KR100187753B1

KR100187753B1 - 배추폐기물을 이용한 살충성 곰팡이 배지 및 그를 이용한 생물학적 방제법

Info

Publication number: KR100187753B1
Application number: KR1019960053204A
Authority: KR
Inventors: 강선철; 윤종원; 최명철; 이동규
Original assignee: 강선철
Priority date: 1996-11-07
Filing date: 1996-11-07
Publication date: 1999-06-01
Anticipated expiration: 2016-11-07
Also published as: KR19980034989A

Abstract

본 발명은 김치공장, 대형청과물시장 등에서 생성되는 고형폐기물인 손상된 배추잎, 배추뿌리, 무 등(이중 90%이상은 배추잎)을 분쇄, 압축처리 후 고상과 액상으로 분리회수하여 각각 적잘한 공정을 거쳐 살충성 곰팡이 보베리아 바시아나(Beauveria bassianna ATCC 7159), 메탈히지움 아니소플리(Metarhiizium anisopliae ATCC 20500)균주를 포함하는 산업적으로 중요한 살충성 곰팡이(Fungi) 균주들의 배양을 위한 값싼 배지를 제조하고 이를 이용한 생물학적 방제법을 제공하는 뛰어난 효과가 있다.

Description

배추폐기물을 이용한 살충성 곰팡이 배지 및 그를 이용한 생물학적 방제법

본 발명은 김치공장, 대형청과물시장 등에서 대량으로 생성되는 배추폐기물을 이용하여 살충성 곰팡이의 배양을 위한 값싼 배지 및 그를 이용한 생물학적 방제법에 관한 것이다. 현재 우리나라에서 발생되는 유기성 폐기물은 전체 폐기물 발생량의 절반이상을 차지하고 있는 것으로 보고되고 있으며, 부패성이 크기 때문에 악취발생, 오수누출 등의 환경문제 유발가능성이 큰 것으로 평가되고 있다. 따라서, 유기성 페기물을 안정 한 물질로 전환, 감량화시키기 위한 처리/처분기술이 페기물처리의 가장 큰 목적으로 대두되고 있다. 우리나라에서 발생되는 폐기물의 처리방법은 지금까지 대부분 매립에 의존해 왔는데, 매립처리법은 폐기물의 양이 많고 안정화하는데 시간이 오래 걸릴뿐 아니라 침출수 등에 의한 2차오염이 불가피하여 환경보존 측면에서 바람직한 방법은 될 수 없다.

특히, 김치공장, 대형청과물시장 등에서 발생되고 있는 다량의 유기성 폐기물(주로 손상된 배추잎, 배추뿌리, 무 등)들은 불순고형물이 거의 없어 퇴비화 등의 방법으로 자원화가 용이함에도 불구하고 지금까지 대부분 매립해 오고 있다. 그러나 최근 매립지가 거의 한계에 도달해 있고 정부의 환경정책이 선진국형으로 변화되고 있어 이에 대한 대비책을 마련하기 위해 여러 가지 방법을 모색하고 있는 실정이지만 효과적인 자원화 기술은 아직 확립되어 있지 못한 실정이다.

한편, 배추는 최근 10년간 연평균 약 300만톤이 생산, 출하되고 있으며 이중 약 30%인 90만톤 정도가 매년 폐기물로써 매립 처분되고 있으므로 이를 재활용한다면 환경보호 효과와 살충성 곰팡이 보베리아 바시아나(Beauveria bassianna ATTC 7159), 메탈히지움 아니소플리(Metarhiizium anisopliae ATCC 20500) 등의 유용미생물의 대량생산이 가능하게 된다. 한편, 보베리아 바시아나(Beauveria bassianna ATCC 7159), 메탈히지움 아니소플리(Metarhiizium anisopliae ATCC 20500) 등은 벼멸구, 진딧물, 좀 등 다양한 종류의 해충에 감염하여 이들을 치사시킬 수 있는 능력을 가진 곤충병원성 곰팡이로 보고되고 있다(Leger, R, J. et al., 1987, J. Gen, Microbiol., 133, 1371-1382; Moorhouse, E. R. et al., 1993, Biocintrol Sci, Technol., 3, 63-72 ; Ziding F., et al., 1988, Can, Entomol. 120, 133-144). 지금까지 알려진 곤충병원성 곰팡이는 곰팡이 보베리아 바시아나(Beauveria bassianna), 메탈히지움 아니소플리(Metarhiizium anisopliae), 힐수텔라 쏘니소닐(Hirsutella thonysonil) 등을 포함하여 약 400여종이 된다(Mittler, T. E. et al., 1987, Annual Review of Entomology. Vol. 32, pp. 228-229). 이와같은 살충성 곰팡이를 해충방제의 수단으로 이용하기 위해서는 이 균주들의 균체 및 포자를 대량 생산하는 공정기술이 필요하다.

