JPWO1996028966A1 - 外来遺伝子の導入により高等霊長類の抗原型を発現した非霊長哺乳類の形質転換動物及びその作出方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 非霊長哺乳類の動物に、高等霊長類の糖転移酵素を発現させる外来遺伝子を導入し、高等霊長類の糖鎖抗原を発現するようする。これにより、非霊長類哺乳動物の組織を、高等霊長類へ移植する際の超急性拒絶反応を緩和することができる。

Description

【発明の詳細な説明】 外来遺伝子の導入により高等霊長類の抗原型を発現した非霊長哺乳類の形質転換 動物及びその作出方法 〔技術分野〕 この発明は、外来遺伝子導入により、高等霊長類への移植に適した細胞、組織 あるいは臓器等を有する非霊長哺乳類の形質転換動物及びその動物の作出方法に 関し、特に、非霊長哺乳類の糖鎖抗原を高等霊長類に特有な形に転換し、その状 態を遺伝的に安定化させた形質転換動物及びその作出方法に関するものである。

なお、本発明において、高等霊長類とは、霊長類の真猿亜目のうち、ヒトやチ ンパンジー、オランウータン、ヒヒ、日本猿などが属する狭鼻猿類をいう。また 、非高等霊長類とは、霊長類の真猿亜目のうちの広鼻猿類及び原猿亜目をいう。

また、非霊長哺乳類あるいは非霊長類哺乳動物とは、霊長類でない哺乳類をいう 。

〔背景技術〕

今日、ヒトの欠損あるいは不完全な組織を、代替物を移植することにより補充 する治療法が一般的な治療法の一つとなりつつある。ここで、例えば組織とは、 腎臓や肝臓等の臓器から、皮膚、血管、細胞までも含まれ、かかる組織の代替物 としては、人工臓器や人工血管に代表される人工材料、自己の組織、さらには同 種あるいは異種の動物の組織や細胞までが含まれるものである。

しかし、人工臓器の多くは、いまのところ人工弁の他は移植された動物体内で 臓器として充分に機能できるまでには至っておらず、また、人工血管においては 、その内部に血栓が生じやすいという欠点があり、とりわけ、人工血管の直径が 小さいほど、その傾向が大きいという問題がある。

また、自己の組織を代替物として用いるにあたっては、補充用として利用可能 な器官や量に極めて限りがあるし、かかる組織を摘出し、さらに補充するための 身体への負担を考慮すれば、実際には不可能なことも多い。

さらに、ヒトに近い高等霊長類から摘出した組織により補充するには、その飼 育上の問題から需要に応じ切れないとともに、倫理的観点等からの問題があるた め、困難なことが多い。

一方、家畜は、非霊長哺乳類であって、その飼育方法が確立しており、容易に 入手でき、倫理的問題も少ないため、代替物の提供体、いわゆるドナーとして有 望である。

しかしながら、その反面、かかる哺乳動物から摘出した組織は、ヒトにおいて は激しい拒絶反応を引き起こすことが知られ、特に２４時間以内に発生する激し い拒絶反応（以下、超急性拒絶反応ともいう。）が問題となっている。

かかる超急性拒絶反応は、補充したドナー組織の血管をレシピエントの血管と を吻合して血液を灌流する際に、ドナーの組織内の血管内皮細胞で生じる。

この超急性拒絶反応は、ヒトが自然抗体を持つところの種との組み合わせにお いては、２種類あるヒトの補体系の活性化経路のうち、抗原抗体反応によって引 き起こされる古典経路が主要な反応であると考えられている。この抗原抗体反応 は、以下の原因によるものと考えられている。

まず、第１に、ブタなどの非霊長類哺乳動物の血管内皮細胞膜を含む脈管系細 胞及び血球系細胞（以下、単に脈管・血球系細胞ともいう。）上の抗原性がヒト 等の高等霊長類のそれと異なるからである。

すなわち、ブタなど非霊長哺乳類は、高等霊長類の持っていない彼ら特有の糖 鎖抗原（以下、この抗原をＧ型抗原あるいはＧ型物質という。）をその脈管・血 球系細胞膜表面に持っているからである。

第２に、ヒトはブタなどのＧ型抗原に対する自然抗体を生まれながらに持って いるからである。

したがって、例えばブタをドナーとする場合に、ブタの血管の中にヒトの血液 が流された際、ヒトの血液中の抗Ｇ自然抗体とブタの血管内皮細胞膜上のＧ型抗 原との抗原抗体反応が引き起こされ、その結果形成された抗原抗体複合体が補体 系を活性化し、ブタの血管内皮細胞が破壊され、補充したドナー組織の破壊につ ながり、超急性拒絶反応が生ずるのである。

かかる超急性拒絶反応を回避するために、非霊長哺乳類の組織を摘出してヒト に補充する際に、同時にヒト等のレシピエントにおける補体の活性を制限する物 質を供給する技術も開示されているが（特表平５−５０３０７４号公報）、そこ に示されている補体制限因子を持ったブタの細胞とヒトの血流との関係は、基本 的にはいわゆる異型輸血と同じ構造を持った関係となるため、超急性拒絶反応の 発生を必ずしも防止できるものではなく、又、ヒトが動物の抗原に感作されるた め、いわゆる血清病を誘発する可能性を併せもつという不都合がある。

また、ドナーにおいてＧ型抗原の発現に係わる遺伝子に対するアンチセンスＤ ＮＡを導入したり、この遺伝子の発現を完全に抑制したりしてドナー組織におけ るＧ型抗原の発現を抑制しようとする考えもある。しかし、この方法だけでは、 ドナー組織に、Ｇ型抗原の前駆物質が蓄積されることになり、この前駆物質は、 また、いわゆるボンベイ型抗原であるため、依然としてヒトに存する自然抗体に よる超急性拒絶反応を生じることになる。

