KR100199819B1

KR100199819B1 - 천연으로부터 분리한 신균주 캔디다 트롭피칼리스에 의한 자일리톨의 제조방법

Info

Publication number: KR100199819B1
Application number: KR1019970009717A
Authority: KR
Inventors: 김상용; 오덕근; 최진환; 정수련; 김수은
Original assignee: 정기련; 주식회사보락
Priority date: 1997-03-21
Filing date: 1997-03-21
Publication date: 1999-06-15
Anticipated expiration: 2017-03-21
Also published as: US5998181A; KR19980074068A

Abstract

본 발명은 자일로스 제조회사(Korea Biotech Co., 안양)의 발효 슬러지(sludge)에서부터 자일리톨의 생산균주들을 분리하여 그 중에 특정 균주가 높은 수율과 생산성으로 자일리톨을 생성함을 발견하고, 이 신균주를 캔디다 트롭피칼리스(Candida tropicalis)(기탁번호 KFCC-10960호)를 이용하여 자일로스 질소원 및 무기염류 함유 배지에서 배양시킴을 특징으로 하는 고수율, 고생산성의 자일리톨 제조방법에 관한 것이다. 이때 배지는 자일로스 5~12%, 효모추출물 0.2~2.0%, 이인산칼륨 0.2~2.0% 및 황산마그네슘 0.01~0.2%를 함유하는 배지에서 배양하여 고수율, 고생산성으로 자일리톨을 제조한다.

Description

천연으로부터 분리한 신균주 캔디다 트롭피칼리스에 의한 자일리톨의 제조방법

본 발명은 천연으로부터 분리한 높은 자일리톨(xylitol)의 수율과 생산성을 지닌 신균주 캔디다 트롭피칼리스(Candida tropicalis)를 이용하여 자일로스(xylose)로부터 자일리톨을 제조하는 방법에 관한 것이다.

자일리톨은 1891년 화학자 에밀 피셔(Emil Fisher)에 의하여 발견되어, 1960년부터 감미료로서 사용되고 있는 오탄당 알코올이다. 또한 자일리톨은 과일, 채소 및 버섯등의 자연에서 소량 존재하고 포유동물의 탄수화물 대사과정 중에 존재한다. 자일리톨은 당도가 설탕과 같고 용해될 때 열 감소가 일어나는 특성으로 인하여 입안에서 느끼는 청량감이 커서 제과제품의 무설탕 원료로 사용되고 있고 섭취후 대사과정이 인슐린(insulin)과 무관하기 때문에 당뇨병 환자의 대용당으로 이용할 수 있다. 자일리톨은 충치발생과 관련된 스트렙토코커스 뮤탄스(Streptococcus mutans)의 생육을 저해하여 충치발생을 억제한다고 보고되고 있어 치약 등에 사용되고 있다. 또한, 매일라드(Maillard) 반응에 대하여 화학적으로 무반응 하다는 것도 주목할만한 특성이며 단당류이기 때문에 설탕과 달리 전화될 수 없으며, 따라서 변질의 우려가 없이 산성 환경에서도 사용할 수 있으며, 끓는 점이 95

이기 때문에 변성되지 않고 끓는 점에 도달할 수 있어 당의(sugar-coating)로 사용할 경우 특별히 물에 용해시켜 사용해야 할 필요가 없다는 장점을 지닌다.

자일리톨은 여러 가지의 과일이나 채소에 자연상태로 존재하지만 이 경우에는 극히 미량으로만 존재하기 때문에 이와 같이, 과일이나 채소로 부터 추출하는 것은 산업적으로 경제성이 없다. 그러므로 자일리톨은 자일로스가 많이 함유된 반섬유소 가수분해물(hemicellulose hydrolysate)을 환원시키는 화학적 방법으로 부터 생산되고 있다. 그러나 화학적 방법은 자일로스 또는 자일리톨과 반섬유소 부분에서 생기는 다른 가수분해물들과의 분리와 정제가 어렵고 그 수율도 50~60%정도로 낮다. 또한 알칼리를 이용한 고온 고압의 반응이므로 위험성과 폐기물 문제가 존재하는 단점이 있다.

