KR0180991B1 - 합성 펩티드를 함유하는 녹농균 백신 및 이것으로부터 생산된 치료제 - Google Patents

Abstract

본 발명은 녹농균(Pseudomonas aeruginosa)의 감염을 예방 및 치료하기 위한 합성 펩티드 함유 백신 및 이것으로부터 생산된 치료제에 관한 것이다. 본 발명의 백신은 주면역-에피토프인 동시에 중화(neutralizing) 에피토프로서 특정 펩티드를 함유한다. 본 발명에 따른 백신은 독성이 없고 안전한 항체 생산능을 나타내며, 또한 다양한 녹농균에 대해 교차 반응 능력을 나타낸다.

Description

합성 펩티드를 함유하는 녹농균 백신 및 이것으로부터 생산된 치료제

제 1도는 녹농균 OprF의 C-말단 영역의 아미노산 잔기에 대응하는 합성된 중첩(overlapping)펩티드를 나타낸 도면.

제 2도는 합성 펩티드를 면역흡착 항원으로 사용하여 녹농균 감염후 회복된 사람의 혈청과의 반응성을 고체상 효소 면역분석(ELISA)한 결과를 나타낸 그래프도.

제 3도는 고체상 ELISA분석에 의한 항원-항체의 역가 측정 프로필(titration profile)을 나타낸 도면.

제 4도는 본 발명의 에피토프에 해당하는 아미노산 서열과 다른 슈도모나스(Pseudomonas)종들에서 유래한 OprF내의 대응 아미노산 서열을 비교한 도면.

본 발명은 녹농균(Pseudomonas aeruginosa)의 감염을 예방하기 위한 합성펩티드 함유 백신 및 이것으로부터 생산된 치료제에 관한 것이다. 좀 더 상세히 설명하자면, 본 발명은 녹농균 백신 및 치료제의 제조시 항원으로 사용될 수 있는 주면역에피토프(immunodominant epitope) 영역을 지닌 합성 펩티드 및 이 펩티드로부터 제조된 백신 및 치료제에 관한 것이다.

녹농균 감영증의 예방 또는 치료를 위해 공통 항원을 사용하여 백신을 개발하려는 많은 시도가 이루어지고 있다. 그 예로서는, 녹농균을 구성하고 있는 성분들 중에서 면역학적으로 방어 효과가 있는 특정 부분을 단리하고, 이를 항원으로 이용하는 방안을 들 수 있다. 주목을 받고 있는 공통 항원들은 톡신 A 톡소이드, 고분자량의 폴리사카라이드, 무독화시킨 LPS-단백질 콘주게이트, 폴리사카라이드-톡신 A 콘주게이트, 편모 (flagella), 섬모(pili) 및 세포 외막 단백질 등이다(Infect. Immun. 52, pp 161 - 165, 1986; J. Clin. Invest. 69, pp 303 - 308, 1982; 및 J. Biol. Chem. 256, pp 7305 - 7310, 1981).

세포 외막 단백질 성분들 중에서도 포린(porin)의 일종인 프로테인 F가 가장 바람직한 물질이라고 보고 되어 있다. (J. Biol. Chem. 266, pp 770 - 779, 1991). 포린 프로테인 F(이하, OprF라고 부름)는 일반적으로 녹농균의 모든 균주에 존재하며, 면역학적으로 교차 면역 반응성(cross-reactivity)을 가지고 있다(J. Clin. Microbiol. 26, pp 1161 - 1165. 1988; 및 J. Imfect. Dis. 146, pp. 770~779, 1982). 이러한 점에서 OprF는 녹농균 감염에 대한 예방백신 및 치료제의 개발에 있어서 가능성이 높은 후보 물질이다.

그러나, OprF를 사용하는 한 가지 가장 큰 단점은 이 OprF가 녹농균의 감염예방에 있어서 주요한 공통 항원이지만, 이를 단독으로 사용하는 경우에는 서로 다른 혈청형을 갖는 모든 녹농균에 대한 교차 면역 반응을 효과적으로 일으키지 못하므로, 전체의 세포 외막 단백질을 사용하는 경우에 비해 비교적 방어 유효성(protective efficacy)이 비교적 낮다는 점이다.

즉, OprF가 녹농균 감염 예방을 위해 충분한 면역 반응을 일으키기에 양적으로 부족하든지 혹은 균 자체의 생존을 위하여 중화 에피토프(neutralizing epitope)가 노출되어 있지 않든지 아니면 어떤 추가적인 성분을 필요로 한다든지의 여러 가지 원인이 있을 수 있다(Infect. Immun. 33, 527 - 532, 1981).

듀켄(Duchene)등은 OprF에 관한 유전자를 클로닝하였으며, 이 유전자의 염기 서열과 아미노산 서열을 밝혀내었다(J. Bacteriol. 170, pp. 155~162, 1988). 최근에는 듀켄이 밝힌 OprF의 아미노산 서열을 근거로 OprF 단백질을 동물에 면역하여 얻어진 항혈청과 반응하는 OprF내의 항원성 펩티드를 찾아내기 위한 연구들이 수행되고 있다.

디 모트(De Mot)등은 P. fluorescens의 OprF의 서열분석을 수행하여, OprF에 관한 구조적 모델을 제시하였다(Microbiology 140, pp 1377-1387, 1994).

그 모델에 따르면, 추정되는 에피토프가 N-말단으로부터 188 내지 270위치 내에 존재할 것으로 보았으며, 대부분의 N-말단영역(1-187)이 외막에 묻혀있는 것으로 나타냈다. 또한, 이들의 보고는 녹농균의 OprF의 C-말단 영역이 막 표면에 노출되어 있는 것으로 밝혀져 있다는 사실과 일치한다(Infect. Immun. 60, 3497-3503, 1992). 그러나, 디 모트 등은 녹농균 및 P. fluorescens 모두에 있어서 항원성영역은 제시하지 않고 있다.

휴우즈(Hughes)등은 듀켄이 발표한 녹농균의 세포 외막 단백질 F(OprF)의 아미노산 서열을 사용하여, 컴퓨터 분석을 수행함으로써 예측되는 항원성 영역을 동정하였다. 즉, 이들은 OprF의 아미노산 서열의 분석을 통해서 항원성 인덱스(antigenic index), 표면 노출 가능성(surface exposure probability) 및 친수성(hydrophilicity)이 가장 우수한 10개의 펩티드를 선정하여 합성하였다(Infect. Immun. 60, pp 3497 - 3503, 1992). 이들 펩티드에 대해서 특이하게 반응하는 마우스 항체를 얻어서 녹농균의 모든 면역형 균주들의 전세포(whole cell; 全細胞)와 반응시켰다. 그 결과, 3개의 합성 펩티드가 모든 녹농균들의 면역형 균주들의 전세포와 결합 가능한 항체를 생성할 수 있는 것으로 보고 하였다. 이들3개의 영역은 듀켄이 밝힌 326개의 아미노산 서열 중 N-말단으로부터 219-232 (7 번째 펩티트), 261 - 274 (9 번째 펩티드), 305 - 318 (10 번째 펩티드)위치에 존재하는 것들이며, 이 부위가 세포 외부로 노출되어 있음을 제시하였다. 이들이 제시한 펩티드는 다음과 같다.

