JPH11511970A

JPH11511970A - 化学化合物

Info

Publication number: JPH11511970A
Application number: JP9509938A
Authority: JP
Inventors: ブレイキー，デイヴィッド・チャールズ; デイヴィーズ，デイヴィッド・ハウ; ダウェル，ロバート・イアン; ヘナム，ジョン・フレデリック; マーシャム，ピーター・ロバート; スレイター，アンソニー・マイケル; エンヌカン，ローラン・フランソワーズ・アンドレ
Original assignee: ゼネカ・リミテッド
Priority date: 1995-08-16
Filing date: 1996-08-13
Publication date: 1999-10-19
Also published as: HUP9900062A2; CN1193278A; MX9800967A; TR199800233T1; HUP9900062A3; CZ43098A3; AU707689B2; IL123271A0; BR9610050A; GB9726893D0; GB2317387B; NO980630L; AU6747696A; GB2317387A; NO980630D0; KR19990036383A; PL325017A1; US6436691B1; CA2227040A1; EP0844885A2

Abstract

(57)【要約】突然変異カルボキシペプチダーゼＢ（ＣＰＢ）酵素に基づく癌で用いるための抗体に支配された酵素プロドラッグ療法（ＡＤＥＰＴ）システム。ＡＤＥＰＴのための酵素結合体は、ヒトにおいて実質的に非免疫原性であり、腫瘍関連抗原と結合することができる標的到達部分（例えば、抗体）を含み、該標的到達部分は、プロドラッグを抗腫瘍性薬に変換することができるＣＰＢ酵素の突然変異型に対して結合していて、ここにおいて、該プロドラッグは、ヒトにおいて天然の非突然変異酵素によって抗腫瘍性薬にほとんど変換されない。好ましい酵素突然変異体は、２５３位にＬｙｓまたはＡｒｇ残基を含むヒト膵臓ＣＰＢである。適当なマスタードプロドラッグを本明細書中で開示する。

Description

【発明の詳細な説明】化学化合物本発明は、ＡＤＥＰＴ系でプロドラッグと一緒に用いるための突然変異ＣＰＢ酵素に関する。略号ＡｃアセチルＡＤＥＰＴ抗体に支配された酵素プロドラッグ療法ＢＯＣｔ−ブトキシカルボニルＣＰＢカルボキシペプチダーゼＢＤＣＣＩ１，３−ジシクロヘキシルカルボジイミドＤＭＡＰ４−ジメチルアミノピリジンＤＭＦＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミドＤＭＳＯジメチルスルホキシドＥｔエチルＥＤＣＩ１−（３−ジメチルアミノプロピル）−３−エチルカルボジイミドＨＣＰＢヒトＣＰＢＨＯＢＴ１−ヒドロキシベンゾトリアゾールＰＣＲポリメラーゼ連鎖反応ＴＦＲトリフルオロ酢酸ＴＨＦテトラヒドロフラン患者の癌細胞を選択的に死滅させるための薬物のターゲッティングは、長い間、医学的研究の課題であった。ＡＤＥＰＴは、その課題を克服する一つのアプローチである。ＡＤＥＰＴは、酵素に結合した抗体などの腫瘍選択的薬剤を用いる。その結合体を患者に投与して（通常、静脈内）、１か所または複数の腫瘍部位に局在化させ且つ全身循環から除去させる。次に、プロドラッグを患者に投与するが、これは(腫瘍部位に局在した)酵素によって変換されて、腫瘍細胞を死滅させる細胞障害性薬になる。酵素１分子が多数の細胞障害性薬分子の生産を触媒しうるので、増幅作用が生じる。更に、抗体によって認識される抗原を示さない腫瘍細胞（腫瘍は、通常、微小不均一性を示す）もまた、酵素によって増幅される細胞障害性薬の生産によって死滅する。既知の系は、原核性酵素カルボキシペプチダーゼＧ２（ＣＰＧ２）を酵素成分として用いる（ＷＯ88/07378号を参照されたい）。既知の系でのもう一つの課題は、結合体の反復投与が宿主免疫応答を引き起こして、その療法の効力を少なくすることである。抗体成分は、概して、マウス単クローン性抗体であり、これは、既知の技法を用いてヒト化して、免疫原性を低下させることができる。しかしながら、酵素成分の免疫原性の低下は、更に問題であることが判った。これは、その酵素成分がヒト宿主循環中で天然に存在してはならないためであり、さもなければ、プロドラッグの細胞障害性薬への未成熟変換が起こるであろうし、そして腫瘍に対する選択的細胞障害性はほとんど見られないであろう。これらの課題は、国際特許出願ＷＯ95/13095号（ウェルカム財団（Wellcome F oundation））によってある程度取り組まれてきた。この出願は、該当する天然酵素によって活性化されないプロドラッグを活性化させるのに突然変異哺乳動物酵素を用いるＡＤＥＰＴを提案した。しかしながら、カルボキシペプチダーゼＡの突然変異体を用いるＡＤＥＰＴ系のみがその開示で可能になった。本発明の一つの態様により、ヒトにおいて実質的に非免疫原性である結合体であって、腫瘍関連抗原と結合することができる標的到達（targeting）部分を含み、該標的到達部分が、プロドラッグを抗腫瘍性薬に変換することができるカルボキシペフチダーゼＢ（ＣＰＢ）酵素の突然変異型に対して結合していて、ここにおいて、該プロドラッグは、ヒトにおいて天然の非突然変異酵素によって抗腫瘍性薬にほとんど変換されない上記結合体を提供する。好ましくは、該標的到達部分は抗体である。好ましくは、該抗体はＦ（ａｂ′）２抗体フラグメントである。好ましくは、該酵素は、相補的極性を有するプロドラッグを代謝回転できるようなその活性部位の極性変化を含むように突然変異している。好ましくは、該酵素は、次の膵臓ヒトＣＰＢ突然変異体、Ａｒｇ、Ａｓｎ、ＧｌｎまたはＬｙｓのいずれか一つによって置換されたアミノ酸Ａｓｐ２５３を、場合により、Ａｒｇ、ＬｙｓまたはＡｓｎのいずれか一つによって置換された天然のアミノ酸Ｇｌｎ５４；Ｖａｌ、Ｌｅｕ、ＩｌｅまたはＡｌａのいずれか一つによって置換された天然のアミノ酸Ａｓｐ１４５；ＳｅｒまたはＴｈｒのいずれか一つによって置換された天然のアミノ酸Ｉｌｅ２０１；Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ｈｉｓ、ＬｙｓまたはＡｒｇのいずれか一つによって置換された天然のアミノ酸Ｓｅｒ２０５；Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ｌｙｓ、ＡｒｇまたはＨｉｓのいずれか一つによって置換された天然のアミノ酸Ｉｌｅ２４５；Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ、ＳｅｒまたはＴｈｒのいずれか一つによって置換された天然のアミノ酸Ａｌａ２４８；Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ｓｅｒ、Ｇｌｎ、Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｖａｌ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ａｌａまたはノルロイシンのいずれか一つによって置換された天然のアミノ酸Ｇｌｙ２５１；およびＳｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｌａ、Ｖａｌ、ＬｅｕまたはＩｌｅのいずれか一つによって置換された天然のアミノ酸Ｃｙｓ２８８から選択されるいずれか一つまたはそれ以上のアミノ酸置換との組合せで有する膵臓ヒトＣＰＢ突然変異体のいずれか一つである。更に好ましくは、該酵素は、次の膵臓ヒトＣＰＢ突然変異体、ＡｒｇまたはＬｙｓのいずれか一つによって置換された天然アミノ酸Ａｓｐ２５３およびＴｈｒ、Ａｓｎ、Ｓｅｒ、Ｇｌｎ、ＬｙｓまたはＶａｌのいずれか一つによって置換された天然のアミノ酸Ｇｌｙ２５１を、場合により、Ａｒｇによって置換された天然のアミノ酸Ｇｌｎ５４；Ａｌａによって置換された天然のアミノ酸Ａｓｐ１４５；Ｓｅｒによって置換された天然のアミノ酸Ｉｌｅ２０１；Ａｓｎによって置換された天然のアミノ酸Ｓｅｒ２０５；Ｓｅｒ、ＡｌａまたはＨｉｓのいずれか一つによって置換された天然のアミノ酸Ｉｌｅ２４５；Ｈｉｓ、ＳｅｒまたはＡｓｎのいずれか一つによって置換された天然のアミノ酸Ａｌａ２４８；およびＳｅｒまたはＡｌａのいずれか一つによって置換された天然のアミノ酸Ｃｙｓ２８８から選択されるいずれか一つまたはそれ以上のアミノ酸置換との組合せで有する膵臓ヒトＣＰＢ突然変異体のいずれか一つである。更に好ましくは、該酵素は、次の膵臓ヒトＣＰＢ突然変異体、ＡｒｇまたはＬｙｓのいずれか一つによって置換された天然アミノ酸Ａｓｐ２５３およびＴｈｒ、ＡｓｎまたはＳｅｒのいずれか一つによって置換された天然のアミノ酸Ｇｌｙ２５１を、場合により、Ａｒｇによって置換された天然のアミノ酸Ｇｌｎ５４；Ａｌａによって置換された天然のアミノ酸Ａｓｐ１４５；Ｓｅｒによって置換された天然のアミノ酸Ｉｌｅ２０１；Ａｓｎによって置換された天然のアミノ酸Ｓｅｒ２０５；Ａｌａによって置換された天然のアミノ酸Ｉｌｅ２４５；ＳｅｒまたはＡｓｎのいずれか一つによって置換された天然のアミノ酸Ａｌａ２４８；およびＳｅｒによって置換された天然のアミノ酸Ｃｙｓ２８８から選択されるいずれか一つまたはそれ以上のアミノ酸置換との組合せで有する膵臓ヒトＣＰＢ突然変異体のいずれか一つである。特に、該酵素は、次の膵臓ヒトＣＰＢ突然変異体、Ｄ２５３Ｋ；Ｄ２５３Ｒ；［Ｇ２５１Ｎ，Ｄ２５３Ｋ］；［Ｇ２５１Ｔ，Ｄ２５３Ｋ］；［Ｇ２５１Ｓ，Ｄ２５３Ｋ］；［Ｇ２５１Ｔ，Ｄ２５３Ｒ］；［Ａ２４８Ｓ，Ｇ２５１Ｔ，Ｄ２５３Ｋ］；［Ａ２４８Ｎ，Ｇ２５１Ｎ，Ｄ２５３Ｋ］；［Ａ２４８Ｓ，Ｇ２５１Ｎ，Ｄ２５３Ｋ］；または［Ｓ２０５Ｎ，Ｇ２５１Ｎ，Ｄ２５３Ｋ］のいずれか一つである。本発明のもう一つの態様により、宿主中で用いるために設計された対合二成分系であって、該成分が、（ｉ）腫瘍関連抗原と結合することができる標的到達部分である第一成分であって、該標的到達部分が、プロドラッグを抗腫瘍性薬に変換することができるＣＰＢ酵素に対して結合している該第一成分；および（ii）該酵素の影響下で抗腫瘍性薬に変換できるプロドラッグである第二成分を含み；ここにおいて、該酵素はＣＰＢ酵素の突然変異型であり；該第一成分は、宿主中において実質的に非免疫原性であり；そして該プロドラッグは、宿主中において天然の非突然変異宿主酵素によって抗腫瘍性薬にほとんど変換されない上記対合二成分系を提供する。「プロドラッグは、宿主中において天然の非突然変異宿主酵素によって抗腫瘍性薬にほとんど変換されない」という用語は、そのプロドラッグが、宿主に対して投与上の不適当な標的不到達の毒性問題を与えないことを意味する。「実質的に非免疫原性」という用語は、第一成分（結合体）を、例えば、ヒト宿主中での細菌酵素に対して結合したマウス抗体の使用で見られたような有意の宿主免疫応答を引き起こすことなく、宿主に対して２回以上投与することができることを意味する。好ましくは、突然変異酵素は、系の使用が予定されている宿主と同じ種からの酵素に基づくが、不適当な免疫原性問題を生じないように酵素の構造が種間で充分に保存されている限りにおいて、突然変異酵素は別の種の宿主酵素に基づくことができる。