기티디스표면 단백질 항체를 정제하기 위하여, 친화성 매체로서 고정화네이쎄리아 메닝기티디스표면 단백질을 사용하는 친화성 크로마토그래피를 이용할 수 있다.
본 발명의 또다른 측면에 따르면, 불용성 담체에 공유적으로 결합된, 도 1 (서열번호 2), 도 8 (서열번호 4), 도 9 (서열번호 6) 또는 도 10 (서열번호 8)에 도시한 서열을 포함하는 아미노산 서열을 갖는네이쎄리아 메닝기티디스22 kDa 표면 단백질, 또는 그의 일부 또는 그의 유사체가 제공된다.
본 발명의 바람직한 측면에 따르면, 불용성 담체에 공유적으로 결합된, 도 1 (서열번호 2)에 도시한 서열을 포함하는 아미노산 서열을 갖는네이쎄리아 메닝기티디스22 kDa 표면 단백질, 또는 그의 일부 또는 그의 유사체가 제공된다.
본 발명의 또다른 측면에 따르면, 본 발명의네이쎄리아 메닝기티디스표면 단백질이네이쎄리아 메닝기티디스감염의 진단 및 특히 치료를 위한 특이적 항체를 생산하기 위한 면역원으로서 사용된다. 예를 들어 테스트 모델에서네이쎄리아메닝기티디스감염에 대해 수동적 방어작용을 나타낼 수 있는 특정 항체의 능력을 측정하므로써, 적절한 스크리닝 방법을 이용하여 적절한 항체를 결정할 수 있다. 동물 모델의 한 예는 본 발명의 실시예에 기재된 생쥐 모델이다. 항체는 전(whole) 항체 또는 그의 항원-결합 단편일 수 있으며, 일반적으로 면역글로불린 클래스중 어느 것에 속하여도 무방하다. 항체 또는 단편은 동물에서 유래된 것일 수 있으며, 특히 포유동물, 보다 구체적으로는 생쥐, 쥐 또는 인간에서 유래된 것일 수 있다. 천연 항체 또는 그의 단편일 수 있으며, 또는 필요하다면 제조합 항체 또는 항체 단편일 수 있다. 재조합 항체 또는 항체 단편은 분자생물학 기술을 이용하여 제조한 항체 또는 항체 단편을 의미한다. 항체 또는 항체 단편은 다중클론성, 또는 바람직하게는 단클론성의 것일 수 있다.네이쎄리아 메닝기티디스표면 단백질과 관련된 다수의 에피토프에 대해 특이적일 수 있지만, 바람직하게는 하나의 에페토프에 대해 특이성을 나타낸다. 바람직하게는 항체 또는 항체 단편은네이쎄리아 메닝기티디스22 kDa 표면 단백질과 관련된 하나 또는 그 이상의 에피토프에 대해 특이적이다. 또한 바람직한 것은 본 명세서에 기재한 단클론성 항체 Me-1 및 Me-7이다.
발명의 요약
본 발명은네이쎄리아 메닝기티디스생명체의 표면에 존재하는 고도로 보존되고 면역학적으로 접근할 수 있는 항원을 제공하므로써 상술한 문제점을 해결한다. 또한 본 발명은 상기 항원을 코딩하는 재조합 DNA 분자, 이 DNA 분자에 의해 형질전환된 단세포 숙주, 및 실제적으로 순수한 재조합 항원을 제조하는 방법을 제공한다. 또한 본 발명은 상기네이쎄리아 메닝기티디스항원에 대해 특이적인 항체를 제공한다. 본 발명의 항원과 항체는네이쎄리아 메닝기티디스질환의 검출, 예방 및 치료를 위한 독특한 방법 및 제약학적 조성물의 기초를 제공한다.
바람직한 항원은네이쎄리아 메닝기티디스22 kDa 표면 단백질, 그의 단편, 유사체 및 유도체이다. 바람직한 항체는네이쎄리아 메닝기티디스22 kDa 표면 단백질에 대해 특이적인 Me-1 및 Me-7 단클론성 항체이다. 이들 항체는네이쎄리아 메닝기티디스에 대해 강력한 용균 활성을 나타내며, 실험적 감염에 대하여 생쥐를 수동적으로 방어한다.
본 발명은 또한 신규네이쎄리아 메닝기티디스표면 항원 및 그에 대해 특이적인 항체를 분리하는 방법을 제공한다.
본 발명을 보다 잘 이해할 수 있게 하기 위하여, 하기 실시예들을 기재하였다. 이들 예는 설명을 위한 것일 뿐이며, 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 추정되어서는 안된다.
실시예 1은네이쎄리아 메닝기티디스외막 제제를 단백분해효소로 처리하고 이어서네이쎄리아 메닝기티디스22 kDa 표면 단백질을 동정하는 것을 설명한다.
실시예 2는네이쎄리아 메닝기티디스22 kDa 표면 단백질에 대해 특이적인 단클론성 항체의 제조방법을 설명한다.
실시예 3은네이쎄리아 메닝기티디스22 kDa 표면 단백질의 제조방법을 설명한다.
실시예 4는네이쎄리아 메닝기티디스22 kDa 표면 단백질을 발현하는 생명체를 학인하기 위해 DNA 탐침을 이용하는 것을 설명한다.
실시예 5는네이쎄리아 메닝기티디스감염으로부터 생쥐를 방어하기 위해 항-네이쎄리아 메닝기티디스22 kDa 표면 단백질 단클론성 항체를 사용하는 것을 설명한다.
실시예 6은네이쎄리아 메닝기티디스감염에 대한 방어적 반응을 유도하기 위해 정제된 재조합 22 kDa 표면 단백질을 이용하는 것을 설명한다.
실시예 7은 여러네이쎄리아 메닝기티디스균주 (MCH88 및 Z4063), 및 한 종의네이쎄리아 고노로에에 대한 단백질-코딩 유전자 및 22 kDa 단백질의 서열의 동정을 설명한다.
실시예 8은 22 kDa네이쎄리아 메닝기티디스표면 단백질에 대한 토끼 및 원숭이의 면역학적 반응을 설명한다.
실시예 9는 22 kDa네이쎄리아 메닝기티디스표면 단백질의 여러 상이한 면역학적 에피토프의 지도를 작성하는데 이용되는 절차를 설명한다.
실시예 10은 22 kDa 표면 단백질의 대규모 생산에 이용되는 발현 벡터를 열에 의해 유도되는 것을 설명한다.
실시예 11은 재조합 기술에 의해 생산된 22 kDa 표면 단백질의 정제공정을 설명한다.
실시예 12는 22 kDa 표면 단백질을 인간 백신으로서 사용하는 것을 설명한다.
실시예 1 : 네이쎄리아 메닝기티디스 외막 제제의 단백분해효소 처리 및 네이쎄리아 메닝기티디스 22 kDa 표면 단백질의 동정
네이쎄리아 메닝기티디스외막의 한외구조(ultrastructure)를 연구하기 위하여 전 세포 (whole cell), 염화리튬 추출액 또는 사르코실 추출액으로부터 얻은 여러 항원 제제를 사용하였다. 그램-음성균의 외막은 세포의 내부와 환경의 사이에서 계면으로 작용하며, 숙주 면역 방어계에 자유롭게 노출된 항원의 대부분을 함유한다. 본 연구의 주요 목적은네이쎄리아 메닝기티디스에 대한 방어적 반응을 유도할 수 있는 새로운 항원을 동정하는 것이다. 이러한 항원을 동정하기 위하여 본 발명자들에 의해 이용된 한가지 접근법은, 상술한 항원성 제제를 여러 단백분해효소로 부분분해하는 것이다. 효소 처리에 의해 얻어지게 되는 항원 결정인자는 이들 처리된 항원 제제의 면역학적 및 방어적 특성을 분석하는 것에 동정할 수 있다. 놀랍게도, 본 발명자들은네이쎄리아 메닝기티디스염화리튬 외막 추출액을 전기영동으로 분리한 후에도, 쿠마씨 브릴리안트 블루 R-250으로 염색되는 저분자량 밴드가 단백분해효소 처리에 의해서 파괴되지 않는다는 것을 관찰하였다. 쿠마씨 블루는 단백질과 펩티드를 염색하는데 이용되며, 외막의 주요 성분인 다당류 또는 지질에 대해매우 낮은 친화성을 나타내거나 전혀 나타내지 않는다. 이 저분자량 항원이 쿠마씨 블루에 의해 염색되었다는 사실은 이것의 적어도 일부는 단백분해효소에 의해 소화되지 않는 폴리펩티드로 이루어져 있거나, 또는 다른 표면 구조에 의해 효소의 작용으로퉈 보호된다는 것을 시사한다. 또한, 아래에서 입증되는 바와 같이, 매우 강력한 효소인 프로테이나제 K도 극심한 처리 이후에도 상기 저분자량 항원을 소화시키지 못하였다.
염화리튬 추출을 사용하여 본 발명자에 의해 이미 보고된 바 있는 방식으로 [Brodeur et al.,Infect. Immun., 50, p.510 (1985)] 여러 균종의네이쎄리아 메닝기티디스로부터 외막 제제를 얻었다. 막 분획에 맞게 적응시킨 로우리법 [Lowry et al.,J. Biol. Chem.193, p.265 (1951)]을 이용하여 이들 제제의 단백질 함량을 측정하였다.네이쎄리아 메닝기티디스608B (B:2a:P1.2) 주로부터 유도된 외막 제제를 37℃에서 24시간동안 연속적인 진탕조건하에, 소 췌장으로부터 분리한 알파 -키모트립신 (E.C. 3.4.21.1) (Sigma) 또는 소 췌장에서 분리한 트립신 1형 (E.C. 3.4.21.4) (Sigma)의 존재하에 처리하였다. 효소 농도를 처리하고자 하는 단백질 1 mg당 2 mg이 되도록 조정하였다. 또한트리티라키움 알붐림버에서 유래된 프로테이나제 K (Sigma 또는 Boehringer Mannheim, Laval, Canada) (E.C. 3.4.21.14)를 여러 가지 농도로 사용하여 동일한 외막 제제를 처리하였다. 프로테이나제 K에 의한 단백질 분해를 촉진하기 위하여, 여러 실험조건을 이용하였다. 진탕 조건하에 또는 진탕 없이 37℃ 또는 56℃에서 1시간, 2시간, 24시간 또는 48시간동안 시료를 보온하였다. 혼합물 시료의 pH를 pH 7.2 또는 pH 9.0으로 조정하였다. 1% (v/v)의소듐도데실설페이트(SDS)를 특정 시료에 첨가하였다. 처리 직후에, 제작자의 지시에 따라 14% (w/v) 겔 상에서 미니프로틴IIR(Bio-Rad, 캐나다 온타리오 미씨사우가) 시스템을 이용하여 SDS-PAGE 겔 전기영동을 실시하여 시료를 분리하였다. 단백질을 2-메르캅토에탄올 및 SDS를 이용하여 100℃에서 5분간 가열하고, 14% SDS 겔에서 분리한 후, 쿠마씨 브릴리안트 블루 R-250을 이용하여 염색하였다.
도 2는네이쎄리아 메닝기티디스균 608B (B:2a:P1.2)의 외막 제제를 α-키모트립신 및 트립신으로 37℃에서 24시간동안 처리한 후에, 분해물에 존재하는 단백질의 14% SDS-PAGE 겔에서의 이동 프로필을 보여준다. 미처리 대조군(도 2의 레인 2)과 비교할 때, 고분자량 단백질 및 여러 주요 외막 단백질이 심하게 단백분해 소화된 것이 관찰된다 (도 2의 레인 3 및 4). 반면에, 겉보기 분자량이 22 kDa인 단백질 밴드는 단백분해효소로 24시간동안 처리된 후에도 영향을 받지 않았다.
이 독특한 단백질에 대해, 프로테이나제 K를 이용하여 보다 공격적인 단백분해 처리를 하므로써 더 연구를 행하였다 (도 3). 프로테이나제 K는 낮은 펩티드 본드 특이성 및 광범위한 최적 pH 범위를 보여주기 때문에 가장 강력한 단백분해효소 중의 하나이다. 놀랍게도 22 kDa 단백질은 2 국제단위 (IU)의 프로테이나제 K를 이용하여 56℃에서 24시간동안 처리한 후에도 내성을 나타내었다 (도 3의 레인 2). 이러한 처리조건은 본 발명자들의 실험실에서 단백질을 거의 포함하지 않는 DNA 나 리포당당류를 생산할 때 종종 쓰이는 것이다. 정말, 외막 제제에 대해 이러한 공격적인 단백분해 처리를 행한 후에도 소량의 폴레펩티드가 보였을 뿐이다. 또한, 48시간에 이르는 보다 긴 시간동안 처리한 후에도, 또는 더 많은 양의 효소 (24 IU 까지 이용)를 사용하였을 때에도 22 kDa 단백질의 양은 변화하지 않았다. 22 kDa 단백질의 SDS-PAGE에서 결정한 이동성 및 양은 반응 혼합물의 pH를 9.0으로 증가시키거나, 또는 강력한 단백질 변성제인 1.0% SDS를 사용하였을 때에도 영향을 받지 않았다 (도 3의 레인 4, 6 및 8). 이들 두가지의 변성 조건을 함께 이용하면 보통 외막 제제중에 존재하는 단백질이 완전하게 분해되어 아미노산 잔기만이 남게 된다. 분해물 중에 종종 저분자량의 폴레펩티드가 관찰되기도 하며, 이는 효소처리 도중에 효과적인 분해작용을 받지 못한 민감성 단백질의 단편인 것으로 추측된다. 이들 단편은 대대분 외막에 존재하는 탄수화물 및 지질에 의해 분해작용으로부터 보호될 수 있다. 처리된 시료 중에 존재하는 28 kDa 및 34 kDa의 겉보기 분자량을 갖는 밴드는 각각 모든 시험용 효소 제제에 존재하는 잔류 효소 및 오염 단백질이다.
흥미롭게도, 22 kDa 단백질이 단백분해효소에 대해 내성을 나타내는 것에 대한 이 연구는 겉보기 분자량이 18 kDa인 다른 단백질 밴드도 효소 분해에 대해 내성을 나타내는 것 같다는 것을 보여준다 (도 3a). 이 18 kDa 단백질 밴드에 대한 실마리는 친화성 크로마토그래피로 정제한 재조합 22 kDa 단백질의 SDS-PAGE 이동 프로필을 분석하므로써 얻을 수 있었다 (도 3b). 이 18 kDa 밴드는, 시료를 겔에 적용하기 전에 세정제 SDS를 포함하는 시료 완충액 중에서 상기 친화성-정제 재조합 22 kDa 단백질을 연장기간동안 가열하였을 때에만 나타났다. 에드만 분해를 이용한 N-말단 아미노산 분석 (실시예 3)에 의해, 18 kDa 밴드에서 동정된 아미노산잔기 (E-G-A-S-G-F-Y-V-Q)가 아미노산 1-9 (서열번호 1)에 해당한다는 것을 명백하게 보여준다. 이런 결과는 SDS-PAGE에서 보여지는 18 및 22 kDa 밴드가 사실은 동일한 단백질로부터 유래된 것이라는 것을 나타내는 것이다. 이 마지막 결과는 또한 성숙 18 kDa 단백질로부터 리더(leader) 서열이 절단된다는 것을 보여준다. 겉보기 밀도가 변화되는 이런 현상을 설명하는 분자 변형을 확인하고, 이것이 단백질의 항원 특성 및 방어 특성에 미치는 충격을 평가하기 위하여 추가의 연구를 행하였다.