펩티드 7: KFDFDKSKVKENSY (서열 확인 번호 8)

펩티드 9: TDAYNQKLSERRAN (서열 확인 번호 9)

펩티드 10: NATAEGRAINRRVE (서열 확인 번호 10)

휴우즈 등의 발표에 의하면, 7번째의 합성 펩티드는 상기 3개의 펩티드 중에서 가장 낮은 역가로 녹농균의 항체를 유발하였고, 프로테인F-결핍 KG 1077세포와도 비슷하게 반응하는 점으로 미루어, 주요한 에피토프가 아니고, 9 번 및 10 번 서열의 항원성 펩티드가 시험된 모든 펩티드 중에서 가장 높은 역가로 녹농균의 항체를 유발하였므로, 이들을 합성 백신으로 사용될 가능성이 높은 항원으로서 제시하였다. 이들은 이와 같은 높은 역가가 펩티드들의 영역이 세포 외부로 가장 잘 노출되어 있는 것에 기인하는 것으로 추정하였다. 그러나, 이들 펩티드는 컴퓨터 예측과는 달리, 실제로 동물 시험에서 대조군에 비해 뚜렷한 효과를 보이지 않았다(Vaccine, 13, pp 1750-1753, 1995). 또한, 본 발명자들이 이들 펩티드를 녹농균에 감염된 후 회복된 사람의 항체와 반응시켜 보았을 때, 이들의 항체와의 반응성은 극히 낮았으므로, 이들 서열을 효율적인 면역원으로 사용하기에는 부적절하였다.

본 발명의 목적은 녹농균의 공통 항원인 OprF 내에 존재하는, 면역학적으로 유의성 있는 특정 항원성 펩티드를 제공하는 것이다.

본 발명의 제2의 목적은 본 발명에 따른 펩티드를 항원으로 사용하여 제조된 백신을 제공하는 것이다.

본 발명의 제3의 목적은 본 발명에 따른 펩티드로부터 유도되는 항체 및 이를 함유하는 치료제를 제공하는 것이다.

이상의 본 발명의 목적은 이하의 상세한 설명으로부터 자명하게 될 것이다.

위와 같은 본 발명의 목적은 LDVKFD (서열 확인 번호 1)의 아미노산 서열을 필수적으로 함유하는 일련의 합성 펩티드를 제공함으로써 달성된다.

본 발명에서 사용된 용어 환자, 또는 녹농균에 감염된 환자는 녹농균에 감염된 후 회복되어 녹농균에 대한 항체를 가지고 있는 사람을 의미한다. 본 명세서의 전반에 걸쳐서 이들 용어는 달리 정의하지 않는 한, 녹농균에 감염된 후 회복되어 녹농균에 대한 항체를 가지고 있는 사람을 의미하는 것으로 이해되어야 한다.

본 발명자들은 OprF에서 주면역 에피토프를 규명하던 중, 지금까지 알려지지 않은 새로운 주면역 에피토프를 포함하는 특정 서열의 펩티드가 녹농균에 감염된 환자의 혈청 내의 항체와 충분히 높은 역가로서 특이성을 가지고 반응한다는 사실을 알게 되었다. 이에 따라서, 이 펩티드가 신규한 주면역 에피토프로서, 녹농균의 감염증을 예방하기 위한 뛰어난 백신 및 치료제의 제조에 사용될 수 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성하게 되었다.

본 발명의 제 1의 특징에 의하면, 특정 아미노산 서열을 필수적으로 함유하는 항원성 펩티드를 주면역 에피토프로서 포함하는 녹농균 감염증의 예방용 백신이 제공된다.

본 발명의 제 2의 특징에 의하면, 천연 γ-글로불린으로 이루어지고, 특정 아미노산 서열을 포함하는 펩티드를 항원으로 사용하여 얻은 녹농균 감염증의 치료용 항체 및 치료제 조성물이 제공된다.

본 발명의 더욱 다른 특징에 의하면, 특정 아미노산 서열을 갖는 펩티드의 녹농균 백신 및 치료제 제조를 위한 용도가 제공된다.

본 발명자들은 OprF를 단리·정제하여 녹농균에 대한 주면역 에피토프 및 중화 반응 에피토프를 찾기 위하여 OprF의 C-말단 영역을 펩티드 스캐닝의 타겟으로 선정하였다.

그 이유는 N-말단 영역은 외막 내에 또는 원형질 주변 영역 내에 위치하고 있어서 항원결정기(antigenic determinant)의 존재 가능성이 매우 희박한 반면, C-말단 영역은 녹농균의 세포 외막으로부터 외부로 노출되어 있으므로, 이 부분에서 매우 효과적인 에피토프가 존재할 가능성이 높기 때문이다.

본 발명자들은 듀켄에 의하여 밝혀진 OprF의 아미노산 서열을 토대로 녹농균의 OprF의 C-말단 부분에 대해서 9 개의 펩티드가 중첩된 펩티드 15 개를 합성하고 (제1도 참조), 녹농균에 감염된 환자의 혈청과의 반응성을 평가하여 예방 백신 및 치료제의 후보 물질이 될 수 있는 주면역 및 중화 반응 에피토프를 규명하였다.

더욱 구체적으로 말하자면, 녹농균의 OprF에 대한 보고된 326개의 아미노산 서열 분석 데이터를 이용하여 첨부된 제1도 에 나타낸 바와 같은 C-말단에 대한 중첩된 펩티드 15 개를 공지의 방법[Sheppard, R. C. (1986) Science The LKB Instrument Journal 33, 9]에 따라 시판되는 합성기를 사용하여 합성한다. 본 발명에서는 multisyntec (독일, Bochum사 제품)을 사용할 수 있다.

이어서, 상기 합성 펩티드로부터 주면역 에피토프를 동정하기 위해서 녹농균에 감염된 후 회복된 사람의 항혈청과 반응성을 ELISA법으로 조사한다. ELISA법은 당해 기술 분야에 잘 알려져 있으며, 문헌 [J. Clin. Microbiol. 15, pp 1054-1058, 1982]을 참조할 수 있다. 본 발명에서는 고체상(solid-phase) ELISA법을 사용하여 조사한다.

ELISA법에 의해 각 펩티드와 항체와의 결합 활성(binding activity)을 측정하기 위해 490 nm에서의 흡광도를 조사한 결과, 위 15 개의 펩티드 중 펩티드 No. 3 (서열 확인 번호 2)와 No. 4 (서열 확인 번호 4)의 흡광도가 가장 높게 나타났으며, 특히 펩티드 No. 3의 흡광도가 더 높았다.