さらに、同種移植の場合は免疫抑制剤の利用は有効な場合が多いが、異種移植 の場合は多剤併用してもなお、今日、超急性拒絶反応を免れていない。

ここで、脈管・血球系細胞におけるＡＢＨ型物質の異種間分布をみると、ＡＢ Ｈ型物質が発現されるのは、本発明にいう、高等霊長類、すなわち、真猿亜目の うち、ヒトやチンパンジー、オランウータン、ヒヒ、日本猿などが属する狭鼻猿 類だけであって、他の霊長類や非霊長類哺乳動物では消化管粘膜や嗅覚受容体細 胞などでは発現されていることがあるが、脈管・血球系細胞には発現されていな い。

一方、非霊長哺乳類が脈管・血球系細胞に有するＧ型物質は、ＡＢＨ型物質の 前駆物質（Ｎ−アセチルラクトサミン）に対し、ガラクトースがα１−３構造で 結合した物質である。

ＡＢＨ型物質とＧ型物質の合成経路について図１に示す。

すなわち、本発明にいうＨ型物質は前駆物質（Ｎ−アセチルラクトサミン）に 対して、ＧＤＰ-L-フコース：β-D-ガラクトシド ２-α-L-フコシルトランスフ ェラーゼ（以下、単にＦＴという。）が作用して生成され、Ｇ型物質は、前述の Ｈ型物質と同じ前駆物質であるＮ−アセチルラクトサミンに対してＵＤＰガラク トース：β-D-ガラクトシル-1,4-Ｎ-アセチル-D-グルコサミニド α-1,3-ガラ クトシルトランスフェラーゼ（以下、単にＧＴという。）が作用して生成される のである。このように、ヒト等とブタ等における脈管・血球系細胞における抗原 型の差異は、前駆物質に作用する酵素の差異、換言すれば、ブタ等に酵素ＧＴが 存在し、反対にヒト等に酵素ＧＴが存在せず酵素ＦＴが存在するという差異に基 づくものである。このような各種組織におけるＡＢＨ型物質の存否、酵素の存否 は、進化に基づくものであると考えられている。

しかしながら、かかる高等霊長類と非霊長類哺乳動物におけるそれぞれ特有の 糖鎖抗原の分布と、超急性拒絶反応の主たる場である血管内皮細胞等におけるこ れら糖鎖抗原の差異を積極的に利用して、超急性拒絶反応を緩和することについ ては、従来全く着目されていなかった。

〔発明の開示〕

そこで、本発明は、従来の異種間移植における問題を解決するべく、家畜とし て広く餌育され入手の容易なブタ等の非霊長類哺乳動物において、従来にない新 しい手法により、移植時の超急性拒絶反応を緩和して、非霊長類哺乳動物の組織 を高等霊長類への移植に適用することを目的とするものである。

上記目的を達成するため、本発明者は、ブタ等の非霊長類哺乳動物において、 遺伝子工学的・発生工学的に、例えばＦＴ等の高等霊長類の糖転移酵素を発現さ せて、高等霊長類の抗原物質を積極的に生成せしめ、あるいは同時に、例えばＧ Ｔ等の非霊長類哺乳動物の糖転移酵素の発現を抑制して、脈管・血球系細胞を抗 原的に高等霊長類型に転換することにより、高等霊長類に非霊長類哺乳動物の組 織を移植した際の超急性拒絶反応を緩和できることを見い出し、以下の発明を完 成したのである。

なお、異種間移植の超急性拒絶反応を緩和させるために、ドナーにおいてヒト 等の高等霊長類とおなじＨ型物質を発現させることは従来考えられていない。す なわち、従来は、自然抗体と抗原との結合後における補体活性化経路の抑制等に 着目されていた。また、本発明は、ヒト等の高等霊長類における抗Ｇ自然抗体と Ｇ型抗原との結合自体を抑制する点で、従来の手法に対し、より本質的な解決手 段といえる。

本発明の非霊長哺乳類の形質転換動物は、高等霊長類の糖耘移酵素を発現させ る外来遺伝子を有することを特徴とする。

これらの外来遺伝子は、ヘテロの状態で保持されていても、ホモの状態で保持 されていてもかまわないが、ホモの状態で保持されることが好ましい。

この動物は、特に、前記高等霊長類の糖転移酵素としてＦＴを発現させる外来 遺伝子を有することもできる。

また、本発明の動物は、高等霊長類の糖転移酵素を発現させる第１の外来遺伝 子と、非霊長哺乳類の糖転移酵素の発現を抑制する第２外来遺伝子、とを有する 。

特に、前記高等霊長類の糖転移酵素をＦＴとし、非霊長哺乳類の糖耘移酵素を ＧＴとすることができる。

これらの外来遺伝子は、ヘテロの状態で保持されていても、ホモの状態で保持 されていてもかまわないが、ホモの状態で保持されることが好ましい。

特に、本発明の非霊長類哺乳動物は、ブタとすることができる。

また、本発明の動物から得られた組織は、幅広く高等霊長類への移植材料に適 用することができる。

さらに、本発明の方法は、高等霊長類の糖耘移酵素を発現させる第１の外来遺 伝子及び／又は非霊長哺乳類の糖転移酵素の発現を抑制する第２の外来遺伝子を 非霊長哺乳類に導入することを特徴とする高等霊長類型の抗原型を発現した非霊 長哺乳類の形質転換動物の作出方法である。

以下、本発明を詳細に説明する。

ブタ等の非霊長類哺乳動物の脈管・血球系細胞において、ヒトなど高等霊長類 だけが持ち、ブタなどの非霊長類哺乳動物が持たない遺伝子あるいはその発現物 質であるタンパク質を発現させるには、形質転換動物を作成することが必要にな る。

ヒトとヒトとの移植における基本原則の一つとして血液型を合わせることが広 く認められているが、いわゆる血液型すなわちＡＢＯ式の分類の基本物質はＨ型 物質であって、それは脈管・血球系細胞においては、前述のように前駆物質（Ｎ −アセチルラクトサミン）に糖転移酵素ＦＴが作用して形成される。