이러한 단점을 해결하기 위하여 미생물에 의한 자일리톨 생산방법에 대한 많은 연구가 진행되고 있다. 미생물에 의한 자일리톨의 생산은 효모의 경우 캔디다(Candida)속의 블랭키(blankii), 구일러리몬디(guilliermondii), 펠리큘로사(pelliculosa), 파랍실로시스(parapsilosis), 트로피칼리스(tropicalis), 유틸리스(utilis)와 사카로마이세스(Saccharomyces)속의 바일리(bailii), 루우시(rouxii), 유바리움(uvarium)와 시조사카로마이세스(Schizosaccharomyces)속의 폼베(pombe)등이 있고 세균의 경우 엔테로박터 리퀘파시엔스(Enterobacter liquefaciens), 코리네박테리움(Corynebacterium)와 마이코박테리움 스메그마티스(Mycobacterium smegmatis)등이 있다. 미생물에 의한 방법은 고가의 방법이 아니고 식물성 원료의 가수분해물로부터 선별적으로 자일리톨만 전환시킬 수 있어 반응후의 자일리톨의 분리 정제과정을 매우 용이하게 할 수 있으나, 그 생산성이 0.3~1.5 g/L-h로 낮은 단점 때문에 산업화가 어려움이 있다.

따라서, 본 발명자들은 자일로스 제조회사(Korea Biotech Co., 안양)의 발효 슬러지(sludge)에서부터 자일리톨의 생산균주들을 분리하여 그 중에 특정 균주가 높은 수율과 생산성으로 자일리톨을 생성함을 발견하고 본 발명을 완성하였다.

본 발명은 천연슬러지에서 분리된 신균주 캔디다 트롭피칼리스(Candida tropicalis)(기탁번호 KFCC-10960호)를 이용하여 자일로스, 질소원 및 무기염류 함유 배지에서 배양시킴을 특징으로 하는 고수율 고생산성의 자일리톨 제조방법에 관한 것으로, 이때 배지는 자일로스 5~12%, 효모추출물 0.2~2.0%, 이인산칼륨 0.2~2.0% 및 황산마그네슘 0.01~0.2%를 함유하는 배지이며, 발효배지에서 신균주를 배양하여 고수율, 고생산성으로 자일리톨을 제조하는 방법 및 분리된 신균주 캔디다 트롭피칼리스에 관한 것이다.

이때 본 발명의 신균주 캔디다 트롭피칼리스의 종배양은 포도당 18~22 g/L, 펩톤 4~6 g/L, 효모추출물 2.5~3.5g/L 및 맥아추출물 2.5~3.5 g/L가 함유된 YM 배지에서 균체농도가 3~4 g/L로 성장할때 까지 진탕배양한다.

또한 발효배양시 적당한 pH는 4.5~5.5이고, 배양온도는 27~33

가 적당하다.

이하 본 발명의 신균주 캔디다 트롭피칼리스의 분리방법을 설명하면 다음과 같다.

자일로스 제조회사의 천연 슬러지의 시료를 적당히 희석한 후 자일로스 18~22 g/L, 펩톤 4~6 g/L, 효모 추출물 2.5~3.5 g/L, 맥아 추출물 2.5~3.5 g/L, 아가(agar) 12~17 g/L가 포함된 평판을 이용하여 28~32

에서 빨리 자라는 균주들을 중심으로 단일 군락(single colony)을 선별하였고, 이들 선별된 균주들을 자일로스 90~110 g/L, 효모 추출물 4~6 g/L, 황산암모니움 4~6 g/L, 이인산칼륨 4~6 g/L로 구성된 배지에서 발효시간 25~35시간 후에 자일리톨을 가장 많이 생산하는 균을 최종적으로 선별하였다.

균주의 동정은 형태학적, 배양학적 및 생리학적 특성을 Kreger-Van Rij(Elsevier Science Publishers, Amsterdam, 1984)의 방법에 준하여 조사하였고 Barnett등(Yeasts:Characteristics and identification. Cambridge university Press, London, 1983)의 분류방법에 따라 동정하였다. 선별된 균주의 생리적 특성은 다음과 같다.

