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JPWO2000031132A1 - 新規ポリペプチド - Google Patents

新規ポリペプチド

Info

Publication number
JPWO2000031132A1
JPWO2000031132A1 JP2000-583958A JP2000583958A JPWO2000031132A1 JP WO2000031132 A1 JPWO2000031132 A1 JP WO2000031132A1 JP 2000583958 A JP2000583958 A JP 2000583958A JP WO2000031132 A1 JPWO2000031132 A1 JP WO2000031132A1
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
polypeptide
amino acid
jnk3
oligonucleotide
dna
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
JP2000-583958A
Other languages
English (en)
Inventor
通朗 市村
了 廣瀬
克次 善岡
Original Assignee
協和醗酵工業株式会社
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 協和醗酵工業株式会社 filed Critical 協和醗酵工業株式会社
Publication of JPWO2000031132A1 publication Critical patent/JPWO2000031132A1/ja
Pending legal-status Critical Current

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Abstract

(57)【要約】 【課題】ＪＮＫ３カスケードと関連した疾患の診断薬、予防薬、治療薬を提供する。 【解決手段】 本発明によれば、ＪＮＫ３に結合する新規ポリペプチドＪＳＡＰ、該ポリペプチドの製造法、該ポリペプチドをコードするＤＮＡ、該ＤＮＡを組み込んで得られる組換え体ベクター、該組換え体ベクターを保有する形質転換体、該ポリペプチドを認識する抗体、該抗体を用いる本発明のポリペプチドの定量法および免疫染色法、該ポリペプチドを用いたスクリーニング法、および該ポリペプチド、該ＤＮＡまたは該抗体を用いたＪＮＫ３カスケードと関連した疾患の診断薬、予防薬、治療薬を提供することができる。

Description

【発明の詳細な説明】技術分野 本発明は、ｃ−Ｊｕｎ Ｎ−ｔｅｒｍｉｎａｌ ｋｉｎａｓｅ（ＪＮＫ）のア
イソザイムの一つであるＪＮＫ３に結合する新規ポリペプチド、該ポリペプチド
をコードするＤＮＡ、該ＤＮＡを含むベクター、該ベクターで形質転換された形
質転換体および該ポリペプチドの製造方法に関する。 また、該ポリペプチドを認識する抗体、該抗体を産生する微生物、動物細胞又
は動物、該ポリペプチドもしくはその一部又はそれらを発現した微生物もしくは
動物細胞等を利用したＪＮＫ３シグナル伝達の阻害活性を有する化合物を探索す
る方法および細胞を利用した該ポリペプチドの遺伝子発現を調節する化合物を探
索する方法に関する。背景技術 細胞内情報伝達分子として重要な役割を果たしているｍｉｔｏｇｅｎ−ａｃｔ
ｉｖａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ（ＭＡＰＫ）によるカスケードは
酵母からヒトに至るまで、真核生物に普遍的に存在する細胞内シグナル伝達経路
である。 脊椎動物では、ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｓｉｇｎａｌ−ｒｅｇｕｌａｔ
ｅｄ ｋｉｎａｓｅ（ＥＲＫ）、ｐ３８、ＪＮＫ／ＳＡＰＫ（ｃ−Ｊｕｎ ａｍ
ｉｎｏ−ｔｅｒｍｉｎａｌ ｋｉｎａｓｅ／ｓｔｒｅｓｓ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ
ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ）の３種類のＭＡＰＫ、およびそれらの活性化
因子が多数同定され、機能的に異なるさまざまなＭＡＰＫ経路の存在が明らかに
なってきた。 Ｔｕｍｏｒ ｎｅｃｒｏｓｉｓ ｆａｃｔｏｒ−α（ＴＮＦ−α）、ｉｎｔｅ
ｒｌｅｕｋｉｎ−１（ＩＬ−１）、ｅｐｉｄｅｒｍａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃ
ｔｏｒ（ＥＧＦ）、ｅｎｄｏｔｏｘｉｃ ｌｉｐｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄ
ｅ（ＬＰＳ）、ｈｅａｔ ｓｈｏｃｋ、ｕｌｔｒａｖｉｏｌｅｔ ｌｉｇｈｔ（
ＵＶ），Ｘ−ｒａｙ等の細胞外の種々のストレス要因により、ＭＡＰＫのうちＪ
ＮＫが活性化され、該活性化によりアポトーシス（細胞死）が誘発されると考え
られている〔Ｓｃｉｅｎｃｅ，２７０，１３２６（１９９５）〕。 即ち、ストレスにさらされた細胞において、該ストレスシグナルがｓｍａｌｌ
Ｇ−ｐｒｏｔｅｉｎ（Ｒｈｏ、Ｒａｓ等）に伝わることにより、ＭＡＰＫ ｋ
ｉｎａｓｅ ｋｉｎａｓｅ（ＭＡＰＫＫＫ）の一つであるＭＥＫＫ１（ＭＡＰＫ
ｋｉｎａｓｅ ｋｉｎａｓｅ １）が活性化され、ＭＡＰＫ ｋｉｎａｓｅ（
ＭＡＰＫＫ）の一つであるＳＥＫ１（もしくはＭＫＫ４とも呼ばれる。）をリン
酸化し、ＳＥＫ１を活性化する。該活性化されたＳＥＫ１がＪＮＫ（ＭＡＰＫ）
をリン酸化し、ＪＮＫが活性化される。活性化されたＪＮＫが細胞の核内の転写
因子の一つであるｃ−Ｊｕｎをリン酸化し、ＡＰ−１、ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ
ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ ２（ＡＴＦ２）等の関与の元に、
リン酸化されたｃ−Ｊｕｎの転写活性が亢進され、アポトーシスが誘発されると
推定されている。しかしながら、この核内のアポトーシスへの過程に関しては、
ほとんど不明である。 神経細胞であるＰＣ１２細胞を、神経細胞のタンパク性栄養因子であるｎｅｒ
ｖｅ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ（ＮＧＦ）含有培地で培養し、ＮＧＦを除い
てさらに培養を続けるとアポトーシスが誘発される。該アポトーシスの誘発にお
いてＪＮＫ活性の上昇が認められることが報告されている〔Ｓｃｉｅｎｃｅ，２
７０，１３２６（１９９５）〕。 ３種類のＪＮＫ（ＪＮＫ１、ＪＮＫ２、ＪＮＫ３）のうち、ＪＮＫ３は脳で特
に高い発現を示すことが知られている〔ＥＭＢＯ Ｊ．，１５，２７６０（１９
９６）〕。 ＪＮＫ３分子のノックアウトマウスは、興奮性アミノ酸レセプターアゴニスト
であるカイニン酸による発作に対する耐性が確認され、野生型のマウスで見られ
たカイニン酸による海馬ＣＡ３領域でのアポトーシスが見られなかった〔Ｎａｔ
ｕｒｅ，３８９，８６５（１９９７）〕。このことより、ＪＮＫ３分子のノック
アウトによる神経保護作用は、ＪＮＫ３経路の消失によるものと考えられている
。 神経変性疾患において、アポトーシスによる神経細胞死が報告されている。即
ち、アルツハイマー病患者の脳の海馬において、アポトーシスを起こして死滅し
た神経細胞が多く見られる〔Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ，
１３３，２２５（１９９５）〕、アルツハイマー病患者の脳において、ＤＮＡの
断片化や、アポトーシス特有の核の変化が観察されている〔Ｎｅｕｒｏｒｅｐｏ
ｒｔ，５，２５２９（１９９４）、Ｎｅｕｒｏｒｅｐｏｒｔ，６，１０５３（１
９９５）〕、パーキンソン病において、黒質神経細胞のアポトーシスが観察され
ている〔Ｊ．Ｎｅｕｒｏｌ．Ｓｃｉ．，１３７，１２０（１９９６）〕等の報告
がある。 ＪＮＫ３が脳において高い発現を示すのに対し、ＪＮＫ１およびＪＮＫ２に関
しては、ほとんどの組織で発現している。ＪＮＫ１およびＪＮＫ２のリン酸化基
質としては、ｃ−Ｊｕｎタンパク質、ＡＴＦ２、Ｅｌｋ−１（遺伝子発現を制御
する転写因子の一つ）が考えられている〔Ｎａｔｕｒｅ，３８９，８６５（１９
９７）〕。 ＪＮＫ３は上記リン酸化基質に結合はするが、ＪＮＫ１、ＪＮＫ２に比較する
と、結合は弱い〔ＥＭＢＯ Ｊ．，１５，２７６０（１９９６）〕ため、これら
が真の哺乳動物におけるリン酸化基質であるかどうかについては不明である。 ＪＮＫ３のリン酸化酵素活性は基質としてｃ−Ｊｕｎタンパク質を用いて見る
ことしかできず、ＪＮＫ３と相互作用すると考えられる、哺乳動物における結合
タンパク質についてもほとんど報告がなかったため、ＪＮＫ３と相互作用し、Ｊ
ＮＫ３の機能を調節しているタンパク質を用いた生化学反応はほとんど調べられ
ていない。 上記リン酸化基質以外にＪＮＫ３と結合するとされるポリペプチドとして、最
近ＪＮＫ／ＳＡＰＫ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ（ＪＳＡＰ１ａ）
が報告された〔１９９７年日本分子生物学会（１２月）〕。 ＪＳＡＰ１ａは、後述するようにＪＮＫ３経路のスキャフォルド（ｓｃａｆｆ
ｏｌｄ）タンパク質として機能していることが推定されている。スキャフォルド
タンパク質としては、ＪＮＫ１およびＪＮＫ２を結合する、ＪＩＰ−１（ＪＮＫ
ｉｎｔｅｒａｃｔｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ−１）が知られている〔Ｓｃｉｅｎ
ｃｅ，２８１，１６７１（１９９８）〕。また、ＪＩＰ−１の５５７番目のアミ
ノ酸残基の後に４７アミノ酸が挿入された配列を有するバリアントＪＩＰ−１ｂ
も知られている。ＪＩＰ−１およびＪＩＰ−１ｂをコードするｃＤＮＡ配列はＧ
ｅｎＢａｎｋ ｄａｔａ ｂａｓｅに登録されている（ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎ
ｕｍｂｅｒはそれぞれＡＦ００３１１５、ＡＦ０５４６１１）。 更に、酵母Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの接合フェロ
モンのシグナル伝達経路において、ＳＴＥ５タンパク質がスキャフォルドタンパ
ク質として機能していることが知られている。 即ち、ＳＴＥ５タンパク質は、フェロモンがそのレセプターに結合したシグナ
ルを伝達する一連のＭＡＰ−ｋｉｎａｓｅ経路にある、ＳＴＥ１１（ＭＡＰＫＫ
Ｋ）、ＳＴＥ７（ＭＡＰＫＫ）およびＦＵＳ／ＫＳＳ１（ＭＡＰＫ）のすべての
ｋｉｎａｓｅと結合し、そのシグナルを効率よく伝達する機能を有するスキャフ
ォルドタンパク質である〔Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ，８，３１３（１９９４）、Ｃｅ
ｌｌ，７８，４９９（１９９４）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ
．Ｓ．Ａ．，９１，７７６２（１９９４）〕。発明の開示 本発明は、ストレスやアポトーシスを誘導するシグナルに応答して活性化され
るＪＮＫ３カスケード上のＪＮＫ３に結合する新規ポリペプチド、該新規ポリペ
プチドをコードするＤＮＡ、該ポリペプチドを認識する抗体などを利用し、アル
ツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病、多発性硬化症等の神経変性疾
患、筋萎縮性側索硬化症等の筋萎縮性疾患、虚血性疾患、脳卒中時の脳障害、精
神分裂病、うつ病、てんかん、各種免疫、炎症性疾患の予防薬、治療薬を提供す
ることを目的とする。 細胞のアポトーシスを起こすメカニズムの一つとしては、ＪＮＫカスケードの
活性化が考えられる。一方、アルツハイマー病、あるいはパーキンソン病などの
神経変性疾患においては、その細胞死のメカニズムとしてアポトーシスがあげら
れる。 したがって、脳で特に高い発現をしているＪＮＫ３経路を阻害、遮断すること
ができれば、これら神経変性疾患の治療薬となり得、ＪＮＫ３経路を選択的に阻
害、遮断できる薬剤は副作用の少ない治療薬としての可能性を有しているとの考
えの基に鋭意検討を行い、本発明を完成するに至った。 即ち、本発明は以下の（１）〜（３９）の発明に関する。 （１） 配列番号１０〜１６のいずれか１つに記載のアミノ酸配列から選ばれる
アミノ酸配列からなるポリペプチド。 （２） 配列番号１４〜１６のいずれか１つに記載のアミノ酸配列から選ばれる
アミノ酸配列において１以上のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ
酸配列からなり、かつＪＮＫ３と結合することのできるポリペプチド。 上記において、欠失、置換もしくは付加されるアミノ酸の数は特に限定されな
いが、１個から数十個、特に１個から数個のアミノ酸であることが好ましい。ま
た、欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチドがもとの
ポリペプチドと同様にＪＮＫ３と結合することができるためには、もとのポリペ
プチドのアミノ酸配列と少なくとも６０％以上、通常は８０％以上、特に９５％
以上の相同性を有していることが好ましい。以下、本明細書において記載された
、欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチドは同様の定
義に基づくポリペプチドを意味する。 アミノ酸の欠失、置換若しくは付加は、出願前周知技術である部位特異的変異
誘発法により実施することができ、具体的には、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎ
ｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉ
ｏｎ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅ
ｓｓ（１９８９）（以下、モレキュラー クローニング 第２版と略す）、Ｃｕ
ｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ
，Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ １〜３８，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ（１
９８７−１９９７）（以下、カレント プロトコル イン モレキュラ バイオ
ロジーと略す）、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１０，６４
８７（１９８２）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７９，６
４０９（１９８２）、Ｇｅｎｅ，３４，３１５（１９８５）、Ｎｕｃｌｅｉｃ
Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１３，４４３１（１９８５）、Ｐｒｏｃ．Ｎａ
ｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８２，４８８（１９８５）、Ｐｒｏｃ．Ｎａ
ｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８１，５６６２（１９８４）、Ｓｃｉｅｎｃ
ｅ，２２４，１４３１（１９８４）、ＰＣＴ ＷＯ８５／００８１７（１９８５
）、Ｎａｔｕｒｅ，３１６，６０１（１９８５）等に記載の方法に準じて行うこ
とができる。 （３） 上記（１）または（２）記載のポリペプチドをコードするＤＮＡ。 （４） 配列番号２〜８のいずれか１つに記載の塩基配列から選ばれる塩基配列
からなるＤＮＡ。 （５） 配列番号６〜８のいずれか１つに記載の塩基配列からなるＤＮＡとスト
リンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつＪＮＫ３と結合することのでき
るポリペプチドをコードするＤＮＡ。 上記の「ストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつＪＮＫ３と結合
することのできるポリペプチドをコードするＤＮＡ」とは、上記（３）または（
４）記載のＤＮＡをプローブとして、コロニー・ハイブリダイゼーション法、プ
ラーク・ハイブリダイゼーション法あるいはサザン・ブロット・ハイブリダイゼ
ーション法等を用いることにより得られるＤＮＡを意味し、具体的には、コロニ
ーあるいはプラーク由来のＤＮＡを固定化したフィルターを用いて、０．７〜１
．０ＭのＮａＣｌ存在下、６５℃でハイブリダイゼーションを行った後、０．１
〜２倍濃度のＳＳＣ（ｓａｌｉｎｅ−ｓｏｄｉｕｍ ｃｉｔｒａｔｅ）溶液（１
倍濃度のＳＳＣ溶液の組成は、１５０ｍＭ 塩化ナトリウム、１５ｍＭ クエン
酸ナトリウムよりなる）を用い、６５℃条件下でフィルターを洗浄することによ
り同定できるＤＮＡをあげることができる。 ハイブリダイゼーションは、モレキュラー クローニング 第２版、カレント
プロトコル イン モレキュラ バイオロジー、ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ １
：Ｃｏｒｅ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃ
ｈ，Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐ
ｒｅｓｓ（１９９５）等の実験書に記載されている方法に準じて行うことができ
る。 ハイブリダイズ可能なＤＮＡとして具体的には、ＢＬＡＳＴ〔Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂ
ｉｏｌ．，２１５，４０３（１９９０）〕やＦＡＳＴ〔Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ
Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，１８３，６３−６９〕等を用いて計算したときに、配列
番号１〜８で表される塩基配列と少なくとも８０％以上の相同性を有するＤＮＡ
、好ましくは９５％以上の相同性を有するＤＮＡをあげることができる。 （６） 上記（３）〜（５）のいずれか１つに記載のＤＮＡをベクターに組み込
んで得られる組換え体ＤＮＡ。 （７） 組換え体ＤＮＡが、プラスミドｐｃＤＮＡ３−Ｓ−ＪＳＡＰ１ｂ、ｐｃ
ＤＮＡ３−Ｓ−ＪＳＡＰ１ｃ、ｐｃＤＮＡ３−Ｓ−ＪＳＡＰ４、ｐＧＡＤ１０−
ＪＳＡＰ５およびｐｃＤＮＡ３−Ｈｉｓ−Ｓ−ＪＳＡＰ５から選ばれる組換え体
ＤＮＡである、上記（６）の組換え体ＤＮＡ。 （８） 上記（６）または（７）の組換え体ＤＮＡを保有する形質転換体。 （９） 形質転換体が、微生物、動物細胞、植物細胞および昆虫細胞から選ばれ
る形質転換体である、上記（８）の形質転換体。 （１０） 微生物が、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属に属する微生物である、上記（
９）の形質転換体。 （１１） Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属に属する微生物が、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉ
ａ ｃｏｌｉ ＪＳＡＰ１ｂ／ｐｃＤＮＡ３（ＦＥＲＭ ＢＰ−６５６７）、Ｅ
ｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＪＳＡＰ１ｃ／ｐｃＤＮＡ３（ＦＥＲＭ Ｂ
Ｐ−６５６８）、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＪＳＡＰ４／ｐｃＤＮＡ
３（ＦＥＲＭ ＢＰ−６５６９）、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＪＳＡ
Ｐ５／ｐＧＡＤ１０（ＦＥＲＭ ＢＰ−６５７０）およびＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉ
ａ ｃｏｌｉ ＪＳＡＰ５／ｐｃＤＮＡ３（ＦＥＲＭ ＢＰ−６９２８）から選
ばれる微生物である、上記（１０）の形質転換体。 （１２） 上記（８）〜（１１）のいずれかに記載の形質転換体を培地に培養し
、培養物中に上記（１）または（２）記載のポリペプチドを生成蓄積させ、該培
養物から該ポリペプチドを採取することを特徴とする、上記（１）または（２）
のポリペプチドの製造方法。 （１３） 上記（３）〜（５）および配列番号５記載の塩基配列からなるＤＮＡ
のいずれか１つに記載のＤＮＡの有する塩基配列中の連続した５〜６０塩基と同
じ配列を有するオリゴヌクレオチド、該オリゴヌクレオチドと相補的な配列を有
するオリゴヌクレオチド、およびこれらオリゴヌクレオチドの誘導体オリゴヌク
レオチドから選ばれるオリゴヌクレオチド。 （１４） 誘導体オリゴヌクレオチドが、オリゴヌクレオチド中のリン酸ジエス
テル結合がホスフォロチオエート結合に変換された誘導体オリゴヌクレオチド、
オリゴヌクレオチド中のリン酸ジエステル結合がＮ３’−Ｐ５’ホスフォアミデ
ート結合に変換された誘導体オリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチド中のリボ
ースとリン酸ジエステル結合がペプチド核酸結合に変換された誘導体オリゴヌク
レオチド、オリゴヌクレオチド中のウラシルがＣ−５プロピニルウラシルで置換
された誘導体オリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチド中のウラシルがＣ−５チ
アゾールウラシルで置換された誘導体オリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチド
中のシトシンがＣ−５プロピニルシトシンで置換された誘導体オリゴヌクレオチ
ド、オリゴヌクレオチド中のシトシンがフェノキサジン修飾シトシン（ｐｈｅｎ
ｏｘａｚｉｎｅ−ｍｏｄｉｆｉｅｄ ｃｙｔｏｓｉｎｅ）で置換された誘導体オ
リゴヌクレオチド、ＤＮＡ中のリボースが２’−Ｏ−プロピルリボースで置換さ
れた誘導体オリゴヌクレオチドおよびオリゴヌクレオチド中のリボースが２’−
メトキシエトキシリボースで置換された誘導体オリゴヌクレオチドから選ばれる
誘導体オリゴヌクレオチドである、上記（１３）のオリゴヌクレオチド。 （１５） 上記（１３）または（１４）のオリゴヌクレオチドを用い、上記（１
）または（２）のポリペプチドをコードするｍＲＮＡを検出する方法。 （１６） 上記（１３）または（１４）のオリゴヌクレオチドを用い、上記（１
）または（２）のポリペプチドの発現を抑制する方法。 （１７） 上記（１）または（２）のポリペプチドを認識する抗体。 （１８） 上記（１７）の抗体を用いることを特徴とする、上記（１）または（
２）のポリペプチドの免疫学的検出法。 （１９） 上記（１７）の抗体を用いることを特徴とする、上記（１）または（
２）のポリペプチドの免疫組織染色法。 （２０） 上記（１７）の抗体を含有する、免疫組織染色剤。 （２１） 配列番号９〜１６のいずれか１つに記載のアミノ酸配列から選ばれる
アミノ酸配列からなるポリペプチドまたは配列番号９〜１６のいずれか１つに記
載のアミノ酸配列から選ばれるアミノ酸配列において１以上のアミノ酸が欠失、
置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつＪＮＫ３と結合することの
できるポリペプチド、ＪＮＫ３および被験試料とを接触させることを特徴とする
、該ポリペプチドとＪＮＫ３との結合を阻害する活性を有する化合物のスクリー
ニング方法。 （２２） 配列番号９〜１６のいずれか１つに記載のアミノ酸配列から選ばれる
アミノ酸配列からなるポリペプチドまたは配列番号９〜１６のいずれか１つに記
載のアミノ酸配列から選ばれるアミノ酸配列において１以上のアミノ酸が欠失、
置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつＪＮＫ３と結合することの
できるポリペプチド、活性化されたＪＮＫ３および被験試料とを接触させること
を特徴とする、活性化されたＪＮＫ３による、該ポリペプチドのリン酸化を阻害
する活性を有する化合物のスクリーニング方法。 （２３） 上記（２１）または（２２）の方法により得られる化合物またはその
薬理学的に許容される塩。 本明細書において、化合物の薬理学的に許容される塩は、薬理学的に許容され
る酸付加塩、金属塩、アンモニウム塩、有機アミン付加塩、アミノ酸付加塩など
を包含する。 （２４） 配列番号９〜１６のいずれか１つに記載のアミノ酸配列から選ばれる
アミノ酸配列からなるポリペプチドまたは配列番号９〜１６のいずれか１つに記
載のアミノ酸配列から選ばれるアミノ酸配列において１以上のアミノ酸が欠失、
置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつＪＮＫ３と結合することの
できるポリペプチドを発現する細胞と被験試料とを接触させることを特徴とする
、該ポリペプチドをコードする遺伝子の発現を変動させる化合物のスクリーニン
グ方法。 （２５） 遺伝子の発現を変動を上記（１５）の方法を用い検出することを特徴
とする、上記（２４）のスクリーニング方法。 （２６） ポリペプチドを上記（１８）の方法を用い、検出することを特徴とす
る、上記（２４）のスクリーニング方法。 （２７） 上記（２４）〜（２６）のいずれか１つに記載の方法により得られる
化合物またはその薬理学的に許容される塩。 （２８） 配列番号９〜１６のいずれか１つに記載のアミノ酸配列から選ばれる
アミノ酸配列からなるポリペプチドまたは配列番号９〜１６のいずれか１つに記
載のアミノ酸配列から選ばれるアミノ酸配列において１以上のアミノ酸が欠失、
置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつＪＮＫ３と結合することの
できるポリペプチドとＪＮＫ３との結合阻害剤。 （２９） 活性化されたＪＮＫ３による、配列番号９〜１６のいずれか１つに記
載のアミノ酸配列から選ばれるアミノ酸配列からなるポリペプチドまたは配列番
号９〜１６のいずれか１つに記載のアミノ酸配列から選ばれるアミノ酸配列にお
いて１以上のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、
