JPS6340858A - 炎症の検出とその新しい抗体 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野］ 本発明は免疫学に関するものであり、より詳しくは、体
液中のインターロイキン−１（“ＩＬ−１”）のレベル
の測定に抗体を用いることによる炎症の検出、および、
」二記測定を行うためのキットに関するものである。

［従来技術］ 多くの急性疾患および慢性疾患は、血管およびその隣接
器官の炎症を引き起こす。−上記疾患および異常は、病
原体の侵入、および、過敏症のような免疫系機能障害な
どの、多様な原因から生じる。過敏症は抗体媒介性免疫
反応、あるいは、細胞媒介性免疫反応、または、その双
方に由来するものである。抗体媒介性免疫反応の例とし
ては、枯堕熱、ぜんそく、じんましんなどのアナフィラ
キシ−反応（ａｎａｐｈｙｌａｘｉｓ　ｒｅａｃｔｉｏ
ｎｓ）がある。

他の免疫媒介性反応には、アルラス反応（Ａｒｔｈｕｓ
ｒｅａｃｔｉｏｎｓ）、および、多様な免疫複合病、例
えば、糸球体腎炎、ウィルス性肝炎、クリオグロプリン
血症、および気管支肺アスペルギルス症（ｂｒｏｎｅｈ
ｏｐｕｌｍｏｎａｒｙ　ａｓｐｅｒｇｉｌｌｏｓｉｓ）
が含まれるＯ細胞媒介性過敏症反応に関与する疾患の例
には、皮膚炎、薬剤感受症、および、甲状腺炎が劇まれ
る。

抗体媒介性反応および細胞媒介性反応の双方を含む、炎
症を引き起こす過敏症は、自己免疫反応から生じる自己
免疫病を含む。上記反応は、自己成分に対する免疫寛容
（ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ　ｔｏｌｅｒａｎｃｅ）
の欠陥を示し、自己抗原に対するレセプターを庁するＴ
細胞およびＢ細胞の“禁止クローン（ｆｏｒｂｉｄｄｅ
ｎ　ｃｌｏｎｅｓ）”の出現を引き起こす。自己免疫病
は、甲状腺（橋本甲状腺炎）、じんましん（交感性眼炎
（ｓｙｍｐａｔｈｅｔｉｃ　ｏｐｈｔｈａｌｍｉａ））
　、腎臓（グツド・パスツール症候群　（Ｇｏｏｄ　Ｐ
ａ５ｔｕｒｅ’ｓｓｙｎｄｒｏｍｅ）　）、赤血球（自
己免疫溶１ｆＩｌ　性貧血）　、肝臓〔第一胆管硬変症
（ｐｒｉｍａｒｙ　ｂｉｌａｒｙ　ｅｉｒｒｈｏｓｉｓ
））および、滑脱（ｓｙｎｏｖｉａｌ　［ｌｌｅｍｂｒ
ａｎｅｓ）　（リューマチ様関節炎（ｒｈｃｕｍａｔｏ
ｉｄ　ａｒｔｈｒｉｔｉｓ））を含む、はとんど全ての
身体部分に影響を及ぼす。

炎症は、局部的血管拡張を含む、患部血管およびその隣
接組織における、複雑な一連の細胞学的および組織学的
反応に関与しており、赤色化や発熱を誘発し、組織部分
への、血しょう、タンパク質、および、食細胞の流入を
可能にし、それによって隆起部が生じる。他の血管およ
び組織反応性酵素の部分的な放出あるいは活性化、およ
び、組織の圧迫の増大は、痛みの原因となる、部分的神
経終末を生じさせる。

正確な炎症試験は、上記の多数の免疫機能障害および他
の異常を引き起こす炎症の診断の可能性を増大させ、ま
た、疾患に対して選択された治療法の−ａ効件の追跡の
大きな助けになると思われるにもかかわらず、以前は、
炎症を正確に検出することが不可能であった。これは、
一つには、炎症の四つの主要な兆候、即ち、熱、赤色化
、腫れ、および、痛みの全てが常に存在するとは限らな
いことによる。さらに、患者による痛みの評価は、炎症
のＨ用な指標として用いるには、しばしば主観的過ぎる
。また、以前に炎症試験に用いられた診断法は、有効で
あると証明されてはいない。−１−記診断法には、接合
流動性の検出を行う多数の物理的診断法に加え、白血球
、プロスタグランジン（ｐｒｏｓｔａｇｌａｎｄｉｎｓ
）、および、自己反応性抗体の面中の水準の測定、血清
や血しょう中の急性過程タンパク質（ａｃｕｔｅ　ｐｈ
ａｓｅ　ｐｒｏｔｅｉｎ）の検出を含む０一般的に、上
記試験は、その非再現性、および、ある場合には、ある
疾患過程との決定的でない相関のために、有用性が制限
されてきた。炎症を引き起こす個々の疾患のために多様
な特異的試験が発達してきたが、しかしながら、１−記
試験は、炎症が他の疾患による場合は酊効ではない。さ
らに、プロスタグランジンは、主に、多くの宿主免疫お
よび代謝機能に関与している。プロスタクランジンは、
コロニー刺激因子生成における負のフィードバック効果
による血液細胞生成の“ダウンレギュレーション（ｄｏ
ｖｎ−ｒｅｇｕ　ｌ　ａｔ　ｔｏｎ）″と密接に関係し
ている。このように、元来プロスタグランジンは、多様
な代謝機能を調節しているので、該分子のレベルの上昇
を測定することは、炎症反応の正確な指標にはなり寿な
いであろう。出願人らは、モノカインＩＬ−１がしばし
ば炎症の初期指示物質であり、いくつかの経路で炎症反
応生成に中心的に関与していることを見いだした。例え
ば、ＩＬ−１は、直接的に発熱源となり得、急性過程タ
ンパク質合成を開始させることが可能であり、軟骨分解
と同様に、直接に骨の脱鉱化作用さえ行うことが出来る
。さらに、炎症の期間中には、体液中でＩＬ−ルベルの
上昇が認められる。例えば、ＩＬ−ルベルの上昇は、多
様な関節炎状態の患者から得られるリューマチ性滑液で
みられる。

体液中のＩＬ−ルベルの平常時を越える程度が、存在す
る炎症の程度の指標となり得る。

［発明が解決しようとする問題点コ 単純な溶液中におけるＩＬ−１のレベルを決定するアッ
セイ法は存在する。出願人および共同研究者によって開
発された、上記アッセイの一つに、ＩＬ−１試料による
ＣＤ−１マウス山来胸腺細胞の増殖誘導能力を測定する
ものがある。クロンハイム（Ｋｒｏｎｈｅｉｍ）他、Ｊ
、　Ｅｘｐ、　Ｍａｄ。

１６１　：　４９０　−５０２　（１９８５）。別のア
ッセイ（“コミトジエネシスアツセイ（ｅｏｉｉｔｏｇ
ｅｎｃｓｆｓ　ａｓｓａｙ）　”と呼ぶ）では、ＩＬ−
１およびフィトヘマグルチニン（ｐｈｙｔｏｈｃｍａｇ
ｇｌｕｔｌｎｉｎ）の準細胞分裂誘起的投与に対応する
マウス胸腺細胞の増殖を測定する。

マイゼル（Ｍｉｚｃｌ）他、Ｊ、　１ｍｍｕｎｏ１．　
Ｌ２０　（５）　：１４！１１７　（１９７３）。第三
のアッセイは、出願人らが開発したものであるが、イン
ター口・イキンー２（“ＩＬ−２″）非産生マウス上要
細胞系ＬＢＲＭ−３３−ＩＡ５を、ＩＬ−２を産生ずる
ように転換し、ＩＬ−２依存性連続Ｔ　ＩＪンバ細胞系
（ＣＴＬＬ−２）におけるマイトジエネシスを刺激する
ＩＬ−１の能力を利用するものである。全ての上記アッ
セイの限界は、それらがＩＬ−１の生物活性を基礎にし
ていることである。そのため、上記試験は、研究所・診
療所間で標準化することがほとんど不可能である。さら
に、！Ｌ−１機能の生物学的評価によるため、上記アッ
セイは、血清、血しょう、尿などに存在する他の生物媒
介物質によって、重度の阻害を非常に受けやすく、従っ
て、上記の様な患者体液中のＩＬ−１の存在を追跡する
場合には不正確である。一方、本発明のイムノアッセイ
は、新しいモノクローナル抗体を含む、抗体を使用し、
ＩＬ−１によって引き起こされる時間的に後の効果を追
跡するのではなく、ＩＬ−１の物理的存在を特異的に検
出するものであり、そのため、患者体液試料中の、同定
された、あるいは、同定されていない他の媒介物質の存
在によって影響を受けない。

［問題点を解決するための手段および発明の効果］本発
明によると、非生物学的アッセイにより、例えば血清の
ような、体液中のＩＬ−１の物理的存在および水準を追
跡することによって、正確、迅速かつ簡便に、炎症を検
出および定量する。前述のように、多くの感染症および
免疫機能障害は炎症の原因となるため、体液仲のＩＬ−
１の水準を測定することは、上記状態の診断に使用でき
、また、疾患に対して選択される治療法の有効性を選択
および追跡に使用することが可能である。

体液中のＩＬ−１の水準を測定することは、末梢関節の
対称性炎症が特徴である、リューマチ性関節炎の診断に
特に自゛効である。さらに、ＩＬ−１は、リューマチ性
関節炎による肯の脱鉱化作用および軟骨分解の媒介物質
である。６００万人以」−のアメリカ人が、リューマチ
性関節炎に冒されている点で、上記状態の診断試験とし
ての本発明の使用は実質的に−ａ用である。

