JPS5816695B2 - 酵素電極 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は各種物質の混合物中に含まれるトリメチルアミ
ンを選択的に定量することのできる酵素電極に関する。

さらに詳しくは、酸化還元酵素として、特にトリメチル
アミンオキサイド還元酵素を用い、さらに補酵素として
ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ）を用
いた新規なトリメチルアミンの特異的センサー電極に関
する。

トリメチルアミンは、食品、特に魚肉の腐敗に伴って生
成し、その生成量が食品の腐敗度のめやすとなる重要物
質として知られている。

この物質の検査法としては、従来から■臭いによる官能
検査、■ガスクロマトグラフィーによる定量、などが知
られている。

■の方法は簡便性という面ですぐれているが、人間の感
覚器官によるという点で不確実性があり、また定量化が
困難である。

■の方法は定量性あるいは検出感度という面ではすぐれ
ているが、犬がかりな装置を必要とする点で迅速簡便性
に欠けるという問題がある。

一方、水素イオンや各種無機イオンを選択的かつ迅速簡
便に測定するイオン選択電極については、すでに各種の
ものが実用化されているが、これらと同様なトリメチル
アミン選択電極については従来例は知られていない。

以上のようにトリメチルアミン濃度の測定は非常に重要
ではあるが、その濃度を迅速簡便に測定する選択電極の
例はない。

本発明者らは、特に前述の酵素、補酵素を用い、これら
を集電体上もしくはその近傍に固定することにより、こ
れを作製することに成功した。

以下に本発明の原理・実施例について説明する。

食品中のトリメチルアミン（ＣＨ３）３Ｎは、一般にグ
ラム陽性細菌、ダラム陰性細菌などが有するトリメチル
アミンオキサイド還元酵素の特異的触媒作用によって、
トリメチルアミンオキサイド（ＣＨ３）３ＮＯの還元反
応で生成する。

この際、補酵素として還元型ＮＡＤ（ＮＡＤＨ）が共役
し、酸化型ＮＡＤ（ＮＡＤ＋）に変化する。

自然界においては、上述の細菌による食品の腐敗によっ
て、第１図の矢印の方向に酵素触媒反応が進行する。

しかし酸化型のＮＡＤ＋が十分に存在する条件下で、ト
リメチルアミンが存在する場合には図の矢印の逆方向反
応の進行が可能である。

ここでＮＡＤ＋から逆反応によって生成したＮＡＤＨを
集電体上で電気化学的に酸化してやると、ＮＡＤ＋が再
生されると同時に、その酸化電流の値からトリメチルア
ミンの濃度を求めることが可能となる。

さらにＮＡＤは一応電気化学的に活性な物質であるが、
第２図のように適当なレドックス化合物、例えはフラビ
ンモノヌクレオチドを共役させ、ＮＡＤと集電体との間
の電子伝達体として作用させる場合には、一層ＮＡＤ＋
の再生が容易になり、得られる酸化電流値も大きくなる
。

以上のことから前記の酵素ならびに補酵素が集電体上も
しくはその近傍に固定化されており、またそれらに加え
てレドックス化合物も固定化されている場合は、それら
酵素、補酵素あるいはレドックス化合物の再使用が可能
であり、前記酵素の特異的触媒作用を利用したトリメチ
ルアミン選択電極が実現できることになる。

以下本発明をその実施例により説明する。

まず、酵素と補酵素を集電体上に直接固定化した例を示
す。

実施例 １ フラボバクテリウム（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）
属のダラム陰性桿菌より抽出したトリメチルアミンオキ
サイド還元酵素０．３■と、補酵素（酸化型ＮＡＤ）０
．４■相当をｐＨ７，０のリン酸緩衝液に溶解する。