かつＪＮＫ３と結合することのできるポリペプチドのリン酸化阻害剤。 （３０） 上記（１）または（２）のポリペプチドを含有する、アルツハイマー
病、パーキンソン病、ハンチントン病、多発性硬化症等の神経変性疾患、筋萎縮
性側索硬化症等の筋萎縮性疾患、虚血性疾患、脳卒中時の脳障害、精神分裂病、
うつ病、てんかん、各種免疫、炎症性疾患の予防薬。 （３１） 上記（１）または（２）のポリペプチドを含有する、アルツハイマー
病、パーキンソン病、ハンチントン病、多発性硬化症等の神経変性疾患、筋萎縮
性側索硬化症等の筋萎縮性疾患、虚血性疾患、脳卒中時の脳障害、精神分裂病、
うつ病、てんかん、各種免疫、炎症性疾患の治療薬。 （３２） 上記（１３）または（１４）のオリゴヌクレオチドを含有する、アル
ツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病、多発性硬化症等の神経変性疾
患、筋萎縮性側索硬化症等の筋萎縮性疾患、虚血性疾患、脳卒中時の脳障害、精
神分裂病、うつ病、てんかん、各種免疫、炎症性疾患の予防薬。 （３３） 上記（１３）または（１４）のオリゴヌクレオチドを含有する、アル
ツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病、多発性硬化症等の神経変性疾
患、筋萎縮性側索硬化症等の筋萎縮性疾患、虚血性疾患、脳卒中時の脳障害、精
神分裂病、うつ病、てんかん、各種免疫、炎症性疾患の治療薬。 （３４） 上記（１７）の抗体を含有する、アルツハイマー病、パーキンソン病
、ハンチントン病、多発性硬化症等の神経変性疾患、筋萎縮性側索硬化症等の筋
萎縮性疾患、虚血性疾患、脳卒中時の脳障害、精神分裂病、うつ病、てんかん、
各種免疫、炎症性疾患の予防薬。 （３５） 上記（１７）の抗体を含有する、アルツハイマー病、パーキンソン病
、ハンチントン病、多発性硬化症等の神経変性疾患、筋萎縮性側索硬化症等の筋
萎縮性疾患、虚血性疾患、脳卒中時の脳障害、精神分裂病、うつ病、てんかん、
各種免疫、炎症性疾患の治療薬。 （３６） 上記（１）または（２）のポリペプチドをコードする遺伝子の転写を
司るプロモーターＤＮＡ。 （３７） 上記（３６）のプロモーターＤＮＡおよび該プロモーターＤＮＡの下
流に連結させたレポーター遺伝子を含有するプラスミドを保有する形質転換体と
被験試料とを接触させ、該レポーター遺伝子の翻訳産物含量を測定することを特
徴とする、該プロモーターによる転写の効率を変動させる化合物のスクリーニン
グ法。 （３８） レポーター遺伝子が、クロラムフェニコール・アセチルトランスフェ
ラーゼ遺伝子、β−ガラクトシダーゼ遺伝子、ルシフェラーゼ遺伝子およびグリ
ーン・フルオレッセント・プロテイン遺伝子から選ばれる遺伝子である、上記（
３７）のスクリーニング方法。 （３９） 上記（３７）または（３８）の方法により得られる化合物またはその
薬理学的に許容される塩。 以下、本発明を詳細に説明する。 ［１］本発明のＤＮＡの取得およびオリゴヌクレオチドの調製 （１）ｃＤＮＡライブラリーの作製 ｃＤＮＡライブラリーを作製するために、適切な細胞または組織より全ＲＮＡ
あるいはｍＲＮＡを調製する。 全ＲＮＡを調製する方法として、チオシアン酸グアニジン−トリフルオロ酢酸
セシウム法〔Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，１５４，３（１９
８７）〕、酸性グアニジンチオシアネート・フェノール・クロロホルム（ＡＧＰ
Ｃ）法〔Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１６２，１５６（
１９８７）、実験医学，９，１９３７（１９９１）〕等を用いることができる。 全ＲＮＡからポリ（Ａ）＋ＲＮＡとしてｍＲＮＡを調製する方法として、オリ
ゴ（ｄＴ）固定化セルロースカラム法（モレキュラー クローニング 第２版）
やオリゴｄＴラテックスを用いる方法等を用いることができる。 ファースト・トラック・ｍＲＮＡ単離キット〔Ｆａｓｔ Ｔｒａｃｋ ｍＲＮ
Ａ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｋｉｔ；インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）
社製〕、クイック・プレップ・ｍＲＮＡ精製キット〔Ｑｕｉｃｋ Ｐｒｅｐ ｍ
ＲＮＡ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ；ファルマシア（Ｐｈａｒｍａｃｉ
ａ）社製〕等のキットを用いて組織や細胞から直接ｍＲＮＡを調製することもで
きる。 適切な細胞または組織として、動物の脳細胞または脳組織をあげることができ
る。 得られた全ＲＮＡあるいはｍＲＮＡを用い、常法によりｃＤＮＡライブラリー
を作製する。 ｃＤＮＡライブラリー作製法として、モレキュラークローニング 第２版やカ
レント プロトコールズ イン モレキュラー バイオロジー、ＤＮＡ Ｃｌｏ
ｎｉｎｇ １：Ｃｏｒｅ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａ
ｐｐｒｏａｃｈ，Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒ
ｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ（１９９５）等に記載された方法、あるいは市販のキット
、例えばスーパースクリプト・プラスミド・システム・フォー・ｃＤＮＡ・シン
セシス・アンド・プラスミド・クローニング〔Ｓｕｐｅｒ Ｓｃｒｉｐｔ Ｐｌ
ａｓｍｉｄ Ｓｙｓｔｅｍ ｆｏｒ ｃＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ａｎｄ
Ｐｌａｓｍｉｄ Ｃｌｏｎｉｎｇ；ギブコＢＲＬ（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ）社製〕
やザップ−ｃＤＮＡ ・シンセシス・キット〔ＺＡＰ−ｃＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅ
ｓｉｓ Ｋｉｔ、ストラタジーン社製〕を用いる方法等をあげることができる。 ｃＤＮＡライブラリーを作成するためのクローニングベクターとしては、大腸
菌Ｋ１２株中で自立複製できるものであれば、ファージベクター、プラスミドベ
クター等いずれも使用できる。 具体的には、ＺＡＰ Ｅｘｐｒｅｓｓ〔ストラタジーン社製、Ｓｔｒａｔｅｇ
ｉｅｓ，５，５８（１９９２）〕、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＩＩ ＳＫ（＋）
〔Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１７，９４９４（１９８９
）〕、Ｌａｍｂｄａ ＺＡＰ ＩＩ（ストラタジーン社製）、λｇｔ１０、λｇ
ｔ１１〔ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ
，１，４９（１９８５）〕、λＴｒｉｐｌＥｘ（クローンテック社製）、λＥｘ
Ｃｅｌｌ（ファルマシア社製）、ｐＴ７Ｔ３１８Ｕ（ファルマシア社製）、ｐｃ
Ｄ２〔ＭＯｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，３，２８０（１９８３）〕、ｐＵＣ１８
〔Ｇｅｎｅ，３３，１０３（１９８５）〕、ｐＡＭｏ 〔Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅ
ｍ．，２６８，２２７８２−２２７８７（１９９３）、別名ｐＡＭｏＰＲＣ３Ｓ
ｃ（特開平０５−３３６９６３）〕、ｐＧＡＤ１０（クローンテック社製）等を
あげることができる。 宿主微生物としては、大腸菌Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉに属する微生
物であればいずれも用いることができる。具体的には、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＸＬ１−Ｂｌｕｅ ＭＲＦ’〔ストラタジーン社製、Ｓｔｒａｔｅ
ｇｉｅｓ，５，８１（１９９２）〕、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｃ６
００〔Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，３９，４４０（１９５４）〕、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉ
ａ ｃｏｌｉ Ｙ１０８８〔Ｓｃｉｅｎｃｅ，２２２，７７８（１９８３）〕、
Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｙ１０９０〔Ｓｃｉｅｎｃｅ，２２２，７
７８（１９８３）〕、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＮＭ５２２〔Ｊ．Ｍ
ｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１６６，１（１９８３）〕、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏ
ｌｉ Ｋ８０２〔Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１６，１１８（１９６６）〕、Ｅｓ
ｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＪＭ１０５〔Ｇｅｎｅ，３８，２７５（１９８
５）〕、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＳＯＬＲＴＭ Ｓｔｒａｉｎ（ス
トラタジーン社製）、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＬＥ３９２（モレキ
ュラー クローニング 第２版）等を用いることができる。 上記方法により作製したｃＤＮＡライブラリーに加え、市販のｃＤＮＡライブ
ラリーも利用することができる。 市販のｃＤＮＡライブラリーとして、クローンテック社、ライフテックオリエ
ンタル社、ヘルス サイエンス リサーチ リソース バンク（Ｈｅａｌｔｈ
Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ Ｂａｎｋ，Ｊａｐａ
ｎ）等のヒト、ウシ、マウス、ラット、ウサギ等由来の各臓器ｃＤＮＡライブラ
リーをあげることができる。 （２）本発明のＤＮＡの取得 上記（１）で作製したｃＤＮＡライブラリーより、本発明のＤＮＡを有するｃ
ＤＮＡクローンを、以下の酵母を用いたツー ハイブリッド システム（ｔｗｏ
−ｈｙｂｒｉｄ ｓｙｓｔｅｍ）により取得することができる。 ＪＮＫ３をコードする全長ｃＤＮＡ、例えば、マウスＪＮＫ３〔Ｎａｔｕｒｅ
Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，３，８９（１９９７）〕を、ＧＡＬ４ ＤＮＡ結合ドメイ
ンをコードする配列を含むクローニングベクター、例えば、ｐＡＳ２−１（クロ
ーンテック社製）の該配列下に組み込み、酵母ＣＧ−１９４５株（クローンテッ
ク社製）に導入する。 上記（１）の方法で、ＧＡＬ４転写活性化ドメインをコードする配列を含むク
ローニングベクター、例えば、ｐＧＡＤ１０（クローンテック社製）の該配列下
に、脳由来のｃＤＮＡを挿入し、ｃＤＮＡライブラリーを作製する。 該ｃＤＮＡライブラリーを、上記ＪＮＫ３を含有するＣＧ−１９４５株に導入
し、形質転換株を取得する。 ＣＧ−１９４５株は、ＧＡＬ４応答配列の制御下にあるＨＩＳ３およびｌａｃ Ｚ遺伝子を持つレポーター酵母株であり、ＪＮＫ３および脳ｃＤＮＡのハイブリ
ッドコンストラクトから発現される２つのタンパク質が結合する時にのみＨＩＳ ３およびｌａｃＺ遺伝子が発現する。従って、得られた形質転換株より、ヒスチ
ジン要求性が解除され（ヒスチジンを含有しない培地で生育してくる）かつβ−
ガラクトシダーゼ活性を有する株を選択することにより、ＪＮＫ３と結合するこ
とのできるポリペプチド（ＪＳＡＰ：ｃ−Ｊｕｎ Ｎ−ｔｅｒｍｉｎａｌ ｋｉ
ｎａｓｅ／ｓｔｒｅｓｓ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ
−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ）をコードする本発明のＤＮＡを有す
るｃＤＮＡクローンを選択することができる。 ヒスチジン要求性が解除されかつβ−ガラクトシダーゼ活性を有する形質転換
株を一度の行程で取得してもよいが、ヒスチジン要求性が解除された形質転換株
あるいは形質転換株β−ガラクトシダーゼ活性を有する形質転換株（一次ポジテ
ィブクローン）をまず選択し、次にヒスチジン要求性が解除されかつβ−ガラク
トシダーゼ活性を有する形質転換株（二次ポジティブクローン）を選択し、目的
とする形質転換株を取得してもよい。 上記のようにして取得された目的とする形質転換株より、常法に準じてｐＧＡ
Ｄ由来のプラスミドを回収し、目的とする脳由来のｃＤＮＡフラグメントを取得
する。 得られたｃＤＮＡフラグメントをプローブとして用い、該プローブをアイソト
ープあるいは蛍光標識し、コロニー・ハイブリダイゼーション法あるいはプラー
ク・ハイブリダイゼーション法〔モレキュラークローニング 第２版〕等により
、目的とする全長ｃＤＮＡを取得することができる。 上記の方法により取得されたＤＮＡの塩基配列は、該ＤＮＡ断片をそのままあ
るいは適当な制限酵素等で切断後常法によりベクターに組み込み、通常用いられ
る塩基配列解析方法、例えばサンガー（Ｓａｎｇｅｒ）らのジデオキシ法〔Ｐｒ
ｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７４，５４６３（１９７７）〕あ
るいはパーキン・エルマー社（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ：３７３Ａ・ＤＮＡシ
ークエンサー）、ファルマシア社、ライコア（ＬＩ−ＣＯＲ）社等の塩基配列分
析装置を用いて分析することにより決定することができる。 上記方法により取得されるＤＮＡとして、例えば、配列番号１〜８いずれかに
記載の塩基配列からなるＤＮＡをあげることができる。 配列番号２に記載の塩基配列からなるＤＮＡを含有するプラスミドｐｃＤＮＡ
３−Ｓ−ＪＳＡＰ１ｂを保有する大腸菌Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｊ
ＳＡＰ１ｂ／ｐｃＤＮＡ３、配列番号３に記載の塩基配列からなるＤＮＡを含有
するプラスミドｐｃＤＮＡ３−Ｓ−ＪＳＡＰ１ｃを保有する大腸菌Ｅｓｃｈｅｒ
ｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＪＳＡＰ１ｃ／ｐｃＤＮＡ３、配列番号６に記載の塩基
配列からなるＤＮＡを含有するプラスミドｐｃＤＮＡ３−Ｓ−ＪＳＡＰ４を保有
する大腸菌Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＪＳＡＰ４／ｐｃＤＮＡ３およ
び配列番号７に記載の塩基配列からなるＤＮＡを含有するプラスミドｐＧＡＤ１
０−ＪＳＡＰ５を保有する大腸菌Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＪＳＡＰ
５／ｐＧＡＤ１０は平成１０年１１月６日付けで、配列番号８に記載の塩基配列
からなるＤＮＡを含有するプラスミドｐｃＤＮＡ３−Ｈｉｓ−Ｓ−ＪＳＡＰ５を
保有する大腸菌Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＪＳＡＰ５／ｐｃＤＮＡ３
は平成１１年１１月２日付けで、それぞれＦＥＲＭ ＢＰ−６５６７、ＦＥＲＭ
ＢＰ−６５６８、ＦＥＲＭ ＢＰ−６５６９、ＦＥＲＭ ＢＰ−６５７０、Ｆ
ＥＲＭ ＢＰ−６９２８として、工業技術院生命工学工業技術研究所、日本国茨
城県つくば市東１丁目１番３号（郵便番号３０５−８５６６）に寄託されている
。 また、上記方法で取得したＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイ
ズするＤＮＡを選択することにより、他の組織あるいは、他の動物由来、例えば
ヒト由来の目的とするＤＮＡを取得することができる。 上記方法により得られた塩基配列情報に基づき、ＤＮＡ合成機で化学合成する
ことにより目的とするＤＮＡを調製することもできる。ＤＮＡ合成機としては、
チオホスファイト法を利用した島津製作所社製のＤＮＡ合成機、フォスフォアミ
ダイト法を利用したパーキン・エルマー社製のＤＮＡ合成機ｍｏｄｅ１３９２等
をあげることができる。 得られた塩基配列の新規性に関しては、ＢＬＡＳＴ等の相同性検索プログラム
を用いて、ＧｅｎＢａｎｋ、ＥＭＢＬおよびＤＤＢＪ等の塩基配列データベース
を検索することにより確認することができる。 新規な塩基配列については、アミノ酸配列に変換したのもＦＡＳＴＡ、フレー
ムサーチ（ＦｒａｍｅＳｅａｒｃｈ）等の相同性検索プログラムを用いて、Ｇｅ
ｎＰｅｐｔ、ＰＩＲ、Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ等のアミノ酸配列データベースを検
索することにより、相同性をもつ既存の遺伝子を検索することができる。 （３）本発明のオリゴヌクレオチドの調製 上述の方法で取得した本発明のＤＮＡおよびＤＮＡ断片を用いて、常法あるい
は上記のＤＮＡ合成機により、本発明のＤＮＡの一部の配列を有するアンチセン
ス・オリゴヌクレオチド、センス・オリゴヌクレオチド等のオリゴヌクレオチド
を調製することができる。 該オリゴヌクレオチドとしては、上記ＤＮＡの有する塩基配列中の連続した５
〜６０塩基と同じ配列を有するＤＮＡまたは該ＤＮＡと相補的な配列を有するＤ
ＮＡをあげることができ、具体的には、配列番号１〜８で表される塩基配列中の
連続した５〜６０塩基と同じ配列を有するＤＮＡまたは該ＤＮＡと相補的な配列
を有するＤＮＡをあげることができる。 該オリゴヌクレオチドをセンスプライマーおよびアンチセンスプライマーとし
て用いる場合には、両者の融解温度（Ｔｍ）および塩基数が極端に変わることの
ない上記のオリゴヌクレオチドが好ましい。 更に、これらオリゴヌクレオチドの誘導体も本発明のオリゴヌクレオチドとし
て利用することができる。 該誘導体オリゴヌクレオチドとしては、オリゴヌクレオチド中のリン酸ジエス
テル結合がホスフォロチオエート結合に変換された誘導体オリゴヌクレオチド、
オリゴヌクレオチド中のリン酸ジエステル結合がＮ３’−Ｐ５’ホスフォアミデ
ート結合に変換された誘導体オリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチド中のリボ
ースとリン酸ジエステル結合がペプチド核酸結合に変換された誘導体オリゴヌク
レオチド、オリゴヌクレオチド中のウラシルがＣ−５プロピニルウラシルで置換
された誘導体オリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチド中のウラシルがＣ−５チ
アゾールウラシルで置換された誘導体オリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチド
中のシトシンがＣ−５プロピニルシトシンで置換された誘導体オリゴヌクレオチ
ド、オリゴヌクレオチド中のシトシンがフェノキサジン修飾シトシン（ｐｈｅｎ
ｏｘａｚｉｎｅ−ｍｏｄｉｆｉｅｄ ｃｙｔｏｓｉｎｅ）で置換された誘導体オ
リゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチド中のリボースが２’−Ｏ−プロピルリボ
ースで置換された誘導体オリゴヌクレオチド、あるいはオリゴヌクレオチド中の
リボースが２’−メトキシエトキシリボースで置換された誘導体オリゴヌクレオ
チド等をあげることができる〔細胞工学，１６，１４６３（１９９７）〕。 ［２］本発明のポリペプチドの調製 （１）形質転換体の作製 上記［１］に記載の方法により取得したＪＳＡＰをコードする本発明のＤＮＡ
を宿主細胞中で発現させ、本発明のポリペプチドを製造するために、モレキュラ
ー クローニング 第２版、カレント プロトコル イン モレキュラ バイオ
ロジー等に記載された方法を用いることができる。 即ち、本発明のＤＮＡを適当な発現ベクターのプロモーター下流に挿入した組
換えベクターを造成し、該ベクターを宿主細胞に導入することにより、本発明の
ポリペプチドを発現する形質転換体を取得し、該形質転換体を培養することによ
り、本発明のポリペプチドを製造することができる。 宿主細胞としては、細菌、酵母、動物細胞、昆虫細胞、植物細胞等、目的とす
る遺伝子を発現できるものであればいずれも用いることができる。 発現ベクターとしては、上記宿主細胞において自立複製可能ないしは染色体中
への組込が可能で、本発明のＤＮＡを転写できる位置にプロモーターを含有して
いるものが用いられる。 細菌等の原核生物を宿主細胞として用いる場合、本発明のポリペプチド遺伝子
発現ベクターは原核生物中で自立複製可能であると同時に、プロモーター、リボ
ソーム結合配列、本発明のＤＮＡ、転写終結配列、より構成された組換えベクタ
ーであることが好ましい。プロモーターを制御する遺伝子が含まれていてもよい
。 発現ベクターとしては、例えば、ｐＢＴｒｐ２、ｐＢＴａｃ１、ｐＢＴａｃ２
（いずれもベーリンガーマンハイム社より市販）、ｐＫＫ２３３−２（ファルマ
シア社製）、ｐＳＥ２８０（インビトロジェン社製）、ｐＧＥＭＥＸ−１〔プロ
メガ（Ｐｒｏｍｅｇａ）社〕、ｐＱＥ−８（キアゲン（ＱＩＡＧＥＮ）社製）、
ｐＫＹＰ１０（特開昭５８−１１０６００）、ｐＫＹＰ２００〔Ａｇｒｉｃ．Ｂ
ｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，４８，６６９（１９８４）〕、ｐＬＳＡ１〔Ａｇｒｉｃ．
Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，５３，２７７（１９８９）〕、ｐＧＥＬ１〔Ｐｒｏｃ．
Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８２，４３０６（１９８５）〕、ｐＢｌ
ｕｅｓｃｒｉｐｔ ＩＩ ＳＫ（−）（ストラタジーン社製）、ｐＴｒｓ３２（
ＦＥＲＭ ＢＰ−５４０８）、ｐＧＨＡ２（ＦＥＲＭ ＢＰ−４００）、ｐＧＫ
Ａ２（ＦＥＲＭ Ｂ−６７９８）、ｐＴｅｒｍ２（特開平３−２２９７９、ＵＳ
４６８６１９１、ＵＳ４９３９０９４、ＵＳ５１６０７３５）、ｐＧＥＸ（ファ
ルマシア社製）、ＰＥＴ−３（ノバジェン社製）、ｐＳｕｐｅｘ、ｐＵＢ１１０
、ｐＴＰ５、ｐＣ１９４、ｐＴｒｘＦｕｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）、ｐＭ
ＡＬ−ｃ２（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ社製）等をあげることが
できる。 プロモーターとしては、大腸菌や枯草菌等の宿主細胞中で発現できるものであ
ればいかなるものでもよい。例えば、ｔｒｐプロモーター（Ｐｔｒｐ）、ｌａｃ プロモーター（Ｐｌａｃ）、ＰＬプロモーター、ＰＲプロモーター、Ｔ７プロモ
ーター等の、大腸菌やファージ等に由来するプロモーター、ＳＰＯ１プロモータ
ー、ＳＰＯ２プロモーター、ｐｅｎＰプロモーター等をあげることができる。ま
たＰｔｒｐを２つ直列させたプロモーター（Ｐｔｒｐ ｘ２）、ｔａｃプロモー
ター、ｌａｃＴ７プロモーター、ｌｅｔ Ｉプロモーターのように人為的に設計
改変されたプロモーター等も用いることができる。 リボソーム結合配列としては、シャイン−ダルガノ（Ｓｈｉｎｅ−Ｄａｌｇａ
ｒｎｏ）配列と開始コドンとの間を適当な距離（例えば６〜１８塩基）に調節し
たプラスミドを用いることが好ましい。 本発明のＤＮＡの発現には転写終結配列は必ずしも必要ではないが、構造遺伝
子の直下に転写終結配列を配置することが好ましい。 宿主細胞としては、エシェリヒア属、セラチア属、バチルス属、ブレビバクテ
リウム属、コリネバクテリウム属、ミクロバクテリウム属、シュードモナス属等
に属する微生物、例えば、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＸＬ１−Ｂｌｕ
ｅ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＸＬ２−Ｂｌｕｅ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃ
ｈｉａ ｃｏｌｉ ＤＨ１、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＭＣ１０００
、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＫＹ３２７６、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｗ１４８５、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＪＭ１０９、Ｅ
ｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＨＢ１０１、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏ
ｌｉ Ｎｏ．４９、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｗ３１１０、Ｅｓｃｈ
ｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＮＹ４９、Ｓｅｒｒａｔｉａ ｆｉｃａｒｉａ、Ｓ
ｅｒｒａｔｉａ ｆｏｎｔｉｃｏｌａ、Ｓｅｒｒａｔｉａ ｌｉｑｕｅｆａｃｉ
ｅｎｓ、Ｓｅｒｒａｔｉａ ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂ
ｔｉｌｉｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ、Ｂｒｅ
ｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｍｍｏｎｉａｇｅｎｅｓ、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒ ｉｕｍ ｉｍｍａｒｉｏｐｈｉｌｕｍ ＡＴＣＣ１４０６８、Ｂｒｅｖｉｂａｃ
ｔｅｒｉｕｍ ｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃｕｍ ＡＴＣＣ１４０６６、Ｃｏｒ
ｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ ＡＴＣＣ１３０３２、Ｃｏ
ｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ ＡＴＣＣ１４０６７、Ｃ
ｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ ＡＴＣＣ１３８６９、
Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｃｅｔｏａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｍ ＡＴＣ
Ｃ１３８７０、Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｍｍｏｎｉａｐｈｉｌｕｍ
ＡＴＣＣ１５３５４、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐ．Ｄ−０１１０等をあげる
ことができる。 組換えベクターの導入方法としては、上記宿主細胞へＤＮＡを導入する方法で
あればいずれも用いることができ、例えば、カルシウムイオンを用いる方法〔Ｐ
ｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，６９，２１１０（１９７２）〕
、プロトプラスト法（特開昭６３−２４８３９４）、エレクトロポレーション法
〔Ｇｅｎｅ，１７，１０７（１９８２）、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ＆ Ｇｅｎｅｒ
ａｌ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，１６８，１１１（１９７９）〕等をあげることができ
る。 酵母菌株を宿主細胞として用いる場合には、発現ベクターとして、例えば、Ｙ
Ｅｐ１３（ＡＴＣＣ３７１１５）、ＹＥｐ２４（ＡＴＣＣ３７０５１）、ＹＣｐ
５０（ＡＴＣＣ３７４１９）、ｐＨＳ１９、ｐＨＳ１５等を用いることができる
。 プロモーターとしては、酵母菌株中で発現できるものであればいずれのものを
用いてもよく、例えば、ＰＨ０５プロモーター、ＰＧＫプロモーター、ＧＡＰプ
ロモーター、ＡＤＨプロモーター、ｇａｌ １プロモーター、ｇａｌ １０プロ
モーター、ヒートショックポリペプチドプロモーター、ＭＦα１プロモーター、
ＣＵＰ１プロモーター等のプロモーターをあげることができる。 宿主細胞としては、サッカロマイセス属、シゾサッカロマイセス属、クルイベ
ロミセス属、トリコスポロン属、シワニオミセス属等に属する酵母菌株をあげる
ことができ、具体的には、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ 、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍ ｙｃｅｓ ｌａｃｔｉｓ、Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ ｐｕｌｌｕｌａｎｓ、Ｓ
ｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ ａｌｌｕｖｉｕｓ、Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒ
ｉｓ等をあげることができる。 組換えベクターの導入方法としては、酵母にＤＮＡを導入する方法であればいず
れも用いることができ、例えば、エレクトロポレーション法〔Ｍｅｔｈｏｄｓ
ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，１９４，１８２（１９９０）〕、スフェロプラス
ト法〔Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８１，４８８９（１９
８４）〕、酢酸リチウム法〔Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ
，１５３，１６３（１９８３）〕等をあげることができる。 動物細胞を宿主として用いる場合には、発現ベクターとして、例えば、ｐｃＤ
ＮＡＩ／Ａｍｐ（インビトロジェン社製）、ｐｃＤＮＡＩ、ｐＣＤＭ８〔Ｎａｔ
ｕｒｅ，３２９，８４０（１９８７）〕、ｐＡＧＥ１０７〔特開平３−２２９７
９、Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，３，１３３（１９９０）〕、ｐＲＥＰ４（
インビトロジェン社製）、ｐＡＧＥ１０３〔Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｃｈ
ｅｍｉｓｔｒｙ，１０１，１３０７（１９８７）〕、ｐＡＭｏ、ｐＡＭｏＡ、ｐ
ＡＳ３−３（特開平２−２２７０７５）等が用いられる。 プロモーターとしては、動物細胞中で発現できるものであればいずれも用いる
ことができ、例えば、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）のＩＥ（ｉｍｍｅｄｉａ
ｔｅ ｅａｒｌｙ）遺伝子のプロモーター、ＳＶ４０の初期プロモーターあるい
はメタロチオネインのプロモーター、レトロウイルスのプロモーター、ヒートシ
ョックプロモーター、ＳＲαプロモーター等をあげることができる。また、ヒト
ＣＭＶのＩＥ遺伝子のエンハンサーをプロモーターと共に用いてもよい。 動物細胞としては、マウス・ミエローマ細胞、ラット・ミエローマ細胞、マウ
ス・ハイブリドーマ細胞、ヒトの細胞であるナマルバ（Ｎａｍａｌｗａ）細胞ま
たはＮａｍａｌｗａＫＪＭ−１細胞、ヒト胎児腎臓細胞、ヒト白血病細胞、アフ
リカミドリザル腎臓細胞、チャイニーズ・ハムスターの細胞であるＣＨＯ細胞、
ＨＢＴ５６３７（特開昭６３−２９９）等をあげることができる。 マウス・ミエローマ細胞としては、ＳＰ２／０、ＮＳＯ等、ラット・ミエロー
マ細胞としてはＹＢ２／０等、ヒト胎児腎臓細胞としてはＨＥＫ２９３（ＡＴＣ
Ｃ：ＣＲＬ−１５７３）、２９３等、ヒト白血病細胞としては、ＢＡＬＬ−１等
、アフリカミドリザル腎臓細胞としてはＣＯＳ−１、ＣＯＳ−７等をあげること
ができる。 組換えベクターの導入方法としては、動物細胞にＤＮＡを導入する方法であれ
ばいずれも用いることができ、例えば、エレクトロポレーション法〔Ｃｙｔｏｔ
ｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，３，１３３（１９９０）〕、リン酸カルシウム法（特開平
２−２２７０７５）、リポフェクション法〔Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓ
ｃｉ．ＵＳＡ，８４，７４１３（１９８７）〕、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，５２，４５
６（１９７３）に記載の方法等をあげることができる。 昆虫細胞を宿主として用いる場合には、例えばバキュロウイルス・イクスプレ
ッション・ベクターズ ア・ラボラトリー・マニュアル〔Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕ
ｓ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｖｅｃｔｏｒｓ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａ
ｎｕａｌ，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｎｅｗ Ｙｏｒ
ｋ（１９９２）〕、モレキュラー バイオロジー ア ラボラトリー マニュア
ル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎ
ｕａｌ）、カレント プロトコールズ イン モレキュラー バイオロジー、Ｂ
ｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，６，４７（１９８８）等に記載された方法によっ
て、ポリペプチドを発現することができる。 即ち、組換え遺伝子導入ベクターおよびバキュロウイルスを昆虫細胞に共導入
して昆虫細胞培養上清中に組換えウイルスを得た後、さらに組換えウイルスを昆
虫細胞に感染させ、ポリペプチドを発現させることができる。 該方法において用いられる遺伝子導入ベクターとしては、例えば、ｐＶＬ１３
９２、ｐＶＬ１３９３、ｐＢｌｕｅ ＢａｃＩＩＩ（ともにインビトロジェン社
製）等をあげることができる。 バキュロウイルスとしては、例えば、夜盗蛾科昆虫に感染するウイルスである
アウトグラファ・カリフォルニカ・ヌクレアー・ポリヘドロシス・ウイルス（Ａ
ｕｔｏｇｒａｐｈａ ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ ｎｕｃｌｅａｒ ｐｏｌｙｈｅ
ｄｒｏｓｉｓ ｖｉｒｕｓ）等を用いることができる。 昆虫細胞としては、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａの卵巣細胞
、Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ ｎｉの卵巣細胞、カイコ卵巣由来の培養細胞等を
用いることができる。 Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａの卵巣細胞としてはＳｆ９、Ｓ
ｆ２１（バキュロウイルス・イクスプレッション・ベクターズ ア・ラボラトリ
ー・マニュアル）等、Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ ｎｉの卵巣細胞としてはＨｉ
ｇｈ ５、ＢＴＩ−ＴＮ−５Ｂ１−４（インビトロジェン社製）等、カイコ卵巣
由来の培養細胞としてはＢｏｍｂｙｘ ｍｏｒｉ Ｎ４等をあげることができる
。 組換えウイルスを調製するための、昆虫細胞への上記組換え遺伝子導入ベクタ
ーと上記バキュロウイルスの共導入方法としては、例えば、リン酸カルシウム法
（特開平２−２２７０７５）、リポフェクション法〔Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃ
ａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８４，７４１３（１９８７）〕等をあげることができる
。 遺伝子の発現方法としては、直接発現以外に、モレキュラー クローニング
第２版に記載されている方法等に準じて、分泌生産、融合タンパク質発現等を行
うことができる。 酵母、動物細胞または昆虫細胞により発現させた場合には、糖あるいは糖鎖が
付加されたポリペプチドを得ることができる。 以上のようにして得られる形質転換体を培地に培養し、培養物中に本発明のポ
リペプチドを生成蓄積させ、該培養物から採取することにより、本発明のポリペ
プチドを製造することができる。 また、患者の生体内から採取した細胞に、適切な本発明のポリペプチドを発現
させるための発現ベクターを導入した後、細胞を生体内に戻すことにより、本発
明のポリペプチドを患者の生体内で発現させることもできる。 （２）形質転換体の培養 本発明の形質転換体を培地に培養する方法は、宿主の培養に用いられる通常の
方法に従って行うことができる。 大腸菌等の原核生物あるいは酵母等の真核生物を宿主として得られた形質転換
体を培養する培地としては、該生物が資化し得る炭素源、窒素源、無機塩類等を
含有し、形質転換体の培養を効率的に行える培地であれば天然培地、合成培地の
いずれを用いてもよい。 炭素源としては、該生物が資化し得るものであればよく、グルコース、フラク
トース、スクロース、これらを含有する糖蜜、デンプンあるいはデンプン加水分
解物等の炭水化物、酢酸、プロピオン酸等の有機酸、エタノール、プロパノール
等のアルコール類等を用いることができる。 窒素源としては、アンモニア、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、酢酸ア
ンモニウム、リン酸アンモニウム等の無機酸もしくは有機酸のアンモニウム塩、
その他の含窒素化合物、並びに、ペプトン、肉エキス、酵母エキス、コーンスチ
ープリカー、カゼイン加水分解物、大豆粕および大豆粕加水分解物、各種発酵菌
体、およびその消化物等を用いることができる。 無機塩としては、リン酸第一カリウム、リン酸第二カリウム、リン酸マグネシ
ウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、硫酸銅
、炭酸カルシウム等を用いることができる。 培養は、通常振盪培養または深部通気攪拌培養等の好気的条件下で行う。培養
温度は１５〜４０℃がよく、培養時間は、通常１６〜９６時間である。培養中ｐ
Ｈは３．０〜９．０に保持する。ｐＨの調整は、無機または有機の酸、アルカリ
溶液、尿素、炭酸カルシウム、アンモニア等を用いて行う。 また、培養中必要に応じて、アンピシリンやテトラサイクリン等の抗生物質を
培地に添加してもよい。 プロモーターとして誘導性のプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換し
た微生物を培養するときには、必要に応じてインデューサーを培地に添加しても
よい。例えば、ｌａｃプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物
を培養するときにはイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド等を、ｔｒ
ｐプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養するときには
インドールアクリル酸等を培地に添加してもよい。 動物細胞を宿主として得られた形質転換体を培養する培地としては、一般に使
用されているＲＰＭＩ１６４０培地〔Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ
Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｍｅｄｉｃａｌ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ，１９９，５１９
（１９６７）〕、ＥａｇｌｅのＭＥＭ培地〔Ｓｃｉｅｎｃｅ，１２２，５０１（
１９５２）〕、ＤＭＥＭ培地〔Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，８，３９６（１９５９）〕、
１９９培地〔Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇ ｏｆ ｔｈｅ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｆｏｒ
ｔｈｅ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，７３，１（１９５０）〕ま
たはこれら培地に牛胎児血清等を添加した培地等を用いることができる。 培養は、通常ｐＨ６〜８、３０〜４０℃、５％ＣＯ２存在下等の条件下で１〜
７日間行う。 また、培養中必要に応じて、カナマイシン、ペニシリン、ストレプトマイシン
等の抗生物質を培地に添加してもよい。 昆虫細胞を宿主として得られた形質転換体を培養する培地としては、一般に使
用されているＴＮＭ−ＦＨ培地〔ファーミンジェン（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）社
製〕、Ｓｆ−９００ ＩＩ ＳＦＭ培地（ライフ・テクノロジーズ社製）、Ｅｘ
Ｃｅｌｌ４００、ＥｘＣｅｌｌ４０５〔いずれもＪＲＨバイオサイエンシーズ（
ＪＲＨ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）社製〕、Ｇｒａｃｅ’ｓ Ｉｎｓｅｃｔ Ｍ
ｅｄｉｕｍ〔Ｎａｔｕｒｅ １９５，７８８（１９６２）〕等を用いることがで
きる。 培養は、通常ｐＨ６〜７、２５〜３０℃等の条件下で１〜５日間行う。 また、培養中必要に応じて、ゲンタマイシン等の抗生物質を培地に添加しても
よい。 （３）発現させたポリペプチドの単離精製 上記形質転換体の培養液から、上記方法により発現させたポリペプチドを単離
精製するためには、通常の酵素の単離、精製法を用いればよい。 例えば、本発明のポリペプチドが、細胞内に溶解状態で発現した場合には、培
養終了後、細胞を遠心分離により回収し水系緩衝液にけん濁後、超音波破砕機、
フレンチプレス、マントンガウリンホモゲナイザー、ダイノミル等により細胞を
破砕し、無細胞抽出液を得る。 該無細胞抽出液を遠心分離することにより得られた上清から、通常の酵素の単
離精製法、即ち、溶媒抽出法、硫安等による塩析法、脱塩法、有機溶媒による沈
殿法、ジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）−セファロース、ＤＩＡＩＯＮ ＨＰ
Ａ−７５（三菱化学社製）等レジンを用いた陰イオン交換クロマトグラフィー法
、Ｓ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＦＦ（ファルマシア社製）等のレジンを用いた陽イ
オン交換クロマトグラフィー法、ブチルセファロース、フェニルセファロース等
のレジンを用いた疎水性クロマトグラフィー法、分子篩を用いたゲルろ過法、ア
フィニティークロマトグラフィー法、クロマトフォーカシング法、等電点電気泳
動等の電気泳動法等の手法を単独あるいは組み合わせて用い、精製標品を得るこ
とができる。 また、該ポリペプチドが細胞内に不溶体を形成して発現した場合は、同様に細
胞を回収後破砕し、遠心分離を行うことにより得られた沈殿画分より、通常の方
法により該ポリペプチドを回収後、該ポリペプチドの不溶体をタンパク質変性剤
で可溶化する。 該可溶化液を、タンパク質変性剤を含まないあるいはタンパク質変性剤の濃度
がタンパク質が変性しない程度に希薄な溶液に希釈、あるいは透析し、該ポリペ
プチドを正常な立体構造に構成させた後、上記と同様の単離精製法により精製標
品を得ることができる。 本発明のポリペプチドあるいはその糖修飾体等の誘導体が細胞外に分泌された
場合には、培養上清に該ポリペプチドあるいはその糖鎖付加体等の誘導体を回収
することができる。 即ち、該培養物を上記と同様の遠心分離等の手法により処理することにより可
溶性画分を取得し、該可溶性画分から、上記と同様の単離精製法を用いることに
より、精製標品を得ることができる。 また、本発明のポリペプチドを他のタンパク質との融合タンパク質として生産
し、融合したタンパク質に親和性をもつ物質を用いたアフィニティークロマトグ
ラフィーを利用して精製することもできる。例えば、ロウらの方法〔Ｐｒｏｃ，
Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８６，８２２７（１９８９）、Ｇｅｎｅ
ｓ Ｄｅｖｅｌｏｐ．，４，１２８８（１９９０）〕、特開平０５−３３６９６
３、特開平０６−８２３０２１に記載の方法に準じて、本発明のポリペプチドを
プロテインＡとの融合タンパク質として生産し、イムノグロブリンＧを用いるア
フィニティークロマトグラフィーにより精製することができる。 また、本発明のポリペプチドをＦｌａｇペプチドとの融合タンパク質として生産
し、抗Ｆｌａｇ抗体を用いるアフィニティークロマトグラフィーにより精製する
ことができる〔Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８６，８２２
７（１９８９）、Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖｅｌｏｐ．，４，１２８８（１９９０）〕
。更に、該ポリペプチド自身に対する抗体を用いたアフィニティークロマトグラ
フィーで精製することもできる。 更に、本発明のポリペプチドは、Ｆｍｏｃ法（フルオレニルメチルオキシカル
ボニル法）、ｔＢｏｃ法（ｔ−ブチルオキシカルボニル法）等の化学合成法によ
っても製造することができる。 また、アドバンスト・ケムテック（Ａｄｖａｎｃｅｄ ＣｈｅｍＴｅｃｈ）社
、パーキン・エルマー社、ファルマシア社、プロテイン・テクノロジー・インス
トゥルメント（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｔｅｃｈｏｌｏｇｙ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ）
社、シンセセル・ベガ（Ｓｙｎｔｈｅｃｅｌｌ−Ｖｅｇａ）社、パーセプティブ
（ＰｅｒＳｅｐｔｉｖｅ）社、島津製作所等のペプチド合成機を利用し化学合成
することもできる。 精製した本発明のポリペプチドの構造解析は、タンパク質化学で通常用いられ
る方法、例えば遺伝子クローニングのためのタンパク質構造解析（平野久著、東
京化学同人発行、１９９３年）に記載の方法により実施可能である。 ［３］本発明のポリペプチドを認識する抗体の調製 （１）ポリクローナル抗体の調製 上記［２］に記載の方法により取得した本発明のポリペプチドの全長または部
分断片精製標品を抗原として用い、動物に投与することによりポリクローナル抗
体を作製することができる。 抗原とするペプチドは、本発明のポリペプチドのアミノ酸配列に基づいてペプ
チド合成機で合成することもできる。 また、上記［２］に記載の方法により取得した本発明のポリペプチドを、後述
の活性化ＪＮＫ３を用いてリン酸化したポリペプチドの全長またはリン酸化部分
を含む部分ポリペプチド断片の精製標品を抗原として用い、動物に投与すること
により、リン酸化された本発明のポリペプチドを特異的に認識するポリクローナ
ル抗体を作製することができる。 リン酸化された本発明のポリペプチドとしては、例えば、配列番号９記載のア
ミノ酸配列の２３４、２４４および２５５番目のアミノ酸のいずれか１つ以上を
リン酸化されたもの、配列番号１０記載のアミノ酸配列の２４３、２５３および
２６４番目のアミノ酸のいずれか１つ以上をリン酸化されたもの、配列番号１１
記載のアミノ酸配列の２６６、２７６および２８７番目のアミノ酸のいずれか１
つ以上をリン酸化されたもの、配列番号１２記載のアミノ酸配列の２６５、２７
５および２８６番目のアミノ酸のいずれか１つ以上をリン酸化されたものをあげ
ることができる。 投与する動物として、ウサギ、ヤギ、３〜２０週令のラット、マウス、ハムス
ター等を用いることができる。 該抗原の投与量は動物１匹当たり５０〜１００μｇが好ましい。 ペプチドを用いる場合は、ペプチドをスカシガイヘモシアニン（ｋｅｙｈｏｌ
ｅ ｌｉｍｐｅｔ ｈａｅｍｏｃｙａｎｉｎ）や牛チログロブリン等のキャリア
蛋白に共有結合させたものを抗原とするのが望ましい。 該抗原の投与は、１回目の投与の後１〜２週間おきに３〜１０回行う。各投与
後、３〜７日目に眼底静脈叢より採血し、該血清が免疫に用いた抗原と反応する
ことを酵素免疫測常法〔酵素免疫測常法（ＥＬＩＳＡ法）：医学書院刊 １９７
６年、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ−Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏ
ｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（１９
８８）〕等で確認する。 免疫に用いた抗原に対し、該血清が充分な抗体価を示した非ヒトほ乳動物より
血清を取得し、該血清を分離、精製することによりポリクローナル抗体を取得す
ることができる。 分離、精製する方法としては、遠心分離、４０〜５０％飽和硫酸アンモニウム
による塩析、カプリル酸沈殿〔Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒ
ｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏ
ｒｙ，（１９８８）〕、またはＤＥＡＥ−セファロースカラム、陰イオン交換カ
ラム、プロテインＡまたはＧ−カラムあるいはゲル濾過カラム等を用いるクロマ
トグラフィー等を、単独または組み合わせて処理する方法があげられる。 （２）モノクローナル抗体の調製 （２−１）抗体産生細胞の調製 上記（１）において、免疫に用いた抗原に対し、その血清が十分な抗体価を示
したラットを抗体産生細胞の供給源として供する。 該抗体価を示したラットに抗原物質を最終投与した後３〜７日目に、脾臓を摘
出する。 該脾臓をＭＥＭ培地（日水製薬社製）中で細断し、ピンセットでほぐし、１，
２００ｒｐｍで５分間遠心分離した後、上清を捨てる。 得られた沈殿画分の脾細胞をトリス−塩化アンモニウム緩衝液（ｐＨ７．６５
）で１〜２分間処理し赤血球を除去した後、ＭＥＭ培地で３回洗浄し、得られた
脾細胞を抗体産生細胞として用いる。 （２−２）骨髄腫細胞の調製 骨髄腫細胞としては、マウスまたはラットから取得した株化細胞を使用する。
例えば、８−アザグアニン耐性マウス（ＢＡＬＢ／ｃ由来）骨髄腫細胞株Ｐ３−
Ｘ６３Ａｇ８−Ｕ１（Ｐ３−Ｕ１）〔Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐｉｃｓ Ｍｉｃｒｏｂｉ
ｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，８１，１（１９７８）、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ
．，６，５１１（１９７６）〕、ＳＰ２／０−Ａｇ１４（ＳＰ−２）〔Ｎａｔｕ
ｒｅ，２７６，２６９（１９７８）〕、Ｐ３−Ｘ６３−Ａｇ８６５３（６５３）
〔Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１２３，１５４８（１９７９）〕、Ｐ３−Ｘ６３−Ａ
ｇ８（Ｘ６３）〔Ｎａｔｕｒｅ，２５６，４９５（１９７５）〕等を用いること
ができる。これらの細胞株は、８−アザグアニン培地〔ＲＰＭＩ−１６４０培地
にグルタミン（１．５ｍＭ）、２−メルカプトエタノール（５×１０−５Ｍ）、
ジェンタマイシン（１０μｇ／ｍｌ）および牛胎児血清（ＦＣＳ）（ＣＳＬ社製
、１０％）を加えた培地（以下、正常培地という）に、さらに８−アザグアニン
（１５μｇ／ｍｌ）を加えた培地〕で継代するが、細胞融合の３〜４日前に正常
培地で培養し、融合には該細胞を２×１０７個以上用いる。 （２−３）ハイブリドーマの作製 （２−１）で取得した抗体産生細胞と（２−２）で取得した骨髄腫細胞をＭＥ
Ｍ培地またはＰＢＳ（リン酸二ナトリウム １．８３ｇ、リン酸一カリウム ０
．２１ｇ、食塩 ７．６５ｇ、蒸留水 １リットル、ｐＨ７．２）でよく洗浄し
、細胞数が、抗体産生細胞：骨髄腫細胞＝５〜１０：１になるよう混合し、１，
２００ｒｐｍで５分間遠心分離した後、上清を捨てる。 得られた沈澱画分の細胞群をよくほぐし、該細胞群に、攪拌しながら、３７℃