따라서, 본 발명에서는 이상의 유용한 균주의 대량생산 목적을 달성하기 위해서 김치공장의 고형폐기물을 이용한 배지를 활용하여 보베리아 바시아나(Beauveria bassianna)의 고체 및 액체배양을 수행하였다. 그 결과 배추즙액을 제외한 고형분을 이용하여 고체배양을 했을 경우 배양 2주일에 2.0×10⁸cfu(colony forming units)/g의 분생포자(conidia)가 형성되었다. 또한 액체배양에서는 배추즙액배지에서 배양 5일경에 배양액 미리리터(㎖) 당 4.0×10⁷개의 아상포자(blastosproes)가 생성되었다. 이 배지는 PDB(potato dextrose broth), SDB(Sabouraud dextrose broth), YPD(yeast extract peptone dextrose)등의 흔히 사용하는 곰팡이 성장을 위한 배지 보다 포자형성능이 월등히 높았다. 이들 종래배지의 조성은 각각 다음과 같다. PDB 배지는 포테이포(potato) 200g, 덱스트로스(dextrose) 20g을 증류수에 녹여 최종 부피가 1리터(liter)가 되도록 제조한다. SDB 배지는 네오펩톤(neopeptone) 10g, 덱스트로스(dextrose) 40g을 증류수에 녹여 최종 부피가 1리터(liter)가 되게 제조한다. YPD 배지는 효모 추출액(yeast extract) 10g, 펩톤(peptone) 10g, 덱스트로스(dextrose) 2g을 증류수에 녹여 최종 부피가 1리터(liter)가 되도록 제조한 것이다. 본 발명에서 배추를 이용한 배지를 사용한 경우에 생성된 포자가 살충성을 갖고 있는지 검정하기 위해서 꿀벌부채명나방의 애벌레에 대한 살충효과를 검정하였으며, 또한 보베리아 바시아나(Beauveria bassianna)와 메탈히지움 아니소플리(Metarhiizium anisopliae) 등의 유용곰팡이 배양을 위한 고형폐기물 추출액의 최적농도, 최적 배양온도, 최적 배양 pH, 균체 생성량(dry weight)등을 결정하였다.

제1도는 살충성곰팡이 보베리아 바시아나(Beauveria bassianna)를 고체배양 및 액체배양할 때 현미경 하에서의 포자형태에 관한 사진이다.

제2도는 살충성곰팡이 메탈히지움 아니소플리(Metarhiizium anisopliae)를 고체배양 및 액체배양할 때 현미경 하에서의 포자형태에 관한 사진이다.

제3도는 배추즙액배지에서 보베리아 바시아나(Beauveria bassianna)를 액체배양할 때 배추즙액의 농도에 따른 포자형성능 비교 그림이다.

제4도는 배추즙액배지에서 메탈히지움 아니소플리(Metarhiizium anisopliae)를 액체배양할 때 배추즙액의 농도에 따른 포자형성능 비교 그림이다.

제5도는 보베리아 바시아나(Beauveria bassianna)를 액체배양시 배지종류에 따른 포자형성능 비교 그림이다.

제6도는 메탈히지움 아니소플리(Metarhiizium anisopliae)를 액체배양시 배지종류에 따른 포자형성능 비교 그림이다.

제7도는 보베리아 바시아나(Beauveria bassianna)를 액체배양시 배지종류에 따른 균체생성량(dry weight) 비교 그림이다.