好ましくは、標的到達部分は、抗体、特に、例えば、Ｆ（ａｂ′）₂などの抗体フラグメントである。結合体合成のための酵素に対する結合は、異種二機能性試薬のクロスリンカーとしての使用などの既知の方法によってまたは遺伝子融合若しくは何等かの他の適当な方法によって行うことができる。抗体は、同一宿主からであってよいし（例えば、マウスでのマウス抗体の使用）または抗体は、選択された宿主においてそれが異種としてほとんど認識されないように操作されていてよい（例えば、ヒトにおけるキメラ、ＣＤＲ移植または被覆マウス抗体の使用）。好ましくは、第一成分は、上で定義の結合体である。ヒト抗体の定常ドメイン中への齧歯類動物抗体の可変ドメインの移植（キメラ抗体）またはヒト抗体中への齧歯類動物抗体の抗原結合ループ（ＣＤＲ）の構築（ＣＤＲ移植）は両方とも、サルおよび患者での前臨床研究において齧歯類動物抗体の免疫原性を大きく低下させることが示された。ＣＤＲ移植抗体でさえ、齧歯類動物抗体配列からの極めて多数の（＞５０）アミノ酸をヒトフレームワーク中に包含する。これにもかかわらず、サルおよび患者では、大きく低下した免疫原性が報告された。これは、宿主酵素の触媒部位の極めて限られた数のアミノ酸の突然変異が、最小の免疫原性および非宿主酵素よりも確実に低い免疫原性を有する酵素を生じるらしいという根拠を与える。読者は、次の参考文献に導かれる。A.MountainおよびJ.R.Adair，Biotechnology and Genetic Engineering Revie ws 10,1-142,1992；G.WinterおよびW.J.Harris，Trends in Pharmacological Sc iences,14,139-143,1993；I.I.Singerら，J.Immunol.150,2844-57,1993；J.Haki miら，J.Immunol.147,11352-59,1991；およびJ.D.Isacsら，The Lancet,340,748 -752,1992。定常領域ドメインは、例えば、ヒトＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＧまたはＩｇＭドメインであってよい。ヒトＩｇＧ２および３（特に、ＩｇＧ２）が好ましいが、ＩｇＧ１および４イソ型もまた用いることができる。ヒト抗体を生じるように遺伝子操作されたマウスで生産されたものなどのヒト抗体自体もまた用いることができる。（Fishwaldら，Nature Biotechnology(1996),14,845-851中）。宿主酵素を突然変異させて、天然の宿主酵素と比較された基質の認識の点から、酵素とプロドラッグとの間の相互作用の様式を変化させる。好ましくは、酵素突然変異は、相補的極性を有するプロドラッグを代謝回転できるようなその酵素活性部位の極性変化であり、プロドラッグは、非突然変異宿主酵素によってほとんど代謝回転されない。好ましくは、天然の宿主酵素は、その天然の基質をイオン対相互作用によって認識し、そしてこの相互作用は、突然変異酵素および相補的プロドラッグの設計において逆行する。本明細書中において、「活性部位」という用語には、基質認識および／または触媒機能のいずれの態様にも関与するアミノ酸残基が含まれる。点突然変異は、次のように、天然のアミノ酸（１文字命名法を用いる）、位置、新規アミノ酸について言及されるであろう。例えば、「Ｄ２５３Ｋ」は、成熟活性ＨＣＰＢの２５３位で、アスパラギン酸（Ｄ）がリシン（Ｋ）に変更されたことを意味する。一つの酵素での多数の突然変異は、コンマで隔てられた個々の突然変異を含む角括弧間に示されるであろう。本明細書中において、ＣＰＢという用語には、特に断らない限りまたは前後関係から自明の、次のもの（ｉ）「標識」（例えば、ｃ−ｍｙｃ）を含むまたは含まない酵素の成熟型、プロ型およびプレプロ型；（ii）鍵基質結合部位１８７〜２０６および２３８〜２６８それぞれの中の成熟活性膵臓ＨＣＰＢと実質的配列同一性を有する（好ましくは、少なくとも６０％同一、更に好ましくは、少なくとも７０％同一、更に好ましくは、少なくとも８０％同一、そして特に、少なくとも９０％同一）Ｃ末端にＬｙｓまたはＡｒｇを有するペプチド基質に関して特異性を有する任意のカルボキシペプチダーゼ；好ましくは、ヒト膵臓および血漿ＣＰＢ酵素（本明細書中で開示された膵臓酵素が好ましい）が含まれる。ＣＰＢの天然に存在する対立遺伝子変異型もまた考えられる。対立遺伝子変異型は、１か所またはそれ以上の位置に置換、欠失または付加を有することができる別の形の配列であり、これは、ＣＰＢの機能をほとんど変更していない。カルボキシペプチダーゼと成熟活性膵臓ＨＣＰＢとの間のその鍵基質結合部位での同一性の度合いを確認するために、次の手順を行って配列を並べる。配列番号：３９のアミノ酸残基１０９〜４１５を１〜３０７と番号を付け直し、そして the LASERGENE biocomputing software for MACINTOSH User's Guide,A Manual for the LASERGENE systems（第２版，1994年，DNASTAR Inc.発行，サウス・パーク・ストリート（South Park Street）1228，マディソン、ウィスコンシン州5 3715，米国）で記載のようにＰＡＭ２５０残基操作を伴うクラスタル（Clustal ）法を用いて他のカルボキシペプチダーゼと一緒に並べた場合、鍵亜鉛結合残基（Ｈ６６、Ｅ６９およびＨ１９４で）、鍵末端カルボキシ基質結合残基（Ｒ１２４、Ｎ１４１、Ｒ１４２およびＹ２４６で）および触媒残基（Ｒ１２４、Ｙ２４６およびＥ２６８で）は、本質的に並べられる。鍵基質認識残基は、Ｄ２５３であると考えられ、その基質認識ポケットは、コアβシート（残基１８７〜２０６を含む）と活性部位表面ループおよびヘリックス（残基２３８〜２６８）との間にある。残基２６３〜２６８（配列２３８〜２６８中）は、それらがコアβシートの一部分であるとはいえ、β鎖である。本発明の突然変異ＣＰＢは、本発明に必要な所望の特性を有する上のＣＰＢのいずれかの突然変異体である。膵臓ＨＣＰＢの次の突然変異体、Ｄ２５３Ｋ、Ｄ２５３Ｒ；そして特に、［Ｇ２５１Ｎ，Ｄ２５３Ｒ］が好ましく；他のＣＰＢでの対応する突然変異もまた考えられる。鍵突然変異位置もまた、次の表で示される。本発明の突然変異ＣＰＢはまた、鍵突然変異の特性をほとんど変更しない他の「保存的」突然変異（挿入、置換および／または欠失）を含むことができる。本書の目的のためには、保存的アミノ酸置換は、天然に存在する確率が、偶然に起こる置換の確率の１０倍より大きい置換であり（Dayhoffら，Atlas of Protein Sequence and Structure,1971,95-96頁および図9-10で記載された計算法によって定義される）、次の表で示された通りである。ＣＰＢについての参考文献としては、次のもの、Folk JE，The Enzymes III巻，Academic Press（1971），57頁中；Coll Mら（1991）EMBO Journal 10,1-9；E aton DLら（1991）J Biol Chem 266,21833-21838；Yamamoto Kら（1992）J Biol Chem 267,2575-2581；米国特許第5364934号（Genetech）；および国際特許出願ＷＯ95/14096号（Eli Lilly）がある。本発明のもう一つの態様により、宿主中の腫瘍細胞の成長を制御する方法で用いるための前に定義の系であって、該方法が、該宿主に対する有効量の第一成分の投与、該第一成分を全身循環から実質的に除去させること、および有効量の第二成分を投与することを含む上記系を提供する。好ましくは、該成分は静脈内投与される。本発明のもう一つの態様により、宿主中の腫瘍細胞を処置する方法であって、該方法が、該宿主に対する有効量の第一成分の投与、該第一成分を全身循環から実質的に除去させること、および有効量の第二成分を投与することを含み、ここにおいて、該成分が、本明細書中に定義の二成分系を形成する上記方法を提供する。好ましくは、該成分は静脈内投与される。本発明のもう一つの態様により、有効な腫瘍限局性量の前に定義の第一成分および薬学的に許容しうる担体または希釈剤を含む薬剤組成物を提供する。好ましくは、該組成物は、静脈内投与に適している。好ましくは、該第一成分は、使用前に適当な希釈剤で再構成される乾燥固体として与えられる。本発明のもう一つの態様により、有効な抗腫瘍量の前に定義の第二成分および薬学的に許容しうる担体または希釈剤を含む薬剤組成物を提供する。好ましくは、該組成物は、静脈内投与に適している。好ましくは、該第二成分は、使用前に適当な希釈剤で再構成される乾燥固体として与えられる。ｐＣＧ330（ｐＩＣＩ1698としても知られる）を含有する大腸菌（E.coli）ＭＳＤ1646は、ブダペスト条約に基づき、１９９４年１１月２３日に、the Nation al Collection of Industrial and Marine Bacteria（ＮＣＩＭＢ），マカー・ドライブ（Machar Drive）２３地区，アバディーン，スコットランド，英国ＡＢ２１ＲＹで寄託されており、その寄託番号はＮＣＩＭＢ40694である。ＮＣＩＭＢ40694は、本発明のもう一つの態様である。抗体Ａ５Ｂ７は、ハイブリドーマ寄託番号93071411として、ブダペスト条約に基づき、１９９３年７月１４日に、ECACC,PHLS Centre for Applied Microbiolo gy & Research，ポートン・ダウン（Porton Down），ソールズベリー，ウィルトシャーＳＰ４ＯＪＧ，英国で寄託された。Ｆ（ａｂ′）₂の形のヒト化抗体Ａ５Ｂ７が好ましい。抗体806.077は、ハイブリドーマ寄託番号96022936として、ブダペスト条約に基づき、１９９６年２月２９日に、ECACC,PHLS centre for Applied Microbiolo gy & Research，ポートン・ダウン，ソールズベリー，ウィルトシャーＳＰ４ＯＪＧ，英国で寄託された。抗体806.077は、本発明において用いるのに適しているＡ５Ｂ７に対する別の抗ＣＥＡ抗体である。本発明のもう一つの態様により、本明細書中に定義の第一成分（結合体）を製造する方法であって、腫瘍関連抗原と結合することができる標的到達部分；およびプロドラッグを抗腫瘍性薬に変換することができる酵素であって、宿主ＣＰＢ酵素の突然変異型である該酵素を結合することによる上記方法を提供する。結合は、化学的または分子生物学的技法によって行うことができる。本発明のもう一つの態様により、本発明の第一成分を提供する。本発明のもう一つの態様により、本発明の第一成分（結合体）をコードすることができるポリヌクレオチド配列を提供する。本発明のもう一つの態様により、本発明の第一成分をコードすることができるポリヌクレオチド配列を含むベクターを提供する。本発明のもう一つの態様により、本発明の第一成分をコードすることができるベクターまたはポリヌクレオチド配列を含む細胞を提供する。