で、１０８抗体産生細胞あたり、ポリエチレングライコール−１０００（ＰＥＧ
−１０００）２ｇ、ＭＥＭ ２ｍｌおよびジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）０
．７ｍｌを混合した溶液を０．２〜１ｍｌ添加し、更に１〜２分間毎にＭＥＭ培
地１〜２ｍｌを数回添加する。 添加後、ＭＥＭ培地を加えて全量が５０ｍｌになるように調製する。 該調製液を９００ｒｐｍで５分間遠心分離後、上清を捨てる。 得られた沈殿画分の細胞を、ゆるやかにほぐした後、メスピペットによる吸込
み、吹出しでゆるやかにＨＡＴ培地〔正常培地にヒポキサンチン（１０−４Ｍ）
、チミジン（１．５×１０−５Ｍ）およびアミノプテリン（４×１０−７Ｍ）を
加えた培地〕１００ｍｌ中に懸濁する。 該懸濁液を９６穴培養用プレートに１００μｌ／穴ずつ分注し、５％ＣＯ２イ
ンキュベーター中、３７℃で７〜１４日間培養する。 培養後、培養上清の一部をとりアンチボディイズ〔Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ−Ａ
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏ
ｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｈａｐｔｅｒ１４（１９８８）〕等
に述べられている酵素免疫測常法により、上記抗体産生細胞を取得するために、
免疫に用いた抗原に特異的に反応するハイブリドーマを選択する。 酵素免疫測常法の具体的例として、以下の方法をあげることができる。 免疫の際、抗原に用いた本発明のポリペプチドの全長または部分断片精製標品
を適当なプレートにコートし、ハイブリドーマ培養上清もしくは後述の（２−４
）で得られる精製抗体を第一抗体として反応させ、さらに第二抗体としてビオチ
ン、酵素、化学発光物質あるいは放射線化合物等で標識した抗ラットイムノグロ
ブリン抗体を反応させた後に標識物質に応じた反応を行ない、本発明のポリペプ
チドに特異的に反応するものを本発明のポリペプチドに対するモノクローナル抗
体を生産するハイブリドーマとして選択する。 該ハイブリドーマを用いて、限界希釈法によりクローニングを２回繰り返し〔
１回目はＨＴ培地（ＨＡＴ培地からアミノプテリンを除いた培地）、２回目は正
常培地を使用する〕、安定して強い抗体価の認められたものを本発明のポリペプ
チドに対するモノクローナル抗体を生産するハイブリドーマ株として選択する。 （２−４）モノクローナル抗体の調製 プリスタン処理〔２，６，１０，１４−テトラメチルペンタデカン（Ｐｒｉｓ
ｔａｎｅ）０．５ｍｌを腹腔内投与し、２週間飼育する〕した８〜１０週令のマ
ウスまたはヌードマウスに、（２−３）で取得した本発明のポリペプチドに対す
るモノクローナル抗体を生産するハイブリドーマ細胞５〜２０×１０６細胞／匹
を腹腔内に注射する。１０〜２１日間でハイブリドーマは腹水癌化する。 該腹水癌化したマウスから腹水を採取し、３，０００ｒｐｍで５分間遠心分離
して固形分を除去する。 得られた上清より、ポリクローナルで用いた方法と同様の方法でモノクローナ
ル抗体を精製、取得することができる。 抗体のサブクラスの決定は、マウスモノクローナル抗体タイピングキットまた
はラットモノクローナル抗体タイピングキットを用いて行う。タンパク質量は、
ローリー法あるいは２８０ｎｍでの吸光度より算出する。 ［４］ＪＮＫ３と結合することのできる新規ポリペプチドを用いた、有用医薬品
のスクリーニング法 （１）スクリーニング法に用いるタグポリペプチドと本発明のポリペプチドとの
融合ポリペプチドの調製 １）チオレドキシンＳタグ（ｔｈｉｏｒｅｄｏｘｉｎ・Ｓ−ｔａｇ、以下、Ｔｒ
ｘ・Ｓと略す）ペプチドとの融合ポリペプチドの調製 上記［１］で取得されるＪＮＫ３と結合することのできるポリペプチド（ＪＳ
ＡＰ）をコードするｃＤＮＡの全長あるいは部分長ＤＮＡを、Ｔｒｘ・Ｓ配列を
含む発現ベクター、例えば、ｐＥＴ３２（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）のＴｒｘ・Ｓ配
列の下流に挿入することにより、Ｔｒｘ・Ｓ−ＪＳＡＰ融合ポリペプチドを発現
するベクターを作製することができる。同様に、Ｔｒｘ・Ｓ−ＡＴＦ２配列を含
む発現ベクター、例えば、ｐＥＴ３２ａ（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）のＴｒｘ・Ｓ−
ＡＴＦ２配列の下流に挿入することにより、Ｔｒｘ・Ｓ−ＡＴＦ２−ＪＳＡＰ融
合ポリペプチドを発現するベクターを作製することができる。 得られた発現ベクターを用い、上記［２］に記載の方法に準じて融合ポリペプ
チドを取得することができる。 ２）Ｓタグ（Ｓ−ｔａｇ）ペプチドとの融合ポリペプチドの調製 ＪＳＡＰをコードするｃＤＮＡの全長あるいは部分長ＤＮＡを、Ｓタグ配列を
含む発現ベクター、例えば、ｐｃＤＮＡ３（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）にＳタ
グ配列を挿入したｓ−ｍｏｄｉｆｉｅｄ ｐｃＤＮＡ３のＳタグ配列の下流に挿
入することにより、Ｓ−ＪＳＡＰ融合ポリペプチドを発現するベクターを作製す
ることができる。 得られた発現ベクターを用い、上記［２］に記載の方法に準じて融合ポリペプ
チドを取得することができる。 ３）ＧＡＬ４ＡＤペプチドとの融合ポリペプチドの調製 ＪＳＡＰをコードするｃＤＮＡの全長あるいは部分長ＤＮＡを、ＧＡＬ４ＡＤ
配列を含む発現ベクター、例えば、ｐＧＡＤ１０（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）のＧ
ＡＬ４ＡＤ配列の下流に挿入することにより、ＧＡＬ４ＡＤ−ＪＳＡＰ融合ポリ
ペプチドを発現するベクターを作製することができる。 得られた発現ベクターを用い、上記［２］に記載の方法に準じて融合ポリペプ
チドを取得することができる。 ４）Ｆｌａｇペプチドとの融合ポリペプチドの調製 ＪＳＡＰをコードするｃＤＮＡの全長あるいは部分長ＤＮＡを、Ｆｌａｇ配列
を含む発現ベクター、例えば、ｐＦｌａｇ−ＣＭＶ−２（Ｋｏｄａｋ社製）、ｐ
ｃＤＮＡ３にＦｌａｇタグ配列を挿入したＦｌａｇ−ｍｏｄｉｆｉｅｄ ｐｃＤ
ＮＡ３ ｖｅｃｔｏｒ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）のＦｌａｇ配列の下流に挿
入することにより、Ｆｌａｇ−ＪＳＡＰ融合ポリペプチドを発現するベクターを
作製することができる。 得られた発現ベクターを用い、上記［２］に記載の方法に準じて融合ポリペプ
チドを取得することができる。 ５）グルタチオン Ｓ−トランスフェラーゼ（Ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ Ｓ−ｔ
ｒａｎｓｆｅｒａｓｅ、以下、ＧＳＴと略す）との融合ポリペプチドの調製 ＪＳＡＰをコードするｃＤＮＡの全長あるいは部分長ＤＮＡを、ＧＳＴ配列を
含む発現ベクター、例えば、ｐＧＥＸ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）あるいはｐＧ
ＥＸ−３Ｘ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）のＧＳＴ配列の下流に挿入することによ
り、ＧＳＴ−ＪＳＡＰ融合ポリペプチドを発現するベクターを作製することがで
きる。 得られた発現ベクターを用い、上記［２］に記載の方法に準じて融合ポリペプ
チドを取得することができる。該融合ポリペプチドはＧｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ
Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ６Ｂ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）カラム（Ｐｈａｒｍａｃｉ
ａ社製）を用いて精製することができる。 ６）Ｍｙｃタグペプチドとの融合ポリペプチドの調製 ＪＳＡＰをコードするｃＤＮＡの全長あるいは部分長ｃＤＮＡを、Ｍｙｃタグ
配列を含む発現ベクター、例えば、Ｍｙｃ−ｍｏｄｉｆｉｅｄ ｐｃＤＮＡ３〔
Ｍｙｃタグコード配列を該遺伝子の上流につなぎ、タグを付加した該タンパク質
を発現させるように改変したｐｃＤＮＡ３（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）〕のＭ
ｙｃタグ配列の下流に挿入することにより、Ｍｙｃ−ＪＳＡＰ融合ポリペプチド
を発現するベクターを作製することができる。 得られた発現ベクターを用い、上記［２］に記載の方法に準じて融合ポリペプ
チドを取得することができる。 ７）Ｈｉｓ−Ｓタグペプチドとの融合ポリペプチドの調製 ＪＳＡＰをコードするｃＤＮＡの全長あるいは部分長ｃＤＮＡを、Ｈｉｓ−Ｓ
タグ配列を含む発現ベクター、例えば、Ｈｉｓ−Ｓ−ｍｏｄｉｆｉｅｄ ｐｃＤ
ＮＡ３〔Ｈｉｓ−Ｓタグコード配列を該遺伝子の上流につなぎ、タグを付加した
該タンパク質を発現させるように改変したｐｃＤＮＡ３（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ
社製）〕のＨｉｓ−Ｓタグ配列の下流に挿入することにより、Ｈｉｓ−Ｓ−ＪＳ
ＡＰ融合ポリペプチドを発現するベクターを作製することができる。 得られた発現ベクターを用い、上記［２］に記載の方法に準じて融合ポリペプ
チドを取得することができる。 上記１）〜７）の方法に準じ、ＭＡＲキナーゼカスケードに関わるポリペプチ
ドとの融合ポリペプチドを同様に調製することができる。 （２）活性化ＪＮＫ３の調製 上記［４］（１）の方法に準じ調製したＦｌａｇ−ＪＮＫ３全長あるいは部分
長をコードするＤＮＡをｐＦｌａｇ−ＣＭＶ−２に組み込んだベクターを作製す
る。 またΔＭＥＫＫ１（ＭＥＫＫ１の１１６９−１４８８アミノ酸残基を含むペプ
チドであり恒常的に活性化されているＭＥＫＫ１）をコードするＤＮＡを発現ベ
クターｐＥＦ−ＢＯＳに組み込む。 得られた両発現ベクターをＣＯＳ−７細胞にＴｒａｎｓＩＴ−ＬＴ１（Ｍｉｒ
ｕｓ社製）を用いてトランスフェクションし、常法に準じて、ＣＯＳ−７細胞を
培養し、Ｆｌａｇ−ＪＮＫ３融合ポリペプチドおよびΔＭＥＫＫ１を、一過性に
発現させる。 培養２４−４８時間後、細胞を緩衝液Ｂ〔５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５
）、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１％ ＮＰ−４０、１０％ ｇｌｙｃｅｒｏｌ、２
ｍＭ ＭｇＣｌ２、１ｍＭ ＥＧＴＡ、２０ｍＭ β−ｇｌｙｃｅｒｏｐｈｏｓ
ｐｈａｔｅ、２ｍＭ Ｎａ３ＶＯ４、１ｍＭ ＰＭＳＦ、０．２ｍＭ ＤＴＴ〕
に溶解し、抗Ｆｌａｇ抗体カラム（Ｋｏｄａｋ社製）で活性化Ｆｌａｇ−ＪＮＫ
３精製する。 該活性化Ｆｌａｇ−ＪＮＫ３は、２０〜５０％グリセリンを含有した緩衝液あ
るいはグリセリンを含まない緩衝液中、−２０℃〜−８０℃で保存することが可
能で、使用時に解凍して用いることができる。 （３）ＪＮＫ３結合活性を指標としたスクリーニング系 ＪＮＫ３と、上記［２］で取得した各ＪＳＡＰとの結合を阻害する活性を有す
る化合物を見出すことにより、ＪＮＫ３経路を阻害することができるためアポト
ーシス等のＪＮＫ３経路に起因する疾患の予防、治療に有用である。 以下、各ＪＳＡＰとＪＮＫ３との結合を阻害する活性を有する化合物をスクリ
ーニングする方法について詳述する。 １）スクリーニング系１（培養細胞を用いる方法） 上記［４］（１）の方法に準じ調製したＳ−ＪＳＡＰ発現ベクターと、Ｆｌａ
ｇ−ＪＮＫ３発現ベクターをＣＯＳ−７細胞にＴｒａｎｓＩＴ−ＬＴ１（Ｍｉｒ
ｕｓ社製）を用いてトランスフェクションし、常法に準じて、被検化合物添加ま
たは無添加の条件下で、ＣＯＳ−７細胞を培養し、Ｓ−ＪＳＡＰおよびＦｌａｇ
−ＪＮＫ３融合ポリペプチドを、一過性に発現させる。 培養２４〜４８時間後、該培養細胞を緩衝液Ｂに溶解し、Ｓプロテインアガロ
ース（Ｓ−ｐｒｏｔｅｉｎ ａｇａｒｏｓｅ）を添加し、Ｓ−ＪＳＡＰおよびＳ
−ＪＳＡＰと結合するポリペプチドを沈降させ回収する。 該回収ポリペプチド画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥで展開し、メンブレンＩｍｍｏｂ
ｉｌｏｎ−Ｐ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製）にトランスファーする。 該メンブレンおよびプローブとしてａｎｔｉ−Ｆｌａｇ Ｍ５ ｍｏｎｏｃｌ
ｏｎａｌ抗体（Ｋｏｄａｋ社製）を用いウエスタンブロティングを行い、該抗体
と結合するポリペプチド（Ｆｌａｇ−ＪＮＫ３）をＥＣＬ検出システム（Ａｍｅ
ｒｓｈａｍ社製）で可視化し、ＪＳＡＰと結合しているＪＮＫ３量を定量化する
。 該方法により、被検化合物を入れていない場合の値をコントロールとして、Ｊ
ＮＫ３との結合を阻害する化合物を検出することができる。 被験試料としては、合成化合物、天然に存在するタンパク質、人工的に合成さ
れたタンパク質、ペプチド、糖質、脂質、これらの修飾体、誘導体を、また哺乳
動物（例えばマウス、ラット、モルモット、ハムスター、ブタ、ヒツジ、ウシ、
ウマ、イヌ、ネコ、サル、ヒト等）の尿、体液、組織抽出物、細胞培養上清、細
胞抽出物を、更に、非ペプチド性化合物、発酵生産物、植物その他の生物の抽出
物等をあげることができる。後述のスクリーニング法においても、被験試料とし
て同様のものを用いることができる。 ２）スクリーニング系２（ＥＬＩＳＡ法） 上記［４］（１）の方法に準じ調製したＧＳＴ−ＪＳＡＰ融合ポリペプチドを
そのまま、あるいはプロテアーゼｆａｃｔｏｒ Ｘａ（Ｓｉｇｍａ社製）で切断
したＪＳＡＰポリペプチド断片を結合反応に使用する。以下、これらポリペプチ
ドをＪＳＡＰ関連ポリペプチドと呼ぶ。 該ポリペプチドは使用時まで、−８０〜−２０℃でグリセリンを２０〜５０％
含有した緩衝液あるいはグリセリンを含まない緩衝液で保存することができ、使
用時に解凍して用いる。 上記ＪＳＡＰ関連ポリペプチドを９６穴プレートに添加する。 ［４］（２）で調製した活性化ＪＮＫ３、または活性化ＪＮＫ３および被検化
合物を、緩衝液、例えば、結合用緩衝液〔ｂｉｎｄｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒ：５０
ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．５％ Ｎ
Ｐ−４０〕に添加し、攪拌する。 得られた攪拌液を上記プレートに添加する。 添加後、４℃で１〜２時間放置する。 放置後、プレートを同緩衝液で３回洗浄し、残存する活性化ＪＮＫ３を、ＥＬ
ＩＳＡ法で定量する。 即ち、１次抗体として、例えば、活性化ＪＮＫ３を認識することのできるＰｈ
ｏｓｈｏ−ＳＡＰＫ／ＪＮＫ（Ｔｈｒ１８３／Ｔｙｒ１８５）抗体（Ｎｅｗ Ｅ
ｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ社製）を使用し、２次抗体として上記抗体を認識
することのできる抗体を用い、ＥＬＴＳＡ法で残存活性化ＪＮＫＳ量を定量する
ことができる。 該方法により、被検化合物を入れていない場合の値をコントロールとして、Ｊ
ＮＫ３との結合を阻害する化合物を検出することができる。 （４）ＪＮＫ３によるＪＳＡＰ１のリン酸化を指標としたスクリーニング系 後述の実施例より得られた、ａ）〜ｃ）の知見より、ＪＳＡＰ１のリン酸化を
阻害する活性を有する化合物をスクリーニングする方法を確立することは、ＪＮ
Ｋ３経路に起因する疾患の予防、治療に有用な化合物を検出する上で重要である
。 ａ）活性化されていないＪＮＫ３は、脳に選択的に発現しているスキャフォル
ド ポリペプチドＪＳＡＰ１ａ、ｂ、ｃ、ｄに結合している。 ｂ）ＴＮＦ−α、ＩＬ−１、ＥＧＦ、ＬＰＳ等の細胞外の種々のストレスによ
り、ＪＮＫ３経路が活性化（ＭＡＰＫＫＫ→ＭＡＰＫＫ→ＪＮＫ３）されると、
ＪＮＫ３そのものが活性化（リン酸化）され、活性化されたＪＮＫ３はＪＳＡＰ
１ａ、ｂ、ｃ、ｄをリン酸化する。 ｃ）ＪＮＫ３はＪＳＡＰ１をリン酸化後、ＪＳＡｐ１から解離し、核内へ移行
する。 核内へ移行したＪＮＫ３は種々の転写因子を活性化して、その細胞をアポトー
シスなどへ導くと考えられる。従って、このＪＮＫ３によるＪＳＡＰ１のリン酸
化を阻害する活性を有する化合物を見出せば、ＪＮＫ３経路を阻害することがで
き、アポトーシス等のＪＮＫ３経路に起因する疾患の予防、治療に有用である。 以下、ＪＮＫ３によるＪＳＡＰ１のリン酸化を阻害する活性を有する化合物を
スクリーニングする方法について詳述する。 １）スクリーニング系（ｃｅｌｌ−ｆｒｅｅ系） １）−１ スクリーニング系１（ラジオアイソトープを使用する方法） ［４］（１）に記載の方法に準じて調製したＧＳＴ−ＪＳＡＰ１あるいはＪ ＳＡＰ１、および［４］（２）に記載の方法に準じて調製した活性化ＪＮＫ３ 、または活性化ＪＮＫ３および被検化合物を、緩衝液、例えば、緩衝液Ａ〔２０
ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１０ｍＭ ＭｇＣｌ２、５ｍＭ β−ｍｅｒｃａｐｔｏｅｔ
ｈａｎｏｌ、０．１ｍｇ／ｍｌ ＢＳＡ（ｐＨ７．４）〕に添加、混合し、スク
リーニング試験液を調製する。該スクリーニング試験液を９６穴プレートに添加
する。 添加後、該プレートに［γ−３２Ｐ］ＡＴＰあるいは［γ−３３Ｐ］ＡＴＰを
添加する。５〜３０分間反応後、５０ｍＭ ＥＤＴＡを添加して反応を停止する
。 反応停止後、反応液中のポリペプチドを、９６ウエルニトロセルロースメンブ
レンプレート、９６ウェルホスホセルロースメンブレンプレート、あるいは９６
ウェルＰＶＤＦメンブレンプレートの各ウェルのメンブレンに、吸引ろ過により
トラップし、該メンブレンを同緩衝液で吸引洗浄する。 該メンブレンを液体シンチレーターＭｉｃｒｏｓｃｉｎｔ−２０（Ｐａｃｋａ
ｒｄ社製）に入れ、メンブレン上の３２Ｐあるいは３３Ｐ放射活性をＴｏｐ ｃ
ｏｕｎｔ（Ｐａｃｋａｒｄ社製）でカウントする。 該方法により、被検化合物を入れていない場合のカウントをコントロールとし
て、ＪＮＫ３によるＪＳＡＰ１のリン酸化を阻害する活性を有する化合物を検出
することができる。 １）−２ スクリーニング系２（ＥＬＩＳＡ法） ［３］に記載した方法に準じて取得したＪＳＡＰ１を認識する抗体（１次抗体
）を、９６穴プレートにコートする。 上記１）−１に記載した方法に準じて調製したスクリーニング試験液に、ＡＴ
Ｐを５０μＭ添加する。 添加後、室温で５〜６０分間反応を行い、０．２５Ｎ ＨＣｌで反応を停止す
る。 停止後、０．２５Ｎ ＮａＯＨおよび０．１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌを含む溶液
（ｐＨ８．０）で中和する。 該中和液の一部一定量を、上記１次抗体でコートしたプレートに添加し、放置
する。 放置後、プレートを同緩衝液で洗浄し、［３］に記載した方法に準じて取得し
たリン酸化されたＪＳＡＰ１を認識する抗体（２次抗体）を添加する。 常法により２次抗体の量をＥＬＩＳＡで定量することにより、リン酸化された
ＪＳＡＰ１の量を定量する。 該方法により、被検化合物を入れていない場合のリン酸化されたＪＳＡＰ１の
量をコントロールとして、ＪＮＫ３によるＪＳＡＰ１のリン酸化を阻害する活性
を有する化合物を検出することができる。 上記１）−１および１）−２の方法により取得される、本発明のポリペプチド
とＪＮＫ３との結合を阻害する化合物またはＪＳＡＰ１のリン酸化を阻害する活
性を有する化合物は、治療薬として単独で用いることが可能ではあるが、通常は
薬理学的に許容される一つあるいはそれ以上の担体と一緒に混合し、製剤学の技
術分野においてよく知られる任意の方法により製造した医薬製剤として用いるこ
とが望ましい。 該治療薬の投与方法としては、治療に際し最も効果的な方法を使用することが
望ましく、経口投与または、口腔内、気道内、直腸内、皮下、筋肉内および静脈
内等の非経口投与による方法を用いることができる。 該治療薬の剤形としては、軟膏剤、噴霧剤、カプセル剤、錠剤、顆粒剤、シロ
ップ剤、乳剤、座剤、注射剤、テープ剤等をあげることができる。 経口投与に適当な製剤としては、乳剤、シロップ剤、カプセル剤、錠剤、散剤
、顆粒剤等をあげることができる。 乳剤およびシロップ剤のような液体調製物は、水、ショ糖、ソルビトール、果
糖等の糖類、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール等のグリコール類
、ごま油、オリーブ油、大豆油等の油類、ｐ−ヒドロキシ安息香酸エステル類等
の防腐剤、ストロベリーフレーバー、ペパーミント等のフレーバー類等を添加剤
として用いて製造することができる。 カプセル剤、錠剤、散剤、顆粒剤等は、乳糖、ブドウ糖、ショ糖、マンニトー
ル等の賦形剤、デンプン、アルギン酸ナトリウム等の崩壊剤、ステアリン酸マグ
ネシウム、タルク等の滑沢剤、ポリビニルアルコール、ヒドロキシプロピルセル
ロース、ゼラチン等の結合剤、脂肪酸エステル等の界面活性剤、グリセリン等の
可塑剤等を添加剤として用い製造することができる。 非経口投与に適当な製剤としては、注射剤、座剤、噴霧剤等があげられる。 注射剤は、例えば、塩溶液、ブドウ糖溶液、あるいは両者の混合物からなる担
体等を用いて調製することができる。 座剤は、例えば、カカオ脂、水素化脂肪またはカルボン酸等の担体を用いて調
製することができる。 噴霧剤は、上記で取得されたリン酸化阻害剤または結合阻害剤をそのまま噴霧
剤として用いることが可能であるが、受容者の口腔および気道粘膜を刺激せず、
かつ該化合物を微細な粒子として分散させ吸収を容易にさせる担体等を用いて調
製した噴霧剤が好ましい。 担体として、具体的には乳糖、グリセリン等を例示することができる。 上記で取得されたアゴニストまたはアンタゴニスト、および担体の性質により
、エアロゾル、ドライパウダー等の製剤を調製することが可能である。 これらの非経口剤においても、経口剤で添加剤として例示した成分を添加する
ことができる。 投与量または投与回数は、目的とする治療効果、投与方法、治療期間、年齢、
体重等により異なるが、通常成人１日当たり１０μｇ／ｋｇ〜８ｍｇ／ｋｇであ
る。 ［５］本発明のポリペプチドの発現を調節する化合物（以下、発現調節化合物と
略す）の探索および同定 （１）本発明の抗体を用いた発現調節化合物の探索および同定 本発明のポリペプチドを発現する細胞を被験試料と接触させた後、本発明の抗
体を用いることにより、その細胞中、細胞培養上清中に存在する発現調節化合物
を探索、同定することができる。 細胞としては、本発明のポリペプチドを発現している細胞、細胞株、組織なら
ばいかなるものでも用いることができる。 また、［３］に記載した抗体により免疫学的に検出する方法を用い、該ポリペ
プチドの発現が認められた細胞、細胞株あるいは組織を用いることができる。 好適な細胞株として、例えば、レチノイン酸で神経細胞様に分化させたマウス
由来Ｐ１９細胞（ＡＴＣＣ：ＣＲＬ−１８２５）をあげることができる。 被験試料としては、上記［４］の被験試料であげたものを用いることができる
。 本発明のポリペプチドを発現する細胞を、該細胞の増殖することのできる培地
に懸濁し、被験試料を該培地に添加し、該細胞と接触させた後、本発明の抗体を
用い、該細胞の発現したポリペプチド含量を定量する。抗体を用いて定量する方
法としては、例えば下記の免疫細胞染色を利用した方法をあげることができる。 培養付着細胞をＰＢＳ緩衝液で洗浄し、０．０５％ トリプシン、０．０２％
ＥＤＴＡ（エチレンジアミン４酢酸）を含むＰＢＳ緩衝液３ｍｌを加え、余分
な溶液を除いた後、３７℃、５分間インキュベートすることによりフラスコより
細胞を剥がす。 浮遊細胞については培養細胞をそのまま用いることができる。 免疫細胞染色を行う細胞を免疫細胞染色用緩衝液（１％ ＢＳＡ、０．０２％
ＥＤＴＡ、０．０５％ アジ化ナトリウムを含むＰＢＳ）等に懸濁し、１〜２
０×１０５個ずつ丸底９６穴プレートに分注する。 該プレートに、本発明のモノクローナル抗体を分注する。 モノクローナル抗体としては、［３］（２−３）で取得した本発明のモノクロ
ーナル抗体を産生するハイブリドーマの培養上清、［３］（２−４）で取得した
精製モノクローナル抗体をあげることができる。更に、該モノクローナル抗体を
標識した抗体も用いることができる。 モノクローナル抗体を標識した抗体としては、例えばビオチン標識した抗体を
あげることができる。 ビオチン標識した抗体は公知の方法（酵素抗体法：学際企画刊１９８５年）で
調製することができる。 上記抗体を、免疫細胞染色用緩衝液あるいは１０％動物血清を含む免疫細胞染
色用緩衝液を用いて０．１〜５０μｇ／ｍｌの濃度になるように希釈する。 該希釈抗体を２０〜５００μｌ／穴となるように分注し、氷冷下で３０分間放
置する。 標識されていない抗体を用いた場合には、上記プレートに免疫細胞染色用緩衝
液を添加し、細胞を洗浄後、ＦＩＴＣ（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ ｉｓｏｔｈｉ
ｏｃｙａｎａｔｅ）あるいはフィコエリスリン等の蛍光色素で標識した抗マウス
イムノグロブリン抗体あるいは抗ラットイムノグロブリン抗体を０．１〜５０μ
ｇ／ｍｌ程度の濃度で含む免疫細胞染色用緩衝液を５０〜５００μｌ／穴ほど分
注し、氷冷下で３０分間遮光して放置する。 ビオチン標識した該モノクローナル抗体を用いた場合には、上記プレートにＦ
ＩＴＣあるいはフィコエリスリン等の蛍光色素で標識したストレプトアビジンを
５０〜５００μｌ／穴ほど分注し、氷冷下で３０分間遮光して放置する。 両ケースとも、放置後、プレートに免疫細胞染色用緩衝液を添加し、細胞を良
く洗浄し、蛍光顕微鏡、セルソーター等により解析する。 上記において被験試料を添加せず、同様の操作を行い、得られた解析結果と、
被験試料を添加して得られた解析結果とを比較し、本発明のポリペプチド含量を
増加あるいは減少させることのできた被験試料を探索することにより、発現調節
化合物を同定することができる。 （２）本発明のポリペプチド遺伝子の転写産物定量系を用いた探索および同定 本発明のポリペプチドあるいは該ポリペプチドをコードするｍＲＮＡを発現す
る細胞を被験試料と接触させた後、該ｍＲＮＡ含量を定量することにより発現調
節化合物を探索、同定することができる。 本発明のポリペプチドあるいは該ポリペプチドをコードするｍＲＮＡを発現す
る細胞を、該細胞の増殖することのできる培地に懸濁し、被験試料を該培地に添
加し、該細胞を接触させた後、該細胞の発現した該ｍＲＮＡの含量を、通常のノ
ーザンハイブリダイゼーション法、ＲＮＡのドットブロットハイブリダイゼーシ
