JPH1156397A - 高脂血症治療薬のスクリーニング方法 - Google Patents
高脂血症治療薬のスクリーニング方法Info
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- JPH1156397A JPH1156397A JP9228267A JP22826797A JPH1156397A JP H1156397 A JPH1156397 A JP H1156397A JP 9228267 A JP9228267 A JP 9228267A JP 22826797 A JP22826797 A JP 22826797A JP H1156397 A JPH1156397 A JP H1156397A
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Abstract
(57)【要約】
【課題】脂肪肝を併発しない安全な高脂血症治療剤をス
クリーニングする方法を提供する。 【解決手段】SREBP（ステロール応答性エレメント結合
タンパク質）-2の作用を選択的に増加させる薬剤をスク
リーニングする方法、ならびにSREBP-2の作用を選択的
に増加させる薬剤を含む高脂血症治療薬。
クリーニングする方法を提供する。 【解決手段】SREBP（ステロール応答性エレメント結合
タンパク質）-2の作用を選択的に増加させる薬剤をスク
リーニングする方法、ならびにSREBP-2の作用を選択的
に増加させる薬剤を含む高脂血症治療薬。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は高脂血症治療薬のス
クリーニング方法に関する。さらに詳しくは、本発明
は、SREBP（ステロール応答性エレメント結合タンパク
質）-2の作用を選択的に増加させる薬剤をスクリーニン
グする方法に関する。このような薬剤は高脂血症治療剤
として有望である。
クリーニング方法に関する。さらに詳しくは、本発明
は、SREBP（ステロール応答性エレメント結合タンパク
質）-2の作用を選択的に増加させる薬剤をスクリーニン
グする方法に関する。このような薬剤は高脂血症治療剤
として有望である。
【０００２】
【従来の技術】高コレステロール血症の治療には、現在
主としてHMG-CoAレダクターゼ（ヒドロキシメチルグル
タリルＣｏＡ還元酵素：ヒドロキシメチルグルタリルＣ
ｏＡをＮＡＤＰＨ存在下で還元してメバロン酸を生成す
る反応を触媒する酵素）阻害剤や胆汁酸再吸収阻害剤が
用いられている。いずれの薬剤も肝臓のコレステロール
を低下し低比重リポタンパク質（LDL）受容体を活性化
することにより血中コレステロールを低下する。しかし
ながら、いずれの場合も肝コレステロール低下という間
接的な機序によりLDL受容体を活性化するため、LDL受容
体活性化による肝へのコレステロール取り込みにより作
用が減弱し、強いコレステロール低下の効果を発揮でき
ない。
主としてHMG-CoAレダクターゼ（ヒドロキシメチルグル
タリルＣｏＡ還元酵素：ヒドロキシメチルグルタリルＣ
ｏＡをＮＡＤＰＨ存在下で還元してメバロン酸を生成す
る反応を触媒する酵素）阻害剤や胆汁酸再吸収阻害剤が
用いられている。いずれの薬剤も肝臓のコレステロール
を低下し低比重リポタンパク質（LDL）受容体を活性化
することにより血中コレステロールを低下する。しかし
ながら、いずれの場合も肝コレステロール低下という間
接的な機序によりLDL受容体を活性化するため、LDL受容
体活性化による肝へのコレステロール取り込みにより作
用が減弱し、強いコレステロール低下の効果を発揮でき
ない。
【０００３】この肝コレステロール低下に応答したLDL
受容体の活性化機構として、LDL受容体遺伝子などの転
写開始点上流にあるステロール応答性エレメント(SRE:s
terolreguratory element)に結合する転写活性化因子で
ある、ステロール応答性エレメント結合タンパク質(SRE
BP)の関与が明らかにされている。細胞のコレステロー
ル量が低下すると、小胞体に結合したSREBPが特異的プ
ロテアーゼにより膜から遊離した活性化型SREBP-2とな
って核内に移行し、SREに結合することにより、LDL受容
体遺伝子の転写を活性化すると考えられている（Wang e
t al., Cell 77:53-62, 1994）。従ってSREBPの膜から
の遊離等を活性化することによりLDL受容体を細胞内コ
レステロールに関わりなく活性化できると考えられ、こ
のような機序の薬物の探索が行われたが、現在までのと
ころ実用化に至っていない。
受容体の活性化機構として、LDL受容体遺伝子などの転
写開始点上流にあるステロール応答性エレメント(SRE:s
terolreguratory element)に結合する転写活性化因子で
ある、ステロール応答性エレメント結合タンパク質(SRE
BP)の関与が明らかにされている。細胞のコレステロー
ル量が低下すると、小胞体に結合したSREBPが特異的プ
ロテアーゼにより膜から遊離した活性化型SREBP-2とな
って核内に移行し、SREに結合することにより、LDL受容
体遺伝子の転写を活性化すると考えられている（Wang e
t al., Cell 77:53-62, 1994）。従ってSREBPの膜から
の遊離等を活性化することによりLDL受容体を細胞内コ
レステロールに関わりなく活性化できると考えられ、こ
のような機序の薬物の探索が行われたが、現在までのと
ころ実用化に至っていない。
【０００４】SREBPには、SREBP-1とSREBP-2の２種類の
アイソフォームがあり、さらにSREBP-1にはその5'ある
いは3'でのオルタネイティブスプライシングにより1a,1
b,1cの３つのアイソフォームがある（Yokoyama et al.,
Cell 75(1):187-98, 1993）。SREBPアイソフォームの
構造とそれぞれの核移行型の模式図、ならびにSREBPの
小胞体膜からの切り出しによる核への移行を図１に示
す。
アイソフォームがあり、さらにSREBP-1にはその5'ある
いは3'でのオルタネイティブスプライシングにより1a,1
b,1cの３つのアイソフォームがある（Yokoyama et al.,
Cell 75(1):187-98, 1993）。SREBPアイソフォームの
構造とそれぞれの核移行型の模式図、ならびにSREBPの
小胞体膜からの切り出しによる核への移行を図１に示
す。
【０００５】SREBP-1はヒトのcDNAライブラリーから見
いだされたが、これより先にラットの脂肪細胞のcDNAラ
イブラリーからそのホモローグと考えられるADD1が脂肪
細胞の分化に重要な転写因子として見いだされていた
（Tontonoz et al., Mol. Cell. Biol. 13:4753-9, 199
3）。
いだされたが、これより先にラットの脂肪細胞のcDNAラ
イブラリーからそのホモローグと考えられるADD1が脂肪
細胞の分化に重要な転写因子として見いだされていた
（Tontonoz et al., Mol. Cell. Biol. 13:4753-9, 199
3）。
【０００６】上述のようにSREBPはヒトのLDL受容体遺伝
子の転写活性化因子として発見された。しかし、その後
の研究の結果、コレステロール合成系酵素であるHMG-Co
Aシンターゼ(Yokoyama et al., Cell 75(1):187-98, 1
993)、HMG-CoAレダクターゼ(Vallettet al., J. Biol.
