JPS5813598A - 組み替えｄｎａクロ−ニング・ベクタ−ならびにその真核細胞性および原核細胞性被形質転換体 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、ハイグロマイシンＢ　（ｈｙｇｒ５ｏｍｙｃ
ｉｎ　Ｂ）およびＧｌｔｌｌ耐性を真核細胞および原核
細胞の両方に伝える新規の組み替えＤＮＡクローニング
・ベクターに関する。本発明は更に前述のベクターの被
形質転換体に関する。

本発明は、真核細胞および原核細胞に選択機能を持たな
いクローニングされたＤＮＡ配列をいかにして取出し、
取扱い、安定化させるかとし）う問題を解決しているの
で特に重要である。これまで真核細胞における組み替え
ＤＮＡ技術の発達および開発は、　／）真核細胞におい
て選択的なマーカーラ含む好適なりローニング・ベクタ
ーが一般的には存在しないこと、２）真核細胞におＬ）
で所望のＤＮＡ配列を即座に増重できなＬ）ことおよび
３）培養時の真核細胞の一世代時間が長いこと、とし）
う理由から、遅れまた困難になっていた。

今回・ａ）真核細胞性プロモーター。

ｂ）それに対する耐性が伝わる抗生物質ノ１イグロマイ
シンＢおよびＧ１１ｌｒの一方または両方に感受性で、
形質転換細胞分裂および培養しやすし）宿主細胞に移入
したとき、上記抗生物質の一方または両方に対する耐性
を伝えるｌまたは２個の異なった構造遺伝子および関連
制御配列およびＣ）上述の宿主細胞が原核細胞であると
きレプリコンが機能性である原核細胞性レプリコン１　
　′から成る組み替えＤＮＡクローニング・ベクター（
但し、！または２個の構造遺伝子および関連制御配列は
真核細胞性プロモーターに隣接していて真核性宿主細胞
において真核細胞性プロモーターから転写されたものと
し、１個の遺伝子および関連制御配列はハイグロマイシ
ンＢおよびａｔｔｔｔの両方にではなくどちらか一方に
対する耐性を伝えるものとし、且つＧ１１ｌＦに対する
耐性を伝える遺伝子は酵素フォスフオドランスフェラー
ゼをコード化しないものとする）が、真核細胞において
も原核細胞においても共に機能性で選択性であるので、
上記の問題が当該ベクターにより解決されることを発見
した。したがってこの可転性（ｖｅｒｓａｔｉ　ｌｅ　
）のベクターにクローニングされたＤＮＡ配列は原核細
胞において常法により取扱い増巾させることができ、か
くして真核細胞において操作を行なう際の不都合や問題
点を避けられる。その上９本ベクターは真核細胞におい
て機能性で選択性でもあるので、このベクターは更に修
飾することなく真核細胞性宿主に直接移入でき、続いて
操作し増巾させることができる。これは、当技術分野に
おいて優れているだけでなく、格段に進んだ技術である
といえる。

ＤＮＡを真核性宿主細胞にクローニングする能力と容易
に被形質転換体を選別する能力は組み替えＤＮＡ技術が
より一層高度に発達するために１よ重要である。形質転
換が起こりその結果プラスミドＤＮＡが取得される乙と
はそれほど頻繁には起こらないので、このような機能試
験は何百万という細胞の中でどの細胞がプラスミドＤＮ
Ａを取得。

したかを決めるのに実際上必要である。この機能試験は
非選択的なりＮＡ配列がベクターに挿入されて特定の抗
生物質耐性遣−子を挿入的に不活化することがあり得る
ので重要である。したがって形質転換の後にベクターと
必要な特定のＤＮＡ配列とを含む細胞は適当な抗生物質
で選別することハイグロマイシンＢまたはＧａｔｚに感
受性で細胞分裂ののちにＤＮＡを取り込むことができる
Ｘ− ゝる、真核細胞または原核細胞において移入され選別さ
れ得るの゛で、特に有益である。今日まで組み替えＤＮ
Ａ技術における進歩はたいていの場合、原核細胞性宿主
中で真核細胞性のポリペプチド（例えば−プロインシュ
リン、インシュリンＡ１１ｌ、インシュリンＢ鎖、ヒト
成長ホルモン、ウシ成長ポルモン、インターフェロン、
ソマトスタチン、チモシンａｊ等）を製造する仁とを要
していたので。

このことは重要である。原核細胞は真核細胞性ポリペプ
チドに糖質部を正しく結合できない。したがって組み替
えＤＮＡ技術により翻訳後（ｐｏｓｔｔｒａｎｓｌｊｍ
ｉ◆ｎａｌｌｙ　）　Ｉ４修飾された真核細胞性ポリペ
プチド９例えばグリ□：トヲシル化されたポリペプチド
を製造するには、真核細胞性宿主および適当な真核細胞
性組み替えＤＮＡクローニング・ベクターがなくては不
可能である。

本ベクターは以上のような必要性を満たし９組み替えＤ
ＮＡ技術の範囲と応用を広げる。したがって真核細胞に
おける修飾されていないあるいは翻訳後に修飾された蛋
白質の商業的生産は共に高められる。

ここに記載された本発明の目的のために９次の用語を以
下に定義する。

構造遺伝子−ポリペプチドをコード化スルＤＮＡ配列 制御因子−構造遺伝子の転写および形質表現を管理し調
整するＤＮＡ配列 真核細胞性プロモーター−真核細胞において構造遺伝子
の形質表現を部分的に促進し調整するＤＮＡ配列 原核細胞性レプリコン−原核細胞においてＤＮＡの複製
を制御し調製するＤＮＡ配列 組み替えＤＮＡクローニング・ベクタニーｌっ以上のＤ
ＮＡ断片を加えることのできるまたは加えたＤＮＡ分子
からなる物質でプラスミド、バクテリオファージ、ウィ
ルスがその筒中に入るがこれだけに限定されるわけでは
ない 形質転換−遺伝子型を変えその結果受容細胞に安定な遺
伝性の変化を起こさせる。受容株宿主細胞へのＤＮＡの
導入 挿入部位の違いによる異性体−受容ＤＮＡのλつ以上の
適当な部位の１つにＤＮＡフラグメントを挿入するとき
に生成するλつ以上の可能な組み替えＤＮＡ分子の１つ 本ベクターはｐ下記の操作からなる過程によって１抗生
物質ノ）イグロマイシンＢおよびＧ１１ｌｆのどちらか
一方または両方に対する耐性を伝えるｌまたは２個の異
なった構造遺伝子および関連制御配列を有するＤＮＡ配
列を調製することにより構成する。

ａ）プラスミドｐＫＣ２０３をＩＩＩ制限酵素で処理し
・上述の両抗生物質に対する耐性を伝える７３ｋｂのシ
１π制限フラグメントを単離する。または ｂ）プラスミドｐＫｃ２０３を！ｊＬ！Ｉｔおよびシリ
Ｉ制限酵素で処理し、上述の両抗生物質に対する耐性を
伝える！？ｊｋ　ｂのシリＩ　／　シｌ、Ｉ［制限フラ
グメントを単離する。または Ｃ）プラスミドｐＫｃ２０３をＢｇｌｌｉおよび５ａｃ
Ｉ制限酵素で処理し、抗生物質ハイグロマイシンＢに対
する耐性を伝える／、　ｊ　／　ｋ　ｂのＧａｅｌ／Ｂ
Ｈ４■制限フラグメントを単離する。゛またはｄ）プラ
スミドｐＫＣ２ｏ３をシリ■およびシ」ＲＩ制限酵素と
処理し、抗生物質Ｇ４！Ｉｔに対する耐性を伝える１、
ｔｓｋｌｘｎ旦鵠ＲＩ／シ吐！制限フラグメントを単離
する。

かくして得られるＤＮＡ配列を真核細胞性プロモーター
および必要ならば原核細胞性レプリコンからなるもう１
つのＤＮＡ配列に連結する。連結により得られるＤＮＡ
配列は閉じられてプラスミドを形成するが、このプラス
ミドは、仁れを宿主細胞の中に移入して移入された宿主
を抗生物質ハイグロマイシンＢまたは抗生物質Ｇ４ｔｌ
ｔの存在下で培養し、生き残った細ｉを選別することに
よ５．安定。あ、持、。６．　　　　９ 本発明はここに例示したように、ハイグロマイ性宿主細
胞において耐性を内包し表現する新規のプラスミドを生
成するために、アミノグリコシド系抗生物質ハイグロマ
イシンＢおよびａａｔｔに対する耐性を伝達する細菌性
プラスミドＤＮＡを実現する。かくして本発明はＤＮＡ
を事実上どのタイプの細胞にクローニングするにも有益
である。

その上、０仁に例示されたベクターの、真核細胞および
原核細胞のどちらにおいても毒となる抗生物質に対する
耐性を伝達する能力は、そのベクターを取得した細胞を
選別し安定化するための機能試験を提供する。

ξこに例示された構成中に使用された特定の細菌性プラ
スミドＤＮＡ配列は、プラスミドｐＫｃａＪからの７３
ｋ　ｂのＷ■制限フラグメントまたはその誘導体である
。プラスミドｐＫＣ２０３は約１ｊｋｂの大きさで、ｉ
′ヒコリ（Ｅ、　　ｃｏｌｉ）　ＪＲ２，２３）。

から常法により容易に単離できる。菌株Ｅ、コリＪＲ、
ｌｊは学術上知られており［Ｄａｙ、ｉｃｓ　ａｎｄ　
ｄ　Ｃｏｎｎｏｒ。

１９りＩ＊ｊｋｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ　Ａｇｅｎｔ
ｓ　ａｎｄＣｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ　＊／＠（１）：
／：９］、またメリーランド州（Ｍａｒｙｌａｎｄ　）
ロツクヴイル（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ　）にあるアメリカ
ン・タイプ・カルチャー・コレクション（Ａｍｅｒｉｃ
ａｎ　ＴｙｐｅＣｕｌｔｕｒｅ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ
　）　ニ寄託すレ保存菌株ニナッテいてそこから寄託番
号ＡＴＣＣ３１９１２のもとに何ら制限されることなく
誰でも入手できる６゜プラスミドｐＫｃ２０３の制限部
位と機能地図を添付図の図１に示す。図１を始めとする
全ての図には目盛りを記載していない。

ｐＫｃ２０３　から（Ｆ）　７ｊ　ｋ　ｂ　ｃＤ　Ｂ３
ｉ　’Ｊ（制限フラグメントは、抗生物質ハイグロマイ
シンＢおよびＧａ１ｒに対する耐性の形質表現に関する
構造遺伝子と制御因子を含む。このフラグメントを、そ
の構成がミューνガン（Ｍｕｌｌｉｇａｎ　）とベルブ
（Ｂｅｒｇ）によって記載されている［　５ｃｉｅｎｃ
ｅ　＊　、２０９（４７１１６３）：　１ｌＡ２２　、
　（１９１０年）コ　既知のプラスミドであるプラスミ
ドｐ８Ｖ、ｔ　ｇｐｔに連結した。プラスミドｐｓＶｊ
　ｇＰｔ　ハ約９．３ｋｂテ、プラＸ’？、ドｐＢＲ３
２２の複製の開始点とアンピシリン耐性マーカーを含み
、その上、キサンチンーグアニ、ン・フオスフオリボシ
ルトランスフエラーゼ（ｇｐｔ）をコード化する遺伝子
の転写を制御する機能性ＳＶｇＱ初期プロモーター（ｅ
ａｒｌｙ　ｐｒｏｍｏｔｅｒ　）をも含む。プラスミド
ｐｓＶｊ　ｇｐｔの制限部位と機能地図を添付図の図２
に示す。当業者には自明であろうが、プラスミドｐ８Ｖ
ｊ　　ｇｐｔは、Ｅ、コリ中でもっｓｊ例えば哺乳動物
の細胞のような真核細胞中でも、複製することができる
。更にまた。プラスミドｐｓＶＪ’　ｇＰ’のＢｇｌｌ
ｉで特異的に制限される部位は、プラスミドｐＫｃＪＯ
Ｊからの７ｊｋｂの鮒■制限フラグメントと直接連結す
ることができる。かくし・て、ハイグロマイシンＢおよ
びＧ４ｔｌｌｊ耐性伝達７！；ｋｂフラグメントは一！
！ｇｕＩ［で処理したプラスミドｐ　ＳＶｊｇＰｔに連
結できる。’Ｚｔｋｂフラグメントの可能なλつの方向
は等しく現実に存在しえるので、７３ｋｂフラグメント
をプラスミドｐ８Ｖｊ　ｇｐｔに連“結させると２つの
タイプのプラスミドを生じ、それをこξでプラスミドｐ
ＫＣ，２／４（およびｐＫＣ，ｉ！／３と表わす。プラ
スミドｐＫＣ，２／ｌおよびｐＫＣ，２／ｊの制限部位
と機能地図を各々添付図の図３および図りに示す。

例示されたプラスミドｐＫｃＪ／ｌおよびｐＫＣ，２１
５において、真核細胞性プロモーターは関連制御因子を
含めたハイグロマイシンＢおよびＧ　ｇ　／　、ｒ耐タ
ーは、真核性宿主細胞に移入されたとき、耐性遺伝子の
転写を制御し形質表現を部分的に調整する。更に９本プ
ラスミドは真核細胞性宿主にオイて染色体統合（Ｃｈｒ
ｏｍｏｓｏｎａｌ　ｉｎｔｅｇｌａｔｉｏｎ　）を受け
るので通常の真核細胞分裂の間に染色体の一部に伴なっ
て一部として複製する。

例示されたプラスミドｐＫｃ２１’ＡおよびｐＫＣλｌ
ｊにおいてここで例に挙げた真核細胞性プロモーターは
ｓｖｇθ初期プロモーター［０’Ｈａｒｅ並旦、　＋　
／　９ｇ　／　＋　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔ、Ａｃａｄ、　
Ｓｃｉ、ＵＳＡ　７ざ（３）１３２７；　Ｍｕｌｌｉｇ
ａｎ　ａｎｄ　Ｂｅｒｇ　＊　１９ｆθ、Ｓｃｉ、２θ
９　：　１ｌ１２２Ｊであるが他の多くの真、、核細胞
性プロモーターも使用できる。他に例示された真核細胞
性プロモーターとしては、　５ＶＩＩＯ後期プロモータ
ー（ｌａｔｅｐｒｏ−Ｊ、ｔ］　、Ｈ８ＶＩＴＫ　　プ
ロモーター［Ｐｅ１ｌ　１ｃｅｒ　ｅｔ　ａｌ、　。