여러 온도에서 균의 증식 : 20

+ 30

+

37

+ 42

-

균의 증식 : 40% D-포도당 +

50% D-포도당 -

비타민 제거 배지 -

요소 분해 : -

전분 형성 : -

디아조니움 블루 B 형성 반응 : -

질산염의 이용 : -

필라멘트 : +

탄소원의 이용

이상과 같은 균주의 특성을 동정한 결과 본 균주는 캔디다 트롭피칼리스 종의 균주로 판명되었고 신균주 캔디다 트롭피칼리스(Candida tropicalis)를 한국미생물보존협회에 1997년 3월 17일 기탁번호 KFCC-10960호로 기탁하였다.

본 발명의 자일리톨 생성 배양법을 좀더 구체적으로 설명하면 다음과 같다.

본 균주의 종배양을 위한 성장배지로는 포도당 18~22 g/L, 펩톤 4~6 g/L, 효모추출물 2.5~3.5g/L 및 맥아추출물 2.5~3.5 g/L로 구성된 YM 배지를 사용하였고, 플라스크의 발효배지로는 탄소원으로 자일로스 80~120 g/L 사용하였고 질소원으로 효모 추출물 또는 무기염으로 이인산칼륨, 황산마그네슘으로 구성된 배지를 사용하였다.

각 성분의 양은 자일리톨의 생산성을 높이기 위하여 변화시킬수 있다. 발효조에서 사용한 배지로 자일로스는 유가식으로 총 첨가된 농도는 300 g/L이었고 효모 추출물 10 g/L, 이인산칼륨 5 g/L, 황산마그네슘 0.2 g/L로 구성된 최적배지이었다.

종배양은 냉동 보관된 균주를 YM 배지 50ml가 들어있는 250 ml의 플라스크에 접종하여 진탕 배양기에서 230~250 rpm, 28~32

로 균체농도가 3~4 g/L(약 10시간)로 성장할 때까지 수행하였다. 플라스크 배양에서는 배지에 5%에 해당되는 종배양액을 발효배지가 50 ml가 들어있는 250 ml의 플라스크에 접종하여 진탕 배양기에서 210~230 rpm, 27~33

로 하여 28~32시간동안 배양하였다.

발효조 배양에서는 발효초기에 200g의 자일로스가 함유된 배지부피가 3 L인 5 L 발효조(한국발효기(주))를 사용하였다. 발효과정 중에 교반속도는 250 rpm으로 조절하였고 통기량은 1.0 vvm으로 조절하였다. pH는 발효 전 과정동안 4.5~5.5로 조절하였고 배양온도는 27~33

이었다.

자일로스와 자일리톨의 농도는 Sugar-Pak

칼럼(Millipore, USA)이 장착된 HPLC (ShimadzuC-R6A,Japan)의 Refractive Index Detector (Shimadzu RID-6A, Japan)를 이용하여 측정하였다. 이때, 용매는 물을 사용하였고, 온도는 70

이고, 유속은 0.6 ml/분 이였다. 균체농도는 탁도계를 이용하여 600 nm에서 현탁도를 측정하여 미리 측정한 표준곡선을 이용하여 건조중량으로 전환하였다. 용존산소 농도는 Ingold사(Swiss, polarographic type)의 용존산소전극을 사용하여 측정하였다.

본 발명을 실시예에 따라 더욱 상세히 설명하면 다음과 같다.

[실시예 1]

종배양 : 자일로스 제조회사의 sludge로부터 분리한 균주 캔디다 트롭피칼리스(KFCC-10960호)를 YM 배지 50 ml가 들어있는 250 ml 플라스크에 접종하여 240rpm 30

로 10시간 배양하였다.

본배양 : 종 배양액을 발효배지 50 ml가 함유된 250 ml 플라스크에 접종한후, 진탕 배양기로 220 rpm에서 30

로 자일로스가 완전히 소모될 때까지 배양하였고 배지의 pH는 발효 초기에 5.0으로 조절한 후 조절하지 않았다. 이때 배지성분은 자일로스 100 g/L, 효모 추출물 5 g/L, 황산암모늄 5 g/L, 이인산칼륨 5 g/L이었다. 시간 경과에 따른 자일리톨의 생산을 살펴본 결과를 표 1에 나타내었다. 분리균주의 최대 비증식속도는 0.5 h^-1이었고 최대균체량은 5.7 g/L이었다. 배양시간 32시간에서 자일로스를 모두 소모하였으며 72 g/L의 자일리톨이 생산되었다.