결론적으로, 단백분해효소에 의한 소화작용에 대해 내성을 갖는 매우 희귀한 특성을 갖는네이쎄리아 메닝기티디스외막 단백질의 발견은 이의 분자적 특성 및 면역학적 특성을 더 연구할 것을 보장한다. 실시예 3에서 에세리키아 콜리에 의해 생산된 정제 재조합 22 kDa 표면 단백질은 또한 프로테이나제 K 분해에 대해 고도로 내성을 나타낸다. 본 발명자들은네이쎄리아 메닝기티디스22 kDa 표면 단백질이 단백분해효소에 대해 이런 흔하지 않은 내성을 갖게된 메카니즘을 이해하고자 노력하고 있다.
실시예 2 : 네이쎄리아 메닝기티디스 22 kDa 표면 단백질에 대해 특이성을 나타내는 단클론성 항체의 생산
여기에서 설명하고 있는 단클로성 항체는 세가지의 독립적인 융합 실험으로부터 얻은 것이다. 각각 혈청그룹 A, B 및 C로 구분되는네이쎄리아 메닝기티디스604A, 608B 및 2241C주로부터 얻은 외막 제제를 이용하여 자성 Balb/c 생쥐 (Charles River Laboratories, 캐나다 퀘벡 성-콘스탄트)를 면역화하였다. 이들 외막 제제를 얻기 위해, 본 발명자에 의해 이미 보고된 바 있는 방식으로 [Brodeur et al.,Infect. Immun., 50, p.510 (1985)] 염화리튬 추출법을 적용하였다. 막 분획에 맞게 적응시킨 로우리법 [Lowry et al.,J. Biol. Chem.193, p.265 (1951)]을 이용하여 이들 제제의 단백질 함량을 측정하였다. 상술한 외막 제제를 여러 가지로 조합한 것 10 mg을 이용하여 생쥐 그룹에게 3주 간격으로 2회 복강내 또는 피하 투여하였다. 생쥐 그룹에 따라, 면역화에 따라 이용된 보조제는 프로인트 완전 또는 불완전 보조제 (Gibco Laboratories, 뉴욕 그랜드 아일랜드), 또는 Qui1A (CedarLane Laboratories, 캐나다 온타리오 혼비)이었다. 융합 절차를 실시하기 3일 전에, 면역화 생쥐에게 상술한 외막 제제중 하나를 10 mg의 양으로 정맥내 경로를 통해 최종 주사하였다. 목적하는 단클론성 항체를 분비하는 하이브리도마 세포주를 생산하기 위해 사용된 융합 프로토콜은 발명자에 의해 기술된 바 있다 [Hamel et al.,J. Med. Microbiol., 25, p. 2434 (1987)]. 이미 보고된 바 있는 [Martin et al.,J. Clin. Microbiol., 28, p. 1720 (1990)] ELISA법을 이용하여 단클론성 항체 Me-1, Me-2, Me-3, Me-5, Me-6 및 Me-7의 클래스, 서브클래스 및 경쇄 타입을 결정하고 표 1에 나타내었다.
본 발명자들에 의해 보고된 바 있는 방법 [Martin et al.,Eur. J. Immuno.18, p. 601 (1988)]에 따라 웨스턴 면역블롯팅을 이용하여 단클론성 항체의 특이성을 확립하였다. 이때 다음과 같은 변형을 가하였다. 서로 다른 종의네이쎄리아 메닝기티디스로부터 얻은 외막 제제를 14% SDS-PAGE 겔에서 분리하였다. 세미-드라이 장치 (Bio-Rad)를 이용하여 단백질을 겔에서부터 니트로셀룰로스 막으로 옮겼다.25 mM 트리스-HCl, 192 mM 글리신 및 20% (v/v) 메탄올을 함유하고 pH 8.3인 전기블롯 완충액 내에서 10분간 겔 (6 × 10 ㎝)당 60 mA의 전류를 통하였다. 웨스턴 면역블롯팅 실험은 단클론성 항체 Me-1, Me-2, Me-3, Me-5, Me-6 및 Me-7이네이쎄리아 메닝기티디스22 kDa 단백질에 존재하는 그들의 대응 특이적 에피토프를 인식한다는 것을 명백하게 보여준다 (도 4A). SDS-PAGE 겔 및 대응하는 웨스턴 면역블롯의 분석은 본 발명의 단백질의 겉보기 분자량이 종에 따라 변화하지 않는다는 것을 보여준다. 그러나 외막 제제에 존재하는 단백질의 양은 종마다 상이하였으며, 균종의 혈청그룹과는 관계가 없는 것으로 나타났다. 또한 단클론성 항체들은 외막 제제를 단백질 1mg당 2 IU의 프로테이나제 K로 처리하였을 때에도 (상기 실시예 1에서와 같이 처리)네이쎄리아 메닝기티디스22 kDa 표면 단백질에 존재하는 에피토프를 인식하였다. 흥미롭게도 효소 분해후에도 에피트포가 그대로 존재한다는 것은 막 제제에서 항체에 접근할 수 있을 때에조차도 효소 처리에 의해 파괴되지 않는다는 것을 확인하는 것이다. 후자의 결과는 관찰된 프로테이나제 K 내성을 설명하는 메카니즘이 아마도 효소가 단백질에 접근하는 것을 막는 표면 구조와 관련되어 있지 않거나, 또는 단백질이 막속에 깊숙히 파묻혀있는 것에 의해 보호받는 것은 아니라는 것을 시사한다. 도 4에는 나타내지 않았지만, Me-1에 대한 면역블롯의 결과는 다른 다섯가지의 단클론성 항체의 결과와 일치한다.
네이쎄리아 메닝기티디스22 kDa 표면 단백질을 부분적으로 특성화하고 다른 공지의 수막염균혈증균의 표면 단백질과 구분하기 위하여 일련의 실험을 행하였다. 외막 제제를 2-메르캅토에탄올의 존재 또는 부재하에 전기영동 시료 완충액에서100℃에서 5분간 또는 37℃ 및 56℃에서 30분간 가열하였을 때에도,네이쎄리아 메닝기티디스22 kDa 표면 단백질의 SDS-PAGE 겔 겉보기 분자량은 변화하지 않았다. 이는 외막에 존재할 때 22 kDa 표면 단백질의 이동이 열이나 2-메르캅토에탄올에 의해 변화되지 않는다는 것을 나타내는 것이다.
단클론성 항체가네이쎄리아 메닝기티디스생명체로부터 분리된 외막 제제에 존재하는 탄수화물 에피토프와 반응하지를 결정하기 위해 과요오드산소듐 산화법을 이용하였다. 이 실험을 행하기 위해 사용된 방법은 본 발명자들에 의해 보고된 바 있다 [Martin et al.,Infect. Immun., 60, pp. 2718-2725 (1992)]. 외막제제를 실온에서 100 mM 과요오드산나트륨으로 1시간동안 처리하였을 때에도네이쎄리아 메닝기티디스22 kDa 표면 단백질에 대한 단클론성 항체의 반응성은 변화되지 않았다. 이 처리는 통상적으로 탄수화물에 대해 특이적인 항체의 결합능을 제거한다.
단클론성 항체 2-1-CA2 (워싱턴 디씨에 소재하는 리드 아미 인스터튜트 오브 리서치에 근무하는 A. Bhattacharjee 박사로부터 제공받음)는 모든 병원성네이쎄리아속 균종에 공통적으로 존재하는 표면 항원인 lip 단백질 (또한 H.8로도 불린다)에 대해 특이성을 나타낸다. 외막 제제에 대한 이 단클론성 항체의 반응성을 단클론성 항체 Me-5의 반응성과 비교하였다. lip-특이적 단클론성 항체는 겉보기 분자량이 30 kDa인 단백질 밴드와 반응한 반면, 단클론성 항체 Me-5는 22 kDa의 단백질 밴드와 반응을 하였다. 이 결과는네이쎄리아 메닝기티디스22 kDa 표면 단백질과, 또다른 고도로 보존된 외막 단백질인 lip 단백질 사이에 아무런 관계가 없음을 명백하게 보여주는 것이다.
본래의네이쎄리아 메닝기티디스세균 세포의 표면에 22 kDa 단백질이 노출되어 있음을 확인하기 위하여, 본 발명자에 의해 이미 보고된 바 있는 방법 [Proulx et al., Infect. Immun., 59, p. 963 (1991)]에 따라 방사면역분석법을 행하였다. 이 분석에 6시간 배양액 및 18시간 배양액을 이용하였다. 여섯종의 단클론성 항체를 9종의네이쎄리아 메닝기티디스균주 (도 5에서 각 균주의 혈청그룹을 괄호안에 표시하였다), 2종의네이쎄리아 고노로에균주 ("NG"), 2종의모락셀라 카타르할리스균주 ("MC") 및 2종의네이쎄리아 락타미카균주 ("NL")와 반응시켰다. 방사면역분석법은 단클론성 항체에 의해 인식되는 에피토프가 여러 다른 혈청그룹과 혈청타입을 갖는 본래의네이쎄리아 메닝기티디스분리균의 표면에 노출되어 있으며, 단백분해효소에 의해서도 접근될 수 있다는 것을 입증한다 (도 5). 단클론성 항체는 테스트에 제공된 모든네이쎄리아 메닝기티디스균주의 표면에 있는 표적 에피토프에 강력하게 반응하였다. 얻어진 결합값 (3,000 CPM 내지 35,000 CPM)은 균종과 세균의 생리학적 상태에 따라 상이하게 나타났다. 각 세균 균종에 대한 음성 대조군으로는헤모필루스 인플루엔자포린-특이성 단클론성 항체를 사용하였다. 500 CPM 미만의 계수가 얻어졌는데 각 결합값으로부터 이 값을 뺐다. 이 분석법에서 테스트에 제공된네이쎄리아 메닝기티디스와 관련하여, 단클론성 항체 Me-5 및 Me-7에 대해 도 5에 도시한 결과는 단클론성 항체 Me-1, Me-2, Me-3 및 Me-6에 대해 얻어진 결과를 대표한다. 시험에 제공된 다른 세균에 관해서는, Me-7에 대해 나타낸 결합 활성은 동일한 세균 균종에 의해 인식되는 다른 단클론성 항체에 대해 얻어진 결합 활성을 대표한다.
단클론성 항체에 의해 인식되는 에피토프의 항원 보전성도 평가하였다. 다수의 세균 균종에 대한 단클론성 항체를 신속하게 스크리닝하기 위하여 도트 효소 면역분석법을 이용하였다. 이 방법은 본 발명자들에 의해 이미 보고된 바 있는 방법에 따라 실시하였다 [Lussier et al.,J. Immunoassay, 10, p. 373 (1989)]. 71종의네이쎄리아 메닝기티디스를 이 분석에서 이용하였다. 시료는 19종의 혈청 그룹 A, 23종의 혈청 그룹 B, 13종의 혈청 그룹 C, 1종의 혈청 그룹 29E, 6종의 혈청 그룹 W-135, 1종의 혈청 그룹 X, 2종의 혈청 그룹 Y, 2종의 혈청 그룹 Z, 및 4종의 혈청그룹을 특정하지 않은 분리균 ("NS")을 포함한다. 이들 분리균은 다음 기관 : Caribbean Epidemiology Centre (Port of Spain, Trinidad); Children's Hospital of Easter Ontario (Ottawa, Canada); Department of Saskatchewan Health (Regina, Canada); Laboratoire de Sante Publique du Quebec (Montreal, Canada); Max-Planck Institut fur Molekulare Genetik (Berlin, FRG); Montreal Children Hospital (Montreal, Canada); Victoria Genreal Hospital (Halifax, Canada); 및 본 발명자들 자신의 보존균주로부터 얻었다. 다음의 세균들에 대해서도 역시 테스트를 행하였다:네이쎄리아 고노로에16종, 네이쎄리아 시네레 (Neisseria cinerea) 4종, 네이쎄리아 락타미카 5종, 네이쎄리아 플라바1종, 네이쎄리아 플라베센스1종, 네이쎄리아 무코사 3종, 네이쎄리아 퍼를라바/시카 (Neisseria perflava/sicca) 4종, 네이쎄리아 퍼를라바 4종, 네이쎄리아 시카1종, 네이쎄리아 서브플라바1종, 모락셀라 카타르할리스 5종, 알칼리레네스 피칼리스(ATCC 8750) 1종,시트로박터 프로인디이 (Citrobacter freundii)(ATCC 2080) 1종,에드바르시엘라 타르다(Edwarsiella tarda)(ATCC 15947) 1종,엔테로박터 클로아카(ATCC 23355) 1종,엔테로박터 아에로게네스(ATCC 13048) 1종,에세리키아 콜리1종,플라보박테리움 오도라툼1종,헤모필루스 인플루엔자b형 (이간(Eagan) 균주) 1종,클레브시엘라 뉴모니에(ATCC 13883) 1종,프로테우스 래트게리(ATCC 25932) 1종,프로테우스 불가리스(ATCC 13315) 1종,슈도모나스 아에루기노사(ATCC 9027) 1종,살모넬라 티피무리움(ATCC 14028) 1종,세라티 마르세센스(ATCC 8100) 1종,쉬겔라 플렉스네리(ATCC 12022) 1종,쉬겔라 손네이(ATCC 9290) 1종. 이들은 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션 또는 캐나다 오타와에 소재하는 Laboratory Centre for Disease Control에 보존된 것으로부터 입수하였다. 대부분의 관련성 있는네이쎄리아균에 대한 단클론성 항체의 반응성을 표 1에 나타내었다. 단클론성 항체 Me-7은 테스트에 제공된 71종의 모든 (100%)네이쎄리아 메닝기티디스균의 특이적 에피토프를 인식하였다. Me-2, Me-3, Me-5 및 Me-6 뿐만 아니라 상기 단클론성 항체도네이쎄리아속의 다른 균종에 대해 반응성을 나타내었는데, 이는 이들의 특이적 에페토프가 다른 밀접하게 관련된네이쎄리아속 균에 의해서도 발현된다는 것을 보여준다. 1종의네이쎄리아 락타미카균종과의 거짓 반응을 제외하고, 단클론성 항체 Me-1은네이쎄리아 메닝기티디스분리균과만 반응을 하였다. Me-1은 또한 177종의네이쎄리아 메닝기티디스분리균과도 반응시험을 했는데 테스트에 재공된 모든네이쎄리아 메닝기티디스균주중 99% 이상을 정확하게 확인할 수 있었다. 표 1에 나타낸네이쎄리아 메닝기티디스균주 이외에는, 단클론성 항체는 상술한 다른 세균종과는 전혀 반응을 하지 않았다.
결론적으로,네이쎄리아 메닝기티디스를 22 kDa 표면 단백질과 특이적으로 반응하는 6종의 단클론성 항체는 본 발명자에 의해 처음으로 제공되는 것이다. 이들 단클론성 항체를 이용하여, 본 발명자들은 그들의 특이적 에피토프가 (1)네이쎄리아 메닝기티디스의 외막에 존재하는 프로테이나제 K 저항성 22 kDa 단백질에 존재하며, (2)네이쎄리아 메닝기티디스분리균 중에서는 보존되어 있고, (3) 본래의네이쎄리아 메닝기티디스세포의 표면에 노출되어 있어 항체가 접근할 수 있으며, (4)네이쎄리아 메닝기티디스22 kDa 표면 단백질에 대한 이들 단클론성 항체의 반응성은 과요오드산나트륨 처리에 의해 변화되지 않는데 이는 그들의 특이적 에피토프가 탄수화물에 존재하지 않는다는 것을 시사한다.