１９７ｇ、　Ｃｅ１ｌ　　ＩＩＩ　：　１３３コ、アデ
ノウィルス・プロモーター［Ｔｈｕｍｍｅｌ　ａｎｄ　
Ｔｊｉｉｎ　＋　１９ｆ／　、　Ｃｅ１ｌ　、２３：♂
、２ｊコ　、アデノウィルス＠２（Ａｄ、２）後期プロ
モーター［Ｒｏｌｎｉ、ｃｋ　＋　１９♂／、Ｃｅ１１
．２４１／３５］　、ポリオ−ｖ　（Ｐｏｌｙｏｍａ　
）　・プロモーター［Ｃｏ１ａｎｔｕｏｎｉ　ｅｔ　ａ
ｌ　。

／９Ｊ’Ｏ，ＰｒｏｃＪＪｓｔ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、　
ＵＳＡ　７７（７）：　３ざｓｏ］。

マウス・サルコーマ・ウィルス・プロ’？−１−［Ｖａ
ｎ　Ｂｅｖｅｒｅｎ　ｅｔ　ａｌ、　、／　９７八Ｎａ
ｔｕｒｅ　、２♂９：、２．ｔｆ］　。

酵母ｔｒｐ−／プロモーター［Ｓｔｉｎｃｈｃｏｍｂ郵
ａ１．　。

／　９７９　、　Ｎａｔｕｒｅ　、２Ｊ’、２　：　３
９１．酵母１ｅｕ　２プロモーター［Ｒａｔｍｋｉｎ　
ａｎｄ　Ｃａｒｂｏｎ　ｔ　１９７７　＋　Ｐｒｏｃ、
　Ｎｉｔ、Ａｅａｄ。

Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　ＱＣ２戸１１７７］、酵母ｈｉｓ３
プロモーター［Ｂｒｏａｃｈ　ｅｔ　ａｌ、　ｓ　／９
７９　＋　Ｇｅｎｅ♂：／、２／］、酵母アルコール脱
水素酵素プロモーターおよび酵母チ゛トクロムｃ、プロ
・ンモーター［Ｇｕａｒｅｎｔｅ　ａｒｄ　Ｐｔａｓｈ
ｎｅ。

／　９７７１　＋　Ｐｒｏｃ、　’ＮｈｔヨＡｃａｄ、
Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　７♂（１戸Ｊ／９９］が含まれるが
ξれ等に制限されるわけではない。

例示されたプラスミドｐＫＣ，１１４１おヨヒｐＫＣ２
１ｊの構成は遺伝子ｐｓＶｊ　ｇｐｔ中の初期ＳＶψプ
ロモーターの下側（ｄｏｗｎｓｔｒｅａｍ）にシｄ■挿
入を含むが、上に挙げた真核細胞性プロモーターを１つ
以上含む他の類似の構成もなし得る。例えば。

ハイグロマイシンＢおよびａｔｔｉｒ耐性遺伝子ヲ含む
Ｂｇｌ　■直鎖状ＤＮＡフラグメントは、プラスミドＰ
ＫＣ，２θ３またはその誘導体から、常法によりプラス
ミドをＢｇｌ、［制限酵素で処理することにより得られ
る。このフラグメントは直ちに使うことができるがまた
は公知技術である合成りＮＡ連結物質（ｆｉｎｋｅｒ　
）をこの耐性伝達フラグメントに連結することもできる
。かくして調製されたフラグメントは９例えばＡｄ　２
または酵母チトクロムＣ・プロモーターなどのような適
当な真核細胞性プロモーターの下側にクローニングでき
る。原核細胞性レプリコンと連結すると、ここでは例と
してプラスミドｐＧＤ／、ｐＧＤ、２．ｐＧＤＪおよび
ｐＧ　Ｄ４！などが挙げられているがこれらの構成は真
核性および原核性宿主細胞において機能性であり、かく
して本発明の範囲内にある。更に珍種々の真核細胞性プ
ロモーターを含むこの他の構成を作ることができ、ある
特定の宿主を用いる場合にはある真核細胞性プロモータ
ーおよび構成が他のもの以上に好適であることが当業者
にはよくわかるし、自明なことである。

特定のハイグロマイシンＢおよびＧ＆／Ｊ’ｉ４性遺伝
子および制限因子は２例に挙げたプラスミドであるｐＫ
ｃ２１１１．ｐＫｃ２１！、ｐＧＤ／、ｐＧＤコ、ｐＧ
Ｄ３およびｐＧＤ＆において例証されているが、この遺
伝子はプラスミドＰＫＣ，２０Ｊからの７３；ｋ　ｂの
フラグメントを含む。また、このｌＣ■フラグメントの
内部には耐性をコード化するＤＮＡ配列が更に、２．ｊ
ｋ　ｂのＳａ　ｌ　Ｉ　／　町ＩＩ［フラグメントに局
在化しの一部として表わす。プラスミドｐＫＣ２，２２
ｇｉ特定の抗生物質に対する耐性を°伝える個々の遺伝
子と制御因子を単離するのに有用である。例えば。

プラスミドｐ　ＫＣ２２２の／Ｊｌ’ｋｂのＢｇｌ■／
シリエフラグメントはハイグロマイシンＢ耐性遺伝子お
よび制御因子を含むが＋／、４ｊｋｂのＥｃｏＲＩ／５
ａｌＪフラグメントはａｔｔｉｒに対する耐性を伝達す
る遺伝子および制御因子を含む。更にまた。

Ｇ１１ｌｆに対する耐性を伝達する遺伝子および関連制
御因子は同時に例えばＥ、コリなどの感受性宿主におい
て抗生物質アブラマイシンおよびトブラマイシンに対す
る耐性も伝達すると考えられる。

したがって、１つ、１つ以上、または全ての抗生物質に
対して耐性を伝達する組み替えＤＮＡクローニング・ベ
クターは適当な真核細胞性プロモーターの下側に適当な
プラスミドＰＫＣ，２θ３またはｐＫｃ、２２２　　Ｄ
　Ｎ　Ａフラグメントをクローニングすることによって
構成することができる。原核細胞性レプリコンを供給す
ると、プラスミドｐＧＤ　／θ。

ｐＧＤ／ノ、ｐＧＤ１２．ｐＧＤ／３．ｐｃＩ）１ｇ　
およびｐＧＤｉ３がここでは例に挙げられているがこれ
らのベクターは真核およ・び原核細胞性宿主の両方にお
いて機能性でありかくして本−萌□の範囲内にある。

本発明がＧｇ／♂耐性遺伝子の上述した付加的耐性伝達
能力により何ら制限されないのは明らかでプラスミドｐ
Ｋｃ２０３からの７．ｔｋｂの町ｄｌ’［フラグメント
は原核細胞性レプリコンをも含むので自身で連結してプ
ラスミドを形成することができる。得られるプラスミド
をｐＳＣ７θｌ　と表わすが。

このプラスミドはＥ、コリにおいて機能性であり。

出発物質として有用な誘導体プラスミドを産生ずるのに
有益である。かくして、プラスミドｐＳＣ■ ７０／ＤＮＡはｌａｅ消化され、連結してプラスミド−
△ ｐＫｃ２５７およびｐ　ＫＣ２！；　９　を得る。プラ
スミドｐＫｃ、２ｊ７は〜１Ａ２ｋｂでありハイグロマ
イシンＢに対する耐性を伝達するが、一方プラスミドｐ
ＫＣ２３９は〜よθでありハイグロマイシンＢおよびア
ブラマイシンの両方に対する耐性を伝達スル。

プラスミドｐＫＣ，２ｊ７　Ｄ　Ｎ　Ａを声四３ＡＩ消
化して連結するとかなり小きなプラスミドを生じるが。

これをｐＫｃ２Ｊ／　と表′ワす。このプラスミドもハ
□　、。

イグロマイシンＢに対す□゛る耐性を伝達する。

上記の誘導体プラスミドはＥ、コリにおいて機能性で本
発明のベクターを構成するための出発物質として有用で
ある。かくして、プラスミドＩＫＣ２！；９ヲｐＳＶｊ
　ｇｐｔ　ニ挿入ス；Ｓドブ−＞　スｉ　Ｆ　ｐＬＯ３
１１ＡおよびｐＬＯ３１！を生じる；プラスミドｐＫｃ
２ｊ７ヲＰＳＶｊ　ｇｐｔ　ニ挿入スルドブラスミドｐ
Ｌ０３１６およびｐＬＯＪ／７を生じる；そして、プラ
スミドｐＫｃ２６１　ヲｐＳＶｊ’　ｇｐｔ　ニ挿入ス
ルトフラスミドｐＬＯ３１１およびｐ　ＬＯ３／　９　
を生じる。前述のＰＬＯプラスミドは全て原核性および
真核性宿主細胞の両方において機能性で、かくして本発
明の範囲内である。

更に別のプラスミド出発物質も構成することができ−る
。例えば、プラスミドｐＵＲ２２２からのｐｌａｃを含
むＨａｅｌ［制限フラグメント［その構成はリューチル
（ｍ１ｈｅｒ　）によりヌクレイツク・アシツズーリ４
）−チ（Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅ５ｅａｒｃ
ｈ　）　ｔ　９　：１ｔ０１ｒ７　、　（／　９ｌｆ年
）に開示されている］をプラスミドｐＫＣ２４／に挿入
するとプラスミドｐＫｃＪ７ｊを生じる。プラスミドｐ
　ＫＧ　２７　！；　は〜３，６ｋｂであり、ハイグロ
マイシンＢに対する耐性を伝達し・プラスミドｐｓＶｊ
　ｇｐｔに挿入して例示されたプラスミドｐＬＯ３２θ
およびｐＬＯ３２１を形成することができる。更には、
プラスミドＹＥｐ、２＆からの２μＤＮＡを含む制限フ
ラグメントをｐＫＣ２５９に挿入するとプラスミドＰＫ
Ｃ２Ａｌｌ−を生じる。ＩＩ椹スベＸＸ＼＼鳳＼ｐＫＣ
２ｊ９からの〜２５ｋｂシ已ＩＩ／５ａｌｌフラグメン
トを適当に切断したＹ　Ｅ　ｐ　２１１に挿入するとプ
ラスミドｐ　Ｋ　Ｃ２７３を生じる。そして、プラスミ
ドｐＫＣ，２６ｇからの〜３．２ｋ　ｂのＰｓｔエフラ
グメントをｐＢＲＪ２２に挿入するとプラスミドｐ　Ｌ
　Ｏ３７１を生じる。プラスミドｐＬＯ−３７ざとｐＫ
Ｃ，２’７？　は共に、酵母およびＥ、コリにおいて機
能性であるので本発明の範囲内にある。

前述のプラスミド出発物質を用いた前述のおよびその他
のベクターの構成は更により明確に以下の実施例２Ｓか
らり２に開示されている。

ハイグロマイシンＢおよびＧｇ／♂のどちらか一方ある
いは両方に対する耐性をやはり伝達する更にその他のＤ
ＮＡ配列を構成または単離することができること、およ
びこれらの配列をここに例として挙げた耐性遺伝子およ
び制御因子の代わりに使うことができることは当業者に
明らかである。

更には、７ｊｋｂのジｄ■フラグメントまたはコ、ｊｋ
ｂのＳａｌ　ｌ　／　ＢｇＵ■サブフググメントの機能
的な誘導体は遺伝子コドンに従っである特定のヌクレオ
チドを付加、脱離または置換することにより構成できる
。このような誘導体ならびにその他のハイグロマイシン
Ｂおよびａａｔｒ耐性伝達ＤＮＡ断片を用いると本発明
の範囲内にあるベクターを生じることは当業者が理解し
得るところである。

例示したプラスミドにおいてここで例に挙げた原核細胞
性レプリコンはプラスミドｐＢＲＪ、２．２レプリコン
であるが、同様の構成をなすのに他の多くのレプリコン
も用いることができる。他の例示される真核細胞性レプ
リコンとしてはｅ　ｐＢＭ／レプリコン［Ｂｅｔｌａｃ
ｈ　ａｔ　ａｌ、　ｓ　１９７６　ｔ　Ｆｅｄ、　Ｐｒ
ｏｃ、　３３：２０３り］　、ＮＲ／　レプリコン［Ｒ
ｏｗｎｄ　ａｎｄ　Ｍｉｄｃｅｌ　。

１９り八Ｎａｔｕｒｅ　２３１ｅ、０コ、　ＲＫ、２レ
プリコン［Ｂｅｒｉｎｇｅｒ　＊　１９７ｔｌ　＊　Ｊ
、　Ｇｅｎ、　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、　ＩＩ　：　１１
１３　ｓｍ９レプリコン［ｋｏｎｔｏｍｉｃｈａｌｐｕ
　ａｔ　ａｌ、ｓ　１９りＯ９Ｊ、　Ｂａｃｔｅｒｉｏ
ｌ、　ＩＯ’Ａ　：　３４４］　−ｐ８Ｃ１０ルプリコ
ンロＣｏｈｅｎ　ａｎｄ　Ｃｈａｎｇ　＋　／　９り７
　＋　Ｊ、Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、　／　３２　：　７３
１１コ　、ＲＰ／レブリ＝ｙ　ン［Ｇｒｉｎｓｔｅｄ　
ｅｔ　ａｌ、、　／９７２　ｓ　Ｊ。

Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、　１１０　：ｊ２９］、　Ｒｐｇ
レプリコ：／　［／　９７７−Ｎａｇａｈａｒｉ　ｅｔ
　ａｌ、　、　Ｇｅｎｅ　／　：　／Ｑ／］　　＋　Ｒ
８Ｆ　１０１θレプリ：ｌ　ン［Ｇｕｅｒｒｙ　ｅｔ　
ａｌ、　、　／９り４！　、　Ｊ、Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ
、　１１７　：６／９コ、ＰＵＢ／１０レプリ：ｌ　ン
［Ｇｒｙｃｉａｎ　、　ｅｔ　ａｌ、　。

１９７１　、　Ｊ、Ｂａｅｔｅｒｉｏｌ、　１３ｕ　：
　３１．ｒコおよび５ＬＰｔ、２レブリ：ｌ　：／　［
Ｂｉｂｂ　ｅｔ　ｉ　、　Ｎａｔｕｒｅ　２１４Ａ　：
　３２６コが包含されるがこれらに制限されるわ、けで
はない。

多くの更に別の原核細胞性レプリコンを構成することが
でき、一般的に、ある特定の宿主を用いる場合にはある
原核細胞性レプリコンが他のもの以上に好適であり選択
され得るという仁とが当業者にはよくわかるし、自明な
ことである。例えば。

ＲＢＦｌｏｌｏ、ＰＵＢｌｌＯおよび５ＬＰｔ、！レプ
リコンは各々シュードモナス（ｐｓｅｕｄｏｍｏｍｓ　
）　＊バチルス。

（Ｂａｃｉ　ｌ　ｌｕｓ　）　　お１よびストレブトマ
イセｘ　（Ｓｔｒｅｐｔｏ−ｍｙｃｅｓ）属に使馴二１
が好まし乱、一方、上で引用したその他のレプリコンは
にコリに使うのが好ましい。