本発明のもう一つの態様により、本発明の所望の特性を有する突然変異ＣＰＢ酵素を提供する。本発明のもう一つの態様により、本発明の突然変異ＣＰＢ酵素をコードすることができるポリヌクレオチド配列を提供する。本発明は、更に、配列間に少なくとも７０％同一性がある場合に、突然変異ＣＰＢをコードするポリヌクレオチド配列に対してハイブリッド形成するポリヌクレオチドに関する。本発明は、特に、上記ポリヌクレオチドに対して緊縮条件下でハイブリッド形成するポリヌクレオチドに関する。本明細書中で用いられる「緊縮条件」という用語は、配列間に少なくとも９５％、好ましくは少なくとも９７％同一性がある場合にのみハイブリダイゼーションが起こることを意味する。本発明のもう一つの態様により、本発明の突然変異ＣＰＢ酵素をコードすることができるポリヌクレオチド配列を含むベクターを提供する。該ポリヌクレオチド配列は、種々の発現ビヒクルのいずれか一つ、詳しくは、ポリペプチドを発現するためのベクターまたはプラスミド中に含まれることができる。このようなベクターとしては、染色体、非染色体および合成のＤＮＡ配列、例えば、ＳＶ４０の誘導体；細菌プラスミド；ファージＤＮＡ；酵母プラスミド；プラスミドおよびファージＤＮＡの組合せから誘導されたベクター、ワクシニア、アデノウイルス、鶏痘ウイルスおよび仮性狂犬病などのウイルスＤＮＡがある。しかしながら、他のいずれのプラスミドまたはベクターも、それらが宿主中で複製可能であり且つ生存可能でありさえすれば用いることができる。適当なＤＮＡ配列は、様々な手順によってベクター中に挿入することができる。概して、ＤＮＡ配列は、当該技術分野において知られている手順によって、１か所または複数の適当な制限エンドヌクレアーゼ部位中に挿入される。このような手順およびその他は、当業者の知識の範囲内であると考えられる。発現ベクター中のＤＮＡ配列は、一つまたは複数の適当な発現制御配列（プロモーター）に対して機能的に結合されて、ｍＲＮＡ合成を支配する。このようなプロモーターの典型的な例として、原核性または真核性細胞またはそれらのウイルス中の遺伝子の発現を制御することが知られている、ＬＴＲまたはＳＶ４０プロモーター、大腸菌ｌａｃまたはｔｒｐ、ファージλ Ｐ．ｓｕｂ．Ｌプロモーターおよび他のプロモーターを挙げることができる。発現ベクターはまた、翻訳開始および転写終結のためのリボソーム結合部位を有する。ベクターはまた、発現を増幅するのに適当な配列を含むことができる。更に、発現ベクターは、好ましくは、真核性細胞培養物でのジヒドロ葉酸レダクターゼまたはネオマイシン耐性などのまたは大腸菌でのテトラサイクリンまたはアンピシリン耐性などの、形質転換された宿主細胞の選択に関して表現型の特徴を与える遺伝子を有する。上記の適当なＤＮＡ配列、更には、適当なプロモーターまたは制御配列を含有するベクターは、適当な宿主がタンパク質を発現できるように、その宿主を形質転換するのに用いることができる。適当な宿主の典型的な例として、大腸菌、ストレプトミセス属（Streptomyces）、ネズミチフス菌（Salmonella Typhimurium）などの細菌細胞；酵母などの真菌細胞；キイロショウジョウバエ（Drosophila）およびＳｆ９などの昆虫細胞；ＮＳＯ、ＣＨＯ、ＣＯＳまたはボウズ（Bowes）黒色腫などの動物細胞；植物細胞等を挙げることができる。適当な宿主の選択は、本明細書中の教示から、当業者の知識の範囲内であると考えられる。更に詳しくは、本発明は、更に、上で大まかに記載の配列の一つまたはそれ以上を含む組換え構築物を包含する。該構築物は、本発明の配列が中に挿入されたプラスミドまたはウイルスベクターなどの、前進方向または逆方向のベクターを含む。この実施態様の好ましい態様において、該構築物は、例えば、プロモーターを含めた、配列に対して機能的に結合した調節配列を含む。極めて多数の適当なベクターおよびプロモーターが当業者に知られており、しかも商業的に入手可能である。次のベクターを例として与える。細菌性：ｐＱＥ 70、ｐＱＥ60、ｐＱＥ-9（Qiagen）、ｐｂｓ、ｐＤ10、phagescript、ｐｓｉＸ1 74、pbluescript ＳＫ、ｐｂｓｋｓ、ｐＮＨ８Ａ、ｐＮＨ16ａ、ｐＮＨ18Ａ、ｐＮＨ46Ａ（Stratagene）；ｐｔｒｃ99ａ、ｐＫＫ223-3、ｐＫＫ233-3、ｐＤＲ54 0、ｐＲＩＴ５（Pharmacia）。真核性：ｐＷＬＮＥＯ、ｐＳＶ２ＣＡＴ、ｐＯＧ 44、ｐＸＴ１、ｐＳＧ（Stratagene）ｐＳＶＫ３、ｐＢＰＶ、ｐＭＳＧ、ｐＳＶＬ（Pharmacia）。しかしながら、いずれの他のプラスミドまたはベクターも、それらが宿主中で複製可能であり且つ生存可能でありさえすれば用いることができる。プロモーター部分は、選択可能なマーカーを含むＣＡＴ（クロラムフェニコールトランスフェラーゼ）ベクターまたは他のベクターを用いて何等かの望ましい遺伝子から選択することができる。二つの適当なベクターは、ＰＫＫ232- 8およびＰＣＭ７である。具体的に名前が挙げられる細菌プロモーターとしては、ｌａｃＩ、ｌａｃＺ、Ｔ３、Ｔ７、ｇｐｔ、λＰ．ｓｕｂ．Ｒ、Ｐ．ｓｕｂ．Ｌおよびｔｒｐがある。真核性プロモーターとしては、ＣＭＶ即時(immediate e ar ly)型、ＨＳＶチミジンキナーゼ、初期および後期ＳＶ４０、レトロウイルスからのＬＴＲ、およびマウスメタロチオネイン−Ｉがある。適当なベクターおよびプロモーターの選択は、充分に当該技術水準の範囲内である。もう一つの実施態様において、本発明は、上記構築物を含有する宿主細胞に関する。該宿主細胞は、哺乳動物細胞などの高等真核生物細胞若しくは酵母細胞などの下等真核生物細胞でありうるし、または宿主細胞は、細菌細胞などの原核生物細胞でありうる。宿主細胞中への構築物の導入は、例えば、リン酸カルシウムトランスフェクション、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介トランスフェクション、リポフェクション（ポリヌクレオチドの陽イオン脂質媒介供給［Felgnerら，Metho ds:A Companion to Methods in Enzymology(1993)5,67-75中］またはエレクトロポレーション（Davis,L.，Dibner,M.，Battey,I.，Basic Methods in Molecular Biology,(1986)）によって行うことができる。当該読者は、ある与えられた宿主に最も適した方法を選択することができるであろう。宿主細胞中の構築物は、慣用法で用いられて、組換え体配列によってコードされた遺伝子産物を生じることができる。或いは、本発明のポリペプチドは、慣用的なペプチドシンセサイザーによって合成することができる。成熟タンパク質は、哺乳動物細胞、酵母、細菌または他の細胞中において適当なプロモーターの制御下で発現されうる。細胞不含翻訳系もまた、本発明のＤＮＡ構築物に由来するＲＮＡを用いてこのようなタンパク質を製造するのに用いることができる。原核性および真核性宿主で用いるのに適当なクローニングおよび発現ベクターは、Sambrookら，Molecular Clon ing:A Laboratory Manual，第２版，コールド・スプリング・ハーバー（Cold Sp ring Harbor），ニューヨーク（1989）で記載され、その開示は本明細書に援用される。本発明のポリペプチドをコードしているＤＮＡの高等真核生物による転写は、エンハンサー配列をベクター中に挿入することによって増加する。エンハンサーは、プロモーターに対して作用してその転写を増加させる、通常約１０〜３００ｂｐの、ＤＮＡのｃｉｓ作用要素である。例としては、複製起点ｂｐ１００〜２７０の後期側のＳＶ４０エンハンサー、サイトメガロウイルス初期プロモーターエンハンサー、複製起点の後期側のポリオーマエンハンサー、およびアデノウイルスエンハンサーがある。概して、組換え発現ベクターは、宿主細胞の形質転換を可能にする複製起点および選択可能なマーカー、例えば、大腸菌およびＳ．セレビシエ（cerevisiae）ＴＲＰ１遺伝子のアンピシリン耐性遺伝子、並びに下流構造配列の転写を支配する高度に発現された遺伝子に由来するプロモーターを含むであろう。このようなプロモーターは、特に、３−ホスホグリセリン酸キナーゼ（ＰＧＫ）などの解糖酵素、α因子、酸性ホスファターゼまたは熱ショックタンパク質をコードしているオペロンから誘導することができる。異型構造配列は、適当な段階で、翻訳開始および終結配列、好ましくは、翻訳されたタンパク質の細胞周辺腔または細胞外培地中への分泌を支配することができるリーダー配列と一緒に組み立てられる。場合により、異型配列は、望まれる特性、例えば、発現された組換え産物の安定化または簡単な精製を与えるＮ末端識別ペプチドを含めた融合タンパク質をコードすることができる。細菌用途に有用な発現ベクターは、望ましいタンパク質をコードしている構造ＤＮＡ配列を、適当な翻訳開始および終結シグナルと一緒に、機能性プロモーターを用いて操作可能な機能的読取りフェーゼで挿入することによって構築される。ベクターは、１種類またはそれ以上の表現型選択可能マーカーと、ベクターの維持を確実にする、そして所望ならば、宿主中で増幅させる複製起点を含むであろう。形質転換に適当な原核性宿主としては、大腸菌、枯草菌（Bacillus subtilis）、ネズミチフス菌、並びにシュードモナス属（Pseudomonas）、ストレプトミセス属およびブドウ球菌属（S taphylococcus）の属中の様々な種があるが、その他も、好みの問題として用いることができる。典型的なものとしてであるが非制限例として、細菌用途に有用な発現ベクターは、周知のクローニングベクターｐＢＲ322（ＡＴＣＣ 37017）、ｐＡＴ153およびpBluescriptの遺伝要素を含む商業的に入手可能なプラスミドに由来する選択可能マーカーおよび細菌の複製起点を含むことができる。このような市販のベクターとしては、例えば、ｐＫＫ223-3（Pharmacia Fine Chemical s,ウプサラ，スウェーデン）およびＧＥＭ１（Promega Biotec，マディソン，ＷＩ，米国）がある。これらｐＢＲ322「主鎖」部分を、適当なプロモーターおよび発現される構造配列と組合せる。適当な宿主菌株の形質転換および該宿主菌株の適当な細胞密度までの成長後、選択されたプロモーターを適当な手段（例えば、温度シフトまたは化学的誘導）によって誘導し、細胞を追加の時間培養する。細胞は、典型的に、遠心分離によって採集され、物理的または化学的手段によって破壊され、そして得られた粗抽出物を更に精製用に保存する。タンパク質の発現で用いられる微生物細胞は、凍結融解サイクル、音波処理、機械的破壊または細胞溶解剤の使用を含めた何等かの慣用法によって破壊することができ、このような方法は当業者に周知である。種々の哺乳動物細胞培養系もまた、組換えタンパク質を発現させるのに用いることができる。哺乳動物発現系の例としては、 Gluzman,Cell,23:175(1981)で記載されたサル腎線維芽細胞のＣＯＳ−７系、および適合したベクターを発現することができる他の細胞系、例えば、ＮＳＯ、Ｃ１２７、３Ｔ３、ＣＨＯ、HeLaおよびＢＨＫ細胞系がある。