[실시예 2]

배양방법은 실시예 1과 같고, 자일로스 100 g/L, 질소원 5 g/L, 이인산칼륨 5 g/L로 구성된 발효배지에서 발효시간 30시간 후 여러 가지 질소원이 자일리톨의 생산에 미치는 영향을 살펴보았다. 여러 가지 질소원에서 배양한 결과를 표 2에 나타내었다. 무기질소원의 경우에는 자일리톨이 전혀 생성되지 않았고 균체농도도 0.2 g/L 이하로 나타났다. 유기질소원을 사용한 경우에는 모두 균체가 증식하였으나 자일리톨은 효모추출물(yeast extract)와 효모질소(yeast nitrogen base)를 제외한 다른 유기 질소원에서 낮은 농도를 나타났고 그 중에서도 효모 추출물이 가장 좋은 질소원이었다.

[실시예 3]

배양방법은 실시예 1과 같고, 본 배양에서 발효배지를 자일로스 100 g/L, 효모 추출물, 이인산칼륨 5 g/L로 하여 이 중 효모 추출물의 농도를 변화시켜 30시간 동안 배양한 결과를 표 3에 표시하였다.

[실시예 4]

배양방법은 실시예 1과 같고, 본 배양에서 발효배지를 자일로스 50 g/L, 효모 추출물 10 g/L, 황산암모늄 5 g/L, 이인산칼륨으로 하고, 이 중 이인산칼륨의 농도를 변화시키면서 30시간 동안 배양한 결과를 표 4에 표시하였다.

[실시예 5]

배양방법은 실시예 1과 같고, 본 배양에서 발효배지를 자일로스 100g/L, 효모 추출물 10g/L, 이인산칼륨 5 g/L, 황산암모늄 5 g/L, 황산마그네슘으로 하고 이중 황산마그네슘의 농도를 변화시키면서 30시간 동안 배양한 결과를 표 5에 표시하였다.

[실시예 6]

종배양은 실시예 1과 같고, 본 배양에서 최적발효배지(자일로스 100 g/L, 효모 추출물 10 g/L, 이인산칼륨 5 g/L, 황산마그네슘 0.2 g/L)가 3L인 5L 발효조를 사용하여 배양하였다. 배양온도 30

에서 여러 pH별 실험을 수행하였다. 통기량은 1.0 vvm이었고 교반속도는 250 rpm으로 조절하여 pH를 변화시켜 자일로스가 완전히 소모될 때까지 배양한 결과를 표 6에 표시하였다.

[실시예 7]

배양방법과 발효배지는 실시예 6과 같고, 본 배양에서 배양 pH는 4.5로 하여 배양온도별 실험을 수행하였고 배양한 결과를 표 7에 표시하였다.

[실시예 8]

선정된 최적배지(효모 추출물 10 g/L, 이인산칼륨 5 g/L, 황산마그네슘 0.2 g/L)에서 자일로스의 농도를 300 g/L로 증가시켜 발효조에서 자일로스의 유가식 배양을 수행하였다. 이때 유가식 배양을 수행한 이유는 캔디다 트롭피칼리스의 경우 100 g/L 이상의 자일로스에서는 자일리톨 생산속도가 저하되었기 때문이었다. 배양은 발효초기에 200 g의 자일로스가 함유된 배지부피가 2L인 5L 발효조(한국발효기(주))를 사용하였다. 발효과정 중에 175g의 자일로스가 함유된 250ml의 용액을 4번(19.5h, 26h, 32h, 37.5h) 추가하여 최종배양액의 부피를 3L(총 첨가된 자일로스의 농도는 300 g/L에 해당)가 되는 유가식 배양을 하였다. 용존산소는 교반속도를 300~800 rpm으로 조절하여 배양초기에는 20%이상 유지시키고 균체농도가 약 15 g/L되는 시점에서 교반속도를 350 rpm으로 변화시켜 용존산소를 제한하였다. pH는 발효 전 과정 동안 4.5로 조절하였고 배양온도는 30

이었고 통기량은 1.0 vvm으로 조절하였다. 시간에 따른 자일리톨의 생산은 표 8에 나타내었다. 이러한 방법으로 300 g/L의 자일로스로부터 43시간만에 240 g/L의 자일리톨을 얻었다. 이러한 결과는 자일로스에 대한 자일리톨의 수율 80%와 자일리톨의 생산성 5.38 g/L-h에 해당되는 것이다.