、　　　　本発明（１＞Ｒ’）ｌ−は非常に可転性１り
殆４どどんな原核性および真核性宿主細胞においても機
能性である。必要な要件は、／）宿主細胞が分裂および
培養できること；、２）宿主細胞が形質転換できること
；３）非形質転換宿主細胞がハイグロマイシンＢおよび
Ｇ１１ｌｔのどちらか一方または両方に感受性でしたが
って死滅してしまうこと。

のみである。故に９本ベクターは細菌類、菌類。

酵母、植物細胞、動物細胞および自由生活型単細胞真核
生物に有用である。

Ｅ、コリＫ１２に関する遺伝子のおよび生化学上の情報
が豊富であるほどＥ、コリＫｌコは本発明の目的のため
の便利な好適な原核性宿主細胞となる。

ｔｉｌｉｓ）、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａ
ｓ　）　、アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｌｍｅｔｅｒ
ｉｕｍ）　ｓ　、にトレプトマイセｘ　（８ｔｒａｐｔ
ｏｍｙｅｅｓ　）　＊スタフィロコッカス（Ｓ−−ｐｂ
ｙｌｏｃｏｅｃｕｓ　）　、　ｘトレプトコツカｘ　（
８ｔｒａｐｔｏ−ｃｏｃｃｕｓ　）　、　７クチノマイ
セテｘ　（Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔａｓ　）およびセラ
チア（５ｅｒｒａｔｉａ　）が包含されるがこれらに限
定されるわけではない］および藍藻類である。

好適な真核性宿主細胞は、かび類［！イロスポラ（ＮＬ
Ｉｕｒｏｓｐｏｒａ　）　ｓセファロスポリウム（Ｃｅ
ｐｈａｌｏｓ　−ｐｏｒｉｕｍ　）　ｓ　７　スペルギ
ルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　）　、ペニシリウム（
Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）および酵母が包含されるがこ
れらに限定されるわけではないコ　、多細胞有機体の組
織由来の培養しやすい細胞［＠乳類の細の細胞、を索動
物門の動物由来の細胞、動物細胞。

植物細胞、裸子植物細胞および被子植物細胞を包含する
がこれらに限定されるわけではないコおよび自由生活型
単細胞有機体［藻類および原生動物を包含するがこれら
に限定されない］である。

上記の如く９本発明のベクターは、事実上どんなタイプ
の原核性および真核性宿主細胞にも機能性であり９例え
ばＥ、コリＫＩ２ＢＥｔ２７　、Ｅ、コリＫ　／　２１
１１りｌｒ３ｍ　　Ｋ、：ｌすＫ　／　、ｌ　ＢＢ１０
４Ａ１．　？　’７　ＸＬｔｋ−細胞およびサラカロマ
イセス・セレヴイシニー（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ
　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ　）　などのハイグロマイシン
ＢおよびＧ１１ｌｌ感受性細胞に所望の抗生物質耐性を
伝達する。かくして９本発明の被形質転換体［例示され
た被形質転換体であるＥ、コリＫ　／　２　ＢＥＩ２７
／ＰＫＣ２１ｕ　　、Ｅ、ニア　　！Ｊ　Ｋ　／　ＪＢ
ＥＪＪ７／ｐＫＣ２１１，マウスＬｔｋ　／ｐＫｃ、２
／ｇ、マウスＩ、ｔｋ−／ｐＫｃ２１！、　Ｅ、コリＫ
１２　　Ｂ’Ｅ７１ｒ３／ｐＫｃ２７３　およびサツカ
ロマイセス・セレヴイシエ−／ＰＫＣ２７３を包含する
がこれらに限定されるわけではない］は前述の抗生物質
のどちらか一方または両方に対する耐性を表現している
ので、適当な選別条件のもとで本ベクターを増殖させ保
持するのに有用である。更に、非選択的な構造遺伝子を
ベクターにクローニングできることおよび形質転換して
引き続きハイグロマイシンＢまたはａａｉｔ選別圧力下
で哺乳類またはその他の宿主細胞中にて培養するとクロ
ーニングされた遺伝子を安定化し保持し表現できる乙と
が当業者薯と理解され得る。かくして形質転換された宿
主細胞だけがノ）イグロマイシンＢまたはａｕｔｔの存
在下で生き残れるので本び初期同定を可能にする。

本発明のベクターで形質転換できる宿主細胞の大部分は
、原核性宿主細胞において真核細胞性ベクターをたやす
く増巾し操作できるようにするので重要である。このこ
とは１例えばＥ、コリといった原核生物に関する遺伝学
的背景はよく知られていて従来の組み替えＤＮＡの方法
をこの系に応用でき簡便に行なえるので特に都合が良い
。したがって本組み替、１１７ＤＮＡクローニング・ベ
クターを選択的または非選択的構造遺伝子を含有するも
のを含めてまず原核細胞中で操作して増巾しそののち真
核性宿主細胞に移入して形質表現させることができ、か
くしてもっばら真核細胞系に制限されてきたことに伴う
重大な問題を解消することができる。

本発明の全ての具体的内容は有用であるが・本組み替え
ＤＮＡりｄ′昭ニング・ベクターおよび被形質転換体の
あるものはさらに好ましい。したがって、好適なベクタ
ーはプラスミドｐＫｃ２１ｕｐＫＣ，２／ｊならびにＰ
ＫＣ２り３であり、好適な原核細胞性被形質転換体はＥ
、コ＋Ｊ　Ｋ　／　Ｊ　ＢＥＩ２７／ｐＫｃ２／４！　
　、　Ｅ、コリＫｔ２ＢＥ１２り／ｐＫＣコｌｊならび
にＥ、コリＫ　ｔ２ＢＥ７１３／ｐＫＣコア３であり。

好適な真核細胞性被形質転換体はマウスＬｔｋ−／ｐＫ
Ｃ，２／μ、マウスＬｔｋ−／ｐＫ（，２／ｊならびに
サツカロマイセス・セレヴイシエ−／ｐＫＣ，？り３で
ある。

（以下余白） 本発明のベクターおよび被形質転換体の効用は広く０組
み替えＤＮＡ技術を真核細胞系により大きくより迅速に
適用できるようにする。例えば。

プラスミド纂バクテリオファージおよびウィルスを含め
た本ベクターの、真核細胞および原核細胞に共に毒性を
有する抗生物質に対する耐性を伝達する能力は、被形質
転換体を選別する機能試験方法を提供する。このことは
、そのような試験がベクターＤＮＡを取得した特定の細
胞を決定し選別するのに実質上必要なので重要である。

その存在に関する機能試験方法が無い別のＤＮ・Ａ配列
が本ベクターに挿入でき、そののち非選択的ＤＮＡを含
む被形質転換体をハイグロマイシンＢまたはＧ’Ｉ−／
ｌｒ選別により単離することができる。この非選択的Ｄ
ＮＡ配列は９例えばフィブロネクチン（Ｂ　ａｎｔｉｇ
＠ｎ）（これらは共に翻訳後に真核細胞によもグリコジ
ル化したものであるが）などの翻訳後に修飾した蛋白質
を規定する遺伝子を包含するがこれらに限定されるわけ
ではない。

より詳しくは２例えば、プラスミドｐＫＣ，２θ３から
の、２，７．ｔｋｂのＳａｌ　Ｉ　／　Ｂｇｌ　Ｉ［制
限フラグメントを含む９例えば例示したプラスミドｐＧ
Ｄ／４ｔｕよびｐＧＤ／ｊなどのプラスミドのＲｖｕ　
１部位に非選択的遺伝子配列を挿入できる。このような
挿入によりハイグロマイシンＢ耐性遺伝子は不活化され
、かくして組み替えプラスミドを含む被形質転換体を簡
単に取り出せる。それには、まずＧ’ｌ／ｆ耐性かどう
かで選別し１次にハイグロマイシンＢに対して耐性でな
いＧ４（／ｆ耐耐性形形質転換体取り出すことにより行
なう。同様に、意味のある遺伝子配列を例えばＸｈｏ１
部位に挿入するとＧ＆／ざ耐性遺伝子を不活化する。か
くして、この組み替えプラスミドを保有する被形質転換
体もまたハイグロマイシンＢ耐性かどうかでまず選別し
１次にａｕＨに対して耐性でないハイグロマイシンＢ耐
性被形質転換体を同定する９とにより容易に同定できる
。それ故に、真核細龜性または原核細胞性被形質転換体
において抗生物質耐性かどうかで選別する能力により、
意味のある特定の非選択性ことができる。

上述したように、抗生物質耐性による機能試験は制御因
子として働いて個々の抗生物質耐性遺伝子の形質表現を
管理しているＤＮＡ配列を同定するのにも用いることが
できる。このような配列〔プロモーター、アテニュエイ
タ−（ａｔｔｅｎｕａｔｏｒ　’）　＊リプレッサーー
インデューサーふりボゾーム結合部位などを包含する＼
＼がこれらに限定されるわけではない〕ｉよ真核細胞お
よび原核細胞の両方において他の構造遺伝子の形質表現
を制御するのに用いることができる。

本発明のハイグロマイシンＢおよびＧ４ｔ／？耐性伝達
ベクターはまた種々の連結したＤＮＡ配列を安定化する
のにも有用である。ハイグロマイシンＢまたはＧ４（／
ざ耐性遺伝子に共有結合で連結して゛いて真核細胞か原
核細胞のどちらかで増殖した遺、： 伝子またはフラグメ、ン゛４トは、形質転換していない
細胞には有毒な程度のハイグロマイシンＢまたはＧｇ／
♂に被形質転換体をさらにしても保持することができる
。したがって、ベクターを失なった被形質転換体および
その結果共有結合で連結したＤＮＡは死滅し培養液から
排除される。かくして。

本発明のベクターは意味のあるＤＮＡ配列を安定化し保
持できる。

本発明のクローニング・ベクターおよび被形質転換体は
、真核細胞において非修飾のおよび翻訳後に修飾された
ポリペプチドの両方の商業上実行可能な製造を提供する
だけでなく原核細胞および真核細胞で一般に製造される
種々の生産物の収率を改善する。このような生産物の例
としては、ストレフトマイシン、チロシン、セファロス
ホリン。

アクタプラニン、生合成インシュリン、生合成ヒトイン
シュリン、　生合成ヒトプロインシュリン。

生合成インターフェロンおよび生合成ヒトインターフェ
ロンが包含されるがこれらに限定されない。

本発明はまたｌ）商業上重要な蛋白質２）商業上重要な
工法や化合物に導く代謝系路における酵素的作用３）遺
伝子表現を改善する制限因子、をコード化するＤＮＡ配
列を同定し特色づけ再構成するのに用いることのできる
選択的ベクターを提供する。これらの所望のＤＮＡ配列
は、炭化水素の生物学的劣化（ｂｉｏｄｅｇｒａｄａｔ
ｉｏｎ）　、または例えばセファロスポリン、チロシン
およびアクタフラニン誘導体などの抗生物質誘導体、ま
たは抗生物質その他の生産物の生物学的方法による製造
を中介し増加させる酵素をコード化するＤＮＡを包含す
るがこれらに制限されるわけではない。このようなりＮ
Ａ配列を真核細胞および原核細胞に挿入して安定化でき
ることは９組み替えＤＮＡ法を用いである特定の抗生物
質および翻訳後に修飾した蛋白質を作るのには真核細胞
性宿主が必要であるので重要である。その上１本ベクタ
ーは例えばＥ、コリなとの原核細胞で機能性であり得る
ので簡単に操作し増巾させることができ、かくしてこの
ような操作が不可能ではないにしろ困難な真核細胞に伴
なう問題を解消することができる。

本発明は更に１体内の寄生動物、病原菌および他の伝染
性物質を排除することを意図した抗生物質の強力な支配
に比較的よく耐えることができる新しい種または株の多
細胞有機体の構成を提供する。例えば１本発明のハイグ
ロマイシンＢまたはＧ４ｔ／ｆ耐性遺伝子を個々、また
は−緒に生殖細胞または初期胎細胞に挿入してこれらの
抗生物質に非常に耐性の多細胞有機体を創造することが
できる。

それ故に５例えば豚、牛および羊などの耐性多細胞種は
、成長を遅らせ体力を減弱させる物質を生じさせる有害
な寄生動物や感染症をより良く制御することを要求され
る抗生物質に高濃度までより耐えられるようになる。

以下の実施例により本発明の実施態様を詳細に提示する
。本発明を構成する説明と実処方手続を必要に応じて記
載する。

（以下余白） プラスミドｐＫＣ，２θ３ Ｅ−１’）ＪＲ，！２！；　（ＡＴＣＣＮ、ｏ、３／９
／２）を従来の微生物学的方法に従って抗生物質ハイグ
ロマイシンＢ　（ｈｙｇｒｏｍｙｅｉｎＢ）　（／　０
　ＯＮ／ｍｌ　）を含むＴＹ培坤（１％トリプトン、９
５％酵母エキス、θＳ％塩化ナトリウム、ｐＨ７ｇ）で
培養した。１７時間培養したのち、培養液のうち約０３
ｍ１をｉ！；ｍｌのエッペンドルフ（Ｅｐｐｅｎｄ、ｏ
ｒｆ　）試験管に移し約／ｊ秒間遠心分離した。特に記
載のない場合は全ての操作は室温で行なった。得られた
上清を先にチップのついた吸引器（ｆｉｎｅ−ｔｉｐａ
ｓｐｉｒａｔｏｒ）で注意深く取り除いて、細胞沈渣を
リゾチーム（２１１１１／ｓｌ）、ｊＯｒｎＭグルコー
ス。

／７７ｍＭＣＤＴＡ（シクロヘキサン・ジアミンテトラ
アセテート）およｐ　２３　ｍ　Ｍ　）リス−塩酸（ｐ
Ｈｚｏ）からなる新たに調製したりゾチーム溶液（約１
００ｔｄ）に懸濁した。０″Ｃで３０分間培養したのち
、アルカリ性ＳＤＳ　（ドデシル硫酸ナト’）ラム）＃
’＆（０２Ｎ水酸化ナトリウム、１％５ＤＳ）（約２０
０ｐｌ）を添加し、試験管を穏やかにポルテックスにか
けて０℃で７５分間保持した。次に３Ｍ酢酸ナトリウム
（約ｌｓθｌｌ１）（酢酸ナトリウム（３モル）を極少
量の水に溶かし。

氷酢酸でｐＨＩＡｌｒに調整したのち／ｌにすることに
より調製）を添加し、試験管の内容物をインバージョン
（ｉｎｖｅｒｓｉｏｎ　）により数秒間穏やかに混和す
るとその間にＤＮＡのかたまり（ｃｌｏｔ　）が生成し
た。