炎症を検出するための、体液中のＩＬ−１の測定は、前
述の、以前の炎症検出法よりも有効である。例えば、出
願人らは、体液中のＩＬ−１水準が、炎症初期過程に」
二重することを見いだし、そのため、本発明は他の検出
法よりもすい時期に炎症の検出が可能である。これは、
炎症の検出にプロスタグランジンの水準を使用する試み
に比較して、特に当てはまる。前述のように、ＩＬ−１
の機能の一つは、プロスタグランジン合成の誘導であり
、従って、ＩＬ−１の測定は、」二足目的で血中のプロ
スタグランジン水準を測定する場合に可能な時期よりも
１ｆ（い炎症発達過程で、炎症の検出が行える。

本発明によれば、以下に示すように、本発明のアッセイ
に使用するために、新しいポリクローナル抗体およびモ
ノクローナル抗体が作成された。

ＩＬ−１は、ＩＬ−１αおよびＩＬ−１βで示される、
少なくとも二種類の異なる成分から描成されていること
は、出願人らおよび共同研究者により、以前に発見され
ており、マーチ（Ｍａｒｃｈ）他、Ｎａｔｕｒｅ　（Ｌ
ｏｎｄｏｎ）　　３１５　：　６４１　（１９８５）を
参考として挙げる。

まだ、完全に解明されてはいないが、炎症初期段階にお
いて、体液中で両方の成分の水準が上昇すると、考えら
れている。以−にのように、本発明は、ＩＬ−１の」二
足双方の種のアッセイに使用する、新しい抗体を含む。

ポリクローナル抗体は、ウサギ、げっ歯類動物や、他の
動物を、ＩＬ−１あるいはＩＬ−１ペプチドで免疫し、
同動物の血清から抗体を精製することにより得られる。

新しいモノクローナル抗体は、ＩＬ−１分子あるいはペ
プチドを、宿主動物に注入し、免疫した動物体由来のリ
ンパ球を腫瘍細胞と融合させ、ＩＬ−１分子に特異的に
結合する新しいモノクローナル抗体を発現可能なハイブ
リドーマを作成することにより調製した。

本発明の、別の側面では、体液中のＩＬ−１の物理的存
在および水準を、ＩＬ−１分子上に存在する単独の抗原
決定基に特異的な一つ以−ヒの新しい抗体を使用する多
様なイムノアッセイ法によって測定する。イムノアッセ
イでは、ＩＬ−１と、それに特異的な抗体との反応性は
、例えば、蛍光標識、放射性標識あるいは酵素標識によ
って、ＩＬ−１抗体複合体の形成を検出することにより
決定する。上記複合体が形成される程度は、試料中に存
在するＩＬ−１量の指標となり、また、疾患によって生
じる炎症の状態および水準に関連している。

本発明のより詳しい局面では、体液試料を、■Ｌ−１分
子に単独に特徴的な第一抗体部位に特異的な本発明の新
しい第一抗体と反応させ、次に、第一抗体あるいは第一
抗体に対する特異的結合分子のいずれかに結合した標識
によって生成されるシグナルを測定することによって抗
体複合体の形成を測定することにより、炎症状態を直接
検出する。イムノアッセイはまた、体液試料を、ＩＬ−
１に特徴的な第一抗原部位に特異的な、本発明の新しい
第一抗体と接触させる、二重決定アッセイを含む。」−
記のように形成された第一抗体−ＩＬ−１複合体を、第
一抗ＩＬ−１抗体反応性の抗原部位とは異なるＩＬ−１
分子」−の単独の第二抗原部位に対して誘導した本発明
の新しい第二抗ＩＬ−１抗体と接触させる。非結合成分
の分離後、第一抗体に“トラップされた（ｔｒａｐｐｅ
ｄ）“　ＩＬ−１量を決定するために、第二抗体−ＩＬ
−１複合体を測定する。上記反応性は、第二抗体あるい
は第二抗体に対する特異的結合分子に結合した標識によ
って生成されるシグナルを測定することにより決定する
。

本発明のさらに別の局面では、ＩＬ−１アツセイは、反
応物質が、体液試料、一定量の本発明の新しい抗ＩＬ−
１抗体、および、一定量の標識ＩＬ−１抗体を含む、競
合アッセイの形式を取ることも可能である。試料中に存
在するＩＬ−１、および、標識ＩＬ−１のいずれも、反
応時に存在するそれらの相対量に比例して、ＩＬ−１抗
体と特異的に結合することが可能である。反応によって
結合した成分と、結合していない成分とを分離した後、
結合成分あるいは非結合成分中の、あるいは双方に存在
する標識によって生成される検出可能なシグナルの水準
を測定する。上記アッセイの複合体成分によって生成さ
れるシグナル水準は、測定される試料中に存在するＩＬ
−１量に反比例する。

本発明のさらに異なる局面では、本発明のアッセイ法を
行うための診断用キットを含む。上記キットは、ＩＬ−
１分子上に存在する単独の抗１皇部位に対して誘導され
た、抗体を含む。−り記キットは、例えば、標識と本発
明の新しい抗ＩＬ−１抗体分子との複合体、あるいは、
標識と、新しい抗ＩＬ−１抗体分子に対する特異的結合
物質との複合体からなる、シグナル生成系をさらにＳむ
。

−ト記標識は、蛍光団、発色団、放射性同位体、色素生
成酵素、および、常磁性金属を含む。特異的結合分子は
、抗ＩＬ−１抗体分子に対して反応性のポリクローナル
、あるいは、モノクローナル抗体、あるいは、抗体分子
自体に不可逆的に結合可能なあらゆる分子を含む。

本発明によれば、ＩＬ−１分子上の独立の抗原決定部位
に対する一つ以上の特異的抗体を用いて体液中のＩＬ−
１水準を測定することにより、疾患による炎症の存在を
検出することが出来る。上記抗原部位は、ＩＬ−１分子
に特異的であり、従って、他の分子あるいは細胞から、
ＩＬ−１を区別する。“炎症”という語は、傷害、ある
いは、物理的、化学的、あるいは生物学的作用物質によ
って引き起こされる異常刺激に対して、動物体の患部血
管および隣接器官で生じる、細胞学的および組織学的反
応を言う。上記反応は、局部的なものであり、形態学的
変化、有害物質の破壊あるいは除去、および、患部組織
の治療、回復の原因となる。しかしながら、慢性的な炎
症は、持続性感染あるいは病状の進行に、しばしば関係
している。

本発明の炎症検出法では、液体試料を、ＩＬ−１に特異
的に反応する新しい抗体と接触もしくは反応させ、次に
、試料と抗体間の反応性のＧ無を、望ましくは、イムノ
アッセイ法によって確定する。使用可能な多様なイムノ
アッセイ法のうち、ＩＬ−１と新しい抗体との反応性は
、例えば、蛍光法、放射性同位体法、あるいは、酵素法
によって、ＩＬ−１抗体複合体の形成を＃Ｉｌす定する
ことにより、決定する。上記複合体が形成される程度は
、試料中に存在するＩＬ−１水準の指標となり、従って
、疾患による炎症の状態および程度を示すものである。

抗　　体 本発明においては、体液試料中のＩＬ−１の存在を検出
するアッセイに使用するために、ＩＬ−１に対する新し
い抗体を単離した。また、検出可能なマーカーで標識し
た抗体は、ＩＬ−１と結合した抗ＩＬ−１抗体を同定す
るために使用した。

本発明の抗ＩＬ−１アッセイに使用する抗体の望ましい
型は、モノクローナル抗体であるが、ポリクローナル抗
体も、上記目的のために、また、抗ＩＬ−１抗体に対す
る標識第二抗体としても使用可能である。ポリクローナ
ル抗体は、ＩＬ−１αおよびＩＬ−１βに対して、ＩＬ
−１の対応する種の生成した天然ＩＬ−１および（ある
いは）組換えＩＬ−１でウサギやモルモットのような動
物を免疫することにより作成した。局所的炎症の誘導に
より抗体産生を促進するために、注射するＩＬ−１は、
完全あるいは不完全フロイント捕助ｉ？ＩＩ（１″ｒｃ
ｕｎｄ’ｓ　ａｄｊｕｖａｎｔ）の様な補助剤と混合す
るのがよい。ｒＬ−１に対する抗体のｉｎ　ｖｌｖｏで
の産生を誘導するために、−回以上の免疫を、定量的に
、様々な量で行うことが望ましい。また、ｆＬ−１の全
量を動物体の特定部分に一度に注入するよりも、谷々の
場合に、動物体の異なる部位に、複数の注入を皮下的お
よび（あるいは）皮肉的に行うことが望ましい。潜伏期
間中に、動物体の採血をし、血清試料の抗ＩＬ−１反応
を、酵素結合性免疫溶剤アッセイ（ｅｎｚｙｍｅ−１ｉ
ｎｋｃｄｌｗＩＩｕｎｏａｂｓｏｒｂｅｎｔ　ａｓｓａ
ｙ、　　’ＣＬＩＳＡ　’　）などの適当なアッセイ法
により検査する。エングバル（Ｃｎｇｖａｌｌ）および
パールマン（Ｐｃｒｌｇａｎ）、ｌ５ｓｕｎｏｅｈｅｓ
　８　：　８７１−８７４　（１９７１）。血清力価が
、ｒＬ−１に対して十分に高い反応性を示した場合は、
動物体の採血を行い、血清を直接ポリクローナル抗体源
として使用する。もしくは、Ａタンパク質アフィニティ
クロマトグラフィーあるいは、ＩＬ−１あるいはＩＬ−
１ペプチドを固定したカラムを用いたアフィニティ精製
等の標顯的方法で、抗体を血清から精製することが出来
る。精製されたイムノグロブリン（ＩｇＧ）画分は、あ
るいは、本発明のアッセイ法のための抗体源として使用
可能である。前述のように、ＩＬ−１に対するモノクロ
ーナル抗体は、体液中のＩＬ−１のアッセイに特にＧ用
である。