Chem. 271(21):12247-53, 1996)、ファルネシル二リン
酸シンターゼ(Jackson et al., J. Biol. Chem. 37(8):
1712-21, 1996)、スクアレンシンターゼ(Guan et al.,
J. Biol. Chem. 270(37):21958-65, 1995)のみならず、
脂肪酸合成系酵素であるアセチル CoAカルボキシラーゼ
(Lopez et al.,Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93(3):104
9-53, 1996)、脂肪酸シンターゼ(Bennett et al., J. B
iol. Chem. 270(43):25578-83, 1995)、トリグリセリド
合成系酵素であるグリセロール-3-リン酸アセチルトラ
ンスフェラーゼ(Ericsson et al.SREBP-2, J. Biol. Ch
em. 272(11):7298, 1997)などの発現調節にもSREBPが関
与することが報告され、またSREBP-2遺伝子自身が転写
活性化の標的遺伝子となっている可能性が報告された(S
ato et al., J. Biol. Chem. 271(43):26461-4,1996)。
子の転写活性化因子として発見された。しかし、その後
の研究の結果、コレステロール合成系酵素であるHMG-Co
Aシンターゼ(Yokoyama et al., Cell 75(1):187-98, 1
993)、HMG-CoAレダクターゼ(Vallettet al., J. Biol.
Chem. 271(21):12247-53, 1996)、ファルネシル二リン
酸シンターゼ(Jackson et al., J. Biol. Chem. 37(8):
1712-21, 1996)、スクアレンシンターゼ(Guan et al.,
J. Biol. Chem. 270(37):21958-65, 1995)のみならず、
脂肪酸合成系酵素であるアセチル CoAカルボキシラーゼ
(Lopez et al.,Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93(3):104
9-53, 1996)、脂肪酸シンターゼ(Bennett et al., J. B
iol. Chem. 270(43):25578-83, 1995)、トリグリセリド
合成系酵素であるグリセロール-3-リン酸アセチルトラ
ンスフェラーゼ(Ericsson et al.SREBP-2, J. Biol. Ch
em. 272(11):7298, 1997)などの発現調節にもSREBPが関
与することが報告され、またSREBP-2遺伝子自身が転写
活性化の標的遺伝子となっている可能性が報告された(S
ato et al., J. Biol. Chem. 271(43):26461-4,1996)。
【０００７】さらに最近になって、SREBP-1aあるいは1c
の核内移行領域を肝臓にて過剰発現する遺伝子導入マウ
スが開発され、これらのマウスは脂肪肝の症状を呈して
いたことから、SREBP-1の活性化はLDL受容体の活性化機
序としては不適切と考えられた（Shimano, H. et al.,
J. Clin. Invest. 98:1575-1584, 1996; Shimano, H.et
al., J. Clin. Invest. 99:846-854, 1997）。
の核内移行領域を肝臓にて過剰発現する遺伝子導入マウ
スが開発され、これらのマウスは脂肪肝の症状を呈して
いたことから、SREBP-1の活性化はLDL受容体の活性化機
序としては不適切と考えられた（Shimano, H. et al.,
J. Clin. Invest. 98:1575-1584, 1996; Shimano, H.et
al., J. Clin. Invest. 99:846-854, 1997）。
【０００８】
【発明が解決すべき課題】本発明は、LDL受容体の活性
化機序としてのSREBPの可能性として、SREBPがアイソフ
ォームによって異なる作用を有する可能性に着眼し、細
胞内コレステロールに関わりなく、LDL受容体遺伝子の
転写を活性化できるSREBPアイソフォームを探索し、該S
REBPアイソフォームを選択的に増加する薬剤をスクリー
ニングする方法を提供することを目的とする。本発明は
さらに、そのような薬剤を用いて高脂血症の治療を行う
ことを目的とする。
化機序としてのSREBPの可能性として、SREBPがアイソフ
ォームによって異なる作用を有する可能性に着眼し、細
胞内コレステロールに関わりなく、LDL受容体遺伝子の
転写を活性化できるSREBPアイソフォームを探索し、該S
REBPアイソフォームを選択的に増加する薬剤をスクリー
ニングする方法を提供することを目的とする。本発明は
さらに、そのような薬剤を用いて高脂血症の治療を行う
ことを目的とする。
【０００９】
【課題を解決するための手段】上記目的を達成するた
め、本発明者らは鋭意研究した結果、SREBPアイソフォ
ームであるSREBP-2の選択的な作用の増強によって、脂
肪酸合成を増加することなく、LDL受容体活性を増加す
ることができることを発見して本発明を完成した。
め、本発明者らは鋭意研究した結果、SREBPアイソフォ
ームであるSREBP-2の選択的な作用の増強によって、脂
肪酸合成を増加することなく、LDL受容体活性を増加す
ることができることを発見して本発明を完成した。
【００１０】即ち、本発明は、SREBP（ステロール応答
性エレメント結合タンパク質）-2の作用を選択的に増加
させる薬剤をスクリーニングする方法を提供する。本発
明の好ましい態様では、SREBP-1及びSREBP-2の2つを発
現している細胞に被検薬剤を作用させ、SREBP-1の作用
の増加に比べてSREBP-2の作用の増加が大きい薬剤を同
定することにより行う。
性エレメント結合タンパク質）-2の作用を選択的に増加
させる薬剤をスクリーニングする方法を提供する。本発