試験管を０°Ｃで６ｇ分間保持したのちＳ分間遠心分離
するとほとんど透明な上清が得られた。上清（約０１１
ｍ１）を別の遠沈管に移しそこへ冷エタノール（７ｍｌ
）を加えた。遠沈管を一２θ″′Ｃで３０分間保持した
のち、得られた沈澱を遠心分離（２分間）により採取し
、上清は吸引器により除去した。かくして得られた沈渣
を／θθＩの０７Ｍ酢酸ナトリウム１１００Ｋトリス−
塩酸（ｐＨｒ）に溶解し、２倍量の冷エタノールを添加
することによって再沈澱させる。２ｇ°Ｃで７０分間保
持したのち、沈澱を上述のように遠心分離で採取すると
所望のＥ、コリＪＲ２２！；プラスεドＤＮＡが得られ
る。

Ｅ、コリＪＲＱ２！；プラスミドＤＮＡの沈渣を約１０
０１１１の０７Ｍ酢酸ナトリウム１００！；Ｍトリス−
塩酸（ｐＨｌ’）に溶解し、２倍量の冷エタノールで沈
澱させた。得られたプラスミドＤＮＡを採取し水または
希薄な緩衝液（約４ｔＯＪｉｌ）に溶解したのち、ペン
ジンクＣＷｅｎｓｉｎｋ）のセル（Ｃｅｌｌ）３：３／
３（１９７１１年）と本質的に同じ移入法でＥ、コリに
／２ＢＥ／ｒ２７に移入サセタ。Ｅ、：＋９に／２ＢＥ
ざ２７はメリーランド州（Ｗｈ　ｒｙ　ｌ　ａｎｄ　）
０ツクヴイル（Ｒｏｃｋｖｉ　ｌ　ｌｅ　）にあるアメ
リカン・タイプ・カルチャー・コレクション（Ａｍｅｒ
ｉｃａｎＴｙｐｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉ
ｏｎ）に寄託され保存菌となっているのでそこから何ら
制限な（ＡＴＣＣ３７９／／の番号のもとに誰でも手に
入れろことができる。得られた被形質転換体を抗生物質
ハイグロマイシンＢ（２００ＩＪｇ／ｍｌ）を含むＴＹ
寒天培地（１％トリプトン、０５％酵母エキス、２ｔ％
塩化ナトリウム、ｌ５％寒天、ＩＩＨ’２１）上で選別
した。ある被形質転換体はゲル電気泳動〔ラオ（Ｒａｏ
）とロジャーズ（Ｒｏｇｅｒｓ）、　／　９７１年〕お
よびその他の試験で示されるように大きなプラスミドと
比較的小さな（／３ｋｂ）プラスミドを共に含み、アン
ピシリンとハイグロマイシンＢの両抗生物質に耐性であ
った。またある被形質転換体は比較的小さな／、ｆｋｂ
のプラスミドのみを含み、抗生物質ハイグロマイシンＢ
およびＧ１１ｎｔに耐性であったがアンピシリンには感
受性であった。

後者のタイプの被形質転換体を抗生物質ハイグロマイシ
ンＢ（／ＩＰ／ｇ／）を含むＴＹ寒天培地に移植し標準
の微生物学的手段を用いて培養した。

得られた細胞から、実施例／Ａの方法に従って。

上述の／　ｊ　ｋｂハイグロマイレンＢおよび０１１１
！耐性伝達プラスミド、を単離した。以後これをプラス
ミドｐＫＣＪ７Ｊ　と表わす。プラスミドｐＫＣ２０３
耐性遺伝子が存在することは、一連の形質転換および選
別分析により確かめた。

実施例２ プラスミドｐＫＣ２０３ＤＮＡ　（約！Ｉ４）を製造元
の説明書に従って規定された条件下にｈ±■制限酵素で
処理した。１ｔｋｂ、ｊｔｋｂおよび０ｊｋｂのフラグ
メントが回収されるが、その中で７ｊｔｋｂのＢｇｌｌ
フラグメントが所望の抗生物質ハイグロマイシンＢおよ
びＧ４ｔ／ｒ耐性遺伝子ならびに制御因子を含んでいた
。この事は０通常は抗生物質ハイグロマイシンＢおよび
ａａｔｒに感受性である細胞が７　ｊ　ｋｂ　（り　！
！ＬＬ　ＩＩフラグメントを移入するとそれらの抗生゛
物質に耐性になるという一連の形譬“転換および選別分
析により確かめられた。

秦制限酵素と説明書は以下の所から容易に入手できる： ベセスダ・リサーチ・ラボラトリーズ・インコーホレイ
テッド； Ｂｅｔｈｅａｄａ　Ｒｅａｅａｒｅｈ　Ｌａｂｏｒａｔ
ｏｒｉｅｓ　Ｉｎ６゜Ｂｏｘ　６０１０ Ｒｏｅｋｖｉｌｌａ、Ｍａｒｙｌａｎｄ　２Ｑｌｆ３Ｑ
ベーリンガーｅマンハイム・バイオケミカルズ；Ｂｏｅ
ｈｒｉｎｇｅｒ　Ｍａｎｎｈｅｉｍ　Ｂｉｏｅｈｅｍｉ
ｃａ１ｇ７９’ｌ／　　ＣｍｓＣｍ５Ｌｌｅ　Ｄｒｉｖ
ｅＰ、　００ＢＯ！　ｊ　０１　／　４ Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、Ｉｎｄｉａｎａ　ｕｌｓ２
３０ニューイングランド・バイオラボラトリーズ・イン
コーホレイテッド Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏ　Ｌａｂｓ、、Ｉｎｅ
。

２ｆ３　　Ｃａｂｏｔ Ｂｅｖｅｒｌｙ、Ｍａｓｓａｅｈｕｓｅｔｔｓ　Ｏ／９
／！ｒリサーチ・プロダクツ Ｒｅ５ｅａｒｅｈ　Ｐｒｏｄｕｅｔｓ Ｍｉｌｅｓ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ　Ｉｎ６゜Ｅｌ
ｌｅ：ｈｕｒｔ、Ｉｎｄｉａｎａ　１１６！　／ｊ実施
例３ プラスミドｐＫＣ２／ｌＩ−およびｐＫＣ２／ｊならび
プラスミドｐＳＶｊｇｐｔは、その構成についてはマリ
ガン（Ｍｕ　ｌ　ｌ　ｉ　ｇａｎ　）とベルブｒＢｅｒ
ｇ）による記載〔Ｂｅ１ｅｒｎｏｅ、２０９（’Ｉ’１
ｔ３）：　／’７２２（／９７０年〕〕があるが、この
プラスミドはｇｐｔ遺伝子内部のＢｇｌｌに特異な部位
を持っている。以下に示すようにクローニングすること
により抗生物質ハイグロマイシンＢおよびＧｌｔ／を耐
性遺伝子の形質を表現できる。

ブー７　スＥ　Ｆ　ｐｓＶｊ　ｇｐｔＤＮＡ　（約３ｐ
ｇ　）　ヲ製造元の説明書に従って規定された条件下に
Ｂｇｌｌ［制限酵素で処理した。酵素を７０℃で５分間
加熱することにより不活化したのち、Ｄ、ＮＡ（約／ｐ
ｇ）をｐＫＣ２０３からとった７ｊｋｂのＢｇｌｌフラ
グメントとｌ：ｌの“比率で混和した。これらの７ラグ
メントを製造元の説明書に従って規定された条件下でＴ
４！ＤＮＡリガーゼを用いて結合した。

＊Ｔ４！ＤＮＡリガーゼおよび説明書は以下の所から容
易に入手できる： ベセスダ・リサーチ・ラボラトリーズ Ｂｅｔｈａｓｄａ　Ｒａ５ｅａｒｏｈ　Ｌａｂｏｒａｔ
ｏｒｉｅａＢｏｘ　６Ｉ１０ Ｒｏａｋｖｉｌ　Ｉｓ　、Ｍａｒｙｌａｎｄ　２０１　
ｊ　Ｏこの結合体をペンジンクのセル３：３／！（１９
り１年）と本質的に同じ移入法で、抗生物質アンピシリ
ンとアブラマイシンを各＃　／　００１１１１７１Ｉｊ
づつ含むＴＹプレート上でＥ、コリに／２　ＢＥｌｒ２
りに移入した。この組み替えクローンをアンピシリン（
／　００ｐｔｐ／ｍｌ　）および抗生物質ハイグロマイ
シンＢ（２００１４７露ｊ）を含むＴＹプレートに移植
した。抗生物質ハイグロマイシンＢ耐性組換えクローン
の約半数はプラスミドｐｖｃｃ２１ａ（第３図）を含み
、残りの半数はプラスミドｐＫＣＪ／ｊ（第ダ図）を含
んでいた。

上記の種々のクローン中のプラスミドＤＮＡを。

実施例／Ａの方法に従って単離し、制限酵素分析により
常法で識別した。この方法により、構成しに構成した被
形質転換クローン９　Ｋ／２ＢＥ♂２７／ｐＫＣ２／’
ＩおよびＥ、　ｓｏｌ　ｉ　Ｋ／、２　ＢＥｒ、ｌり／
ｐＫｃ２／ｊを取出し、続いてこれからの使用に供すべ
く単離した。

実施例１ マウスＬｔｋ−／ｐＫＣ２／ダの構成 マウスＬｉｋ−細胞をエールの塩（Ｅａｒｌｅ’ａ　５
ａｌｔ　）。

非必須アミノ酸〔イーグル（Ｅ亀ｇｌ・）、／９３９．
サイエンス、／３０’：Ｉｔ３２’Ｊ、１０９６　／Ｖ
新生子牛血清およびグ・ルタミン（２９２ｐｇ／ｄｌを
含んだ最小必須培地からなる培地中で細胞が一定の状態
に維持されるようになるまで常法で培養した。このよう
にして培養したマウスＬｔｋ−細胞に、ウィグラー（Ｗ
ｉｇｌｅｒ）等による方法（Ｐｒｏｓ、　Ｎａｔ、　Ａ
ｅａＬＢｅ　ｉ、　ＵＳム７−４（Ｊ）：　＜３７３（
１９７９年）〕と以下の点を除いて本質的に−じ方法で
プラスミドｐＫＣ■、。

２／４４を移入した。異なる点はｌ）プラスミドＤＮＡ
（１００〜３００ｍｇ）をリン酸カルシウムの沈澱（Ｌ
ｄ）中でそれぞれのプレートに加えたこと、２）培養培
地は上述のものであったことの２点である。約弘時間、
３り０Ｃで培養したのち。

培地を新しい培地と取り替え、細胞を更に２０時間培養
した。その際には、抗生物質ハイグロマイシンＢ選択圧
力をかけた。これは上記の培地に抗生物質ハイグロマイ
シンＢ　（約７３−１０００ｐｓ。

／ｌｌ１）をも合せて含んだ選択培地に培地を変えるこ
とにより行った。選択培地に好適な抗生物質の濃度は２
００Ｉ４／露ｊである。選択培地は第１８目の後１次は
その２日後、それから被形質転換クローンが出現する２
〜３週間にわたっては３日が経過スる毎に取も替えた。

コロニーはピペットを用いて手で採取し、絶えず選択圧
力下に保って大量培養で成育させた。このようにして培
養した抗生物質ハイグロマイシンＢ耐性細胞により所望
のマウスＬｉｋ−／ｐＫｃＪ／４（被形質転換体が得ら
れる。

実施例ｊ マウスＬｔｋ−／ｐＫｃ２／ｊの構成 マウスＬｔｋ−／ｐＫＣ−２／　、を細胞は、形質転換
過程においてプラスミドｐＫｃ、２．’ｌ　ＩＩの代り
にプラスミドｐＫＣ’２／ｊを用いろという点を除いて
は、実施例グの説明と本質的に同じ方法で得られた。か
くして得られた被形質転換体マウスＬｔｋ　／ｐＫｃ２
／ｊを大量培養で生育させた。

実施例６ プラスミドｐＫｃＪＯＪ　、　ｐＫＣ２／ダおよびｐＫ
Ｃ２／３の抗生物質ハイグロマイシンＢおよびＧ’Ｉ−
／ｒに対する耐性を伝える能力は、抗生物質の量をいろ
いろ変えた培地上での形質転換されたおよび形質転換さ
れていない虱コリおよびマウスＬｔｋ−細胞の成育を試
験して決定した。虱コリおよびマウスＬｉｋ−細胞に関
する培地および培養条件は実施例／Ａからグの各々に記
載されたのと本質的！ζ同じである。試験結果を以下の
表１および表２に示すが９表中、＃十′は成長したこと
を、ター′は成長しなかったことを、’ＮＥＴ”は試験
しなかったことを表わす。

実施例７ プラスミドｐＬＧ４４９はその構成についてはグアレン
チ（Ｇｕａｒｅｎｉｅ）とピタシュン（Ｐｔａｓｈｎｅ
　’）による記載（Ｐｒ　ｏｅ、　Ｎａｔ、　Ａｃａｄ
、　Ｓｃ　ｉ、　ＵＳＡ７＜５’　（’ｌ　）　：２／
９９（／９ｊｒ／年）〕があるが、これはチトクロムＣ
遺伝子の内部にＢａｍＨＩで制限される特異な部位を有
している。プラスミドＰＫＣ，２，θ３からとった７３
ｋｂのＢｇｌ’ｌフラグメントを以下のようにしてこの
部分にクローニングすることにより、抗生物質ハイグロ
マイシンＢ耐性遺伝子の形質を表現できる。、所望の挿
入は、　Ｂｇｌ　ＩＩフラグメントがＢａｍＨＩ、フラ
グメントのＳ′−拡張部と同一であるＧＡＴＣ配列をそ
のｊ′−拡張部に有しているので容ｄに行なえる。それ
故にＢｇｌｌｌフラグメントとＢａｍＨＩフラグメント
は符合して直接連結させて組み替え体會住ることができ
る。

プラスヱドｐＧＤ／およびＰＧＤ、２ならびにＥ、コリ
’に／、２ＢＥざ２７／ｐＧＤ／およびＥ、コリに／、
２　　ＢＥざ２７／　ＰＧＤ、２は、　Ｂａｎ…工部位
工部具的な部位を有するプラスミドｐＬＧ４＆９をプラ
スミドｐｓＶｔｇＰもの代わりに用いることを除いては
、実施例３ど本質的に同じ操作で得られる。Ｂｇｌ　ｌ
フラグメントの方向によりλ方向のプラスミドが得られ
る。プラスミドｐＧＤ／はＳａｌ／で制限される部位が
ｕｒａ遺伝子の最も近くにある組み替えプラスミドを表
わす。プラスミドｐＧＤ　、２はその逆方向のプラスミ
ドを表わす。