抗ＩＬ−１モノクローナル抗体は、ＩＬ−１分子上の単
一の抗原決定基と反応し、無制限に生産可能であり、そ
のため、ポリクローナル抗体の異種反応性や個別の特異
性の問題を除去することが出来る点で、ポリクローナル
抗体よりも有用である。しかしながら、ＩＬ−１に対す
るモノクローナル抗体を単離することは、研究者にとっ
て、困難であった。その理由の一つは、ＩＬ−１水準の
上昇は、マウスに対して′Ｇ害なことである。従って、
ＩＬ−１に対する抗体を産生させるためにマウスに導入
するＩＬ−１ｆｆｉは、低水準に抑えなければならず、
そのため、ＩＬ−１に対する抗体を産生ずる可能性を減
少させる。さらに、ｒＬ−１は著しく発熱性であるため
、ＩＬ−１がマウスに全身的に侵入すると、しばしば高
熱を引き起こし、そのため、動物体が免疫抑制となり、
それによって、体液性抗体媒介免疫応答を増大させる可
能性を低減させる。それにも関わらず、出願人らは、Ｉ
Ｌ−１の二つの種、ＩＬ−１αおよびＩＬ−１βの双方
に対する多数の新しいモノクローナル抗体を生成するこ
とが出来た。

本発明の新しい抗ＩＬ−１モノクローナル抗体を産生ず
るための実施例においては、生成した天然のｒＬ−１お
よび組換えＩＬ−１の双方をマウスのような動物体を免
疫するのに使用した。数回の免疫感作を定期的な間隔を
置いて行うことが望ましい。ポリクローナル抗体を調製
する方法と同様に、モノクローナル抗体産生を促進する
ために、注射に先立ち、ＩＬ−１を７０インド補助剤な
どの、補助剤で乳化することが望ましい。また、谷々の
場合に、動物体に複数の注射を行うことが望ましい。免
疫感作間間中に、以下に詳述する、ＥＬＩＳＡなどの方
法で、動物体の血清試料の抗ＩＬ−１応答を測定する。

陽性を示した動物体から、肺臓を回収する。肺臓細胞由
来の単一細胞懸濁液は、抗体産生細胞数を増やすために
、多数の添加物を加えた組織培養培地中で培養する。

ＩＬ−１と反応性の免疫グロブリン分子の基本的な塩基
配列をコードする染色体を有する肺臓細胞は、マウスあ
るいはヒトなどに出来する、骨髄腫細胞あるいはリンフ
オーマ（ｌｙｍｐｈｏＩＩａ）細胞と融合させることに
より不死化し、ハイブリドーマを形成させる。融合過程
を促進するために、多数の融合試薬が使用される。上記
融合試薬には、ポリエチレングリコール（”ＰＥＧ”）
　１５００などの、異なる型のエチレン酸化物縮合重合
体水溶ｉｔＭを含む。池の使用可能な融合試薬としては
、センダイウィルスなどの、形質転換されたデオキシリ
ボヌクレオチド（”ＤＮＡ“）ウィルスや、それから得
られた融合タンパク質を含む。最適条件で融合を行うた
めには、融合試薬の量および濃度を凋節しなければなら
ない。例えば、Ｉ）ＥＧ　１５００を使用する場合には
、同試薬は、およそ４０％（ｗｔ／ｖｏＮ　）含まれる
べきである。しかし、ＰＥＧ　１５００の体積は、０６
５から３ミリリットル（ｍｌ）の範囲にあり、［’ｌＥ
Ｇ　１５００の濃度は、培地の３５％から６０％（ｗｔ
／ｖｏＪ２　）の範囲であればよい。

融合したハイブリドーマを含む、得られた細胞は、多数
の添加物、および、選択された抑制試薬を含む組織培養
培地で増殖させ、融合していない骨髄肝細胞、二重骨髄
腫ハイブリッド、融合していない肝臓細胞、および、二
重肝臓細胞ノ＼イブリッドの増殖を不可能にし、それに
よって、抗ＩＬ−１抗体を産生ずるモノクローナル細胞
を遊離させる。上記インヒビターあるいは抑制物質とし
ては、ヒポキサンチン、アミノプテリン、及び、チミジ
ン（以降、まとめて“ＨＡＴ”と呼ぶ）を含む。本方式
によって生成されたハイブリドーマ細胞は、ＥＬＩＳＡ
アッセイなどで、抗ＩＬ−１抗体応答に関してスクリー
ニングを行う。陽性を示したハイブリッド細胞を回収し
、米国特許第４．４１１，９３３号に詳述され、ここに
参考として含める、制限希釈法によってクローン化及び
サブクローン化する。制限希ＩＲ法では、抗ＩＬ−１抗
体産生ハイブリッド細胞を個々に、ＨＡ　Ｔを含む培地
中でｉｎ　ＶｉｔｒＯで培養する。ハイブリッド♀（１
胞か増殖したクローニング培ｒｉ：液は、ＩＬ−１に対
する反応性でスクリーニングを行う。陽性を示すクロー
ン化されたハイブリドーマを回収し、次に、大量産生の
ために、より大きな体積で、ｉｎ　ＶｉｔｒＯで培養す
る。もしくは、クローン化された／’％イブリドーマ細
胞を、適当なは乳動物宿主の腹腔に注射し、その後、高
濃度の抗ＩＬ−１抗体を含む腹腔的腹水を回収すること
により、ｉｎ　ｖｉｖｏで抗ＩＬ−１抗体を増やすこと
も可能である。腹水中に含まれる抗体は、硫酸アンモニ
ウム沈澱分画に続いて、ゲルカラムクロマトグラフィー
を行うなどの、既知の方法により、単離、濃縮すること
が出来る。必要であれば、−１−記抗体は、イオン交換
クロマトグラフィー、および（或は）、スタフィロコッ
カス・アウレウス（５ｔａｐｈｙ　Ｉｏｅｏｃｃｕｓａ
ｕｒｃｕｓ）由来のＡタンパク質に結合する、抗体の性
質を利用したアフィニティクロマトグラフィー、および
（あるいは）、ＩＬ−１あるいはＩＬ−１ペプチドを固
定したカラムでのアフイニテイクロマトグラフィーによ
ってさらに精製が可能である。

−１−記方法により、本発明のイムノアッセイ法で前動
な新しいモノクローナル抗体が単離される。

これらの独立なモノクローナル抗体には二つの型があり
、第一の型は、ＩＬ−１αと特異的に反応１２、第二の
型は、ＩＬ−１βと特異的に反応する。

出願人らが単離した、ＩＬ−１αと特異的に反応する新
しいモノクローナル抗体の一つを、１５Ａ４と命名した
。１５Ａ４モノクロ一ナル抗体は、オフタロ二−免疫拡
散法（Ｏｕｃｈｔｅｒｌｏｎｙ　ｉｍｍｕｎｏｄｉｌ’
ｌ’ｕｓｉｏｎ）や、免疫電気泳動等の標準的方法によ
り、分類、解析が可能である。１５Ａ４モノクロ一ナル
抗体は、ＩｇＧ、クラスであり、ｒＬ−１αと特異的に
反応し、他のいかなるリンホカイン〔即ち、ＩＬ−２、
ＩＬ−１β、顆ｔ＋７球マクロファージコロニー刺激囚
子（ＧＭ−Ｃ８Ｆ）など〕とも結合せず、沈降反応も起
こさない。

出願人らが単離した、ＩＬ−１βに特異的に反応する新
しいモノクローナル抗体の一つを、７［３４と命名した
。７Ｂ４モノクロ一ナル抗体も、オフタロ二−免疫拡散
法や、免疫電気泳動等の標準的方法の使用により、分類
、解析を行うことが出来る。

７Ｂ４抗体は、ＩｇＧ１クラスであり、ＩＬ−１βと特
異的に反応し、池のいかなるリンホカイン（即ち、ＩＬ
−２、ＩＬ−１α、ＧＭ−Ｃ３Ｆなど）とも結合せず、
沈降反応も起こさない。

本発明の新しい抗体の特定の例は、ＩｇＧ抗体からなる
が、これは制限を与えるものではない。

上記抗体および同等の機能を−１するものは、マウス、
ヒＩ・を含むは乳類、あるいは池の動物、あるいは、そ
れらの他の組合せから得ることか出来る。

また、抗体は、ＩｇＧ以外のクラス、例えば、アイソタ
イプを含む、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＥも可能である。上
記の同定されたモノクローナル抗体と同等の機能を示す
、Ｆ　（ａｂ）　２フラグメントからなるもののような
、ハイブリッド抗体もまた、本発明の範囲に含まれる。

“機能的に同等”という語は、ＩＬ−１分子に特異的に
結合でき、−に記分子に結合する際に、他の抗体や、機
能的同等物質と競合できるような、抗体、アイソタイプ
、抗体フラグメント、抗体ハイブリッド、及び、タンパ
ク質産物をＳむ。言い替えれば、機能的同等物質は、Ｉ
Ｌ−１やそのフラグメントを含む試料と混合した場合に
、ＩＬ−１あるいはそのフラグメントに結合し、他の抗
体あるいは機能的同等物質が、ＩＬ−１に結合すること
を妨げるものである。

抗ＩＬ−１抗体を生成するのに使用するＩＬ−１は、天
然のもの、及び、組換え体のいずれも可能である。天然
ＩＬ−１は、ρ１１えば、クロンハイム（Ｋｒｏｎｈｃ
ｉｍ）他、Ｊ、　ＩＥｘｐ、　Ｍａｄ、、前述、に示さ
れ、ここに参考として含める方法によって、産生じ、精
製する。前述のように、出願人らと共同研究者らは、Ｉ
Ｌ−１αおよびＩＬ〜１βと呼ばれる、ＩＬ−１の二つ
の種を既に同定している。組換えＩＬ−１αおよびＩＬ
−１βの産生法は、マーチ（Ｍａｒｃｈ）他、Ｎａｔｕ
ｒｅ、前座、に示されている。