이와 같은 결과는 상기의 휴우즈 등이 보고한 결과와 전혀 다른 것이다. 휴우즈 등은 컴퓨터 분석에 의해 에피토프로 추정되는 펩티드를 합성하고, 이 합성 펩티드를 마우스에 면역화시켜서, 이것이 녹농균의 모든 혈청형에서 항체를 유발하는 지를 시험하였다. 그 결과, 9번 및 10번 서열의 항원성 펩티드가 시험된 모든 펩티드중에서 가장 높은 역가로 녹농균의 항체를 유발하였다고 보고 하고 있다. 그러나, 본 발명자들이 휴우즈 등이 보고한 펩티드를 녹농균에 감염된 후 회복된 사람의 항체와 반응시켜 보았을 때, 이들의 항체와의 반응성은 극히 낮았다. 즉, 이들 9번 및 10번 펩티드는 제 1도의 펩티드 No. 9 및 No. 14에 포함되며, 면역반응성을 보이지 않았다. 이러한 상이한 결과는 휴우즈 등에 있어서는 컴퓨터 분석에 의하여 에피토프를 추정하고, 마우스의 항체에 대하여 시험한 반면, 본 발명에서는 각 합성 펩티드를 실제 녹농균 감염된 후 회복된 사람의 항체에 대해서 직접 분석 실험을 수행한 데서 기인하는 것으로 보인다. 더욱이, 휴우즈 등은 단지 컴퓨터 분석에 의해 본 발명의 펩티드 No. 3의 서열을 포함하는 영역을 간과했을 가능성이 매우 높다. 또 다른 이유로서는 다른 연구자들의 경우, 펩티드 No. 3의 서열을 포함하는 영역에 대한 동물로부터 얻어진 항혈청 분석의 유의성 있는 값을 얻지 못하였거나, 펩티드 3를 포함한 영역이 아마도 세포질주변 영역(periplasm region)에 존재하는 것으로 추정한 기존의 연구 결과에 따라서 펩티드 No. 3을 간과한 것으로 보인다.

이와 같은 결과를 토대로 하여, 펩티드 No. 3에 대한 18개의 아미노산을 각 데이터 뱅크의 자료를 통하여 분석해 본 결과, LDVKFD (서열 확인 번호 1)의 서열의 표면 노출 가능성 및 친수성이 가장 높았다.

펩티드 No. 3(서열 확인 번호 2)과 펩티드 No. 4(서열 확인 번호 4)의 서열의 일부를 다른 아미노산으로 치환하여 혈청과의 반응성을 조사해 본 결과, 펩티드 No. 4의 KSKVKE (서열 확인 번호 7)의 서열이 에피토프일 가능성은 가장 높았으나, 펩티드 No. 4, 4-1 및 4-3(이들 서열에 대해서는 표2에 기재됨)의 경우에는 혈청과의 반응성이 낮았다.

이러한 결과는 펩티드 No. 3(서열 확인 번호 2)이 녹농균에 대한 주면역 에피토프로서 유용하다는 사실을 보여준다.

주면역 에피토프로서 유용한 본 발명에 따른 펩티드는 LDVKFD(서열 확인 번호 1)의 아미노산 서열을 필수적으로 함유한다.

이러한 펩티드들은 다음의 아미노산 서열을 갖는다.

GAPAVAEVVRVQLDVKFD---(서열 확인 번호 2)

GAPAAAAVVRVQLDVKFD---(서열 확인 번호 3)

RVQLDVKFDFDKSKVKEN---(서열 확인 번호 4)

VRVQLDVKFDFD---------(서열 확인 번호 5)

AVAEVVRVQLDVKFDFDKSKVKE---(서열 확인 번호 6)

본 발명에 따른 합성 펩티드는 그대로 사용하여 녹농균 감염 예방용 백신으로 제조할 수 있다. 별법으로, 본 발명의 합성 펩티드는 백신의 항원성을 높이기 위해서 공지된 KLH 용액(keyhole limpet hemocyanine, Calbiotec사로부터 입수가능, 미합중국 California주 San Diego 소재; 50% 글리세롤 용액에 ml 당 125 mg을 용해시킴)을 커플링(coupling)시킬 수도 있다. 본 발명의 백신은 제약학상 허용되는 부형제, 예를 들면 수산화알루미늄(Al(OH)₃), 인산알루미늄(AlPO₄), ISCOM(immunostimulating complex), SAF-1 (Syntex Adjuvant Formulation-1), 또는 SAFm(Modified Syntex Adjuvant Formulation) 등을 함유할 수 있다.

녹농균 감염 예방 백신으로 사용할 경우의 사용량은 녹농균 감염이 우려되는 투여 대상의 연령, 체중, 성별, 일반적인 건강 상태에 따라 다르지만, 2일 간격으로 2 내지 40㎍/Kg의 양으로 3회 투여한다. 투여 경로는 근육내 투여가 바람직하다.

녹농균의 감염증을 치료하기 위한 치료제로 사용되는 면역 글로불린은 펩티드를 함유하는 항원을 면역 항체를 유발할 수 있는 양으로 실험 동물에 투여함으로써 얻는다. 치료제는 심장으로부터 채혈하고 분리함으로써 얻어지는 항혈청을 정제하여 얻어진 순수한 항체를 사용한다. 별법으로서는, 정제된 감마 글로불린 성분 및 임의의 성분, 예컨대 생리식염수, 포도당 수용액 또는 인산염 완충액 등을 함유하는 조성물의 형태로 사용해도 좋다.

본 발명에 의한 면역 글로불린은 필요에 따라 액체 또는 동결 건조된 형태로 제형화해도 좋으며, 임의로 제약학상 허용되는 담체, 예컨대 안정화제, 방부제, 등장성 시약(isotonic agent)등을 함유시킬 수도 있다. 제약학상 허용되는 담체로는 동결 건조된 제제일 경우, 만니톨, 락토오스, 사카로오스, 인간 알부민 등을 예로 들 수 있으며, 액상 제제의 경우에는 생리 식염수, 주사용수, 인산염 완충액, 수산화알루미늄 등을 예로 들 수 있다. 그러나, 이들에만 한정되는 것은 아니다.

면역 글로불린의 투여량은 환자의 연령, 체중, 성별, 일반적인 건강 상태, 녹농균 감염증의 정도 및 투여되는 면역 글로불린의 성분에 따라 다양하다. 본 발명의 면역 글로불린 제제는 일반적으로 정맥내 투여의 경우 성인에 대하여 체중 kg 당 1일 0.1 내지 1000 mg, 바람직하게는 1 내지 100 mg으로 투여하는 것이 좋다.

이하, 본 발명을 최선의 실시예에 의한 더욱 구체적으로 설명하겠다. 그러나, 본 발명이 이들 실시예에만 국한되는 것은 아니다.