ョン法、ＲＴ−ＰＣＲ法等を用い定量する。 ハイブリダイゼーション法等に用いることのできるプローブおよびＲＴ−ＰＣ
Ｒ法等に用いることのできるプライマーとして、本発明のポリペプチドをコード
する遺伝子断片をあげることができる。 具体的には、配列番号１〜８記載の塩基配列中の連続した５〜６０塩基と同じ
配列を有するオリゴヌクレオチド、該オリゴヌクレオチドと相補的な配列を有す
るオリゴヌクレオチドを好適に用いることができる。 上記において被験試料を添加せず、同様の操作を行い、得られた定量結果と、
被験試料を添加して得られた定量結果とを比較し、本発明のポリペプチドをコー
ドするｍＲＮＡ含量を増加あるいは減少させることのできた被験試料を探索する
ことにより、発現調節化合物を同定することができる。 （３）レポーター遺伝子を用いた探索および同定 本発明のポリペプチドをコードする遺伝子の転写を制御する領域（以下、転写
制御領域と略す）の下流にレポーター遺伝子の連結されたＤＮＡを含むプラスミ
ドで形質転換された形質転換体と被験試料とを接触させた後、レポーター遺伝子
によりコードされたポリペプチドの発現量を定量することにより発現調節化合物
を探索、同定することができる。 転写制御領域は、通常、遺伝子の５’上流に含まれることが多い。本発明のポ
リペプチドをコードする遺伝子の５’上流領域は、例えばＧｅｎｏｍｅ Ｗａｌ
ｋｅｒ ｋｉｔｓ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）等を用いて調製することができる。
また、該領域を適当な制限酵素を用い、適切な長さに切断した断片を転写制御領
域として用いることができる。 レポーター遺伝子としては、該遺伝子の翻訳産物が細胞内で安定であり、該翻
訳産物の存在量が容易に定量できるものであればいかなるものでも用いることが
でき、例えば、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）、
β−ガラクトシダーゼ（β−ｇａｌ）、ルシフェラーゼ（ｌｕｃ）、グリーンフ
ルオレッセントプロテイン（ＧＦＰ）等をあげることができる。 該転写制御領域を含むレポータープラスミドを導入する宿主細胞としては、い
かなる細胞も用いることができるが、好適には、［５］（１）記載の本発明のポ
リペプチドあるいは該ポリペプチドｍＲＮＡの発現が認められている細胞株を用
いることができる。 被験試料として、上記［４］のものを用いることができる。 転写制御領域の下流に常法によりレポーター遺伝子を連結し、作製したプラス
ミドを用い、常法により宿主細胞を形質転換する。 また、ポジティブセレクション用マーカー（Ｇ４１８耐性遺伝子等）およびネ
ガティブセレクション用マーカー（単純ヘルペスウイルスのチミジンキナーゼや
ジフテリア毒素Ａフラグメント遺伝子等）をつないだジーンターゲティングベク
ターを作成し、本発明のポリペプチドをコードする遺伝子の一部をレポーター遺
伝子で置換した細胞株を作成することもできる〔Ｎａｔｕｒｅ，３３６，３４８
（１９８８）、Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２１４，７
７（１９９３）、Ｇｅｎｅ Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ，Ｔｈｅ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ
Ａｐｐｒｏａｃｈ Ｓｅｒｉｅｓ，ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ（１９９３）〕。 該形質転換体を、例えば該細胞の増殖することのできる培地に懸濁し、被験試
料を該培地に添加し、該細胞を接触させた後、該細胞の発現したレポーター遺伝
子にコードされたポリペプチドの量を、該ポリペプチドに適した方法で検出、定
量する。 検出、定量法として、ＣＡＴの場合には、例えば、モレキュラー クローニン
グ 第２版，１６章，６０頁に記載の方法を、β−ｇａｌの場合には、例えば、
モレキュラー クローニング 第２版，１６章，６６頁に記載の方法を、ｌｕｃ
の場合には、例えば、実験医学別冊バイオマニュアルシリーズ４遺伝子導入と発
現・解析法，８１（１９９４）に記載の方法を、ＧＦＰの場合には、例えば、Ｐ
ｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９４，４６５３（１９９７）記
載の方法等をあげることができる。 上記において被験試料を添加せず、同様の操作を行い、得られた定量結果と、
被験試料を添加して得られた定量結果とを比較し、レポーター遺伝子にコードさ
れたポリペプチド含量を増加あるいは減少させることのできた被験試料を探索す
ることにより、発現調節化合物を同定することができる。 ［６］本発明のＤＮＡ、ポリペプチド、抗体、結合阻害剤、リン酸化阻害剤およ
び発現調節化合物の利用 （１）本発明のＤＮＡは、該ＤＮＡをプローブとして用いて、ヒトの組織やヒト
由来の細胞から［１］（１）と同様にして抽出したＲＮＡについてノーザンハイ
ブリダイゼーションを行うことにより、その組織や細胞における本発明のポリペ
プチド遺伝子のｍＲＮＡを検出あるいは定量することができる。各種の組織でそ
のｍＲＮＡの発現量を比較することにより本発明のポリペプチドの組織発現分布
を知ることができる。 （２）本発明のオリゴヌクレオチドは、本発明のＤＮＡの特異的プライマーとし
て用いて、ヒトの組織やヒト由来の細胞から［１］（１）と同様にして抽出した
ＲＮＡについてＲＴ−ＰＣＲ〔ｒｅｖｅｒｓｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ
ＰＣＲ；ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ（１９９０）］を行うことにより、本発明
のポリペプチドをコードするｍＲＮＡの検出や定量を行うことができる。 該ｍＲＮＡを定量する方法は、本遺伝子が関与する病態の診断に用いることが
できる。 各種病態モデル動物において、該ｍＲＮＡを定量することにより、病態におけ
る該遺伝子産物の重要性を明らかにすることができる。また、薬剤の有無による
該ｍＲＮＡの発現量を比較することにより薬剤を評価することができる。 （３）本発明のオリゴヌクレオチドは、これをプローブとして用いて、ヒトの組
織切片に対してｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション〔Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ
Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，２５４，４１９（１９９５）〕を行うことにより、組
織内での本発明のポリペプチドの発現細胞の特定等、より細かい発現分布を知る
ことができる。 これらの方法によって得られる、本発明のポリペプチドがどのような組織や細
胞で発現しているかに関する情報および細胞がどのような刺激を受けたときに発
現量が変化するかに関する情報は、本発明のポリペプチドの生理機能や病態への
関与を解析するために有用である。 （４）本発明のＤＮＡをプローブとして用い、ゲノムＤＮＡに対してサザンハイ
ブリダイゼーション（モレキュラー クローニング 第２版）を行うことにより
、本発明のポリペプチドをコードする遺伝子の変異を検出することができる。 変異の検出を行うことにより、該遺伝子の変異が原因となっている可能性のあ
る、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病、多発性硬化症等の神
経変性疾患、筋萎縮性側索硬化症等の筋萎縮性疾患、虚血性疾患、脳卒中時の脳
障害、精神分裂病、うつ病、てんかん、各種免疫、炎症性疾患の診断を行うこと
ができる。 （５）本発明のアンチセンス・オリゴヌクレオチド（ＲＮＡ／ＤＮＡ）を用い、
本発明のポリペプチドをコードする遺伝子の転写もしくはｍＲＮＡの翻訳を抑制
することにより〔化学，４６，６８１（１９９１）、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏ
ｇｙ，９，３５８（１９９２）〕、該遺伝子が発症に関与している可能性のある
、例えばアルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病、多発性硬化症等
の神経変性疾患、筋萎縮性側索硬化症等の筋萎縮性疾患、虚血性疾患、脳卒中時
の脳障害、精神分裂病、うつ病、てんかん、各種免疫、炎症性疾患の疾患の予防
や治療に用いることができる。 上述のアンチセンス・オリゴヌクレオチドは、本発明のポリペプチドをコード
するＤＮＡの配列番号１〜８の塩基配列中の連続した５〜６０塩基と相補的な配
列を有するオリゴヌクレオチド、好ましくは本発明のポリペプチドをコードする
ＤＮＡの翻訳開始領域にある５〜６０塩基と相補的な塩基配列を基にして設計・
調製し、生体内に投与する。 本発明のＤＮＡを含有する医薬は、上記［４］の本発明のポリペプチドのリン
酸化阻害剤または結合阻害剤の医薬製剤の調製法と同様な方法を用いて調製する
ことができ、調製された該医薬製剤を上記［４］の場合と同様の方法で投与する
ことができる。 （６）本発明のＤＮＡを用い、［２］記載の方法により本発明のポリペプチドを
取得することができる。 本発明のポリペプチドの用途としては、アルツハイマー病、パーキンソン病、
ハンチントン病、多発性硬化症等の神経変性疾患、筋萎縮性側索硬化症等の筋萎
縮性疾患、虚血性疾患、脳卒中時の脳障害、精神分裂病、うつ病、てんかん、各
種免疫、炎症性疾患の治療薬または予防薬が考えられる。 本発明のポリペプチドを含有する医薬は、上記［４］の本発明のポリペプチド
のリン酸化阻害剤または結合阻害剤の医薬製剤の調製法と同様な方法を用いて調
製することができ、調製された該医薬製剤を上記［４］の場合と同様の方法で投
与することができる。 （７）本発明のオリゴヌクレオチドは一本鎖または二本鎖としてレトロウィルス
、アデノウィルス、アデノ随伴ウィルス等のウイルスベクター、その他のベクタ
ーに組み込んで遺伝子治療用ベクターとして、遺伝子治療に用いることができる
。 （８）本発明のポリペプチドを抗原として用い、［３］記載の方法により本発明
のポリペプチドに対する抗体を製造することができる。 本発明のポリペプチドに対する抗体を用いて、本発明のポリペプチドを免疫学
的に検出または定量することができる。 具体的にはマイクロタイタープレートを用いるＥＬＩＳＡ法、酵素標識抗体法
や蛍光抗体法による免疫組織染色、ウェスタンブロット法等を用いた検出法をあ
げることができる。 具体的には、液相中で本発明のポリペプチドと反応する抗体のうちエピトープ
が異なる２種類のモノクローナル抗体を用いたサンドイッチＥＬＩＳＡ法、１２
５Ｉ等の放射性同位体で標識した本発明のポリペプチドと本発明のポリペプチド
を認識する抗体を用いるラジオイムノアッセイ法等をあげることができる。 また、本発明の抗体は病理組織切片を用いた免疫組織染色にも利用できる。 本発明の抗体を用い、健常者および被験者の細胞または組織に存在する本発明
のポリペプチドを免疫学的に検出または定量し、その量を健常者と被験者とで比
較し、発現量が変化しているかどうかを調べることにより、被験者の神経変性疾
患（アルツハイマー病、パーキンソン病など）、虚血性疾患、脳卒中時の脳障害
、てんかん、各種の免疫、炎症性疾患の診断に用いることができる。 （９）本発明のポリペプチドの機能（ＪＮＫ３ スキャフォルド ポリペプチド
あるいはＪＮＫ３によるリン酸化の基質、あるいはＪＮＫ３との結合）を阻害す
る抗体を投与することにより、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチント
ン病、多発性硬化症等の神経変性疾患、筋萎縮性側索硬化症等の筋萎縮性疾患、
虚血性疾患、脳卒中時の脳障害、精神分裂病、うつ病、てんかん、各種免疫、炎
症性疾患の予防、治療が可能となる。 本発明の抗体を含有する医薬は、上記［４］の本発明のポリペプチドのリン酸
化阻害剤または結合阻害剤の医薬製剤の調製法と同様な方法を用いて調製するこ
とができ、調製された該医薬製剤を上記［４］の場合と同様の方法で投与するこ
とができる。 （１０）本発明のリン酸化阻害剤、結合阻害剤および本発明のポリペプチド遺伝
子の発現を調節する化合物は、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチント
ン病、多発性硬化症等の神経変性疾患、筋萎縮性側索硬化症等の筋萎縮性疾患、
虚血性疾患、脳卒中時の脳障害、精神分裂病、うつ病、てんかん、各種免疫、炎
症性疾患の予防、治療として用いることができる。発明を実施するための最良の形態 以下により具体的な実施例をあげて説明するが、これにより本発明の範囲が限
定されるものではない。 下記実施例における遺伝子操作的手法は、特に断らない限りモレキュラー ク
ローニング 第２版に記載されている常法に準じて行った。 実施例１ ＪＮＫ３と結合する活性を有するポリペプチドをコードするｃＤＮＡ
のクローン化 （１）マウス脳由来ｃＤＮＡライブラリーからのクローン化 マウスＪＮＫ３〔Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，３，８９（１９９７）〕
をコードする全長ｃＤＮＡを、ＧＡＬ４ ＤＮＡ結合ドメインをコードする配列
を含むクローニングベクターｐＡＳ２−１（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）のＮｃｏＩ
−ＢａｍＨＩサイトに組み込み（ｐＡＳ２−１−ＪＮＫ３）、酵母ＣＧ−１９４
５（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）に導入した。 ＧＡＬ４転写活性化ドメインをコードする配列を含むクローニングベクターｐ
ＧＡＤ１０マウス脳ｃＤＮＡ ライブラリー（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）を、上記
ｐＡＳ２−１−ＪＮＫ３を導入した酵母に導入し、形質転換酵母を取得した。 該形質転換酵母より、ヒスチジン要求性がなくなった株（ヒスチジンを含有し
ない培地で生育してくる）、またはβ−ガラクトシダーゼ活性を有する株を選択
した（一次ポジテイブクローン）。 得られた一次ポジテイブクローンより、ヒスチジン要求性がなく、かつβ−ガ
ラクトシダーゼ活性を有するクローンを選択した（二次ポジテイブクローン）。 得られたクローンからｐＧＡＤ１０由来のプラスミドを回収した。 その結果、上記酵母によるｔｗｏ−ｈｙｂｒｉｄ ｓｙｓｔｅｍにより、マウ
ス脳ｃＤＮＡライブラリーより、配列の異なる４種類の部分長ｃＤＮＡフラグメ
ントを取得した。 これら得られたフラグメントをプローブとして利用し、常法によりλＺＡＰＩ
Ｉマウス脳ｃＤＮＡライブラリー（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）をスクリーニングす
ることにより、ＪＮＫ３と結合することのできるポリペプチド（ＪＳＡＰ）であ
る、ＪＳＡＰ１ａ、ＪＳＡＰ１ｂ、ＪＳＡＰ１ｃ、ＪＳＡＰ１ｄ、ＪＳＡＰ３、
ＪＳＡＰ４およびＪＳＡＰ５をコードする７種類のｃＤＮＡクローンを取得した
。 ＪＳＡＰ１ａ、ＪＳＡＰ１ｂ、ＪＳＡＰ１ｃ、ＪＳＡＰ１ｄ、ＪＳＡＰ３およ
びＪＳＡＰ４をコードするｃＤＮＡは全長ｃＤＮＡとして取得されたが、ＪＳＡ
Ｐ５をコードするｃＤＮＡは部分長のｃＤＮＡとして取得された。 ＪＳＡＰ１ａ、ＪＳＡＰ１ｂ、ＪＳＡＰ１ｃ、ＪＳＡＰ１ｄ、ＪＳＡＰ３また
はＪＳＡＰ４をコードするｃＤＮＡにはそれぞれ、３，９１８ｂｐ、３，９４５
ｂｐ、４，０１４ｂｐ、４，０１１ｂｐ、１，２９３ｂｐ、４，５２７ｂｐのオ
ープンリーディングフレーム（以下、ＯＲＦと略す）が存在し、それぞれ、１３
０５残基、１３１４残基、１３３７残基、１３３６残基、１５０８残基のアミノ
酸残基をコードしていることが分かった（配列番号１〜６）。 またＪＳＡＰ１ａ、ＪＳＡＰ１ｂ、ＪＳＡＰ１ｃ、ＪＳＡＰ１ｄは同一の遺伝
子由来のスプライスバリアントでった。即ち、ＪＳＡＰ１ａにおいて、２７ｂｐ
の塩基配列が挿入されたものがＪＳＡＰ１ｂ、３ｂｐおよび９３ｂｐの塩基配列
が挿入されたものがＪＳＡＰ１ｃ、９３ｂｐの塩基配列が挿入されたものがＪＳ
ＡＰ１ｄであった。 具体的には、ＪＳＡＰ１ｂの挿入箇所は、配列番号１００２０１番目のセリン
残基から２０９番目のセリン残基の９残基のアミノ酸をコードする２７ｂｐのＤ
ＮＡ配列部、ＪＳＡＰ１ｃの挿入箇所は、配列番号１１の２０１番目のセリン残
基をコードする３ｂｐのＤＮＡ配列部および２１９番目のバリン残基から２４９
番目のグルタミン残基をコードする３１残基のアミノ酸をコードする９３ｂｐの
ＤＮＡ配列部、ＪＳＡＰ１ｄの挿入箇所は、配列番号１２０２１８番目のバリン
残基から２４８番目のグルタミン残基の３１残基のアミノ酸をコードする９３ｂ
ｐのＤＮＡ配列部である。 ＪＳＡＰ１ａは既に公知の配列〔配列番号９：１９９７年日本分子生物学会（
１２月）〕と一致していた。 ＪＳＡＰ３は、ｈｕｍａｎ Ｃ−ｔｅｒｍｉｎａｌ−ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏ
ｔｅｉｎ １（ＣｔＢＰ）〔ＥＭＢＯ Ｊ．，１７，５１２９（１９９８）〕の
マウスホモログであると推定された（配列番号１３）。 配列番号１４で示されるアミノ酸配列を有するＪＳＡＰ４中には、該アミノ酸
配列８７〜１２１番目、３４１〜３７３番目、６５８〜６９０番目、７００〜７
３２番目に、ＷＤ４０−ｒｅｐｅａｔと呼ばれる配列が見られた。 該配列は、他のタンパク質との相互作用（結合）に関与し得ることが予想され
、またＧ−プロテイン（Ｇ−ｐｒｏｔｅｉｎ）といった、細胞内情報伝達を担う
分子中にもみられる〔ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．，３０７，１３１（１９９４）〕。
該配列は、後述の実施例よりＪＮＫ３経路において、情報伝達に重要な機能を有
していることが明らかとなった。 ＪＳＡＰ５をコードするｃＤＮＡは配列番号７に示した、７３４ｂｐよりなる
ＤＮＡであった。このｃＤＮＡには開始、および終止コドンがなく、部分長であ
ることがわかった。該ｃＤＮＡは２４４アミノ酸残基をコードしていた（配列番
号１５）。 ＪＳＡＰ５の全長ｃＤＮＡ（配列番号８）を、ＪＳＡＰ５のｃＤＮＡ塩基配列
情報を基に作製したプローブを用い、λＺＡＰＩＩマウス脳ｃＤＮＡライブラリ
ー（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）より、常法により、取得した。該ｃＤＮＡには１，
４５５ｂｐのＯＲＦが存在し、４８４残基のアミノ酸残基をコードしていること
が分かった（配列番号１６：以下、ＪＳＡＰ５Ｆと略す）。以下の実験には、Ｊ
ＳＡＰ５Ｆの部分長であるＪＳＡＰ５のｃＤＮＡを用いた。 （２）ＪＳＡＰの性質の解析に用いる種々のポリペプチドおよび該ポリペプチド
を発現するベクターの調製 ＪＮＫ３に結合することのできる上記で取得されたポリペプチドＪＳＡＰの機
能を解析するために、下記のポリペプチドおよび該ポリペプチドを発現するベク
ターを調製した。 １）チオレドキシンＳタグ（ｔｈｉｏｒｅｄｏｘｉｎ・Ｓ−ｔａｇ、以下、Ｔｒ
ｘ・Ｓと略す）ペプチドとの融合ポリペプチドを発現するベクターの調製 ＪＮＫ１、ＪＮＫ２、ＪＮＫ３およびＳＥＫ１のｃＤＮＡはλＺＡＰＩＩマウ
ス脳ｃＤＮＡライブラリー（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）より、ＭＥＫＫ１ ｃＤＮ
ＡはλＺＡＰＩＩマウス脾臓ｃＤＮＡライブラリー（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）か
ら常法により取得した。 ｃ−Ｒａｆ１ ｃＤＮＡはＨｅａｌｔｈ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ
Ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ Ｂａｎｋ，Ｊａｐａｎ提供のｃＤＮＡライブラリーから
取得した。 ヒトリンパ球由来のＭＫＫ６、ｐ３８、ＥＲＫ２、ｃ−Ｊｕｎ（１−７９）お
よびＡＴＦ２、マウス胸腺由来のＭＥＫ１、ＭＫＫ７およびＣｄｃ４２のｃＤＮ
ＡをＰＣＲ法を用いることにより取得した。 得られた各々のｃＤＮＡをｐＥＴ３２ａ（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）のＴｒｘ・Ｓ
配列の下流に挿入し、Ｔｒｘ・Ｓ−ＪＮＫ１、Ｔｒｘ・Ｓ−ＪＮＫ２、Ｔｒｘ・
Ｓ−ＪＮＫ３、Ｔｒｘ・Ｓ−ＳＥＫ１、Ｔｒｘ・Ｓ−ＭＥＫＫ１、Ｔｒｘ・Ｓ−
ｃ−Ｒａｆ１、Ｔｒｘ・Ｓ−ＭＫＫ６、Ｔｒｘ・Ｓ−ｐ３８、Ｔｒｘ・Ｓ−ＥＲ
Ｋ２、Ｔｒｘ・Ｓ−ｃ−Ｊｕｎ、Ｔｒｘ・Ｓ−ＡＴＦ２、Ｔｒｘ・Ｓ−ＭＥＫ１
、Ｔｒｘ・Ｓ−ＭＫＫ７またはＴｒｘ・Ｓ−Ｃｄｃ４２を発現するベクターを各
々作製した。 上記（１）で取得したＪＳＡＰをコードするＤＮＡまたは該ＤＮＡの断片を、
発現ベクターｐＥＴ３２ａ（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）のＴｒｘ・Ｓ配列の下流に存
在する下記制限酵素サイトに挿入し、Ｔｒｘ・Ｓ−ＪＳＡＰ１ａ、Ｔｒｘ・Ｓ−
ＪＳＡＰ１ｂ、Ｔｒｘ・Ｓ−ＪＳＡＰ１ｃ、Ｔｒｘ・Ｓ−ＪＳＡＰ１ｄ、Ｔｒｘ
・Ｓ−ＪＳＡＰ３、Ｔｒｘ・Ｓ−ＪＳＡＰ４、Ｔｒｘ・Ｓ−ＪＳＡＰ５を発現す
るベクターを各々作製した。 挿入した各ＤＮＡのコードするポリペプチドおよび各挿入制限酵素サイトは以
下の通りである。 ＪＳＡＰ１ａ（１１５〜２７４アミノ酸残基）：ＮｃｏＩ−ＢａｍＨＩサイト ＪＳＡＰ１ａ（１１５〜５０４アミノ酸残基）：ＥｃｏＲＩサイト ＪＳＡＰ１ａ（２６８〜４８６アミノ酸残基）：ＮｃｏＩサイト ＪＳＡＰ１ａ（４８６〜７４４アミノ酸残基）：ＮｃｏＩ−ＢａｍＨＩ ＪＳＡＰ１ａ（７４４〜１１９４アミノ酸残基）：ＢａｍＨＩサイト ＪＳＡＰ１ｂ（１１５〜２８３アミノ酸残基）：ＮｃｏＩ−ＢａｍＨＩサイト ＪＳＡＰ１ｃ（１１５〜３０６アミノ酸残基）：ＮｃｏＩ−ＢａｍＨＩサイト ＪＳＡＰ１ｄ（１１５〜３０５アミノ酸残基）：ＮｃｏＩ−ＢａｍＨＩサイト ＪＳＡＰ３（全長）：ＥｃｏＲＩ−ＳａｌＩサイト ＪＳＡＰ４（１０４２〜１３３１アミノ酸残基）：ＥｃｏＲＩ−ＨｉｎｄＩＩ
Ｉサイト ＪＳＡＰ５（部分長）：ＥｃｏＲＩサイト また、ＡＴＦ２の１〜１０７アミノ酸残基をコードするＤＮＡおよびＡＴＦ２
の１〜１１６アミノ酸残基をコードするＤＮＡを、発現ベクターｐＥＴ３２ａ（
Ｎｏｖａｇｅｎ社製）のＴｒｘ・Ｓ配列の下流にあるＢａｍＨＩ−ＸｈｏＩ、Ｂ
ａｍＨＩ−ＸｈｏＩサイトにそれぞれ挿入し、Ｔｒｘ・Ｓ−ＡＴＦ２（１−１０
７アミノ酸残基）、Ｔｒｘ・Ｓ−ＡＴＦ２（１−１１６アミノ酸残基）を調製し
た。 ２）Ｆｌａｇペプチドとの融合ポリペプチドを発現するベクターの調製 ＪＮＫ１、ＪＮＫ２、ＪＮＫ３、ＥＲＫ２またはｐ３８をコードする全長のｃ
ＤＮＡを哺乳動物発現ベクターｐＦｌａｇ−ＣＭＶ−２（Ｋｏｄａｋ社製）のＦ
ｌａｇ配列の下流に存在するＮｏｔＩ−ＢａｍＨＩサイトにそれぞれ挿入し、Ｆ
ｌａｇ−ＪＮＫ１、Ｆｌａｇ−ＪＮＫ２、Ｆｌａｇ−ＪＮＫ３、Ｆｌａｇ−ＥＲ
Ｋ２またはＦｌａｇ−ｐ３８を発現するベクターを各々作製した。 また、下記ポリペプチドをコードするＤＮＡを、Ｆｌａｇ−ｍｏｄｉｆｉｅｄ
ｐｃＤＮＡ３ ｖｅｃｔｏｒのＦｌａｇ配列の下流に存在する下記制限酵素サ
イトに挿入し、Ｆｌａｇ−ＳＥＫ１、Ｆｌａｇ−ＭＫＫ６、Ｆｌａｇ−ＭＫＫ７
、Ｆｌａｇ−ＭＥＫ１、Ｆｌａｇ−ＭＥＫＫ１、Ｆｌａｇ−ｃ−Ｒａｆ１、Ｆｌ
ａｇ−Ｒａｆ−Ｃ、Ｆｌａｇ−ＭＥＫＫ−Ｎ、Ｆｌａｇ−ＴＡＫ１を発現するベ
クターを各々作製した。 挿入した各ＤＮＡのコードするポリペプチドおよび各挿入制限酵素サイトは以
下の通りである。 ＳＥＫ１（全長）：ＨｉｎｄＩＩＩ−ＸｂａＩサイト ＭＫＫ６（全長）：ＨｉｎｄＩＩＩ−ＸｂａＩサイト ＭＫＫ７（全長）：ＨｉｎｄＩＩＩ−ＸｂａＩサイト ＭＥＫ１（全長）：ＨｉｎｄＩＩＩ−ＸｂａＩサイト ＭＥＫＫ１（全長）：ＢａｍＨＩ−ＥｃｏＲＶサイト ｃ−Ｒａｆ１（全長）：ＥｃｏＲＩ−ＸｈｏＩサイト Ｒａｆ−Ｎ（１−３２７アミノ酸残基）：ＥｃｏＲＩ−ＥｃｏＲＶサイト Ｒａｆ−Ｃ（３１６−６４８アミノ酸残基）：ＥｃｏＲＶ−ＸｈｏＩサイト ＭＥＫＫ−Ｎ（１−６４０アミノ酸残基）：ＢａｍＨＩ−ＥｃｏＲＩサイト ＴＡＫ１（全長）：ＥｃｏＲＩ−ＸｈｏＩサイト ＴＡＫ１（ＴＧＦ−β−ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｋｉｎａｓｅ １）〔Ｓｃｉｅ
ｎｃｅ，２７０，２００８（１９９５）〕をコードするＤＮＡは、マウス細胞株
ＢＡＦ−Ｂ０３ｃＤＮＡライブラリーより常法により取得した。 ３）ＧＳＴとの融合ポリペプチドを発現するベクターの調製 ｃ−Ｊｕｎの１〜７９アミノ酸残基をコードするＤＮＡをＧＳＴ融合タンパク
質発現ベクターｐＧＥＸ−３Ｘ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）のＢａｍＨＩ−Ｅｃ
ｏＲＩサイトに挿入し、ＧＳＴ−ｃ−Ｊｕｎ（１−７９）発現ベクターを作製し
た。 該発現ベクターを用い、常法によりＥ．ｃｏｌｉを形質転換し、ＧＳＴ−ｃ−
Ｊｕｎ（１−７９）を発現させた。 発現されたＧＳＴ−ｃ−Ｊｕｎ（１−７９）をＧｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ ｓｅ
ｐｈａｒｏｓｅ ４Ｂ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）を用いて精製した。 ＪＮＫ３（全長）をコードするＮｃｏＩ（平滑化）−ＢａｍＨ１（平滑化）Ｄ
ＮＡ断片を、ＧＳＴ融合タンパク質発現ベクターｐＧＥＸ−２Ｔ（Ｐｈａｒｍａ
ｃｉａ社製）のＢａｍＨＩ（平滑化）サイトに挿入し、ＧＳＴ−ＪＮＫ３発現ベ
クターを作製した。 該発現ベクターを用い、常法によりＥ．ｃｏｌｉを形質転換し、ＧＳＴ−ＪＮ
Ｋ３を発現させた。発現させたＧＳＴ−ＪＮＫ３をＧｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ ｓ
ｅｐｈａｒｏｓｅ ４Ｂ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）を用いて精製した。 ４）Ｓタグペプチドとの融合ポリペプチドを発現するベクターの調製 下記ポリペプチドをコードするＤＮＡまたは該ＤＮＡの断片を、発現ベクター
Ｓ−ｍｏｄｉｆｉｅｄ ｐｃＤＮＡ３のＳタグ配列の下流に存在する下記制限酵
素サイトに挿入し、Ｓ−ＪＳＡＰ１ａ、Ｓ−ＪＳＡＰ１ａΔ１、Ｓ−ＪＳＡＰ１