明の好ましい態様では、SREBP-1及びSREBP-2の2つを発
現している細胞に被検薬剤を作用させ、SREBP-1の作用
の増加に比べてSREBP-2の作用の増加が大きい薬剤を同
定することにより行う。
【００１１】本発明はさらに、SREBP-2の作用を選択的
に増加させる薬剤を含む高脂血症治療薬を提供する。こ
のような治療薬は上述のスクリーニング方法によって同
定することができる。
に増加させる薬剤を含む高脂血症治療薬を提供する。こ
のような治療薬は上述のスクリーニング方法によって同
定することができる。
【００１２】なお、ヒトSREBP-2は、１１４１個のアミ
ノ酸からなり、SREBP-1a（１１４７アミノ酸）と４７％
相同である。SREBP-1a及びSREBP-2はいずれも酸性のＮ
Ｈ2末端、高度に保存されたｂＨＬＨ−Ｚｉｐ（塩基性
ヘリックス−ループ−ヘリックス−ロイシンジッパー）
モチーフ（７１％相同）、ならびにｂＨＬＨ−Ｚｉｐ領
域のＣＯＯＨ末端に７４０アミノ酸の非常に長い配列を
有する。SREBP-2は、グルタミンに富む領域（１２１残
基中、グルタミンが２７％）をもつ点でSREBP-1aと異な
る（米国特許第5,527,690号）。
ノ酸からなり、SREBP-1a（１１４７アミノ酸）と４７％
相同である。SREBP-1a及びSREBP-2はいずれも酸性のＮ
Ｈ2末端、高度に保存されたｂＨＬＨ−Ｚｉｐ（塩基性
ヘリックス−ループ−ヘリックス−ロイシンジッパー）
モチーフ（７１％相同）、ならびにｂＨＬＨ−Ｚｉｐ領
域のＣＯＯＨ末端に７４０アミノ酸の非常に長い配列を
有する。SREBP-2は、グルタミンに富む領域（１２１残
基中、グルタミンが２７％）をもつ点でSREBP-1aと異な
る（米国特許第5,527,690号）。
【００１３】
【発明を実施の形態】本発明のスクリーニング方法を開
発するにあたって、まずSREBPアイソフォームであるSRE
BP-2の標的遺伝子を探索し、SREBP-2による転写活性化
の結果生じる細胞の脂質代謝の変化を検討できる細胞系
を構築した。
発するにあたって、まずSREBPアイソフォームであるSRE
BP-2の標的遺伝子を探索し、SREBP-2による転写活性化
の結果生じる細胞の脂質代謝の変化を検討できる細胞系
を構築した。
【００１４】この細胞系は、ヒト由来細胞であるHeLa S
3細胞に、LacIの発現ベクターp3'SS及び活性化型のヒト
SREBP-2（1-481アミノ酸を含む）をlac operator の制
御のもとに発現するベクター（pOPI3BP2）の各2種類の
プラスミドを導入した（図２に模式図を示す）。この細
胞では、通常は導入したベクターからのSREBP-2(1-481)
発現はLacIの発現により抑制される。しかしイソプロピ
ルチオガラクトピラノシド (IPTG)の添加によって、本
ベクターからのSREBP-2(1-481)発現が誘導される。した
がって、IPTG添加後に生じる本細胞における標的とする
各種遺伝子の発現レベルあるいは脂質代謝活性の変化を
測定することにより、活性化型SREBP-2が脂肪酸合成活
性を増加せずにLDL受容体活性を増加するか否かを明ら
かにすることができる。
3細胞に、LacIの発現ベクターp3'SS及び活性化型のヒト
SREBP-2（1-481アミノ酸を含む）をlac operator の制
御のもとに発現するベクター（pOPI3BP2）の各2種類の
プラスミドを導入した（図２に模式図を示す）。この細
胞では、通常は導入したベクターからのSREBP-2(1-481)
発現はLacIの発現により抑制される。しかしイソプロピ
ルチオガラクトピラノシド (IPTG)の添加によって、本
ベクターからのSREBP-2(1-481)発現が誘導される。した
がって、IPTG添加後に生じる本細胞における標的とする
各種遺伝子の発現レベルあるいは脂質代謝活性の変化を
測定することにより、活性化型SREBP-2が脂肪酸合成活
性を増加せずにLDL受容体活性を増加するか否かを明ら
かにすることができる。
【００１５】上記細胞を用いて、発現調節にSREBPの関
与が報告されている上述したような各種遺伝子の転写調
節ならびに代謝活性に及ぼす効果を試験した。その結
果、表１に示すように、IPTG添加によってLDL受容体mRN
AおよびLDL受容体活性は約２．５及び３．５倍に増加し
たが、脂肪酸合成酵素mRNAは変化せず、また脂肪酸合成
酵素活性も増加しなかった。
与が報告されている上述したような各種遺伝子の転写調
節ならびに代謝活性に及ぼす効果を試験した。その結
果、表１に示すように、IPTG添加によってLDL受容体mRN
AおよびLDL受容体活性は約２．５及び３．５倍に増加し
たが、脂肪酸合成酵素mRNAは変化せず、また脂肪酸合成
酵素活性も増加しなかった。
【００１６】これらの結果から、脂肪肝を誘導するSREB
P-1とは異なり、SREBP-2の作用増強は脂肪酸合成を増加
することなく、LDL受容体活性を上げることを示してい
る。従って、SREBP作用活性化で生じる脂肪肝を併発し
ない安全な作用機序として、SREBP-2選択的な作用の増
強が有用であることが判明した。なお、SREBP-1及びSRE
BP-2によるLDL受容体の発現の制御メカニズムを図３に
示す。
P-1とは異なり、SREBP-2の作用増強は脂肪酸合成を増加
することなく、LDL受容体活性を上げることを示してい
る。従って、SREBP作用活性化で生じる脂肪肝を併発し
ない安全な作用機序として、SREBP-2選択的な作用の増
強が有用であることが判明した。なお、SREBP-1及びSRE
BP-2によるLDL受容体の発現の制御メカニズムを図３に
示す。
【００１７】なお、本発明において、「SREBP-2の作用
を選択的に増加させる」とは、SREBP-1の作用の増加に
比べてSREBP-2の作用の増加が大きいことを意味する。S
REBP-1の作用の増加に比べてSREBP-2の作用の増加が
１．５倍以上大きいことが好ましく、さらには２倍以上
大きいことがより好ましい。
を選択的に増加させる」とは、SREBP-1の作用の増加に
比べてSREBP-2の作用の増加が大きいことを意味する。S