一方グラファイト粉末をプレス成型して・直径１５朋の
円板を作る。

この円板上に前記溶液を塗布、乾燥し、この乾燥表面に
グルクルアルデヒドを作用させる。

このようにして、酵素ならびに補酵素はグラファイト表
面上に直接架橋固定化される。

この酵素、補酵素固定化円板を用いて第３図のような酵
素電極を構成した。

図において、１は絶縁材よりなる支持体、２はその中に
通した金属リード、３はリード２と接続した白金板より
なる集電体である。

４は前記酵素、補酵素を固定化したグラファイト円板で
ある。

グラファイト円板はその上に固定した酵素、補酵素の集
電体の役割を果たしており、さらに第２の集電体である
白金板３と接触する。

すなわち、円板４は絶縁材よりなるねじ式止め具５で白
金板３と接触するように支持具１に固定される。

以上のように構成した酵素電極を第４図に示すような測
定系に組み入れる。

ここで６は酵素電極、７は参照電極、８は対極、９は緩
衝液、１０は塩橋を示す。

飽和甘木電極（Ｓ−Ｃ−Ｅ）よりなる参照電極に対して
０．２Ｖの定電位に酵素電極の電位を設定し、酵素電極
に流れるアノード電流を測定した。

第５図は緩衝液中に含まれるトリメチルアミンの濃度変
化（０から１０−３モル／ｌ）に伴うアノード電流の時
間変化を示す。

約１分でトリメチルアミンに起因する電流は定常値に達
し、０，６５μＡの電流増が認められる。

同じ系で各種のトリメチルアミン濃度に対する定常電流
の変化量をプロットした結果を第６図に示す。

ここで、１Ｘ１０−３〜４Ｘ１０−３モル／ｌのトリメ
チルアミンの濃度範囲で、濃度と電流増加量との間に直
線殴が認められ、本発明による酵素電極を用いてトリメ
チルアミンの定量が可能なことがわかる。

この酵素電極は、緩衝液中につけて保存すると約１週間
にわたって濃度測定が可能であった。

次に酵素、補酵素、レドックス化合物３者を集電体近傍
に固定した例を示す。

実施例 ２ 実施例１と同じ酵素０．１ｒＩｂ９相尚をセロハン半透
膜上にグルタルアルデヒドを用いて架橋固定化する。

一方補酵素（酸化型ＮＡＤ）は、多糖ポリマー担体であ
るアガ吊−スに共有結合させたものを用いる。

レドックス化合物としてはメチロール化ポリアクリルア
ミドにリボフラビン−５７−リン酸エステルを結合させ
た下記の構造式で示されるレドックスポリマーを用いる
。

上記の高分子化されたＮＡＤならびにレドックス化合物
を、上記の酵素が固定されたセロハン半透膜を用いて、
実施例１で用いた支持体の白金集電体と接触させて保持
する。

この場合、第３図のグラファイト円板の存在する部分が
高分子化されたＮＡＤならびにレドックス化合物の存在
部分であり、白金集電体と対向していない側はセロハン
半透膜でおおわれていることになる。

そして高分子化されたＮＡＤならびに補酵素は半透膜に
よって外部へ溶出することなく、酵素とともに白金集電
体の近傍に固定化されていることになる。

このようにして作製した酵素電極を用い、実施例１と同
様の測定を行った。

トリメチルアミンの濃度変化（０から１０−３モル／ｌ
）に伴い約３μＡの電流増が認められ、約２分で電流は
定常値に達し、また５Ｘ１０＝〜０°Ｉ Ｘ １０−”
モア、／ｌのトリメチルアミンの定量が可能であった。

以上のように本発明によれは食品の腐敗度を知るための
重要なめやすとなるトリメチルアミン量を簡便に測定で
きるセンサーが実現できる。

【図面の簡単な説明】

第１図はトリメチルアミンオキサイド還元酵素によるト
リメチルアミンオキサイドの還元反応を示す図、第２図
はさらにレドックス化合物を共役させた場合の反応を示
す図、第３図は本発明の酵素電極の一例を示す縦断面図
、第４図は測定系の略図、第５図は酵素電極のトリメチ
ルアミンに対する応答特性を示す図、第６図はトリメチ
ルアミン濃度と電流変化との関係を示す。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ 少なくとも酸化還元酵素と、補酵素と、集電体を有
   し、酸化還元酵素と補酵素が集電体上もしくはその近傍
   に固定化された酵素電極であって、酸化還元酵素がトリ
   メチルアミンオキサイド還元酵２であり、補酵素がニコ
   チンアミドアデニンジヌクレオチドであることを特徴と
   する酵素電極。 ２ 少なくとも酸化還元酵素と、補酵素と、補酵素と共
   役し電子伝達体となるレドックス化合物と、集電体とを
   有し、酸化還元酵素と補酵素とレドックス化合物が集電
   体上もしくはその近傍に固定化された酵素電極であって
   、酸化還元酵素がトリメチルアミンオキサイド還元酵素
   であり、補酵素がニコチンアミドアデニンジヌクレオチ
   ドであることを特徴とする酵素電極。