ａΔ２、Ｓ−ＪＳＡＰ１ａΔ３、Ｓ−ＪＳＡＰ１ａΔ４、Ｓ−ＪＳＡＰ１ａΔ５
、Ｓ−ＪＳＡＰ１ｂ、Ｓ−ＪＳＡＰ１ｃ、Ｓ−ＪＳＡＰ１ｄ、Ｓ−ＪＳＡＰ３、
Ｓ−ＪＳＡＰ４、Ｓ−ＪＳＡＰ４（１−７５４）、Ｓ−ＪＳＡＰ４（７５５−１
５０８）、Ｓ−ＪＳＡＰ４（７５５−１０６２）、Ｓ−ＪＳＡＰ４（１０６３−
１３３１）、Ｓ−ＪＳＡＰ４（１３３２−１５０８）を発現するベクターを各々
作製した。 挿入した各ＤＮＡのコードするポリペプチドおよび各挿入制限酵素サイトは以
下の通りである。 ＪＳＡＰ１ａ（全長）：ＮｏｔＩサイト ＪＳＡＰ１ａΔ１（１−１０５３アミノ酸残基）：ＮｏｔＩ−ＸｈｏＩ ＪＳＡＰ１ａΔ２（７４４−１３０５アミノ酸残基）：ＮｏｔＩサイト ＪＳＡＰ１ａΔ３（１０５４−１３０５アミノ酸残基）：ＢａｍＨＩサイト ＪＳＡＰ１ａΔ４（３４３−１０５３アミノ酸残基）：ＨｉｎｄＩＩＩ−Ｘｈ
ｏＩ ＪＳＡＰ１ａΔ５（１−３４３アミノ酸残基）：ＨｉｎｄＩＩＩサイト ＪＳＡＰ１ｂ（全長）：ＮｏｔＩサイト ＪＳＡＰ１ｃ（全長）：ＮｏｔＩサイト ＪＳＡＰ１ｄ（全長）：ＮｏｔＩサイト ＪＳＡＰ３（全長）：ＥｃｏＲＩ−ＸｈｏＩ／ＳａｌＩ ＪＳＡＰ４（全長）：ＥｃｏＲＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ ＪＳＡＰ４（１−７５４アミノ酸残基）：ＥｃｏＲＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ ＪＳＡＰ４（７５５−１５０８アミノ酸残基）：ＥｃｏＲＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ ＪＳＡＰ４（７５５−１０６２アミノ酸残基）：ＥｃｏＲＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ ＪＳＡＰ４（１０６３−１３３１アミノ酸残基）：ＥｃｏＲＩ−ＨｉｎｄＩＩ
Ｉ ＪＳＡＰ４（１３３２−１５０８アミノ酸残基）：ＥｃｏＲＩ−ＨｉｎｄＩＩ
Ｉ。 またＪＳＡＰ５のｃＤＮＡ（部分長）を発現ベクターｐＧＡＤ１０（Ｃｌｏｎ
ｔｅｃｈ社製）のＧＡＬ４ＡＤ配列の下流に存在するＥｃｏＲＩサイトに、ＪＳ
ＡＰ５ＦのｃＤＮＡ（全長）を発現ベクターＨｉｓ−Ｓ−ｍｏｄｉｆｉｅｄ ｐ
ｃＤＮＡ３のＨｉｓ−Ｓタグ配列の下流に存在するＥｃｏＲＶ（平滑化）−Ｈｉ
ｎｄＩＩＩサイトに組み込んだ（第１〜１０図）。 ５）ＪＮＫ３を発現するベクターの調製 ｐＧＥＭ−３７ｆ（＋）（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）をＥｃｏＲＩで切断後、ＧＣ
ＣＡＴＧＣの塩基配列を有するオリゴヌクレオチドリンカーを添加してｓｅｌｆ
−ｌｉｇａｔｉｏｎを行い、ｐＧＥＭ−３７ｆ（＋）にＮｃｏＩサイトを付加し
たプラスミドｐＧＥＭ−ＮＧＯを作製した。 該ｐＧＥＭ−ＮＣＯのＮｃｏＩ−ＢａｍＨＩサイトにＪＮＫ３（全長）を挿入
し、発現ベクター（ｐＧＥＭ−ＪＮＫ３）を調製した。 ６）恒常的に活性化されたＣｄｃ４２を発現するベクターの調製 恒常的に活性化されているＣｄｃ４２を、点変異導入によりＣｄｃ４２の１２
番目のグリシンをバリンに変換することにより作製した〔Ｃｄｃ４２（Ｇ１２Ｖ
）〕。該Ｃｄｃ４２（Ｇ１２Ｖ）（全長）をコードするＤＮＡ断片（ＢａｍＨＩ
−平滑末端）を発現ベクター ｓ−ｍｏｄｉｆｉｅｄ ｐｃＤＮＡ３のｓタグ配
列の下流に存在するＢａｍＨＩ−ＥｃｏＲＶサイトに組み込んだ。 ７）恒常的に活性化されたＭＥＫＫ１を発現するベクターの調製 ΔＭＥＫＫ１（１１６９−１４８８アミノ酸残基；ＭＥＫＫ１のｔｒｕｎｃａ
ｔｅｄ ｆｏｒｍで恒常的に活性化されている）をコードするｃＤＮＡをｐＥＦ
−ＢＯＳ ｖｅｃｔｏｒ〔Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１８，５３
２２（１９９０）〕のＸｂａＩサイトへ組み込んだ。 ８）５ＸＧＡＬ４−ＬＵＣレポーター、ＧＡＬ４−ｃ−Ｊｕｎ、ＧＡＬ４−Ｅｌ
ｋ１発現ベクター ５ＸＧＡＬ４−ＬＵＣレポーター、ＧＡＬ４−ｃ−ＪｕｎおよびＧＡＬ４−Ｅ
ｌｋ１発現ベクターはいずれもＳｔｒａｔａｇｅｎｅ社から購入し、用いた。 ９）ＲＬ（Ｒｅｎｉｌｌａ ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ）コントロールベクター ＲＬコントロールベクターはＰｒｏｍｅｇａ社から購入し、用いた。 １０）Ｍｙｃタグペプチドとの融合ポリペプチドを発現するベクターの調製 ＪＳＡＰ４（全長）およびＪＳＡＰ４（１０６３−１３３１アミノ酸残基）を
コードするｃＤＮＡをそれぞれ、発現ベクターＭｙｃ−ｍｏｄｉｆｉｅｄ ｐｃ
ＤＮＡ３のＭｙｃタグ配列の下流に存在するＥｃｏＲＩ−ＮｏｔＩに組み込み、
Ｍｙｃ−ＪＳＡＰ４（全長）およびＭｙｃ−ＪＳＡＰ４（１０６３−１３３１）
を発現するベクターを各々作製した。 １１）Ｈｉｓ−Ｓタグペプチドとの融合ポリペプチドを発現するベクターの調製
下記ポリペプチドをコードするＤＮＡを、Ｈｉｓ−Ｓタグをコードする発現ベク
ターＨｉｓ−Ｓ−ｍｏｄｉｆｉｅｄ ｐｃＤＮＡ３のＨｉｓ−Ｓタグ配列の下流
に存在する下記制限酵素サイトに挿入し、ＭＡＰＫ−Ｈｉｓ−Ｓ、ＭＡＰＫＫＫ
−Ｈｉｓ−Ｓ、ＪＮＫ１−Ｈｉｓ−Ｓ、ＪＮＫ２−Ｈｉｓ−Ｓ、ＪＮＫ３−Ｈｉ
ｓ−Ｓ、ＥＲＫ２−Ｈｉｓ−Ｓ、ＭＥＫＫ１−Ｈｉｓ−Ｓを発現するベクターを
各々作製した。 全長ポリペプチドをコードする各ＤＮＡの挿入制限酵素サイトは以下の通りで
ある。 ＪＮＫ１〔ＮｏｔＩ（平滑化）−ＢａｍＨＩ ＤＮＡ断片〕：ＥｃｏＲＶ−Ｂ ａｍ ＨＩ ＪＮＫ２〔ＮｏｔＩ（平滑化）−ＢａｍＨＩ ＤＮＡ断片〕：ＥｃｏＲＶ−Ｂ
ａｍＨＩ ＪＮＫ３〔ＮｏｔＩ（平滑化）―ＢａｍＨＩ（平滑化）ＤＮＡ断片〕：Ｅｃｏ ＲＶ ＥＲＫ２〔ＢａｍＨＩ ＤＮＡ断片〕：ＢａｍＨＩ ＭＥＫＫ１〔ＨｉｎｄＩＩＩ ＤＮＡ断片〕：ＨｉｎｄＩＩＩ 実施例２ ＪＳＡＰ１ａ、ＪＳＡＰ１ｂ、ＪＳＡＰ１ｃ、ＪＳＡＰ１ｄ 以下に記載の解析結果は、ＪＳＡＰ１ａ、ＪＳＡＰ１ｂ、ＪＳＡＰ１ｃ、ＪＳ
ＡＰ１ｄいずれも同一であったため、図には代表してＪＳＡＰ１ａの結果を示し
た。以下、ＪＳＡＰ１ａ、ＪＳＡＰ１ｂ、ＪＳＡＰ１ｃおよびＪＳＡＰ１ｄを総
称してＪＳＡＰ１と記載した。 １）ノーザンハイブリダイゼーションによるＪＮＫ３、ＪＳＡＰ１ ｍＲＮＡの
発現解析 Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９２，４９７２（１９９５
）に記載されている方法に準じてノーザンハイブリダイゼーションを実施した。 即ち、３２Ｐで放射ラベルしたＪＮＫ３、ＪＳＡＰ１、β−ａｃｔｉｎ ｃＤ
ＮＡプローブを用いてマウスの肝臓、脾臓、腎臓、脳、心臓、肺、精巣の各組織
について解析した。 結果を第１１図に示す。 ＪＮＫ３は脳特異的に発現が見られた。ＪＳＡＰ１ａについては、約６−ｋｂ
の大きさのＪＳＡＰ１ａ ｍＲＮＡが脳特異的に見られた。 ２）種々のＭＡＰＫに対するＪＳＡＰ１の結合特異性と結合領域の解析 実施例１（２）で調製した、Ｓ−ＪＳＡＰ１ａ、Ｓ−ＪＳＡＰ１ｂ、Ｓ−ＪＳ
ＡＰ１ｃまたはＳ−ＪＳＡＰ１ｄ（全長）発現ベクター、およびＦｌａｇ−ＪＮ
Ｋ１、Ｆｌａｇ−ＪＮＫ２、Ｆｌａｇ−ＪＮＫ３、Ｆｌａｇ−ＥＲＫ２またはＦ
ｌａｇ−ｐ３８発現ベクターをＣＯＳ−７細胞にＴｒａｎｓＩＴ−ＬＴ１（Ｍｉ
ｒｕｓ社製）を用いてトランスフェクションした後、該ＣＯＳ−７細胞を培養し
、導入した各ベクター由来のポリペプチドを一過性に発現させた。 培養３４時間後、該細胞を緩衝液Ｂ中で溶解し、Ｓプロテインアガロース（Ｎ
ｏｖａｇｅｎ社製）を添加し、Ｓ−ＪＳＡＰ１およびＳ−ＪＳＡＰ１と結合する
ポリペプチドを沈降させ回収した。 得られた回収画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥで展開し、メンブレンＩｍｍｏｂｉｌｏ
ｎ−Ｐ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製）にトランスファーした。 該メンブレンおよびプローブとしてａｎｔｉ−Ｆｌａｇ Ｍ５ ｍｏｎｏｃｌ
ｏｎａｌ抗体（Ｋｏｄａｋ社製）を用いウエスタンブロティングを行い、該抗体
と結合するポリペプチド（Ｆｌａｇ−ＪＮＫ３）をＥＣＵ検出システム（Ａｍｅ
ｒｓｈａｍ社製）で可視化し、ＪＳＡＰ１と結合可能なＭＡＰＫを調べた。 結果を第１２図に示す。ＪＳＡＰ１はＪＮＫ３とのみ結合し、他のＭＡＰＫと
は結合しないことがわかった。 ＪＮＫ３とのＪＳＡＰ１結合領域を以下の方法で解析した。 実施例１（２）で調製した発現ベクターを用い、Ｔｒｘ・ＳとＪＳＡＰ１の部
分断片との融合ポリペプチドＴｒｘ・Ｓ−ＪＳＡＰ１（断片）を常法に従って、
Ｅ．ｃｏｌｉで発現させ、Ｓプロテインアガロースに結合させ取得した。 実施例１（２）で調製した発現ベクターｐＧＥＭ−ＪＮＫ３を用い、全長ＪＮ
Ｋ３の３５Ｓ放射能ラベル体を、ＴＮＴ Ｔ７ Ｑｕｉｃｋ Ｃｏｕｐｌｅｄ
Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ／Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏ
ｍｅｇａ社製）によりｉｎ ｖｉｔｒｏ翻訳により調製した。 得られたＪＮＫ３の３５Ｓ放射能ラベル体と、Ｔｒｘ・Ｓ−ＪＳＡＰ１（断片
）を緩衝液Ａ〔５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１５０ｍＭ Ｎａ
Ｃｌ、０．５％ ＮＰ−４０〕中で混合し、４℃で２時間、チューブを回転させ
ながら反応液を攪拌し反応させた。 反応後、緩衝液Ａで３回洗浄し、得られた沈降物をＳＤＳ−ＰＡＧＥで展開し
、オートラジオグラフィー（ａｕｔｏｒａｄｉｏｇｒａｐｈｙ）により解析した
。 その結果、ＪＮＫ３とのＪＳＡＰ１の結合領域は、１１５〜２７４（ＪＳＡＰ
１ａ）、１１５〜２８３（ＪＳＡＰ１ｂ）、１１５〜３０６（ＪＳＡＰ１ｃ）、
１１５〜３０５（ＪＳＡＰ１ｄ）番目のアミノ酸残基領域に存在することがわか
った。 ＪＳＡＰ１ａでの結果を第１３図に示した。ＪＳＡＰ１ａでは結合領域は１１
５〜２７４番目のアミノ酸残基であった。 ３）ＪＮＫ３によるＪＳＡＰ１のリン酸化と、該リン酸化よるＪＮＫ３の結合能
の欠失 ＪＮＫ３とのＪＳＡＰ１の結合領域には、下記のようにｐｒｏｌｉｎｅ−ｄｉ
ｒｅｃｔｅｄ ｓｅｒｉｎｅ／ｔｈｒｅｏｎｉｎｅ ｋｉｎａｓｅによるリン酸
化を受ける可能性のあるスレオニン残基が存在する。 ＪＳＡＰ１ａ：２３４、２４４、２５５番目のアミノ酸残基 ＪＳＡＰ１ｂ：２４３、２５３、２６４番目のアミノ酸残基 ＪＳＡＰ１ｃ：２６６、２７６、２８７番目のアミノ酸残基 ＪＳＡＰ１ｄ：２６５、２７５、２８６番目のアミノ酸残基 上記リン酸化を受けると推定される箇所を含むＪＳＡＰ断片とＴｒｘ・Ｓとの
融合ポリペプチド、Ｔｒｘ・Ｓ−ＪＳＡＰ１ａ（１１５−２７４アミノ酸残基）
、Ｔｒｘ・Ｓ−ＪＳＡＰ１ｂ（１１５−２８３アミノ酸残基）、Ｔｒｘ・Ｓ−Ｊ
ＳＡＰ１ｃ（１１５−３０６アミノ酸残基）、Ｔｒｘ・Ｓ−ＪＳＡＰ１ｄ（１１
５−３０５アミノ酸残基）を実施例１（２）に従って調製した。 実施例１（２）で取得したＦｌａｇ−ＪＮＫ３発現ベクターおよびΔＭＥＫＫ
１発現ベクターを、あるいはＦｌａｇ−ＪＮＫ３発現ベクターのみをＣＯＳ−７
細胞にＴｒａｎｓＩＴ−ＬＴ１（Ｍｉｒｕｓ社製）を用いてトランスフェクショ
ンした後、該ＣＯＳ−７細胞を培養し、導入した各ベクター由来のポリペプチド
を一過性に発現させた。 ３４時間培養後、該細胞を緩衝液Ｂ中で溶解し、プロテインＧアガロース（ｐ
ｒｏｔｅｉｎ−Ｇ−ａｇａｒｏｓｅ）に固定化したａｎｔｉ−Ｆｌａｇ Ｍ５モ
ノクローナル抗体（Ｋｏｄａｋ社製）を用いてＦｌａｇ−ＪＮＫ３を免疫沈降さ
せた。 得られたＪＮＫ３あるいは活性化されたＪＮＫ３と、Ｓプロテインアガロース
に結合させた、上記で調製したＴｒｘ・Ｓ−ＪＳＡＰ１ａ（１１５−２７４アミ
ノ酸残基）、Ｔｒｘ・Ｓ−ＪＳＡＰ１ｂ（１１５−２８３アミノ酸残基）、Ｔｒ
ｘ・Ｓ−ＪＳＡＰ１ｃ（１１５−３０６アミノ酸残基）またはＴｒｘ・Ｓ−ＪＳ
ＡＰ１ｄ（１１５−３０５アミノ酸残基）を用い、Ｃｅｌｌ，７６，１０２５（
１９９４）に記載されている方法に準じて、３２Ｐで放射ラベルされたＡＴＰ（
［γ−３２Ｐ］ＡＴＰ）を加えリン酸化反応を行った。リン酸化のポジティブコ
ントロールとして、ＧＳＴ−ｃ−Ｊｕｎ（１−７９アミノ酸残基）を基質として
用いた〔ＥＭＢＯ．Ｊ．，１５，２７６０（１９９６）〕。 該反応液をＳＤＳ−ＰＡＧＥで展開後、オートラジオグラフィーにより解析し
た。 結果を第１４図に示す。ＪＳＡＰ１は効率的にリン酸化された（第１４図のレ
ーン４）。ポジティブコントロールであるｃ−Ｊｕｎのリン酸化も確認された（
第１４図のレーン２）。 ＪＳＡＰ１においてリン酸化を受けている可能性のある上記に示したスレオニ
ン残基を、それぞれアラニン残基へ、オーバーラッピングＰＣＲ法〔ｏｖｅｒｌ
ａｐｐｉｎｇ ＰＣＲ；Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅ
ｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．
，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８９）〕による部位特異的変異により変換し、変換さ
せた該ポリペプチドを実施例１（２）の方法に準じて発現させ、取得した。 取得したポリペプチドＷＴ〜Ｔ−３は以下の通りである。 （ｉ）Ｔｒｘ・Ｓ−ＪＳＡＰ１ａ（１１５−２７４アミノ酸残基領域） ＷＴ ：アラニン残基への置換なし Ｔ−０：２３４、２４４、２５５番目をアラニン残基に置換 Ｔ−１：２４４、２５５番目をアラニン残基に置換 Ｔ−２：２３４、２５５番目をアラニン残基に置換 Ｔ−３：２３４，２４４番目をアラニン残基に置換 （ｉｉ）Ｔｒｘ・Ｓ−ＪＳＡＰ１ｂ（１１５−２８３アミノ酸残基領域） ＷＴ ：アラニン残基への置換なし Ｔ−０：２４３、２５３、２６４番目をアラニン残基に置換 Ｔ−１：２５３、２６４番目をアラニン残基に置換 Ｔ−２：２４３、２６４番目をアラニン残基に置換 Ｔ−３：２４３，２５３番目をアラニン残基に置換 （ｉｉｉ）Ｔｒｘ・Ｓ−ＪＳＡＰ１ｃ（１１５−３０６アミノ酸残基領域） ＷＴ ：アラニン残基への置換なし Ｔ−０：２６６、２７６、２８７番目をアラニン残基に置換 Ｔ−１：２７６、２８７番目をアラニン残基に置換 Ｔ−２：２６６、２８７番目をアラニン残基に置換 Ｔ−３：２６６，２７６番目をアラニン残基に置換 （ｉｖ）Ｔｒｘ・Ｓ−ＪＳＡＰ１ｄ（１１５−３０５アミノ酸残基領域） ＷＴ ：アラニン残基への置換なし Ｔ−０：２６５、２７５、２８６番目をアラニン残基に置換 Ｔ−１：２７５、２８６番目をアラニン残基に置換 Ｔ−２：２６５、２８６番目をアラニン残基に置換 Ｔ−３：２６５，２７５番目をアラニン残基に置換 上記取得したポリペプチドを用いてリン酸化を行った。 Ｔｒｘ・Ｓ−ＪＳＡＰ１ａにおける結果を第１４図に示す。 Ｔｒｘ・Ｓ−ＪＳＡＰ１ａ〜ｄいずれも、リン酸化の予想されるスレオニンを
全てアラニンに置換したＴ−０のみリン酸化が認められず（第１４図のレーン５
）、ＷＴおよび他のアラニン置換体（Ｔ−１〜３）は全てリン酸化された（第１
４図のレーン６〜８）。 上記でリン酸化を受けなかった上記Ｔ−０、Ｆｌａｇ−ＪＮＫ３、ΔＭＥＫＫ
１を、実施例２（１）の方法に準じて、同時にレチノイン酸によって分化させた
Ｐ１９細胞で発現させ、ａｎｔｉ−Ｆｌａｇ Ｍ５ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ抗体
（Ｋｏｄａｋ社製）で細胞を染色した。 同様の実験を、上記でリン酸化を受けることの示されたＷＴ、Ｆｌａｇ−ＪＮ
Ｋ３、ΔＭＥＫＫ１を用いて行い、細胞を染色した。 ＪＳＡＰ１ａでの結果を第１５図に示す。 ＪＳＡＰ１いずれにおいても、Ｔ−０を用いた場合には、ＪＮＫ３は細胞質に
のみ存在し、核内に移行できなかったが、ＷＴを用いた場合にはＪＮＫ３は核内
に移行していた。 上記結果は、ＪＮＫ３によりＪＳＡＰ１がリン酸化されることにより、それま
でＪＳＡＰ１に結合していたＪＮＫ３がＪＳＡＰ１より解離し、核内へと移行す
ることを示している。 ４）種々のＭＡＰＫＫ、ＭＡＰＫＫＫとＪＳＡＰ１との結合 実施例１（２）で取得したＳ−ＪＳＡｐ１（全長）発現ベクター、ＭＡＰＫＫ
であるＳＥＫ１（ＭＫＫ４）のＦｌａｇ融合ポリペプチドＦｌａｇ−ＳＥＫ１の
発現ベクターおよびΔＭＥＫＫ１発現ベクターの３種類のベクター、あるいはＳ
−ＪＳＡＰ１（全長）発現ベクターおよびＦｌａｇ−ＳＥＫ１発現ベクターの２
種類のベクターをＣＯＳ−７細胞にＴｒａｎｓＩＴ−ＬＴ１（Ｍｉｒｕｓ社製）
を用いてトランスフェクションした後、該ＣＯＳ−７細胞を培養し、導入した各
ベクター由来のポリペプチドを一過性に発現させた。 ３４時間培養後、細胞を緩衝液Ｂ中で溶解させ、Ｓ−ｐｒｏｔｅｉｎ ａｇａ
ｒｏｓｅ（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）を用い、Ｓ−ＪＳＡＰ１およびＳ−ＪＳＡＰ１
と結合するポリペプチドを免疫沈降させた。 得られた回収画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥで展開し、メンブレンＩｍｍｏｂｉｌｏ
ｎ−Ｐ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製）にトランスファーし、ａｎｔｉ−Ｆｌａｇ
Ｍ５ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ抗体（Ｋｏｄａｋ社製）をプローブとして、Ｆｌａ
ｇ−ＳＥＫ１をＥＣＬ検出システム（Ａｍｅｒｓｈａｍ社製）で可視化した。 結果を第１６図に示す。ΔＭＥＫＫ１によってＳＥＫ１が活性化された場合に
、ＪＳＡＰ１との結合が見られた（第１６図のレーン２および３）。ΔＭＥＫＫ
１によるＳＥＫ１の活性化は、リン酸化され活性化されたＳＥＫ１を認識するモ
ノクローナル抗体（ＮＥＢ社製）を用いたウエスタンブロッティングにより確認
した。 上記で得られた結果を基に、ＪＳＡＰ１中の、ＳＥＫ１結合領域について、上
記と同様の方法で解析した。即ち、Ｓ−ＪＳＡＰ１の種々の欠失変異体を作製し
、それぞれとＦｌａｇ−ＳＥＫ１との結合を調べた。 ＪＳＡＰ１ａ由来の欠失変異体を用いて得られた結果を第１６図のレーン４〜
８に示す。ＪＳＡＰ１ａの全長ＦＬ（１−１３０５残基）、欠失変異体Δ２（７
４４−１３０５残基を有する）および欠失変異体Δ３（１０５４−１３０５残基
を有する）にＳＥＫ１は結合することができたが（第１６図のレーン５、７、８
）、欠失変異体Δ１（１−１０５３残基を有する）には結合することができなか
った（第１６図レーン６）。 以上のことから、ＪＳＡＰ１ａのＣ末端側の１０５４〜１３０５アミノ酸残基
にＳＥＫ１が結合することがわかった。 他のＭＡＰＫＫのＪＳＡＰ１ａへの結合についても同様の方法で解析した。 結果を第１７図および第１８図に示す。 ＭＫＫ７（ＪＮＫ経路の他のＭＡＰＫＫ）もＳＥＫ１と同様にＪＳＡＰ１ａの
Ｃ末端の１０５４−１３０５残基に結合した（第１７図）。ＥＲＫまたはｐ３８
経路のＭＡＰＫＫであるＭＥＫ１、ＭＫＫ６もＪＳＡＰ１ａに結合した（第１８
図）。 実施例１（２）で取得したＳ−ＪＳＡＰ１ａ（全長）ＦＬ、欠失変異体Δ１（
１−１０５３アミノ酸残基を有する）、またはΔ４（３４３−１０５３アミノ酸
残基を有する）の発現ベクター、およびＭＡＰＫＫＫであるＭＥＫＫ１のＮ末端
部分配列ポリペプチド（ＭＥＫＫ１−Ｎ；１−６４０アミノ酸残基）とＦｌａｇ
タグとの融合ポリペプチドＦｌａｇ−ＭＥＫＫ−Ｎの発現ベクターをＣＯＳ−７
細胞にＴｒａｎｓＩＴ−ＬＴ１（Ｍｉｒｕｓ社製）を用いてトランスフェクショ
ンした後、該ＣＯＳ−７細胞を培養し、導入した各ベクター由来のポリペプチド
を一過性に発現させた。 上記において、全長のＭＥＫＫ１のＣＯＳ−７細胞での発現は非常に低かった
ため、本実験においてはＭＥＫＫ１の部分配列であるＭＥＫＫ１−Ｎを用いた。 結果を第１９図に示す。ＭＥＫＫ−ＮはＪＳＡＰ１ａのＦＬ、Δ１、Δ４いず
れとも結合した。Δ４に結合したことより、ＭＥＫＫ−ＮはＪＳＡＰ１ａの３４
３−１０５３アミノ酸残基部に結合すると考えられた。 同様の実験を、ＭＥＫＫ１のＮ末端部以外の部分を有するポリペプチドを用い
て行い、該ポリペプチドが上記Ｎ末端部以外の領域でＪＳＡＰ１ａと結合しない
ことを確認した。 ＭＥＫＫ１は、全長ＪＳＡＰ１ａよりもＪＳＡＰ１ａΔ１（１−１０５３アミ
ノ酸残基）に、より高親和性で結合している（第１９図のレーン３）ことより、
上記でＳＥＫ１の結合部位と考えられたＪＳＡＰ１ａのＣ末端の１０５４−１３
０５残基は、ＭＥＫＫ１の結合を阻害する作用のある可能性がある。 さらに、ＭＡＰＫ経路のうち、ＥＲＫ経路に関与しているＭＡＰＫＫＫである
、ｃ−Ｒａｆ１とＪＳＡＰ１との結合について調べた。 実施例１（２）で取得したｃ−Ｒａｆ１のＮ末端側領域（１−３２７アミノ酸
残基）またはＣ末端側領域（３１６−６４８アミノ酸残基）をＦｌａｇペプチド
と融合させたＦｌａｇ−Ｒａｆ−ＮまたはＦｌａｇ−Ｒａｆ−Ｃを発現するベク
ターおよび実施例１（２）で取得したＳ−ＪＳＡＰ１各々の発現ベクターをＣＯ
Ｓ−７細胞にＴｒａｎｓＩＴ−ＬＴ１（Ｍｉｒｕｓ社製）を用いてトランスフェ
クションした後、該ＣＯＳ−７細胞を培養し、導入した各ベクター由来のポリペ
プチドを一過性に発現させた。 上記において、全長のｃ−Ｒａｆ１のＣＯＳ−７細胞での発現は非常に低かっ
たため、本実験においてはｃ−Ｒａｆ１の部分配列であるＲａｆ−ＮおよびＲａ
ｆ−Ｃを用いた。 結果を第２０図に示す。Ｒａｆ−ＣはＪＳＡＰ１（第２０図のレーン４）と結
合したが、Ｒａｆ−Ｎは結合しなかった（第２０図のレーン２）。また、Ｒａｆ
−Ｃの結合親和性はＭＥＫＫ１の親和性より低かった（第２０図のレーン４、６
）。 以上からＪＮＫ３経路に関与する、ＭＡＰＫＫＫ（ＭＥＫＫ１）、ＭＡＰＫ（
ＳＥＫ１、ＭＫＫ７）、ＭＡＰＫ（ＪＮＫ３）のＪＳＡＰ１の結合領域は互いに
異なることがわかった。 ＪＳＡＰ１ａにおいて、ＭＥＫＫ１に対する結合領域は３４３−１０５３アミ
ノ酸残基領域、ＳＥＫ１、ＭＫＫ７に対する結合領域は１０５４−１３０５残基
領域、ＪＮＫ３に対する結合領域は１１５−２７４残基領域であった。 ＪＳＡＰ１はロイシンジッパー構造を有していると考えられた。ロイシンジッ
パー構造を形成しているロイシン残基の各ＪＳＡＰ１中のアミノ酸配列番号を以
下に示す。 ＪＳＡＰ１ａ：３９２、３９９、４０６、４１３、４２０、４２７ ＪＳＡＰ１ｂ：４０１、４０８、４１５、４２２、４２９、４３６ ＪＳＡＰ１ｃ：４２４、４３１、４３８、４４５、４５２、４５９ ＪＳＡＰ１ｄ：４２３、４３０１４３７、４４４、４５１、４５８ 以上のことから、ＪＳＡＰ１はホモ、あるいはヘテロダイマーとして存在し、
機能していると考えられた。 ５）レポーター系を用いたＪＳＡＰ１のＪＮＫ３経路におけるスキャフォルドタ
ンパク質としての機能解析 全長ＪＳＡＰ１の過剰発現によるＪＮＫ３経路の活性化に関して解析した。 ＪＳＡＰ１ａおよびＪＮＫ３をもともと発現している、レチノイン酸によって
分化させたＰ１９細胞に、５ＸＧＡＬ４−ＬＵＣレポーター発現ベクター（Ｓｔ
ｒａｔａｇｅｎｅ社製）、ＧＡＬ４−ｃ−Ｊｕｎ発現ベクター（ｃ−Ｊｕｎ活性
化ドメインを含む１−２２３残基、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）およびＲＬコン
トロールベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）を導入した。 該Ｐ１９細胞に、全長Ｓ−ＪＳＡＰ１ａ−ＦＬ発現ベクター、Ｓ−ＪＳＡＰ１
ａ−Δ５（１−３４３残基）発現ベクターおよび／または恒常的に活性化されて
いるＳ−Ｃｄｃ４２（Ｇ１２Ｖ）発現ベクターを導入した。 該Ｐ１９細胞を培養し、導入した各ベクター由来のポリペプチドを一過性に発
現させた。 培養２４時間後にルシフェラーゼ活性を測定し、ＧＡＬ４−ｃ−Ｊｕｎ転写活
性、即ち、ＪＮＫ３活性を求めた。ルシフェラーゼ活性の相対値は、ＲＬルシフ
ェラーゼの活性値で補正して求めた。 結果を第２１図に示す。 Ｃｄｃ４２（Ｇ１２Ｖ）はＪＮＫ３活性を上昇させ、またＪＳＡＰ１ａの過剰
発現はＣｄｃ４２（Ｇ１２Ｖ）と同程度にＪＮＫ３活性を上昇させた。 Ｃｄｃ４２（Ｇ１２Ｖ）と全長ＪＳＡＰ１ａを同時に発現させた細胞では、そ
れぞれ単独の場合と相加的にＪＮＫ３活性を上昇させた。 これに対し、ＪＮＫ３結合領域を含むＪＳＡＰ１ａ−Δ５（１−３４３アミノ
酸残基）とＣｄｃ４２（Ｇ１２Ｖ）を同時に発現させた場合は、ＪＮＫ３活性は
阻害された。 上記と同様の方法で、全長ＪＳＡＰ１の過剰発現によるＥＲＫ経路への影響を
調べた。 レチノイン酸によって分化させたＰ１９細胞に、５ＸＧＡＬ４−ＬＵＣレポー
ター発現ベクター、ＧＡＬ４−Ｅｌｋ１（Ｅｌｋ１活性化ドメインを含む３０７
−４２７残基）発現ベクターおよびＲＬコントロールベクターを導入した。 該Ｐ１９細胞に、Ｓ−ＪＳＡＰ１ａ−ＦＬ（全長ＪＳＡＰ１ａ）発現ベクター
および／または恒常的に活性化されているΔＲａｆ１〔Ｍｏｌ，Ｃｅｌｌ．Ｂｉ
ｏｌ．，９，６３９（１９８９）〕のＦｌａｇポリペプチド（Ｆｌａｇ−ΔＲａ
ｆ１）発現ベクターを導入した。 該Ｐ１９細胞を培養し、導入した各ベクター由来のポリペプチドを一過性に発
現させた。 培養２４時間後にルシフェラーゼ活性を測定し、ＧＡＬ４−Ｅｌｋ１転写活性
、即ち、ＥＲＫ活性を求めた。ルシフェラーゼ活性の相対値は、ＲＬルシフェラ
ーゼの活性値で補正して求めた。 結果を第２２図に示す。 ＪＳＡＰ１ａの過剰発現は、ＥＲＫ活性を阻害することが明らかとなった。 ＪＳＡＰ１はＪＮＫ３経路に存在するＭＡＫＰＫＫＫ、ＭＡＰＫＫおよびＪＮ
Ｋ３のすべてと結合し、また上記結果より、ＪＮＫ３経路の効果的、かつ特異的
な活性化を担う重要なスキャフォルドポリペプチドとして機能していると結論さ
れた。 ６）ＪＮＫ３によるＪＳＡＰ１のリン酸化を阻害する阻害剤をスクリーニングす
る系の構築 ＪＮＫ３のリン酸化基質として用いる、ＪＳＡＰ１ａのアミノ酸配列１１４−
２７４に相当する部分タンパク質（ＪＮＫ３結合部位，および３つのリン酸化さ
れるＴｈｒ残基を含む）とＧＳＴとの融合タンパク質を以下のように調製した。 ＪＳＡＰ１ａ特異的なＰＣＲプライマーとして、配列番号１７で示される塩基
配列を有するフォーワードプライマーおよび配列番号１８で示される塩基配列を
有するリバースプライマーを合成した。 フォーワードプライマーは、配列番号１で示される塩基配列を有するＪＳＡＰ
１ａをコードするｃＤＮＡの塩基配列４４６〜４６４の領域に相当する塩基配列
の直前にＥｃｏＲＶ認識配列を導入した塩基配列を有する。 リバースプライマーは、配列番号１で示される塩基配列を有するＪＳＡＰ１ａ