본 발명자들은네이쎄리아 메닝기티디스22 kDa 단백질을 엄격한 조건하에서 가열하면 겉보기 분자량이 약 18 kDa로 옮겨가는 것을 발견하였지만, 2-메르캅토에탄올 처리에 의해서는 이러한 이동상의 변화가 변화되지 않는 것을 관찰하였다.
본 발명자들은 또한네이쎄리아 메닝기티디스22 kDa 표면 단백질이,네이쎄리아 메닝기티디스외막에 존재하는 또다른 저분자량의 고도로 보존된 단백질인 lip 단백질과 비교하여 항원성에 있어 유사하지 않다는 것을 입증하였다.
실시예 3에서는,네이쎄리아 메닝기티디스22 kDa 표면 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 플라스미드 벡터 pNP2202를 이용하여에세리키아 콜리BL21 (DE3)을 형질전환시킨 후 생산한 정제된 재조합 22 kDa 표면 단백질과도 상기 단클론성 항체가 반응한다는 것을 설명한다.
네이쎄리아분리균과 단클론성 항체와의 반응성
단클론성 항체에 의해 인식되는네이쎄리아분리균의 수
명칭 이소타입 네이쎄리아 메닝기티디스의 혈청그룹 모락셀라카타르할리스(5) 네이쎄리아 고노로에(26) 네이쎄리아 락타미카(5)
A(19) B(23) C(13) 29E(1) W135(6) X(1) Y(2) Z(2) NS*(4) 총(71)
Me-1 IgG2a(k) 19 22 13 1 6 1 2 2 3 69 0 0 1
Me-2 IgG2a(k) 19 20 13 1 6 0 2 2 4 67 0 2 0
Me-3 IgG3(k) 19 22 13 1 6 1 2 2 3 69 0 2 4
Me-5 IgG2a(k) 19 22 13 1 6 1 2 2 3 69 0 2 0
Me-6 IgG1(k) 19 23 13 1 6 1 2 2 3 70 0 2 4
Me-7 IgG2a(k) 19 23 13 1 6 1 2 2 4 71 5 2 4
* 분리균에 대해 혈청그룹을 결정하지 않았다.
실시예 3 : 네이쎄리아 메닝기티디스 22 kDa 표면 단백질의 분자 클로닝, 유전자의 서열분석, 고수율 발현 및 정제
A. 분자 클로닝
제작자의 권고 (Promega Co., Madison, WI)에 따라네이쎄리아 메닝기티디스608B (B:2a:P1.2)로부터 람다 GEM-11 게놈 DNA 라이브러리를 구축하였다. 간단하게 설명하자면, 608B 균주의 게놈 DNA를 Sau 3AI으로 부분 소화시키고, 9 내지 23 kB 사이의 단편을 아가로스 겔상에서 정제한 후 람다GEM-11 암(arm)의 Bam HI 부위에 연결시켰다. 얻어진 재조합 파지를 이용하여에세리키아 콜리LE392 (Promega)를 감염시킨 후 LB 한천 플레이트에 도말하였다. 후술하는 프로토콜을 이용하여, 실시예 2의네이쎄리아 메닝기티디스22 kDa 표면 단백질-특이적 단클론성 항체와 라이브러리를 면역-스크리닝한 후 19개의 양성 플라크를 확인하였다. 플레이트를 -20℃에서 15분간 보온하여 한천의 정상부분을 경화시켰다. 플레이트의 표면에 니트로셀룰로스 필터를 부드럽게 놓고 4℃에서 30분간 놓아두어 재조합 바이러스 클론에 의해 생산된 단백질을 흡착하도록 한다. 이어 필터를 PBS-Tween 0.2% (v/v)로 세척하고, 이미 보고된 방법 [Lussier et al.,J. Immunoassay,10, p. 373 (1989)]에 따라 면역블롯팅을 행하였다. 증폭 및 DNA 정제과정 이후에, 13Kb 삽입물을 갖고 클론 8로 명명된 하나의 바이러스 클론을 선택하여 서브클로닝 실험에 이용하였다. 이 클론을 Sac I으로 소화시킨 후 5kb 및 8kb의 두 단편을 얻었다. 이들 단편을 아가로스 겔 상에서 정제한 후, 저 복제수 플라스미드 pWKS30 [Wang and Kushner, Gene, 100, p. 195(1991)]의 Sac I 제한 부위에 연결시켰다. 일렉트로포레이션 (Bio-Rad, Mississauga, Ont., Canada)를 이용하여 제작자의 권고에 따라 상기 재조합 플라스미드로에세리키아 콜리JM109 (Promega)를 형질전환시키고, 얻어진 콜로니에 대해 실시예 2의네이쎄리아 메닝기티디스22 kDa 표면 단백질-특이적 단클론성 항체 생산을 스크리닝하였다. 8 kb 삽입물을 함유하는 플라스미드로 형질전환시켰을때에만 양성을 보인 콜로니가 발견되었다. 양성 콜로니에 대한 웨스턴 블롯 분석 (방법은 실시예 2에 기재되어 있다)은에세리키아 콜리에 의해 발현되는 단백질이 완전한 것이고, SDS-PAGE 겔에서네이쎄리아 메닝기티디스22 kDa 표면 단백질과 동일하게 이동하는 것을 보여준다. 삽입물의 크기를 더 축소시키기 위하여, 8 kb 단편을 함유하는 클론을 Cla I으로 소화시키고, 2.75 kb 단편을 pWKS30의 Cla I 부위에 연결시켰다. 얻어진 클론의 웨스턴 블롯 분석은 또다시에세리키아 콜리에의해 발현되는 단백질이 완전한 것이고, SDS-PAGE 겔에서네이쎄리아 메닝기티디스22 kDa 표면 단백질과 동일하게 이동하는 것을 보여주었다.
제한분석을 행하였을 때, pNP2202 및 pNP2203으로 명명된 두 개의 클론이 방향이 서로 반대되게 2.75 kb 삽입물을 갖고 있는 것으로 밝혀졌으며, 이들을 선택하여네이쎄리아 메닝기티디스22 kDa 표면 단백질을 코딩하는 유전자의 성열을 분석하는데 사용하였다. 시판되는 (Pharmacia Biotech Inc., Piscataway, NJ) "이중 표준 네스트 결실 키트 (Double Stranded Nested Deletion Kit)"를 제작자의 지시에 따라 이용하여 두 클론으로부터 일련의 네스팅된 결실을 발생시켰다. 제작자의 권고에 따라 Applied Biosystems Inc. (Foster City, CA) 자동화 시퀀서 모델 373A를 이용하여 "Taq Dye Deoxy Terminator Cycle Sequencing Kit"를 갖고 pWKS30 벡터에 존재하는 M13 퍼워드 프라이머로부터 상기에서 얻어진 절단 삽입물의 서열을 분석하였다.
B. 서열분석
삽입물의 서열을 양쪽 방향으로 모두 분석한 결과, 누클레오티드 서열은 525 누클레오티드 (중지 코돈 포함)고 이루어진 오픈 리딩 프레임을 나타내었는데, 이는 예측 분자량이 18,000 달톤이고 pI가 9.93인 174개 아미노산 잔기로 이루어진 단백질을 코딩한다. 누클레오티드 및 아미노산 서열을 도 1에 나타내었다 (서열번호 1; 서열번호 2).
클로닝된 유전자가 올바르게 발현된 것을 확이하기 위하여,네이쎄리아 메닝기티디스균주 608B로부터 유도된 천연의 22 kDa 표면 단백질의 N-말단 아미노산서열을 분석하여 누클레오티드 시퀀싱 데이터로부터 유도된 아미노산 사열과 비교하였다.네이쎄리아 메닝기티디스균주 608B로부터 유래된 외막 제제를 14% SDS-PAGE 겔에서 전기영동한 후, 이미 알려진 방법 [Sambrook et al.,Molecular Cloning; a Laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)]에 따라 폴리비닐리딘 디플루오라이드 막 (Millipore Porducts, Bedford MA)에 옮겼다. 겔에서 22 kDa 단백질 밴드를 절취하여, 제작자의 권고에 따라 Applied Biosystems Inc. (Foster City, CA) 모델 473A를 이용하여 에드만 분해를 시켰다. 아미노산 서열 E-G-A-S-G-F-Y-V-Q-A는 오픈 리딩 프레임의 아미노산 1-10 (서열번호 2)에 해당되는데, 이는네이쎄리아 메닝기티디스균주 608B 22 kDa 표면 단백질이 19 아미노산 리더 펩티드 (서열번호 2의 아미노산 잔기 -19 내지 -1)를 갖는 것을 나타낸다.
기존의 확립된 데이터베이스를 조사한 결과,네이쎄리아 메닝기티디스균주 608B 22 kDa 표면 단백질 (서열번호 2) 또는 그의 유전자 (서열번호 1)가 기존에 전혀 기술된 바 없다는 것이 확인되었다.
C. 재조합 네이쎄리아 메닝기티디스 22 kDa 표면 단백질의 고수율 발현 및 정제
재조합네이쎄리아 메닝기티디스22 kDa 표면 단백질을에세리키아 콜리에서 최고의 수율로 생산하고 정제하기 위해 다음의 공정을 개발하였다. 이 공정은 플라스미드 pNP2202를 갖는에세리키아 콜리BL21(DE3) [Studer and Moffat,J. Mol. Biol., 189, p. 113 (1986)]에 의해 생산된 재조합 22 kDa 표면 단백질이 외막에서 다량으로 발견되지만, 상기 단백질을 단백질 중에서 가장 풍부한 양으로 포함하고있는 배양 상층액에서도 얻을 수 있다고 하는 관찰에 근거를 두고 있다. 따라서, 친화성 크로마토그래피를 이용하여 재조합 22 kDa 표면 단백질을 정제하기 위한 재료로서 배양 상층액을 이용하였다 (도 6A).
친화성 크로마토그래피의 매트릭스를 만들기 위하여, 제작자의 권고에 준하여 단클론성 항체 Me-2, Me-3 및 Me-5 (실시예 2에서 설명)를 CNBr-활성화 세파로스 4B (Pharmacia Biotech Inc., Piscataway, NJ)에 고정화시켰다.
배양 상층액을 얻기 위하여, 플라스미드 pNP2202를 갖는에세리키아 콜리BL21(DE3)의 1일밤 배양액을 25 mg/㎖ 암피실린 (Sigma)을 함유하는 LB 브로쓰 (Gibco Laboratories, Grand Island, N.Y.)에 접종하고 교반하에 37℃에서 4시간동안 보온하였다. 4℃, 10,000 × g에서 10분간 2회 원심분리하여 배양배지로부터 세균세포를 제거하였다. 배양 상층액을 0.22 mm 막 (Millipore, Bedfords, MA)에 통과시켜 여과한 후, 한계 분자량이 10,000 달톤인 한외여과막 (Amicon Co., Beverly, MA)을 이용하여 대략 100배 농축시켰다. 막 소포(小胞)를 완전히 가용화시키기 위하여, 농축 배양 상층액에 엠피겐 BB (Calbiochem Co., LaJolla, CA)를 최종 농도 1% (v/v)로 첨가하였다. 상층액을 실온에서 1시간동안 보온하고, 0.05% 엠피겐 BB (v/v)를 함유하는 10 mM 트리스-HCl 완충액 (pH 7.3) 수 ㎖에 대해 밤새 투석을 행하고, 4℃, 10,000 × g에서 20분간 원심분리를 행하였다. 항원 제제를 친화성 매트릭스에 가하고, 일정한 교반조건 하에 4℃에서 밤새 보온하였다. 겔 슬러리를 크로마토그래피 칼럼에 쏟아붓고 0.05% 엠피겐 BB (v/v)를 함유하는 10 mM 트리스-HCl 완충액 (pH 7.3)을 이용하여 강하게 세척하였다. 10 mM 트리스-HCl 완충액 (pH 7.3)에 용해시킨 1 M LiCl을 이용하여 재조합 22 kDa 단백질을 칼럼으로부터 용출시켰다. 용출 단백질을 함유하는 용액을 0.05% 엠피겐 BB (v/v)를 함유하는 10 mM 트리스-HCl 완충액 (pH 7.3) 수 ㎖에 대해 강하게 투석을 행하였다. 쿠마씨 블루 및 은 염색된 SDS-PAGE 겔 (Tsai and Frasch,Analytical Biochem., 119, pp. 19 (1982)]을 이용하여 각 정제 단계에서의 재조합 22 kDa 표면 단백질의 순도를 평가하고, 각각의 결과를 도 6A에 도시하였다. 겔의 은 염색에 의하면, 정제공정이 매우 소량의에세리키아 콜리리포다당류만을 포함하는 상당히 잘 정제된 재조합 22 kDa 단백질을 만들어낸다는 것이 명백하게 입증된다.
정제된 재조합 22 kDa 표면 단백질이 단백분해효소에 의한 절단에 대해 저항성을 나타내는 것을 입증하였으며, 그 결과를 도 6B에 도시하였다. 일정한 진탕조건 하에, 단백질 1 mg당 2 mg의 알파-키모트립신 및 트립신, 또는 2 IU의 프로테이나제 K를 이용하여 실시예 1에서처럼 정제된 재조합 22 kDa 표면 단백질를 처리하였다. 이들 처리가 끝난 후 어느 것에서도 단백질의 양이 감소되지 않았다. 비교를 위하여 실시한 소 혈청 알부민 (BSA, Sigma)에 대한 실험에서는, 선정된 효소에 따라 부분 또는 완전 분해작용이 관찰되었다. 덧붙여, 처리 기간을 길게 하더라도 단백질에는 아무런 변화도 일어나지 않았다. 이런 후자의 결과는 형질전환된에세리키아 콜리세포가 완전한 재조합 22 kDa 표면 단백질을 발현시킬 수 있으며, 이 단백질은 또한네이쎄리아 메닝기티디스에서 발견되는 천연의 단백질과 마찬가지로 상기 세가지의 단백분해 효소의 작용에 대해 매우 강한 내성을 나타냄을 입증한다. 또한, 에세리키아 콜리의 외막에 파묻혀 있지 않는 정제된 재조합 22 kDa 표면 단백질도 단백분해 효소의 작용에 대해 매우 강한 내성을 나타낸다.
본 발명자들은 재조합 22 kDa 단백질의 항원성에 미치는 효소처리의 영향을 확인하였다. ELISA 및 웨스턴 면역블롯팅에 의해 결정된 바에 따르면, 실시예 2에 기술된 단클론성 항체는 상기에 기재한 방법에 따라 정제된 재조합 22 kDa 표면 단백질을 쉽게 인식한다 (도 6C). 또한, 정제된 재조합 22 kDa 표면 단백질에 대해 기타 다른 22 kDa 단백질-특이적 단클론성 항체가 나타내는 반응성과 마찬가지로단클론성 항체 Me-5의 반응성도 효소 처리에 의해 변화하지 않았는데, 이는 재조합 22 kDa 단백질의 항원성이 천연 단백질에 대해 설명한 특성과 유사하다는 것을 확인해주는 것이다.
실시예 3에서 중요한 데이터가 주어졌으며 이는 다음과 같이 요약될 수 있다:
(1)네이쎄리아 메닝기티디스22 kDa 표면 단백질의 완전한 누클레오티드 및 아미노산 서열이 얻어졌다 (서열번호 1; 서열번호 2);
(2) 천연 단백질의 N-말단 서열분석은네이쎄리아 메닝기티디스22 kDa 유전자가 정말로 클로닝되었다는 것을 확인해주었다;
(3) 이 단백질은 이전에는 보고된 바 없다;
(4)에세리키아 콜리와 같은 숙주를 형질전환시켜서 재조합네이쎄리아 메닝기티디스22 kDa 표면 단백질을 고수율로 발현시킬 수 있다;
(5) 기타 다른네이쎄리아 메닝기티디스분자를 함유하지 않고 또에세리키아 콜리에 의해 생산되는 성분을 거의 함유하지 않는 재조합 단백질을 얻을 수 있다;
(6) 정제된 재조합 22 kDa 표면 단백질은 알파-키모트립신, 트립신 및 프로테이나제 K와 같은 단백분해 효소의 작용에 대해 강력한 내성을 유지한다; 및
(7) 재조합 22 kDa 단백질의 항원성은 천연의네이쎄리아 메닝기티디스22 kDa 표면 단백질에 대해 설명된 바 있는 항원성에 버금간다.