제8도는 메탈히지움 아니소플리(Metarhiizium anisopliae)를 액체배양시 배지종류에 따른 균체생성량(dry weight) 비교 그림이다.

제9도는 배추즙액배지(100%)에서 보베리아 바시아나(Beauveria bassianna)를 액체배양할 때 초기 pH에 따른 포자형성능 비교 그림이다.

제10도는 배추즙액배지(100%)에서 메탈히지움 아니소플리(Metarhiizium anisopliae)를 액체배양할 때 초기 pH에 따른 포자형성능 비교 그림이다.

제11도는 배추즙액배지(100%)에서 보베리아 바시아나(Beauveria bassianna)를 액체배양할 때 배양온도에 따른 포자형성능 비교 그림이다.

제12도는 배추즙액배지(100%)에서 메탈히지움 아니소플리(Metarhiizium anisopliae)를 액체배양할 때 배양온도에 따른 포자형성능 비교 그림이다.

제13도는 보베리아 바시아나(Beauveria bassianna)의 포자감염에 따른 꿀벌부채명나방의 애벌레에 대한 살충효과 검증 사진이다.

제14도는 메탈히지움 아니소플리(Metarhiizium anisopliae)의 포자감염에 따른 꿀벌부채명나방의 애벌레에 대한 살충효과 검증 사진이다.

본 발명의 구성 및 작용을 실시예를 통하여 구체적으로 살펴보지만, 하기 예에 본 발명의 범주가 한정되는 것은 아니다.

[실시예 1]

배지의 조제

고형폐기물인 배추쓰레기(대구 칠성시장에서 구입한 김장용 배추 1㎏을 원료로 사용함)를 이용하여 몇 단계의 전처리 과정을 거친 후 미생물 성장 배지를 제조하였다. 액체 배지를 위한 전처리과정은 (I) 압착녹즙기를 이용한 배추즙 추출과정, (II) 가압멸균기(Autoclave)를 이용한 121℃에서 2분간 가열하는 과정, (III) 12,000rpm으로 15분간 원심분리하는 과정, (IV) 상등액을 취한 후 여과지(Whatman No. 1, USA)로 여과하는 과정 등을 순서대로 수행하였다. 이때 최종 생산된 배추즙에 적당히 물을 부가하여 100%(배추집 원액), 50%, 10%로 희석된 배지를 제조하여 본 발명의 기본 배추배지의 성분으로 한다. 또한 일반 배지로 활용하기 위해 필요한 양의 탄소원(포도당, 설탕, 유당, 감자 전분, 전분, 자이로스, 당밀 등), 질소원(펩톤, 트립톤, 카시미노산, 카제인, 효모 추출액, 소이톤, 콘 글루텐 밀[CGM], 콘 스팁 리커[CSL], 소이빈 플로어[SBF] 등)을 부가하여 일반배지로도 사용한다. 이상의 전처리 공정은 파쇄된 찌꺼기를 완전히 제거함으로써 액체배양시 미생물의 성장을 분광광도계(spectrophotometer)를 이용하여 쉽게 정량화하기 위하여 실행하였다. 전처리 후 배추폐기물의 즙액은 121℃에서 15분간 멸균하여 액체배지를 제조하였다. 또한 단순히 페트리디쉬(petri dish)에서 배양할 목적으로 고체배지를 제조할 경우에는 위의 액체배지에 한천을 1.5-2.0% 첨가하여 제조하였다. 이상의 방법으로 제조된 배지를 이용하여 살충성 곰팡이 보베리아 바시아나와 메탈히지움 아니소플리를 고체 및 액체배양하여 생성된 포자를 현미경으로 관찰한 사진을 각각 도1과 도2에 나타내었다.

[실시예 2]

고형배지의 제조

상기 실시에 1의 액체 배추즙액배지를 80-100℃로 12시간 이상 가열건조하여 분말 배지를 제조하였다. 이렇게 제조된 분말배지는 단순히 물만 첨가하면 실시예 1과 동일한 배지가 제조된다. 따라서 용도에 따라서 액체배지 또는 고형분 배지로 사용하였다.