をコードするｃＤＮＡの塩基配列９０９〜９２８の領域の相補配列に相当する塩
基配列の直後にストップコドンを導入し、更にその直後にＥｃｏＲＩ認識配列を
導入した塩基配列を有する。 これら２種類のブライマーを用い、実施例１の（２）で調製した全長ＪＳＡＰ
１ａを含む発現プラスミドｐＥＴ３２ａをテンプレートとしてＫＯＤ ＤＮＡ
ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｔｏｙｏｂｏ社製）によりＰＣＲ反応をＴｈｅｒｍａｌ
ｃｙｃｌｅｒ ４５０（宝社製）により行なった。 増幅したＪＳＡＰ１ａ ｃＤＮＡ断片をアガロースゲル電気泳動により分離し
、該断片をＱｉａｅｘ ＩＩ ＤＮＡ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｑｉａ
ｇｅｎ社製）により抽出した。 同様に、制限酵素ＥｃｏＲＩとＥｃｏＲＶで切断したｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ
ＩＩ ＫＳ−のＤＮＡ断片を抽出した。 得られた直鎖状のｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＩＩ ＫＳ−のＤＮＡ断片とＪＳ
ＡＰ１ａ ＤＮＡ断片を、ＤＮＡ ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（宝社製）を用い
、１６℃でｌｉｇａｔｉｏｎ反応を行なうことにより、連結し、ｐＢｌｕｅｓｃ
ｒｉｐｔ ＩＩ ＫＳ−にＪＳＡＰ１ａ ＤＮＡ断片を挿入したプラスミドｐＲ
Ｈ１００１を取得した。 該ｐＲＨ１００１でＥ． ｃｏｌｉのコンピテント細胞をトランスホーム後、
該Ｅ． ｃｏｌｉをアンピシリンを添加したＬＢ培地プレート（トリプトン １
％、酵母エキス ０．５％、ＮａＣｌ １％）で一晩培養した。 現れたコロニーより得られたＥ． ｃｏｌｉを２ｍｌのアンピシリンを添加し
たＴＢ培地〔トリプトン １２ｇ、酵母エキス ２４ｇ、グリセロール ４ｍｌ
に９００ｍｌの水を加え、オートクレープ滅菌し、６０℃に冷却後、滅菌した１
００ｍｌリン酸カリウム溶液（０．１７Ｍ ＫＨ２ＰＯ４、０．７２Ｍ Ｋ２Ｈ
ＰＯ４）を添加した培地〕中で培養し、該Ｅ． ｃｏｌｉよりｐＲＨ１００１を
抽出した。 該ｐＲＨ１００１をＥｃｏＲＩとＥｃｏＲＶで切断し、得られたＤＮＡ断片の
塩基配列を決定することにより、ＪＳＡＰ１ａをコードする塩基配列と一致する
ことを確認した。 ＥｃｏＲＩとＥｃｏＲＶで切断したｐＲＨ１００１のＤＮＡ断片をアガロース
ゲル電気泳動により分離し、該断片をＱｉａｅｘ ＩＩ ＤＮＡ Ｅｘｔｒａｃ
ｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ社製）により抽出した。 同様に、制限酵素ＥｃｏＲＩとＳｍａＩで切断したｐＧＥＸ−３Ｘ（Ｐｈａｒ
ｍａｃｉａ社製）のＤＮＡ断片を抽出した。 得られた直鎖状のｐＧＥＸ−３ＸのＤＮＡ断片とｐＲＨ１００１のＤＮＡ断片
を、ＤＮＡ ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（宝社製）を用い、１６℃でｌｉｇａｔ
ｉｏｎ反応を行なうことにより、連結し、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＩＩ ＫＳ
−にＪＳＡＰ１ａ ＤＮＡ断片を挿入したプラスミドｐＲＨ１００３を取得した
。 該ｐＲＨ１００３でＥ． ｃｏｌｉのコンピテント細胞をトランスホーム後、
該Ｅ． ｃｏｌｉをアンピシリンを添加したＬＢ培地プレート上で一晩培養した
。 現れたコロニーより得られたＥ． ｃｏｌｉを２ｍｌのアンピシリンを添加し
たＴＢ培地中で培養し、該Ｅ． ｃｏｌｉよりｐＲＨ１００３を抽出した。 ｐＲＨ１００３はＧＳＴ−ＪＳＡＰ１融合タンパク質をコードするＤＮＡ断片
を持つＥ． ｃｏｌｉ発現ベクターである。 上記ｐＲＨ１００３を有するＥ． ｃｏｌｉを２０ｍｌのアンピシリンを添加
したＴＢ培地中、３７℃で一晩前培養した。 得られた培養液を、４４０ｍｌのアンピシリンを添加したＴＢ培地に添加し、
２５℃で５時間培養後、該培養液にｉｓｏｐｒｏｐｙｌ−ｂ−Ｄ−ｔｈｉｏｇａ
ｌａｃｔｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ（ＩＰＴＧ）を添加し、２５℃で１５時間培養
した。 得られた培養液より、遠心分離により菌体を回収した。該菌体に、０．１ｍｇ
／ｍｌ リゾチームを添加したＰＢＳを２０ｍｌ添加し、４℃で１時間放置した
。 放置後、２００μｌの１０％ Ｎ−ｌａｕｒｏｙｌｓａｒｃｏｓｉｎｅを加え
、超音波破砕機を用いて菌体を破壊した。 得られた菌体破壊液を１００，０００×ｇ、４℃の条件で１時間遠心分離し、
細胞質画分を取得した。 該細胞質画分より、以下の方法でＧｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ ｓｅｐｈａｒｏｓ
ｅ ４Ｂ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）を用いて、ＧＳＴ−ＪＳＡＰ１融合タンパ
ク質精製した。 即ち、Ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ４Ｂ担体のゲル５ｍｌ
をカラム詰め、０．１％ Ｎ−ｌａｕｒｏｙｌｓａｒｃｏｓｉｎｅを添加したＰ
ＢＳで平衡化した。該平衡化したＧｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ ｓｅｐｈａｒｏｓｅ
４Ｂ担体にＧＳＴ−ＪＳＡＰ１融合タンパク質を吸着し、３０ｍｌのＮ−ｌａ
ｕｒｏｙｌｓａｒｃｏｓｉｎｅを添加したＰＢＳで洗浄後、２０ｍｌの溶出緩衝
液（５ｍＭ還元型ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅおよび０．１％ Ｎ−ｌａｕｒｏｙｌ
ｓａｒｃｏｓｉｎｅを添加したＰＢＳ）でＧＳＴ−ＪＳＡＰ１融合タンパク質を
溶出した。該溶出液をＰＢＳに対して透析し、精製されたＧＳＴ−ＪＳＡＰ１融
合タンパク質溶液を取得した。 該精製ＧＳＴ−ＪＳＡＰ１融合タンパク質溶液は−８０℃で保存することが可
能で、使用時に解凍して用いた。 ΔＭＥＫＫ１、ＪＮＫ３および活性化ＪＮＫ３を以下のように調製、取得した
。 ＣＯＳ−７細胞を６０ｍｍプレートに２〜５×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍｌ ＤＭ
ＥＭ培地となるようにまき、３７℃で一晩培養した。 ９μｌのＦｕＧｅｎｅ ６ ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ ｒｅａｇｅｎｔ（Ｆ
．Ｈｏｆｆｍａｎｎ−Ｌａ Ｒｏｃｈｅ社製）を３００μｌのＯＰＴＩ−ＭＥＭ
（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ，Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）に加え、得
られた溶液に、実施例１の（２）で調製したΔＭＥＫＫ１をコードするｃＤＮＡ
を導入した発現ベクター０．１〜０．５μｇおよび／またはＪＮＫ３をコードす
るｃＤＮＡを導入した発現ベクター４．５〜４．９μｇを添加し、１５分間室温
で放置した。 得られた混合液を、上記培養ＣＯＳ−７細胞に３滴ずつ加えゆっくりと混ぜた
後、該細胞を３７℃で３０〜４０時間培養した。 該細胞をスクレイパーで回収し、１０ｍｌのＰＢＳで洗浄した。 得られたＣＯＳ−７細胞に１ｍｌの細胞溶解緩衝液〔５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ／
ＮａＯＨ（ｐＨ７．６）、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．３％（Ｖ／Ｖ）Ｎｏｎｉ
ｄｅｔ Ｐ−４０、２０ｍＭ ＭｇＣｌ２、１ｍＭ ｅｔｈｙｌｅｎｅｇｌｙｃ
ｏｌ ｂｉｓ（β−ａｍｉｎｏｅｔｈｅｒ）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−ｔｅｔｒａ
ａｃｅｔｉｃ ａｃｉｄ（ＥＧＴＡ）、２０ｍＭ β−ｇｌｙｃｅｒｏｐｈｏｐ
ｈａｔｅ、１０ｍＭ Ｎａ３ＶＯ４、１０ｍＭ ＮａＦ、４０μｇ／ｍｌ ｐｈ
ｅｎｙｌｍｅｔｈｙｌｓｕｌｆｏｎｙｌ ｆｌｕｏｒｉｄｅ（ＰＭＳＦ）、１μ
ｇ／ｍｌ ｐｅｐｓｔａｔｉｎ Ａ、１μｇ／ｍｌ ｌｅｕｐｅｐｔｉｎ、１μ
ｇ／ｍｌ ｃｈｙｍｏｓｔａｔｉｎ、２ｍＭ ｄｉｔｈｉｏｔｈｒｅｉｔｏｌ（
ＤＴＴ）〕を加え、細胞を破壊した。 得られた細胞破壊液を、２０，０００×ｇ、４℃の条件で遠心分離し、上清を
取得した。ΔＭＥＫＫ１をコードするｃＤＮＡを導入した発現ベクター導入由来
の細胞破壊液の上清をΔＭＥＫＫ１酵素溶液として、ＪＮＫ３をコードするｃＤ
ＮＡを導入した発現ベクター導入由来の細胞破壊液の上清をＪＮＫ３酵素溶液と
して、ΔＭＥＫＫ１、ＪＮＫ３をコードするｃＤＮＡを導入した２種類の発現ベ
クター導入由来の細胞破壊液の上清を活性化ＪＮＫ３酵素溶液として用いた。 以下に、活性化ＪＮＫ３によるＪＳＡＰ１のリン酸化を阻害する阻害剤のスク
リーニングする系について記述する。 活性化ＪＮＫ３によるＪＳＡＰ１のリン酸化は、活性化ＪＮＫ３、［γ−３３
Ｐ］−ＡＴＰ（７４ＴＢｑ／ｍｍｏｌ，Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｎｕｃｌｅａ
ｒ社製）、およびＧＳＴ−ＪＳＡＰ１を用いた均質な液相系で反応後、ＧＳＴ−
ＪＳＡＰ１への３３Ｐの取り込み放射活性を指標にして測定した。 ９６ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ社製）の各ウェルに、スクリーニング用
反応液〔３μＭ［γ−３３Ｐ］−ＡＴＰ（２８ｋＢｑ／ｍｌ）、２．３μＭ Ｇ
ＳＴ−ＪＳＡＰ１、２０ｍＭ ＭｇＣｌ２、２０ｍＭ β−ｇｌｙｃｅｒｏｐｈ
ｏｓｐｈａｔｅ、２０ｍＭ ｐ−ｎｉｔｒｏｐｈｅｎｙｌｐｈｏｐｈａｔｅ、１
ｍＭ Ｎａ３ＶＯ４、１ｍＭ ＮａＦ、２ｍＭ ＤＴＴ、１％ＤＭＳＯまたは１
％ＤＭＳＯを含む被検化合物、２％（Ｖ／Ｖ）上記で調製した３種類の酵素溶液
のいずれか（実際のスクリーニング時には活性化ＪＮＫ３酵素溶液を用いる）、
５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ／ＮａＯＨ（ｐＨ７．６）〕を１００μｌずつ加え、３０
℃で１０〜３０分間放置した。 放置後、１００μｌのエタノールを該反応液に添加して反応を停止し、ＧＳＴ
−ＪＳＡＰ１を沈殿させた。 該沈殿をフィルターメイトハーベスター（Ｐａｃｋａｒｄ社製）で、ユニフィ
ルタープレートＧＦ／Ｂ（Ｐａｃｋａｒｄ社製）上でろ過し、吸着させた。 該プレートをＰＢＳで３回以上洗浄し、乾燥後、シンチレーターであるＭｉｃ
ｒｏｓｃｉｎｔ−２０（Ｐａｃｋａｒｄ社製）４０μｌを添加し、検出器Ｔｏｐ
Ｃｏｕｎｔ−ＨＴＳ（Ｐａｃｋａｒｄ社製）により放射活性を測定した。 結果を第１表に示した。 ＧＳＴ−ＪＳＡＰ１は、上記系において、スクリーニング用反応液に活性化Ｊ
ＮＫ３酵素溶液を用いた時のみ特異的にリン酸化された。 従って、スクリーニング用反応液に活性化ＪＮＫ３酵素溶液を用いた上記系は
、ＪＮＫ３によるＪＳＡＰ１のリン酸化を阻害する阻害剤を効率的にスクリーニ
ングすることのできる系として利用可能である。真のリン酸化活性は活性化ＪＮ
Ｋ３酵素溶液を用いない系におけるリン酸化活性を差し引くことにより求めるこ
とができる。 上記活性化ＪＮＫ３酵素溶液が活性化ＪＮＫ３を含有する溶液であることを以
下の実験で確認した。 上記で調製したΔＭＥＫＫ１酵素溶液、ＪＮＫ３酵素溶液および活性化ＪＮＫ
３酵素溶液それぞれ各１０μｇ（酵素量として）を用いてＳＤＳ−ＰＡＧＥを行
い、泳動された各タンパク質をメンブレンＨｙｂｏｎｄ−ＥＣＬ（Ａｍｅｒｓｈ
ａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ社製）にトランスファーした。 該メンブレン、およびプローブとしてａｎｔｉ−ａｃｔｉｖｅ ＪＮＫ ｐｏ
ｌｙｃｌｏｎａｌ抗体（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）およびａｎｔｉ−Ｆｌａｇ Ｍ２
ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ抗体（Ｓｉｇｍａ社製）を用い、ウエスタンブロティン
グを行なった。発色は検出緩衝液〔１００ｍＭ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ（ｐＨ９．５
）、１００ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＭｇＣｌ２、０．３３ｍｇ／ｍｌ ｎｉｔ
ｒｏ ｂｌｕｅ ｔｅｔｒａｚｏｌｉｕｍ（ＮＢＴ）、０．１７ｍｇ／ｍｌ ５
−ｂｒｏｍｏ−４−ｃｈｌｏｒｏ−３−ｉｎｄｏｙｌｐｈｏｓｐｈａｔｅ（ＢＣ
ＩＰ）、ｐ−ｔｏｌｕｉｄｉｎｅ ｓａｌｔ〕を用いて行なった。結果を第２３
図に示した。 活性化ＪＮＫ３酵素溶液のみにリン酸化された活性化ＪＮＫ３のバンドが観測
された（第２３図−Ａのレーン２）。ＪＮＫ３酵素溶液にはＪＮＫ３タンパク質
のバンドが観測され（第２３図−Ｂのレーン３）、ＪＮＫ３のリン酸化によるバ
ンドシフト（第２３図−Ｂのレーン２および３）が観測された。 上記で構築されたスクリーニング系における、リン酸化反応の基質ＡＴＰおよ
びＧＳＴ−ＪＳＡＰ１のＫｍ値を、酵素反応速度論入門生物化学実験法２１ 大
西正健著 学会出版センター １９８７記載の方法に準じて算出した。 ＡＴＰ、ＧＳＴ−ＪＳＡＰ１ともにＭｉｃｈａｅｌｉｓ−Ｍｅｎｔｅｎ型の基
質−反応初速度曲線を示し、Ｌｉｎｅｗｅａｖｅｒ−Ｂｕｒｋ ｐｌｏｔより、
ＡＴＰ、ＧＳＴ−ＪＳＡＰ１のＫｍ値はそれぞれ、６．３μＭ、０．４８μＭで
あることがわかった。 実施例３ ＪＳＡＰ３のＪＮＫ３への結合 実施例１（２）で取得したＳ−ＪＳＡＰ３（全長）発現ベクターおよびＦｌａ
ｇ−ＪＮＫ３発現ベクターをＣＯＳ−７細胞にＴｒａｎｓＩＴ−ＬＴ１（Ｍｉｒ
ｕｓ社製）を用いてトランスフェクションした後、該ＣＯＳ−７細胞を培養し、
導入した各ベクター由来のポリペプチドを一過性に発現させた。 培養３４時間後、該細胞を緩衝液Ｂ中で溶解し、Ｓプロテインアガロースを添
加し、Ｓ−ＪＳＡＰ３およびＳ−ＪＳＡＰ３と結合するポリペプチドを沈降させ
た。 得られた回収画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥで展開し、メンブレンＩｍｍｏｂｉｌｏ
ｎ−Ｐ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製）にトランスファーした。 該メンブレンおよびプローブとしてａｎｔｉ−Ｆｌａｇ Ｍ５ ｍｏｎｏｃｌ
ｏｎａｌ抗体（Ｋｏｄａｋ社製）を用いウエスタンブロティングを行い、該抗体
と結合するポリペプチド（Ｆｌａｇ−ＪＮＫ３）をＥＣＬ検出システム（Ａｍｅ
ｒｓｈａｍ社製）で可視化した。 結果を第２４図に示す。 ＪＳＡＰ３はＪＮＫ３結合することが確認された（第２４図のレーン２）。 以下の方法で、ＪＳＡＰ３の転写因子ＡＴＦ２との結合およびＡＴＦ２結合領
域の解析を行った。 実施例１（２）に記載の方法に準じて、ＪＳＡＰ３（全長ポリペプチド）、Ｔ
ｒｘ・Ｓ、Ｔｒｘ・Ｓ−ＡＴＦ２（アミノ酸残基１−１０７）およびＴｒｘ・Ｓ
−ＡＴＦ２（アミノ酸残基１−１１６）融合ポリペプチドをＥ． ｃｏｌｉで発
現させ、Ｓプロテインアガロースに結合させることによりそれぞれ取得した。 実施例１（２）で取得したＳ−ＪＳＡＰ３（全長）発現ベクターを使用して、
Ｓ−ＪＳＡＰ３の３５Ｓ放射能ラベル体を、ＴＮＴ Ｔ７ Ｑｕｉｃｋ Ｃｏｕ
ｐｌｅｄ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ／Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅ
ｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）によりｉｎ ｖｉｔｒｏ翻訳により調製した。 得られたＪＳＡＰ３の３５Ｓ放射能ラベル体と、Ｔｒｘ・Ｓ、Ｔｒｘ・Ｓ−Ａ
ＴＦ２（アミノ酸残基１−１０７）、Ｔｒｘ・Ｓ−ＡＴＦ２（アミノ酸残基１−
１１６）それぞれを緩衝液Ａ中で混合し、４℃で２時間、チューブを回転させな
がら反応液を攪拌し、反応させた。 反応後、緩衝液Ａで３回洗浄し、得られた沈降物をＳＤＳ−ＰＡＧＥで展開し
、オートラジオグラフィー（ａｕｔｏｒａｄｉｏｇｒａｐｈｙ）により解析した
。 結果を第２５図に示した。 ＪＳＡＰ３はＡＴＦ２の１０８−１１６アミノ酸残基の領域に結合することが
わかった。 ＪＳＡＰ３のＡＴＦ２結合領域１０８−１１６残基のうち、１０８−１１２の
配列は、すでに報告されているＣｔＢＰ結合配列ｍｏｔｉｆＰＬＤＬＳと完全に
一致した〔Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７３，８５４９（１９９８）〕。 実施例４ ＪＳＡＰ４ １）ＪＳＡＰ４のＪＮＫ３への結合 実施例１（２）で取得したＳ−ＪＳＡＰ４（全長）発現ベクターおよびＦｌａ
ｇ−ＪＮＫ３発現ベクターをＣＯＳ−７細胞にＴｒａｎｓＩＴ−ＬＴ１（Ｍｉｒ
ｕｓ社製）を用いてトランスフェクションした後、該ＣＯＳ−７細胞を培養し、
導入した各ベクター由来のポリペプチドを一過性に発現させた。 培養３４時間後、該細胞を緩衝液Ｂ中で溶解し、Ｓプロテインアガロースを添
加し、Ｓ−ＪＳＡＰ４およびＳ−ＪＳＡＰ４と結合するポリペプチドを沈降させ
た。 得られた回収画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥで展開し、メンブレンＩｍｍｏｂｉｌｏ
ｎ−Ｐ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製）にトランスファーした。 該メンブレンおよびプローブとしてａｎｔｉ−Ｆｌａｇ Ｍ５ ｍｏｎｏｃｌ
ｏｎａｌ抗体（Ｋｏｄａｋ社製）を用いウエスタンブロティングを行い、該抗体
と結合するポリペプチド（Ｆｌａｇ−ＪＮＫ３）をＥＣＬ検出システム（Ａｍｅ
ｒｓｈａｍ社製）で可視化した。 結果を第２４図に示す。 ＪＳＡＰ４はＪＮＫ３結合することが確認された（第２４図のレーン４）。Ｊ
ＳＡＰ４のＪＮＫ３結合領域を以下の方法で解析した。 実施例１（２）で取得したＧＳＴあるいはＧＳＴ−ＪＮＫ３融合タンパク質発
現ベクターをＥ． ｃｏｌｉ中で発現させ、該タンパク質をＧｌｕｔａｔｈｉｏ
ｎｅ−ａｇａｒｏｓｅ（Ｓｉｇｍａ社製）に吸着させた。 実施例１（２）で取得した全長、あるいは部分長のＪＳＡＰ４のＳ−ＪＳＡＰ
４発現ベクターを使用して、種々のＳ−ＪＳＡＰ４の３５Ｓ放射能ラベル体を、
ＴＮＴ Ｔ７ Ｑｕｉｃｋ Ｃｏｕｐｌｅｄ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ／Ｔ
ｒａｎｓｌａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）によりｉｎ ｖｉ
ｔｒｏ翻訳により調製し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで展開し、オートラジオグラフィー
（ａｕｔｏｒａｄｉｏｇｒａｐｈｙ）により解析した。 結果を第２６図に示した。 緩衝液Ａを含むチューブに、得られた種々のＪＳＡＰ４の３５Ｓ放射能ラベル
体、およびＧｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ−ａｇａｒｏｓｅに吸着させたＧＳＴあるい
はＧＳＴ−ＪＮＫ３融合タンパク質添加し、チューブを回転させながら混合し、
４℃で２時間放置した。 放置後、緩衝液Ａで３回洗浄し、Ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ−ａｇａｒｏｓｅに
吸着しているタンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥで展開し、オートラジオグラフィー
により解析した。 結果を第２７図に示した。 ＪＳＡＰ４の１０６３−１３３１アミノ酸残基領域にＪＮＫ３が結合すること
が判明した。 ２）ＪＳＡＰ４のＪＮＫ１、ＪＮＫ２への結合 実施例１（２）で取得したＭｙｃタグを付加したＭｙｃ−ＪＳＡＰ４（１０６
３−１３３１アミノ酸残基領域；ＪＮＫ３と結合する領域）発現ベクターおよび
、Ｈｉｓ−Ｓタグを付加したＨｉｓ−Ｓ−ＪＮＫ１、Ｈｉｓ−Ｓ−ＪＮＫ２、Ｈ
ｉｓ−Ｓ−ＪＮＫ３またはＨｉｓ−Ｓ−ＥＲＫ２発現ベクターを、ＣＯＳ−７細
胞にＦｕＧｅｎｅ ６ ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ ｒｅａｇｅｎｔ（Ｆ．Ｈｏ
ｆｆｍａｎｎ−Ｌａ Ｒｏｃｈｅ社製）を用いてコトランスフェクションした。 該ＣＯＳ−７細胞を培養し、導入した各ベクター由来のポリペプチドを一過性
に発現させた。 培養３４時間後、該細胞を緩衝液Ｂ中で溶解し、Ｓ−ｐｒｏｔｅｉｎ ａｇａ
ｒｏｓｅ（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）を用い、免疫沈降させた。 得られた沈降画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥで展開し、メンブレンＩｍｍｏｂｉｌｏ
ｎ−Ｐ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製）にトランスファーした。 該メンブレンおよびプローブとしてａｎｔｉ−Ｍｙｃ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ
抗体 ９Ｅ１０（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ社製）を用いウエス
タンブロティングを行い、該抗体と結合するＭｙｃ−ＪＳＡＰ４をＥＣＬ検出シ
ステム（Ａｍｅｒｓｈａｍ社製）で可視化した。またそれぞれのコトランスフェ
クションされた細胞中のＭｙｃ−ＪＳＡＰ４の発現は、細胞溶解後、ａｎｔｉ−
Ｍｙｃ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ抗体 ９Ｅ１０（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎ
ｎｈｅｉｍ社製）によるウエスタンブロティングにより、またＨｉｓ−Ｓ−ＪＮ
Ｋ１、Ｈｉｓ−Ｓ−ＪＮＫ２、Ｈｉｓ−Ｓ−ＪＮＫ３およびＨｉｓ−Ｓ−ＥＲＫ
２の発現はａｎｔｉ−Ｈｉｓ ｐｏｌｙｃｌｏｎａｌ抗体（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕ
ｚ社製）によるウエスタンブロティングにより確認した。 その結果を第２８図に示した。 ＪＳＡＰ４はＪＮＫ１、ＪＮＫ２、ＪＮＫ３と結合するが、ＥＲＫ２とは結合
しないことが判明した。 ３）ノーザンハイブリダイゼーションによるＪＳＡＰ４ ｍＲＮＡの発現解析 Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９２，４９７２（１９９５
）に記載されている方法に準じてノーザンハイブリダイゼーションを実施した。 即ち、３２Ｐで放射ラベルした、ＪＳＡＰ４、β−ａｃｔｉｎ ｃＤＮＡプロ
ーブを用いてマウスの精巣、大腸、心臓、肺、腎臓、脳、脾臓、肝臓の各組織に
ついて解析した。 結果を第２９図に示す。 ＪＳＡＰ４は精巣、心臓、腎臓でわずかな発現が認められたが、特に脳に最も
多い発現が見られた。 ＪＳＡＰ４にはＷＤ４０−ｒｅｐｅａｔと呼ばれる配列が見られるため、他の
タンパク質との相互作用（結合）に関与し得ることが予想され、ＪＮＫ３経路に
おいて、その情報伝達で重要な機能を有していることが予想された〔ＦＥＢＳ
Ｌｅｔｔ．，３０７，１３１（１９９４）〕。 ４）レポーター系を用いたＪＳＡＰ４のＪＮＫ経路における機能解析 全長ＪＳＡＰ４を過剰発現させＪＮＫ経路への影響を以下の方法で解析した。 ＣＯＳ−７細胞に、５ＸＧＡＬ４−ＬＵＣレポーター発現ベクター（Ｓｔｒａ
ｔａｇｅｎｅ社製）、ＧＡＬ４−ｃ−Ｊｕｎ発現ベクター（ｃ−Ｊｕｎ活性化ド
メインを含む１−２２３残基、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）およびＲＬコントロ
ールベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）をＦｕＧＥＮＥ６ ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉ
ｏｎ ｒｅａｇｅｎｔ（Ｆ．Ｈｏｆｆｍａｎｎ−Ｌａ Ｒｏｃｈｅ社製）を用い
て導入した。 該ＣＯＳ−７細胞に、実施例１の（２）で作製したＭｙｃ−ＪＳＡＰ４−ＦＬ
発現ベクター、Ｈｉｓ−Ｓ−ＭＥＫＫ１発現ベクターおよびＦｌａｇ−ＴＡＫ１
発現ベクターのいずれか一つ以上をＦｕＧＥＮＥ６ ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ
ｒｅａｇｅｎｔを用いて導入した。 該ＣＯＳ−７細胞を培養し、導入した各ベクター由来のポリペプチドを一過性
に発現させた。 培養３４時間後にルシフェラーゼ活性を測定し、ＧＡＬ４−ｃ−Ｊｕｎ転写活
性、即ち、ＪＮＫ活性を求めた。ルシフェラーゼ活性の相対値は、ＲＬルシフェ
ラーゼの活性値で補正して求めた。 結果を第３０図に示す。 ＪＳＡＰ４そのものだけでは、ＪＮＫ活性の上昇はわずかであったが、ＭＡＰ
ＫＫＫであるＭＥＫＫ１、ＴＡＫ１はＪＮＫ活性をそれぞれ３倍、３．２倍に上
昇させた。しかし、ＭＥＫＫ１およびＴＡＫ１によるＪＮＫ活性化は、ＪＳＡＰ
４の過剰発現によってそれぞれさらに２．７倍、３倍に増強された。 上記と同様の方法で、全長ＪＳＡＰ４の過剰発現によるＥＲＫ経路への影響を
調べた。 ＣＯＳ−７細胞に、５ＸＧＡＬ４−ＬＵＣレポーター発現ベクター、ＧＡＬ４
−Ｅｌｋ１（Ｅｌｋ１活性化ドメインを含む３０７−４２７残基）発現ベクター
およびＲＬコントロールベクターをＦｕＧＥＮＥ６ ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ
ｒｅａｇｅｎｔを用いて導入した。 該ＣＯＳ−７細胞に、実施例１の（２）で作製したＭｙｃ−ＪＳＡＰ４−ＦＬ
発現ベクター、および／または恒常的に活性化されているΔＲａｆ１〔Ｍｏｌ．
Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，９，６３９（１９８９）〕のＦｌａｇポリペプチド（Ｆ