天然あるいは組換えＩＬ−１分子全体で、動物体を免疫
感作するのではなく、同分子の一部からなるペプチドを
使用することも可能である。」−記ペブチドの使用は、
ＩＬ−１分子上の特定の抗原決定部位に対して誘導され
るモノクローナル抗体の生成を促進しうる。

アッセイ法実施例 本発明の新しい抗ＩＬ−１抗体を一種類以上使用して、
体液中に物理的に存在するＩＬ−１水準を７１１１定す
るために、多様なイムノアッセイ法を用いることが出来
る。以下に示すのは、上記イムノアッセイ法の、実施例
であるが、制限的なものではない。第一の、“直接”法
は、ＩＬ−１を＾むと思われる液体試料を、検出可能な
マーカーあるいは標識とＩＬ−１分子上の抗原部位に特
異的な本発明の新しい抗体との混合物と反応させ、抗原
（ＩＬ−１）　　−抗体複合体を形成させるものである
。試料中に含まれるＩＬ−１量は、以下により詳しく述
べるように、使用した標識の種類に応じた標準的なシグ
ナル検出法により、ＩＬ−１に対する抗体の反応性の程
度を測定することにより決定できる。一般的には、ＩＬ
−１−抗体複合体を、結合していないアッセイ成分と分
離し、複合体を定性的及び（あるいは）定量的に分析す
る。

第一の直接アッセイ法の応用として、マーカーを直接抗
ＩＬ−１抗体に結合させる代わりに、マーカーを新しい
抗ＩＬ−１抗体の適当な特異的結合分子に結合させるこ
とも可能である。結合分子は、抗ＩＬ−１抗体、あるい
は、抗ＩＬ−１抗体に特異的な抗イムノグロブリン上の
単独の抗原決定部位に対して誘導したモノクローナルあ
るいはポリクローナル抗体がよい。本アッセイ法では、
第二抗体は、より標識に結合しやすいものが−ａ効であ
る。また、第二抗体の使用により、マーカーの抗ＩＬ−
１抗体に対する結合が抗ＩＬ−１抗体の親和性に悪影響
を及ぼす可能性が除かれる。さらに、第二抗体はポリク
ローナル的でよく、一般的にモノクローナル抗体よりも
精製が簡単である。

さらに、抗ＩＬ−１抗体に対して誘導された第二抗体を
使用することにより、より大きな複合体ができ、アッセ
イの非結合成分からより容易に分離できる。

液体試料中のＩＬ−１の存在および量は、また、“競合
的“イムノアッセイによっても分析可能である。この型
のアッセイでは、既知量の本発明の新しい抗ＩＬ−１抗
体と、既知量の標識したＩＬ−１とを、アッセイする試
料と共にインキュベートする。抗体は、標識ＩＬ−１と
非標識ＩＬ−１とを区別しないので、その相対量に比例
して、標識ＩＬ−１および非標識ＩＩ、−１に結合する
。その後、本アッセイの結合成分、即ち、ＩＬ−１−抗
体および標識ＩＬ−１−抗体複合体を、遊離成分あるい
は非反応成分から分離し、以下に示す標準的方法によっ
て結合量を測定する。

この型の競合的アッセイ系では、抗ＩＬ−１抗体の特異
的濃度を用いる。ＩＬ−１抗体の希釈は、抗体が標識抗
原のおよそ５０％に結合するように選択することが望ま
しい。その結果、上記成分の、結合−遊離比が、およそ
１：１となる。しかしながら、本発明の範囲および本質
を離れることなく、他の抗ＩＬ−１抗体希釈法を選択し
得ることは、理解されるべきである。

」二足の競合的アッセイでは、任意の試料のアッセイに
先立ち、様々な量の非標識ＩＬ−１を固定量の標識ＩＬ
−１および固定量の新しい抗ＩＬ−１抗体と共にインキ
ュベ−１・する。次に、標識ＩＬ−１が抗ＩＬ−１抗体
と結合する程度を、各既知量の非標識ＩＬ−１を含む試
料について測定する。上記δ１り定の結果から、ある量
の非標識ＩＬ−１存在下での標識ＩＬ−１とその抗体と
の結合程度を示す、標準曲線を描くことが出来る。

次に、未知量の非標識ＩＬ−１を含む任意の試料をアッ
セイする場合には、試料中の非標識ＩＬ−１濃度は、標
識ＩＬ−１が抗ＩＬ−１抗体に結合する程度を測定した
標準曲線から決定する。

本発明は、また、体液中のＩＬ−１水準を測定する“二
重決定“イムノアッセイに、出願人らが単離した新しい
抗体を用いることをも意図する。

この型のアッセイでは、ＩＬ−１分子上の単独の認識部
位に反応性の新しい第一抗体を、試験を行う試料と接触
させる。ＩＬ−１が試料中に存在していれば、ＩＬ−１
は第一抗体分子に特異的に結合する。非結合ＩＬ−１を
、例えば洗浄などて、結合ＩＬ−１から分離した後、第
一抗体ＩＬ−１複合体を、“トラップされた″　ＩＬ−
１分子の別の認識部位と反応性の第二抗体と接触させ、
第二抗体を用量依存的に結合ＩＬ−１と結合させる。

二重決定アッセイでは、二種類の抗ＩＬ−１抗体が、Ｉ
Ｌ−１分子」二の関連のないエピトープに結合し、それ
によって、ＩＬ−１分子に二つの抗体が結合することに
よる立体構造的影響が防止されることが重要であること
は、理解されるであろう。

第二抗体は、以下により詳しく述べるように、標準的方
法によって、第二抗体のＩＬ−１に対する結合の程度を
測定できるように標識を施してよい。第二抗体を直接標
識するよりも、マーカーに結合した、第二抗体への結合
分子を使用してもよい。結合分子は、第二抗体に特異的
な二次抗体が使用できる。前述のように、抗ＩＬ−１抗
体の標識の必要性を避けることにより、標識が抗体の親
和性を変化させる可能性を排除する。さらに、二次抗体
として使用する抗体は、標識の容易さ、結合抗体の生成
の能率、および、非結合抗体からの結合抗体の分離の容
易さなどの望ましい性質に基づいて選択する。二重決定
アッセイにおいては、′Ｉ　Ｌ　−１分子を“トラップ
“するのに新しい第一抗体を用い、次に、同分子を検出
するために新しい第二抗体を使用し、非常に感度の高い
イムノアッセイとなることが理解されるであろう。

上記のように、様々な型のイムノアッセイを述べたが、
他の型のイムノアッセイと同様に、上記アッセイの多く
の応用も使用できることは理解されるであろう。例えば
、標識ＩＬ−１あるいは非標識ＩＬ−１は、抗体が反応
できる適当に標識したＩＬ−１特異的ペプチドと置き換
えることが出来る。

本発明では、上記イムノアッセイに際して、多様な型の
不溶性分離基質あるいは支持体を使用することが予測さ
れる。例えば、競合的アッセイでは、抗ＩＬ−１抗体は
、共有結合的あるいは非共有結合的に、適当な支持体に
結合させる。二重決定アッセイで用いる抗ＩＬ−１抗体
も同様である。

支持体は、プラスチックあるいはガラスの微量タイター
プレートウェル、あるいは、アッセイが行える他の反応
容器を含む。もしくは、支持体は、ＩＬ−１を含む液体
試料中に浸すか、置くことの出来る、プラスチック、セ
ルロース、あるいはグラスファイバーの円盤、板、小片
状の形態が可能である。プラスチック支持体は、ポリビ
ニル、ポリアクリルアミド、ポリスチレン、アクリルア
ミド、ポリプロピレン、あるいは、ポリカーボネート等
の、多様な組成が可能である。紙状支持体は、ニトロセ
ルロース、酢酸セルロース、あるいは、ＡＢＭ紙などが
可能である。また、支持体は、反応容器中に含まれる、
メツシュ状物質や、球状等のビーズのような、様々な形
態の基質も可能である。ビーズを用いる場合は、アガロ
ース、前述のプラスチックの一種、ガラス、セルロース
、デキストラン、あるいは、セファロースなどから作成
することが出来る。本分野では知られているように、抗
体を共Ｕ結合的に固体支持体に結合させるために、多様
な活性化物質を使用できる。そのような活性化試薬は、
例えば、ブロモシアンＣＣＮＢｒ　）　、カルポジイミ
ド、グルタルアルデヒド、ポリエチレングリコール、お
よび、タンニン酸等を含む。

本発明のアッセイは、穏やかなｐＨおよび温度下のｉｌ
に体温媒中で行うことが望ましい。溶媒は、水溶性で酊
ればよいが、３％アルブミン（ヒツジ、ウシ、ヒト）を
含む０．１モル（Ｍ）トリス緩衝化生理食塩水の様な、
緩衝塩溶液で有ることが望ましい。溶媒のｐｌｌは、５
−１０の範囲が望ましく、およそ６−９がより望ましく
、約７．２が理想的である。ｐＨは、ＩＬ−１と抗体と
の特異的結合は促進するが、抗体に結合したマーカーに
よって生成されるシグナルに対して、あらゆるＵ意な負
の効果を及ぼさないように選択する。望みのｐＨを達成
し、維持するためには、アッセイ朋間中に多数の緩衝液
を使用する。適当な緩衝液の例としては、Ｎ−２−ヒド
ロキシ−エチルピペラジン−Ｎ−２−エタン−スルホン
酸（“ＨＥＰＥＳ“）、トリス、ホウ酸、リン酸、カル
ボン酸、および、バルビツールなどを含む。