しかし、ブタなど非霊長類哺乳動物は、ＦＴでなくＧＴを持ち、それによりヒ トとは異なった物質（Ｇ型物質）を形成している。

したがって、例えば、Ｈ型物質をその前駆物質から生成する糖耘移酵素ＦＴを コードするＦＴ遺伝子を含む外来遺伝子断片をブタ等の受精卵に導入し、この遺 伝子断片が染色体上に組み込まれた場合、各細胞でこのＦＴ遺伝子が転写翻訳さ れ、酵素ＦＴが産生されてＨ型物質を発現させることが期待できる。

さらに、Ｈ型物質の場合には、酵素ＦＴが前駆物質を消費すれば、それだけ、 内在する酵素ＧＴと前駆物質との結合が阻害され、Ｇ型物質の生成が抑制される ことが期待できる。なお、ＦＴ遺伝子はブタ染色体にくみこまれた後、安定して 子孫に伝達されることが可能である。

さらに、本発明では、ブタ等の非霊長類哺乳動物に内在する糖耘移酵素、例え ば、Ｇ型物質をその前駆物質から生成する糖転移酵素ＧＴの遺伝子の発現を不活 性化する目的で、ＧＴ遺伝子のアンチセンスＤＮＡを含む外来遺伝子断片をブタ 受精卵に導入する。この遺伝子断片が、個体の染色体上に組み込まれた場合、各 細胞でこのアンチセンスＤＮＡが転写されれば、その転写物は内在性のＧＴ転写 産物と対合して、ＧＴ遺伝子の翻訳が抑制されることが期待される。

この結果、個体レベルでは、酵素ＦＴが積極的に発現されるとともに、酵素Ｇ Ｔの発現が抑制されて、Ｈ型物質が生成される一方、一層Ｇ型物質の生成が低減 されたブタ等を得ることができる。なお、アンチセンスＤＮＡ等の外来遺伝子断 片は、染色体に組み込まれた後、安定して子孫に伝達されることが可能である。

なお、一旦、染色体に外来遺伝子が組みこまれた後、交配により外来遺伝子に 関してホモの状態にすることが可能であり、高等霊長類の糖転移酵素を発現させ る外来遺伝子に関してホモの状態の系と、非霊長哺乳類の糖転移酵素に関してホ モの状態の系とを交配させることにより、非霊長哺乳類の酵素を発現するかわり に、高等霊長類の糖転移酵素を発現して、高等霊長類の抗原型を呈した非霊長類 哺乳動物の系を得ることができる。

本発明では、高等霊長類として、特にヒトを対象することができる。また、本 発明では、非霊長哺乳類として、特に、前記高等霊長類に対して異種間移植の対 象となる動物を対象とすることができる。さらに、家畜として飼育されるブタ、 ウシ、ヒツジ、ヤギ等が好適である。これらの家畜は、飼育が容易で、安定した 供給が可能なため、移植用組織の補充に適する。さらに、ブタが、臓器の大きさ や、生理学的・生化学的な観点、発育が早く多産である点から好適である。

高等霊長類の糖転移酵素とは、高等霊長類において見いだされ、非霊長哺乳類 の脈管・血球系細胞において見いだされない抗原の生成に関与する糖転移酵素を いう。具体例としては、ＦＴを挙げることができる。特に、ヒトＦＴは〔ＥＣ２ ．４．１．８９〕で特定される。

高等霊長類の糖転移酵素を発現させる外来遺伝子は、該糖転移酵素の遺伝子の 他、プロモータ、ターミネーター等を有することができる。ＳＶ４０の初期遺伝 子のポリＡ付加シグナルに続くターミネーターは付加に適した配列の一つである 。一般的にどの遺伝子からとったポリＡシグナルかによって遺伝子の発現のレベ ルはかなり左右されるが、ＳＶ４０初期遺伝子から取ったポリＡ付加遺伝子が優 れている。このシグナルはターミネーターの前に置かれる。

例えば、ＦＴを発現させることのできる外来遺伝子を形成するには、少なくと もＦＴの遺伝子配列を知る必要がある。ヒトのＦＴについては、既に報告されて いる（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，87(1990),pp6674-6678 ）。

また、外来遺伝子は、染色体における非相同的組み換えのみならず、相同的組 み換えを目的として構築することもできる。この場合、例えば、ブタのＧＴ遺伝 子をターゲットに、ヒトのＦＴ遺伝子を組み換えるようにすれば、ＧＴの発現の 抑制と、ＦＴの発現が同時に可能である。

なお、遺伝子断片が染色体に組み換えられた際に、高率に前記糖転移酵素が発 現される手段を用いることができる。例えばｐＭＡＭをベクタープラスミドとし て外来遺伝子断片を調製した場合には、ステロイドの投与により高発現が誘導さ れうる。

非霊長哺乳類の糖転移酵素とは、非霊長哺乳類の脈管・血球系細胞において見 いだされ高等霊長類において見いだされない抗原の生成に関与する糖転移酵素を いう。具体例としては、ブタやマウスのＧＴを挙げることができる。特に、マウ スＧＴは、〔ＥＣ ２．４．１．１５１〕で特定される。

非霊長哺乳類の糖転移酵素の発現を抑制する外来遺伝子には、該糖耘移酵素の 遺伝子に対するアンチセンスＤＮＡや、該糖転移酵素の遺伝子において相同的に 組み換えされて、該遺伝子を他の遺伝子で置換したり、該遺伝子に他の遺伝子を 挿入したり、変異を導入することにより、該遺伝子を破壊する外来遺伝子を用い ることができる。

この外来遺伝子を形成するには、少なくとも非霊長哺乳類の糖転移酵素の遺伝 子配列を知る必要がある。マウスＧＴ遺伝子は、既に報告されている(Ｐｒｏｃ ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，86(1989),pp.8227-8231)。また、ブタ ＧＴ遺伝子も既に報告されている（Ｘｅｎｏｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ １９９４；１：pp.81-88）。