REBP-1の作用の増加に比べてSREBP-2の作用の増加が
１．５倍以上大きいことが好ましく、さらには２倍以上
大きいことがより好ましい。
【００１８】従って、SREBP-1の作用の増加に比べてSRE
BP-2の作用の増加が大きい薬剤をスクリーニングするこ
とができれば、この薬剤を用いて血中コレステロールを
低下させ、高脂血症の治療に用いることができる。
BP-2の作用の増加が大きい薬剤をスクリーニングするこ
とができれば、この薬剤を用いて血中コレステロールを
低下させ、高脂血症の治療に用いることができる。
【００１９】本発明のスクリーニング方法では、SREBP-
1及びSREBP-2の２つを発現する細胞を使用する。SREBP-
1及びSREBP-2の２つを発現する細胞とは、SREBP-1及びS
REBP-2の2つを同じ細胞中に発現していても、あるいは
別々の細胞中に発現しているものであってもよい。
1及びSREBP-2の２つを発現する細胞を使用する。SREBP-
1及びSREBP-2の２つを発現する細胞とは、SREBP-1及びS
REBP-2の2つを同じ細胞中に発現していても、あるいは
別々の細胞中に発現しているものであってもよい。
【００２０】SREBP-2作用の増強とは、核移行型SREBP-2
の核内量を増加し、LDL受容体の転写活性化作用を増強
することである。SREBP-2作用増強は、SREBP-2 mRNA量
やSREBP-2タンパク質の発現を増加することや、小胞体
あるいは核膜に発現したSREBP-2前駆体を切断し核内へ
の移行を増加すること、さらにはLDL受容体遺伝子プロ
モーター上でSREBP-2と転写活性化因子の結合が増強さ
れることなどによって可能となる。したがって、SREBP-
2の作用を増強する薬物の作用点としては、例えば、SRE
BP-2遺伝子の転写効率増加、SREBP-2 mRNAの安定性増
加、SREBP-2 mRNAの翻訳効率増加、SREBP-2タンパク質
安定性増加、SREBP-2タンパク質の核移行型への切断増
加、SREBP-2タンパク質核移行増加、SREBP-2の転写活性
増加、核内でのSREBP-2への転写活性化因子結合増強な
どが考えられる。従って、SREBP-2を選択的に増強する
薬剤をスクリーニングする際には、これらの作用点の１
つ以上を指標として行うことができる。特に、SREBP-2
遺伝子の転写効率増加及び／又はSREBP-2の転写活性増
加を指標とすることが好ましい。スクリーニングしよう
とする薬剤のSREBP-1及びSREBP-2に対する効果を比較
し、SREBP-1の作用の増加に比べてSREBP-2の作用の増加
が大きい薬剤を同定する。
の核内量を増加し、LDL受容体の転写活性化作用を増強
することである。SREBP-2作用増強は、SREBP-2 mRNA量
やSREBP-2タンパク質の発現を増加することや、小胞体
あるいは核膜に発現したSREBP-2前駆体を切断し核内へ
の移行を増加すること、さらにはLDL受容体遺伝子プロ
モーター上でSREBP-2と転写活性化因子の結合が増強さ
れることなどによって可能となる。したがって、SREBP-
2の作用を増強する薬物の作用点としては、例えば、SRE
BP-2遺伝子の転写効率増加、SREBP-2 mRNAの安定性増
加、SREBP-2 mRNAの翻訳効率増加、SREBP-2タンパク質
安定性増加、SREBP-2タンパク質の核移行型への切断増
加、SREBP-2タンパク質核移行増加、SREBP-2の転写活性
増加、核内でのSREBP-2への転写活性化因子結合増強な
どが考えられる。従って、SREBP-2を選択的に増強する
薬剤をスクリーニングする際には、これらの作用点の１
つ以上を指標として行うことができる。特に、SREBP-2
遺伝子の転写効率増加及び／又はSREBP-2の転写活性増
加を指標とすることが好ましい。スクリーニングしよう
とする薬剤のSREBP-1及びSREBP-2に対する効果を比較
し、SREBP-1の作用の増加に比べてSREBP-2の作用の増加
が大きい薬剤を同定する。
【００２１】本発明のスクリーニング方法の一例として
は、例えば、細胞の培養液中に被検薬剤を添加しインキ
ュベーションした後、細胞を回収しSREBP-1a,-1b,-1c及
びSREBP-2のmRNA量あるいはSREBP-1a,-1b,-1c及びSREBP
-2蛋白量を測定することによって行うことができる。SR
EBP-1 mRNAあるいはSREBP-1タンパク質の増加に比べ
て、SREBP-2 mRNAあるいはSREBP-2タンパク質の増加が
大きい被検薬物を陽性とする。
は、例えば、細胞の培養液中に被検薬剤を添加しインキ
ュベーションした後、細胞を回収しSREBP-1a,-1b,-1c及
びSREBP-2のmRNA量あるいはSREBP-1a,-1b,-1c及びSREBP
-2蛋白量を測定することによって行うことができる。SR
EBP-1 mRNAあるいはSREBP-1タンパク質の増加に比べ
て、SREBP-2 mRNAあるいはSREBP-2タンパク質の増加が
大きい被検薬物を陽性とする。
【００２２】SREBP-1又はSREBP-2の作用を測定するにあ
たっては、SREBP-1又はSREBP-2をコードする遺伝子のみ
ならず、SRE結合領域を他のタンパク質に置き換えて作
成した融合タンパク質をコードするSREBP-1融合タンパ
ク質遺伝子又はSREBP-2融合タンパク質遺伝子を用いて
もよい。これは核移行型SREBPの遊離増強によりSREBP-2
作用を増強する機序の場合、核移行型遊離に関わらない
と考えられる（Sakai, J. et al., Cell 85:1037-1046,
1996）SRE結合領域を他のタンパク質に置き換えても膜
結合領域からの切断遊離が野生型と同様に起こるためで
ある。ただし、このような遺伝子としては、SREBPで核
移行型SREBPを遊離するために必要な特異的な切断部位
のアミノ酸配列をコードする配列を融合タンパク質中に
含んでいることが必要である。例えば、SREBP-1aでは、
455-1147アミノ酸、SREBP-2では463-1141アミノ酸の配