前述のように、本アッセイは、−回以」二のインキュベ
ーション過程を含む。例えば、二重決定アッセイ法では
、対象となる試料は、まず、不溶性支持体と結合した第
一抗ＩＬ−１抗体とともにインキュベートする。その後
、第二の過程として、第一抗ＩＬ−１複合体を第二抗Ｉ
Ｌ−１抗体とともにインキュベートする。インキュベ−
１・期間の長さ、およびインキュベート温度は、ＩＬ−
１の抗体に対する結合速度、および、使用する標識に著
しく依存する。インキュベーション期間は、数分から数
時間にわたり、典型的には５分から２４時間である。イ
ンキュベーション温度は、一般的に、およそ１６Ｃから
３２℃であり、理想的にはおよそ４℃である。

本発明では、抗ＩＬ−１抗体自体あるいは、独立した、
抗ＩＬ−１抗体に対して誘導された第二抗体は、試料中
のＩＬ−１の存在に関連したシグナルを生成する、検出
可能なマーカーと結合している。検出可能なマーカーは
、本分野で知られているフルオロフォア、染色剤、酵素
、発色剤、補酵素、化学発光物質、酵素阻害剤、ガドリ
ニウムなどの常磁性体、フェリチン、および、放射性核
種から選択することが出来る。使用可能な特定の酵素の
例としては、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホ
スファターゼ、およびＢ−ガラクトシダーゼなどが含ま
れるが、制限的なものではない。

染色剤の、制限的でない例としては、アミノブラック、
およびエオシンが倉まれる。蛍光物質の、制限的でない
例としては、フルオレセイン、イソチオシアネート、ダ
ンシル、ヨウ素プロビジウム（ｐｒｏｐｉｄｉｕｍ　１
ｏｄｉｎｅ＞、およびフィコエリトリンのようなフィコ
フォアがＡまれる。

検出可能なマーカーとしては、放射性同位体も用いるこ
とが出来る。抗体標識に使用される技術は、用いる放射
性同位体の種類によって異なる。

例えば、標識は、抗体分子のあるぶ子を、対応する放射
性同位体で置換することにより行われる。

具体的な例として、水素原子は、トリチウム（３Ｈ）で
置換され；炭素原子は、炭素−１４（１４Ｃ）、ストロ
ンチウム原子は、ストロンチウム−３８（３８Ｓｒ）で
置換される。別の標識法では、抗体の原子を放射性同位
体で置き換えるのではなく、抗体分子に同位体を加える
。通常使用される」１記放射性同位体は、例えば、ヨウ
素−１２５（１２５■）、および、鉄−５９（５９Ｆｃ
　）をＳむ。

使用される各々のマーカーあるいは標識は、使用される
イムノアッセイの個々の種類、および、標識される抗Ｉ
Ｌ−１抗体あるいは第二抗体の生物学的および生化学的
性質などの、様々な要因に依存することは、理解される
であろう。用いるマーカーの種類が何であろうと、勿論
、標識抗体とその特異的認識部位との間の特異的に顕著
な変化を生じさせるものであってはならない。

本発明のアッセイの各々のインキュベーション後、アッ
セイの複合成分、あるいは、結合成分は、一般的に、非
結合成分、非複合ＩＬ−１、過剰抗ＩＬ−１抗体および
二次抗体から分離する。その方法は、例えば、生理食塩
水のみ、あるいは、遠心分離と組み合わせた、単純な洗
浄を含む。分離は、限外ろ過、透析、あるいは、塩）Ｊ
７を含む。他の分離方法としては、クロマトグラフィー
、電気泳動、クロマト電気泳動、およびゲルろ過などの
、生化学的な移動度の差異を基にしたものがある。

使用される分離方法の個々の型は、用いられる谷々のイ
ムノアッセイ法、および、アッセイ試薬の特性に依存す
る。

診断用キット 本発明は、また、炎症の存在を検出するための、前述の
ＩＬ−１アツセイを行う診断用キットを禽む。キットの
個々の成分は、使用する個々のイムノアッセイ法に対応
する。おそらくもっとも単純な態様においては、上記診
断用キットは、検出可能なシグナルを生成できる適当な
マーカーと結合している、ＩＬ−１に対して誘導された
本発明の新しいポリクローナル抗体あるいはモノクロー
ナル抗体を含む。アッセイを行うためには、試料を、抗
体−マーカー複合体と接触させる。その後、複合成分を
、アッセイの遊離成分から分離し、次に、マーカーによ
って生成されたシグナルを検出し、イムノアッセイ反応
の結合成分あるいは】分離成分のいずれかを定量する。

前述のように、アッセイ成分は、抗体が共Ｇ結合的ある
いは非共有結合的に結合した不溶性支持体、イムノアッ
セイ反応の望ましいｐＨを保つための緩衝液、および流
動体試料を希釈するための結合溶媒を含んでよい。また
、に記キットは、ＥＬ　Ｉ　ＳＡの適当な酵素試薬や、
検出可能なシグナルを増感させる試薬のような、シグナ
ルを生成するマーカーに必要とされる試薬も含んでよい
。

他の実際的で、しかも、制限的でない例においては、診
断用キットは、ＩＬ−１に対する新しいポリクローナル
あるいはモノクローナル抗体、および、抗ＩＬ−１抗体
に対する二次抗体を含んでよく、この二次抗体には検出
可能なシグナルを生成できる適当なマーカーが結合して
よい。上記アッセイキットの態様と同様に、本キットの
態様はまた、更に他の成分を含みつる。アッセイを行う
ために、試料を抗ＩＬ−１抗体と接触させ、次に、複合
成分を、遊離成分から分離する。その後、複合成分を、
ＩＬ−１に結合した抗ＩＬ−１抗体と特異的に結合する
標識二次抗体に接触させる。

非結合二次抗体をアッセイの複合成分から除いた後、ア
ッセイ反応の結合成分あるいは非結合成分のいずれかの
、標識によって生成されたシグナルを測定する。

本発明のさらに例示的な態様として、上記診断用キット
は、前述の二重決定アッセイ法を行うのに必要な成分を
含んでよい。この特定のキットの成分は、ＩＬ−１分子
上の別々の決定部位に対する新しい一次抗体および二次
抗体を含む。必須ではないが、第一抗体は、支持物質に
共Ｕ結合的あるいは非共有結合的に結合していることが
望ましい。第二抗ＩＬ−１抗体は、検出可能なシグナル
を生成できる適当なマーカーに結合しているか、もしく
は、第二抗ＩＬ−１抗体に対して誘導された、第三の標
識二次抗体を用いることもできる。

また、前述のように、キットは、アッセイ法を、効果的
にし、あるいは、促進するために、様々な他の成分を含
むこともある。

反応性の測定 試料中に存在するＩＬ−１と、それに対する抗体との間
の結合の測定に使用する方法および装置は、用いる検出
可能なマーカーの種類に依存する。

マーカーが、酵素或は染色剤を使用するマーカーの場合
は、アッセイで生成される色は、適当な自動化装置、例
えば、マルチスキャンプレートリーダー（フローラボラ
トリーズ、バージニア州マクリーン）によって、適当な
波長で測定される。蛍光マーカーを用いる場合には、ア
ッセイ成分の反応性は、例えば、ＦＡＣ３４４０マイク
ロフルオリネイタ−（ベクトン・ディキンソン、カリフ
ォルニア州パロ・アルド）あるいは、スクリーンマシン
（パンデックス社、イリノイ州マンゾリン）を用いて、
流動微少蛍光測定によって分析する。放射性マーカーを
使用する場合には、ガンマ線を放射する同位体にはガン
マカウンターを、ベータ線を放出する同位体には液体シ
ンチレーションカウンターを用いる。上記カウンターは
、一般的に人手可能である。

本発明の方法および産物は、本発明で使用した個々の方
法のアルファベット順に示す実施例によって更に示し、
次に、数字で示した実施例によって示す。以下の実施例
は、本発明を説明し、同様の物を作成し、使用するため
の通常の技術の一つの補助のために示したものである。

実施例は、開示の範囲あるいは、本発明の特許による保
護を制限するためのものではない。

［実施例　Ａコ ＥＬ　Ｉ　ＳＡアッセイ 前述のように、ポリクローナル抗体、ハイブリドーマ培
養上清、および、モノクローナル抗体が、ＥＬＩＳＡア
ッセイの抗ＩＬ−１応答に関する試験に用いられる。本
アッセイでは、精製された天然のＩＬ−１あるいは組換
えＩＬ−１を、ウシ血清アルブミンを含む０．１Ｍ　ト
リス緩衝生理食塩水（Ｔ−ＢＳＡ）１マイクロリツトル
あたり、およそ１ナノグラム（１ｎｇ／μｇ）の濃度に
希釈する。

同溶液の約２０マイクロリツトル（μｇ）を多段式連続
ピペットを用いて、２００μｇニトロセルロースＥＬＩ
ＳＡプレートの各ウェルに加える。同溶液由来の流動体
は、蒸発させ、それによってＩＬ−１をニトロセルロー
スに非特異的に付着させる。

にに代わる方法としては、」−記のようにＴ−ＢＳＡで
希釈したＩＬ−１でプレートのウェルをコートすること
も可能である。３７℃で５０分インキュベートしたのち
、過剰の流動体は真空でニトロセルロースフィルターか
ら除去する。

次に、ウェルの非反応部分を１００μｇのＴ−ＢＳＡで
、３７℃で６０分間ブロックする。それによって、Ｔ　
−ＢＳＡは問題となる抗体のウェルへの非特異的吸着を
阻止する。そのインキュベーション期間後、ウェルをリ
ン酸（０，０５Ｍ）ｍｉ化生理食塩水（０，１５Ｍ）　
　（“ＰＢＳ”）でｐＨ７，２において、吸引により３
回洗浄する。