実施例１ 酵母（サツカロマイセス・セレヴイシエー）全従来技術
でよく知られている微生物学的方法により１％酵母エキ
ス７２％バクトー々ブトン（ｂａｃｔｏ−ｐｅｐｉｏｎ
　’）中で典型的方法で成・育させる。プラスミ′ニ ドｐＧＤ　／を酵母の中に移入、Ｊさ省るにはヒネン（
Ｈｉｎｎｅｎ）等の方法（Ｐｒｏｅ、　Ｎａｔ、　Ａｃ
ａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ７３：／９Ｚり（７９７ｇ年
）〕と本質的に同じ操作でンＢの致死量を培養培地に添
加することにより選別する。

実施例９ サツ力ロマイセスーセレヴイシェー／ｐＧＤ２の構成 所望の被形質転換体はプラスミドＰＧＤ、２をプラスミ
ドｐＧＤ／の代わりに用いることを除いては実施例ざと
本質的に同じ操作で得られる。

実施例１０ プラスミドルφ帽よ、その構成についてはツルニック（
Ｓｏｌｎｉｅｋ）のセル２１／−：／３！；（／９１ｒ
／年）に記載されているが、このプラスミドは地図座標
上“／Ｊ：４’（ＥｅｏＲＩ　）から／　ｌ−６（Ｈｉ
ｎｄｌｌ　）までの１　　　　　　　　□ 間に主要なア、デノウィルス２　（Ａｄｅｎｏｖｉｒｕ
ｓ　２；Ａｄ２）後期プロモーターを含んでいる。プラ
スミドｐＫＣ２０３からとった７ｊｋｂのＢｇｌｌｌフ
ラグメントをプラスミドｐφｑのＨｉｎｄｎ１部位にク
ローニングすることにより抗生物質ハイグロマイシンＢ
耐性遺伝子の形質を表現できる。

所望の構成を行なうには、ウルリツヒ（Ｕｌｌｒｉｃｈ
）等による方法（Ｓｅｉｅｎｅｅ　／９Ａ：／３１３（
１９７７年）〕と本質的に同じ操作で、Ｈｉｎｄｌｌ連
結物質（ｌｉｎｋｅｙ）を７５ｋｂのＢｇｌ　■フラグ
メントに加え。

得られた修飾フラグメントをＴ４ＺＤＮＡリガーゼを用
いてＨｉｎｄｌｌ処理したプラスミドｐφグに連結させ
るという常法による。Ｈｉｎｄｌｌ制限酵素とＴｇＤＮ
Ａ’Ｊガーゼ酵素は各々実施例λと３で引用した会社か
ら使用説明書と共に入手できる。７ｊｋｂのＢｇｌｌｌ
フラグメントとＨｉｎｄＩ［Ｉ連結物質を用意したのち
、そのフラグメントをプラスミドｐφグに連結させてプ
ラスミドｐＧＤ３およびｐＧＤｇを作るには実施例３と
本質的に同じ操作で行なう。引き続いてＥ、コリに／２
　ＢＥ♂２７に移入して玖コリに／２　　ＢＥｊｒ２７
／ｐＧＤ３およびＥ、コリに／、２　ＢＥざ２７／ｐＧ
Ｄｕを作るにも実施例３の操作に従って行なう。

実施例３および７で説明したように、挿入された耐性伝
達フラグメントの方向に依って２方向のプラスミドが生
成してくる。プラスミドｐＧＤ３は挿入された抗生物質
ハイグロマイシンＢ耐性伝達フラグメントの５ａｄ）に
よる制限部位がＭ２プロモーターのＥｅｏＲＩ部位に最
も近い組み替えプラスミドを表わす。プラスミドｐＧＤ
Ｑはその逆方向のプラスミドを表わす。

肇Ｈｉ　ｎｄ　ｍ　Ｃ（ｄ　（ＣＣＡＡＧＣＴＴＧＧ　
）、：］およびその他の連結物質はコラボレイティブ・
リサーチ゛・インコーホレイテッドｒｃｏｌｌａｂｏｒ
ａｔｉｖｅ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　ＩｎｃＩｌ。

／３１．！；　Ｍａｉｎ　５ｔｒｅｅｔ　、ＮＶａｌｔ
ｈａｍ、ＭＡ　Ｏ／２！’ｌ）で容易に入手できる。

実施例／／ マウスＬｔｋ　／ｐＧＤＪの構成 マウスＬｉｋ　／ｐＧＤ３を構成するには、プラスミド
ｐＧＤ３をプラスミドｐＫＣ２／ｇの代わりに用いるこ
とを除いては、実施例ｔと本質的に同じ操作で行なう。

実施例１２ マウスＬｔｋ−／ｐＧＤｇの構成 マウスＬｔｋ／ｐＧＤ＆を構成するには、プラスミドｐ
ＧＤ　４（をプラスミドｐＫＣ２／！の代わりに用いる
ことを除いては、実施例ダと本質的に同じ操作で行なう
。

実施例１３ プラスミドｐＫＣ２０３（約ｊ１１ｇ）を製造元の説明
書に従って規定された条件下に８ａｌ　ｌおよびＢｇｌ
　ｌ制限酵素で処理した。抗生物質ハイグロマイシンＢ
およびａａｉｚ耐性の遺伝子および制御因子を含む２り
ｊｋｂの７ラグメントは汎用される方法で回収した。

一一一一一一一−−−−−、・１）１ −制限酵素および説明書は実施例２で引用した所から得
ることができる。

プラスミドｐＫＣ７（約ｓｐｇ）は、その構成について
はラオ（Ｒａｏ）とロジャーズ（Ｒｏｇ・ｒｓ）による
記載（Ｇｏｎｅりニア９（／９り９年）〕があるが、コ
ノプラスミドを５ａｌｌとＢｇｌｌ制限酵素で処理した
。

酵素を７０℃で５分間加熱して不活化したのち。

ＤＮＡ（約ｌｎ）を／　：　／（２）比率でＰＫＣ２０
３からとつ？）Ｌ７ｊｋｂのＳａｌ　Ｉ　／　Ｂｇｌ　
ＩＩ　７ラグメントと混和した。フラグメントどおしは
、実施例３で引用した製造元の説明書に従って規定され
た条件下でＴｌｔＤＮＡリガーゼを用いて結合し、た。

得られたプラスミドｐ　ＫＣ２２２を実施例３と本質的
に同じ操作でＥ、コ９に／２　に移入すると、抗生物質
アンピシリン、ハイグロマイシンＩｌｌよびａａｔｒに
耐性が伝達されることがわかった。

実施例１１ の単離 所望のＤＮＡフラグメントは制限消化に際しＳａｇ■の
代もに８ａａ　ｌをＢｇｌ　ｌと共に用いることを除い
ては実施例／３Ａと本質的に同じ操作で単離した。

実施例／ｊ 所望のＤＮＡフラグメントは制限消化に際しＢｇｌ■よ
りもＥｅｏＲｌをＳ亀ＩＩと共に用いることを除いては
実施例／３にと本質的に同じ操作で単離した。

実施例１６ 所望のプラスミドは、プラスミド、ＫＣ２２２からとっ
たｉ５／ｋｂの８ａａ　Ｉ　／　Ｂｇｌ　ＩＩフラグメ
ントをプラスミド、ＫＣ２０３カらとツｔニア　ｊ　ｋ
ｂノＢｇｌ■フラグメントの代わりに使用することおよ
びＨｉｎｄｕ　連結物質よりもＢｇｌ　ｌ連結物質を抗
生物質耐性伝達フラグメントに付加することを除いては
、実施例３およびｌＯと本質的に同じ操作で構成する。

Ｂｇｌ　ｌ連結物質の付加した／！ｊ”／ｋｂのフラグ
メントは、実施例３と本質的に同じ方法でプラスミドｐ
ｓＶｊｇｐＬＯ中に挿入されろ。

実施例３および７で説明したように、挿入される抗生物
質耐性伝達フラグメントの方向に依って２方向のプラス
ミドが生成する。プラスミドｐＧＤＩＯは挿入されるハ
イグロマイシンＢ耐性伝達フラグメントのＡＶ亀！制限
部位がｇｐｔ遺伝子のＨｉｎｄ■部位の最も近くにある
組み替えプラスミドを表わす。プラスミドｐＧＤ／／は
その逆方向のプラスミドを表わす。

プラスミドｐＧＤ１０およびＰＧＤ／／をＥ、コリに１
２　ＢＢｒ２りに移入してそれぞれ較コＩＪＫ／２ＢＥ
１２り／ｐＧＤ１０および鳳′ｓＬ＼ＸＸＪ　’ｌｌｊ
＜刻鯉Ｘ１１ｉａｘＸ＼’ｉ、、演１．コ＋ＪＫ／２　
　ＢＥｔ２７／ｐＧＤ／／’に作るにも実施例３と本質
的に同じ操作で行なう。

実施例１７゜ マウスＬｔｋ　／ｐＧＤ＃）の構成 所望の構成は形質転換過程においてプラスミドｐＫＣ２
／４１の代りにプラスミドｐＧＤ１０を用いることを除
いては実施例１と本質的に同じ操作で行なう。かくして
得られたマウスＬｃｋ７／ｐＧＤ／θは大量培養で生育
させることができる。

実施例／ｒ マウスＬｔｋ−／ｐＧＤ／／の構成 所望の構成は形質転換過程においてプラスミド、ＫＣ２
／　４’の代りにプラスミドｐＧＤ／／を用いることを
除いては実施例１と同じ操作で行なう。かくして得られ
たマウスＬｉｋ−／ｐＧＤ／／は大量培養で生育させる
ことができる。

実施例１９ 所望のプラスミドは、プラスミドｐＫＣ２２２からとっ
た７４３ｋｂ　（Ｑ　ＥａｏＲＩ／Ｓａｌ　ｌフラグメ
ントをプラスミドｐＫＣ２０３からとった７　！ｋｂの
Ｂｇｌｌ−− フラグメントの代わりに用いることおよびＨｉｎｄ■連
結物質の代りにＢｇｌｌｊ連結物質を抗生物質耐性伝達
フラグメントに付加することを除いては。

実施例３およびｌθと本質的に同じ操作で構成する。Ｂ
ｇｌ　７１連結物質を付加した／、ｇｊｋｂの７ラグメ
ントを実施例３と本質的に同じ方法でプラスミドｐ　Ｓ
　Ｖ　ｊ　ｇ　ｐ　＊に挿入する。

実施例／４で説明したように、２方向のプラスミドが生
成する。プラｉＥドＰＧＤ／２は挿入されｔ：抗生物質
ａ４Ｉｉｔ耐性伝達フラグメントのＰａ＆１制限部位が
ｇＰｔ遺伝子のＨｉｎｄ　１１１部位の最も近くにある
組み替えプラスミドを表わす。グラスミドｐＧＤ／３は
その逆方向のプラスミドを表わす。

プラスミドｐＧＤ／２およびＰＧＤ／ｌをＥ、コリに／
２　ＢＥ／２７に移入してそれぞれＥ、コリに／２ＢＥ
ｔ２７／ｐＧＤ／２およびＥ、コリに／２　ＢＢＦ２７
／ｐＧＤ／’Ｊを生成するにも、被形質転換体を選別す
る際に抗生物質ハイグロマイシンＢの代りにＧμ／♂を
用いることを除いては、実施例３と本質的に同じ操作で
行なう。　　　′ 実施例コθ マウスＬｔｋ−／ｐＧＤ／２の構成 所望の構成は、形質転換過程においてグラスミドｐｘｃ
２７ｇの代りにプラスミドＰＧＤ／、２を用いることお
よび被形質転換体を選別する際に抗生物質ハイグロマイ
シンＢの代すにａｕｔｔを用いることを除いては、実施
例ｑと本質的に同じ操作で行なう。かくして得られたマ
ウスＬｔｋ−／ｐＧＤ／Ｊは大量培養で生育させること
ができる。

実施例２１ マウスＬｔｋ−／ｐＧＤ／Ｊの構成 所望の構成は、形質転換過程においてプラスミドｐＫｃ
Ｊ／４（の代りにプラスミドＰＧＤ／３を用いることお
よび被形質転換体を選別する際に抗生物質ハイグロマイ
シンＢの代りにａｔｉｒを用いることを除いては、実施
例１と本質的に同じ操作で行なう。かくして得られたマ
ウスＬｔ　ｋ７／ｐ　ＧＤ　／　３は大量培養で生育さ
せることができる。

実施例２２ プラスミドｐＫｃ２０３からとった！７５ｋｌ）の４工
１／Ｂ、Ｉｎフラグメントは実施例１３に記載した方法
に従って単離した。分子状の連結物質を、Ｈｉｎｄ■連
結物質の代りにＢｇｌｌ連結物質を用いろことを除いて
は、実施例１０の操作に従って付加した。

得られたフラグメントを実施例３と本質的に同じ方法で
プラスミドｐ８Ｖｊｇｐｔに挿入すると所望のプラスミ
ドを形成する。

実施例１６で説明したように、２方向のプラスミドが生
成す°る。プラスミドｐＧＤ／Ｑは、抗生物質耐性伝達
フラグメントのＡｖａ　ｌ制限部位がｇｐｔ遺伝子のＨ
ｉｎｄｌ１部位に最も近い組み、替えプラスミドを表わ
す。プラスミド、ＧＤ／ｊはその逆方向のプラスミドを
表わす。

プラスミドｐＧＤ／４（およびｐＧＤ／ｊをＥ、コリに
／２　Ｂ）Ｊ！７に移入してそれぞれＥ、コリに／２　
ＢＥ１２７／ｐＧＤ／４！およびＬコリＫＩ２ＢＥ１２
り／ｐＧＤ／３を生成するにも実施例３と本質的に同じ
操作で行なう。

実施例２３ 所望の構成は形質転換過程においてプラスミドｐＫＣ２
／ｕの代りにプラスミドｐＧＤ７１を用いることを除い
ては実施例グと本質的に同じ操作で行ナウ。かくして得
られたマウスＬｔｋ　／ｐＧＤ／＆　＋ｉ大量培地で生
育させることができる。

実施例２１ マウスＬｉｋ　／ｐＧＤ１５の構成 所望の構成は形質転換過程においてプラスミドｐＫＣ２
／’ｔの代りにプラスミドｐＧＤ／ｊを用いることを除
いては実施例グと本質的に同じ操作で行なう。かくして
得られたマウスＬｔｋ　／ｐＧＤ／１１．を大量培養で
生育させることができる。

実施例２ｊ フラ７．ｊドｐＫＣ２０３（実施例１で単離。約ｊｐ１
．ｊＩｔｇ）をＴＥ緩衝液（１０ｍＭトリス−塩酸。

ｐｕ、ｒθ、／ｍＭ　ＥＤＴＡ）、、ＤＴＴ（’１００
ｍＭジチオスレイトール、ｊｐ）、ＢＳＡ（牛血清アル
ブミン；／θθＯＷ／ｍｌ　、　！ｉｐ！　）　、水（
２６ｔｉ’）。