哺乳動物発現ベクターは、複製起点、適当なプロモーターおよびエンハンサー、そして更に、何等かの必要なリボソーム結合部位、ポリアデニル化部位、スプライスドナーおよび受容体部位、転写終結配列、並びに５′フランキング非転写配列を含むであろう。ＳＶ４０スプライスに由来するＤＮＡ配列およびポリアデニル化部位もまた、必要な非転写遺伝要素を与えるのに用いることができる。発現産物は、硫酸アンモニウムまたはエタノール沈降、酸抽出、陰イオンまたは陽イオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロースクロマトグラフィー、疎水的相互作用クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィーヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィーおよびレクチンクロマトグラフィーを含めた方法によって組換え細胞培養物から回収され且つ精製される。精製中に存在するカルシウムイオンは低濃度（約０．１５〜５ｍＭ）であることが好ましい。（Priceら，J.Biol.Chem.,244: 917(1969)。タンパク質再生工程は、成熟タンパク質の立体配置を完成させる場合に、必要に応じて用いることができる。最後に、高性能液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を最終精製工程に用いることができる。本発明のポリペプチドは、自然に精製された生産物であってよいしまたは化学合成法の生産物であってよいし、または原核性若しくは真核性宿主からの（例えば、培養物中の細菌、酵母、高等植物、昆虫および哺乳動物細胞による）組換え技術によって製造されてよい。組換え体製造法で用いられる宿主に応じて、本発明のポリペプチドは、哺乳動物または他の真核性炭水化物を用いてグリコシル化されうるしまたは非グリコシル化されうる。本発明のポリペプチドはまた、初期メチオニンアミノ酸残基を含むことができる。他の発現系、例えば、トランスジェニック非ヒト哺乳動物も考えられ、この場合、好ましくはベクターから切り取られ且つ好ましくは、発現されたタンパク質を動物の乳中へ向ける乳房プロモーターに関連した目的の遺伝子は、哺乳動物接合体の前核中に（通常、前核中の二つの核の一方（通常、雄性核）へのマイクロインジェクションによって）導入され、次に、養母に内植される。養母によって生産される一部分の動物は、染色体中に組込まれた導入された遺伝子を有し且つ発現するであろう。通常、組込まれた遺伝子は、慣用的な繁殖によって子に伝えられ、したがって、系統の容易な増殖が可能になる。好ましくは、目的のタンパク質は、雌トランスジェニック動物の乳から簡単に採集される。読者は、次の刊行物に導かれる。Simonsら（1988），Bio/Technology 6:179-183；Wrightら（19 91）Bio/Technology 9:830-834；米国特許第4,873,191号；および米国特許第5,3 22,775号。マウス胚の操作は、Hoganら，“Manipulating the Mouse Embryo;A L aboratory Manual”，Cold Spring Harbor Laboratory 1986で記載されている。トランスジェニック植物技術、例えば、次の刊行物で記載されたものなども考えられる。Swain W.F.（1991）TIBTECH 9:107-109；Ma J.K.C.ら（1994）Eur.J. Immunology 24:131-138；Hiatt A.ら（1992）FEBS Letters 307:71-75；Hein M. B.ら（1991）Biotechnology Progress 7:455-461：Duering K.（1990）Plant Mo lecular Biology 15:281-294。所望ならば、宿主遺伝子は、下記で簡単に概説されたような、そして例えば、 “Gene Targeting;A Practical Approach”，IRL Press 1993で記載のような標準法を用いて不活性化することができるしまたは修飾することができる。標的遺伝子またはその部分は、好ましくは、その機能を破壊するように遺伝子中に挿入された選択マーカー（Ｎｅｏなど）を含むベクター中にクローン化される。ベクターは線状化された後、胚幹（ＥＳ）細胞（例えば、マウスの１２９／０１ａ系統に由来する）を形質転換し（通常、エレクトロポレーションによって）、そして次に、一部分の幹細胞で相同的組換えが起こる。遺伝子破壊を有する幹細胞を増殖させ、胚盤胞（例えば、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスからのような）中に注入し、そして発生のために養母に内植する。キメラの子は、外被色彩マーカーによって識別することができる。キメラを、ＥＳ由来配偶子と宿主胚盤胞由来配偶子との間に区別をつける遺伝マーカーを有するマウスに対して交配することによって繁殖させて、ＥＳ細胞の生殖細胞系への寄与を確かめる。ＥＳ細胞由来配偶子の半数は、遺伝子修飾を有するであろう。子をスクリーニングして（例えば、サザンブロッティング）、遺伝子破壊を有するもの（子孫の約５０％）を識別する。これらの選択された子はヘテロ接合であろうし、したがって、別のヘテロ接合体と交配され、そしてその後、ホモ接合の子を選択することができる（子孫の約２５％）。遺伝子ノックアウトを有するトランスジェニック動物は、ＤＮＡの前核中へのマイクロインジェクション、スフェロプラスト融合（Jakobovitsら（1993 ）Nature 362:255-258）またはＥＳ細胞の脂質媒介トランスフェクション（Lamb ら（1993）Nature Genetics 5 22-29）などの既知の技法によって生産されたトランスジェニック動物と交雑されて、内因性遺伝子ノックアウトおよび外来遺伝子置換を有するトランスジェニック動物を生じることができる。標的の遺伝子破壊を有するＥＳ細胞は、独特の変更を有する標的遺伝子配列を用いて形質転換することによって更に修飾することができ、好ましくは、これをベクター中にクローン化し、そして形質転換の前に線状化する。相同的組換えの後、変更された遺伝子をゲノム中に導入する。これら胚幹細胞は、引続き、上記のようにトランスジェニックを作るのに用いることができる。「宿主細胞」という用語には、例えば、細菌、酵母、植物細胞並びに非ヒト哺乳動物接合体、卵母細胞、胚盤胞、胚幹細胞およびトランスジェニック技術に適当な何等かの他の細胞などの発現技術に適したいずれの原核性または真核性細胞も含まれる。状況が許すならば、「宿主細胞」という用語には、形質転換された非ヒト哺乳動物接合体、卵母細胞、胚盤胞、胚幹細胞、植物細胞およびトランスジェニック技術に適当な何等かの他の細胞から発生したトランスジェニック植物または非ヒト哺乳動物も含まれる。本発明のもう一つの態様により、本発明の突然変異ＣＰＢ酵素をコードすることができるベクターまたはポリヌクレオチド配列を含む細胞を提供する。本発明のもう一つの態様により、２４３位でコードされたシステイン残基が存在する、１０９位から前方に配列番号：３９で定義された成熟ヒト膵臓カルボキシペプチダーゼＢまたはその突然変異体をコードしているヌクレオチド配列を提供する。クローン化された配列中の２４３位のこのシステイン残基は、Yamamotoらが、Jo urnal of Biological Chemistry，267巻，2575-2581,1992において、他の哺乳動物膵臓カルボキシペプチダーゼＢアミノ酸配列と並べた場合に、２４４番の位置の後の配列中にギャップを示して強調したように、他の公表されたヒト膵臓カルボキシペプチダーゼＢ配列中で見られない（参考例６の考察を参照されたい）。好ましくは、ヌクレオチド配列は単離状態、すなわち、何等かの天然に存在する形から少なくとも部分的に精製された状態にある。好ましくは、突然変異体は、本発明に適した突然変異ＣＰＢ酵素である。本発明のもう一つの態様により、２４３位でコードされたシステイン残基が存在するヒト膵臓カルボキシペプチダーゼＢまたはその突然変異体を製造する方法であって、２４３位でコードされたシステイン残基が存在する１０９位から前方に配列番号：３９で定義された成熟ヒト膵臓カルボキシペプチダーゼＢまたはその突然変異体をコードしているヌクレオチド配列の宿主細胞中での発現を含む上記方法を提供する。本発明のもう一つの態様により、式１［式中、Ｗは、直接結合またはＣＨ₂であり、Ｒ¹およびＲ²は、独立して、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉまたは−ＯＳＯ₂Ｍｅであり、Ｒ³およびＲ⁴は、独立して、Ｈ、Ｃ_1-3アルキル、Ｃ_1-3アルコキシ、ＦまたはＣｌＣ_1-4アルキルであり、またはＲ⁵およびＲ⁶は、独立して、ＨまたはＣ_1-4アルキルであり、またはＲ³およびＲ⁶が一緒になって−ＣＨ＝ＣＨ−ＣＨ＝ＣＨ−であって、Ｏ、ＮおよびＳから選択される１〜３個のヘテロ原子を有していてよい二環式環系を形成することができ、Ｘは、 −ＣＨＲ⁷ＣＨＲ⁸−、ここにおいて、Ｒ⁷およびＲ⁸は、Ｈおよび、少なくともＲ⁷またはＲ⁸がＨであるならばフェニルで置換されていてよいＣ_1-4アルキルから選択される； −ＮＨＣＨＲ⁹−、ここにおいて、Ｒ⁹は、Ｈ；例えば、Ａｌａ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｃｙｓ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、ＴｙｒおよびＶａｌの側鎖を含めた一般的なアミノ酸の側鎖；（ＣＨ₂）_nＣＯＮＨＲ¹⁰（式中、ｎ＝１〜３であり、Ｒ¹⁰は、Ｃ_1-6アルキル、シクロペンチル、シクロヘキシルおよびフェニルから選択され、そして前に挙げられたＲ¹⁰はそれぞれ、場合により、ハロゲン、Ｃ_1-4アルキルまたはＣ_1-4 アルコキシで置換される）から選択される； −ＮＨ−Ｎ（Ｒ¹²）−、ここにおいて、Ｒ¹²は、ＨおよびＣ_1-4アルキルから選択されるから選択され、Ｙは、ＮＨまたはＯであり、Ｚは、 −（ＣＨ₂）_n−ＣＯ₂Ｈ（ｎ＝１〜４） −ＣＨ₂ＯＣＨ₂ＣＯ₂Ｈ −ＣＨ₂−ＣＨ＝ＣＨ−ＣＯ₂Ｈ −（ＣＨ₂）_nテトラゾール−５イル（ｎ＝１〜４） −（ＣＨ₂）_nＣＯＮＨＳＯ₂Ｒ¹¹（ｎ＝１〜４）（式中、Ｒ¹¹は、Ｃ_1-4アルキルから選択される） −（ＣＨ₂）_nＳＯ₂ＮＨ₂（ｎ＝１〜４）から選択される］を有するプロドラッグおよびそれらの塩を提供する。本発明のもう一つの態様により、次の化合物、（ａ）Ｎ−（４−｛４−［ビス−（２−クロロエチル）−アミノ］−３−メチルフェノキシ｝−ベンゾイル）−Ｌ−アラニン；（ｂ）Ｎ−［Ｎ−（４−｛４−［ビス−（２−クロロエチル）−アミノ］−３ −メチルフェノキシ｝−ベンゾイル）−Ｌ−アラニン］−Ｌ−グルタミン酸；（ｃ）Ｎ−（４−｛４−［ビス−（２−クロロエチル）−アミノ］−フェノキシ｝−ベンゾイル）−Ｌ−アラニン；若しくは（ｄ）Ｎ−［Ｎ−（４−｛４−［ビス−（２−クロロエチル）−アミノ］−フェノキシ｝−ベンゾイル）−Ｌ−アラニン］−Ｌ−グルタミン酸またはその薬学的に許容しうる塩のいずれか一つを提供する。