실시예 4. 네이쎄리아 메닝기티디스 22 kDa 표면 단백질을 코딩하는 유전자의 분자 보존
네이쎄리아 메닝기티디스22 kDa 표면 단백질을 코딩하는 유전자가 여러네이쎄리아분리균에 있어서 분자 보존되어 있음을 확인하기 위하여, DNA 도트 블롯 하이브리드화 분석법을 이용하여 여러 상이한네이쎄리아균종 및 기타 다른 세균종을 테스트하였다. 먼저네이쎄리아 메닝기티디스22 kDa 표면 단백질을 코딩하는 525 염기쌍의 유전자를 PCR에 의해 증폭하고, 아가로스 겔에서 정제한 후, 제작자의 지시에 따라 비-방사성 DIG DNA 표지화 및 검출 시스템 (Boehringer Mannheim, Laval, Canada)을 이용하여 랜덤 프라이밍법에 의해 표지화하였다.
제작자 (Boehringer Mannheim)의 지시에 따라 DNA 도트 블롯 분석법을 행하였다. 간단하게 설명하면, 테스트하고자 하는 세균을 양 전하를 띈 나일론 막 (Boehringer Mannheim)에 도팅하고, 건조시킨 후 콜로니 리프트를 위한 DIG 시스템 사용자 안내에 따라 처리하였다. 50% 포름알데히드 (Sigma)를 함유하는 용액을 이용하여 42℃에서 예비-하이브리드화 및 하이브리드화를 실시하였다. 예비-하이브리드화 용액은 DNA 탐침의 비특이적 하이브리드화를 차단하기 위하여 부가적인 차단제로서 100 mg/㎖의 변성화 청어 정자 DNA(Boehringer Mannheim)를 더 함유한다. DIG 시스템 사용자 안내에 설명된대로 화학발광성 발광물질 PPD 기질을 이용하여 엄격한 세척 및 검출단계를 수행하였다.
시험에 제공된 71종의네이쎄리아 메닝기티디스균에 대해, 단클론성 항체 Me-7와 525 염기쌍의 DNA 탐침을 이용하여 얻은 결과는 완전하게 일치하는 것이었다. 이 결과에 따르면, 시험에 제공된 모든네이쎄리아 메닝기티디스균주들은네이쎄리아 메닝기티디스22 kDa 표면 단백질을 갖고 있었으며, 이들 모두 단클론성 항체에 의해 인식되었으므로 상기 단백질을 발현한다는 것이 입증되었는데, 이는 이 단백질이네이쎄리아 메닝기티디스분리균에서는 고도로 보존된 것이라는 것을 확인해주는 것이다 (표 2).
DNA 탐침은 또한 시험에 제공된 모든네이쎄리아 고노로에균종에 있어서도네이쎄리아 메닝기티디스22 kDa 표면 단백질을 코딩하는 유전자를 검출해내었다.
반면에, 단클론성 항체 Me-7은 16종의네이쎄리아 고노로에균주 중에서 2개와만 반응하였는데, 이는네이쎄리아 고노로에균주에 있어서는 특이적 에피토프가 어떤 이유로 존재하지 않거나, 접근할 수 없거나 또는 변형되어 있음을 시사하거나, 또는 대부분의네이쎄리아 고노로에균주가 게놈안에는 코딩 서열을 갖고 있음에도 불구하고 그 단백질을 발현하지 않는다는 것을 시사하는 것이다 (표 2).
한 종의네이쎄리아 락타미카균종에서만 단백질을 발현시키지는 않으면서 유전자를 갖고 있다는 것이 밝혀졌기 때문에, 상술한 두가지 검출 방법 사이에 좋은 상호관계가 있다는 것이 발견되었다 (표 2). 이 결과는 또한 바로 위 패러그래프에 제시한 것과 같은 이유로 설명될 수 있다.
이는 22 kDa이 발현되지 않거나, 또는네이쎄리아 고노로에균주의 표면에서 접근이 허용되지는 않지만, 그럼에도 불구하고네이쎄리아 고노로에및네이쎄리아 락타미카균의 22 kDa 단백질-코딩 서열을 22 kDa 표면 단백질 또는 그의 유사체를 생산하는데 사용하기 위한 재조합 플라스미드의 제작에 이용될 수 있음을 나타내는 것이다. 이들 모든 단백질 또는 유사체를네이쎄리아감염의 예방, 검출 또는 진단에 사용할 수 있다. 보다 구체적으로는 이런 감염은네이쎄리아 메닝기티디스, 네이쎄리아 고노로에및네이쎄리아 락타미카균에 의한 감염으로부터 선택된 것일 수 있다. 따라서, 22 kDa 단백질 또는 유사체는 이러한 감염의 검출 또는 진단을 위한 키트의 제작에 이용될 수 있다.
모락셀라 카타르할리스균으로부터 얻어진 결과는 시험에 제공된 5종의 균주중 3종만이 단클론성 항체 Me-7과 반응하였을 뿐, 어느 것도 DNA 탐침과는 반응하지 않았는데, 이는 이들 균주의 게놈에는네이쎄리아 메닝기티디스22 kDa 표면 단백질을 코딩하는 유전자가 존재하지 않는다는 것을 나타내는 것이다 (표 2).
기타 다른 세균 및 여러 다른네이쎄리아속 균종을 시험하였지만 (하기 표 2의 주석 참조), 이들 중 어느 것도 두가지 테스트 방법중 어느 것에 의해서도 양성을 나타내지 않았다. 이 후자의 결과는 22 kDa 표면 단백질의 유전자가 밀접하게 관련된네이쎄리아균종에서만 공유되어 있음을 의미하는 것처럼 보인다.
네이쎄리아균(시험에 제공된 균의 수) 하기 항체에 의해 동정된 균주의 수
단클론성 항체 Me-7 DNA 탐침
네이쎄리아 메닝기티디스(71) 71 71
네이쎄리아 카타할리스(5) 3 0
네이쎄리아 고노로에(16) 2 16
네이쎄리아 락타미카(5) 4 5
다음에 나타낸네이쎄리아균종 및 기타 다른 세균들이 두가지 분석법에 의해 시험되었지만 모두 음성 결과를 나타내었다 :네이쎄리아 플라바1종, 네이쎄리아 플라베센스1종, 네이쎄리아 무코사 2종, 네이쎄리아 퍼를라바/시카 (Neisseria perflava/sicca) 4종, 네이쎄리아 퍼를라바 1종, 네이쎄리아 시카1종, 네이쎄리아 서브플라바1종, 알칼리게네스 피칼리스(ATCC 8750) 1종,보르드텔라 퍼투씨스(9340) 1종,보르드텔라 브론치셉티카1종,시트로박터 프로인디이(ATCC 2080) 1종,에드바르시엘라 타르다(ATCC 15947) 1종,엔테로박터 클로아카(ATCC 23355) 1종,엔테로박터 아에로게네스(ATCC 13048) 1종,에세리키아 콜리1종,플라보박테리움 오도라툼1종,헤모필루스 인플루엔자b형 (Eagan 주) 1종,클레브시엘라 뉴모니에(ATCC 13883) 1종,프로테우스 래트게리(ATCC 25932) 1종,프로테우스 불가리스(ATCC 13315) 1종,슈도모나스 아에루기노사(ATCC 9027) 1종,살모넬라 티피무리움(ATCC 14028) 1종,세라티 마르세센스(ATCC 8100) 1종,쉬겔라 플렉스네리(ATCC 12022) 1종,쉬겔라 손네이(ATCC 9290) 1종 및산토모나스 말토필라1종.
결론적으로, DNA 하이브리드화 분석은네이쎄리아 메닝기티디스22 kDa 표면 단백질을 코딩하는 유전자가 병원성네이쎄리아균주에서 고도로 보존되어 있음을 명백하게 드러낸다. 또한, 얻어진 이 결과는 DNA 탐침이 임상학적 표본에서 병원성네이쎄리아균을 신속하고 직접적으로 검출하기 위한 가치있는 수단이 될 수 있음을 명백하게 보여준다. 이 탐침은네이쎄리아 메닝기티디스및네이쎄리아 고노로에를 분별하기 위하여 이용될 수도 있다.
실시예 5. 단클론성 항체의 용균(bscteriolytic) 및 방어 작용
정제된네이쎄리아 메닝기티디스22 kDa 표면 단백질-특이적 단클론성 항체의 용균활성을 공지의 방법 [Brodeur et al.,Infect. Immun., 50, p. 510 (1985);Martin et al.,Infect. Immun., 60, p. 2718 (1992)]에 따라 시험관내에서 평가하였다. 기니 픽 혈청 보체의 존재하에서, 정제된 단클론성 항체 Me-1 및 Me-7은네이쎄리아 메닝기티디스608B 균을 효과적으로 죽였다. 비교적 낮은 농도의 이들 단클론성 항체 각각은 생균수를 50% 이상 감소시켰다. 고농도의 정제된 단클론성 항체 Me-1 및 Me-7은 다수의 세균 콜로니 형성 단위를 급격히 (99% 이하) 감소시겼다. 중요한 것은, 이들 단클론성 항체의 용균 활성이 보체에 의존적이라는 것인데, 기니 픽 혈청을 56℃에서 30분간 가열하여 불활성화시키면 사멸활성이 완전히 사라진다는 것이다. 다른 단클론성 항체들은 동일한 균에 대해 유의적인 용균 활성을 나타내지 않았다. 여러 실험의 대표적인 결과를 도 7에 도시하였는데, Me-7에 대한 결과가 대표성을 띄며 Me-1에 대해 얻어진 결과와 일치한다. Me-2에 대한 결과가 대표성을 띄며 다른 단클론성 항체 Me-3, Me-5 및 Me-6에 대한 결과와 일치한다.
본 발명자중 한 명에 의해 이미 보고된 바 있는 [Brodeur et al.,Infect. Immun., 50, p. 510 (1985); Brodeur et al.,Can. J. Microbiol., 32, p. 33 (1986)] 감염의 생쥐 모델을 이용하여 각 단클론성 항체의 방어 활성을 평가하였다. 간단하게 설명하면, 세균의 공격에 노출시키기 18시간전에, 각 단클론성 항체를 포함하는 무균액 600 ㎖를 Balb/c 생쥐에게 복강내 주사하였다. 1000 콜로니 형성 단위의네이쎄리아 메닝기티디스608B, 4% 뮤신 (Sigma) 및 1.6% 헤모글로빈 (Sigma)을 함유하는 1 ㎖의 현탁액을 쥐에게 주사하였다. 여러 실험의 결과를 취합하여 표 3에 나타내었다. 용균성 단클론성 항체 Me-1 및 Me-7만이 실험실적네이쎄리아 메닝기티디스감염에 대해 방어작용을 나타냈다는 것에 유의하는 것이 중요하다. 실제로 세균에 감염시키기 전에 이들 두 종류의 단클론성 항체를 함유하는 복수(腹水)를 주사하면, 600 ㎖의 Sp2/0 유도 복수 또는 비관련 단클론성 항체를 함유하는 복수 600 ㎖를 투여받은 대조군에서 관찰되는 9%와 비교하여 Balb/c 생주의 생존율을 70% 이상으로 현저하게 증가시켰다. 또한 세균 감염 18시간전에, 단백질 A-정제된 Me-7 400㎍을 미리 주사해주면 80%의 생쥐가 살아남는다. 50%의 생쥐를 방어하기 위해 필요한 최소 항체 농도를 결정하기 위한 실험이 현재 행해지고 있다. 다른네이쎄리아 메닝기티디스22 kDa 표면 단백질-특이적 단클론성 항체에 대해서는 20 내지 40%의 보다 낮은 생존율이 관찰되었다.
네이쎄리아 메닝기티디스608B (B:2a:P1.2)에 대한 22 kDa 표면 단백질-특이적 단클론성 항체의 면역방어력의 평가
단클론성 항체 감염후 생존한 생쥐의 수 생존율 (%)
24시간 72시간
Me-1 29/30 23/30 76
Me-2 17/20 3/20 25
Me-3 5/10 2/10 20
Me-5 11/20 8/20 40
Me-7 10/10 7/10 70
정제된 Me-7 13/15 12/15 80
대조군 31/100 9/100 9
결론적으로, 이 결과들은네이쎄리아 메닝기티디스22 kDa 표면 단백질에 특이적인 항체가 실험적 치사 감염으로부터 생쥐를 효과적으로 방어할 수 있다는 것을 명백하게 보여준다. 항원에 의한 방어적 항체의 유도는 가능성 있는 후보에 대해 추가적인 연구를 행하는 것을 정당화할 수 있는 가장 중요한 기준의 하나이다.
실시예 6. 정제된 재조합 22 kDa 표면 단백질에 의한 면역화는 그 이후의 세균 감염으로부터 방어를 제공한다
실시예 3에서 제시한 바 있는 프로토콜에 따라 정제된 재조합 22 kDa 표면 단백질을 준비하고, Balb/c 생쥐를 면역화하여 치사량의네이쎄리아 메닝기티디스608B (B:2a:P1.2)에 의한 감염으로부터 효과적인 방어작용을 나타내는 지를 결정하였다. 이들 실험에 사용된 백신 제제에 있어서, 정제된 재조합 단백질과 천연의 수막염균혈증균 단백질과의 사이에 아무런 차이가 없다는 것을 확인하기 위하여, 천연 수막염균혈증균 단백질 대신에 정제된 재조합 단백질을 사용하였다. 이 실험에 사용되었던 생쥐 감염 모델은 본 발명자중 한 명에 의해 이미 보고된 바 있다 [Brodeur et al.,Infec. Immun., 50, P. 510 (1985); Brodeur et al.,Can. J. Microbiol., 32, p. 33 (1986)]. 정제된 재조합 22 kDa 표면 단백질을 생쥐 1마리당 10 ㎍ 또는 20 ㎍의 양으로 함유하는 항원 제제 100㎖를 3주 간격으로 3회 피하 주사하였다. 매 주사당 25㎍의 농도로 QuilA을 보조제로 사용하였다. 대조군의 생쥐에게는 실시예 3에 기술된대로 제조한 수막염균혈증균 단백질을 코딩하는 삽입 유전자를 갖지 않는 플라스미드 pWKS30을 보유하는에세리키아 콜리BL21(DE3)주의 농축 배양 상층액 20㎍, 또는 생리식염수, 그리고 10 또는 20 ㎍의 BSA를 투여하였다. 각 주사 전에 각 생쥐로부터 혈청 시료를 얻어 재조합 단백질에 대항한 면역 반응의 발달을 분석하였다. 세 번째 면역화를 행하고 2주후에, 모든 그룹의 생쥐에게 4% 뮤신 (Sigma) 및 1.6% 헤모글로빈 (Sigma)에 용해시킨 1000 콜로니 형성 단위의네이쎄리아 메닝기티디스608B를 함유하는 현탁액 1 ㎖를 복강내 투여하였다.