ｌａｇ−ΔＲａｆ１）発現ベクターをＦｕＧＥＮＥ６ ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏ
ｎ ｒｅａｇｅｎｔを用いて導入した。 該ＣＯＳ−７細胞を培養し、導入した各ベクター由来のポリペプチドを一過性
に発現させた。 培養３４時間後にルシフェラーゼ活性を測定し、ＧＡＬ４−Ｅｌｋ１転写活性
、即ち、ＥＲＫ活性を求めた。ルシフェラーゼ活性の相対値は、ＲＬルシフェラ
ーゼの活性値で補正して求めた。 結果を第３１図に示す。 ＪＳＡＰ４の過剰発現は、ＥＲＫ経路の活性に対して影響しなかった。また活
性型ΔＲａｆ−１によるＥＲＫ活性化に対しても影響しなかった。 実施例４の１）、２）の結果より、ＪＳＡＰ４はＪＮＫ１、ＪＮＫ２、ＪＮＫ
３に結合し、かつそれらＪＮＫ経路の活性化の効率を特異的により増強するとい
う機能を有していると結論された。 実施例５ ＪＳＡＰ５のＪＮＫ３への結合 実施例１（２）で取得したＳ−ＪＳＡＰ５（部分長）発現ベクターおよびＦｌ
ａｇ−ＪＮＫ３発現ベクターをＣＯＳ−７細胞にＴｒａｎｓＩＴ−ＬＴ１（Ｍｉ
ｒｕｓ社製）を用いてトランスフェクションした後、該ＣＯＳ−７細胞を培養し
、導入した各ベクター由来のポリペプチドを一過性に発現させた。 培養３４時間後、該細胞を緩衝液Ｂ中で溶解し、Ｓプロテインアガロースを添
加し、Ｓ−ＪＳＡＰ５およびＳ−ＪＳＡＰ５と結合するポリペプチドを沈降させ
た。 得られた回収画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥで展開し、メンブレンＩｍｍｏｂｉｌｏ
ｎ−Ｐ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製）にトランスファーした。 該メンブレンおよびプローブとしてａｎｔｉ−Ｆｌａｇ Ｍ５ ｍｏｎｏｃｌ
ｏｎａｌ抗体（Ｋｏｄａｋ社製）を用いウエスタンブロティングを行い、該抗体
と結合するポリペプチド（Ｆｌａｇ−ＪＮＫ３）をＥＣＬ検出システム（Ａｍｅ
ｒｓｈａｍ社製）で可視化した。 結果を第２４図に示す。 ＪＳＡＰ５はＪＮＫ３結合することが確認された（第２４図のレーン６）。産業上の利用可能性 本発明により得られるＪＮＫ３結合活性を有する新規ポリペプチドのＤＮＡを
用いることにより、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病、多発
性硬化症等の神経変性疾患、筋萎縮性側索硬化症等の筋萎縮性疾患、虚血性疾患
、脳卒中時の脳障害、精神分裂病、うつ病、てんかん、各種免疫、炎症性疾患の
予防、治療が可能となる。
【配列表フリーテキスト】
配列番号１７−人工配列の説明：合成ＤＮＡ 配列番号１８−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
【配列表】
【図面の簡単な説明】
第１図 ｐｃＤＮＡ３−Ｓ−ＪＳＡＰ１ａ−Δ１の制限酵素地図を示した図であ
る。 第２図 ｐｃＤＮＡ３−Ｓ−ＪＳＡＰ１ａ−Δ２の制限酵素地図を示した図であ
る。 第３図 ｐｃＤＮＡ３−Ｓ−ＪＳＡＰ１ａ−Δ３の制限酵素地図を示した図であ
る。 第４図 ｐｃＤＮＡ３−Ｓ−ＪＳＡＰ１ａ−Δ４の制限酵素地図を示した図であ
る。 第５図 ｐｃＤＮＡ３−Ｓ−ＪＳＡＰ１ａ−Δ５の制限酵素地図を示した図であ
る。 第６図 ｐｃＤＮＡ３−Ｓ−ＪＳＡＰ１ａ〜ｐｃＤＮＡ３−Ｓ−ＪＳＡＰ１ｄの
制限酵素地図を示した図である。 第７図 ｐｃＤＮＡ３−Ｓ−ＪＳＡＰ３の制限酵素地図を示した図である。 第８図 ｐｃＤＮＡ３−Ｓ−ＪＳＡＰ４の制限酵素地図を示した図である。 第９図 ｐＧＡＤ１０−ＪＳＡＰ５の制限酵素地図を示した図である。 第１０図 ｐｃＤＮＡ３−Ｈｉｓ−Ｓ−ＪＳＡＰ５の制限酵素地図を示した図で
ある。 第１１図 マウスＪＮＫ３、マウスＪＳＡＰ１ａの各ｃＤＮＡの一部の配列をプ
ローブとしてマウス肝臓、脾臓、腎臓、脳、心臓、肺、精巣のｍＲＮＡに対して
ノーザンハイブリダイゼーションを行った結果を示した電気泳動の図である。発
現コントロールとしてβ−ａｃｔｉｎの結果も合わせて示した。 第１２図 ＪＮＫ１、ＪＮＫ２、ＪＮＫ３、ＥＲＫ２、ｐ３８に対するＪＳＡＰ
１ａの結合性をウエスタンブロティングにより解析した結果を示した電気泳動の
図である。下段はＣＯＳ−７細胞における各Ｆｌａｇ−ＪＮＫ１、２、３、ＥＲ
Ｋ２、ｐ３８の発現量を確認するため、細胞抽出液を用いたウエスタンブロティ
ングの結果を示している。 第１３図 ＪＳＡＰ１ａにおけるＪＮＫ３結合領域の解析結果を示した電気泳動
の図である。図である。 第１４図 ＪＮＫ３によるＪＳＡＰ１ａのリン酸化を解析結果を示した電気泳動
の図である。 第１５図 ＪＳＡＰ１ａのリン酸化と、ＪＮＫ３の細胞内局在性を解析した結果
を示した図である。ＪＮＫ３は抗体染色により検出した。細胞の核はＨｏｅｃｈ
ｓｔ染色により検出した。 第１６図 ＳＥＫ１に対するＪＳＡＰ１ａの結合性をウエスタンブロティングに
より解析した結果を示した電気泳動の図である。下の２段はＣＯＳ−７細胞にお
ける各Ｆｌａｇ−ＳＥＫ１、および活性化ＳＥＫ１の発現量を確認するため、細
胞抽出液を用いたウエスタンブロティングの結果を示している。ＦＬは全長ポリ
ペプチドを意味する。 第１７図 ＭＫＫ７に対するＪＳＡＰ１ａの結合性をウエスタンブロティングに
より解析した結果を示した電気泳動の図である。下段はＣＯＳ−７細胞における
各Ｆｌａｇ−ＭＫＫ７の発現量を確認するため、細胞抽出液を用いたウエスタン
ブロティングの結果を示している。ＦＬは全長ポリペプチドを意味する。 第１８図 ＭＥＫ１、ＭＫＫ６およびＭＫＫ７に対するＪＳＡＰ１ａの結合性を
ウエスタンブロティングにより解析した結果を示した電気泳動の図である。下段
はＣＯＳ−７細胞における各Ｆｌａｇ−ＭＥＫ１、ＭＫＫ６およびＭＫＫ７の発
現量を確認するため、細胞抽出液を用いたウエスタンブロティングの結果を示し
ている。ＦＬは全長ポリペプチドを意味する。 第１９図 ＭＥＫＫ１のＮ末端部分（１−６４０アミノ酸残基）に対するＪＳＡ
Ｐ１ａの結合性をウエスタンブロティングにより解析した結果を示した電気泳動
の図である。下段はＣＯＳ−７細胞における各Ｆｌａｇ−ＭＥＫＫ１のＮ末端部
分の発現量を確認するため、細胞抽出液を用いたウエスタンブロティングの結果
を示している。ＦＬは全長ポリペプチドを意味する。 第２０図 Ｆｌａｇ−ｃ−Ｒａｆ１のＮ末端部分（１−３２７アミノ酸残基）あ
るいはＣ末端部分（３１６−６４８アミノ酸残基）に対するＪＳＡＰ１ａの結合
性をウエスタンブロティングにより解析した結果を示した電気泳動の図である。
下段はＣＯＳ−７細胞における各Ｆｌａｇ−Ｒａｆ−Ｎ、Ｒａｆ−Ｃの発現量を
確認するため、細胞抽出液を用いたウエスタンブロティングの結果を示している
。ＦＬは全長ポリペプチドを意味する。 第２１図 Ｐ１９細胞におけるＪＮＫ３活性をＧＡＬ４−ｃ−Ｊｕｎ転写活性と
して測定するＬＵＣレポーター系で、ＪＮＫ３活性に対するＣｄｃ４２およびＪ
ＳＡＰ１ａの効果を調べた結果を示す図である。縦軸はＪＮＫ３活性に対応する
、相対的なルシフェラーゼ活性を示した。 第２２図 Ｐ１９細胞におけるＥＲＫ活性をＧＡＬ４−Ｅｌｋ１転写活性として
測定するＬＵＣレポーター系で、ＥＲＫ活性に対するΔＲａｆ１およびＪＳＡＰ
１ａの効果を調べた結果を示す図である。縦軸はＥＲＫ活性に対応する、相対的
なルシフェラーゼ活性を示した。 第２３図 ＣＯＳ−７細胞にΔＭＥＫＫ１、ＪＮＫ３遺伝子を単独あるいは両方
をいっしょに導入し、得られたΔＭＥＫＫ１酵素液、ＪＮＫ３酵素液、活性化Ｊ
ＮＫ３酵素液を用い、ウエスタンブロティングにより解析した結果を示した電気
泳動の図である。Ａは活性化ＪＮＫ３の発現をリン酸化型ＪＮＫ３を認識する抗
体で染色した結果を、Ｂは抗Ｆｌａｇ抗体でＪＮＫ３を染色した結果を示す。レ
ーン１にはΔＭＥＫＫ１酵素液、レーン２には活性化ＪＮＫ３酵素液、レーン３
にはＪＮＫ３酵素液、レーン４には遺伝子を導入しないＣＯＳ−７細胞破砕液を
泳動した。 第２４図 ＪＮＫ３に対するＪＳＡＰ３、４、５の結合性をウエスタンブロティ
ングにより解析した結果を示した電気泳動の図である。下段はＣＯＳ−７細胞に
おける各Ｆｌａｇ−ＪＮＫ３の発現量を確認するため、細胞抽出液を用いたウエ
スタンブロティングの結果を示している。 第２５図 ＡＴＦ２に対するＪＳＡＰ３の結合性をオートラジオグラフィーによ
り解析した結果を示した電気泳動の図である。 第２６図 ３５Ｓでラベルされた種々の長さを有するＪＳＡＰ４分子の発現をオ
ートラジオグラフィーにより解析した結果を示した電気泳動の図である。 第２７図 ＪＳＡＰ４のＪＮＫ３結合領域をオートラジオグラフィーにより解析
により解析した結果を示した電気泳動の図である。得られた３５Ｓでラベルされ
た種々の長さを有するＪＳＡＰ４分子と、ＧＳＴあるいはＧＳＴ−ＪＮＫ３との
結合を解析した結果であり、結合した場合にそれがバンドとして観測される。 第２８図 ＪＳＡＰ４のＪＮＫ１、ＪＮＫ２、ＥＲＫ２への結合性をウエスタン
ブロティングにより解析した結果を示した電気泳動の図である。３段のブロティ
ングのうち、第２段および第３段はそれぞれＣＯＳ−７細胞におけるＪＳＡＰ４
および各ＭＡＰＫ（ＪＮＫ１、ＪＮＫ２、ＪＮＫ３、ＥＲＫ２）の発現量を確認
するため、細胞抽出液を用いたウエスタンブロティングの結果を示している。 第２９図 ＪＳＡＰ４のｃＤＮＡの一部の配列をプローブとしてマウス精巣、大
腸、心臓、肺、腎臓、脳、脾臓、肝臓のｍＲＮＡに対してノーザンハイブリダイ
ゼーションを行った結果を示す。発現コントロールとしてβ−ａｃｔｉｎの結果
も合わせて示した。 第３０図 ＣＯＳ−７細胞におけるＪＮＫ活性をＧＡＬ４−ｃ−Ｊｕｎ転写活性
として測定するＬＵＣレポーター系で、ＪＮＫ活性に対するＭＥＫＫ１、ＴＡＫ
１およびＪＳＡＰ４の効果を調べた結果を示す図である。縦軸はＪＮＫ活性に対
応する、相対的なルシフェラーゼ活性を示した。 第３１図 ＣＯＳ−７細胞におけるＥＲＫ活性をＧＡＬ４−Ｅｌｋ１転写活性と
して測定するＬＵＣレポーター系で、ＥＲＫ活性に対するΔＲａｆ１およびＪＳ
ＡＰ４の効果を調べた結果を示す図である。縦軸はＥＲＫ活性に対応する、相対
的なルシフェラーゼ活性を示した。 ［符号の説明］ ｋｂ：キロ塩基対（ｋｉｌｏｂａｓｅ ｐａｉｒｓ） Ａｐ：アンピシリン耐性遺伝子 ｋｎｔ：キロヌクレオチド（ｋｉｌｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ）
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ Ａ６１Ｋ 48/00 Ａ６１Ｐ 25/08 Ａ６１Ｐ 25/08 25/18 25/18 25/28 25/28 37/00 37/00 Ｃ０７Ｋ 16/18 Ｃ０７Ｋ 16/18 Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ 5/10 21/08 15/09 ＺＮＡ Ｃ１２Ｑ 1/02 Ｃ１２Ｐ 21/02 1/68 Ａ 21/08 Ｇ０１Ｎ 33/15 Ｚ Ｃ１２Ｑ 1/02 33/50 Ｚ 1/68 33/53 Ｄ Ｇ０１Ｎ 33/15 33/566 33/50 Ａ６１Ｋ 45/00 33/53 37/64 33/566 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ // Ａ６１Ｋ 45/00 Ｃ (Ｃ１２Ｎ 1/21 15/00 ＺＮＡＡ Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ Ｃ１２Ｒ 1:91） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:19） (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＵＡ(ＡＭ，ＡＺ ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＵ ，ＢＧ，ＢＲ，ＣＡ，ＣＮ，ＣＺ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ， ＩＮ，ＪＰ，ＫＲ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＲＯ，Ｓ Ｇ，ＳＩ，ＳＫ，ＵＡ，ＵＳ，ＶＮ，ＺＡ （注）この公表は、国際事務局（ＷＩＰＯ）により国際公開された公報を基に作 成したものである。 なおこの公表に係る日本語特許出願（日本語実用新案登録出願）の国際公開の 効果は、特許法第１８４条の１０第１項（実用新案法第４８条の１３第２項）に より生ずるものであり、本掲載とは関係ありません。

Claims (39)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 配列番号１０〜１６のいずれか１つに記載のアミノ酸配列から選
    ばれるアミノ酸配列からなるポリペプチド。
  2. 【請求項２】 配列番号１４〜１６のいずれか１つに記載のアミノ酸配列から選
    ばれるアミノ酸配列において１以上のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加された
    アミノ酸配列からなり、かつｃ−Ｊｕｎ Ｎ−ｔｅｒｍｉｎａｌ ｋｉｎａｓｅ
    ３（ＪＮＫ３）と結合することのできるポリペプチド。
  3. 【請求項３】 請求項１または２記載のポリペプチドをコードするＤＮＡ。
  4. 【請求項４】 配列番号２〜８のいずれか１つに記載の塩基配列から選ばれる塩
    基配列からなるＤＮＡ。
  5. 【請求項５】 配列番号６〜８のいずれか１つに記載の塩基配列からなるＤＮＡ
    とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつｃ−Ｊｕｎ Ｎ−ｔｅｒ
    ｍｉｎａｌ ｋｉｎａｓｅ ３（ＪＮＫ３）と結合することのできるポリペプチ
    ドをコードするＤＮＡ。
  6. 【請求項６】 請求項３〜５のいずれか１項に記載のＤＮＡをベクターに組み込
    んで得られる組換え体ＤＮＡ。
  7. 【請求項７】 組換え体ＤＮＡが、プラスミドｐｃＤＮＡ３−Ｓ−ＪＳＡＰ１ｂ
    、ｐｃＤＮＡ３−Ｓ−ＪＳＡＰ１ｃ、ｐｃＤＮＡ３−Ｓ−ＪＳＡＰ４、ｐＧＡＤ
    １０−ＪＳＡＰ５およびｐｃＤＮＡ３−Ｈｉｓ−Ｓ−ＪＳＡＰ５から選ばれる組
    換え体ＤＮＡである、請求項６記載の組換え体ＤＮＡ。
  8. 【請求項８】 請求項６または７記載の組換え体ＤＮＡを保有する形質転換体。
  9. 【請求項９】 形質転換体が、微生物、動物細胞、植物細胞および昆虫細胞から
    選ばれる形質転換体である、請求項８記載の形質転換体。
  10. 【請求項１０】 微生物が、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属に属する微生物である、
    請求項９記載の形質転換体。
  11. 【請求項１１】 Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属に属する微生物が、Ｅｓｃｈｅｒｉ
    ｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＪＳＡＰ１ｂ／ｐｃＤＮＡ３（ＦＥＲＭ ＢＰ−６５６７
    ）、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＪＳＡＰ１ｃ／ｐｃＤＮＡ３（ＦＥＲ
    Ｍ ＢＰ−６５６８）、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＪＳＡＰ４／ｐｃ
    ＤＮＡ３（ＦＥＲＭ ＢＰ−６５６９）、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ
    ＪＳＡＰ５／ｐＧＡＤ１０（ＦＥＲＭ ＢＰ−６５７０）およびＥｓｃｈｅｒｉ
    ｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＪＳＡＰ５／ｐｃＤＮＡ３（ＦＥＲＭ ＢＰ−６９２８）
    から選ばれる微生物である、請求項１０記載の形質転換体。
  12. 【請求項１２】 請求項８〜１１のいずれか１項に記載の形質転換体を培地に培
    養し、培養物中に請求項１または２記載のポリペプチドを生成蓄積させ、該培養
    物から該ポリペプチドを採取することを特徴とする、請求項１または２記載のポ
    リペプチドの製造方法。
  13. 【請求項１３】 請求項３〜５および配列番号５記載の塩基配列からなるＤＮＡ
    のいずれか１項に記載のＤＮＡの有する塩基配列中の連続した５〜６０塩基と同
    じ配列を有するオリゴヌクレオチド、該オリゴヌクレオチドと相補的な配列を有
    するオリゴヌクレオチド、およびこれらオリゴヌクレオチドの誘導体オリゴヌク
    レオチドから選ばれるオリゴヌクレオチド。
  14. 【請求項１４】 誘導体オリゴヌクレオチドが、オリゴヌクレオチド中のリン酸
    ジエステル結合がホスフォロチオエート結合に変換された誘導体オリゴヌクレオ
    チド、オリゴヌクレオチド中のリン酸ジエステル結合がＮ３’−Ｐ５’ホスフォ
    アミデート結合に変換された誘導体オリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチド中
    のリボースとリン酸ジエステル結合がペプチド核酸結合に変換された誘導体オリ
    ゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチド中のウラシルがＣ−５プロピニルウラシル
    で置換された誘導体オリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチド中のウラシルがＣ
    −５チアゾールウラシルで置換された誘導体オリゴヌクレオチド、オリゴヌクレ
    オチド中のシトシンがＣ−５プロピニルシトシンで置換された誘導体オリゴヌク
    レオチド、オリゴヌクレオチド中のシトシンがフェノキサジン修飾シトシン（ｐ
    ｈｅｎｏｘａｚｉｎｅ−ｍｏｄｉｆｉｅｄ ｃｙｔｏｓｉｎｅ）で置換された誘
    導体オリゴヌクレオチド、ＤＮＡ中のリボースが２’−Ｏ−プロピルリボースで
    置換された誘導体オリゴヌクレオチドおよびオリゴヌクレオチド中のリボースが
    ２’−メトキシエトキシリボースで置換された誘導体オリゴヌクレオチドから選
    ばれる誘導体オリゴヌクレオチドである、請求項１３記載のオリゴヌクレオチド
    。
  15. 【請求項１５】 請求項１３または１４記載のオリゴヌクレオチドを用い、請求
    項１または２記載のポリペプチドをコードするｍＲＮＡを検出する方法。
  16. 【請求項１６】 請求項１３または１４記載のオリゴヌクレオチドを用い、請求
    項１または２記載のポリペプチドの発現を抑制する方法。
  17. 【請求項１７】 請求項１または２記載のポリペプチドを認識する抗体。
  18. 【請求項１８】 請求項１７記載の抗体を用いることを特徴とする、請求項１ま
    たは２記載のポリペプチドの免疫学的検出法。
  19. 【請求項１９】 請求項１７記載の抗体を用いることを特徴とする、請求項１ま
    たは２記載のポリペプチドの免疫組織染色法。
  20. 【請求項２０】 請求項１７記載の抗体を含有する、免疫組織染色剤。
  21. 【請求項２１】 配列番号９〜１６のいずれか１つに記載のアミノ酸配列から選
    ばれるアミノ酸配列からなるポリペプチドまたは配列番号９〜１６のいずれか１
    つに記載のアミノ酸配列から選ばれるアミノ酸配列において１以上のアミノ酸が
    欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつｃ−Ｊｕｎ Ｎ−ｔ
    ｅｒｍｉｎａｌ ｋｉｎａｓｅ ３（ＪＮＫ３）と結合することのできるポリペ
    プチド、ＪＮＫ３および被験試料とを接触させることを特徴とする、該ポリペプ
    チドとＪＮＫ３との結合を阻害する活性を有する化合物のスクリーニング方法。
  22. 【請求項２２】 配列番号９〜１６のいずれか１つに記載のアミノ酸配列から選
    ばれるアミノ酸配列からなるポリペプチドまたは配列番号９〜１６のいずれか１
    つに記載のアミノ酸配列から選ばれるアミノ酸配列において１以上のアミノ酸が
    欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつｃ−Ｊｕｎ Ｎ−ｔ
    ｅｒｍｉｎａｌ ｋｉｎａｓｅ ３（ＪＮＫ３）と結合することのできるポリペ
    プチド、活性化されたＪＮＫ３および被験試料とを接触させることを特徴とする
    、活性化されたＪＮＫ３による、該ポリペプチドのリン酸化を阻害する活性を有
    する化合物のスクリーニング方法。
  23. 【請求項２３】 請求項２１または２２に記載の方法により得られる化合物また
    はその薬理学的に許容される塩。
  24. 【請求項２４】 配列番号９〜１６のいずれか１つに記載のアミノ酸配列から選
    ばれるアミノ酸配列からなるポリペプチドまたは配列番号９〜１６のいずれか１
    つに記載のアミノ酸配列から選ばれるアミノ酸配列において１以上のアミノ酸が
    欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつｃ−Ｊｕｎ Ｎ−ｔ
    ｅｒｍｉｎａｌ ｋｉｎａｓｅ ３（ＪＮＫ３）と結合することのできるポリペ
    プチドを発現する細胞と被験試料とを接触させることを特徴とする、該ポリペプ
    チドをコードする遺伝子の発現を変動させる化合物のスクリーニング方法。
  25. 【請求項２５】 遺伝子の発現を変動を請求項１５記載の方法を用い検出するこ
    とを特徴とする、請求項２４記載のスクリーニング方法。
  26. 【請求項２６】 ポリペプチドを請求項１８記載の方法を用い検出することを特
    徴とする、請求項２４記載のスクリーニング方法。
  27. 【請求項２７】 請求項２４〜２６のいずれか１項に記載の方法により得られる
    化合物またはその薬理学的に許容される塩。
  28. 【請求項２８】 配列番号９〜１６のいずれか１つに記載のアミノ酸配列から選
    ばれるアミノ酸配列からなるポリペプチドまたは配列番号９〜１６のいずれか１
    つに記載のアミノ酸配列から選ばれるアミノ酸配列において１以上のアミノ酸が
    欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつｃ−Ｊｕｎ Ｎ−ｔ
    ｅｒｍｉｎａｌ ｋｉｎａｓｅ ３（ＪＮＫ３）と結合することのできるポリペ
    プチドとＪＮＫ３との結合阻害剤。
  29. 【請求項２９】 活性化されたＪＮＫ３による、配列番号９〜１６のいずれか１
    つに記載のアミノ酸配列から選ばれるアミノ酸配列からなるポリペプチドまたは
    配列番号９〜１６のいずれか１つに記載のアミノ酸配列から選ばれるアミノ酸配
    列において１以上のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列から
    なり、かつｃ−Ｊｕｎ Ｎ−ｔｅｒｍｉｎａｌ ｋｉｎａｓｅ ３（ＪＮＫ３）
    と結合することのできるポリペプチドのリン酸化阻害剤。
  30. 【請求項３０】 請求項１または２記載のポリペプチドを含有する、アルツハイ
    マー病、パーキンソン病、ハンチントン病、多発性硬化症等の神経変性疾患、筋
    萎縮性側索硬化症等の筋萎縮性疾患、虚血性疾患、脳卒中時の脳障害、精神分裂
    病、うつ病、てんかん、各種免疫、炎症性疾患の予防薬。
  31. 【請求項３１】 請求項１または２記載のポリペプチドを含有する、アルツハイ
    マー病、パーキンソン病、ハンチントン病、多発性硬化症等の神経変性疾患、筋
    萎縮性側索硬化症等の筋萎縮性疾患、虚血性疾患、脳卒中時の脳障害、精神分裂
    病、うつ病、てんかん、各種免疫、炎症性疾患の治療薬。
  32. 【請求項３２】 請求項１３または１４記載のオリゴヌクレオチドを含有する、
    アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病、多発性硬化症等の神経変
    性疾患、筋萎縮性側索硬化症等の筋萎縮性疾患、虚血性疾患、脳卒中時の脳障害
    、精神分裂病、うつ病、てんかん、各種免疫、炎症性疾患の予防薬。
  33. 【請求項３３】 請求項１３または１４記載のオリゴヌクレオチドを含有する、
    アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病、多発性硬化症等の神経変
    性疾患、筋萎縮性側索硬化症等の筋萎縮性疾患、虚血性疾患、脳卒中時の脳障害
    、精神分裂病、うつ病、てんかん、各種免疫、炎症性疾患の治療薬。
  34. 【請求項３４】 請求項１７記載の抗体を含有する、アルツハイマー病、パーキ
    ンソン病、ハンチントン病、多発性硬化症等の神経変性疾患、筋萎縮性側索硬化
    症等の筋萎縮性疾患、虚血性疾患、脳卒中時の脳障害、精神分裂病、うつ病、て
    んん、各種免疫、炎症性疾患の予防薬。
  35. 【請求項３５】 請求項１７記載の抗体を含有する、アルツハイマー病、パーキ
    ンソン病、ハンチントン病、多発性硬化症等の神経変性疾患、筋萎縮性側索硬化
    症等の筋萎縮性疾患、虚血性疾患、脳卒中時の脳障害、精神分裂病、うつ病、て
    んかん、各種免疫、炎症性疾患の治療薬。
  36. 【請求項３６】 請求項１または２記載のポリペプチドをコードする遺伝子の転
    写を司るプロモーターＤＮＡ。
  37. 【請求項３７】 請求項３６記載のプロモーターＤＮＡおよび該プロモーターＤ
    ＮＡの下流に連結させたレポーター遺伝子を含有するプラスミドを保有する形質
    転換体と被験試料とを接触させ、該レポーター遺伝子の翻訳産物含量を測定する
    ことを特徴とする、該プロモーターによる転写の効率を変動させる化合物のスク
    リーニング法。
  38. 【請求項３８】 レポーター遺伝子が、クロラムフェニコール・アセチルトラン
    スフェラーゼ遺伝子、β−ガラクトシダーゼ遺伝子、ルシフェラーゼ遺伝子およ
    びグリーン・フルオレッセント・プロテイン遺伝子から選ばれる遺伝子である、
    請求項３７記載のスクリーニング方法。
  39. 【請求項３９】 請求項３７または３８記載の方法により得られる化合物または
    その薬理学的に許容される塩。
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