５０−１００μｇの被験試料（ポリクローナル抗体を含
む動物血清、モノクローナル抗体、あるいは、ハイブリ
ドーマ上／ｉ７）をウェルに加え、約６０分間３７℃で
インキュベートする。インキュベート後、抗体溶液を除
去し、各ウェルを生理食塩水で３回から５回吸引によっ
て洗浄する。次に、約５０−１００μｇの体積の酵素標
識抗イムノグロブリン抗体、例えば、アルカリホスファ
ターゼ結合二次抗体を各ウェルに加える。ハイブリドー
マ上清の抗ＩＬ−１反応性を分析するために本アッセイ
を使用する場合には、アルカリホスファターゼを結合し
た試薬は、ヤギ抗マウスＩｇＧ抗体（シグマケミカル社
、ミズーリ州セントルイス）を３％Ｔ−ＢＳＡで約１：
５００に希釈して用いることが望ましい。本アッセイを
、例えばウサギ由来の、ＩＬ−１に対するポリクローナ
ル抗体を検出するために用いる場合には、アルカリホス
ファターゼを結合した試薬は、ヤギ抗つサギＩｇＧ抗体
（シグマケミカル社）を３％Ｔ−ＢＳＡで約１：２００
に希釈することが望ましい。

適当なアルカリホスファターゼ結合抗体と共に、３０分
間インキュベート後、各ウェルを生理食塩水で３回から
５回洗浄する。次に、約１００μΩの無色のアルカリホ
スファターゼ基質を各ウェルに加える。望ましい基質の
一つは、パラニトロフェニルリン酸（シグマケミカル社
）である。この基質は、０．１Ｍグリシン（ｐＨｌＯ，
４）　、　　１ｍＭ塩化亜鉛、および１１１１Ｍ塩化マ
グネシウムからなる基質緩衝液で、およそ１　ｍｇ／　
ｍｌの強度に調製する。３０分間インキュベーション後
、各ウェルから５０−７５μｇのアリコートを取り、Ｅ
Ｌ　Ｉ　ＳＡプレートに移す。

抗ＩＬ−１抗体がプレートに結合したＩＬ−１に結合す
ると、何色の産物が形成される。発色の光学的濃度は、
マルチイスカンプレート読み取り機（フローラボラトリ
ーズ）で色素の４０５ナノメートルでの吸収を測定する
ことによって確認し得る。測定した光学的濃度の値は、
ウェル試料中のＩＬ−１抗体量に正比例する。

［実施例　Ｂ］ ＩＬ−１α値の放射性標識 ＩＬ−１α種を、改良クロラミン−Ｔ法によりて、　　
　■で放射性標識を行った。本方法では、１３１ｚ　ｇ
　（７，４３ＸｌＯ”モル）のＩＬ−１αを、　１．５
マイクロキユリー（μＣｉ）　　（６ＸｌＯ’モル）の
Ｎ；１１　（ＮＩＥＮ）および、４　Ｘ　１０−”Ｍの
タロラミン−Ｔ　（ｅｈｌｏｒａｍｉｎｃ−Ｔ）　（シ
グマケミカル社）の０．０５Ｍリン酸ナトリウム緩衝液
（ｐＨ７，０）中の溶液を６５μｇ加え、氷−ヒで３０
分間インキュベートする。ＮａＩＩＬ−１複合体は、充
填体積１ｍｌのバイオゲルＰ６−カラム（バイオラッド
社、カリフォルニア州すッチモンド）で、結合していな
いＮａ　　１２５１−　ＩＬ−１を分離する。ドデシル
硫酸すトリウム−ポリアクリルアミド電気泳動（ＳＤＳ
−ＰＡＧＥ）によって、放射性標識されたＩＬ−１αは
、分子量的１７，５００ダルトンの、単一の１２５■ポ
リペプチドを含むことが見いだされた。放射性標識ＩＬ
−１αは、また、９５％以上ＴＣＡで沈殿し、ＩＬ−ル
セブター保Ｕ細胞に９５％以上結合可能であり、１〜５
　Ｘ　１１０１５ＣＰ／ｄの範囲の比活性を示した。

［実施例　Ｃ］ ＩＬ−１μ種の放射性標識 ＩＬ−１μ種は、ジ−ヨウ素（Ｉ）　　−ポルトン−ハ
ンター試薬（Ｂｏｌｔｏｎ　−１１ｕｎｔｃｒ　ｒｃａ
ｇｃｎｔ）にューイングランドニュークリア、マサチュ
ーセッツ州ボストン）で標識した。標識法は、０．２Ｍ
ホウ酸ナトリウムとＯ，１５Ｍ　　Ｎａ　ＣΩ緩衝液（
ｐＨ８，５）　２ｆｔΩ中の２００μｇのＩＬ−１βを
、５μｇの０．１Ｍホウ酸ナトリウム、０．７ＭＮａＣ
，１１）、ｆ衝液（ｐＨ８，５）と混合し、この混合物
を次に、予め１ｍＣ１（０，２３ナノモル）のポルトン
−ハンター試薬を含む１００μｇのベンゼンを、乾燥窒
素の緩やかな気流により蒸発させておいたバイヤルに添
加した。氷」−で１時間反応させた後、５μｇの１Ｍグ
リシンエチルエステルを加えて反応を終結させた。３０
μｇの２％ゼラチンＰＢＳ溶液、ｐｌ＋７．２をキャリ
アとして加え、放射性標識しｆ：、　Ｉ　Ｌ　−１を、
パスツールピペット中に充填したバイオゲルＰ６（バイ
オラッド）の１ｍｌ充填体積カラムによるクロマトグラ
フィーによって、遊離ポルトン−ハンター試薬から分離
した。カラムベツド物質は、ウシ血清アルブミン（“Ｂ
ＳＡ“）でブロックし、続いて、結合していないＢＳＡ
を使用に先立゛ち、２０ｍ１のＰＢＳで洗浄した。

１００μｇずつの分画を集め、タンパク質結合性放射活
性を有するフラクションを保存した。

使用したＩＬ−１β量が少ないため、放射性標識法によ
る回収率の直接の算出は不可能であった。

回収率を見積るために、ＩＬ−１β（２００μｇ）を１
２５Ｉ　−Ｉ　Ｌ　−１（３Ｘｌ０４ｃｐａ＋）と混合
し、ヨウ素化法を行うが、ポルトン−ハンター試薬は使
わない、より制御された実験を行った。５回の測定によ
り、ゲルろ過般、５４±８％のカウントが回収された。

続くヨウ素化によって、この比率は、ＩＬ−１βタンパ
ク質の回収率であると考えられた。この算出法を用いて
、放射性標識ＩＬ−１β凋製物の非活性は、ＩＬ−１β
ペプチドの分子量が約１７　、５００ダルトンであると
して、２−５　Ｘ　１１０１５ＣＰ／ｍＭであった。

［実施例　１］ ポリクローナル抗ＩＬ−１β抗体の産生若いウサギの背
に、精製天然ＩＬ−１βおよび組換えＩＬ−１βを皮下
的あるいは皮肉に注射し、免疫感作を行った。第一の免
疫感作は、完全フロイント補助剤と混合した２００μｇ
について行った。

続く免疫感作は、不完全フロイント補助剤と混合した１
００μｇを投与し、毎月１回４カ月間行った。

１回の免疫感作で、１カ所に全量を投与するのではなく
、各回にウサギの背に、複数の注入を皮下的に行った。

免疫潜伏期中に、ウサギの血清試料を採取して前述のＥ
Ｌ　Ｉ　ＳＡアッセイで、抗ＩＬ−１応答試験を行った
。ウサギ血清力価が、１　：　ｔｏｏ以−１−の希釈で
もＩＬ−１との反応で、十分高い値を示した後に、最後
の免疫感作後１カ月口から二カ月おきにウサギから抗血
清を採取し、本発明のアッセイに使用する抗体源として
使用した。

［実施例　２］ １’Ｌ−１α種に対するポリクローナル抗体の産生 ＩＬ−１α種に対するポリクローナル抗体も、以下の変
形を含む、ＩＬ−１μ種に対するポリクローナル抗体の
産生に関する実施例１と実質的に同様の方法を用いて、
ウサギで作成した。抗ＩＬ−１αのポリクローナル抗体
を生成させるために用いた方法では、ウサギはまず、完
全フロイント補助剤中の２５０μｇのＩＬ−１αで免疫
感作を行った。２力月後、同動物を不完全フロイント補
助剤中の精製ＩＬ−１α１７０μｇで追加免疫感作を行
った。ウサギ血清力価が十分な水準に達した（即ち、１
：１００以上で反応性を持つ）後に、同動物から２力月
おきに抗血清を取り、本発明のアッセイのだめの抗体源
として使用した。

［実施例　３］ ＩＬ−１に対するモノクローナル抗体の産生Ｂ　Ａ　Ｌ
　Ｂ　／　Ｃ７ウスを、１５０μｇのＩＬ−１αペプチ
ドで、皮下的、および、皮肉的に免疫感作を行った。に
記免疫感作のためのペプチドは、マーチ（Ｍａｒｃｈ）
ら、Ｎａｔｕｒｅ、前出のアミノ酸２５Ｇ−２７１から
なるＩＬ−１α分子のＣ末端部分からなる。免疫感作に
先立ち、ＩＬ−１αペプチドは、０．５ｍＩ　Ｐ　Ｂ　
Ｓ　、　　０．５ｍｌ完全フロイント浦助剤（デイフコ
ラボラトリーズ、ミズーリ州デトロイｌ−）中１５０μ
ｇのＩＬ−１αペプチドのエマルジョンとして調製した
。最初の免疫感作後、不完全７０インド補助剤中のＩＬ
−１α７５μｇを、１力月おきに３力月間追加投与した
。