[실시예 3]

파쇄찌꺼기를 이용한 고체 배지의 제조

상기 실시예 1에서 제조된 배추즙액을 제외한 고형분은 수분함량을 30-85%, 좋게는 50-70%로 조절하여 멸균한 다음, 살충성곰팡이 보베리아 바시아나(Beauveria bassianna ATTC 7159), 메탈히지움 아니소플리(Metarhiizium anisopliae ATCC 20500)등을 고체배양하기 위한 배지로 제조하였다. 이 배지를 이용하여 1.0×105/㎖ 농도의 포자현탁액을 0.1㎖ 접종하여 보베리아 바시아나 균체를 배양한 결과 배양시간별 생성되는 분생포자(Conidia) 수는 표 1과 같았다.

[실시예 4]

배추즙액의 농도에 따른 포자형성능 비교

상기 실시예 1에서 제조한 10, 50, 100%의 배추즙액배지를 250㎖ 삼각플라스크에 100㎖식 담았다. 이 배지에 1.0×106/㎖ 농도의 포자 현탁액을 0.5㎖ 접종하여 pH 6.0, 25℃, 160rpm으로 보베리아 바시아나와 메탈히지움 아니소플리 균체를 진탕배양한 결과 배양시간별 생성되는 아상포자(blastspores/㎖)수는 각각 제3도, 제4도와 같았다. 그 결과 50-100%의 배추즙액배지에서 포자형성능이 가장 높게 나타났다. 또한 본 발명의 배추즙액배지가 상기한 살충성 곰팡이 보베리아 바시아나와 메탈히지움 아니소플리 외에도 페니실리움 노타툼(Penicillium notatum ATCC 7813), 세팔로스포리움 아크레모니움(Cephalosporium acremonium ATCC 36225), 아스페르질러스 나이거(Aspergillus niger ATCC 22343, ATCC 26550 emd), 아스페르질러스 오리자(Aspergillus oryzae ATCC 42149), 라이조푸스 오리고스포러스(Rhizopus oligosporus ATCC 22959), 사카로마이세스 세레비시(Saccharomyces cerevisiar ATCC 9763, 22244 등), 느타리버서(Pleurotus ostreatus), 표고버섯(Lentinus edodes ATCC 6069) 등의 배양에서도 그 효과가 입증되었다. 따라서, 상기 배추즙액배지는 곰팡이 배양을 위한 일반배지로 활용이 된다.

[실시예 5]

배추즙액배지와 일반배지와의 포자형성능 비교

상기 실시예 1에서 제조한 100%의 배추즙액배지과 일반배지인 PDB, SDB, YPD 배지를 따로 준비하여 250㎖ 삼각플라스크에 100㎖식 담았다. 이 배지에 1.0×106/㎖ 농도의 포자 현탁액을 0.5㎖ 접종하여 pH 6.0, 25℃, 160rpm으로 보베리아 바시아나와 메탈히지움 아니소플리 균체를 진탕배양한 결과 배양시간별 생성되는 아상포자(blastspores/㎖)수는 각각 제5도, 제6도과 같았다. 그 결과 배추즙액배지의 포자형성능이 일반배지에 비해 월등이 높음을 알 수 있다.

[실시예 6]

배지종류에 따른 균체생성량 비교

상기 실시예 4 및 실시예 5에서 배양한 보베리아 바시아나와 메탈히지움 아니소플리의 배지에 따른 균체생성량(dry weight)을 알아보기 위하여 매일 한 개씩 배양액을 꺼내어 원심분리한 후 침전된 균체를 동결건조기에서 건조하여 무게를 측정하여 그 결과를 각각 도7과 도8에 나타내었다. 그 결과 100% 배추즙액배지에서 균체생성량이 가장 높음을 알 수 있었다.