[실시예 1]

녹농균 감염후 회복된 사람으로부터 혈청의 제조

녹농균에 감염된 것으로 확인된 환자들로부터 채혈된 서로 상이한 20 여종의 혈액을 각각 약 1 내지 5 ㎖ 씩 무균적으로 분양받아 실온에서 1시간 정도 방치한 후, 4℃의 냉장고에서 밤새 보관하였다. 이어서, 4℃에서 1500 g로 10분간 원심 분리하여 고형물을 제거하고 상층액의 혈청을 수득하였다. 미리 준비한 1.0 내지 1.5% 아가(agar)를 첨가한 트립틱 소이 브로쓰 배양 평판에 위에서 얻은 혈청을 인산염 완층 용액(ℓ당 Na₂HPO₄1. 15 g. KCl 0.2 g. KH₂PO₄0.2 g. NaCl 8.766g)을 사용하여 1:10의 비율로 희석하여 각각을 도말한 후, 37℃로 유지되는 호기성 조건의 배양기에서 12 시간 이상 배양하였다. 이와 같이하여 얻은 배양물을 새로운 배양 평판에 옮겨서 공지의 미생물 순수 분리 방법[참조: Biology of Microorganisms, 5th Edition, Thomas D. Brock, Michael T. Madigan, pp 28-34, 1988]을 사용하여 미생물을 순수한 형태로 분리하였다. 분리된 녹농균들의 혈청학적-면역학적 분류는 이미 알려져 있으며(참조: Bergey´s Manual), 시판되는 분석키트를 이용하여 다음과 같은 분석 방법으로 동정하였다 [J. Gen. Microbiol. 130, 631-644, 1984]. 트립틱 소이 브로쓰 5 ㎖를 시험관에 넣고 각각의 균을 접종한 후, 37℃로 유지되는 호기성 조건하에서 배양하여 650 ㎚에서의 흡광도가 대략 2.0이상이 유지되도록 균체 농도를 조절하였다. 이 배양액 1 ㎖를 무균적으로 분취하여 4℃에서 6000g로 10분간 원심 분리한 후, 상층의 배양액을 제거하고, 침전된 미생물에 동량의 멸균 식염수를 가하여 현탁시켰다. 준비된 96-웰 마이크로플레이트에 시험 혈청 및 대조 혈청(정상 토끼 헐청) 15㎕씩을 각각 가한 후, 각 혈청에 위에서 얻은 미생물 현탁액 15㎕ 씩을 각각 가하여 혼합시키고, 10 내지 30분 사이에 응집 반응(agglutination)이 일어나는 지의 여부를 관찰하였다. 이 때, 양성의 응집 반응이 일어나는 웰의 균주는 거기에 첨가한 혈청과 일치되는 혈청학적 형태(Serotype)를 가지는 것이므로 쉽게 구별할 수 있다. 여기서, 양성 반응을 보인 환자 중에서 녹농균 감염증에서 회복된 환자를 선별하여 혈액을 채취하고 전술한 방법에 따라서 항혈청을 분리하여 생화학적 또는 면역학적 분석에 사용할 때까지 -20℃에 보관하였다.

[실시예 2]

팹티드 합성 및 결합력 평가

문헌[Duchene et al, J. Bacteriol. 170, 155-162, 1988]에 보고된 OprF의 326개의 아미노산 서열 분석 데이타를 이용하여 녹농균의 OprF의 C-말단 영역에 대해 15개의 중첩(overlapping) 펩티드를 합성하였다. (multisyntec, Bochum, Germany) (도면 제1도). 제1도에 있어서 성숙 OprF의 시스테인(C)은 합성 펩티드에서 알라닌(A)으로 치환되었다. 괄호의 숫자는 농녹균의 성숙 OprF에있어서의 위치를 나타낸다. 주면역 에피토프를 확인하기 위하여 15개의 중첩 펩티드를 항원으로 사용하여 실시예 1에서 제조된 녹농균에 감염된 환자의 혈청과의 반응성을 고체상 ELISA를 수행하여 확인하였다. ELISA분석 방법은 다음과 같다.

우선, 코팅 완충액(0.05M 탄산염 완충액, pH 9.6)으로 20㎍/㎖의 농도로 조성된 합성 펩티드들을 희석하여 96-마이크로플레이트의 각 웰에 100 ㎕씩 첨가하였다. 각 플레이트는 실온에서 2시간 또는 4℃의 가습실 내에서 12 내지 16 시간 반응시켜 펩티드를 플레이트에 부착시킨 다음, 수용액을 제거하고 여기에 각 플레이트에 비결합된 부분을 차단하기 위해 1% 소(牛) 혈청 알부민(BSA) 200 ㎕를 첨가 한 후 2시간 동안 반응시켜서 단백질 비결합 부분을 차단시켰다. 다시 0.05% 트윈(Tween) 20이 포함된 PBS(PBST, pH 7.2)로 3회 세척후, 각 합성 펩티드가 코팅 된 마이크로플레이트의 각 웰에 PBS로 1:50이 되게 희석한 혈청 100 ㎕를 첨가하고 2 시간 동안 반응시켰다. 이 때, 음성 대조군은 녹농균에 있어서 기저 저 역가 (basal low titer)를 갖는 건강한 사람의 혈청을 사용하였다. 반응 종료후 다시 동일한 인산염 완충 세척액으로 4 내지 5회 세척하였다. 여기에 2차 항체로서 100㎕의 염소-항 인간 IgG-퍼록시다아제 콘주게이트(goat-anti human IgG-peroxidase conjugate)를 가하여 상온에서 1 시간 동안 반응시킨 후, 동일한 인산염 완충 세척액으로 5회 이상 격렬하게 세척하였다. 여기에 기질로서 시트르산염-인산염 완충액 (0.1 M, pH 5.0)에 오르토-페닐렌디아민디하이드로클로라이드를 0.3 내지 0.4㎎/㎖의 농도로 조정하여 50㎕씩 첨가하고 20분간 차광 하에 반응시킨 후, 1N황산을 50㎕씩 가하여 반응을 정지시켰다. 그 후, 각 반응 용액을 분광 광도계를 이용하여 펩티드와 항체의 결합 활성을 490 ㎚에서 흡광도를 측정하여 결정하였다. 그 결과를 제2도에 나타내었다.

제2도에서 보는 바와 같이, 분석된 15개의 합성 펩티드 중 펩티드 No. 3(서열 확인 번호 2) 및 펩티드 No. 4(서열 확인 번호 4)의 2개의 펩티드만이 특이성을 갖는 반응을 나타내었으며, 펩티드 No. 4는 펩티드 No. 3에 비해 거의 50%의 반응성을 나타내었다.

동일한 고체상 ELISA법에 따라, 본 발명자들이 분리한 공지의 세포 외막 단백질(OMP, CFC-101), 펩티드 No. 3 및 펩티드 No. 4를 항원으로 사용하여 녹농균에 감염된 환자의 혈청과의 결합력을 측정하였다. 이 때 사용한 항원들의 농도는 모두 20 ㎍/㎖이었는데, 인간 항체는 1:30으로 희석하였다. 그 결과를 제3도 및 표1에 나타내었다. 제3도에 있어서, 곡선 a는 OMP이고, b는 펩티드 No. 3이며, c는 펩티드 No. 4이다. 곡선에 있어서 각각의 점은 3 통계점의 평균값을 나타낸다. 하기 표 1은 면역흡수제로서 여러 가지 항원과 녹농균 감염 환자로부터의 혈청과의 면역학적 반응을 나타낸 것이다. 표 1에 있어서, a는 ELISA 단위(A 각 분석시료-A 음성 대조군) / (A 양성 대조군-A 음성 대조군) x 160(여기서, 160은 혈청 희석의 역함수 값이고, A는 490 ㎚에서의 흡광도임)이고, 양성 대조군은 녹농균 감염 환자의 가장 활성이 높은 혈청 (펩티드 No. 3 중에서)이고, 음성 대조군은 녹농균에 대한 가장 낮은 농도의 천연 항체를 갖는 정상 혈액 제공자의 혈청이다. 양성 및 음성 대조군 모두 ELUSA에서 사용되었다. 값은 환자 10명에 대한 통계의 평균±표준 편차로 나타냈다. b는 p 값이고, c는 OMP(Outer Membrane Protein)이다.