化合物（ｂ）および（ｄ）は、本発明の好ましいプロドラッグ第二成分である。化合物（ａ）および（ｃ）は、それらの対応する薬物である。本発明のもう一つの態様により、薬剤として用いるための式１を有する化合物または上記のプロドラッグ（ｂ）若しくは（ｄ）またはその薬学的に許容しうる塩を提供する。本発明のもう一つの態様により、（本発明の第１成分と組み合わせた）癌の治療用薬剤の製造のための式１を有する化合物または上記のプロドラッグ（ｂ）若しくは（ｄ）またはその薬学的に許容しうる塩を提供する。本明細書中において、「アルキル」という総称には、直鎖および分岐状鎖両方のアルキル基が含まれる。しかしながら、「プロピル」などの個々のアルキル基の意味は、直鎖型のみを特定し、そして「イソプロピル」などの個々の分岐状鎖アルキル基の意味は、分岐状鎖型のみを特定する。同様の慣例が他の総称に当てはまる。式１を有する化合物のいくつかが、１個またはそれ以上の不斉炭素原子によって光学活性体またはラセミ体で存在しうる限りにおいて、本発明は、その定義において、本発明の突然変異ＣＰＢの基質である特性を有する何等かのこのような光学活性体またはラセミ体を包含するということを理解すべきである。しかしながら、式１の化合物中で、結合した基Ｙ、ＺおよびＣＯＯＨを有する炭素原子のところで、対応する遊離アミノ酸が存在する場合、その炭素原子は、好ましくは、対応する遊離アミノ酸においてＬ立体配置を有する。光学活性体の合成は、当該技術分野において周知の有機化学の標準的な技法によって、例えば、光学活性出発物質からの合成によってまたはラセミ体の分割によって行うことができる。同様に、突然変異ＣＰＢに対する基質特性は、標準的な実験室技術を用いて評価することができる。式１を有する塩基性化合物の適当な薬学的に許容しうる塩は、例えば、無機酸または有機酸、例えば、塩酸、臭化水素酸、硫酸、リン酸、トリフルオロ酢酸、クエン酸またはマレイン酸との酸付加塩である。更に、式１を有する酸性化合物の適当な薬学的に許容しうる塩は、アルカリ金属塩、例えば、ナトリウム若しくはカリウム塩、アルカリ土類金属塩、例えば、カルシウム若しくはマグネシウム塩、アンモニウム塩、または生理学的に許容しうる陽イオンを与える有機塩基との塩、例えば、メチルアミン、ジメチルアミン、トリメチルアミン、ピペリジン、モルホリン若しくはトリス−（２−ヒドロキシエチル）アミンとの塩である。本発明の化合物は、経口投与用の錠剤、カプセル剤またはエリキシル剤、肛門投与用の坐剤、非経口または筋肉内投与用の滅菌液剤または懸濁剤等のような組成物で用いることができる。本発明の化合物は、このような処置を必要としている患者（動物およびヒト）に対して、最適薬剤効能を与える用量で投与することができる。投薬量は、疾患の性状および重症度、患者の体重、患者によって引続き行われる特別治療食、同時に行われる投薬、および当業者が認める他の因子に応じて患者ごとに変化するであろうが、その用量範囲は、概して、患者一人につき約１〜１０００ｍｇ／日であり、これは、１回量でまたは多数回量で投与することができる。好ましくは、用量範囲は、患者一人につき約２．５〜２５０ｍｇ／日、更に好ましくは、患者一人につき約２．５〜７５ｍｇ／日であろう。当然ながら、これらの用量範囲は、分割１日量を可能にするように必要に応じて単位基準で調整することができるし、そして上記のように、その用量は、疾患の性状および重症度、患者の体重、特別治療食、および他の因子に応じて変化するであろう。典型的に、これらの組合せを製剤化して薬剤組成物にすることができ、以下で論及する。式１の化合物若しくは化合物の混合物またはその生理学的に許容しうる塩約１〜１００ｍｇを、生理学的に許容しうるビヒクル、担体、賦形剤、結合剤、保存剤、安定剤、着香剤等と一緒に、薬学的に許容された慣例によって要求される単位剤形で配合する。これら組成物または製剤中の活性物質の量は、指示された範囲内の適当な用量が得られるような量である。錠剤、カプセル剤等に包含されうるアジュバントの典型的なものは、次のものである。トラガカントゴム、アラビアゴム、コーンスターチまたはゼラチンなどの結合剤；マイクロクリスタリンセルロースなどの賦形剤；コーンスターチ、プレゲル化デンプン、アルギン酸等のような崩壊剤；ステアリン酸マグネシウムなどの滑沢剤；スクロース、ラクトースまたはサッカリンなどの甘味剤；ペパーミント、冬緑油またはチェリーなどの着香剤。単位剤形がカプセルである場合、それは、上の種類の材料の他に、脂肪油などの液状担体を含むことができる。様々な他の材料が、コーティングとしてまたはさもなければ、用量単位の物理的形態を変更するように存在しうる。例えば、錠剤は、セラック、砂糖または両方でコーティングされてよい。シロップまたはエリキシルは、活性化合物、甘味剤としてのスクロース、保存剤としてのメチルおよびプロピルパラベン、色素並びにチェリーまたはオレンジフレーバーなどの着香剤を含むことができる。注射用の滅菌組成物は、慣用的な薬学的慣例にしたがって、活性物質を、注射用水、ゴマ油、ココナツ油、ピーナツ油、綿実油等のような天然に存在する植物油、またはオレイン酸エチルのような合成脂肪ビヒクル等のビヒクル中に溶解させるまたは懸濁させることによって製剤化することができる。緩衝剤、保存剤、抗酸化剤等を、必要に応じて包含させることができる。式Ｉを有する本発明の化合物またはその薬学的に許容しうる塩は、構造的に関連した化合物の製造に適用できることが知られているいずれの方法によっても製造することができる。このような手順を、本発明のもう一つの特徴として提供し、そして次の典型的な実施例によって例証するが、ここにおいて、変化しうる基は、特に断らない限り、前に定義された意味のいずれかを有する。具体的な化合物の合成が以下で詳しく述べられる場合、検討中の具体的な構造の化合物全部に及ぶように一般的な方法を応用できることは理解されるであろう。１．Ｗ＝直接結合の化合物このような化合物は、図９の略図で示されたように製造することができる。これらプロドラッグは、突然変異ＣＰＢで切断されて中間体を遊離し、それが更に壊れて、対応するフェノールマスタード（典型的なＩＣ₅₀＝１．５μＭ）を放出する。工程ａ〜ｄに適当な試薬としては、次のものがある。（ａ）ＤＣＣＩ、ＨＯＢＴまたは水溶性カルボジイミド（ＥＤＣＩ）若しくはクロロギ酸イソブチル／トリエチルアミン；（ｂ）ＴＦＡ（Ｐ₁＝ｔ−ブチル、Ｐ₂がベンジルである場合）またはＨ₂，Ｐｄ／Ｃ（Ｐ₁がベンジルであり且つＰ₂＝ｔ−ブチルの場合）；（ｃ）ＥＤＣＩ、ＤＭＡＰ、ＣＨＣｌ₃、（ｄ）Ｐ₂＝ベンジルの場合のＨ₂／Ｐｄ／Ｃまたはｔ−ブチルを保護で用いる場合のＴＦＡ図９の化合物２（ｉ）Ｙ＝ＮＨ₂およびＰ₂がベンジルなどの保護基である時、しかもＺが、例えば、−（ＣＨ₂）_n−ＣＯ₂Ｈ（ｎ＝１〜４）である時に、更に、ｎ＝１の場合、ジベンジルＬ−アスパラギン酸を用い；ｎ＝２の場合、Ｌ−グルタミン酸ジベンジルエステルを用い；そしてｎ＝３の場合、Ｌ−２−アミノアジピン酸ジベンジルエステルを用いる。（ii）Ｚが−（ＣＨ₂）_n−テトラゾールである時：例えば、ｎ＝２の場合、図１０で示された反応順序を用いて、既知のメチルエステルから必要なジベンジル保護中間体を生じる。工程ａ〜ｅに適当な試薬としては、次のものがある。（ａ）Ｃｓ₂ＣＯ₃、ＰｈＣＨ₂Ｂｒ、ＤＭＦ；（ｂ）１０％Ｐｄ／Ｃ、Ｈ₂、ＢＯＣ−Ｏ−ＢＯＣ；（ｃ）ＮａＯＨ、ＭｅＯＨ、Ｈ₂Ｏ；（ｄ）Ｃｓ₂ＣＯ₃、ＰｈＣＨ₂Ｂｒ、ＤＭＦ；分離された異性体；（ｅ）ＨＣｌ、エーテル、ＣＨ₂Ｃｌ₂ （iii）Ｚが−（ＣＨ₂）_nＣＯＮＨＳＯ₂Ｒ¹¹である時に、例えば、ｎ＝２およびＲ¹¹＝Ｍｅの場合、保護中間体は、図１１で示されたように、Ｎ−ＢＯＣ−α −ベンジルグルタミン酸から製造される。工程ａ〜ｂに適当な試薬としては、次のものがある。（ａ）ＭｅＳＯ₂ＮＨ₂、ＤＣＣＩ、ＤＭＡＰ；（ｂ）ＨＣｌ、ＥｔＯＡｃ（iv）Ｚ＝−（ＣＨ₂）_nＳＯ₂ＮＨ₂の時に、例えば、ｎ＝２の場合、Ｌ−２− アミノ−４−スルファモイル酪酸（Aldrich Chemical Company）から製造されたＬ−２−アミノ−４−スルファモイル酪酸ベンジルエステルを用いる。（ｖ）ＹがＯＨである化合物は、確立された経路によってまたは、例えば、Ｌ −リンゴ酸などの化合物を対応するＬ−グルタミン酸の代わりに用いることによって生成される。図９の化合物３（ｉ）Ｘ＝−ＣＨ₂ＣＨ₂−の場合、中間体は、図９で化合物２として示された化合物を無水コハク酸と反応させて、Ｐ₁＝Ｈの半コハク酸エステルを生じることによって製造することができる。或いは、無水コハク酸を用いる代わりにコハク酸の半エステルを用いて、上の中間体に対して結合させることができる。（ii）Ｘ＝−ＮＨＣＨ（Ｒ⁹）−の場合、プロドラッグを突然変異ＣＰＢで切断して、直接的に細胞障害性である式５の化合物を生じる。例えば、Ｒ⁹＝（ＣＨ₂）₂ＣＯＮＨ−ｎＣ₄Ｈ₉およびＲ¹＝Ｒ²＝Ｃｌ、Ｒ³＝Ｒ⁴＝Ｒ⁵＝Ｒ⁶＝Ｈの場合、ＬｏＶｏ細胞に対する細胞障害性はほぼＩＣ₅₀＝２０μＭである。Ｘ＝ＮＨＣＨ（Ｒ⁹）の化合物を製造するために、慣用的なペプチド結合法を図１２で示されたように用いる。次に、中間体を酸（例えば、ＨＣｌ／エーテル）で処理して遊離アミンを形成する。フェノールマスタードに対する結合は、図１３で示されたように行われる。工程ａの適当な試薬としては次のものがある。１．クロロギ酸ｐ−ニトロフェニル、トリエチルアミン、クロロホルム２．トリエチルアミン、ＣＨ₂Ｃｌ₂；または１．ＣＯＣｌ₂／キノリン、ＣＨ₂Ｃｌ₂ ２．トリエチルアミン、ＣＨ₂Ｃｌ₂ Ｗ＝ＣＨ₂およびＸ＝−ＮＨ−ＮＨ（Ｒ¹²）−の化合物このような化合物は、図１４で示されたように合成することができる。工程ａ〜ｂに適当な試薬としては、次のものがある。（ａ）ＢＯＣ−Ｎ（Ｒ¹²）−ＮＨ₂、ＥＤＡＣ、ＣＨ₂Ｃｌ₂；ＴＦＡ、ＨＣｌ／ＥＴＯＡｃ（ｂ）１．ピリジン、ＣＨ₂Ｃｌ₂ ２．トリエチルアミン、ＣＨ₂Ｃｌ₂ 次に、得られた生成物を標準法によって脱保護する。式Ｉの化合物の薬学的に許容しうる塩が必要とされる場合、それは、例えば、慣用法を用いる前記化合物と適当な酸または塩基との反応によって得ることができる。式Ｉの化合物の光学活性体が必要とされる場合、それは、光学活性出発物質を用いて前記手順の一つを行うことによって、または慣用法を用いる前記化合物のラセミ体の分割によって得ることができる。本発明の突然変異ＣＰＢの更に別の用途には、次のものがある。（ｉ）カルボキシペプチダーゼ酵素は、タンパク質からのＣ末端アミノ酸の逐次的除去に用いることができ、そして放出された残基のアミノ酸分析後に、タンパク質のＣ末端アミノ酸配列を決定するのに用いることができる（R.P.Ambler， Methods in Enzymology,1967，XI巻，436-445，Academic Press中）。Ｃ末端アスパラギン酸およびグルタミン酸残基に対する特異性を有する突然変異ＣＰＢの使用は、カルボキシペプチダーゼ消化によるＣ末端分析の範囲および容易さを拡大する場合のこれら酵素の使用を可能にする。（ii）突然変異酵素は、免疫検定において酵素標識として用いることができる。基質（プロドラッグ）代謝回転からの産物は、いずれかの適当な技術、例えば、ＨＰＬＣによって検出することができる。