列を有する融合タンパク質が挙げられる。これらのタン
パク質はいずれも、caspase-3により切断されると考え
られる460番目(SREBP-1a)あるいは480番目(SREBP-2)のA
spを含んでおり（Wang, X. et al., J. Biol. Chem. 27
0:18044-18050, 1995）、この切断位置よりカルボキシ
ル末端側で起こるステロール応答性の２段階切断反応に
必要な配列をも含んでいる（Sakai, J. et al., Cell 8
5:1037-1046, 1996）。このような融合タンパク遺伝子
を用いる方法の最大の特徴は、SREBP-1やSREBP-2による
SREへの結合を介して発現される反応を直接的あるいは
間接的に検出する方法では不可能なSREBP-1とSREBP-2と
の区別が可能になることである。さらに、より検出が容
易なタンパク質を融合することにより高感度で簡便なス
クリーニング系の構築が可能となる。
たっては、SREBP-1又はSREBP-2をコードする遺伝子のみ
ならず、SRE結合領域を他のタンパク質に置き換えて作
成した融合タンパク質をコードするSREBP-1融合タンパ
ク質遺伝子又はSREBP-2融合タンパク質遺伝子を用いて
もよい。これは核移行型SREBPの遊離増強によりSREBP-2
作用を増強する機序の場合、核移行型遊離に関わらない
と考えられる（Sakai, J. et al., Cell 85:1037-1046,
1996）SRE結合領域を他のタンパク質に置き換えても膜
結合領域からの切断遊離が野生型と同様に起こるためで
ある。ただし、このような遺伝子としては、SREBPで核
移行型SREBPを遊離するために必要な特異的な切断部位
のアミノ酸配列をコードする配列を融合タンパク質中に
含んでいることが必要である。例えば、SREBP-1aでは、
455-1147アミノ酸、SREBP-2では463-1141アミノ酸の配
列を有する融合タンパク質が挙げられる。これらのタン
パク質はいずれも、caspase-3により切断されると考え
られる460番目(SREBP-1a)あるいは480番目(SREBP-2)のA
spを含んでおり（Wang, X. et al., J. Biol. Chem. 27
0:18044-18050, 1995）、この切断位置よりカルボキシ
ル末端側で起こるステロール応答性の２段階切断反応に
必要な配列をも含んでいる（Sakai, J. et al., Cell 8
5:1037-1046, 1996）。このような融合タンパク遺伝子
を用いる方法の最大の特徴は、SREBP-1やSREBP-2による
SREへの結合を介して発現される反応を直接的あるいは
間接的に検出する方法では不可能なSREBP-1とSREBP-2と
の区別が可能になることである。さらに、より検出が容
易なタンパク質を融合することにより高感度で簡便なス
クリーニング系の構築が可能となる。
【００２３】例えば、ルシフェラーゼなどのレポーター
遺伝子の上流にGAL4などの転写因子の結合配列（GAL4の
場合はUASG）を持つプラスミドが導入されている細胞を
用意する。これに加えて、１）GAL4などの細胞に導入し
た上流配列に結合する転写活性化因子を、あるいは融合
型の人工転写活性化因子を、核移行型SREBPを遊離する
ために必要な特異的な切断部位のアミノ酸配列を含む膜
結合領域及びそのカルボキシル側末端と融合したタンパ
ク質、例えば、SREBP-2では463-1141アミノ酸の配列を
有する融合タンパク質を発現する遺伝子、又は２）ヒト
SREBP-1a（455-1147アミノ酸）のN端側に１）で示した
ような転写活性化因子を融合したタンパク質を発現する
遺伝子、を先に用意した細胞にそれぞれ導入した２つの
細胞を用意する。それぞれの細胞の培養液中に薬物を添
加しインキュベーション後、細胞を回収し各々のレポー
ター活性を測定する。
遺伝子の上流にGAL4などの転写因子の結合配列（GAL4の
場合はUASG）を持つプラスミドが導入されている細胞を
用意する。これに加えて、１）GAL4などの細胞に導入し
た上流配列に結合する転写活性化因子を、あるいは融合
型の人工転写活性化因子を、核移行型SREBPを遊離する
ために必要な特異的な切断部位のアミノ酸配列を含む膜
結合領域及びそのカルボキシル側末端と融合したタンパ
ク質、例えば、SREBP-2では463-1141アミノ酸の配列を
有する融合タンパク質を発現する遺伝子、又は２）ヒト
SREBP-1a（455-1147アミノ酸）のN端側に１）で示した
ような転写活性化因子を融合したタンパク質を発現する
遺伝子、を先に用意した細胞にそれぞれ導入した２つの
細胞を用意する。それぞれの細胞の培養液中に薬物を添
加しインキュベーション後、細胞を回収し各々のレポー
ター活性を測定する。
【００２４】具体的には以下の実施例に示すような系が
挙げられるが、本発明のスクリーニング方法はこれに限
定されることなく、種々の変更や修飾が当業者には可能
である。
挙げられるが、本発明のスクリーニング方法はこれに限
定されることなく、種々の変更や修飾が当業者には可能
である。
【００２５】本発明のスクリーニング方法によって同定
された、SREBP-1の作用を増加することなく、SREBP-2の
作用のみを増加させる薬剤は、LDL受容体の発現を促進
する。細胞表面におけるLDL受容体の増加は、血漿中のL
DLレベルを低下させることになり、したがってこのよう
な薬剤は高脂血症治療剤として有望である。
された、SREBP-1の作用を増加することなく、SREBP-2の
作用のみを増加させる薬剤は、LDL受容体の発現を促進
する。細胞表面におけるLDL受容体の増加は、血漿中のL
DLレベルを低下させることになり、したがってこのよう
な薬剤は高脂血症治療剤として有望である。
【００２６】
実施例１：SREBP-2のみを活性化することのできる細胞
系の構築 Ｌａｃオペレーター配列をRSVプロモーター内に含有す
る発現ベクターpOPI3CATをNotIで切断した後、クレノウ
フラグメントで平滑末端とし、さらに脱リン酸化する。