제3도 및 표1에서 보는 바와 같이, 사용된 모든 항원들은 강한 반응성이 나타났으나, 그 중에서도 펩티드 No. 3의 흡광도의 값이 혼합 OMP와 유사하게 높은 값을 보여주었으며, 특히 실험에 사용한 서로 다른 9 가지의 인간혈청에 대해서도 동일하게 높은 반응성이 나타났다(표 1). 이 실험 결과는 종전의 알려진 것과는 달리 주면역 에피토프인 동시에 좋은 면역원일 수 있는 펩티드가 펩티드 No. 3의 서열(GAPAVAEVVRVQLDVKFD:서열 확인 번호 2)에 함유되어 있음을 의미한다.

[실시예 3]

아미노산 서열 분석을 통한 녹농균 Opr F의 세포 외막에서 주면역-에피토프의 국부화

녹농균 종의 OprF에 대한 아미노산 서열의 분석은 NCBI BLAST 전자 우편 서비스(E-mail service)를 통하여 새로운 TBLASTX 프로그램인『PDB/SwissProt/PIR/SPUpdate/ GenPept/GPUpdate peptide sequence data libraries』로부터 얻었다. 선별된 펩티드의 분석은『PC/GENE genetic analysis package (Intelligene-tics)』에 포함된 다양한 프로그램을 가지고 IBM 컴퓨터에서 수행하였다. 펩티드 No. 3에 해당하는 18개의 아미노산 서열은『PC/GENE software』를 이용하여 호프 및 우즈(Hopp and woods)의 방법 (P.N.A.S U.S.A. 781, 3824-3828, 1981)으로 분석하였다.

분석 결과, 펩티드 No. 3 중에서 LDVKFD (서열 확인 번호 1)의 서열이 표면 노출 가능성, 친수성이 가장 높은 것으로 나타났다. 주면역 에피토프로서 예측되는 이 부분은 펩티드 No. 3과 펩티드 No. 4에 공통적으로 존재함에도 불구하고, 펩티드 No. 4는 펩티드 No. 3에 비하여 녹농균에 감염된 환자의 혈청 내의 항체와 비교적 낮은 반응성을 나타냈으므로, 이러한 결과는 주면역 에피토프로 추정되는 LDVKFD(서열 확인 번호 1)의 영역이 온전한 세포에서 약하게 표면에 노출되어 있거나 또는 쉽게 접근할 수 없는 선천적인 배결(native configuration)을 가지는 것으로 추측된다. 또한, 세포 외막에 리포-또는 엑소-폴리사카라이드들이 OprF 내의 LDVKFD영역에 항체의 결합을 공간적으로 방해(steric hinderance)하는 것에 기인하는 것으로 추측할 수도 있다. 따라서, 녹농균에 감염된 환자의 혈청 내의 항체는 펩티드 No. 3의 3차 구조에서 LDVKFD(서열 확인 번호 1)영역이 밖으로 돌출되어 있어서, 이 에피토프를 쉽게 인식할 수 있으나, 펩티드 No. 4의 경우에는 이 에피토프가 3차 구조의 내부 부위에 존재하게 되며, 따라서 쉽게 항체와 접촉할 수 없을 것으로 여겨진다.

[실시예 4]

주면역 에피토프의 동정

상기 LDVKFD(서열 확인 번호 1)이 주면역 에피토프임을 증명하기 위하여, 이 부분에 대한 변형된 5개의 펩티드를 합성하고, 이를 녹농균 감염된 인간 환자의 혈청에서 분리한 항체와 반응시켜 실시예 2에 기재된 방법과 동일한 방법으로 반응성을 조사하였다. 합성된 펩티드의 서열은 표 2에 나타내었다.

먼저, 주면역 에피토프로 추정되는 KFD가 AAA로 치환된 경우 (No. 3-1 및 4-1)에는, 펩티드와 인간 혈청 내의 항체와의 반응성은 전혀 나타나지 않거나(No. 3-1), 또는 상당히 감소하는 것으로 나타났다(No. 4-1). 그러나, 펩티드 No. 3의 다른 부분 (No. 3-2: VAE→ AAA; 펩티드 No. 3에서 두 번째로 친수성을 지닌 부분)을 치환한 경우나, LDVKFD가 보존되어 있으면서 펩티드의 길이를 다르게 한 경우(No. 4-2, 및 4-3)에 있어서는 별 영향을 받지 않았다. 또한, 펩티드 No. 3펩티드 No. 4에 해당하는 선열 전부를 컴퓨터 분석으로 분석한 결과, 가장 친수성이 높은 부분은 펩티드 No. 4의 KSKVKE (서열 확인 번호 7)의 서열로 나타났으나, 이 부분이 포함된 펩티드 No. 4, 4-1, 4-3의 사람 혈청에 대한 반응성은 펩티드 No. 3보다 낮게 나타났다. 따라서, 펩티드 No. 3의 LDVKFD(서열 확인 번호 1)이 보다 중요한 주면역 에피토프임을 알 수 있다.

[실시예 5]

주면역 에피토프의 아미노산 서열의 비교 분석

펩티드 No. 3과 펩티드 No. 4에 해당하는 아미노산 서열을 알려진 다양한 슈도모나스 속균(Pseudomonas spp.)의 OprF 서열과 비교하였다. 비교 대상이 되는 슈도모나스 종 및 서열들은 제4도에 나타내었다. 제4도에 있어서 숫자는 성숙 OprF의 위치를 나타낸다. 본 발명자들의 실험 결과에 의해 제안된 중화 에피토프의 후보자는 굵은 선으로 표시하였다.

제4도로부터 알 수 있는 바와 같이, 녹농균 내의 OprF내의 주면역 에피토프 영역(LDVKFD: 서열 확인 번호 1)은 다른 슈도모나스 종의 OprF 내의 일치하는 부분에 있어서 완전하게 보존되어 있었다. 합성 펩티드 No. 3 및 펩티드 No. 4에 해당하는 녹농균의 OprF의 펩티드 서열은 밑줄친 부분이다. 녹농균의 경우, C-말단 영역이 표면에 노출되어 있는데, 노출 된 루프(loop)는 매우 가변 영역(variable region)이라는 것이 밝혀졌다. (참조, J. Bacteriol. 174, 4977-4985, 1992). 특히, 시스테인 도메인이 세균 표면에 노출되어 있다는 보고가 있다 (Mol. Microbiol. 10, 283-292, 1993). 따라서, OprF 내의 주면역 에피토프인 LDVKFD 영역은 세포 외막의 밖으로 노출되어 있을 것으로 추정된다.