酵素を標識として用いる免疫検定技術は、D.M.Kemeny，Pergamon Press 1991によってA Practical Guide to ELISA で記載されている。本発明を、ここで、次の非制限実施例によって（参考例の論及と共に）記載するが、ここにおいて、（ｉ）蒸発は、真空中でロータリーエバポレーターによって行われ、そして処理手順は、濾過による残留固体の除去後に行われた；（ii）操作は、室温で、すなわち、１８〜２５℃範囲でおよびアルゴンなどの不活性ガスの雰囲気下で行われた；（iii）カラムクロマトグラフィー（フラッシュ法による）および中速液体クロマトグラフィー（ＭＰＬＣ）は、E.Merck，ダルムシュタット，ドイツから得られたMerck Kieselgelシリカ（製品9385）またはMerck Lichroprep RP-18（製品9303）逆相シリカ状で行われた；（iv）収率は単に例示として与えられ、必ずしも達成しうる最大値ではない；（ｖ）式Ｉを有する最終生成物は、納得のいく微量分析を有し、そしてそれらの構造は、核磁気共鳴（ＮＭＲ）および質量スペクトル技術によって確証された；特に断らない限り、式Ｉを有する最終生成物のＣＤＣｌ₃溶液をＮＭＲスペクトルデータの確認に用い、化学シフト値は、δスケールで測定された；次の略号、ｓ，一重線；ｄ，二重線；ｔ，三重線；ｍ，多重線が用いられた；（vi）中間体は、概して充分に特性決定されていないし、そして純度は、薄層クロマトグラフィー、赤外（ＩＲ）またはＮＭＲ分析によって評価された；（vii）融点は不正確であり、Mettler SP62自動融点装置または油浴装置を用いて測定された；式Ｉの最終生成物の融点は、エタノール、メタノール、アセトン、エーテルまたはヘキサンなどの単独または混合物での慣用的な有機溶媒からの結晶化後に測定された；そして（viii）温度は全て、℃中である。図面の簡単な説明を下記に示す。図１は、膵臓ＨＣＰＢクローニングを示す。図２は、膵臓ＨＣＰＢ配列順序を示す。図３は、ベクターｐＩＣＩ1266を示す。図４は、ｐＩＣＩ1266発現ベクター遺伝子クローニングを示す。図５は、プロドラッグおよび対応する薬物の細胞障害性を示す。図６は、増殖培地の組成を示す。図７〜１４は、化学合成法を示す。図１５は、実施例２１のプロドラッグ単独および実施例２２の対応する薬物単独のＬｏＶｏ腫瘍細胞での細胞障害性を示す。図１６は、突然変異酵素Ｄ２５３ＫＨＣＰＢの存在下の実施例２１のプロドラッグのＬｏＶｏ腫瘍細胞での細胞障害性を示す。番号を付した列は、次の、１＝ブランク（細胞不含）；２〜４＝それぞれ、５０μＭ、１００μＭおよび２００μＭの実施例２２の薬物；５〜８＝それぞれ、１．４７μｇ／ｍｌ、２．４μ ｇ／ｍｌ、５．９μｇ／ｍｌおよび１１．７５μｇ／ｍｌのＤ２５３ＫＨＣＰＢの存在下の実施例２１のプロドラッグ；９＝５００μＭの実施例２１のプロドラッグ；および１０＝対照（細胞のみ）である。番号を付した列はそれぞれ、２本のバー（示された誤差限界を含む）を含み、ここにおいて、それぞれのバーは、プレート上の６ウェルからのデータである。図１７は、化学合成を示す。参考例１ヒプリル−Ｌ−グルタミン酸の合成（図８を参照されたい）ＴＨＦ中のヒプリル−Ｌ−グルタミン酸ジベンジルエステル（化合物３）（２．０６ｇ，４．２ｘ１０^-3モル）および３０％Ｐｄ／炭素（５０％水分）（０．７７ｇ）を水素雰囲気中で１．５時間撹拌した。その混合物を、珪藻シリカ（Ce lite^TM）を介して濾過し、そしてその濾液を蒸発乾固させた。ジエチルエーテルでの研和は、所望の最終生成物を白色結晶性固体１．０２ｇ（７８％）として与えた。融点１６９〜１７１℃。２０Ｄ＝−２．５° ＮＭＲＤＭＳＯｄ６１２．３，２Ｈ（幅広）；８．７，１Ｈ（ｔ）；８．２，１Ｈ（ｔ）；７．９，２Ｈ（ｍ）；７．５，３Ｈ（ｍ）；４．３，１Ｈ（ｍ）；３．９，２Ｈ（ｍ）；２．３，２Ｈ（ｔ）；１．９，２Ｈ（ｍ）出発物質化合物３は、次のように製造された。馬尿酸（０．９０ｇ，５ｘ１０^-3 モル）およびＬ−グルタミン酸ジベンジルエステル（２．５０ｇ，５ｘ１０^-3 モル）のＤＭＦ（３５ｍｌ）中溶液に対して、１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（０．７３ｇ，５．５ｘ１０^-3モル）、トリエチルアミン（１．４ｍｌ，９．７ｘ１０^-3モル）および１（３−ジメチルアミノプロピル）−３−エチルカルボジイミドＨＣｌ塩（１．０５ｇ，５．５ｘ１０^-3モル）を加えた。その混合物を室温で一晩中撹拌し、水（４００ｍｌ）中に注入し、そして酢酸エチル（１００ｍｌ）で２回抽出した。合わせた抽出液を飽和重炭酸ナトリウム溶液、水、２ＮＨＣｌおよび水で洗浄した。有機相をＭｇＳＯ₄上で乾燥させ且つ蒸発させて、所望の出発物質を黄色油状物として得た。２．０６ｇ（８４％）。ＮＭＲＤＭＳＯｄ６８．７，１Ｈ（ｔ）；８．４，１Ｈ（ｄ）；７．９，２Ｈ（ｍ）；７．５，３Ｈ（ｍ）；７．３５，１０Ｈ（ｍ）；５．１５，２Ｈ（ｓ）；５．０５，２Ｈ（ｓ）；４．４，１Ｈ（ｍ）；３．９，２Ｈ（ｔ）；２．０，４Ｈ（ｍ）。参考例２ヒプリル−Ｌ−アスパラギン酸の合成ＴＨＦ中のヒプリル−Ｌ−アスパラギン酸ジベンジルエステル（１．２８ｇ，２．７ｘ１０^-3モル）および３０％Ｐｄ／炭素（５０％水分）（０．５１ｇ）を水素雰囲気中で３時間撹拌した。その混合物を、Celite^TMを介して濾過し、そしてその濾液を蒸発乾固させた。ジエチルエーテルでの研和は、オフホワイト結晶性固体０．６２ｇ（７８％）を与えた。融点２００〜２０２℃。２０Ｄ＝＋７．９° ＮＭＲＤＭＳＯｄ６１２．５，２Ｈ（幅広）；８．７，１Ｈ（ｔ）；８．２，１Ｈ（ｄ）；７．７，２Ｈ（ｍ）；７．５，３Ｈ（ｍ）；４．６，１Ｈ（ｍ）；３．９，２Ｈ（ｄ）；２．７，２Ｈ（ｍ）出発物質は、次のように合成された。馬尿酸（０．９０ｇ，５ｘ１０^-3モル）およびＬ−アスパラギン酸ジベンジルエステル（２．３１ｇ，５ｘ１０^-3モル）のＤＭＦ（３５ｍｌ）中溶液に対して、１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（０．７３ｇ，５．５ｘ１０^-3モル）、トリエチルアミン（１．４ｍｌ，９．７ｘ１０^-3モル）および１−（３−ジメチルアミノプロピル）−３−エチルカルボジイミドＨＣｌ塩（１．０５ｇ，５．５ｘ１０^-3モル）を加えた。その混合物を室温で４時間撹拌した後、水（４５０ｍｌ）中に注入し、そして酢酸エチル（１００ｍｌ）で２回抽出した。抽出液を飽和重炭酸ナトリウム溶液、水、２ＮＨＣｌおよび水で洗浄した。有機相をＭｇＳＯ₄上で乾燥させ且つ蒸発乾固させて、所望の出発物質を黄色油状物として得た。１．９０ｇ（８０％）。ＮＭＲＤＭＳＯｄ６８．７，１Ｈ（ｔ）；８．４５，１Ｈ（ｄ）；７．９，２Ｈ（ｍ）；７．５，３Ｈ（ｍ）；７．３，１０Ｈ（ｍ）；５．１５，２Ｈ（ｓ）；５．０５，２Ｈ（ｓ）；４．８，１Ｈ（ｍ）；３．９，２Ｈ（ｍ）；２．９，２Ｈ（ｍ）参考例３Ｈｉｐｐ−Ａｒｇに対する組換えＨＣＰＢの酵素活性。参考例１２で記載のように製造された精製ヒトＣＰＢを、ヒプリル−Ｌ−アルギニン（Ｈｉｐｐ−Ａｒｇ；Sigma）を馬尿酸に変換するその能力について分光光度検定を用いて検定した。天然のＨＣＰＢのＫｍおよびｋｃａｔは、一定範囲のＨｉｐｐ−Ａｒｇ濃度（０．７５〜０．１２５ｍＭ）および１μｇ／ｍｌのＣＰＢ酵素濃度を用いて、２５４ｎＭでＨｉｐｐ−Ａｒｇを馬尿酸へ変換する初期速度を測定することによって決定された。測定は、全容量１．０ｍｌの１ｃｍ路長キュベットを用い、０．２５ｍＭトリスＨＣｌ緩衝液、ｐＨ７．５中において３７℃で、パーキン・エルマーλ２分光光度計を用いて行われた。ＫｍおよびＶｍａｘ値は、ENZFITTERソフトウェアプログラム（Biosoft，Perkin Elmer）を用いて計算された。Ｋｃａｔは、Ｖｍａｘから、反応混合物中の酵素濃度で割ることによって計算された。Ｈｉｐｐ−Ａｒｇに対するヒトＣＰＢの結果は、Ｋｍ＝０．１８ｍＭｋｃａｔ＝６５ｓ^-1 であった。それらの結果は、組換えＨＣＰＢが酵素的に活性であり、そしてＨｉｐｐ−Ａｒｇ中のアミド結合を切断して馬尿酸を放出できることを示している。参考例４アルギニンマスタードプロドラッグの合成（図７を参照されたい）（２Ｓ），２−（３−｛４−［ビス−（２−クロロエチル）−アミノ）−フェノキシカルボニル｝−プロピオニルアミノ）−５−グアニジノ吉草酸（化合物５ｃ，図７）（２Ｓ），２−（３−｛４−［ビス−（２−クロロエチル）−アミノ）−フェノキシカルボニル｝−プロピオニルアミノ）−５−（２−ニトロ）−グアニジノ吉草酸ベンジルエステル（化合物４ｃ，図７）（２７５ｍｇ；０．４４ミリモル）の、１０％Ｐｄ／Ｃ（２００ｍｇ）含有酢酸エチル／ＭｅＯＨ（１／１：Ｖ／Ｖ）（８ｍｌ）中溶液を、Paar装置中において８０ｐｓｉで６時間水素化した。濾過後、有機層を蒸発させた。得られた油状物を、ＣＨ₂Ｃｌ₂／ジエチルエーテルを用いて再結晶させて、所望の化合物５ｃを白色固体（１８０ｍｇ），収率８４％として与えた。¹ ＮＭＲ（ＣＤ₃ＯＤ）：１．５５−１．７（ｍ，３Ｈ）；１．８−１．９（ｍ，１Ｈ）；２．６−２．７（ｍ，２Ｈ）；２．７５−２．８５（ｍ，１Ｈ）；２．９−２．９５（ｍ，１Ｈ）；３．１−３．２（ｍ，２Ｈ）；３．６−３．７（ｍ，４Ｈ）；３．７−３．８（ｍ，４Ｈ）；４．３（ｄｄ，１Ｈ）；６．７５（ｄｄ，２Ｈ）；６．９５（ｄｄ，２Ｈ）。ＭＳ（ＥＳＩ）：５１２−５１４（ＭＮａ）＋分析（Ｃ₂₀Ｈ₂₉Ｎ₅Ｏ₄Ｃｌ₂１．５Ｈ₂Ｏ）計算値Ｃ：４７．９１Ｈ：６．４３Ｎ：１３．９７実測値Ｃ：４７．７Ｈ：６．２１Ｎ：１４．２６出発物質化合物４ｃは、次のように製造された。（２Ｓ），２−アミノ−５− （２−ニトロ）−グアニジノ吉草酸ベンジルエステル（化合物２ｃ）（６５４ｍｇ；１ミリモル）のＣＨＣｌ₃（１０ｍｌ）中溶液に対して、ジヒドロフラン− ２，５−ジオン（化合物１）（１２０ｍｇ；２ミリモル）に続いてトリエチルアミン（２０２ｍｇ；２ミリモル）を滴加した。室温で２時間撹拌後、溶媒を蒸発させ、そして粗残留物を水中に溶解させた。ｐＨを２ＮＨＣｌで２．５に調整した。水性層を酢酸エチルで抽出した。有機層をブラインで洗浄し、乾燥させ（ＭｇＳＯ₄）、そして蒸発させて、（２Ｓ），２−（３−カルボキシプロピオニルアミノ）−５−（２−ニトロ）−グアニジノ吉草酸ベンジルエステル（化合物３ｃ）を与えた。得られた固体をジエチルエーテルで研和し、そして濾去した。２８０ｍｇ（６８％）。１ＨＮＭＲ（ＣＤ３ＯＤ）：１．５２−１．６８（ｍ，２Ｈ）；１．７−１．８（ｍ，１Ｈ）；１．８５−１．９５（ｍ，１Ｈ）；２．４５−２．７（ｍ，４Ｈ）；３．１５−３．３（ｍ，２Ｈ）；４．５（ｍ，１Ｈ）；５．１５（ｄｄ，２Ｈ）；７．２５−７．４（ｍ，５Ｈ）ＭＳ（ＥＳＩ）：４３２［ＭＮａ］＋化合物３ｃ（２０４ｍｇ；０．５ミリモル）のＣＨＣｌ₃（５ｍｌ）中懸濁液に対して、４−［ビス（２−クロロエチル）アミノ］−フェノール（化合物６）（１３５ｍｇ；０．５ミリモル）、ＥＤＣＩ（１９ｍｇ；０．５ミリモル）に続いてＤＭＡＰ（１８ｍｇ；０．７５ミリモル）を加えた。室温で６時間撹拌後、溶媒を蒸発させた。残留物を酢酸エチルと水とに分配し、そして水性相を２ＮＨＣｌでｐＨ＝３まで酸性にした。酢酸エチルで抽出後、有機層をブラインで洗浄し、乾燥させ（ＭｇＳＯ₄）、そして蒸発させた。