이들 실험의 결과를 표 4에 나타내었다. 정제된 재조합 22 kDa 표면 단백질에 의해 면역화된 생쥐의 80%가 생존하였는데, 대조군에서는 0 내지 42%가 살아남았다. 중요한 것은 농축된에세리키아 콜리배양 상층액을 투여받은 대조군의 생쥐는 세균 감염으로부터 보호받지 못하였다. 이 결과는 배양배지에 존재하는 성분 및 정제후에도 소량 존재할 수 있는에세리키아 콜리항원은네이쎄리아 메닝기티디스에 대항한 방어작용에 기여하지 못한다는 것을 보여주는 것이다.
정제된 재조합 22 kDa 표면 단백질에 의한 면역화는 그 이후의네이쎄리아 메닝기티디스608B (B:2a:P1.2) 감염에 대항하여 방어작용을 제공한다.
실험 그룹 감염후 생존한 생쥐의 수 생존율 (%)
24시간 48시간 72시간
1 정제된 22 kDa 단백질 10㎍ 20/20 16/20 80
BSA 10㎍ 17/19 8/19 42
2 정제된 22 kDa 단백질 20㎍ 9/10 8/10 8/10 80
농축이.콜리상층액 20㎍ 7/20 5/10 2/10 20
BSA 20㎍ 6/10 4/10 2/10 20
인산염 완충된 식염수 8/10 0/10 0/10 0
결론
정제된 재조합 22 kDa 표면 단백질을 투여하면 치사량의네이쎄리아 메닝기티디스감염에 대항하여 면역화된 생쥐를 현저한 효과로 방어한다.
본 발명에 따른 항체로는 생쥐 하이브리도마 세포주가 생산한 단클론성 항체 Me-1 및 Me-7을 예시할 수 있는데, 이들은 매릴랜드 록빌에 소재하는 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션에 1995년 7월 21일자로 기탁되었으며, 각각 HB 11959 (Me-1) 및 HB 11958 (Me-7)의 수탁번호를 부여받았다.
실시예 7. 그외 다른 네이쎄리아 메닝기티디스 및 네이쎄리아 고노로에 균주의 서열 분석
실시예 3에 기술된 방법대로, 그외 다른네이쎄리아 메닝기티디스및네이쎄리아 고노로에균주의 게놈 DNA로부터 22 kDa 표면 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 2.75 kb의 claI 소화된 DNA 단편을 분리하였다.
a) MCH88 주 : MCH88 (임상학적 분리균)의 누클레오티드 서열을 도 8에 나타내었다 (서열번호 3). 608B 주로부터 얻어진 실험적 증거 (실시예 3)로부터, 아미노산 -19 내지 -1에 대응하는 리더 서열이 추정되었다 (M-K-K-A-L-A-A-L-I-A-L-A-L-P-A-A-A-L-A). 기존의 데이터베이스를 이용한 조사로부터,네이쎄리아 메닝기티디스MCH 188에서 유래된 22 kDa 표면 단백질 (서열번호 4) 또는 그의 유전자 (서열번호 3)가 한번도 보고된 적이 없다는 것을 확인하였다.
b) Z4063 주 : Z4063 [Wang J.F. et al.,Infect. Immun., 60, p.5267 (1992)]의 누클레오티드 서열을 도 9에 나타내었다 (서열번호 5). 608B 주로부터 얻어진 실험적 증거 (실시예 3)로부터, 아미노산 -19 내지 -1에 대응하는 리더 서열이 추정되었다 (M-K-K-A-L-A-T-L-I-A-L-A-L-P-A-A-A-L-A). 기존의 데이터베이스를 이용한 조사로부터,네이쎄리아 메닝기티디스Z4063에서 유래된 22 kDa 표면 단백질 (서열번호 6) 또는 그의 유전자 (서열번호 5)가 한번도 보고된 적이 없다는 것을 확인하였다.
c)네이쎄리아 고노로에b2 주 :네이쎄리아 고노로에b2 주 (혈청타입 1, Nat. Ref. Center for Neisseria, LCDC, Ottawa, Canada)의 누클레오티드 서열을도 10에 나타내었다 (서열번호 3). 608B 주로부터 얻어진 실험적 증거 (실시예 3)로부터, 아미노산 -19 내지 -1에 대응하는 리더 서열이 추정되었다 (M-K-K-A-L-A-A-L-I-A-L-A-L-P-A-A-A-L-A). 기존의 데이터베이스를 이용한 조사로부터,네이쎄리아 고노로에b2 주에서 유래된 22 kDa 표면 단백질 (서열번호 8) 또는 그의 유전자 (서열번호 7)가 한번도 보고된 적이 없다는 것을 확인하였다.
도 11은 시험에 제공되었던 4종의 균주 모두의 DNA 서열로부터 확립된 컨센서스 서열을 보여준다. MCH88 주는 누클레오티드 217에 하나의 코돈 (TCA)이 삽입된 것을 보여주었지만, 일반적으로 4종의 균주는 놀라울 정도의 상동성을 나타내었다.
도 12는 4종의 균주로부터 얻어진, 유도된 아미노산 서열간의 상동성을 보여준다. 4종의 균주 모두 간에 90% 이상의 동일성이 나타났다.
실시예 8. 22 kDa 네이쎄리아 메닝기티디스 표면 단백질에 대한 토끼 및 원숭이의 면역학적 반응
생쥐 이외의 다른 종에서의 항체 반응을 평가하기 위하여 토끼와 원숭이를 재조합 22 kDa 단백질로 면역화하였다.
a) 토끼
플라스미드 pN2202 또는 대조 플라스미드 pWKS30를 갖는 이. 콜리 JM109주로부터 얻은 외막 제제를 이용하여 웅성 뉴질랜드 토끼를 면역화하였다 (균주와 플라스미드는 실시예 3에 기재되어 있다). 이들 외막 제제를 얻기 위해 사용된 염화리튬 추출법은 본 발명자에 의해 이미 보고된 바 있는 방식으로 [Brodeur et al.,Infect. Immun., 50, p.510 (1985)] 수행하였다. 막 분획에 맞게 적응시킨 로우리법 [Lowry et al.,J. Biol. Chem.193, p.265 (1951)]을 이용하여 이들 제제의 단백질 함량을 측정하였다. 상술한 외막 제제중 하나를 150㎍의 양으로 3주 간격으로 토끼의 여러 부위에 2회 피하 및 근육내 주사하였다. 이들 면역화에는 20%(v/v)의 최종농도로 QuilA (CedarLane Laboratories, Hornby, Ont., Canada)을 보조제로 사용하였다.네이쎄리아 메닝기티디스608B (B:2a:P1.2)로부터 추출로부터 추출한 외막 제제를 코팅 항원을 이용하는 ELISA에 의해, 그리고 이미 발명자에 의해 보고된 바 있는 방법 [Brodeur et al.,Infect. Immun.50, 510 (1985); Martin et al.,Eur. J. Immunol.18, 601 (1988)]에 따른 웨스턴 면역블롯팅에 의해 특이적 체액성 반응의 발달을 분석하였다. 이들 분석법에는 알칼리성 포스파타제 또는 퍼옥시다제-표지화 당나귀 항-토끼 면역글로불린 (Jackson ImmunoResearch Laboratories, West Grove, PA)을 이용하였다.
QuilA 보조제와 함께 22 kDa 재조합 단백질을 함유하는이. 콜리외막 제제를 투여하면 ELISA에 의해 결정된 1/32,000의 강력한 특이적 체액성 반응을 유도한다 (도 13). 재조합 22 kDa 단백질의 주사후에 유도된 항체는 정제된 재조합 22 kDa 단백질과 반응하지만, 보다 중요한 것은네이쎄리아 메닝기티디스의 외막에서 발현되고, 폴딩되며 막 속에 파묻혀있는 천연의 단백질도 인식한다는 것이다. 웨스턴 면역블롯팅 실험은 2차 주사후에 존재하는 항체가 니트로셀룰로스 막에 존재하며 22 kDa 단백질에 대해 특이적인 Mab Me-2 (실시예 2에 기재)에 의해 표시되는것과 동일한 단백질 밴드를 인식한다는 것을 명백하게 보여준다.
a) 원숭이
매 주사당 친화성 크로마토그래피로 정제된 재조합 22 kDa 단백질을 100 ㎍ (K28) 및 200 ㎍ (I276)을 이용하여 두 마리의마카카 라시쿨라리스(시노몰구스)원숭이를 면역화하였다.이. 콜리BL21De3으로부터 단백질을 생산 및 정제하기 위해 사용된 방법은 실시예 3에 기재되어 있다. 최종 농도 20% (v/v)의 알히드로겔 (CedarLane Laboratories, Hornby, Ont., Canada)을 보조제로 사용하였다. 원숭이에게 3주 간격으로 2회 근육내 투여를 행하였다. 동일한 방법에 따라 비관련 재조합 단백질 제제를 이용하여 대조 원숭이 (K65)를 면역화하였다. 혈청을 상술한 방법대로 분석하였다. 이들 분석법에는 알칼리성 포스파타제 또는 퍼옥시다제-표지화 염소 항-인간 면역글로불린 (Jackson ImmunoResearch Laboratories, West Grove, PA)을 이용하였다.
매 주사당 100 ㎍의 정제 단백질을 이용하여 면역화한 원숭이 K28의 특이적 항체 반응은 200 ㎍의 단백질을 투여받은 원숭이 I276에서 발견되는 것보다 빠르고 강력하게 나타났다 (도 4). 웨스턴 면역블롯팅에 의해 검출되는 천연 22 kDa 단백질에 대해 특이적인 항체가 1회 주사가 있고 21일 후에 면역화 원숭이의 혈청에 이미 존재하고 있었지만, 대조 항원을 2회 주사한 후의 대조 원숭이의 혈청에는 존재하지 않았다.
결론
실시예 2 및 실시예 5에 나타낸 데이터는 재조합 22 kDa 단백질의 투여에 의해 생쥐에게서네이쎄리아 메닝기티디스균주에 대한 방어적 체액성 반응을 유발할 수 있다는 것으르 명백하게 보여준다. 보다 중요한 것은, 이 실시예에 나타낸 결과는 이 면역학적 반응이 오직 한 종에만 국한된 것이 아니라, 이 재조합 표면 단백질이 토끼나 원숭이와 같은 다른 면역 시스템도 자극할 수 있다는 것이다.
실시예 9. 22 kDa 네이쎄리아 메닝기티디스 단백질의 에피토프의 지도작성
본 발명자중 한 명에 의해 보고된 방법 [Martin et al., Infect. Immun (1991): 59: 1457-1464]을 이용하여네이쎄리아 메닝기티디스22 kDa 표면 단백질의 에피토프의 지도를 작성하였다. 선형 에피토프의 동정은 균주 608B (도 15) 및 이 단백질에 의해 면역화한 후에 얻은 고면역성 혈청으로부터 유래된네이쎄리아 메닝기티디스22 kDa 단백질 서열 전체를 포함하는 18개의 중복 합성 펩티드를 이용하여 수행하였다. 22 kDa 단백질의 면역우세 부위를 동정하는 것은 새로운 효과적인 백신을 설계하는데 도움이 될 수 있다. 또한, 이들 B-세포 에피토프를 집중시키므로써네이쎄리아 메닝기티디스외막에 있는 단백질의 구조에 관한 유용한 정보를 제공받을 수 있다.
모든 펩티드는 Applied Biosystems (Foster City, Calif.)의 자동화 펩티드 합성장치를 이용하여 BioChem Immunosystmes Inc. (Montreal, Canada)에 의해 합성되었다. 합성 펩티드는 역상 고압 액체 크로마토그래피에 의해 정제되었다. 펩티드 CS-845, CS-847, CS-848, CS-851, CS-852 및 CS-856 (도 15)은 소량의 6M 구아니딘-HCl (K.T.Baker, Ontario, Canada) 또는 디메틸 설폭시드 (J.T. Baker)에용해시켰다. 이들 펩티드를 증류수를 이용하여 1 mg/㎖로 조정하였다. 다른 모든 펩티드는 증류수에 자유롭게 용해되는데, 1 mg/㎖로 조정하였다.
합성 펩티드를 50 mM 탄산염 완충액 (pH 9.6)에 50 ㎍/㎖로 용해시키고 미세적정 플레이트 (Immulon 4, Danatech Laboratories Inc., Chantilly, VA)에 코팅하므로써 펩티드 효소-연결 면역흡착 분석법 (ELISA)를 수행하였다. 실온에서 밤새 보온한 후, 플레이트를 0.05% (w/v) Tween 20 (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO)를 함유하는 인산염-완충 식염수 (PBS)로 세척한 후, 0.5% (w/v) 소혈청 알부민(Sigma)을 함유하는 PBS를 이용하여 차단하였다. 친화성 크로마토그래피로 정제한 재조합 22 kDa 표면 단백질을 이용하여 면역화한 원숭이 및 생쥐로부터 얻은 혈청을 희석하고, 매 웰당 100 ㎕의 각 희석액을 ELISA 플레이트에 넣은 후 37℃에서 1시간동안 보온하였다. 플레이트를 3회 세척하고, 제작자의 권고에 따라 희석된 알칼리성 포스파타제-접합된 염소 항-생쥐 또는 항-인간 면역글로불린 (Jackson ImmunoResearch Laboratories, West Gorve, PA)을 첨가하였다. 37℃에서 1시간동안 보온한 후, p-니트로-페닐포스페이트 (Sigma)를 1 mg/㎖로 함유하는 디에탄올아민 (10% (v/v), pH 9.8) 100㎕을 첨가하였다. 60분후, 마이크로플레이트 판독기를 이용하는 분광측정기를 이용하여 반응 (λ=410㎚)을 판독하였다.
친화성 크로마토그래피로 정제한 재조합 22 kDa 단백질 (실시예 8)로 면역화한 후에 얻은 생쥐 및 원숭이 항혈청을 18개의 중복 합성 펩티드와 함께 성공적으로 사용하여 단백질 상의 B-세포 에피토프를 집중시켰다. 이들 에피토프는 단백질 상의 세 개의 항원 도메인내에 클러스터(cluster)를 형성하고 있었다.
첫 번째 영역은 아미노산 잔기 51과 86 상이에 위치하고 있었다. 여러 알고리즘을 이용한 컴퓨터 분석은, 이 영역이 친수성이고 또한 표면에 노출되어 있기 때문에 면역학적으로 가장 중요할 수 있는 가능성이 가장 높다는 것을 시사하였다. 또한, 도 12에 도시한 4개의 단백질 서열간의 비교결과는 73 위치에 하나의 아미노산 잔기가 삽입되어 있는 주요 변화중의 하나가 또한 이 영역에 위치하고 있다는 것을 보여준다.
항 혈청은 아미노산 잔기 110과 140 사이에 위치한 두 번째의 항원 도메인을 확인해주었다. 흥미롭게도, 서열분석에 의해 4개의 단백질 서열중에서는 보존되지 않는 14개의 아미노산 잔기중 7개의 아미노산이 이 영역내에 클러스터를 형성하고 있는 것이 밝혀졌다.
단백질의 고도로 보존된 영역, 즉 아미노산 잔기 31과 55의 사이에 위치한 세 번째 항원 도메인은 원숭이 혈청에 의해서만 인식되었다.