反応液（Ｓμ）中で３７°Ｃにて約７時間培養した。

７０″Ｃで５分間培養して反応を止めたのち、混合反応
液を氷冷してフェノールおよびクロロホルムとイソアミ
ルアルコールの２１ｔ　：　／混合液の各々で抽出しエ
タノールで沈澱させた。得られたＢｇｌ■制限フラグメ
ントをｊ　ｍＭ　Ｎａ１ｌ　　（ｊ　ｐ！　）に溶解し
連結した。連結はＢｇｌｌｌで制限されたＤＮＡ　（／
ｌｄ）を水（約３１ｔｄ　）、　１０ｍＭ　）、ＴＰ（
！；ｔｉ　’）　。

連結液　（ｊｐりおよびＴｌＤＮＡリガーゼ〔〜ｉｏ’
ニューイングランド・バイオ・ラボラトリーズ・ニーー
ッッ（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏ　Ｌａｂ　Ｕｎ
ｉｔｓ　’）　）　（／４）と１６＠Ｃで約１６時間反
応させることにより行なった。７０”Ｃで５分間培養し
て反応を止めた。

氷冷したのち、得られた連結した混合物を抗生物質ハイ
グロマイシンＢ（２００＊／＊ｌ）を含むＴＹプレート
上でべ斗ジンクの形質転換＼法（／９７’ｌ−年）と本
質的に同Ｂ方法でＥ、コリに／２　ＢＥｆ２７に移入す
る。ある被形質転換体は、ゲル電気泳動〔ラオ（Ｒａｏ
’）とロジャーズ（Ｒｏｇｅｒｓ）による；／９７ｇ年
〕およびその他の試験によって従来から示されているよ
うに所望の〜７３ｋｂＯプラスミドを含む。このような
被形質転換体をここではＥ。

コリに／２　ＢＥ１２７／ｐｓｃ７θ／と表わすが、こ
れを選別して抗生物質ハイグロマイシンＢ（２θＯｐｇ
／ｍｌ）を含むＴＹ寒天培地上に移植し、汎用される微
生物学的技術を用いて培養する。得られた細胞から実施
例／Ａと同じ方法でプラスミドｐＳＣ７θｌを単離する
。プラスミドｐｓｃ７０／中に抗生物質ハイグロマイシ
ンＢおよびＧ４Ｚ／♂耐性遺伝子が存在することは一連
の形質転換９選別および制限酵素分析により更に確かめ
られた。プラスミドｐ８ｃ７０／の制限部位と機能地図
を添付図の図６に示す。

秦Ｂｇｌｌ制限酵素用の反応液（／　ＯＸ　）は以下の
成分から調製した： ６００　ｍＭ　ＮａＣ１ ７００ｍＭ）リス−塩酸、ｐＨ７４！ ／　０　（）　ｉｎＭ　Ｍｇ　ＣＩ　Ｊ秦壷連結液は以
下の成分から調製した：！；００ｍＭ　トリス−塩酸、
呉２ｇ ２００　ｍＭジチオスレイトール ／　００　ｍＭ　Ｍｇ　ＣＩ　！ 実施例２６ 所望のプラスミドは、プラスミドｐＫｃ１０３　。

Ｂｇｌｌ制限酵素および反応液の代りにプラスミドｐｓ
ｃ７θ／、Ｈａａｌｌ制限酵素および反応液０を用いる
ことを除いては、実施例２ｊと本質的に同じ操作で生成
した。プラスミドｐｓｃ７θｌは／箇所以上のＨａｅｌ
制限部位を含むので、Ｈａｅｌ消化。

引き続いて連結を行なうと種々のプラスミドが生成する
。

得られる連結した物質は、所望のノ１イグロマイシンＢ
耐性伝達〜４４２ｋｂプラスミドｐＫＣ２，ｆ７なラヒ
にハイグロマイシンＢ、Ｇ４（／Ｊ’およびアブラマイ
シン耐性伝達〜まθｋｂプラスミドｐＫＣＪ−９を含ん
でおり、これを実施例２ｊの形質転換過程と本質的に同
じ方法でＥ、コリに／２ＢＥ７ざ３〔イリノイ州（Ｉｌ
ｌｉｎｏｉｓ　）ペオリ７（Ｐｅｏｒｉａ）にあるノー
ザン・リージョナル・リサーチ・ラボラトリ−（Ｎｏｒ
ｔｈｅｒｎ　Ｒｅ　’ｏｎａｌ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　Ｌ
ａｂｏｒａｔｏｒｙ）ｔ に寄託番号Ｂ−／！θ２θで寄託され永久保存菌株とな
っている〕に移入した。所望の被形質転換体を選別して
抗生物質ハイグロマイシンＢ（２０θＲ／ＩＩ／）を含
むＴＹ寒天培地上に移植し、汎用される微生物学的技術
を用いて別々に培養した。ｐＫＣ２ｊ７を含む被形質転
換体はハイグロマイシンＢ耐性の有無＋スクリーニング
する常法で容易に取出され、プラスミドｐＫＣ２ｊ９を
含む被形質転換体はアブラマイシンおよびハイグロマイ
シンＢ耐性の有無でスクリーニングして取出された。こ
れらの被形質転換体を、ここではＥ、コＩＪＫ／２ＢＥ
７ざ３／ｐＫＣ２！；７およびＥ、コリに／２　ＢＥ７
ｊｒ３／ｐＫＣ，２，５−９と表わすが・そ？各７７か
ら実施例昌と同じ方法で、プラスミドｐＫＣ２ｊ　７お
よびｐＫＣ２５９を単離し在。各々のプラスミドに抗生
物質耐性遺伝子が存在することは、一連の形質転換。

選別および制限酵素分析により更に解かめた。プラスミ
ドＰＫ（−２ｊ７およびｐＫＣ２！；９の各々の制限部
位と機能地図を添付図の図６および図７にそれぞれ示す
。

秦Ｈａｅｌ制限酵素用の反応液（１０Ｘ）は以下の成分
から調製した： ４７７ｍ、Ｍ）リス塩酸、ｐＨ７１ｔ ｔ　ＯｍＭ　ＭｇＣ１ａ 実施例２７ 所望のプラスミドは、プラスミドｐｓｃ７０／。

μ−−■制限酵素および反応液よりもプラスミドＰＫＣ
２！；　７　、　Ｓａｕ、？Ａ’Ｉ制限酵素および反応
液を用いることを除いては、実施例２ｊと本質的に同じ
操作ア生成自、所望撚、・＝、ユｉ　Ｆ　ＰＫＣユ、７
．よ〜３．２ｋｂでありハイグロマイシンＢに対する耐
性を伝達する。

得られる連結した物質を実施例２ｊと本質的に同じ形質
転換過程でＥ、コ！Ｊ　Ｋ７２　ＢＦ、７７３に移入す
る。被形質転換体をここではＥ、コリに／、２ＢＥ７ｇ
、？／ｐＫ（−２４／と表わすが、これを選別し、実施
例／Ａと同じ方法でプラスミドｐＫｃ２６／を単離する
。プラスミドｐＫＣ２ＡＩ中に抗生物質ハイグロマイシ
ンＢ耐性遺伝子が存在することは一連の形質転換９選別
およびＤＮＡ配列分析により更に確かめた。プラスミド
ｐＫｃ２６／の制限部位と機能地図を添付図の図７に示
す。

５ａｕＪＡＩ制限酵素用の反応液（１０Ｘ）は以下の成
分から調製した： ＳＯθｍＭ　　ＮａＣ１ ｔＯｍＭ　トリス−塩酸、　ｐＨＺ、ｊ！；　ＯｍＭ　
　Ｍｇｅｔ。

実施例２ｇ プラスミドｐＫＣ，２４／　（約ｊμ、！；ｐｙＹＣ実
施例２７で単離〕をＴＥ緩衝液、ＤＴＴ（ｊμ）。

ＢＳ　ＡＣ／　０００１１ｇ／ｍｌ、　ｊｐ！　）　、
水（２！；ｐ！　’）　。

Ｈａｅｌ制限酵素（３Ｉｄ、！；ユ＝ット）および／θ
Ｘ反応液（３；ｐｌ’）中で３７°Ｃにて約１時間培養
した。

７０”Ｃで５分間培養して反応を止めたのち０反応混合
液を氷冷してフェノールおよびクロロホルムとイソアミ
ルアルコールの２１４：／混合Ｆｉの各々で抽出し、エ
タノールで沈澱させた。得られたＨａｅｌｌ制御限フラ
グメントを３　ｍＭＮａｃｌ　（３１ｄ　’）に溶解し
た。

Ｂ、μＬ１１１［末端を含む〜３９４！ｎｔ　ｐｌａｅ
フラグメントの単離 プラスミドＰＵＲ２２２（約！ｐｌ　、　！；ｐｙ　）
　Ｃ実施例１と本質的に同じ操作でＥ、コ！Ｊ　Ｋ／２
　ＢＥ／＃、ｇ／ｐＵＲ２２２から単離〕を、完全で部
分的でない消化が確実番′と起こるように反応混合液を
３７℃で約２時間培養することを除いては実施例２♂Ａ
と本質的に同じ操作で、ＴＥ緩衝液中でＨａｅｌｌ消化
した。得られたＨａｅ　■制限フラグメントを５ｍＭＮ
ａＣ１（ｊ　Ｊ　）に溶解した。

Ｅ、コリに／２　ＢＥ／／６６／ｐＵＲ２２２はイリノ
イ州ペオリアにあるノーザン・リージョナル・リサーチ
・ラボラトリ−に寄託され永久保存菌株となっている菌
株であり、寄託番号Ｂ−＃θ２３の下にプラスミドｐＵ
Ｒ２２２の好適な供給源および貯臓物質として誰でも入
手できる。

Ｃ０連結および形質転換 プラスミドｐＫｃ２４／　、プラスミドｐＵＢ２２２Ｈ
ａ・■制限フラグメント（各々約４ＩＩｄ）（実施例２
７におよびＢでそれぞれ調製〕、水（３／〆）。

／　Ｑ　ｍＭ　ＡＴＰ　（ｊ　１４１　）　、連結液（
！ｐｌ）およびＴｌＤＮＡリガーゼ〔〜ｌＯへニーイン
グランド・バイオ・ラボラトリーズ・ユニツツ）　（／
ＰＩ’）を７３℃で約１６時間反応した。７０℃で５分
間培養して反応を止めたのち、得られた連結した物質を
氷冷した。そのＤＮＡをＥ、ｉすに／２　ＢＥ１０１７
／“：１１ （イリノイ州ペオリアにあるノーザン・リージョナル・
リサーチ・ラボラトリ−に寄託番号Ｂ−／３０２／のも
とに寄託され永久保存菌株となっている）に実施例２ｊ
と本質的に同じ形質転換過程で移入した。所望の〜、ｉ
、４ｋｂのプラスミドｐＫＣ２７３だけを含む被形質転
換体をＥ、コ！Ｊ　Ｋ／２ＢＥ１０１１１／ｐＫＣ２７
！と表わした。この被形質転換体を選別、移植、培養し
、続いてプラスミドを単離した。ｐｌａｅを含む〜３９
ｕｎ＊の７ラグメントが存在することおよびプラスミド
ｐＫｃ２７ｊの詳細な構造はゲル電気泳動および制限酵
素分析による常法で決定した。

プラスミドｐＫｃＪ４／は３箇所のＨａ・■制限部位を
有しているので９部分的にＨａ＠ｌ消化が起こる種々の
Ｈａｅｌフラグメントが混じって生成する。

したがって、上に例示した方法により、プラスミドｐＫ
Ｃ！７３およびプラスミドｐＫｃ２７ｊの種々の挿入部
位の違いによる異性体が生じる。約３９ダｎｔのｐｌａ
ｅを含むフ”ラグメントは２方向のうちのどちらにも連
結させることができるので２方向の一゛・。

組み替えプラスミドが□生成する。当業者ならば種々の
方向のプラスミド異性体およびその結果得られる被形質
転換体を容易に常法により単離し同定できることがわか
る。プラスミドｐＫＣ２７！の制限部位および機能地図
を添付図の図１に示す。

実施例２９ 所望の消化は、プラスミドｐＵＲ２２２、μａｅｌ制限
酵素および反応液の代りにプラスミドｐＫＣ２ｊ？、Ｅ
ｃｏＲＩ制限酵素および反応液５用いることを除いては
、実施例２１と本質的に同じ操作で行なった。得られた
ＫｏｏＲＩ制限フラグメントをｊｍＭＮａＣ１（ｊ　ｌ
ｄ　）　ｉｃ溶解した。

＊ＥａｏＲＩ制限酵素用反応液（１０Ｘ）は以下の成分
から調製した。

ｊ　００　ｍＭ　　ＮａＣｌ １００θｍＭ　　）リス−塩酸、ｐＨ７７ｊ　Ｑ　ｍＭ
　　ＭｇＣＩ　Ｊ １次のλμＤＮＡ単離用のプラスミドＹＥｐ、３４！の
ＥｅすＲＩ消化 プラスミドＹＥｐ２ｕを実施例１と本質的に同じ操作で
Ｅ、コリに／２　ＢＥ／／３９／ＹＥｐ２μから単離し
た。Ｅ、コリに／２　ＢＥ／／３９ｆＹＥｐ、Ｚダはイ
リノイ州ペオリアにあるノーザン・リージョナルーリサ
ーチ・ラボラトリ−に寄託され永久保存菌株となってい
る菌株である。これは寄託番号Ｂ−／　Ｊ’　０２２の
もとに上述プラスミドの好適な供給源および貯臓物質と
して誰でも入手できる。プラスミドＹＥｐ、Ｚダの所望
のＥｅｏＲＩ消化は実施例２９Ａと本質的に同じ操作で
行ない、得られたＥｅｏＲＩ制限フラグメントをｊ　ｍ
Ｗ　ＮａＣ１（ｊ　Ｉｄ、）に溶解した。

Ｃ０連結および形質転換 ＫｅｏＲＩで消化したプラスミドｐＫｃ２ｊ９およびプ
ラスミドＹｌｐＪ蓼（それぞれ実施例！９ＡおよびＢで
調製）を連結し、続いて実施例２１ｒＣと本質的に同じ
操作でにコリに／２　ＢＥ７ｒ３に移入した。所望の〜
７．ｌｋｂのハイグロマイシンＢ、アブラマイシンおよ
びＧｌｌ／ｊｒ耐性伝達プラスミドだけを含む被形質転
換体をＥ、コリに／２　ＢＥ７１３／ｐＫｃ２４４’と
表わす。この被形質転換体を常法で選別、移植、培養し
、続いてプラスミドを単離する。

コμＤＮＡがどちらの方向にも連結でき、したがって、
上述の方法によ昨プラスミドｐＫＣ２６μおよびその逆
方向のプラスミドが共に生成することは当業者には明ら
かである。種々のプラスミドおよびその結果得られる被
形質転換体を常法により容易に単離し取出すことができ
る。プラスミドｐＫＣ−２４４’の制限部位と機能地図
を添付図の図１に示す。