残留物を、溶離剤としてＣＨ₂Ｃｌ₂／ＭｅＯＨ（９５／５：Ｖ／Ｖ）を用いるフラッシュクロマトグラフィーによって精製して、所望の出発物質４ｃを白色泡状物（２８１ｍｇ）収率：９０％として与えた。４ｃ：¹ＮＭＲ（ＣＤ₃ＯＤ）：１．５５−１．７（ｍ，２Ｈ）；１．７−１．８（ｍ，１Ｈ）；１．８５−１．９５（ｍ，１Ｈ）；２．５５−２．７５（ｍ，２Ｈ）；２．８−２．９（ｍ，２Ｈ）；３．１５−３．２５（ｍ，２Ｈ）；３．６ −３．７（ｍ，４Ｈ）；３．７−３．８（ｍ，４Ｈ）；４．５（ｄｄ，１Ｈ）；５．１５（ｄｄ，２Ｈ）；６．７（ｄｄ，２Ｈ）；６．９５（ｄｄ，２Ｈ）；７．３２（ｍ，５Ｈ）ＭＳ（ＥＳＩ）：６４７−６４９［ＭＮａ］＋参考例５コハク酸モノ−｛４−［Ｎ，Ｎ−ビス（２−クロロエチル）アミノ］フェニル｝エステル（本明細書中において「中間体」とも称される）の合成無水コハク酸（２２５ｍｇ，２．２５ミリモル）のＣＨＣｌ₃（１０ｍｌ）中懸濁液に対して、４−［Ｎ，Ｎ−ビス（２−クロロエチル）アミノ］フェノール（化合物６，図７；２０３ｍｇ，０．７５ミリモル）に続いてトリエチルアミン（７５ｍｇ，０．７５ミリモル）を撹拌しながら加えた。その混合物を一晩中撹拌し、そして溶媒を蒸発させた。粗残留物をＥｔＯＡＣ／Ｅｔ₂Ｏ／Ｈ₂Ｏ中に溶解させ、そして撹拌しながら、そのｐＨを３に調整した。有機層を水、ブラインで洗浄し、乾燥させ（ＭｇＳＯ₄）、そして蒸発させた。得られた油状物をＥｔ₂ Ｏ／ヘキサンから結晶化させ、そして白色固体を濾去し且つ真空下で乾燥させて、所望の最終生成物（２１０ｍｇ；収率８３％）を得た。融点９８〜１００℃。ＭＳ（ＥＳＩ）：３５６−３５８［ＭＮａ］⁺ ¹ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ₃）：２．８（ｄｄ，２Ｈ）；２．９（ｄｄ，２Ｈ）；３．６５（ｄｄ，４Ｈ）；３．７５（ｄｄ，４Ｈ）；６．６５（ｄ，２Ｈ）；７．０（ｄ，２Ｈ）。分析（Ｃ₁₄Ｈ₁₇Ｃｌ₂Ｏ₄Ｎ０．２Ｈ₂Ｏ）計算値Ｃ：４９．７８Ｈ：５．１９Ｎ：４．１５実測値Ｃ：４９．９Ｈ：５．３Ｎ：４．２参考例６ヒト膵臓カルボキシペプチダーゼＢ（ＨＣＰＢ）のクローニング制限酵素消化、連結反応、キナーゼ反応、脱リン酸化、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、細菌形質転換、ゲル電気泳動、緩衝液調製並びにＤＮＡ生成、精製および単離などの標準的な分子生物学技術は、Maniatisら（1989）Molecular Cl oning,A Laboratory Manual；第２版：Cold Spring Harbor Laboratory，コールド・スプリング・ハーバー，ニューヨークで記載のように、または特定の製品の製造者の推奨手順にしたがって行われた。ほとんどの場合、酵素はNew England BioLabsから購入されたが、他の供給者および同等の手順を用いることができる。オリゴヌクレオチド配列は、Applied Biosystems 380ＡＤＮＡシンセサイザーで、Applied Biosystems Inc．によって与えられたプロトコールにしたがって０．２μモルスケールで、５′ジメトキシトリチル塩基保護ヌクレオシド−２− シアノエチル−Ｎ，Ｎ′−ジイソプロピルホスホルアミダイトおよび一定の細孔ガラス支持体に結合した保護ヌクレオシドから製造された。ヒト膵臓カルボキシペプチダーゼＢのコード配列は、λｇｔ１０ベクター（Cl ontech，ヒト膵臓5'STRETCH ｃＤＮＡ，ＨＬ1163ａ）中にクローン化されたヒト膵臓ｃＤＮＡライブラリーから、ＰＣＲ技術を用いて得られ、そしてプラスミドベクターpBluescript II KS＋（Stratagene）中にクローン化された。典型的に、ｃＤＮＡライブラリーのアリコート（＞１０⁸ｐｆｕ／ｍｌの力価で５μｌ）を、１００ピコモルの２種類のオリゴヌクレオチドプライマーＢＰＴ１およびＢＰＢ１（配列番号：２８および配列番号：２９）、２００μＭの最終濃度までのｄＮＴＰ、Ｔａｑポリメラーゼ反応緩衝液並びに２．５単位のＴａｑポリメラーゼと一緒に、最終容量１００μｌ中で混合した。その混合物は、Ｔａｑ酵素に対して添加する前に、９４℃で１０分間加熱され、そしてＰＣＲインキュベーションは、９４℃１．５分間、５０℃２分間および７２℃２分間のサイクル３０回に続いて、反応の最後に７２℃９．９分間の１回のインキュベーションを用いて行われた。２種類のオリゴヌクレオチドプライマーは、図１で示されたように、ＢＰＴ１（配列番号：２８）からの遺伝子の５′からのＰＣＲ伸長、プレ配列の出発点とプロ配列の出発点との間、およびＢＰＢ１（配列番号：２９）からの遺伝子の３ ′から戻るＰＣＲ伸長を可能にするように設計された。ＢＰＴ１およびＢＰＢ１はまた、独特の制限部位ＳａｃＩおよびＸｈｏＩをそれぞれＰＣＲ生成物中に導入するように設計される。ＰＣＲ生成物のアリコートを、正しい寸法（約１２５０塩基対）のＤＮＡについてアガロースゲル電気泳動によって分析し、そして正しい寸法のバンドが優先的に含まれることが判った。反応配合物からの残りの生成物を、Centricon 100 ミクロコンセントレーターカラム（Amicon）を用いて過剰の試薬から精製し且つ分離した後、エタノール／酢酸ナトリウム沈殿、遠心分離、真空乾燥および蒸留水中への再懸濁によってＤＮＡを単離した。単離されたＤＮＡを、酵素ＳａｃＩおよびＸｈｏＩで制限消化し、そして正しい寸法（約１２５０塩基対）のバンドを、切除およびグラスミルク（Geneclean，Stratec Scientificまたは他の同様の製品）を用いてアガロースゲル電気泳動から精製し且つ単離した。 pBluescript II KS+二本鎖ＤＮＡ（Stratagene）をＳａｃＩ酵素で制限消化し、そしてその産物を、子ウシ腸アルカリホスファターゼで脱リン酸化処理して、５′ホスホリル基を除去し且つ形質転換後の再連結およびベクターバックグラウンドを減少させた。ＤＮＡ生成物は、グラスミルクを用いて酵素反応汚染物から精製された後、ＸｈｏＩ酵素で制限消化された。正しい寸法（約２８５０塩基対）のＤＮＡは、切除およびグラスミルク（Geneclean，Stratec Scientificまたは他の同様の製品）を用いてアガロースゲル電気泳動によって精製され且つ単離された。制限消化されたおよび精製されたＤＮＡ試料両方のアリコートを、既知の標準と比較されるアガロースゲル電気泳動を用いて、純度および濃度評価について検査した。これらの評価から、連結配合物は、ＨＣＰＢ遺伝子をベクター中にクローン化するように、およそ１のベクター対２．５のインサート（１のpBluescrip t II KS+対２．５のＨＣＰＢＰＣＲ生成物）のモル比および約２．５ｎｇ／μ ｌの最終ＤＮＡ濃度を用いて、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ、１ｍＭＡＴＰおよび酵素緩衝液の存在下で製造された。連結反応後、そのＤＮＡ混合物を用いて、大腸菌株ＤＨ５α（Gibco-BRL，最大効率コンピテント細胞）を形質転換した。細胞アリコートを、プラスミドベクターの選択としてアンピシリン１００μｇ／ｍｌを含有するＬ寒天栄養培地上にプレーティングし、そして３７℃で一晩中インキュベートした。目的のインサートを含むプラスミドを含有するコロニーを、ハイブリダイゼーションによって識別した。約２００個のコロニーを採取し、そしてプラスミドベクターの選択としてアンピシリン１００μｇ／ｍｌを含有するＬ寒天栄養培地のプレート上で予め湿潤された二重滅菌ニトロセルロースフィルター（Schleicher and Schull）上にプレーティングし、そして３７℃で一晩中インキュベートした。二重プレートの一方は４℃で貯蔵され、そしてコロニーのための生きた細胞源となり、もう一方のプレートは、個々のコロニーからのＤＮＡを変性させ且つニトロセルロースに対して固定するように処理される。ニトロセルロースフィルターを寒天プレートから除去し、そして引続き、１．１０％ＳＤＳ中に２分間２．０．５ＭＮａＯＨ，１．５ＭＮａＣｌ中に７分間３．０．５ＭＮａＯＨ，１．５ＭＮａＣｌ中に４分間４．０．５ＭＮａＯＨ，１．５ＭＮａＣｌ中に２分間５．０．５Ｍトリス，ｐＨ７．４，１．５ＭＮａＣｌ中に２分間６．２ｘＳＳＣ（標準食塩−クエン酸緩衝液）中に２分間浸漬したワットマン濾紙上に置く。次に、フィルターを、１０ｘＳＳＣ中に浸漬したワットマン濾紙上に置き、そして変性ＤＮＡを、紫外線処理（Spectrolinker ＸＬ-1500 ＵＶクロスリンカー）によってニトロセルロースに対して架橋させる。次に、フィルターを室温で自然乾燥させた後、６ｘＳＳＣの溶液中において静かに撹拌しながら６０℃で１時間プレハイブリダイゼーションさせる（例えば、Techne ＨＢ−ＩＤハイブリダイザーを用いる）。プレハイブリダイゼーションは、フィルター上の非特異的ＤＮＡ結合部位を塞ぐ。どのコロニーが目的のＤＮＡインサートを有するかを確認するために、ニトロセルロースフィルターに対して架橋したＤＮＡを、膵臓ｃＤＮＡライブラリー（上を参照されたい）のＨＣＰＢＰＣＲ生成物から製造された放射性標識³²Ｐ− ＤＮＡプローブとハイブリッド形成させる。約５０ｎｇのＤＮＡを、全容量５０ μｌ中においてＴ７ＤＮＡポリメラーゼを用いて５０μＣｉの³²Ｐ−ｄＣＴＰ（約３０００Ｃｉ／ミリモル）で標識し（Pharmacia T7 Quickprimeキット）、そしてその反応を３７℃で1５分間進行させた。次に、標識されたプローブを９５℃まで２分間加熱して二本鎖ＤＮＡを変性させ、速やかに１０ｍｌの６ｘＳＳＣに対して６０℃で加え、そしてこの溶液を、フィルター上のプレハイブリダイゼーション溶液を交換するのに用いる。緩やかな撹拌を伴うインキュベーションを、６０℃で約３時間続ける。この時間後、ハイブリダイゼーション溶液を排出し、そしてフィルターを２ｘＳＳＣ中において６０℃で各１５分間２回洗浄する。次に、フィルターを緩やかに吸取乾燥させ、密着フィルム（Saran^TMラップまたは類似物）で覆い、そしてＸ線フィルム（例えば、Kodak Xomat-ＡＲ５^TM）に対して室温で一晩中露出させた。フィルムの現像後、目的のインサートを有するコロニーは、Ｘ線フィルム上で最も強い暴露（最も暗いスポット）を与えたものとして識別された。この実験系において、コロニーの約１５％が正のハイブリダイゼーションを与えた。これから１２個のコロニーを更にスクリーニングするために選択した。これらコロニーを二重フィルターから採取し、アンピシリン１００μｇ／ｍｌを含有するＬ寒天栄養培地上に画線接種し且つ維持し、そしてアンピシリン１００μｇ／ｍｌを含有するＬブイヨン栄養培地中で増殖させた。選択された単離物は、正しい寸法のインサートについてプライマーＢＰＴ１およびＢＰＢ１（配列番号：２８および配列番号：２９）を用いて、そして内部プライマーＢＰＴ２（配列番号：３０）およびＢＰＢ１で開始するために、ＰＣＲによって検査された。ＢＰＴ２は、成熟遺伝子が始まる前に、プロ配列の終りで開始するようにおよびＸｂａＩ制限部位を導入するように設計される。ＰＣＲスクリーニングのために、選択された単離物のコロニーを採取し且つ蒸留水２００μｌ中に分散させ、そして密封したエッペンドルフ試験管中において１００℃で１０分間加熱した。