[실시예 6]

항원의 제조

합성 펩티드의 항원성을 높이기 위해서 공지의 방법인 펩티드- KLH 커플링을 수행하였다. 구체적인 방법은 다음과 같다. 합성 펩티드를 무균 증류수에 용해시켜서 최종 농도가 10㎎/㎖이 되도록 조정하였다. 300 ㎕ (3 ㎎)의 합성 펩티드에 80 ㎕의 KLH 용액 (50% 글리세롤 용액에 ㎖ 당 125 ㎎을 용해시킴), 520 ㎕의 증류수, 그리고 100 ㎕의 1M 인산나트륨 (pH 7.0)을 마그네틱 바를 사용하여 천천히 섞어 주었다. 여기에 25% 글루타르알레히드를 적절히 희석하여 최종 농도가 21mM이 되도록 제조한 후, 0.5 ㎖을 점적시키면서 혼합하였다. 이 용액을 실온에서 14∼16 시간 동안 반응시켜서 예방 백신으로서 사용하거나, 항체의 제조를 위한 항원으로 사용하기 전까지 -20℃에 보관하였다.

[실시예 7]

능동 면역에 의한 감염 방어 효과 시험

정제한 합성 펩티드에 대한 감염 방어 효과를 알아보기 위하여, 5 주령의 건강한 웅성 ICR 마우스(20∼25 g)를 사용하여 실험을 행하였다. 실시예 6의 방법에 따라 제조된 항원을 매회 150 ㎍/㎏의 용량으로 각 그룹당 20마리씩 2일 간격으로 3회 복강내에 투여하고, 최종 투여 5일 이후에 녹농균 GN11189 (일본국 Episome Institute로부터 구입)를 복강내에 감염시킨 다음 7일간의 생존율을 관찰하였다. 음성 대조군으로 사용된 합성 펩티드는 제1도의 펩티드 No. 10(서열 확인 번호 14)이었으며, 동일한 조건하에서 20마리를 사용하여 실험하였다. 합성 펩티드를 사용하여 면역시킨 후, 마우스에서의 감염 방어 효과에 대한 결과는 표 3에 나타내었다.

상기 표 3에서 알 수 있는 바와 같이, 펩티드 No. 3을 함유한 백신을 사용한 시험군의 경우는 생존율이 100%로서 우수한 감염의 방어 효과를 나타내는 반면, 음성 대조군의 경우의 생존율이 0% 이었다. 이 실험 결과에 의하면, 펩티드 No. 3을 사용한 경우 항원성 및 방어 효과가 없을 것을 추정되는 기존의 보고 [Infect. Immun. 60, pp 3497-3503, 1992]와는 매우 상이한 결과로서 동물 실험을 통한 생존율은 매우 우수한을 보여주고 있다.

[실시예 8]

서로 다른 혈청형의 녹농균에 대한 교차 면역 방어 효과

정제한 합성 펩티드에 대한 교차 감염 방어 효과를 확인하기 위하여 5주령의 건강한 웅성 ICR 마우스(20∼25 g)을 사용하여 실험을 행하였다. 실시예 6의 방법에 따라 제조된 항원을 매회 150 ㎍/㎏의 용량으로 각 그룹당 20마리씩 2일 간격으로 3회 복강내에 투여하고, 최종 투여 5일 이후에, 각각의 서로 다른 7가지의 혈청형에 상응하는 녹농균을 복강내에 감염시킨 다음 7일간의 생존율을 관찰하였다. 음성 대조군으로 사용된 합성 펩티드는 펩티드 No. 10(서열 확인 번호 14)이었으며, 동일한 조건하에서 20마리를 사용하여 실험을 행하였다. 합성 펩티드 No. 3항원을 사용하여 면역시킨 후, 다양한 면역형의 균주들로 감염시킨 마우스의 예방효능 실험 결과는 표 4에 나타내었다. 표 4에서 사용된 녹농균 균주형 F1 내지 F7은 피셔-데블린(Fisher-Devlin)면역형에 따른 것이다(참조: J. Bacteriol. 1969, 98, 835-837).

상기 표 4에서 알 수 있는 바와 같이, 펩티드 No. 3을 함유한 백신을 사용한 시험군의 경우는 생존율이 F1, F2, F3, 및 F6 형의 경우는 100%로서 우수한 감염의 방어 효과를 나타내는 반면, F4, F5, F7 형을 사용한 경우에는 90% 이상의 방어효과를 나타냈다. 그러나, 음성 대조군의 경우(펩티드 No. 10, 서열 확인 번호 14)는 모든 그룹에서 15% 미만의 낮은 생존율을 나타내었다. 따라서, 이 실험 결과에 의하면, 펩티드 No. 3을 포함하는 항원은 다양한 혈청형의 녹농균의 감염을 효과적으로 방어할 수 있는 백신임을 알 수 있다.

[실시예 9]

펩티드 함유 백신의 독성 실험

실시예 6에서 제조된 합성 펩티드를 함유하는 백신을 녹농균 감염에 대한 예방용으로 사용하기 위해서는 다른 혈청형의 녹농균에 대한 교차 면역 방어 효과뿐만 아니라, 이 백신 제품의 안전성도 보장되어야 한다.

본 발명의 백신은 체중이 20∼25 g인 ICR계 웅성 마우스 및 스프라그-다우리(Sprague-Dawley, SD) 쥐를 실험 동물로 사용하여 근육 투여후 그 독성을 시험하였다. 백신의 투여용량의 설정은 약물의 용해도 및 예상 임상 적용량을 고려하여 최고 용량군을 25 ㎎/㎏으로 하고, 공비를 0.5로 하여 중상(12.5 ㎎/㎏)를 설정하였고, 투여 액량은 모든 개체에서 10 ㎖/㎏이 되게 하였으며, 일주일 동안 관찰하였다. 그 결과를 다음의 표 5에 나타냈다.

상기 표 5로부터 알 수 있는 바와 같이, 마우스 및 쥐에 백신을 근육 투여에 의한 독성 시험을 실시한 결과, 모든 투여군(최고 용량: 25㎎/㎏) 및 대조군에서 폐사예 및 특이 증상이 관찰되지 않았다. 또한, 체중 변화에 있어서도 대조군과 백신 투여군 사이에 유의성 있는 차이는 보이지 않았다.

따라서, 본 시험의 모든 조건에서 LD은 25㎎/㎏ 이상으로 이는 예상 임상 사용 평균 용량의 약 1500 배로 매우 안전한 물질임을 확인하였다.