例えば、ＧＴのアンチセンスＤＮＡを外来遺伝子とする場合には、ＧＴ遺伝子 のｃＤＮＡの一部又は全部をアンチセンス方向に組み込んだ断片を外来遺伝子と して形成する。

また、相同的組み換えによる場合には、例えばＧＴ遺伝子との相同領域を可及 的多く有するように形成するのが好ましい。

なお、非霊長哺乳類の糖転移酵素の発現を抑制するには、外来遺伝子の導入以 外に従来公知の方法によることもできる。

非霊長類哺乳動物への外来遺伝子の導入は、レトロウイルスを用いる方法やマ イクロインジェクションによる方法等多数あるが、どの方法も採用することがで きる。子孫を得るという点からは、生殖細胞を形質転換することが望ましい。こ の場合の形質転換は、非霊長類哺乳動物の胚細胞やＥＳ細胞あるいは、受精卵に 対して行うのが望ましい。

このように、外来遺伝子が導入された非霊長類哺乳動物は、種々の細胞におけ る高等霊長類の糖転移酵素の発現により、あるいは同時に非霊長哺乳類の糖転移 酵素の発現の抑制により、組織・血液の抗原型が高等霊長類に近似された動物と なる。したがって、これらの動物の組織等を高等霊長類へ移植した際の超急性拒 絶反応を緩和することができるようになり、これらの動物の組織等は、高等霊長 類への移植に適したものとなる。また、特に、血管内皮細胞で発現された場合に は、超急性拒絶反応が大きく緩和される。さらに、赤血球細胞における高等霊長 類の糖転移酵素の発現により、血液の抗原型が高等霊長類に近似された動物とな り、これらの動物の血液は高等霊長類の代替血液に適したものとなる。

また、高等霊長類の糖転移酵素ＦＴが導入された場合には、非霊長哺乳類の脈 管・血球系細胞では、Ｈ型物質が発現されると同時にＧ型物質が低減されること になり、組織・血液の抗原型が高等霊長類に近似された動物となる。加えて、同 時にＧＴの発現を抑制する外来遺伝子も導入された場合には、より一層Ｇ型物質 が低減され、組織・血液の抗原型が極めて高等霊長類に近似された動物となり、 これらの組織・血液は、高等霊長類への移植・代替物により適したものとなる。

なお、特に、ＦＴが血管内皮細胞表固に発現されれば、異種間臓器あるいは組 織移植における超急性拒絶反応が大きく緩和される。また、赤血球において発現 されれば、代替血液により適したものとなる。

また、相同組み換えにより、ＧＴのかわりにＦＴが発現するように転換された 形質転換動物においては、染色体上の１本以上のＧＴ遺伝子座のうち、一本が存 在せず、同時にＦＴが少なくとも１本存在するようになるため、交配により染色 体上にＧＴが１本も存在せず、その代わりにＦＴが２本存在する個体を得ること ができる。こうした個体はドナーとして、レシピエントのＡＢＯ式の血液型のい かんをとわずに、ヒト等の移植に適した移植材料を提供する。

このように、かかる形質転換された非霊長類哺乳動物は、ヒト等の高等霊長類 に移植の可能な組織・血液を有するため、ヒト等の組織等の代替物の提供源とな る。また、これらの動物が安定して飼育されることにより、必要時に、必要な組 織等を提供可能となり、移植組織等の貯蔵体となる。

また、非霊長類哺乳動物における高等霊長類特有のＦＴ遺伝子の発現により、 異種間移植の場合に超急性拒絶反応を緩和できる動物や材料を提供する方法は、 従来にない新規なものであるとともに、異種間移植における超急性拒絶反応の緩 和のために、より本質的な解決をもたらすものである。

本発明の非霊長哺乳類の形質転換動物によれば、その組織・血液において、高 等霊長類の糖鎖抗原が生成されるため、あるいは同時に非霊長哺乳類の糖鎖抗原 の生成が抑制されるため、非霊長類哺乳動物の組織を異種間移植となる高等霊長 類に移植した場合に超急性拒絶反応を緩和することができ、従来の人工血管や人 工臓器、あるいは同種間で補充される臓器、組織等に代わり得る材料を提供する ことができる。

なお、本発明により非霊長類哺乳動物を形質転換することは、これらの動物に いかなる被害あるいは虐待を与えることがなく、また、本発明は、形質転換され た非霊長類哺乳動物の生存、生殖等に悪影響を及ぼすものではない。さらに、本 発明は、ヒトをはじめ他のいかなる動物に対しても悪影響を及ぼすものではない 。

〔図面の簡単な説明〕

図１は、前駆物質（Ｎ−アセチルラクトサミン）からのＡＢＨ型物質とＧ型物 質の合成経路を示す図である。

図２は、実施例１のＦＴ遺伝子を有するプラスミドｐＭＡＭ／ＦＴを構築操作 する過程図である。

図３は、実施例１のＦＴ遺伝子導入用断片の模式図である。

図４は、実施例２のｐＲＥＰ８／ＡＳ／ＧＴを構築操作する過程図である。る 。

図５は、実施例２のＡＳ／ＧＴ遺伝子導入用断片の模式図である。

図６は、実施例３のｐＲＥＰ９／ＧＴ３−４を構築操作する過程図である。

図７は、実施例３のｐＲＥＰ９／ＧＴ３−４／ＦＴ／△ＳｓｐＩ／△ＤｒａＩ ＩＩを構築操作する過程及び遺伝子断片ＧＴ３−４／ＦＴ／ｐｏｌｙＡの調製過 程を図示したものである。

図８は、実施例３のｐＧＴ／ＦＴを構築操作する過程図である。

図９は、⁵¹Ｃｒリリースアッセイの結果を示すグラフ図である。

〔発明を実施するための最良の形態〕 以下に本発明の実施例を示す。本発明に於ける外来遺伝子に関して、既に述べ た２種類の糖転移酵素、即ちＧＴ遺伝子とＦＴ遺伝子のｃＤＮＡを例示できる。