２回目の免疫感作後、および、その後の各感作後、血清
をマウスから集め、前述のように、ＥＬＩＳＡアッセイ
により、抗ＩＬ−１の抗体応答について試験した。注射
完了後、ＩＬ−１αに対して高い血清力価の抗体（１：
１００以上）を白゛するマウスを殺し、肺臓を得た。そ
れから単一細胞懸濁液を調製した。肺臓細胞は、クリッ
クの培地（Ｃ１ｉｃｋ’ｓ　ｍｅｄｉｕｍ）　（アルテ
ィックアソシエイツ、ウィスコンシン州ハドソン）中で
培養した。上記培地は、１０％（Ｖ／Ｖ）の加熱不活性
化したウシ胎児血清（Ｆｅ２）、３００μｇ　／　ｍｌ
の新鮮なし一グルタミン、５０μｇ　／　ｏ＋Ｉのゲン
タマイシン、５０μｇ　／　ｍｌのペニシリン、５０　
Ｕ　／　ｏ＋Ｉのストレプトマイシン、２５ｍＭのＨＥ
ＰＥＳ緩衝液、３００μｇ　／　ｍｌのピルビン酸ナト
リウム、および、１６ｍＭのＮ　ａ　ＨＣＯａからなる
（完全クリック培地）。

単一細胞懸濁液から増殖した肺臓細胞は、ＮＳ１マウス
骨髄細胞と融合させた。融合は、１５ｍ１円錐形遠心チ
ューブ中で、約２０Ｘ１０６の肺臓細胞を約ＬＯＸＬＯ
６のＮＳＩマウス肯髄腫細胞と混合することにより行っ
た。細胞混合液は、２５０Ｘｇで１０分間遠心してペレ
ット状にし、ト清を除去した。

次に、完全クリック培地で希釈した４０％（Ｗ／Ｖ）Ｐ
ＥＧ溶液１ｎｎｌを１滴ずつ細胞ペレットに加えた。

その後、１０ｍ１の完全クリック培地を２分間かけて遠
心チューブに加え、細胞ペレットを穏やかに再懸濁した
。次に、同混合液を２５０Ｘｇで５分間遠心し、上清を
除き、融合過程を完了した。

得られた細胞ペレットは、４０ｍ１の完全クリック培地
に再懸濁した。非融合骨髄腫ドライバー細胞（ＮＳＩ）
、重複ＮＳＩハイブリッド、非融合肺臓細胞、および、
重複＋１’？、　１１１１細胞ハイブリツドは、培地に
約１．３５ｍｇ／ｍｌのヒポキサンチン、０．００１７
６ｍｇ／ｍｌのアミノプテリン、および、０．３８８ｍ
ｇ／　ｍｌのチミジンを加えることにより（完全クリッ
クＨＡＴ培地）、増殖を阻害した。続いて、全懸濁液を
２００μρずつのアリコートに分け、平底マイタロタイ
タ−プレートに加えた（Ｎｏ、３５９６コスタ一社、マ
サチューセッツ州ケンブリッジ）。培養液は、空気中に
７％の００２を含む湿潤な大気中で、約３７℃に保った
。７日から１０日培養後、生きているハイブリッド細胞
を含む、ウェルの上清における抗ＩＬ−１抗体の存在を
、ＥＬＩＳＡアッセイによって、試験した。試験したハ
イブリッド細１泡のうち陽性のものは、回収し、制限希
釈法により、クローン化した。ハイブリッド細胞が増殖
したクローン化培養液を、ＥＬＩＳＡアッセイによっス
クリーニングした。

−１−２方法により、ＩＬ−１αに対する新しい抗体が
得られた。本発明で有効であると示された１一記抗体の
例としては、７Ｇ９−Ｃ１，７！１４−Ｇｌ。

１３１）１２−Ｂ２．　Ｌ４Ｄｌ−１３１１４，１５Ａ
４−３Ｇ１２．１５Ｃ２−Ｂ６゜および、１６１１１１
−１１１０と呼ばれるものがある。これらのモノクロー
ナル抗体を産生ずるハイブリドーマ細胞系は、同じ表記
で表す。１５Ａ４−３Ｃ１２モノクロ一ナル抗体試料（
ハイブリドーマ）は、受託番号１１Ｂ９０８４号として
ＡＴＣＣに寄託している。

抗ＩＬ−１抗体Ｌ５Ａ４−３Ｃ１２は、同抗体を産生ず
る約２×１０６ハイブリドーマ細胞をＢ　Ａ　Ｌ　Ｂ　
／　ｃマウスの腹膜中に注入することにより、ｉｎ　ｖ
ｉｖ。

で増殖させた。ハイブリドーマ細胞注入１週間前に、対
象となるＢＡＬＢ／ｃマウスに、腹水誘導・　　　刺激
剤として、１．０ｍｌのブリスタンを腹腔内にＬｙえた
。ハイブリドーマ注入後８０から１４０に腹腔的腹水を
集め、１．０００Ｘｇテｉｏ分間遠心し、１５Ａ４−３
０１２モノクロ一ナル抗体を回収した。

［実施例　４］ ＩＬ−１βに対するモノクローナル抗体の産生実施例３
で述べた方法を、ヒトＩＬ−１βと反応するモノクロー
ナル抗体群の生成に使用した。

ＩＬ−１βに対するモノクローナル抗体の精製のための
肺臓細胞源として使用されたマウスは、まず０．５ｍｌ
　　Ｐ　Ｂ　Ｓおよび０．５ｍｌの完全フロイント補助
剤中の２００μｇのヒトＩＬ−１βで、皮下的および皮
肉的に免疫感作を行った。最初の免疫感作後、同マウス
に、毎月３力月間、不完全フロイント補助剤中の７５μ
ｇのＩＬ−１βを投与した。

これらのモノクローナル抗体は、３Ａ４−ＬＯＧ　、　
３１１３−１１９、４Ｃ１２−３Ｆ　、　５Ａ１１−４
３　、　ＧＢＩＩ−Ｃ１、および。

７１３４−２Ｂと命名した。７１３４−２Ｂモノクロ一
ナル抗体のサンプル（ハイブリドーマ）は、受託番５シ
ＪＩＢ　９０８５として、ＡＴＣＣに寄託している。

［実施例　５］ ７Ｂ４−２Ｂおよび１５Ａ４−３Ｃ１２抗体の解析１５
Ａ４−３Ｃ１２および７Ｂ４−２１３は、双方ともＩｇ
Ｇ１抗体である。１５Ａ４−３Ｃ１２抗体は、ＩＬ−１
αと特異的に反応するが、ＩＬ−１βとは反応せず、よ
り詳しくは、ＩＬ−１α分子のＣ末端１５アミノ酸中に
含まれる抗原決定基に対して誘導されたものである。７
Ｂ４−２Ｂ抗体は、ＩＬ−１βと特異的に反応し、ＩＬ
−１αとは反応しない。どちらの抗体も、他のリンホカ
イン（ＩＬ−２，ＧＭ−Ｃ８Ｆ。

ＩＬ−３，インターフェロン等）に対する特異的反応性
は示さなかった。どちらの抗体も、Ａタンパク質セファ
ロース（シグマケミカル社）を用いたアフィニティーク
ロマトグラフィー、あるいは、連続的なゲルろ過および
イオン交換クロマトグラフィーによって、腹水から精製
することが出来る。

［実施例　６］ ＩＬ−１αおよびＩＬ−１βの競合アッセイ競合ラジオ
イムノアッセイ（ＲＩ　Ａ）は、６００４、ＱＲＩＡチ
ューブ（サルシュチット社、ニューシャーシー州プリン
ストン；カタログ番号７３、１０５５）中で、最終体積
が１５０μｇとなるようにして行った。以下の免疫反応
成分を、各々のＲＩＡチューブに加えた：　（１）結合
培地［５００ｍｌのロスウェル・パーク・メモリアル・
インスティテユート（“ＲＰＭＩ”）　１８４０培地、
５０ｍ１の０．２Ｍ　　ＨＥ　Ｐ　Ｅ　Ｓ　（ｐＨ７，
２）　、　１２．５ｇ　Ｂ　ＳＡ（シグマ費ケミカル令
カンパニー）、および、０．５ｇアジドナトリウム（ｐ
Ｈ７，７）］で希釈した、５０μΩの、上記実施例１あ
るいは実施例２の免疫血清、５０μΩの、上記実施例３
あるいは実施例４のハイブリドーマ上清、実施例３ある
いは実施例４の腹水、あるいは、実施例３あるいは実施
例４で調製したＰＢＳ中の精製ＩＬ−１１ｇＧ；（２）
ＰＢＳＴＡ　（ＰＢＳ、１％トリトンＸｌ００゜５％Ｂ
ＳＡ　（シグマ・ケミカル・カンパニー）、および、０
．２％アジドナトリウム（ｐＨ７，０））中のＡタンパ
ク質セファロース２０％（Ｖ／Ｖ）溶液５０μｇ　；（
３）２５μΩの、標識ＩＬ−１αあるいはＩＬ−１β（
４５、０００ｅｐｍ）を含む結合培地；および、（４）
２５ｔｚρの、非標識ＩＬ−１αあるいはＩＬ−１βの
濃度を徐々に増大させて含ませた結合培地。」二足ＲＩ
Ａチューブを、ミニーオービタルΦシエイカ−（Ｍｉｎ
ｉ−Ｏｒｂｉｔａｌ　５ｈａｋｅｒ）　　（ベリコ・ヴ
インランド、ニューシャーシー州）中に置き、４℃で１
６時間振とうした（シェイカーは、５−１７２にセット
）。その後、試料を２００４ｚΩのＰＢＳで１回、続い
て、４００μｇのＰＢＳで２回、９６ウエルＲＩＡチユ
ーブホルダー中の試料を５００１？ＰＭで１０分間遠心
しくソーパルＩ？Ｔ６０００冷却遠心機）、１−清を真
空吸引することにより、洗浄した。次に、ＲＩＡチュー
ブをディスポ・ポロシリケイト・ガラス培養チューブ（
アメリカン・サイエンティフィック中プロダクツ、イリ
ノイ州マソクゴウパーク、カタログ＃Ｔ１２９０−３）
に入れ、免疫複合体の放射活性をパラカード・マルチブ
リアメ４ガンマ線カウンター（ユナイテッド・チクノロ
シーズ、イリノイ州ダウナーズグロウブ）で測定した。