SREBP-2(1-481)発現ベクターであるpSREBP-2(1-481)か
らXhoIとNotIで切断し取り出した1.5kbの断片をクレノ
ウフラグメントで平滑末端とし、先に得たpOPI3CAT由来
ＤＮＡに挿入する。このようにして構築したプラスミド
pOPI3BP2が、SREBP-2(1-481)をIIPTGによって発現誘導
が可能な方向に挿入されたものであることを塩基配列の
解読により確認した。
系の構築 Ｌａｃオペレーター配列をRSVプロモーター内に含有す
る発現ベクターpOPI3CATをNotIで切断した後、クレノウ
フラグメントで平滑末端とし、さらに脱リン酸化する。
SREBP-2(1-481)発現ベクターであるpSREBP-2(1-481)か
らXhoIとNotIで切断し取り出した1.5kbの断片をクレノ
ウフラグメントで平滑末端とし、先に得たpOPI3CAT由来
ＤＮＡに挿入する。このようにして構築したプラスミド
pOPI3BP2が、SREBP-2(1-481)をIIPTGによって発現誘導
が可能な方向に挿入されたものであることを塩基配列の
解読により確認した。
【００２７】HeLa S3細胞にLacリプレッサー（LacI）発
現ベクターであるp3'SSを電気穿孔法で導入し、０．３
ｍｇ／ｍｌハイグロマイシン及び10% FBSを含有したダ
ルベッコの修正イーグル培地で生存する細胞株を選択し
た。これらの細胞株のうち、LacI mRNAを発現している
株を選び、以下の実験に用いた。
現ベクターであるp3'SSを電気穿孔法で導入し、０．３
ｍｇ／ｍｌハイグロマイシン及び10% FBSを含有したダ
ルベッコの修正イーグル培地で生存する細胞株を選択し
た。これらの細胞株のうち、LacI mRNAを発現している
株を選び、以下の実験に用いた。
【００２８】pOPI3BP2 DNAを、上述のようにして作成し
たLacリプレッサー発現HeLa S3細胞に電気穿孔法で導入
し、0.3mg/mlハイグロマイシン、0.3mg/ml G418及び10%
FBSを含有するダルベッコの修正イーグル培地で生存す
る細胞株を得た。ここで得た細胞株についてIPTGによる
SREBP-2(1-481)誘導性を、IPTG添加前後のSREBP-2 mRNA
レベルを定量して、誘導性の確認を行った。
たLacリプレッサー発現HeLa S3細胞に電気穿孔法で導入
し、0.3mg/mlハイグロマイシン、0.3mg/ml G418及び10%
FBSを含有するダルベッコの修正イーグル培地で生存す
る細胞株を得た。ここで得た細胞株についてIPTGによる
SREBP-2(1-481)誘導性を、IPTG添加前後のSREBP-2 mRNA
レベルを定量して、誘導性の確認を行った。
【００２９】実施例２：発現調節へのSREBP-2の関与の
検討 実施例１で構築した細胞系を用いて、IPTG添加時の各種
遺伝子（LDL受容体、脂肪酸合成酵素）の転写調節へのS
REBP-2の関与と代謝活性に及ぼすSREBP-2の影響を検討
した。
検討 実施例１で構築した細胞系を用いて、IPTG添加時の各種
遺伝子（LDL受容体、脂肪酸合成酵素）の転写調節へのS
REBP-2の関与と代謝活性に及ぼすSREBP-2の影響を検討
した。
【００３０】転写活性の測定は、細胞を0.3mM IPTG、10
ug/mlコレステロール、1ug/ml 25-ヒドロキシコレステ
ロール、10% FBSを含むダルベッコの修正イーグル培地
で４時間培養後、細胞からtotal RNAを調製し、（Kawab
e et al., BBRC 219:515-20,1996）の方法を用いてmRNA
を測定した。代謝活性の測定のうち、LDL受容体につい
ては、細胞を0.3mM IPTG、10ug/mlコレステロール、1ug
/ml 25-ヒドロキシコレステロール、10% FBSを含むダル
ベッコの修正イーグル培地で９時間培養後、（Goldstei
n, J.L. et al., Methods Enzymol. 98:241-260, 198
3）の方法により、125I-LDLの細胞表面への結合量を測
定した。脂肪酸合成活性については、細胞を0.3mM IPT
G、10ug/mlコレステロール、1ug/ml 25-ヒドロキシコレ
ステロール、10% FBSを含むダルベッコの修正イーグル
培地で８時間培養後、培地中に1mM14C-酢酸ナトリウム
を添加し、さらに２時間培養の後、（Brown, M.S. et a
l.,J. Biol. Chem. 253:1121-1128, 1978）により測定
した。なお、いずれの場合も、IPTGのみを除いた培地で
同様に培養した細胞について測定し、IPTG無処置対照群
の値とした。
ug/mlコレステロール、1ug/ml 25-ヒドロキシコレステ
ロール、10% FBSを含むダルベッコの修正イーグル培地
で４時間培養後、細胞からtotal RNAを調製し、（Kawab
e et al., BBRC 219:515-20,1996）の方法を用いてmRNA
を測定した。代謝活性の測定のうち、LDL受容体につい
ては、細胞を0.3mM IPTG、10ug/mlコレステロール、1ug
/ml 25-ヒドロキシコレステロール、10% FBSを含むダル
ベッコの修正イーグル培地で９時間培養後、（Goldstei
n, J.L. et al., Methods Enzymol. 98:241-260, 198
3）の方法により、125I-LDLの細胞表面への結合量を測
定した。脂肪酸合成活性については、細胞を0.3mM IPT
G、10ug/mlコレステロール、1ug/ml 25-ヒドロキシコレ
ステロール、10% FBSを含むダルベッコの修正イーグル
培地で８時間培養後、培地中に1mM14C-酢酸ナトリウム
を添加し、さらに２時間培養の後、（Brown, M.S. et a
l.,J. Biol. Chem. 253:1121-1128, 1978）により測定
した。なお、いずれの場合も、IPTGのみを除いた培地で
同様に培養した細胞について測定し、IPTG無処置対照群
の値とした。