実施例３０ 所望の消化は、プラスＥ　！ｆ’、ｐＵＲ２２２および
Ｈａ・ｍ制限酵素および反応液の代わりにプラスミド、
ＫＣ２！９　、　Ｂｇｌ　ＩＩｌ制限酵素よび反応液を
用いることを除いては、実施例２１ｒＢと本質的に同Ｎ
ａＣ１に溶解する。

所望の消化は、プラスミドＰＵＲ２Ｊ　２　、Ｈａｅ　
ｍ制限酵素および反応液の代りにプラスミドｐＳｖｊ′
ｇｐｔ　、　Ｂｇｌ　ｍ制限酵素および反応液を用いる
ことを除いては、実施例２ＦＢと本質的に同じ操作で行
なった。得られたＢｇｌ［消化物はｊ　ｍＭ　ＮａＣ１
に溶解する。

Ｃ０連結および形質転換 所望の連結は、プラスミドｐＫｃ２６／およびｐＵＲ２
２２の代りにＢｇｌ　ｌ消化されたプラスミドｐＫＣ２
ｊ９）ｔＪ：びｐｓＶｊｇｐｔ　＋用いろこｊ：、、　
を除いては、実施例２ｒＣと本質的に同じ操作で行なう
。

得られた連結した物質をペンジンク（７９７ｇ年）と本
質的に同じ形質転換方法で抗生物質ハイグロマイシンＢ
（２０りＩＩｇ／ｓｌ）を含むＴＹプレー、よ１３□７
．に７ユＢＥ７ｒ３　＋ｃ＄いオ、。あ６被形質転換体
”は、常法のゲル電気泳動（ラオとロジャーズ、／９７
１年）およびその他の試験によりわかるように、所望の
プラスミドＰＬＯ，？／４’または所望のプラスミゾｐ
ＬＯ３／！；だけを含む。これらの被形質転換体を１選
別、移植、培養すると。

所望の被形質転換体マウスリに／２ＢＫ７♂３／ｐＬ０
３１μおよびＥ、フリに／２　［７ざ３／ｐＬＯ３／３
を構成する。これらの被形質転換体を次の所望プラスミ
ドｐＬＯ３／　４（およびｐＬＯ３／ｊの単離に供する
。

ＤＮＡ　７ラグメントは一方向のどちらの方向にも連結
するので２方向の組み替えプラスミドが生じる。制限酵
素および電気泳動分析による常法で所望のプラスミドが
容易に識別され取出されることが当業者には明らかであ
る。プラスミドｐ　Ｌ　Ｏ３／ＩＩ−およびｐＬＯ３／
　！の各々の制限部位と機能地図を添付図の図９に示す
。

実施例３１ マウスＬｔｋ−／ｐＬＯＪ／４’の構成所望の構成は、
プラスミドｐＫＣ２／ＩＩよりもプラスミドｐＬＯＪ／
ダを用いることを除いて、実施例１と本質的に同じ操作
で行なう。かくして得られた被形質転換体マウスＬｔｋ
　／ｐＬＯ３／　ＩＩは大量培養で生育させる。

実施例３２ マウスＬｔｋ／ｐＬｏ、？　／　ｊの構成所望の構成は
、プラスミドｐＫｃ２／４！の代りにプラスミドｐＬＯ
３／ｊを用いることを除いては。

実施例ダと本質的に同じ操作で行なう。かくして得られ
た被形質転換体マウスＬｔｋ　／ｐＬＯＪ　／　ｊは大
量培養で生育させる。

実施例３３ 所望の消イビは、プラスミドｐＵＲ２２２・Ｈｅｅｌ制
限酵素および反応液の代りにプラスミドｐＫＣ２！７　
、　Ｓａｃ　ｌ制限酵素および反応液を用いることを除
いては、実施例２♂Ｂと本質的に同じ操作で行なう。

Ｂｇｌｌｌ連結物質　をＳａｃ　■消化したプラスεド
ｐＫｃ２ｓ７末端に付加するには、セイント・ジョーン
（Ｓｔ、　Ｊｏｂｎ落の方法（Ｊ、Ｍｏ１．　Ｂｉｏｌ
、　／！；２：３／７　（１９１／年）〕と本質的に同
じ操作で行なう。

肇Ｓａｃ　Ｉ制限酵素用の反応液（／θＸ）は以下の成
分から調製する。

１＝　００　ｍＭ　　ＮａＣｌ １θＱｍＭ　　）リス−塩酸、ｐＨ７４＜／　００　ｍ
Ｍ　　ＭｇＣＩ　Ｊ 叢書Ｂｇ　ｌ　ｎ　Ｃ（ｄ　（ＣＡＧＡＴＣＴＧ）　）
およびその他の連結物質は容易に以下の所から入手でき
る：コラボレイテイブ・リサーチ・インコーホレイテッ
ド Ｃｏ１１ａｂｏｒａｔｉ−ｖｅ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　Ｉ
ｎｃ。

／３６！；　Ｍａｉｎ　Ｓｔｒｅｅｔ Ｗａｌｔｈａｍ　ＭＡ　０２／！；４４　’Ｂ、連結お
よび形質転換　□”″１ 実施例３０Ｃと本質的に同じ操作でＢｇｌ　ｆｌ末端を
有する直鎖状プラスミドｐＫｃ２３７をＢｇｌｌ消調製
）に連結する。連結したプラスミドを実施例３０Ｃでも
開示した方法でＥ、コリに／２　ＢＥ７ｆ３に移入する
。得られた被形質転換体にコ’Ｊ　Ｋ／２ＢＥ７ｒ３／
ｐＬＯ３／＆およびＥ、：＋　！Ｊ　Ｋ／２　ＢＥ７ｒ
３／ＰＬＯ３／７から所望のプラスミドｐＬＯ３／乙お
よびｐＬＯ３／７を単離する。実施例３０Ｃで説明した
ように、挿入された耐性伝達フラグメントの方向に依り
、２方向のプラスミドが生じる。これらのプラスミドお
よびその結果得られる被形質転換体は、常法により容易
に識別し取出すことができる。プラスミドｐＬＯ３／ｌ
、およびｐＬＯ３／７の各々の制限部位と機能地図を添
付図の図９に示す。

実施例３１ 所望の構成はそれぞれ、プラスミドｐＫＣ２／’ｌより
もプラスミド４’ｉ的ｔ６またはｐＬＯ３／７のどちら
かを用いることを除いては実施例グと本質的に同じ操作
で行なう。かくして得られた被形質転換体マウスＬｔｋ
　／ｐＬＯ３／　７はそれぞれ大量培養で成育させる。

実施例３ｊ 所望の構成は、プラスミドｐＫＣ，２５７の代りにプラ
スミドＰＫＣ２ｔ／を用いることを除いては。

実施例３３と本質的に同じ操作で行なう。得られる被形
質転換体Ｅ、コリに／、２　ＢＦ２ざ３／ｐＬＯ３／Ｉ
ｒおよびＥ、コリに／２　ＢＥ７ｒ３／ｐＬＯ３／９か
ら所望のプラスミドｐＬＯ３７ｇおよびｐＬＯＪ／９を
単離する。実施例３０Ｃで説明したように、挿入される
耐性伝達フラグメントの方向に依り２方向のプラスミド
が生じる。これらのプラスミドとその結果得られる被形
質転換体は、常法により容易に識別し取出すことができ
る。プラスミドｐＬＯ３／ｒおよびｐＬＯ３／９の各々
の制限部位と機能地図を添付図の図９に示す。　　　　
　　゛ 実施例３６ マウスＬｔ　ｋ　／　ｐＬＯＪ　／　ｒ　オよヒマウス
Ｌｔｋ／所望の構成はそれぞれ、プラスミドｐＫＣ２／
’Ｉ−の代りにプラスミドｐＬＯ３／　ｔまたはｐＬＯ
３／９のどちらかを用いることを除いては実施例１と本
質的に同じ操作で行なう。かくして得られた被形ｉ転換
体マウスＬｔｋ　／ｐＬＯ３／ざおよびマウスＬｔｋ　
／ｐＬＯ３／　９はそれぞれ大量培養で成育させる。

実施例３７ 所望の構成は、プラスミドｐＫＣ，１７の代りにプラス
ミドｐＫＣ２７！；を用いることを除いては。

実施例３３と本質的に同じ操作で行なう。得られ。

る被形質転換体Ｅ、コリに／２　ＢＥ１０４ｔ／／ｐＬ
Ｏ３２０およびＥ、コリＫ１２　ＢＥＩＯ弘／／ｐＬＯ
３２／　　から所望のプラス（ドｐＬＯ３２θおよびｐ
ＬＯ３２／を単離する。実施例３０Ｃで説明したように
、挿入される耐性伝達フラグメントの方向に依り２方向
のプラスミドが生じる。これらのプラスミドおよびその
結果得られる被形質転換体は、常法で容易に識別し取出
すことができる。プラスミドｐＬＯ３２０およびｐＬＯ
３２，／の各々の制限部位と機能地図を添付図の図９に
示す。

実施例３Ｆ 所望の構成はそれぞれ、プラスミドｐＫＣ２’／ｌの代
りにプラスミドｐＬｏ　３２０またはｐＬＯｊ２１のど
ちらかを用いることを除いては実施例１と本質的に同じ
操作で行なう。かくして得られた被形質転換体マウスＬ
ｔ　ｋｍ／ｐ　ＬＯ３２０およびマウスＬｔｋ　／ｐＬ
Ｏ３２／は各々大量培養で生育させる。

実施例３９ プラスミドｐＹＥｐ、Ｚｌｌ　（約ｓｓ、、５’〜）を
ＴＥ緩衝液、ＤＴＴ１５−Ｉｄ）、ＢＳＡ（１０θθｑ
／ｌｅ１．！；ｐｌ）、水（２！；　ｔｄ　）　、　Ｂ
ａｍＨＩ制限酵素（ｊμ、ｊユニツツ）および／θＸ反
応液”（ｊｐ！’）中にて、３７°Ｃで１時間１次いで
７０℃で５分間培養した。Ｂ　ａ　ｍＨＩ消化されたＤ
ＮＡを水冷し、エタノールで沈澱させ、１０ＸＳａｌｌ
緩衝液（反応液ゾ（３；ｐｌ）、ＤＴＴ（！；ｔｔｌ）
、ＢＳＡ（／θθθダ／ｍｌ　、　！；　ｔｉ　’）お
よび５ａｌ）制限酵素（ｊｐ！、！；ユニッッ）を加え
た水（３０ｐ！　）に溶解した。得られた混合液を３７
℃で７時間１次いで、７θ°Ｃで５分間培養し、最後に
ｔ℃まで冷却した。その混合液を次にフェノールおよび
クロロホルムとイソアミルアルコールの２４ｃ：／混合
液の各々で抽出し。

最終的にエタノールで沈澱させた。得られた沈渣は所望
の直鎖状ＤＮＡを含んでおり、　、ｊ　ｍＭＮａｃｌ（
！メ）に溶解して、その後の使用に供するためｌ″Ｃで
貯臓した。　　　□ はそれぞれ下記の成分から調製した２ ７５００ｍＭ　　ＮａＣ１ ｔＯｍＭ　　）リス−塩酸、　ｐＴ（７９ｔ　ＯｍＭ　
　Ｍｇ　ＣＩ　Ｊ 所望の直鎖状ＤＮＡは、プラスミドｐＹＥｐ２’ｌの代
りにプラスミドｐＫＣ２，３−９を用いることを除いて
は、実施例Ｊ９Ａと本質的に同じ操作で得られた。得ら
れた沈渣は所望の直鎖状ＤＮＡを含んでおり、　ｊ　ｍ
Ｍ　ＮａＣ１（！；　ｐｌ　’）に溶解して、その後の
使用に供するため＆’Ｃで貯臓した。

Ｃ０連結および形質転換 所望の連結およびＥ、コ’）Ｋ／２　ＢＥ７ｒ３への移
入は、プラスミドｐＵＲ，２２２およびｐＫｃ２６／か
らとったＨａｅ［フラグメントよりも実施例３９ｈおよ
びＢで調製したＤＮＡフラグメントを連結し続いて形質
転換を行なうことを除いては、実施例２♂Ｃと本質的に
同じ操作により行なった。得られた被形質転換体のうち
のあるものは１選別、ゲル電気泳動（ラオとロジャーズ
、／９７ｆ年）およびその他の試験による常法で示され
るように。

所望のプラスミドを含んでいた。この被形質転換体をＥ
、コリに／２　ＢＥ７ｒ３／ｐＫＣ２７３と表ワシ。

選別、移植、培養して、続いてプラスミドｐＫＣ２７３
を単離した。プラスミドｐＫＣ２７３の制限部位と機能
地図を添付図の図７０に示す。

実施例１１０ サツカロマイセス・セレヴイシエ−／ｐＫＣ２７３の構
成 酵母（サツカロマイナス・セレヴイシエー）を／％酵母
エキス７２％バクトーペプトン／１％グルコース中で従
来から知られている微生物学的方法を用いて生育させた
。プラスミドｐＫＣ２７３を酵母中に移入するには、ヒ
ネン等の方法（Ｐｒｏｃ。

Ｎａｔ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　７ｊ　：　
／９２９（／９７ｇ年）〕と本質的に同じ操作で行なっ
た。被形質転換体をウラシルを欠いた最小培地で成育す
る（　ｕｒａ＋表現型）能力により選別した。ｕｒａ＋
型被形質転換体を続いてハイグロマイシンＢ（２００η
／ＩＩ／）を添加した複合培地で生育する能力について
試験した。この薬物量は形質転換していない細胞に対し
ては致死的である。被形質転換体細胞サツカロマイセス
・セレヴイシェ−／ｐＫｃ２り３はこれらの培地で成育
するが、形質転換していないサツカロマイセスＩセレヴ
イシェーは死滅する。

実施例ｇ／ 所望の消化は、プラスミドＰＵＲ２２２およびＨａｎ■
制限酵素および反応液の代りにプラスミドｐＢＲＪ２．
２　、　ＰｓＬ　Ｉ制限酵素および反応液１を用いるこ
とを除いては、実施例２１”Ｂと本質的に同じ操作で行
なう。得られたＰｓｔ　ｌ消化物を、ｔｍＭＮｍＣｌ（
ｊメ）に溶解する。

−Ｐｓｔｌ制限酵素用の反応液（／　ＯＸ　’）は下記
の成分から調製した： ５００　ｍＭ　　ＮａＣＩ ４０ｍＭ）リス−塩酸、ｐｕＺｕ ｉｓ　ＯｍＭ　　Ｍｇ　ＣＩ　Ｊ 所望の消化は、プラスミドｐＢＲＪ２Ｊの代りにプラス
ミドｐｘｃ、２６ｇを用いることを除いては。