放射活性放出水準測定から、様々な量の非標識ＩＬ−１
αあるいはＩＬ−１βにより、標識ＩＬ−１αあるいは
ＩＬ−１βのそれぞれの抗体への結合の阻害の割合につ
いての標準阻害曲線を描いた。抗ＩＬ−１α抗体および
抗ＩＬ−１β抗体の阻害曲線を、それぞれ第１図、第２
図に示す。

結合の非特異的バックグラウンド水準は、免疫血清を、
結合培地で希釈した５０μｇの非免疫ウサギ血清と置換
して競合アッセイを行うことにより決定した。モノクロ
ーナル抗体の場合（腹水由来あるいは精製Ｉ　ｇＧｌを
ＰＢＳで希釈したもの）、ＰＢＳの対照溶液、ｐＨ７，
２を、反応性の非特異的バックグラウンド水準を決定す
るための適当な試料として用いた。ここにおいて、未知
量のＩＬ−１αあるいはＩＬ−１βを含む試料について
、放射性標識反応の阻害度を測定することが可能であり
、その測定値と第１図および第２図に示した曲線から、
ＩＬ−１αあるいはＩＬ−１βの存在量を決定できる。

試料は、血清、唾液、尿、血しょう、および滑液などの
体液から得られる。針康な提供者からの試料を、炎症が
存在しない場合の試料体液中のＩＬ−１標識水準を決定
するのに用いることができる。これは、アッセイされる
体ｌｆｋ試料中に検出される、上昇したＩＬ−１水準を
基にして、存在する炎症の程度を定量する際に用いる、
対照水準を与える。

［実施例　７］ 二重決定アッセイでの炎症の決定 最初のモノクローナル抗体をＰＢＳで約１０μｇ　／　
ｍｌの濃度に希釈する。この溶液的１００μｇを、９６
ウエル２００Ａｚ、ＱニトロセルロースＥＬ　Ｉ　ＳＡ
プレー１・からなる反応容器に入れる。

溶液からの液体は、インキュベーション過程で蒸発させ
、それによって、第一モノクローナル抗体をプレートに
非特異的に付着させる。その後、プレートを、約１００
μｇのＰＢＳで３回洗浄し、更に、３％（重量）のＢＳ
Ａを含むＰＢＳを１００μｇ加え、プレートを３２℃で
６０分間インキユベートシ、第一モノクローナル抗体の
付着してい・ない、プレートウェル底部の残余部分をブ
ロックする。この再度のインキュベーション後、ＰＢＳ
溶液を真空により除去するか、あるいは、ＰＢＳ１００
７ｚ、１７で３回洗浄しデカンテーションによって除く
。これで、プレートは、二重決定イムノアッセイ法で使
用する準備が出来たことになる。プレートや、チューブ
、プラスチックウェルプレート、などの他の適当な容器
は、臨床用などのためのキットの一部として使用される
ことは、理解されるであろう。

体積５０μｇの体液試料を反応プレートに加え、３２°
Ｃで６０分間インキュベートする。インキュベーション
後、液体を除き、プレートウェルを１００μｇのＰＢＳ
で繰り返し洗浄する。その後、ＩＬ−１に対する第二モ
ノクローナル抗体１００μｇを、ＰＢＳで約１００μｇ
　／　ｍｌの濃度に希釈した後、反応ウェルに加える。

第二モノクローナル抗体は第一抗体が反応性であるエピ
トープとは異なる、ＩＬ−１分子上のエビ！・−ブと反
応する。３２℃でおよそ６０分間インキュベートシたの
ち、第二抗体溶液を除去し、容器を１００μΩのＰＢＳ
で繰り返し洗浄し、第二抗体を除く。その後、第二モノ
クローナル抗体に特異的な二次１ｇＧ抗体をアルカリホ
スファターゼと結合されたちのおよぞ５０−１００μｇ
を反応容器に加える。二次抗体は、およそ３％ＢＳＡを
念むＰＢＳで約１　：　５００１．：希釈して用いる。

３２℃で約３０分間インキュベーションしたのち、標準
生理食塩水（約０．９％ｗｔ／ｖｏｌ）あるいは水道水
に浸し、繰り返し洗浄する。次に、約１００μｇのバラ
ニトロフェニリン酸基質（シグマ・ケミカル・カンパニ
ー）を容器に加える。基質は約０．１　Ｍグリシン（ｐ
Ｈ１０，４）　、　　１ｍＭ塩化亜鉛、および１ｍＭ塩
化マグネシウムとともに、およそ１ｍｇ／ｍｌの強度に
調製する。試験される試料中にＩＬ−１が存在する場合
には、有色の産物が形成される。次に、色素の光学的濃
度は、マルチスヵン・プレートφリーダーで４０５ナノ
メートルでｉｉｌｌ定する。測定した光学的濃度の値は
、試料中の■Ｌ−１量に直接的に比例し、また、試料源
に存在する炎症状態を示唆する。

本発明に関連した分野に熟達した台には明らかなように
、本発明は、その本質あるいは必須の特徴から逸脱する
ことなく、上記のように特異的な形態外の形でも具体化
され得る。上に示した、本発明のひとつの態様は、従っ
て、説明的なものであり、制限を与えるものではない。

本発明の範囲は、特許請求の範囲に述べられており、上
記の本発明の態様に制限されるものではない。

【図面の簡単な説明】

第１図は、競合アッセイ反応において、試料中の様々な
濃度のＩＬ−１が、放射性標識ＩＬ−１αと、本発明の
新しい抗ＩＬ−１抗体との沈降反応を阻害する能力を示
す、ＩＬ−１α種の競合アッセイ阻害曲線を示すグラフ
である；また、第２図は、競合アッセイ反応において、
試料中のＩＬ−１が、放射性標識ＩＬ−１βと、本発明
の新しい抗ＩＬ−１抗体との沈降反応を阻害する能力を
示す、ＩＬ−１β種の競合アッセイ阻害曲線を示すグラ
フである。

Claims (10)

【特許請求の範囲】
1. （１）（ａ）被験者のインターロイキン−１（以下ＩＬ
   −１という）を含有すると推定される体液試料を、ＩＬ
   −１の第一抗原部位の特性に特異的な第一抗体と反応さ
   せること、及び、（ｂ）この第一抗体と試料中のＩＬ−
   １との反応によって、試料を採取した被験者の炎症状態
   の存在に関連するＩＬ−１の存在を検出すること、 を含む、被験者のＩＬ−１によって媒介される炎症を検
   出する方法。
2. （２）上記第一抗体が、１５Ａ４−３Ｃ１２および７Ｂ
   ４−２Ｂからなる群から選択されたモノクローナル抗体
   あるいはそれらと機能的に均等な抗体である、特許請求
   の範囲第１項記載の方法。
3. （３）第一抗ＩＬ−１抗体と反応性の抗原部位とは構造
   的に異なる、ＩＬ−１上の第二抗原部位に対する第二抗
   ＩＬ−１抗体と上記試料を接触させること；および、 第二抗体とＩＬ−１第一抗体複合体との反応を測定する
   こと； により第一抗体とＩＬ−１との反応の程度を決定する、
   特許請求の範囲第１項記載の方法。
4. （４）試料を、既知量の標識ＩＬ−１とも反応させ；そ
   して、第一抗体と標識ＩＬ−１との反応性を測定するこ
   とによりＩＬ−１と第一抗体との反応を測定する特許請
   求の範囲第１項記載の方法。
5. （５）（ａ）被験者由来の血清試料と第一抗体とを、第
   一抗体が血清試料中に存在するＩＬ−１に結合する条件
   下で接触させること；および、 （ｂ）被験者体内の炎症状態の存在に関連する第一抗体
   の免疫複合体の存在を決定すること；を含む、被験者体
   内のＩＬ−１の存在により媒介される自己免疫疾患の検
   出のための特許請求の範囲第１項記載の方法。
6. （６）ＩＬ−１に特徴的なタンパク質あるいはペプチド
   上の抗原部位に特異的な第一抗体、および／または上記
   第一抗体の有用な結合性断片；および、 第一抗体がタンパク質上の対応する抗原部位に結合する
   ことに関連して検出可能な信号を生成し得る、信号生成
   系； を含む、被験者体内の炎症状態の存在を試験するための
   診断用キット。
7. （７）ＩＬ−１に特徴的なタンパク質上の第二抗原部位
   、すなわち、第一抗原部位と構造的に異なる第二抗原部
   位に特異的な第二抗体、および／または第二抗体の有用
   な結合性断片；および、第二抗体のＩＬ−１に特徴的な
   タンパク質への結合に関連した検出可能な信号を生成し
   得る標識； を信号生成系に有する、特許請求の範囲第６項記載のキ
   ット。
8. （８）ＩＬ−１に特徴的なタンパク質上の第二抗原部位
   、すなわち、第一抗原部位と構造的に異なる第二抗原部
   位に特異的な第二抗体、および、第二抗体の有用な結合
   断片； 第二抗体に対する特異的結合相手物質；および、 特異的結合相手物質に結合した標識； を信号生成系に有する、特許請求の範囲第６項記載のキ
   ット。
9. （９）１５Ａ４−３Ｃ１２（ＡＴＣＣ　ＨＢ　９０８４
   ）の同定特性を有するモノクローナル抗体。
10. （１０）７Ｂ４−２Ｂ（ＡＴＣＣ　ＨＢ　９０８５）の
    同定特性を有するモノクローナル抗体。