【００３１】得られた結果を以下の表１に示す。表１ 転写活性（IPTG無処置対照群に対する増加率） LDL受容体 ２．９ 脂肪酸合成酵素 １．１ 代謝活性（IPTG無処置対照群に対する増加率） LDL結合活性 ２．６脂肪酸合成活性 １．４ 表から明らかなように、IPTG添加によってLDL受容体mRN
A及びLDL受容体活性は２．９及び２．６倍に増加した
が、脂肪酸合成酵素mRNAは変化せず、脂肪酸合成活性も
増加しなかった。
A及びLDL受容体活性は２．９及び２．６倍に増加した
が、脂肪酸合成酵素mRNAは変化せず、脂肪酸合成活性も
増加しなかった。
【００３２】実施例３：SREBP-2の作用を選択的に増強
する薬物のスクリーニング方法１ ヒト培養細胞（HeLa S3）の培養液中に被検薬物を添加
しインキュベーションした後、細胞を回収しSREBP-1a,-
1b,-1c及びSREBP-2のmRNA量あるいはSREBP-1a,-1b,-1c
及びSREBP-2蛋白量を測定する。SREBP-1mRNAあるいはSR
EBP-1タンパク質を増加せずにSREBP-2mRNAあるいはSREB
P-2タンパク質のみを選択的に増加する被検薬物を陽性
とする。
する薬物のスクリーニング方法１ ヒト培養細胞（HeLa S3）の培養液中に被検薬物を添加
しインキュベーションした後、細胞を回収しSREBP-1a,-
1b,-1c及びSREBP-2のmRNA量あるいはSREBP-1a,-1b,-1c
及びSREBP-2蛋白量を測定する。SREBP-1mRNAあるいはSR
EBP-1タンパク質を増加せずにSREBP-2mRNAあるいはSREB
P-2タンパク質のみを選択的に増加する被検薬物を陽性
とする。
【００３３】実施例４：SREBP-2の作用を選択的に増強
する薬物のスクリーニング方法２ 図４に示すような２種類の細胞（細胞１、２）を構築
し、被検薬物によるルシフェラーゼ活性を測定し、細胞
２では活性増加を認めず、細胞１でのみ活性を増加する
薬物を陽性とする。
する薬物のスクリーニング方法２ 図４に示すような２種類の細胞（細胞１、２）を構築
し、被検薬物によるルシフェラーゼ活性を測定し、細胞
２では活性増加を認めず、細胞１でのみ活性を増加する
薬物を陽性とする。
【００３４】細胞１、２はともにレポーター遺伝子であ
るルシフェラーゼ遺伝子上流に酵母由来の転写活性化因
子GAL4の結合配列であるUASGを持つプラスミドが導入さ
れている。これに加えて細胞１ではGAL4のDNA結合領域
とヒトインフルエンザウイルス由来の転写活性化因子VP
16の転写活性化領域を、N端の核移行領域を欠失し小胞
体膜貫通領域２つを有するヒトSREBP-2（463-1141アミ
ノ酸）のN端側に融合したタンパク質を発現する遺伝子
を導入する。
るルシフェラーゼ遺伝子上流に酵母由来の転写活性化因
子GAL4の結合配列であるUASGを持つプラスミドが導入さ
れている。これに加えて細胞１ではGAL4のDNA結合領域
とヒトインフルエンザウイルス由来の転写活性化因子VP
16の転写活性化領域を、N端の核移行領域を欠失し小胞
体膜貫通領域２つを有するヒトSREBP-2（463-1141アミ
ノ酸）のN端側に融合したタンパク質を発現する遺伝子
を導入する。
【００３５】一方細胞２では、細胞１に導入した遺伝子
の代わりにヒトSREBP-1a（455-1147アミノ酸）のN端側
にGAL4のDNA結合領域とVP16の転写活性化領域を融合し
たタンパク質を発現する遺伝子を導入する。それぞれの
細胞の培養液中に薬物を添加しインキュベーション後、
細胞を回収し各々ルシフェラーゼ活性を測定する。
の代わりにヒトSREBP-1a（455-1147アミノ酸）のN端側
にGAL4のDNA結合領域とVP16の転写活性化領域を融合し
たタンパク質を発現する遺伝子を導入する。それぞれの
細胞の培養液中に薬物を添加しインキュベーション後、
細胞を回収し各々ルシフェラーゼ活性を測定する。
【００３６】実施例５：SREBP-2の作用を選択的に増強
する薬物のスクリーニング方法３図５示すような細胞を
構築し、被検薬物によるホタル由来ルシフェラーゼ活性
およびシーパンジー由来ルシフェラーゼ活性を測定し、
シーパンジー由来ルシフェラーゼ活性を増加せずホタル
由来ルシフェラーゼ活性のみを増加する薬物を陽性とす
る。
する薬物のスクリーニング方法３図５示すような細胞を
構築し、被検薬物によるホタル由来ルシフェラーゼ活性
およびシーパンジー由来ルシフェラーゼ活性を測定し、
シーパンジー由来ルシフェラーゼ活性を増加せずホタル
由来ルシフェラーゼ活性のみを増加する薬物を陽性とす
る。
【００３７】細胞は２種類のレポーター遺伝子を導入さ
れる。すなわち、ホタル由来ルシフェラーゼ遺伝子上流
に酵母由来の転写活性化因子GAL4の結合配列であるUASG
を持つプラスミドとシーパンジー由来ルシフェラーゼ遺
伝子上流に大腸菌由来の転写活性化因子LexAの結合配列
であるLexAopを持つプラスミドが導入されている。更
に、GAL4のDNA結合領域とVP16の転写活性化領域をヒトS
REBP-2（463-1141アミノ酸）のN端側に融合したタンパ
ク質を発現する遺伝子とLexAのDNA結合領域とVP16の転
写活性化領域をヒトSREBP-1a（455-1147アミノ酸）のN
端側にGAL4のDNA結合領域とVP16の転写活性化領域を融
合したタンパク質を発現する遺伝子を導入する。本細胞
の培養液中に薬物を添加しインキュベーション後、細胞
を回収しホタル由来ルシフェラーゼ活性およびシーパン
ジー由来ルシフェラーゼ活性を測定する。
れる。すなわち、ホタル由来ルシフェラーゼ遺伝子上流
に酵母由来の転写活性化因子GAL4の結合配列であるUASG
を持つプラスミドとシーパンジー由来ルシフェラーゼ遺
伝子上流に大腸菌由来の転写活性化因子LexAの結合配列
であるLexAopを持つプラスミドが導入されている。更
に、GAL4のDNA結合領域とVP16の転写活性化領域をヒトS
REBP-2（463-1141アミノ酸）のN端側に融合したタンパ
ク質を発現する遺伝子とLexAのDNA結合領域とVP16の転
写活性化領域をヒトSREBP-1a（455-1147アミノ酸）のN