[실시예 10]

합성 펩티드에 대한 마우스 항체 제조

실시예 6에서 제조된 각 합성 펩티드 에 KLH가 커플링된 항원을 가지고 항혈청을 얻기 위해 5주령의 건강한 옹성 ICR 마우스 (20∼25 g)를 면역시켰다. 10mM 인산염 완층 용액(pH 7.2)로 적절히 희석하여 마우스 1마리 당 1 ㎖(0.5 ㎎/㎏)씩 1주일 간격으로 2회 복강내 투여하고 채혈하기 1주일 전에 다시 1 ㎖(0.25 ㎎/㎏)를 정맥내 주사하였다. 7일 간격으로 3회 투여후, 일주일 후에 채혈하여 항체가 충분히 생성되었는지의 여부를 ELISA로 측정하여 확인후 심장으로부터 채혈하여 얻어진 항혈청을 분리한 후, 생화학적 또는 면역학적 분석에 사용할 때까지 -20℃에서 보관하였다.

[실시예 11]

합성 펩티드에 대한 토끼 항체의 제조

실시예 6에서 제조된 각 합성 펩티드에 KLH가 커플링된 항원을 가지고 항혈청을 얻기 위해 토끼를 면역시켰다. 토끼는 체중이 2.5 ㎏인 3개월된 웅성 일본화이트 토끼(Japanese white rabbit)를 사용하였다. 10 mM 인산염 완충 용액 (pH 7.2)으로 적절히 희석하여 토끼 1마리당 1 ㎖(100 ㎍/㎏) 씩 1주일 간격으로 3회 피하 투여하고 4주 경과 후, 다량의 항체를 얻기 위하여 채혈하기 1주일 전에 다시 1 ㎖(50 ㎍/㎏)를 정맥내 주사하였다. 최종 투여 후, 채혈하여 항체가 충분히 생성되었는지의 여부를 ELISA로 측정하여 확인한 다음, 심장으로부터 채혈하여 얻어진 항혈청을 분리한 후, 생화학적 또는 면역학적 분석에 사용할 때까지 -20℃에서 보관하였다.

[실시예 12]

수동 면역에 의한 감염 방어 효과 시험

실시예 10 및 11에서 얻어진 합성 펩티드에 대한 마우스 및 토끼의 항혈청을 가지고 수동 면역에 의한 치료제로서의 효과를 알아보기 위해 5주령의 건강한 웅성 ICR 마우스 (체중: 20∼25 g)을 사용하여 실험을 행하였다. 각 합성 펩티드 항원에 대한 항혈청을 0.3 ㎖의 용량으로 각 그룹 당 20마리씩 복강내에 투여하고, 2 시간 후에 공격균인 녹농균 GN11189를 복강내에 감염시킨 다음 7일간의 생존율을 관찰하였다. 음성 대조군으로 사용된 합성 펩티드는 No. 10에 대한 항혈청을 사용하였고, 동일한 조건하에서 20마리를 사용하여 실험하였다. 합성 펩티드 백신에 대한 항-토끼 및 항-마우스 혈청의 수동 면역에 의한 치료 효능에 대한 결과를 표 6에 나타내었다.

상기 표6에서 알 수 있는 바와 같이, 펩티드 No. 3에 대한 항혈청을 사용한 시험군의 경우 생존율이 90% (마우스 항체) 및 80% (토끼 항체)로서 우수한 치료효과를 나타낸 반면, 대조군인 펩티드 No. 10을 사용한 경우에는 생존율이 모두 10% 이하로 낮게 나타났다. 이 실험 결과에 의하면, 펩티드 No. 3을 사용한 경우에 녹농균에 대한 치료 효과는 동물 실험을 통하여 생존율이 매우 우수한 것으로 밝혀 졌다. 따라서, 상기 펩티드 함유 서열은 치료 율이 높은 유효한 항체 생산용 항원으로서 사용될 수 있음을 나타낸다.

[실시예 13]

면역 글로불린의 제제화

상기 실시예 10 및 11에서 제조된 녹농균 면역 글로불린을 체중 ㎏ 당 1 내지 100 ㎎ 씩 투여할 수 있도록 제약학상 허용되는 후술하는 적합한 담체를 사용하여 제제화하였다. 제제화된 면역 글로불린을 녹농균 감염증이 유발된 생쥐에 투여하여 담체의 종류에 따른 면역글로불린을 녹농균 감염증이 유발된 생쥐에 투여하여 담체의 종류에 따른 면역 글로불린의 유효성 차이를 관찰하였다. 그 결과, 액상 제제의 경우에는 담체로 주사용 생리식염수 또는 인산염 완충액을 사용한 면역 글로불린 제제가 유효성이 나타났으며, 동결 건조된 제제의 경우에는 만니톨, 사카로오스, 락토오스를 담체로 사용한 경우에 높은 유효성을 나타내었다. 반면에, 동결 건조 제제의 경우, 인체 알부민을 병용한 경우에는 유효성이 오히려 낮았으며, 액상 제제로는 수산화알루미늄을 사용한 경우에 그 효과가 떨어졌다. 약제 학적 담체에 따른 녹농균 면역글로불린의 유효성은 다음의 표 7에 나타낸다.

[실시예 14]

제제화된 면역 글로불린의 유효성 실험

실시예 13에서 유효성이 높은 것으로 확인된 인산염 완충 제제를 사용하여 제제화된 면역 글로불린의 열상, 화상, 외상 등에서의 2차 피부 감염에 대한 예방 및 치료제로서의 유효성을 확인하였다. 공지의 화상 시험 방법 [J. Infect. Dis. 131, 688-691, 1975]으로 마우스에 화상을 유도한 후, 인산염 완충액 ㎖당 녹농균 면역 글로불린 0.5 내지 1 ㎎를 함유하는 액상 제제로 분무제를 제형화하여 시험군의 생쥐의 화상 부위에 분무 처리하여 그 효과를 비처리군에서의 상태와 비교하여 판정하였다. 화상 시험의 결과는 다음의 표 8에 나타냈다.

상기 표 8로부터 알 수 있는 바와 같이, 면역 글로불린-인산염 완충액 분무제로 분무 처리한 마우스 집단에서는 면역글로불린 비처리 군에 비해 월등히 우수한 생존 능력을 나타내었다. 따라서 본 발명에 따른 녹농균 면역 글로불린 함유제제는 녹농균의 감염증에 대해 우수한 예방 및 치료 효과를 나타낸다는 사실을 알 수 있다.