実施例ｇ／Ａと本質的に同じ操作で行なった。得られり
Ｐｓｔｌ消化物をｊ　ｍＭ　ＮａＣ１（に　ｌｄ　）　
ニ溶解した。

Ｃ０連結および形質転換 所望の連結およびＥ、コりＫ／２　ＢＥ７ｔ３への移入
は、プラスミドｐＵＲ２２２およびｐＫｃ２ｔ／からと
ったＨａａ［フラグメントの代りに、実施４５Ｆ／Ａお
よびＢで調製したＤＮＡフラグメントを連結して続いて
形質転換することを除いては、実施例２／ｒＣと本質的
に同じ操作で行なう。被形質転換体のうちのあるものは
、抗生物質選択、ゲル電気゛泳動〔ラオと、デジ±、−
ズ、／９７１ｒ年〕およびその他の試験による常法で示
されるように、所望のプラスミドを含む。この被形質転
換体をＥ、コリに／２ＢＥ７１３／ｐＬＯ３７ｒ　と表
ワシテ９選別、移植。

培養し続いてプラスミドｐＬＯ３７１ｒを単離する。

実施例３０Ｃで説明したように挿入される耐性伝達フラ
グメントの方向に依り２方向のプラスミドが生じる。し
たがってプラスミドｐＬ０３７Ｆに加えてその逆の方向
のプラスミドも上記の方法により得られる。当業者なら
ば、常法によりこれらのプラスミドおよびその結果得ら
れる被形質転換体を容易に識別し取出すことができる。

プラスミドｐＬＯ３７♂の制限部位と機能地図を添付図
の図１θに示す。

実施例ダ２ サツカロマイセス中セレウイシエー／　ｐＬＯ７７♂の
構成 所望の形質転換は、プラスミドｐＫｃ２７Ｊの代りにＧ
１１ｎ！耐性遺伝子を含むプラスミドｐ　Ｌ　Ｏ３７１
を用いることを除いては、実施例１Ｏと本質的に同じ操
作で行なう。被形質転換体はプラスミドＤＮＡが存在す
るかどうかで受容味である酵母細胞をスクリーニングす
る常法で取出される。所望の被形質転換体サツカロマイ
セス・セレヴイシエ−／ｐＬＯ３７１はかくして容易に
取出され単離される。

【図面の簡単な説明】

第１図はプラスミドｐＫＣ２０３の制限部位と機能地図
を示す。第２図はプラスミドｐｓＶｊｇｐｔの制限部位
と機能地図を示す。第３図はプラスミドｐＫｃＪ／ｌの
制限部位と機能地図を示す。第４図はプラスミドｐＫＣ
２／；の制限部位と機能地図を示す。第５図はプラスミ
ドｐＫＣ２２２の制限部位と機能地図を示す。第６図は
プラスミドｐｓｃ７０／およびｐＫＣ２ｊ７の制限部位
と機能地図を示す。 第７図はプラスミドｐＫｃ２ｊ９およびｐＫｃ２ｔｌの
制限部位と機能地図を示す。第１図はプラスミドｐＫＣ
！７ｊおよびｐＫＣ２４４！の制限部位と機能地図を示
す。第９図はプラスミドｐＬＯ３／’ＡからｐＬＯ３２
／の制限部位と機能地図を示す。第１０図はプラスミド
ｐＬＯ３７ｔおよびＰＫＣ，２り３の制限部位と機能地
図を示す。但し、第２図、第３図および第１図において
、　ＰＹ　Ｔａｇはポリオーマ配列または５ｖａｏ配列
を含む。 第１図 第　　２　　図 第　　　３　　　図 第　　ｑ　　　図 ｈｏＩ 第　　　５　　　図 第　　　６　　　図 第　　　７　　　図 鉾■ Ｈａ＠ｌｌ 第　　ｒ　　　図 緊瞠用　せり９■ 第　　　９　　　図 第　　７０　　図 窮１頁の続き ３）Ｉｎｔ、　Ｃ１，３識別記号　　　庁内整理番号／
ＣＩ２　Ｒ１／４４ ７４６ １／４６５ ７６６ １／７４５ １／８０ １／９１ ０発　明　者　ラマチャンドラ・エヌ・ラオアメリカ合
衆国インディアナ州 インディアナポリス・ツーバー ・ロード６８１８番地

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 ／、ａ）真核細胞性プロモーター。 ｂ）抗生物質ハイグロマイシンＢおよびＧ　ｇ／♂の一
   方または両方に感受性で、形質転換、細胞分裂および培
   養しやすい宿主細胞に移入したとき。 上記抗生物質の一方または両方に対する耐性を伝えるｌ
   または２個の異なった構造遺伝子および関連制御配列お
   よび Ｃ）上述の宿主細胞が原核細胞であるときレプリコンが
   機能性である原核細胞性レプリコンから成る組み替えＤ
   ＮＡクローニング・ベクター（但し、ｌまたは２個の構
   造遺伝子および関連制御配列は真核細胞性プロモーター
   に隣接していて真核性宿主細胞において真核細胞性プロ
   モーターから転写されたものとし、１個の遺伝子および
   関連制御配列はハイグロマイシンＢおよびＧ４１１ｒの
   両方にではなくどちらか一方に対する耐性を伝えるもの
   とし、且っａ４ｃｔｌに対する耐性を伝えは る遺伝子酵素フォスフオドランスフェラーゼをコ△ 一ド化しないものとする）。 が ２原核細胞性レプリコ′Ａｐ　Ｂ　ＲＪ　２Ｊ　レプリ
   コン。 ｐＭ　Ｂ　／　＝　ＮＲ／　−ＲＫＪ　ｓ　ＲＫ　６　
   ＊　ｐ　Ｓ　Ｃ／　０　／　−ＲＰ　／　、ＲＰ　４’
   。 Ｒ８ＦＩＱＩＱ、ＰＵＢＩＩＯおよびＳＬＰ／、２から
   成るグループから選ばれ、真核細胞性プロモーターが独
   立シテ８ＶＩ１．Ｑ初期プロモーター、ＳＶ＠ｏ後期プ
   Ｏモーター、Ｈ８ＶＩＴＫプロモーター、アデノウィル
   ス・プロモーター、　ＡｄＪプロモータ・−、ポリオー
   マ・プロモーター、マウス・サルコーマ・ウィルス・プ
   ロモーター＊　酵母ｔｒｐ　−／プロモーター。 酵母１ｅｕＪプロモーター、酵母ｈｉｓ　３プロモータ
   ーおよび酵母チトクロムＣ・プロモーターから成るグル
   ープから選ばれたプラスミドである特許請求の範囲！記
   載のベクター。 ３プラｘｚドｐＫｃＪＯＪから（Ｄ７Ｊｋｂ）Ｂｇｌ’
   ｌ（制限フラグメントを含有する特許請求の範囲ｌまた
   は２記載のベクター。 竹原核細胞性レプリコンがｐＢ、Ｒｊ２２レプリコンで
   真核細胞性プロモーターがＳＶｇＱ初期プロモーターで
   ある特許請求の範囲３記載のベクター。 ｊ原核細胞性レプリコンがｐＢＲＪ２２レプリコンで真
   核細胞性プロモーターがＡｄ　２プロモータで真核細胞
   性プロモーターが酵母チトクロムＣ。 フロモーターである特許請求の範囲３記載のベクター。 ２遺伝子および関連制御配列がハイグロマイシンＢおよ
   びａｔｉｉｒに対する耐性を伝え、且つ。 プラスミドｐＫＣ，２０３からの２．７ｊｋｂのＢｇｌ
   ｌｌ：／αｓｌ工制限フラグメントを含有するプラスミ
   ドである特許請求の範囲ｌまたはλ記載のベクター。 と当該構造遺伝子の数が１個に制限されているプラスミ
   ドである特許請求の範囲ｌまたは２記載のベクター。　
   　　　　　　□ り遺伝子および関連制御配列がハイグロマイシンＢに対
   する耐性を伝え、且つ、プラスミドｐＫＣ２２２からの
   ／、　、５−　／　ｋ　ｂのαリエ／町１■制限フラグ
   メントを含有する特許請求の範囲ｌ記載のベクター。 ＩＱ遺伝子および関連制御配列がａｔｉｉｔに対する耐
   性を伝え、且つ、プラスミドＰＫＣ２２２かう（７）　
   ／、　６３　ｋｂ　ノα３０　ＲＢｌ　／　Ｓａｌ　ｌ
   制限フラグメントを含有する特許請求の範囲？記載のベ
   クター。 Ｉｌ、プラスミドｐＫＣ，２／４！、　ｐＫＣ，２／ｊ
   　、　ＰＧＤ／　。 ＰＧＤ、２　、　ＰＧＤＪ　、　ｐＧＤ＆　、　ｐＧＤ
   ｌｏ、　ｐＧＤ／／　、　ｐＧＤ／２．ｐＧＤ／Ｊ、ｐ
   ＧＩ）ｌグおよびｐＧＤ／ｊから成るグループから選ば
   れたプラスミドである特許請求の範囲ｌまたは２記載の
   ベクター。 １２、プラスミドｐＬＯ３７１，ｐＫｃ２７ｊ、ｐＬＯ
   ３１１１ＰＬＯ３１！；、　ｐＬＯ３１１，、ｐＬｏ３
   ／７．ｐＬＯ３１１，ｐＬ。 ３１９、ｐＬ０３２０Ｊ−３よびｐＬＯ３２１から成る
   グループから選ばれたプラスミドである特許請求の範囲
   ゛ｌまたは２記載のベタター。 １′：、・。 ／ｊ、ａ）真核細胞□性プロモーター。 ｂ）抗生ｉ質ハイグロマイシンＢおよびＧ１１ｌ／ｉｆ
   の一方または両方に感受性で、形質転換、細胞分裂およ
   び培養しやすい宿主細胞に移入したとき。 上記抗生物質の一方または両方に対する耐性を伝える！
   または２個の異なった構造遺伝子および関連制御配列お
   よび Ｃ）上述の宿主細胞が原核細胞であるときレプリコンが
   機能性である原核細胞性レプリコンから成る組み替えＤ
   ＮＡクローニング・ベクター（但し・ｌまたは２個の構
   造遺伝子および関連制御配列はＸ真核細胞性プロモータ
   ーに隣接シテいて真核性宿主細胞において真核細胞性プ
   ロモーターから転写されたものとし、１個の遺伝子およ
   び関連制御配列はハイグロマイシンＢおよびＧすｌｌの
   両方にではなくどちらか一方に対する耐性を伝えるもの
   とし、且つａａｉｒに対する耐性を伝える遺伝子は酵素
   フォスフオドランスフェラーゼをコード化しないものと
   する）を含有する被形質転換宿主細胞。 ｌｌＡ原核細胞である特許請求の範囲１３記載の被形質
   転換宿主細胞。 １．５：真核細胞である特許請求の範囲１３記載の被形
   質転換宿主細胞。 ／４．Ｅ、コリ、Ｅ、コリＫ１２．Ｅ、コリに／、２Ｂ
   ｇ！２７．バチルス、バチルス・ズブチリス、シュード
   モナス、アグロバクテリウム、ストレプトマイセス、ス
   タフィロコッカスおよびストレプトコッカスから成るグ
   ループから選ばれた特許請求の範囲ｌｌ記載の被形質転
   換宿主細胞。 １７ノイロスポラ、−１？ファロスポリウム、アスペル
   ギルス≦ペニシリウムおよび酵母から成るグループから
   選ばれた特許請求の範囲ｌｊ記載の被形質転換宿主細胞
   。 ｌｌ植物細胞５両生類の細胞および哺乳類の細胞から成
   るグループから選ばれた特許請求の範囲ｉｓ記載の被形
   質転換宿主細胞。 ｌｚプラスミＦＰＫＣ２０３から（７）？：ｊｋｂの屡
   ■制限フラグメント、プラスミドｐＫＣ２０３から゛の
   −２，７Ｊ−ｋ　ｂの詑２ｘ／且ａｌＪ制限？ラグメン
   ト。 プラスミドｐＫＣ２２２からのｉ、５ｔｋｂの均阻工／
   ＩＩＩ制限フラグメントおよびプラスミドｐＫＣ２２２
   からの／、６ｊｋｂのＥｃｏＲＩ／シｄＩ制限フラグメ
   ントから成るグループから選ばれた制限フラグメン＋。 ２０プラスミドＰＫＣ，２θ３．　ＰＫ　Ｃ２，１，ｌ
   　、　ｐ　ＫＣ２３’７　。 ｐＫＣ，２５９、ｐＫｃ２ＡＩ　、　ｐＫｃ２６ｅ　、
   　ｐＫＣ２７！；およびｐＳＣ７０１から成るグループ
   から選ばれた制限フラグメントから成るプラスミド。 ２／、プラスミドＰＫＣ２０３、ＰＫＣ，２コ２　、　
   ｐＫｃ、２３７　。 ＰＫＣ，２！；９　、　ｐＫｃ２６１　、　ｐＫＣ２１
   ，ゲ、　ｐＫＣ２７３およびｐｓｃ７０１から成るグル
   ープから選ばれた制限フラグメントから成るプラスミド
   から成る被形質転換宿主細胞。 ２２、　Ｅ−コリ、Ｅ、コリＫｉ２＋Ｅ、コリに／、２
   ＢＥざ２７．バチルス、バチルス・ズブチリス、シュー
   ドモナス、アグロバクテリウム、ストレプトマイセス、
   スタフイローコツカスおよびストレプトコッカスから成
   るグループから選ばれた特許請求の範囲２１記載の被形
   質転換宿主細胞。 ２３、　＆）真核細胞性プロモーター。 ｂ）抗生物質ハイグロマイシンＢおよびＧＩＡＩＩの一
   方または両方に感受性で、形質転換、細胞分上記抗生物
   質の一方または両方に対する耐性を伝えるｌまたは２個
   の異なった構造遺伝子および関連制御配列および Ｃ）上述の宿主細胞が原核細胞であるときレプリコンが
   機能性である原核細胞性レプリコンから成る組み替えＤ
   ＮＡベクター（但し、ｌまたは２個の構造遺伝子および
   関連制御配列は真核細胞性プロモーターに隣接していて
   真核性宿主細胞において真核細胞性プロモーターから転
   写されたものとし、１個の遺伝子および関連制御配列は
   一／（イグロマイシンＢおよびＧｌｔｌｆの両方にでは
   なくどちらか一方に対する耐性を伝えるものとし。 且つＧ１１ｌｆに対する耐性を伝える遺伝子は酵素フォ
   スフオドランスフェラーゼをコード化しないものとする
   ）を真核細：絢に移入し・得られた細胞を培養すること
   から成・−翻訳後に修飾されたポリペプチドの製造法。