실시예 10. 22 kDa 표면 단백질의 대규모 생산을 위한 열-유도성 발현
네이쎄리아 메닝기티디스22 kDa 표면 단백질을 코딩하는 유전자를 플라스미드 p629 [Geroge et al., Bio/technology 5: 600-603 (1987)]에 삽입하였다. 기능성 Pr 프로모터가 결실된 박테리오파지 λ cI857 온도 민감성 리프레서 유전자의 카세트는 22 kDa 표면 단백질의 합성을 조절하기 위해 PL 프로모터를 이용하는 플라스미드 p629가 보유하고 있다. 온도를 30℃에서 38℃ 이상의 온도로 옮겨서 cI857을 불활성화시키면 플라스미드에 의해 코딩되는 단백질이 생산되게 된다. 온도 변이에 의해 이.콜리 세포내에서 유전자 발현을 유도시키는 것은, 이러한 기술이 현대적인 발효조에 의해 쉽게 달성될 수 있기 때문에 대규모 발효에 적합하다. 그외 다른 유도성 발현 벡터는 목적 유전자의 발현을 유도시키기 위하여 발효 배지에 락토스 또는 이소프로필티오-β-D-갈락토시드 (IPTG)와 같은 특정 분자를 첨가하는 것이 필요하다.
다음의 두 올리고뉴클레오티드 프라이머
OCRR8 : 5'- TAATAGATCTATGAAAAAAGCACTTGCCAC-3' (서열번호 27) ; 및
OCRR9 : 5'-CACGCCAGTTTAAGACTTCTAGATTA -3' (서열번호 28)을 이용히여네이쎄리아 메닝기티디스608B 게놈 DNA로부터 PCR을 이용하여 540 누클레오티드 단편을 증폭시켰다. 이들 프라이머들은 22 kDa 유전자의 양 말단에서 발견되는 누클레오티드 서열에 해당된다. PCR 산물의 클로닝을 단순화하기 위하여, 이들 프라이머의 누클레오티드 서열에 Bgl II (AGATCT) 제한 부위를 삽입하였다. PCR 산물을 Bgl II로 소화시키기 전에 아가로스 겔상에서 정제하였다. 대략 525 염기쌍의 이 Bgl II 단편을 플라스미드 p629의 Bgl II 및 Bam HI 부위에 삽입하였다. pNP2204로 명명된, 이 PCR 산물 삽입물을 함유하는 플라스미드를 사용하여 이.콜리 DH5αF'IQ를 형질전환시켰다. 플라스미드 pNP2204의 부분 지도를 도 16에 도시하였다. 실시예 2에 기술된네이쎄리아 메닝기티디스22 kDa 표면 단백질-특이적 단클론성 항체를 이용하여, 상기에서 얻은 콜로니를 스크리닝하였다. 얻어진 클론의 웨스턴 블롯 분석은 이. 콜리에 의해 합성된 단백질이 완전한 것이며, 천연의네이쎄리아 메닝기티디스22 kDa 표면 단백질처럼 SDS-PAGE상에서 이동한다는 것을 명백하게 보여준다. 선택된 클론으로부터 플라스미드 DNA를 정제한 후 시퀀싱을 행하였다. 플라스미드에 존재하는 삽입물의 누클레오티드 서열은 도 1에 제시한네이쎄리아 메닝기티디스22 kDa 표면 단백질을 코딩하는 유전자의 누클레오티드 서열과 완전하게 일치된다.
22 kDa 표면 단백질의 합성 수준을 연구하기 위하여, 온도-유도성 플라스미드 pNP2204를 사용하여 다음의 이.콜리 균주들: W3110, JM105, BL21, TOPP1, TOPP2 및 TOPP3을 형질전환시켰다. 22 kDa 표면 단백질의 합성 수준, 그리고 여러 세포 분획중에 단백질이 집중되는 것을 각 균주에 대해 측정하였다. LB 브로쓰 (Gibco Laboratories, Grand Island, N.Y.)를 이용한 진탕 플라스크 배양은 온도를 30℃에서 39℃로 이전시키므로써 유전자의 발현을 효과적으로 유도할 수 있다는 것을 보여준다. 합성 수준을 시간경과에 따라 평가한 결과는 SDS-PAGE 겔상에서 결정한 바에 따르면, 유도후 30분이 지나자마자부터 단백질이 나타나기 시작하여 유도 기간중이 꾸준하게 단백질 양이 증가된다.이. 콜리W3110 및 TOPP1 균주에 대해서는 1리터당 8 내지 10 mg의 22 kDa 단백질이 발현되었다. 이들 두 균주에 있어서는, 22 kDa 단백질중 대부분이 세균 외막에 들어있었다.
실시예 11. 네이쎄리아 메닝기티디스 22 kDa 표면 단백질의 정제
대부분의 22 kDa 단백질이이.콜리의 외막에 파묻혀 있기 때문에, 이 실시예에서 제시하는 정제 프로토콜은 다량의 단백질이 배양 상층액으로 방출되는 실시예3에서 기술한 바 있는 방법과 다르다. 플라스미드 pNP2204를 보유하는이.콜리W3110 또는 TOPP1중 하나를 30℃에서 보온시킨, 1일동안 밤새 배양한 배양액을 50 ㎍/㎖의 암피실린 (Sigma)을 함유하는 LB 브로쓰에 접종한 후, 세포밀도가 0.6 (λ= 600㎚)이 될 때까지 교반하에 (250 rpm) 30℃에서 증식시켰다. 세포밀도가 상기 값에 도달한 시점에서 보온 온도를 3-5시간동안 39℃로 상승시켜 단백질의 생산을 유도하였다. 4℃, 8,000 × g에서 15분간 원심분리하여 세균 세포를 수확하고, 인산염 완충 식염수 (PBS, pH 7.3)로 2회 세척하였다. 세균 세포를 초음파 처리에 의해 파괴하였다 (프렌치 프레스를 이용하여 기계적으로 붕괴시키거나 또는 볼을 이용하여 붕괴시키는 기술도 사용할 수 있다). 붕괴되지 않은 세포는 5,000 × g에서 5분간 원심분리하여 분리하고 제거하였다. 10℃, 100,000 × g에서 1시간동안 원심분리하여 세포질 성분으로부터 외막을 분리해내었다. 막-함유 펠릿을 소량의 PBS, pH 7.3에 재현탁시켰다. 막으로부터 22 kDa 표면 단백질이 녹아나오도록 하기 위하여 엠피겐 BB (Calbiochem Co., LaJolla, CA), Zwittergent-3,14 (Calbiochem Co.) 또는 β-옥틸글루코시드 (Sigma)와 같은 세정제를 이용하였다. 세정제는 외막 분획에 최종 농도 3%로 첨가하였으며, 혼합물을 20℃에서 1시간동안 보온하였다. 10℃, 100,000 × g에서 1시간동안 원심분리하여 비가용성 물질을 제거하였다.
이들 세정제중 어느 것에 의해서도 22 kDa 단백질을 효과적으로 가용화할 수 있지만, β-옥틸글루코시드가 여러 원하지 않는 막 단백질을 가용화시키지 않아 이들을 원심분리에 의해 상층액으로부터 분리시킬 수 있음으로 인해 쉽게 제거할 수 있는 장점을 갖는다. 세정제를 제거하기 위해서, 22 kDa을 함유하는 상층액을 여러차례 PBS 완충액으로 광범위하게 투석시켰다. 22 kDa 표면 단백질 제제로부터 원하지 않는 단백질을 더 제거하기 위하여 프로테이나제 K 처리 (실시예 1에 기재된 것처럼)를 이용할 수 있다. 황산암모늄 또는 유기 용매를 이용하는 차별 침전화법 또는 한회여과법은, 겔 여과 및 이온-교환 크로마토그래피를 실시하기 전에 단백질로부터 원하지 않는 핵산과 리포다당류를 제거하기 위해 사용될 수 있는 두가지의 부가적인 단계로서, 정제된 22 kDa 단백질을 얻기 위해 효과적으로 이용될 수 있다. 실시예 3에 기재된 것과 같은 친화성 크로마토그래피도 22 kDa 단백질을 정제하기 위해 사용될 수 있다.
실시예 12. 22 kDa 표면 단백질의 인간 백신으로서 사용
인간에 사용하기 위한 백신을 제제화하기 위해, 본 명세서에 기재된 폴리펩티드로부터 적절한 22 kDa 표면 단백질 항원을 선택할 수 있다. 예를 들어, 당업자는 22 kDa 폴리펩티드 또는 면역원성 에피토프를 함유하는 그의 단편을 갖는 백신을 설계할 수 있다. 실질적으로 순수한 재조합 항원을 제조하는데 분자생물학 기술을 이용하는 것이 특히 적합하다.
백신 조성물은 여러 다양한 형태를 가질 수 있다. 예를 들어, 이들에는 분제, 액체 또는 현탁액 및 리포좀과 같은 고상, 반고상 및 액상 형태가 포함된다. 본 발명의 22 kDa 표면 단백질 항원이 인간에게 투여되었을 때 방어적 면역 반응을 유발할 수 있다고 하는 본 발명자들의 믿음에 근거하면, 본 발명의 조성물은 파상풍과 디프테리아와 같은 다른 단백질 및 폴리펩티드를 이용하여 인간을 면역화하는데 이용되는 것과 유사할 것이다. 따라서, 본 발명의 조성물은 바람직하게는 불완전 프로인트 보조제, 수산화알루미늄,무라밀 펩티드, 유중수형 (water-in-oil) 에멀젼, 리포좀, ISCOM 또는 CTB, 또는 콜레라 독소로부터 얻은 비독성 B 서브유니트와 같은 제약학적으로 허용되는 보조제를 포함한다. 보다 바람직하게는, 조성물은 유중수형 에멀젼 또는 수산화알루미늄을 보조제로 함유한다.
본 발명의 조성물은 근육내, 피부내, 피하 또는 국소 투여를 위한 제제와 같은 다수의 제약학적으로 허용되는 형태로서 환자에게 투여된다. 바람직하게는 백신은 근육내 경로를 통해 투여된다.
일반적으로 최초 주사를 구성하게 되는 투여량은, 대부분의 경우 환자 1인당 보조제와 함께 약 0.01 내지 10 mg, 바람직하게는 0.1 내지 1.0mg의 22 kDa 표면 단백질 항원을 포함하며, 대부분 1회 또는 그 이상의 부스터 주사가 뒤따르게 된다. 바람직하게는 부스터 투여는 최초 주사가 있은 후 약 1 내지 6개월 후에 이루어지게 된다.
백신 개발과 관련하여 고려될 사항은 점막 면역원성의 문제이다. 이상적인 점막용 백신은 1회 또는 수회 투여량의 형태로서 경구적으로 또는 코내부로 안전하게 섭취할 수 있으며, 전신 면역과 함께 적절한 표면에서 방어적 항체를 유발시키게 된다. 점막 백신 조성물은 보조제, 불활성 미립자 담체 또는 재조합 생 벡터를 포함할 수 있다.
본 발명의 항-22 kDa 표면 단백질 항체는네이쎄리아 메닝기티디스또는네이쎄리아 고노로에나네이쎄리아 락타미카와 같은 관련 세균에 의해 감염된 인간의 수동적 면역요법 및 면역예방에 유용하다. 이러한 수동 면역화르 위한 투여 형태및 처방은 다른 수동 면역요법의 것과 유사하다.
본 발명에 따른 항체는 1995년 7월 21일에 미국 매릴랜드 록빌에 소재하는 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션에 기탁되어 있는 MAbs Me-1 또는 Me-7을 생산하는 하이브리도마를 예시할 수 있다. 이들에 대해서는 수탁번호 HB 11959 (Me-1) 및 HB 11958(Me-7)를 부여받았다.
다수의 본 발명 구현예를 여기에 기술하였지만, 이런 기초적인 구현예는 본 발명의 조성물 및 방법을 이용하는 다른 구현예를 제공하기 위해 변화될 수 있다. 따라서, 본 발명의 범위는 지금까지 설명한 상세한 설명란 및 특허청구범위에 정의된 여러 선택적 구현예 및 변형예를 모두 포함하며; 본 발명은 본 출원서에 실시예의 형태로 제시된 구체적인 특정 구현예에만 국한되는 것이 아니라는 것을 이해하게 될 것이다.