ただし、以下の実施例は、請求の範囲を制限するものではない。

（実施例１） 導入用遺伝子を含むプラスミド（ｐＭＡＭ／ＦＴ）の構築及びその遺伝子導入 用断片の調製 （１）ＰＣＲ法によるＦＴ遺伝子断片の調製 Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．87(1990),pp6674-6678に報 告されたヒトのＦＴ〔ＥＣ２．４．１．９６〕のＤＮＡ配列に基づいて、そのス タートコドンとストップコドンを含むような形でＰＣＲ用の２種類のプライマー を合成した。なお、その５’側のプライマーには、制限酵素NheIのサイトを付け た、また３’側のプライマーには、制限酵素XhoIのサイトを付けた。

一方、健康な成人の血液より白血球を採取し全ＲＮＡを抽出し、逆転写酵素を 用いて、全ＲＮＡに対応するｃＤＮＡを合成した。このｃＤＮＡを鋳型にして、 前記のプライマーを用いてＰＣＲを施行した。

本ＰＣＲ施行により得られたｃＤＮＡ断片を１％アガロースゲル電気泳動にか けたところ、約1100bpの長さのバンドを得た。このＰＣＲ産物をｐＧＥＭ−Ｔ（ Promega社製）に挿入した上で自動塩基配列読み取り機で塩基配列を読み取った ところ、前記既報の通りのＦＴ遺伝子の塩基配列を有していた。そこでこのｃＤ ＮＡを０．８％Low Melting Point（以下、ＬＭＰという。）ゲルで電気泳動し て精製した後、制限酵素NheIとXhoIで処理し、レジンを用いたPromega社のWizar dＤＮＡ精製システム（以下、Wizardシステムという。）により精製・分離した 。なお、以下各種ＤＮＡ断片の精製分離は、ＬＭＰゲル電気泳動とWizardシステ ムとを用いることにより行った。

（２）ｐＭＡＭ／ＦＴの構築 哺乳類発現ベクターの一種であるｐＭＡＭ（CLONETECH社製、Lee,F.(1981)Nat ure 294:228)のマルチクローニング部位（ＭＣＳ）を制限酵素NheIとXhoIで処理 し、この断片をＬＭＰゲル電気泳動及びWizardシステムで精製・分離した。この ベクターに精製・分離したＦＴ遺伝子のｃＤＮＡを、Ｔ４ＤＮＡリガーゼにより 挿入させた。このプラスミドＤＮＡによって、コンピテント状態のＪＭ１０９ 細菌細胞を形質転換させて、得られた形質転換体をアンピシリンプレートで選択 した。個々のコロニー毎にＬＢ培地（組成；Bacto-tryprone 10g(DIFCO社製）、 Bacto-yeast extract 5g(DIFCO社製）、NaCl 10gを水にて1Lとする、以下同じ。

）で増殖させ、ミニプラスミド調製を行った。抽出したプラスミドＤＮＡを種々 の制限酵素を使って消化した後に電気泳動して、挿入断片のサイズ及び位置方向 を調べた。その結果、正しい方向に組み込まれているプラスミドを、ｐＭＡＭ／ ＦＴと称した（図２参照）。

（３）遺伝子導入用断片の調製 さらに、遺伝子導入のための直鎖状断片とするために、大腸菌ＪＭ１０９／ｐ ＭＡＭ／ＦＴ株をＬＢ培地で大量培養した後に、プラスミド調製を行った。さら に、得られたプラスミドをｃεＣｌ密度勾配遠心法により精製した。精製したプ ラスミド１０μｇを、制限酵素ＰｖｕＩとＢａｍＨＩで消化後、この断片を精製 ・分離し、ＦＴ遺伝子導入用断片とした。この断片の構築模式図を図３に示す。

（実施例２） 導入用遺伝子を含むプラスミド（ｐＲＥＰ８／ＡＳ／ＧＴ）の構築及びその導 入用遺伝子断片の調製 （１）アンチセンスＧＴの調製 既報（Ｘｅｎｏｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ １９９４；１：pp８１−８ ８）に報告されたブタＧＴ遺伝子のＤＮＡ配列に基づいて、そのスタートコドン とストップコドンを含むような形で２種類のＰＣＲ用のプライマーを合成した。

なお、その５’側のプライマーには、制限酵素XhoIのサイトを付けた、また３’ 側のプライマーには制限酵素NheIのサイトを付けた。

一方、健康なブタの血液より白血球を採取し、その全ＲＮＡを抽出し、逆転写 酵素を用いて全ＲＮＡに対応するｃＤＮＡを合成した。このｃＤＮＡを鋳型にし て、前記のプライマーを用いてＰＣＲを施行した。

本ＰＣＲ施行により得られたｃＤＮＡ断片を１％アガロースゲル電気泳動にか けたところ、約1100bpの長さのバンドを得た。このＰＣＲ産物をｐＧＥＭ−Ｔ（ prornega社製）に挿入した上で、自動塩基配列読み取り機で塩基配列を読み取っ たところ、前記既報の通りのＧＴ遺伝子の塩基配列を有していた。そこでこのｃ ＤＮＡをＬＭＰゲルで電気泳動して精製した後、制限酵素NheIとXhoIで処理し、 Wizardシステムを用いて精製・分離した。

（２）ｐＲＥＰ８／ＡＳ／ＧＴの構築 哺乳類発現ベクターの一種であるｐＲＥＰ８（Invitorogen社製、George,R.,e t al,Gene,81,285(1989)）のＭＣＳを制限酵素XhoIとNheIで処理し、精製・分離 した。このベクターに、Ｔ４ＤＮＡリガーゼにより、精製・分離したＧＴ遺伝子 のｃＤＮＡを、挿入した。このプラスミドＤＮＡによって、コンピテント状態の ＪＭ１０９細菌細胞を形質転換させて、得られた形質転換体をアンピシリンプレ ートで選択した。個々のコロニー毎にＬＢ培地で増殖させ、ミニプラスミド調製 を行った。抽出したプラスミドＤＮＡを種々の制限酵素を使って消化した後に電 気泳動して、挿入断片のサイズ及び位置方向を調べた。その結果、正しくアンチ センス方向に組み込まれているプラスミドを、ｐＲＥＰ８／ＡＳ／ＧＴと称した （図４参照）。