서열표

(1) 일반적 정보:

(i) 출원인: 제일제당 주식회사

(ii) 주소: 서울 특별시 중구 남대문로 5가 500 번지

(iii) 발명의 명칭: 합성펩티드를 함유하는 녹농균 백신 및 이것으로부터 생산된 치료제

(iv) 서열 수: 14

(v) 컴퓨터판독형:

(A) 매체 형태: 플로피 디스크

(B) 컴퓨터: IBM PC 상용성

(C) 운영 체계: PC-DOS/MS-DOS

(D) 소프트웨어 :PatentIn Release #1.0, Version #1.25

(2) 서열 확인 번호 1에 대한 정보:

(i) 서열 특성:

(A) 길이: 6아미노산

(B) 형태: 아미노산

(D) 토폴로지: 직쇄

(ii) 분자형태: 펩티드

(xi) 서열 설명: 서열 확인 번호 1

Leu Asp Val Lys Phe Asp

1 5

(2) 서열 확인 번호 2에 대한 정보:

(i) 서열 특성:

(A) 길이: 18아미노산

(B) 형태: 아미노산

(D) 토폴로지: 직쇄

(ii) 분자형태: 펩티드

(xi) 서열 설명: 서열 확인 번호 2

Gly Ala Pro Ala Val Ala Glu Val Val Arg Val Gln Leu Asp Val Lys

1 5 10 15

Phe Asp

(2) 서열 확인 번호 3에 대한 정보:

(i) 서열 특성:

(A) 길이: 18아미노산

(B) 형태: 아미노산

(D) 토폴로지: 직쇄

(ii) 분자 형태: 펩티드

(xi) 서열 설명: 서열 확인 번호 3

Gly Ala Pro Ala Ala Ala Ala Val Val Arg Val Gln Leu Asp Val Lys

1 5 10 15

Phe Asp

(2) 서열 확인 번호 4에 대한 정보:

(i) 서열 특성:

(A) 길이: 18아미노산

(B) 형태: 아미노산

(D) 토폴로지: 직쇄

(ii) 분자형태: 펩티드

(xi) 서열 설명: 서열 확인 번호 4

Arg Val Gln Leu Asp Val Lys Phe Asp Phe Asp Lys Ser Lys Val Lys

1 5 10 15

Glu Asn

(2) 서열 확인 번호 5에 대한 정보:

(i) 서열 특성:

(A) 길이: 12아미노산

(B) 형태: 아미노산

(D) 토폴로지: 직쇄

(ii) 분자형태: 펩티드

(xi) 서열 설명: 서열 확인 번호 5

Val Arg Val Gln Leu Asp Val Lys Phe Asp Phe Asp

1 5 10

(2) 서열 확인 번호 6에 대한 정보:

(i) 서열 특성:

(A) 길이: 23아미노산

(B) 형태: 아미노산

(D) 토폴로지: 직쇄

(ii) 분자형태: 펩티드

(xi) 서열 설명: 서열 확인 번호 6

Ala Val Ala Glu Val Val Arg Val Gln Leu Asp Val Lys Phe Asp Phe

1 5 10 15

Asp Lys Ser Lys Val Lys Glu

20

(2) 서열 확인 번호 7에 대한 정보:

(i) 서열 특성:

(A) 길이: 6아미노산

(B) 형태: 아미노산

(D) 토폴로지: 직쇄

(ii) 분자형태: 펩티드

(xi) 서열 설명: 서열 확인 번호 7

lys Ser Lys Val Lys Glu

1 5

(2) 서열 확인 번호 8에 대한 정보:

(i) 서열 특성:

(A) 길이: 14아미노산

(B) 형태: 아미노산

(D) 토폴로지: 직쇄

(ii) 분자형태: 펩티드

(xi) 서열 설명: 서열 확인 번호 8

Lys Phe Asp Phe Asp Lys Ser Lys Val Lys Glu Asn Ser Tyr

1 5 10

(2) 서열 확인 번호 9에 대한 정보:

(i) 서열 특성:

(A) 길이: 14아미노산

(B) 형태: 아미노산

(D) 토폴로지: 직쇄

(ii) 분자형태: 펩티드

(xi) 서열 설명: 서열 확인 번호 9

Thr Asp Ala Tyr Asn Gln Lys Leu Ser Glu Arg Arg Ala Asn

1 5 10

(2) 서열 확인 번호 10에 대한 정보:

(i) 서열 특성:

(A) 길이: 14아미노산

(B) 형태: 아미노산

(D) 토폴로지: 직쇄

(ii) 분자형태: 텝티드

(xi) 서열 설명: 서열 확인 번호 10

Asn Ala Thr Ala Glu Gly Arg Ala Ile Asn Arg Arg Val Glu

1 5 10

(2) 서열 확인 번호 11에 대한 정보:

(i) 서열 특성:

(A) 길이: 27아미노산

(B) 형태: 아미노산

(D) 토폴로지: 직쇄

(ii) 분자형태: 펩티드

(xi) 서열 설명: 서열 확인 번호 11

Gly Ala Pro Ala Val Ala Glu Val Val Arg Val Gln Leu Asp Val Lys

1 5 10 15

Phe Asp Phe Asp Lys Ser Lys Val Lys Glu Asn

20 25

(2) 서열 확인 번호 12에 대한 정보:

(i) 서열 특성:

(A) 길이: 18아미노산

(B) 형태: 아미노산

(D) 토폴로지: 직쇄

(ii) 분자형태: 펩티드

(xi) 서열 설명: 서열 확인 번호 12

Gly Ala Pro Ala Val Ala Glu Val Val Arg Val Gln Leu Asp Val Ala

1 5 10 15

Ala Ala

(2) 서열 확인 번호 13에 대한 정보:

(i) 서열 특성:

(A) 길이: 18아미노산

(B) 형태: 아미노산

(D) 토폴로지: 직쇄

(ii) 분자형태: 펩티드

(xi) 서열 설명: 서열 확인 번호 13

Arg Val Gln Leu Asp Val Ala Ala Ala Phe Asp Lys Ser Lys Val Lys

1 5 10 15

Glu Asn

(2) 서열 확인 번호 14에 대한 정보:

(i) 서열 특성:

(A) 길이: 18아미노산

(B) 형태: 아미노산

(D) 토폴로지: 직쇄

(ii) 분자형태: 펩티드

(xi) 서열 설명: 서열 확인 번호 14

Lys Leu Ser Glu Arg Arg Ala Asn Ala Val Arg Asp Val Leu Val Asn

1 5 10 15

Glu Tyr

Claims (5)

1. 하기 서열 확인 번호 1의 아미노산 서열을 필수적으로 함유하는 펩티드를 주면역 에피토프로서 함유하는 녹농균 감염증의 예방용 백신.

   LDVKFD---(서열 확인 번호 1)
2. 제1항에 있어서, 상기 서열 확인 번호 1의 아미노산 서열을 필수적으로 함유하는 펩티드가 하기 서열 확인 번호 2 내지 6의 아미노산 서열을 갖는 펩티드 중에서 선택되는 것인 백신.

   GAPAVAEVVRVQLDVKFD---(서열 확인 번호 2)

   GAPAAAAVVRVQLDVKFD---(서열 확인 번호 3)

   RVQLDVKFDFDKSKVKEN---(서열 확인 번호 4)

   VRVQLDVKFDFD---(서열 확인 번호 5)

   AVAEVVRVQLDVKFDFDKSKVKE---(서열 확인 번호 6)
3. 천연 감마글로불린으로 이루어지고, 상기 제1항 또는 제2항의 서열 확인 번호 1내지 서열 확인 번호 6의 아미노산 서열을 갖는 펩티드를 향원으로서 사용하여 얻은 항체.
4. 제3항의 항체를 함유하는 녹농균 감염증의 치료제.
5. 제1항 또는 제2항의 서열 확인 번호 1 내지 6 중에서 선택된 어느 하나의 아미노산 서열로 이루어지는 녹농균 감염 예방용 백신 및 치료용 항체의 제조에 사용하기 위한 펩티드.