서열표
(1) 일반 정보 :
(ⅰ) 출원인 :브로듀, 버나드 알(Brodeur, Bernard R)
마틴, 데니스(Martin, Denis)
하멜, 조시(Hamel, Josee)
리옥스, 클레멘트(Rioux, Clement)
(ⅱ) 발명의 명칭 : 프로테이나제 K에 대해 내성을 갖는네이쎄리아 메닝기티디스(Neisseria meningitidis)의 표면 단백질
(ⅲ) 서열 수 : 26
(ⅳ) 우편주소 :
(A) 수신인 : 고우드레이 게이지 듀뷰크 & 마르티뉴 워커
(B) 거리 : 800 플라스 빅토리아, 스위트 3400, 투어 데 라 볼스
(C) 도시 : 몬트리올
(D) 주 : 퀘백
(E) 국명 : 캐나다
(F) 우편번호 : H4Z 1E9
(ⅴ) 판독가능한 컴퓨터 :
(A) 매체 타입 : 플로피 디스크
(B) 컴퓨터 : IBM 개인용 컴퓨터
(C) 가동 시스템 : PC-DOS/MS-DOS
(D) 소프트웨어 : PatentIn Release #1.0, Version #1.25
(ⅵ) 본 출원 자료 :
(A) 출원번호 :
(B) 출원일 :
(C) 분류 :
(ⅶ) 선출원 자료 :
(A) 출원번호 : US 08/406,362
(B) 출원일 : 1995년 3월 17일
(ⅶ) 선출원 자료 :
(A) 출원번호 : US (PROVIS) 60/001,983
(B) 출원일 : 1995년 8월 4일
(ⅷ) 대리인 정보 :
(A) 성명 : Leclerc/Dubuc/Prince, Alain/Jean/Gaetan
(C) 정리번호 : BIOVAC-1 PCT
(ⅸ) 전화번호 정보 :
(A) 전화번호 : 514-397-7400
(B) 팩스번호 : 514-397-4382
(2) 서열번호 1에 대한 정보 :
(ⅰ) 서열 특성 :
(A) 길이 : 830 염기쌍
(B) 타입 : 핵산
(C) 쇄의 수 : 2중
(D) 형태 : 선형
(ⅱ) 서열의 종류 : DNA (게놈)
(ⅲ) 추정 서열 : 없음
(ⅳ) 앤티-센스(anti-sence) : 없음
(ⅵ) 기원 :
(A) 생물명 :네이쎄리아 메닝기티디스(Neisseria meningitidis)
(B) 균주 : 608B
(ⅸ) 특징 :
(A) 명칭/기호 : CDS
(B) 위치 : 143..667
(ⅸ) 특징 :
(A) 명칭/기호 : sig-펩티드
(B) 위치 : 143..199
(ⅸ) 특징 :
(A) 명칭/기호 : mat-펩티드
(B) 위치 : 200..667
(ⅹⅰ) 서열 기재 : 서열번호 1 :
Figure pct00001
(2) 서열번호 2에 대한 정보 :
(ⅰ) 서열 특성 :
(A) 길이 : 174 아미노산
(B) 타입 : 아미노산
(D) 형태 : 선형
(ⅱ) 서열의 종류 : 단백질
(ⅹⅰ) 서열 기재 : 서열번호 2 :
Figure pct00002
(2) 서열번호 3에 대한 정보 :
(ⅰ) 서열 특성 :
(A) 길이 : 710 염기쌍
(B) 타입 : 핵산
(C) 쇄의 수 : 2중
(D) 형태 : 선형
(ⅱ) 서열의 종류 : DNA (게놈)
(ⅲ) 추정 서열 : 없음
(ⅳ) 앤티-센스(anti-sence) : 없음
(ⅵ) 기원 :
(A) 생물명 :네이쎄리아 메닝기티디스
(B) 균주 : MCH88
(ⅸ) 특징 :
(A) 명칭/기호 : CDS
(B) 위치 : 116..643
(ⅸ) 특징 :
(A) 명칭/기호 : sig-펩티드
(B) 위치 : 116..172
(ⅸ) 특징 :
(A) 명칭/기호 : mat-펩티드
(B) 위치 : 173..643
(ⅹⅰ) 서열 기재 : 서열번호 3 :
Figure pct00003
(2) 서열번호 4에 대한 정보 :
(ⅰ) 서열 특성 :
(A) 길이 : 175 아미노산
(B) 타입 : 아미노산
(D) 형태 : 선형
(ⅱ) 서열의 종류 : 단백질
(ⅹⅰ) 서열 기재 : 서열번호 4 :
Figure pct00004
(2) 서열번호 5에 대한 정보 :
(ⅰ) 서열 특성 :
(A) 길이 : 850 염기쌍
(B) 타입 : 핵산
(C) 쇄의 수 : 2중
(D) 형태 : 선형
(ⅱ) 서열의 종류 : DNA (게놈)
(ⅲ) 추정 서열 : 없음
(ⅳ) 앤티-센스(anti-sence) : 없음
(ⅵ) 기원 :
(A) 생물명 :네이쎄리아 메닝기티디스
(B) 균주 : Z4063
(ⅸ) 특징 :
(A) 명칭/기호 : CDS
(B) 위치 : 208..732
(ⅸ) 특징 :
(A) 명칭/기호 : sig-펩티드
(B) 위치 : 208..264
(ⅸ) 특징 :
(A) 명칭/기호 : mat-펩티드
(B) 위치 : 265..732
(ⅹⅰ) 서열 기재 : 서열번호 5 :
Figure pct00005
(2) 서열번호 6에 대한 정보 :
(ⅰ) 서열 특성 :
(A) 길이 : 174 아미노산
(B) 타입 : 아미노산
(D) 형태 : 선형
(ⅱ) 서열의 종류 : 단백질
(ⅹⅰ) 서열 기재 : 서열번호 6 :
Figure pct00006
(2) 서열번호 7에 대한 정보 :
(ⅰ) 서열 특성 :
(A) 길이 : 810 염기쌍
(B) 타입 : 핵산
(C) 쇄의 수 : 2중
(D) 형태 : 선형
(ⅱ) 서열의 종류 : DNA (게놈)
(ⅲ) 추정 서열 : 없음
(ⅳ) 앤티-센스(anti-sence) : 없음
(ⅵ) 기원 :
(A) 생물명 :네이쎄리아 메닝기티디스
(B) 균주 : b2
(ⅸ) 특징 :
(A) 명칭/기호 : CDS
(B) 위치 : 241..765
(ⅸ) 특징 :
(A) 명칭/기호 : sig-펩티드
(B) 위치 : 241..297
(ⅸ) 특징 :
(A) 명칭/기호 : mat-펩티드
(B) 위치 : 298..765
(ⅹⅰ) 서열 기재 : 서열번호 7 :
Figure pct00007
(2) 서열번호 8에 대한 정보 :
(ⅰ) 서열 특성 :
(A) 길이 : 174 아미노산
(B) 타입 : 아미노산
(D) 형태 : 선형
(ⅱ) 서열의 종류 : 단백질
(ⅹⅰ) 서열 기재 : 서열번호 8 :
Figure pct00008
(2) 서열번호 9에 대한 정보 :
(ⅰ) 서열 특성 :
(A) 길이 : 16 아미노산
(B) 타입 : 아미노산
(D) 형태 : 선형
(ⅱ) 서열의 종류 : 단백질
(ⅵ) 기원 :
(A) 생물명 :네이쎄리아 메닝기티디스
(B) 균주 : 608B
(ⅹⅰ) 서열 기재 : 서열번호 9 :
Figure pct00009
(2) 서열번호 10에 대한 정보 :
(ⅰ) 서열 특성 :
(A) 길이 : 15 아미노산
(B) 타입 : 아미노산
(D) 형태 : 선형
(ⅱ) 서열의 종류 : 단백질
(ⅵ) 기원 :
(A) 생물명 :네이쎄리아 메닝기티디스
(B) 균주 : 608B
(ⅹⅰ) 서열 기재 : 서열번호 10 :
Figure pct00010
(2) 서열번호 11에 대한 정보 :
(ⅰ) 서열 특성 :
(A) 길이 : 15 아미노산
(B) 타입 : 아미노산
(D) 형태 : 선형
(ⅱ) 서열의 종류 : 단백질
(ⅵ) 기원 :
(A) 생물명 :네이쎄리아 메닝기티디스
(B) 균주 : 608B
(ⅹⅰ) 서열 기재 : 서열번호 11 :
Figure pct00011
(2) 서열번호 12에 대한 정보 :
(ⅰ) 서열 특성 :
(A) 길이 : 15 아미노산0
(B) 타입 : 아미노산
(D) 형태 : 선형
(ⅱ) 서열의 종류 : 단백질
(ⅵ) 기원 :
(A) 생물명 :네이쎄리아 메닝기티디스
(B) 균주 : 608B
(ⅹⅰ) 서열 기재 : 서열번호 12 :
Figure pct00012
(2) 서열번호 13에 대한 정보 :
(ⅰ) 서열 특성 :
(A) 길이 : 15 아미노산
(B) 타입 : 아미노산
(D) 형태 : 선형
(ⅱ) 서열의 종류 : 단백질
(ⅵ) 기원 :
(A) 생물명 :네이쎄리아 메닝기티디스
(B) 균주 : 608B
(ⅹⅰ) 서열 기재 : 서열번호 13 :
Figure pct00013
(2) 서열번호 14에 대한 정보 :
(ⅰ) 서열 특성 :
(A) 길이 : 15 아미노산
(B) 타입 : 아미노산
(D) 형태 : 선형
(ⅱ) 서열의 종류 : 단백질
(ⅵ) 기원 :
(A) 생물명 :네이쎄리아 메닝기티디스
(B) 균주 : 608B
(ⅹⅰ) 서열 기재 : 서열번호 14 :
Figure pct00014
(2) 서열번호 15에 대한 정보 :
(ⅰ) 서열 특성 :
(A) 길이 : 16 아미노산
(B) 타입 : 아미노산
(D) 형태 : 선형
(ⅱ) 서열의 종류 : 단백질
(ⅵ) 기원 :
(A) 생물명 :네이쎄리아 메닝기티디스
(B) 균주 : 608B
(ⅹⅰ) 서열 기재 : 서열번호 15 :
Figure pct00015
(2) 서열번호 16에 대한 정보 :
(ⅰ) 서열 특성 :
(A) 길이 : 15 아미노산
(B) 타입 : 아미노산
(D) 형태 : 선형
(ⅱ) 서열의 종류 : 단백질
(ⅵ) 기원 :
(A) 생물명 :네이쎄리아 메닝기티디스
(B) 균주 : 608B
(ⅹⅰ) 서열 기재 : 서열번호 16 :
Figure pct00016
(2) 서열번호 17에 대한 정보 :
(ⅰ) 서열 특성 :
(A) 길이 : 15 아미노산
(B) 타입 : 아미노산
(D) 형태 : 선형
(ⅱ) 서열의 종류 : 단백질
(ⅵ) 기원 :
(A) 생물명 :네이쎄리아 메닝기티디스
(B) 균주 : 608B
(ⅹⅰ) 서열 기재 : 서열번호 17 :
Figure pct00017
(2) 서열번호 18에 대한 정보 :
(ⅰ) 서열 특성 :
(A) 길이 : 15 아미노산
(B) 타입 : 아미노산
(D) 형태 : 선형
(ⅱ) 서열의 종류 : 단백질
(ⅵ) 기원 :
(A) 생물명 :네이쎄리아 메닝기티디스
(B) 균주 : 608B
(ⅹⅰ) 서열 기재 : 서열번호 18 :
Figure pct00018
(2) 서열번호 19에 대한 정보 :
(ⅰ) 서열 특성 :
(A) 길이 : 15 아미노산
(B) 타입 : 아미노산
(D) 형태 : 선형
(ⅱ) 서열의 종류 : 단백질
(ⅵ) 기원 :
(A) 생물명 :네이쎄리아 메닝기티디스
(B) 균주 : 608B
(ⅹⅰ) 서열 기재 : 서열번호 19 :
Figure pct00019
(2) 서열번호 20에 대한 정보 :
(ⅰ) 서열 특성 :
(A) 길이 : 15 아미노산
(B) 타입 : 아미노산
(D) 형태 : 선형
(ⅱ) 서열의 종류 : 단백질
(ⅵ) 기원 :
(A) 생물명 :네이쎄리아 메닝기티디스
(B) 균주 : 608B
(ⅹⅰ) 서열 기재 : 서열번호 20 :
Figure pct00020
(2) 서열번호 21에 대한 정보 :
(ⅰ) 서열 특성 :
(A) 길이 : 15 아미노산
(B) 타입 : 아미노산
(D) 형태 : 선형
(ⅱ) 서열의 종류 : 단백질
(ⅵ) 기원 :
(A) 생물명 :네이쎄리아 메닝기티디스
(B) 균주 : 608B
(ⅹⅰ) 서열 기재 : 서열번호 21 :
Figure pct00021
(2) 서열번호 22에 대한 정보 :
(ⅰ) 서열 특성 :
(A) 길이 : 15 아미노산
(B) 타입 : 아미노산
(D) 형태 : 선형
(ⅱ) 서열의 종류 : 단백질
(ⅵ) 기원 :
(A) 생물명 :네이쎄리아 메닝기티디스
(B) 균주 : 608B
(ⅹⅰ) 서열 기재 : 서열번호 22 :
Figure pct00022
(2) 서열번호 23에 대한 정보 :
(ⅰ) 서열 특성 :
(A) 길이 : 15 아미노산
(B) 타입 : 아미노산
(D) 형태 : 선형
(ⅱ) 서열의 종류 : 단백질
(ⅵ) 기원 :
(A) 생물명 :네이쎄리아 메닝기티디스
(B) 균주 : 608B
(ⅹⅰ) 서열 기재 : 서열번호 23 :
Figure pct00023
(2) 서열번호 24에 대한 정보 :
(ⅰ) 서열 특성 :
(A) 길이 : 15 아미노산
(B) 타입 : 아미노산
(D) 형태 : 선형
(ⅱ) 서열의 종류 : 단백질
(ⅵ) 기원 :
(A) 생물명 :네이쎄리아 메닝기티디스
(B) 균주 : 608B
(ⅹⅰ) 서열 기재 : 서열번호 24 :
Figure pct00024
(2) 서열번호 25에 대한 정보 :
(ⅰ) 서열 특성 :
(A) 길이 : 14 아미노산
(B) 타입 : 아미노산
(D) 형태 : 선형
(ⅱ) 서열의 종류 : 단백질
(ⅵ) 기원 :
(A) 생물명 :네이쎄리아 메닝기티디스
(B) 균주 : 608B
(ⅹⅰ) 서열 기재 : 서열번호 25 :
Figure pct00025
(2) 서열번호 26에 대한 정보 :
(ⅰ) 서열 특성 :
(A) 길이 : 25 아미노산
(B) 타입 : 아미노산
(D) 형태 : 선형
(ⅱ) 서열의 종류 : 단백질
(ⅵ) 기원 :
(A) 생물명 :네이쎄리아 메닝기티디스
(B) 균주 : 608B
(ⅹⅰ) 서열 기재 : 서열번호 26 :
Figure pct00026
(2) 서열번호 27에 대한 정보 :
(ⅰ) 서열 특성 :
(A) 길이 : 30 염기쌍
(B) 타입 : 아미노산
(C) 쇄의 수 : 단쇄
(D) 형태 : 선형
(ⅱ) 서열의 종류 : 핵산
(A) 설명 : 프라이머
(ⅹⅰ) 서열 기재 : 서열 번호 27 :
Figure pct00027
(2) 서열번호 28에 대한 정보 :
(ⅰ) 서열 특성 :
(A) 길이 : 27 염기쌍
(B) 타입 : 핵산
(C) 쇄의 수 : 단쇄
(D) 형태 : 선형
(ⅱ) 서열의 종류 : 핵산
(A) 설명 : 프라이머
(ⅹⅰ) 서열 기재 : 서열 번호 28 :
Figure pct00028
(2) 서열번호 29에 대한 정보 :
(ⅰ) 서열 특성 :
(A) 길이 : 528 염기쌍
(B) 타입 : 핵산
(C) 쇄의 수 : 단쇄
(D) 형태 : 선형
(ⅱ) 서열의 종류 : 핵산
(A) 설명 : consensus
(ⅹⅰ) 서열 기재 : 서열 번호 29 :
Figure pct00029
(2) 서열번호 30에 대한 정보 :
(ⅰ) 서열 특성 :
(A) 길이 : 175 아미노산
(B) 타입 : 아미노산
(D) 형태 : 선형
(ⅱ) 서열의 종류 : 단백질
(ⅹⅰ) 서열 기재 : 서열 번호 30 :
Figure pct00030

Claims (81)

  1. 스트린전트 조건(stringent conditions)하에서 (a)네이쎄리아표면 단백질을 코딩하는 DNA 서열 또는 (b)네이쎄리아표면 단백질을 코딩하는 DNA 서열과 상보성이 있는 서열과 하이브리드화할 수 있는 분리된 폴리뉴클레오티드로,
    상기네이쎄리아표면 단백질은 (ⅰ) 프로테이나제 K(proteinase K)에 내성이 있으며, (ⅱ) 겉보기분자량(an apparent molecular weight)이 22 kDa이며, (ⅲ) 서열번호 2, 서열번호 4, 서열번호 6 내지 서열번호 8로 이루어진 군에서 선택된 폴리펩티드 서열에서 기인한 적어도 10개의 연속된 아미노산 잔기들을 포함하는 것임을 특징으로 하는 분리된 폴리뉴클레오티드.
  2. 제 1항에 있어서, 상기네이쎄리아표면 단백질을 코딩하는 DNA 서열과 상보성이 있는 서열은 서열번호 1의 서열 중 염기 200∼667을 포함하는 것을 특징으로 하는 폴리뉴클레오티드.
  3. 제 2항에 있어서, 상기 상보적인 서열은 서열번호 1의 서열 중 염기 143∼667을 포함하는 것을 특징으로 하는 폴리뉴클레오티드.
  4. 제 3항에 있어서, 상기 상보적인 서열은 서열번호 1의 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 폴리뉴클레오티드.
  5. 제 1항에 있어서, 상기네이쎄리아표면 단백질을 코딩하는 DNA 서열과 상보성이 있는 서열은 서열번호 3의 서열 중 염기 173∼643을 포함하는 것을 특징으로 하는 폴리뉴클레오티드.
  6. 제 5항에 있어서, 상기 상보적인 서열은 서열번호 3의 서열 중 염기 116∼643을 포함하는 것을 특징으로 하는 폴리뉴클레오티드.
  7. 제 6항에 있어서, 상기 상보적인 서열은 서열번호 3의 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 폴리뉴클레오티드.
  8. 제 1항에 있어서, 상기네이쎄리아표면 단백질을 코딩하는 DNA 서열과 상보성이 있는 서열은 서열번호 5의 서열 중 염기 265∼732을 포함하는 것을 특징으로 하는 폴리뉴클레오티드.
  9. 제 8항에 있어서, 상기 상보적인 서열은 서열번호 5의 서열 중 염기 208∼732을 포함하는 것을 특징으로 하는 폴리뉴클레오티드.
  10. 제 9항에 있어서, 상기 상보적인 서열은 서열번호 5의 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 폴리뉴클레오티드.