（３）導入用遺伝子断片の調製 さらに、遺伝子導入のための直鎖状断片とするために、大腸菌ＪＭ１０９／ｐ ＲＥＰ８／ＡＳ／ＧＴ株をＬＢ培地で大量培養した後に、プラスミド調製を行っ た。さらに、得られたプラスミドをＣｓＣｌ密度勾配還心法により精製した。精 製したプラスミド１０μｇを、制限酵素ＸｂａＩとＰｓｔＩで消化後、この断片 をＬＭＰゲル電気泳動及びWizardシステムで精製・分離し、ＡＳ／ＧＴ遺伝子導 入用断片とした。この断片の構築模式図を図５に示す。

（実施例３） 相同組換え用遺伝子を含むプラスミド（ｐＲＥＰ９／ＧＴ／ＦＴ）の構築及び 導入用遺伝子断片（ｐＧＴ／ＦＴ）の調製 以下、マウスの例を示すがブタにおいても基本的な考え方は同じである。

（１）ｐＲＥＰ９／ＧＴ３−４の構築 以下、ｐＲＥＰ９／ＧＴ３−４の構築を図６に基づいて説明する。

既報(Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，86(1989),pp.8227-82 31)のマウスのＧＴ〔ＥＣ２．４．１．１５１〕の配列に基づいてエキソン３か ら４までの部分をＰＣＲ法にて抽出するために、エキソン３内のセンスプライマ ーとして制限酵素ＫｐｎＩの切断部位をつけたプライマー（ｐ／Ａとする）、又 アンチセンスプライマーとしてエキソン４内のスタートコドンの部位に制限酵素 ＳｓｐＩの切断部位を含み、その下流に制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩの切断部位をつ けたプライマー（ｐ／Ｂ）を合成した。

これらのプライマーｐ／Ａ及びｐ／Ｂを用いてＰＣＲ法を施行し、得られた断 片を、制限酵素ＫｐｎＩ及びＨｉｎｄＩＩＩで切断した後、精製・分離し、これ をＧＴ３−４と称した。

一方、発現ベクターであるｐＲＥＰ９（Invitragen社）を制限酵素ＢａｍＨＩ で切断し、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼによりその断端を平滑にし、Ｔ４ＤＮＡリガ ーゼによりself−ligatianし、制限酵素ＢａｍＨＩの切断部位が欠失した発現ベ クターを、ｐＲＥＰ９／△ＢａｍＨＩと称した。

これを更に制限酵素ＤｒａＩＩＩで切断し、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼによりそ の断端を平滑にし、Ｔ４ＤＮＡリガーゼによりself−ligationし、制限酵素Ｄｒ ａＩＩＩの切断部位が欠失した発現ベクターを、ｐＲＥＰ９／△ＢａｍＨＩ／△ ＤｒａＩＩＩと称した。このベクターを制限酵素ＫｐｎＩ及びＨｉｎｄＩＩＩで 切断し、上記ＧＴ３−４を挿入したプラスミドをｐＲＥＰ９／ＧＴ３−４と称し た。

（２）ｐＲＥＰ９／ＧＴ３−４／ＦＴ／△ＳｓｐＩ／△ＤｒａＩＩＩの構築 以下、ｐＲＥＰ９／ＧＴ３−４／ＦＴ／△ＳｓｐＩ／△ＤｒａＩＩＩの構築を 図７に基づいて説明する。

ヒトＦＴ（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．87(1990),pp667 4-6678）の配列に基づき、そのスタートコドンとストップコドンを含む発現部位 をＰＣＲ法にて抽出するために、スタートコドンを含む５’側のセンスプライマ ー（ｐ／Ｃ）には制限酵素ＮｈｅＩとＤｒａＩＩＩ切断部位を、この順で付けた 。

一方、ＦＴのストップコドンを含むアンチセンスプライマー（ｐ／Ｄ）にはそ の３’側に制限酵素ＸｈｏＩ切断部位を付けた。これらのプライマーを用いてＰ ＣＲ法を施行し、得られた断片を制限酵素ＮｈｅＩ及びＸｈｏＩで切断し、ｐＲ ＥＰ９／ＧＴ３−４を制限酵素ＮｈｅＩ及びＸｈｏＩで切断したプラスミドに挿 入する。これをｐＲＥＰ９／ＧＴ３−４／ＦＴと称した。

このプラスミドｐＲＥＰ／ＧＴ３−４／ＦＴを制限酵素ＳｓｐＩ及びＤｒａＩ ＩＩで切断すると平滑末端が生成された。

ここでＴ４ＤＮＡリガーゼにて処理するとself−ligationにより両者末端が連 結し、ＧＴの発現開始部位にＦＴｃＤＮＡの発現開始部位が位置された。

このプラスミドをｐＲＥＰ９／ＧＴ３−４／ＦＴ／△ＳｓｐＩ／△ＤｒａＩＩ Ｉと称した。以上に於いてこれら制限酵素ＫｐｎＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ，ＳｓｐＩ 、ＮｈｅＩ、ＤｒａＩＩＩ、及びＸｈｏＩがいずれもエキソン３からエキソン４ までの断片及びＦＴｃＤＮＡの発現部位の断片を切断しないことが既に確かめら れている。

（３）導入用遺伝子断片ｐＧＴ／ＦＴの調製 以下、ｐＧＴ／ＦＴの調製について図７及び図８に基づいて説明する。

ｐＲＥＰ９のｐｏｌｙＡの３’側を含みかつ制限酵素ＢａｍＨＩ切断部位を含 む形でアンチセンスプライマー（ｐ／Ｅ）を合成し、これとセンスプライマー（ ｐ／Ａ）とを用いて、ｐＲＥＰ９／ＧＴ３−４／ＦＴ／△ＳｓｐＩ／△ＤｒａＩ ＩＩに対し、ＰＣＲ法を施行し、得られた断片を制限酵素ＫｐｎＩ及びＢａｍＨ Ｉで切断して精製・分離し、得られた断片をＧＴ３−４／ＦＴ／ｐｏｌｙＡと称 した（図７参照）。