端側にGAL4のDNA結合領域とVP16の転写活性化領域を融
合したタンパク質を発現する遺伝子を導入する。本細胞
の培養液中に薬物を添加しインキュベーション後、細胞
を回収しホタル由来ルシフェラーゼ活性およびシーパン
ジー由来ルシフェラーゼ活性を測定する。
【００３８】
【発明の効果】本発明により、脂肪酸合成を増加するこ
となく、LDL受容体活性を上げることのできる薬剤、従
って、SREBP作用活性化で生じる脂肪肝を併発しない安
全な高脂血症治療剤を提供することが可能となり、その
産業上の利用価値は極めて大きい。
となく、LDL受容体活性を上げることのできる薬剤、従
って、SREBP作用活性化で生じる脂肪肝を併発しない安
全な高脂血症治療剤を提供することが可能となり、その
産業上の利用価値は極めて大きい。
【図１】SREBPアイソフォームの構造とそれぞれの核移
行型、ならびにSREBPの小胞体膜からの切り出しによる
核への移行を示す模式図である。
行型、ならびにSREBPの小胞体膜からの切り出しによる
核への移行を示す模式図である。
【図２】SREBP-2による転写活性化の結果生じる細胞の
脂質代謝の変化を検討するための細胞系の構築を示す。
脂質代謝の変化を検討するための細胞系の構築を示す。
【図３】SREBP-1及びSREBP-2によるLDL受容体の発現の
制御メカニズムを示す模式図である。
制御メカニズムを示す模式図である。
【図４】本発明のスクリーニング方法の一例を示す模式
図である。
図である。
【図５】本発明のスクリーニング方法の一例を示す模式
図である。
図である。
Claims (6)
- 【請求項１】SREBP（ステロール応答性エレメント結合
タンパク質）-2の作用を選択的に増加させる薬剤をスク
リーニングする方法。 - 【請求項２】SREBP-1及びSREBP-2を発現している細胞に
被検薬剤を作用させ、SREBP-1の作用の増加に比べてSRE
BP-2の作用の増加が大きい薬剤を同定することにより行
う請求項１記載のスクリーニング方法。 - 【請求項３】SREBP-2の作用の測定を、SREBP-2遺伝子の
転写効率増加、SREBP-2 mRNAの安定性増加、SREBP-2 mR
NAの翻訳効率増加、SREBP-2タンパク質安定性増加、SRE
BP-2タンパク質の核移行型への切断増加、SREBP-2タン
パク質核移行増加、SREBP-2の転写活性増加、核内でのS
REBP-2への転写活性化因子結合増強から選択される１つ
以上を指標とし、SREBP-1の対応する指標と比較するこ
とによって行う請求項１又は２記載のスクリーニング方
法。 - 【請求項４】SRE結合領域を他のタンパク質に置き換え
たSREBP-2融合タンパク質遺伝子を用いてSREBP-2の作用
増加活性を測定する請求項１〜３のいずれかに記載のス
クリーニング方法。 - 【請求項５】SREBP-2の作用を選択的に増加させる薬剤
を含む高脂血症治療薬。 - 【請求項６】請求項１の方法によりスクリーニングされ
た薬剤を含む高脂血症治療薬。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP9228267A JPH1156397A (ja) | 1997-08-25 | 1997-08-25 | 高脂血症治療薬のスクリーニング方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP9228267A JPH1156397A (ja) | 1997-08-25 | 1997-08-25 | 高脂血症治療薬のスクリーニング方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH1156397A true JPH1156397A (ja) | 1999-03-02 |
Family
ID=16873803
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP9228267A Pending JPH1156397A (ja) | 1997-08-25 | 1997-08-25 | 高脂血症治療薬のスクリーニング方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH1156397A (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2008137767A1 (en) * | 2007-05-04 | 2008-11-13 | Oregon Health & Science University | Tandem mass spectrometry for detecting and/or screening for conditions associated with altered sterols |
-
1997
- 1997-08-25 JP JP9228267A patent/JPH1156397A/ja active Pending
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2008137767A1 (en) * | 2007-05-04 | 2008-11-13 | Oregon Health & Science University | Tandem mass spectrometry for detecting and/or screening for conditions associated with altered sterols |
| US8158435B2 (en) | 2007-05-04 | 2012-04-17 | Oregon Health & Science University | Tandem mass spectrometry for detecting and/or screening for conditions associated with altered sterols |
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