  11. 제 1항에 있어서, 상기네이쎄리아표면 단백질을 코딩하는 DNA 서열과 상보성이 있는 서열은 서열번호 7의 서열 중 염기 298∼765을 포함하는 것을 특징으로 하는 폴리뉴클레오티드.
  12. 제 11항에 있어서, 상기 상보적인 서열은 서열번호 7의 서열 중 염기 241∼765을 포함하는 것을 특징으로 하는 폴리뉴클레오티드.
  13. 제 12항에 있어서, 상기 상보적인 서열은 서열번호 7의 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 폴리뉴클레오티드.
  14. 서열번호 1의 서열 중 염기 200∼667을 포함하는 것을 특징으로 하는 분리된 폴리뉴클레오티드.
  15. 서열번호 1의 서열 중 염기 143∼667을 포함하는 것을 특징으로 하는 분리된 폴리뉴클레오티드.
  16. 서열번호 1의 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 분리된 폴리뉴클레오티드.
  17. 서열번호 3의 서열 중 염기 173∼643을 포함하는 것을 특징으로 하는 분리된 폴리뉴클레오티드.
  18. 서열번호 3의 서열 중 염기 116∼643을 포함하는 것을 특징으로 하는 분리된 폴리뉴클레오티드.
  19. 서열번호 3의 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 분리된 폴리뉴클레오티드.
  20. 서열번호 5의 서열 중 염기 265∼732을 포함하는 것을 특징으로 하는 분리된 폴리뉴클레오티드.
  21. 서열번호 5의 서열 중 염기 208∼732을 포함하는 것을 특징으로 하는 분리된 폴리뉴클레오티드.
  22. 서열번호 5의 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 분리된 폴리뉴클레오티드.
  23. 서열번호 7의 서열 중 염기 298∼765을 포함하는 것을 특징으로 하는 분리된 폴리뉴클레오티드.
  24. 서열번호 7의 서열 중 염기 241∼765을 포함하는 것을 특징으로 하는 분리된 폴리뉴클레오티드.
  25. 서열번호 7의 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 분리된 폴리뉴클레오티드.
  26. (ⅰ) 스트린전트 조건에서 제 1항 내지 제 25항 중 어느 한 항에서 정의된 분리된 폴리뉴클레오티드와 하이브리드화할 수 있는 서열번호 2, 서열번호 4, 서열번호 6 내지 서열번호 8로 이루어진 군에서 선택된 폴리펩티드 서열에서 기인한 적어도 10개의 연속된 아미노산 잔기들을 포함하는 폴리펩티드를 코딩함을 특징으로 하는 폴리뉴클레오티드 ; 및
    (ⅱ) 상기 폴리뉴클레오티드에 작동가능한 형태로 연결된(operatively linked) 발현 조절 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 재조합 DNA 분자.
  27. 제 26항에 있어서, 상기 발현 조절 서열은 유도성(inducible) 발현 조절 서열임을 특징으로 하는 재조합 DNA 분자.
  28. 제 27항에 있어서, 상기 유도성 발현 조절 서열은 온도, 락토스 및 IPTG로 이루어진 군에서 선택된 자극에 의해 유도됨을 특징으로 하는 재조합 DNA 분자.
  29. 제 27항에 있어서, 상기 유도성 발현 조절 서열은 λPL, λPR, TAC, T7, T3, LAC 및 TRP 프로모터들로 이루어진 군에서 선택됨을 특징으로 하는 재조합 DNA 분자.
  30. 제 26항에 있어서, 상기 DNA 분자는 pNP2202, pNP2203 및 pNP2204로 이루어진 군에서 선택된 것임을 특징으로 하는 재조합 DNA 분자.
  31. 진핵 및 원핵 숙주로서 이.콜리, 슈도모나스, 바실러스, 스트렙토마이세스, 진균 및 효모, 곤충세포로서 스포도프테라 프루기페르다(SF9), 동물세포로서 CHO 및 생쥐 세포, 아프리카 그린 원숭이 세포로서 COS 1, COS 7, BSC 1, BSC 40 및 BMT 10, 조직배양된 인간 세포 및 식물 세포로부터 선택된 적어도 1종 이상의 단세포를 제 26항 기재의 재조합 DNA 분자로 형질전환시킨 것임을 특징으로 하는 단세포 숙주.
  32. 제 31항에 있어서, 상기 숙주는이.콜리JM109,이.콜리BL21(DE3),이.콜리DH5αF'IQ,이.콜리W3110,이.콜리JM105,이.콜리BL21,이.콜리TOPP1,이.콜리TOPP2 및이.콜리TOPP3으로 이루어진 군에서 선택된 것임을 특징으로 하는 단세포 숙주.
  33. 제 1항 내지 제 25항 중 어느 한 항의 폴리뉴클레오티드를 생산하는 방법에 있어서, 제 31항의 단세포 숙주를 배양하는 단계 및 상기 폴리뉴클레오티드를 분리하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  34. 스트린전트 조건에 있어서 제 1항의 상기 상보적인 서열과 하이브리드화할 수 있는 서열번호 2, 서열번호 4, 서열번호 6 내지 서열번호 8로 이루어진 군에서 선택된 폴리펩티드 서열에서 기인한 적어도 10개의 연속된 아미노산 잔기들을 포함하는 폴리펩티드를 코딩함을 특징으로 하는 폴리뉴클레오티드; 또는 제 2항 내지 255항 중 어느 한 항의 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 폴리펩티드이고, 상기 폴리펩티드는 항원성이 있는 것을 특징으로 하는 분리된 폴리펩티드.
  35. 제 34항에 있어서, 상기 서열은 서열번호 2, 서열번호 4, 서열번호 6 내지 서열번호 8로 이루어진 군에서 선택된 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 분리된 폴리펩티드.
  36. 제 34항에 있어서, 서열번호 9, 서열번호 10, 서열번호 11, 서열번호 12, 서열번호 13, 서열번호 14, 서열번호 15, 서열번호 16, 서열번호 17, 서열번호 18, 서열번호 19, 서열번호 20, 서열번호 21, 서열번호 22, 서열번호 23, 서열번호 24, 서열번호 25 내지 서열번호 26으로 이루어진 군에서 선택된 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 분리된 폴리펩티드.
  37. 제 34항에 있어서, 서열번호 2의 서열 중 아미노산 31 내지 55를 포함하는 것을 특징으로 하는 분리된 폴리펩티드.
  38. 제 34항에 있어서, 서열번호 2의 서열 중 아미노산 51 내지 86을 포함하는 것을 특징으로 하는 분리된 폴리펩티드.
  39. 제 34항에 있어서, 서열번호 2의 서열 중 아미노산 110 내지 140을 포함하는 것을 특징으로 하는 분리된 폴리펩티드.
  40. 제 34항에 있어서, 상기 폴리펩티드는 제 31항의 단세포 숙주를 배양하여 수득된 것임을 특징으로 하는 분리된 폴리펩티드.
  41. 제 34항의 폴리펩티드를 분리하는 방법에 있어서,
    (a)네이쎄리아 메닝기티디스(Neisseria meningitidis)세균의 배양액을 분리하는 단계;
    (b) 상기 세균 배양액으로부터 외막 부분을 분리하는 단계; 및
    (c) 상기 외막 부분으로부터 상기 폴리펩티드를 분리하는 단계
    를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  42. 제 41항에 있어서, 상기 외막 부분을 프로테이나제 K로 처리하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  43. 네이쎄리아병원체에 의한 감염을 예방하기 위한 제약학적 조성물에 있어서, 이 조성물이 제 34항의 폴리펩티드를네이쎄리아병원체에 의한 감염을 예방하기에 유효한 양으로 함유한 백신임을 특징으로 하는 제약학적 조성물.
  44. 제 43항에 있어서, 제약학적 부형제를 포함하는 것을 특징으로 하는 제약학적 조성물.
  45. 제 43항에 있어서, 상기네이쎄리아병원체는네이쎄리아 메닝기티디스임을 특징으로 하는 제약학적 조성물.
  46. 제 43항에 있어서, 상기 폴리펩티드는네이쎄리아22 kDa 표면 단백질임을 특징으로 하는 제약학적 조성물.
  47. 제 46항에 있어서, 상기 네이쎄리아 22 kDa 표면 단백질은네이쎄리아 메닝기티디스2kDa 표면 단백질임을 특징으로 하는 제약학적 조성물.
  48. 인간에게서네이쎄리아에 의한 감염을 예방하기 위한 백신을 제조하는 방법에 있어서, 제 34항의 폴리펩티드와 제약학적으로 허용 가능한 희석제, 부형제 또는 면역보강제를 혼합하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법
  49. 제 48항에 있어서, 상기 폴리펩티드는네이쎄리아22 kDa 표면 단백질임을 특징으로 하는 방법.
  50. 제 49항에 있어서, 상기 네이쎄리아 22 kDa 표면 단백질은네이쎄리아 메닝기티디스2kDa 표면 단백질임을 특징으로 하는 방법.
  51. 제 34항의 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 항체 또는 그의 항원-결합 단편.
  52. 제 51항에 있어서, 상기 폴리펩티드는 네이쎄리아 22kDa 표면 단백질임을 특징으로 하는 항체.
  53. 제 52항에 있어서, 상기 네이쎄리아 22 kDa 표면 단백질은네이쎄리아 메닝기티디스22 kDa 표면 단백질임을 특징으로 하는 항체.
  54. 제 51항에 있어서, 단클론성 항체인 것임을 특징으로 하는 항체.
  55. 제 54항에 있어서, 쥐에서 유래된 것임을 특징으로 하는 항체.
  56. 제 55항에 있어서, IgG 이소타입인 것임을 특징으로 하는 항체.
  57. 제 54항에 있어서, Me-1, Me-2, Me-3, Me-5, Me-6 및 Me-7로 이루어진 군에서 선택된 것임을 특징으로 하는 항체.
  58. 제 51항의 항체를 분리하는 방법에 있어서,
    (a)네이쎄리아생물체 제제를 포유동물에 도입하는 단계; 및
    (b) 상기 항체를 함유하는 상기 포유동물로부터 혈청을 분리하는 단계
    를 포함함을 특징으로 하는 방법.
  59. 제 58항에 있어서, 상기네이쎄리아생물체는네이쎄리아 메닝기티디스인 것을 특징으로 하는 방법.
  60. 제 54항의 단클론성 항체를 분리하는 방법에 있어서,
    (a)네이쎄리아생물체 제제를 포유동물의 항체-생산 세포에 도입하는 단계;
    (b) 상기 항체-생산 세포를 골수종 세포와 융합시켜 하이브리도마 세포를 형성시키는 단계; 및
    (c) 상기 하이브리도마 세포로부터 상기 단클론성 항체를 분리하는 단계
    를 포함함을 특징으로 하는 방법.
  61. 제 60항에 있어서, 상기네이쎄리아생물체는네이쎄리아 메닝기티디스임을 특징으로 하는 방법.
  62. 네이쎄리아병원체에 의한 감염을 예방하기 위한 제약학적 조성물에 있어서, 이 조성물이 제 51항의 항체 또는 그의 항원-결합 단편을네이쎄리아병원체에 의한 감염을 예방하기에 유효한 양으로 함유한 백신임을 특징으로 하는 제약학적 조성물.
  63. 제 62항에 있어서, 제약학적 부형제를 포함함을 특징으로 하는 제약학적 조성물.
  64. 제 62항에 있어서, 상기 항체는 Me-1 및 Me-7로 이루어진 군에서 선택된 것임을 특징으로 하는 제약학적 조성물.
  65. 제 62항에 있어서, 상기네이쎄리아병원체는네이쎄리아 메닝기티디스인 것임을 특징으로 하는 방법.
  66. 생물학적 시료에서네이쎄리아항원을 검출하기 위한 방법에 있어서,
    (a) 환자로부터 생물학적 시료를 분리하는 단계;
    (b) 제 51항의 항체를 상기 생물학적 시료와 배양하는 단계; 및
    (c) 항원에 특이적으로 결합된 항체를 검출하는 단계
    를 포함함을 특징으로 하는 방법.
  67. 제 66항에 있어서, 상기 항원은네이쎄리아 메닝기티디스임을 특징으로 하는 방법.
  68. 제 66항에 있어서, 상기 항체는 Me-1 및 Me-7로 이루어진 군에서 선택된 것임을 특징으로 하는 방법.
  69. 생물학적 시료에서네이쎄리아항원에 특이적인 항체를 검출하는 방법에 있어서,
    (a) 환자로부터 생물학적 시료를 분리하는 단계;
    (b) 제 124항의 항원을 상기 생물학적 시료와 배양하는 단계; 및
    (c) 항체에 특이적으로 결합한 항원을 검출하는 단계
    를 포함함을 특징으로 하는 방법
  70. 제 69항에 있어서, 상기 항원은네이쎄리아 메닝기티디스항원인 것임을 특징으로 하는 방법.
  71. 제 70항에 있어서, 상기 항원은네이쎄리아 메닝기티디스22 kDa 표면 단백질임을 특징으로 하는 방법.
  72. 네이쎄리아병원체를 포유동물에서 검출하는 방법에 있어서,
    (a) 탐지가능한 표지를 가지고 제 51항의 항체를 표지화하는 단계;
    (b) 표지화된 항체를 상기 포유동물에 투여하는 단계; 및
    (c) 병원체에 특이적으로 결합된 표지화된 항체를 검출하는 단계
    를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  73. 제 72항에 있어서, 상기 병원체는네이쎄리아 메닝기티디스임을 특징으로 하는 방법.
  74. 인간에게서네이쎄리아 메닝기티디스에 의한 감염을 검출 또는 진단하기 위한 키트에 있어서, 34항의 폴리펩티드를 포함함을 특징으로 하는 키트.
  75. 생물학적 시료에서네이쎄리아세균을 검출하는 방법에 있어서,
    (a) 환자로부터 생물학적 시료를 분리하는 단계;
    (b) 제 1항 내지 제 25항 중 어느 한 항에 따른 네이쎄리아 표면 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드와 스트린전트 조건에서 하이브리드화할 수 있는 DNA 탐침을 상기 생물학적 시료와 접촉시키는 단계; 및
    (c) 상기 폴리뉴클레오티드에 대한 DNA 탐침에 의해 하이브리드화를 검출하는 단계;
    를 포함함을 특징으로 하는 방법.
  76. 제 75항에 있어서, 상기 DNA 탐침은 제 4항의 폴리뉴클레오티드를 포함함을 특징으로 하는 방법.
  77. 제 75항에 있어서, 상기 DNA 탐침은 제 7항의 폴리뉴클레오티드를 포함함을 특징으로 하는 방법.
  78. 제 75항에 있어서, 상기 DNA 탐침은 제 10항의 폴리뉴클레오티드를 포함함을 특징으로 하는 방법.
  79. 제 75항에 있어서, 상기 DNA 탐침은 제 13항의 폴리뉴클레오티드를 포함함을 특징으로 하는 방법.
  80. 제 75항에 있어서, 상기 DNA 탐침은 제 1항 내지 제 25항 중 어느 한 항의 폴리뉴클레오티드 중에서 적어도 6개의 인접 뉴클레오티드에 상보적인 서열을 갖는 올리고머임을 특징으로 하는 방법.
  81. 제 75항에 있어서, (ⅰ) 제 1항 내지 제 25항 중 어느 한 항의 폴리뉴클레오티드 중 적어도 6개의 연속된 뉴클레오티드들에 상보적인 서열과 (ⅱ) 표적 DNA에 인접한 서열을 가지고 중합연쇄반응에 의해 표적 DNA를 증폭하는 단계를 더 포함함을 특징으로 하는 방법.
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