一方、発現ベクターｐＲＥＰ９を制限酵素ＫｐｎＩとＢａｍＨＩで切断し、上 記の断片ＧＴ３−４／ＦＴ／ｐｏｌｙＡを挿入した。これをｐＲＥＰ９／ＧＴ３ −４／ＦＴ／ｐｏｌｙＡと称した。

ＧＴのエキソン４からエキソン６又はエキソン７までの部分を、センスプライ マー（ｐ／Ｆ）、アンチセンスプライマー（ｐ／Ｇ）とも制限酵素ＢａｍＨＩの 切断部位を付け、ＰＣＲ法にて抽出し、この断片を制限酵素ＢａｍＨＩで切断し 、得られた断片を、制限酵素ＢａｍＨＩで開列したプラスミドｐＲＥＰ９／ＧＴ ３−４／ＦＴ／ｐｏｌｙＡに挿入した（ＢａｍＨＩが、ＧＴ３−４、ＦＴ、ｐｏ ｌｙＡ及びＴ４−７を切断しないことは既に確かめられている）。

得られたプラスミドをｐＲＥＰ９／ＧＴ３−４／ＦＴ／ｐｏｌｙＡ／ＧＴ４− ７、或いは簡単に、ｐＲＥＰ９／ＧＴ／ＦＴと称した。

このプラスミドに対し、プライマーｐ／Ａ及びｐ／Ｇを用いてＰＣＲ法を施行 した。精製後得られた断片を受精卵への導入用断片とし、ＧＴ３−４／ＦＴ／ｐ ｏｌｙＡ／ＧＴ４−７、或いは簡単にｐＧＴ／ＦＴと称した。

このようにして作成した導入用遺伝子断片は、ＧＴの染色体の遺伝子と相同性 が高く、相同組み換えを起こすことが期待される。相同組み換えを起こした場合 は、ＧＴの代わりにＦＴが発現するのでその個体（Ｆｏ）はＧＴもＦＴも発現す る。しかし交配を１、２世代行うと、メンデルの法則により、ＦＴのみを持った 個体を得ることが出来る。この個体こそが、非霊長類哺乳動物に特有な抗原を持 たずに高等霊長類特有の抗原を持つに至った、形質転換動物である。マウスのＧ ＴとブタのＧＴとではホモロジーが高いのでマウスのＧＴに基づいた相同組み換 え遺伝子をブタに適用することができる。

（実施例４） 導入用遺伝子断片（ｐＭＡＭ／ＦＴ及びｐＲＥＰ８／ＡＳ／ＧＴ）のブタ受精 卵への注入及びその受精卵の移植 （１）導入用遺伝子断片（ｐＭＡＭ／ＦＴ及びｐＲＥＰ８／ＧＴ）のブタ受精卵 への注入 実験動物として家畜豚を用いた。受精卵提供用のブタとしてLandraceとWhite Yorkshireの交配豚で、生後約６ヶ月の、まだ自然発情を来す前の雌ブタを用い た。この雌ブタに排卵誘発剤ｐＭＳ(妊馬血清、シグマ社製、G4877)及びｈＣＧ （ヒト絨毛ゴナドトロピン、シグマ社製、CG5）を注射し、Duroc系の成熟雄ブタ から採取した精液により人工受精を行い、卵管をＭ２培地で灌流することにより 受精卵を採取した。これらの受精卵の前核は脂肪滴に覆われているために直視出 来ないため、受精卵を10000gで１０分間遠心することにより、脂肪滴と前核を分 離し、微分干渉顕微鏡で直視下においた。

受精卵への遺伝子の注入に於いては、マウス受精卵に於ける遺伝子導入の既報 (Hogan．et al.，In manipulating the Mouse Bmbryo.，Cold Spring Harbor La baratory Press，1988、Pinkert，et al.,Transgenic animal,technology.,Acad emic press，Inc.1994)に記載されているマイクロインジェクション法を、ブタ 受精卵に適用した。即ち、培養液中で受精卵を保持用ガラスピペットで固定後、 微小ガラスピペットを用いて導入用遺伝子断片の溶液２ｐｌを雄性前核に注入し た。

２種類の遺伝子導入用断片を含む溶液は、これらの導入用断片をＴＥ緩衝液（ 0.25mM EDTA、5mM Tris(pH7.4))に懸濁して、それぞれ1.0 μｇ／ｍｌになるよ うに調製したものを用いた。

（２）遺伝子注入をした受精卵の移植 注入操作後、CO₂インキュベーター内にて、Ｍ２培地で２〜３時間培養後、受 精卵を発情している雌成熟豚の卵管へ移植した。移植は、全身麻酔下にて開腹後 、卵管内移植により行った。卵管移植後分娩満期まで飼育し、産仔を得た。

なお、遺伝子注入した受精卵は、速やかに移植されるのが好ましい。

（実施例５） 遺伝子導入ブタに於ける導入遺伝子の同定 分娩後約１週目に、得られた仔ブタの尾部の先端部分約１cmを切断採取した。

尾部の細胞より高分子ＤＮＡを抽出・精製した後、サザンブロッティング法及び フイルターハイブリダイゼイション法によって、導入した遺伝子断片がブタの染 色体に組み込まれているかを調べた。即ち、制限酵素BcoRIとBamHIで完全に消化 させた10μｇの高分子ＤＮＡを１％アガロースゲル電気泳動した後、ナイロンフ イルター(HybondN，Amersham)にＤＮＡを転写した。フイルターは風乾後、ＵＶ 照射を行いＤＮＡを固定させて、フイルターハイブリダイゼーションに供した。

なお、プローブとして、ｐＭＡＭ／ＦＴを制限酵素Cla ＩとNhe Ｉで完全に消化 させた断片をＦＴ用に用いた。

これらの結果を下記表１に示した。計１９回の実験で５５０個の受精卵に遺伝 子注入を行い、同数を１９頭のレシピエントに移植した。この結果７頭が妊娠し 、２７頭の仔ブタを分娩した。これらのうち、サザンプロッテイング法及びフイ ルターハイブリダイゼイション法によって、ＦＴに関して１頭が陽性であった。