[실시예 7]

초기 pH에 따른 포자형성능 비교

상기 실시예 1에서 제조한 100%의 배추즙액배지를 250㎖ 삼각플라스크에 100㎖식 담았다. 이 배지에 1.0×10⁶/㎖ 농도의 포자 현탁액을 0.5㎖ 접종하여 다양한 초기pH 25℃, 160rpm으로 보베리아 바시아나와 메탈히지움 아니소플리 균체를 진탕배양한 결과 배양시간별 생성되는 아상포자(blastspores/㎖)수는 각각 제9도, 제10도와 같았다. 그 결과 보베리아 바시아나는 pH 4.5-5.5에서 메탈히지움 아니소플리에서는 pH 6.5-8.5에서 최대 포자형성능을 보였다. 따라서 곰팡이의 포자형성능이 최대가 되는 pH 균주에 따라 달자짐을 알 수 있다.

[실시예 8]

배양온도에 따른 포자형성능 비교

상기 실시예 1에서 제조한 100%의 배추즙액배지를 250㎖ 삼각플라스크에 100㎖식 담았다. 이 배지에 1.0×10⁶/㎖ 농도의 포자 현탁액을 0.5㎖ 접종하여 다양한 배양온도에서 pH 6.0, 160rpm으로 보베리아 바시아나와 메탈히지움 아니소플리 균체를 진탕배양한 결과 배양시간별 생성되는 아상포자(blastspores/㎖)수는 각각 제11도, 제12도와 같았다. 그 결과 보베리아 바시아나는 20℃에서, 메탈히지움 아니소플리에서는 25-30℃에서 최대 포자형성능을 보였다. 따라서 곰팡이의 포자형성능이 최대가 되는 배양온도는 균주에 따라 달라짐을 알 수 있다.

[실시예 9]

살충효과 검정

상기 실시예의 배추즙액배지에서 배양한 포자가 살충성을 갖는지 검정하기 위하여 9×1.5㎝ 페트리 디쉬(petri dish)에 여과지를 깔고 꿀벌부채명나방의 애벌레를 8마리씩 넣고 1.0×106/㎖ 농도의 보베리아 바시아나와 메탈히지움 아니소플리 포자현탁액을 0.5㎖ 접종하여 25℃에서 4-7일간 보관하면서 관찰하였다. 그 결과 제13도, 제14도에서 보여주는바와 같이 애벌레가 포자에 감염되어 치사됨을 볼 수 있었다.

본 발명은 이상의 실시예를 통하여 명백한 바와 같이, 김치공장, 대형청과물 시장 등에서 대량 생성되는 배추폐기물을 이용하여 값싼 배추배지를 제공하는 효과가 있다. 또한 살충성 곰팡이 보베리아 바시아나, 메탈히지움 아니소플리 등을 포함하는 산업적으로 유용한 곰팡이를 대량배양하기 위한 값싼 배지로 활용할 수 있는 효과가 있을 뿐만 아니라 배추폐기물을 곰팡이 배지로 활용함으로써 생물학적 방제법을 제공하는 효과와 단순 매립에 의해 발생하는 악취발생, 오수누출 등의 환경문제가 해결할 수 있으므로 생물농약 및 환경산업상 매우 유용한 발명인 것이다.

Claims

배추잎을 압착녹즙기를 이용하여 배추즙 추출을 한 후 가압멸균기에서 121℃, 2분간 처리하고 12,000rpm으로 15분간 원심분리하여취한 상등액을 여과하는 전처리 공정에 이어서 121℃에서 15분간 멸균하여서 되는 배추폐기물을 이용한 생물학적 방제용 곰팡이 배지.
제1항에 있어서, 상기 배지에 한천을 1.5-2.0% 첨가하여 되는 고체배지.
제1항 기재의 곰팡이 배지 제조과정에서 버려지는 배추 파쇄찌꺼기를 원료로 멸균하여서되는 고체 곰팡이용 배지를 제조하는 방법.
제1,2,3항중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 배지에 증류수를 부가하여 제조된 희석배지.
제1,2,3항중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 배지에 부가적으로 탄소원 및 질소원을 첨가하여 제조된 배지.
제1,2,3항중 어느 하나의 항에 따른 배지를 보베리아 바시아나(Beauveria bassianna ATCC 7159), 메탈히지움 아니소플리(Metarhiizium anisopliae ATCC 20500) 등의 곰팡이 배지로 이용함을 특징으로 하는 생물학적 방제법.