[비교예 1]

문헌보고 중 높은 자일리톨의 생산성을 나타낸 경우만을 표 9에 정리하였다. 지금까지 원심분리하여 균체를 농축하지 않고 사용한 문헌보고 최고 수준은 캔디다 구일러리몬디(C. guilliermondii)를 이용하여 406시간 동안 300 g/L의 자일로스로부터 221 g/L의 자일리톨을 생산한 경우이다. 그러나, 본 발명에서의 캔디다 트롭피칼리스의 자일리톨 생산성은 캔디다 구일러리몬디의 생산성 보다 10배 이상 높게 나타났다. 또한 본 발명은 원심분리하여 농축된 균체를 이용한 경우인 캔디다(Candida sp.) L-102와 야하시(Yahashi) 등이 연구한 캔디다 트롭피칼리스에서는 자일리톨의 생산성이 각가 1.53 g/L-h, 2.93 g/L-h를 보여준 결과 뿐 아니라 같은 용존산소 조절 방법을 사용한 캔디다 파랍실로시스(C. parapsilosis)의 자일리톨의 생산성 2.50 g/L-H 보다 훨씬 높은 결과를 보여주었다. 또한 균체 당 자일리톨의 생산성 역시 0.48 g/g-h로 기존에 보고된 다른 균주들 보다 훨씬 높게 나타났다.

^a비 자일리톨 생산성^b총 자일리톨 생산성

^c자일로스에 대한 자일리톨의 수율^d자일로스에 대한 균체의 수율

천연슬러지에서 분리된 신균주 캔디다 트롭피칼리스(Candida tropicalis)를 이용하여 자일로스 5~12%, 효모추출물 0.2~2.0%, 이인산칼륨 0.2~2.0% 및 황산마그네슘 0.01~0.2%를 함유하는 배지에서 배양하여 고수율, 고생산성으로 자일리톨을 제조할수 있다. 이는 종래의 발효방법에 비해 경제적이고 자일로스로부터 선택적으로 환원시켜 자일리톨을 간편하게 발효 생산하게 된 것이다.

Claims

천연슬러지에서 분리된 신균주 캔디다 트롭피칼리스(Candida tropicalis) (기탁번호 KFCC-10960호)를 이용하여 자일로스, 질소원 및 무기염류 함유 배지에서 배양시킴을 특징으로 하는 고수율 고생산성의 자일리톨 제조방법
제1항에 있어서, 발효배지는 자일로스 5~12%, 효모추출물 0.2~2.0%, 이인산칼륨 0.2~2.0% 및 황산마그네슘 0.01~0.2%를 포함함을 특징으로 하는 자일리톨의 제조방법
제1항에 있어서, 발효배양시 pH는 4.5~5.5이고, 배양온도는 27~33
임을 특징으로 하는 자일리톨의 제조방법
제1항에 있어서, 신균주 캔디다 트롭피칼리스의 종배양은 포도당 18~22 g/L, 펩톤 4~6 g/L, 효모추출물 2.5~3.5g/L 및 맥아추출물 2.5~3.5 g/L가 함유된 YM 배지에서 균체농도가 3~4 g/L로 성장할때 까지 진탕배양시킴을 특징으로 하는 자일리톨의 제조방법
천연 슬러지의 시료를 희석한 후 자일로스 18~22 g/L, 펩톤 4~6 g/L, 효모 추출물 2.5~3.5 g/L, 맥아 추출물 2.5~3.5 g/L, 아가(agar) 12~17 g/L가 포함된 평판을 이용하여 28~32
에서 빨리 성장하는 균주들을 중심으로 단일 군락(single colony)을 선별하고, 이들 선별된 균주들을 자일로스 90~110 g/L, 효모 추출물 4~6 g/L, 황산암모니움 4~6 g/L, 이인산칼륨 4~6 g/L로 구성된 배지에서 발효시간 25~35시간 후에 자일리톨을 가장 많이 생성하는 균을 선별함을 특징으로 하는 신균주 캔디다 트롭피칼리스(Candida tropicalis) (기탁번호 KFCC-10960호)의 분리방법
제5항의 방법에 따라 분리된 자일리톨 생성 신균주 캔디다 트롭피칼리스(Candida tropicalis) (기탁번호 KFCC-10960호)