なお、遺伝子導入していないコントロールブタ１５頭に対しても同様の検索を行 ったが、いずれも陰性であった。

（実施例６） 導入遺伝子の発現の確認 遺伝子導入が確認されている仔ブタの尾部の先端を約１cm切断し、また血液を 採取し、導入遺伝子発現の検出の試料とした。採取した尾部よりＡＧＰＣ法(Aci d Guanidinium Thiocyanate-Phenol-Chloroform Method)を用いて、全ＲＮＡを 分離した。次にこの全ＲＮＡを使ったＲＴ−ＰＣＲ法によって、ＦＴ遺伝子の発 現の解析を行った。

即ち、全ＲＮＡから逆転写酵素によってｃＤＮＡを合成し、前述のＦＴ遺伝子 抽出のために用いたプライマーを用いてＰＣＲ法を施行した。その結果、２７頭 中１頭が陽性と判定された。すなわち、導入したＦＴ遺伝子がｍＲＮＡに翻訳さ れ、ＦＴの酵素タンパク質を産生していることを確認した。なお、遺伝子導入し ていないコントロールブタ１５頭に対しても同様の検索を行ったが、いずれも陰 性であった。

（実施例７） 実施例６で陽性と判定された、即ちＦＴの蛋白質を産生していると考えられる 仔ブタから血液を採取し、遠心後、血球を分離し、蛍光抗体を使ったＦＩＴＣ法 でブタ血球を染色した。一方、コントロールブタ（遺伝子導入していないブタ） からも血液を採取し、同様に染色した。

即ち、一次抗体として抗Ｈ塁抗体を、２次抗体として蛍光色素がラベルしてあ るマウスγグロプリン（F(ab)₂）を用いた。この結果、実施例６の陽性の仔ブタ は陽性と判定された。一方、コントロールブタのそれは全て陰性だった。即ち、 導入されたＦＴがブタ細胞の中で正しく機能していることが確かめられた。

（実施例８） ブタの腎由来の細胞系ＰＫ１５にｐＭＡＭ／ＦＴを感染させたコロニーを選択 し、⁵¹Ｃｒを加えた培養液中にて、一定時間培養し、その後健康な成人ヒト血液 （Ａ，Ｂ，Ｏ、ＡＢの４つの血液型を含む）から採取した血漿を加えることによ り、⁵¹Ｃｒリリースアッセイを行った。

この結果、図９に示すように、２４時間経過の後、放出された⁵¹Ｃｒを測定し た。その結果、コントロールブタの血液はほぼ１００％細胞が破壊されたのが観 察されたが、ＦＴを導入したブタの細胞は２４時間経っても細胞破壊は１０％以 下しか観測されなかった。

このように、ブタ細胞にＦＴを導入することによりいわゆる血液型が転換され 、その結果ヒトのＯ型と同じＨ型物質が生成されることになり、ヒトが持つブタ に対する自然抗体と抗原抗体反応を形成しないか、あるいは抗原抗体反応を形成 しても低頻度であることが示された。

なお、この発明は、その本質的特性から逸脱することなく数多くの形式のもの として具体化することができるから、これらの実施態様はもっぱら説明上のもの で制約的なものではない。また、この発明の範囲は、請求の範囲以外の記載によ るものでなく、請求の範囲によって限定するものであるから、請求の範囲の要件 内のあらゆる変更、またはその要件に対する均等物は請求の範囲に包含されるも のである。

───────────────────────────────────────────────────── （注）この公表は、国際事務局（ＷＩＰＯ）により国際公開された公報を基に作 成したものである。 なおこの公表に係る日本語特許出願（日本語実用新案登録出願）の国際公開の 効果は、特許法第１８４条の１０第１項（実用新案法第４８条の１３第２項）に より生ずるものであり、本掲載とは関係ありません。

Claims (9)

【特許請求の範囲】
1. １．高等霊長類の糖転移酵素を発現させる外来遺伝子を有することを特徴とする 非霊長哺乳類の形質転換動物。
2. ２．高等霊長類の糖転移酵素を発現させる第１の外来遺伝子と、 非霊長哺乳類の糖転移酵素の発現を抑制する第２外来遺伝子、 とを有することを特徴とする非霊長哺乳類の形質転換動物。
3. ３．前記高等霊長類の糖転移酵素が、ＧＤＰ-L-フコース：β-D-ガラクトシド２ -α-L-フコシルトランスフェラーゼである請求項１に記載の動物。
4. ４．前記高等霊長類の糖転移酵素が、ＧＤＰ−L-フコース：β-D-ガラクトシド ２-α-L-フコシルトランスフェラーゼであり、 前記非霊長哺乳類の糖耘移酵素が、ＵＤＰガラクトース：β-D-ガラクトシル- 1,4-Ｎ-アセチル-D-グルコサミニド α-1,3-ガラクトシルトランスフェラーゼ である請求項２に記載の動物。
5. ５．餌記外来遺伝子が、ホモの状態で保持されていることを特徴とする請求項１ 又は３に記載の動物。
6. ６．前記第１の外来遺伝子と、前記第２の外来遺伝子がいずれもホモの状態で保 持されていることを特徴とする請求項２又は４に記載の動物。
7. ７．前記非霊長哺乳類の形質転換動物がブタである請求項１から６のいずれかに 記載の動物。
8. ８．請求項１から７のいずれかに記載の非霊長哺乳類の形質転換動物から得られ た高等霊長類への移植用材料。
9. ９．高等霊長類の糖転移酵素を発現させる第１の外来遺伝子及び／又は非霊長哺 乳類の糖転移酵素の発現を抑制する第２の外来遺伝子を非霊長哺乳類に導入する ことを特徴とする高等霊長類型の抗原型を発現した非霊長哺乳類の形質転換動物 の作出方法。