次に、その懸濁液をミクロ遠心機中で１０分間遠心分離してペレット細胞破片にし、そしてその上澄み１μｌをＰＣＲスクリーニングでのＤＮＡ鋳型として用いた。典型的に、上澄み１μｌを、２０ピコモルの２種類のオリゴヌクレオチドプライマーＢＰＴ１およびＢＰＢ１、またはＢＰＴ２およびＢＰＢ１、２００μＭの最終濃度までのｄＮＴＰ、Ｔａｑポリメラーゼ反応緩衝液並びに０．５単位のＴａｑポリメラーゼと一緒に、最終容量２０μｌ中で混合した。ＰＣＲインキュベーションは、９４℃１．５分間、５０℃２分間および７２℃２分間のサイクル２５回に続いて、反応の最後に７２℃９．９分間の１回のインキュベーションを用いて行われた。ＰＣＲ生成物は、正しい寸法のＤＮＡについて（プライマーＢＰＴ１からＢＰＢ１までの約１２５０塩基対およびプライマーＢＰＴ２からＢＰＢ１までの約９００塩基対、図１を参照されたい）アガロースゲル電気泳動によって分析された。１２クローンの内１０個は、正しい寸法のＰＣＲＤＮＡ生成物を与えた。次に、その１０クローンの内６個を、プラスミドＤＮＡ製造用に取った（Qiagen M axiキットを用い、アンピシリン１００μｇ／ｍｌを含むＬブイヨン中において３７℃で一晩の培養物１００ｍｌから）。次に、これらプラスミドＤＮＡ標品を、バクテリオファージＴ７ＤＮＡポリメラーゼを包含するＵＢＳシークエナーゼＤＮＡ配列決定キットを用いて、ＰＣＲ生成物インサートの部分にわたって配列決定した。各クローンを、６７６、３３６、３３７、６７９、６７７、１２８０、１２７９および１２８１（配列番号：３０〜３７）として知られる８種類の別々のオリゴヌクレオチドプライマーを用いて配列決定した。配列決定用プライマーのＨＣＰＢ配列中の位置は、図２で概略的に示され、プライマー３３６、１２７９、６７６、１２８０、６７７および１２８１が「順方向」であり且つ３３７および６７９が「逆方向」である。６クローンの内５個は、ＳａｃＩおよびＸｈｏＩ制限部位の間のおよびそれらを含めた１２６３塩基対の同一配列（配列番号：３８）を有することが判っており、この配列を更に別の実験で用いた。ＤＮＡ配列のそのポリペプチド配列への翻訳は、配列番号：３９で示される。成熟タンパク質配列の出発点は、アミノ酸残基１０９である。１４番のアミノ酸は、推定のプロ酵素配列の出発点を示す。酵素分泌リーダー配列の一部分（プレ配列）だけが、クローン化されたＰＣＲで生じたＤＮＡ中に存在する。ポリペプチド配列は、３６１位にアスパラギン酸残基を示し、これは、配列全体を他の哺乳動物カルボキシペプチダーゼＡおよびＢ配列と並べた場合にＢ型特異性を示す（Catasus L．ら，Biochem J.,287,299-30 3,1992および考察による２５５番のアミノ酸を参照されたい）。しかしながら、クローン化された配列中の２４３位のこのシステイン残基は、Yamamotoらが、Jo urnal of Biological Chemistry，267巻，2575-2581,1992において、他の哺乳動物膵臓カルボキシペプチダーゼＢアミノ酸配列と並べた場合に、２４４番の位置の後の配列中にギャップを示して強調したように、他の公表されたヒト膵臓カルボキシペプチダーゼＢ配列中で見られない。更に、図２で示されているのは、酵素認識部位中のアスパラギン酸アミノ酸残基および成熟酵素の１３５位（配列番号：３９の２４３位）のシステイン残基のおよその部位である。クローンの内の一つは、１９９４年１１月２３日に、the National Collectio n of Industrial and Marine Bacteria Limited（マカー・ドライブ２３地区，アバディーンＡＢ２１ＲＹ，スコットランド）で寄託されており、ＮＣＩＭＢ 40694の呼称を有する。このクローンからのプラスミドは、ｐＩＣＩ1698として知られている。参考例７成熟ＨＣＰＢ−（Ｈｉｓ）₆−ｃ−Ｍｙｃの大腸菌からの発現成熟ＨＣＰＢの大腸菌からの発現を達成するために、ｐＩＣＩ1698からの成熟遺伝子を、細菌のペリプラズム中へのタンパク質生産物の制御された分泌を可能にするプラスミドベクター中にトランスフェクションした。制御された発現に適した細菌宿主ＭＳＤ522中のｐＩＣＩ266として知られるこの分泌ベクターは、１９９３年１０月１１日に、the National Collection of Industrial and Marine Bacteria Limited（アバディーンＡＢ２１ＲＹ，スコットランド）で寄託されており、ＮＣＩＭＢ40589の呼称を有する。ｐＩＣＩ266のプラスミド地図を図３で示す。そのプラスミドは、テトラサイクリン耐性および誘導の遺伝子（ＴｅｔＡおよびＴｅｔＲ）、挿入された遺伝子発現のためのＡｒａＢオペレーターおよびプロモーター配列、並びに発現制御のためのＡｒａＣ遺伝子を有する。プロモーター配列の次にはＰｅｌＢ翻訳リーダー配列が続き、それはその後のポリペプチド配列をペリプラズムへと導く。遺伝子クローニング部位は、いくつか独特の制限部位を有し、そして次にファージＴ４転写終結配列が続く。この部分のＤＮＡ配列および遺伝子クローニングの特徴は、図４で概略的に示される。成熟ＨＣＰＢ配列のｐＩＣＩ266中へのクローニングのために、ＰＣＲによってＨＣＰＢＤＮＡを生成すること、および成熟遺伝子の始まりでのコドン使用法を若干変更して、大腸菌に好ましいコドンを導入することが決定された。更に、発現構築物の検出および精製を助けるために、（Ｈｉｓ）₆−ｃ−ｍｙｃとして知られるＣ末端ペプチド標識を酵素に対して加えた。その標識は、６個のヒスチジン、トリペプチドリンカー（ＥＰＥ）および、抗体９Ｅ１０によって認識されるｃ−ｍｙｃからのペプチド配列（EQKLISEEDL）（Evanら，Mol Cell Biol，５巻，129-136,1985で公開されたような、並びにCambridge Research Biochemic alsおよび他の抗体供給者から入手可能な）から成る。Ｃ末端は、アスパラギンの付加によって完成される。６個のヒスチジン残基は、発現されたタンパク質の金属キレートカラム（例えば、QiagenからのＮｉ−ＮＴＡアガロース）上での精製を可能にするはずである。更に、ＰＣＲプライマーを用いて、独特の制限部位を遺伝子の５′（ＦｓｐＩ）および３′（ＥｃｏＲＩ）に導入して、ＰＣＲ生成物の発現ベクター中への導入を容易にする。FSPTS1および6HIS9E10R1BS1として知られる二つのプライマーの配列は、配列番号：４０および４１で示される。ｐＩＣＩ266中へクローニングするための修飾遺伝子を生成するために、ＰＣＲは、１００ピコモルのプライマーFSPTS1および6HIS9E10R1BS1を用いて、約５ｎｇのｐＩＣＩ1698ＤＮＡ、２００μＭの最終濃度までのｄＮＴＰ、Ｔａｑポリメラーゼ反応緩衝液および２．５単位のＴａｑポリメラーゼの存在下において最終容量１００μｌ中で行われた。その混合物は、Ｔａｑ酵素に対して添加する前に、９４℃で１０分間加熱され、そしてＰＣＲインキュベーションは、９４℃１．５分間、５０℃２分間および７２℃２分間のサイクル３０回に続いて、反応の最後に７２℃９．９分間の１回のインキュベーションを用いて行われた。ＰＣＲ生成物のアリコートを、正しい寸法（約１０００塩基対）のＤＮＡについてアガロースゲル電気泳動によって分析し、そして正しい寸法のバンドが優先的に含まれることが判った。反応配合物からの残りの生成物を、Centricon 100ミクロコンセントレーターカラム（Amicon）を用いて過剰の試薬から精製し且つ分離した後、エタノール／酢酸ナトリウム沈殿、遠心分離、真空乾燥および蒸留水中への再懸濁によってＤＮＡを単離した。単離されたＤＮＡを、酵素ＦｓｐＩおよびＥｃｏＲＩで制限消化し、そして正しい寸法（約１０００塩基対）のバンドを、切除およびグラスミルク（Geneclean，Stratec Scientificまたは他の同様の製品）を用いてアガロースゲル電気泳動から精製し且つ単離した。標準的なＤＮＡ技術（Qiagenプラスミドキットまたは類似物）を用いて製造されたｐＩＣＩ266二本鎖ＤＮＡを、ＫｐｎＩ酵素で、完全な消化を確実にするように極めて慎重に制限消化した。次に、６５℃で１０分間加熱することによって酵素を失活させた後、氷上で冷却した。次に、ＫｐｎＩによって生じた３′突出部分を、供給者（New England BioLabs）によって指示された通り、ｄＮＴＰの存在下でのＴ４ＤＮＡポリメラーゼの添加および１６℃で１５分間のインキュベーションによって酵素的に消化した。反応は、酵素を７０℃で１５分間加熱することにより失活させることによって停止した。ＤＮＡ生成物は、グラスミルクを用いて酵素反応汚染物から精製され、収率についてアガロースゲル電気泳動によってアリコートを検査し、そして残りのものをＥｃｏＲＩ酵素で制限消化した。再度、完全な制限消化を確実にするように注意を払った。正しい寸法（約５６００塩基対）のＤＮＡは、切除およびグラスミルク（Geneclean，Stratec Scien tificまたは他の同様の製品）を用いてアガロースゲル電気泳動によって精製され且つ単離された。制限消化されたおよび精製されたＤＮＡ試料両方のアリコートを、既知の標準と比較されるアガロースゲル電気泳動を用いて、純度および濃度評価について検査した。これらの評価から、連結配合物は、ＨＣＰＢ遺伝子をベクター中にクローン化するように、およそ１のベクター対２．５のインサート（１のｐＩＣＩ26 6対２．５のＨＣＰＢＰＣＲ生成物）のモル比および約２．５ｎｇ／μｌの最終ＤＮＡ濃度を用いて、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ、１ｍＭＡＴＰおよび酵素緩衝液の存在下において、平滑末端付きＤＮＡの連結（Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼ処理されたＫｐｎＩに対するＦｓｐＩ）に適当な条件を用いて製造された。連結反応後、そのＤＮＡ混合物を用いて、大腸菌株ＤＨ５α（Gibco-BRL，最大効率コンピテント細胞）を形質転換した。細胞アリコートを、プラスミドベクターの選択としてテトラサイクリン１０μｇ／ｍｌを含有するＬ寒天栄養培地上にプレーティングし、そして３７℃で一晩中インキュベートした。目的のインサートを含むプラスミドを含有するコロニーを、ハイブリダイゼーションによって識別した。約３５０個のコロニーを採取し、そしてプラスミドベクターの選択としてテトラサイクリン１０μｇ／ｍｌを含有するＬ寒天栄養培地のプレート上で予め湿潤された二重滅菌ニトロセルロースフィルター（Schleicher and Schull）上にプレーティングし、そして３７℃で一晩中インキュベートした。二重プレートの一方は４℃で貯蔵され、そしてコロニーのための生きた細胞源となり、もう一方のプレートは、個々のコロニーからのＤＮＡを変性させ且つニトロセルロースに対して固定するように処理される。ニトロセルロースフィルターを寒天プレートから除去し、そして引続き、１．１０％ＳＤＳ中に２分間２．０．５ＭＮａＯＨ，１．５ＭＮａＣｌ中に７分間３．０．５ＭＮａＯＨ，１．５ＭＮａＣｌ中に４分間４．０．５ＭＮａＯＨ，１．５ＭＮａＣｌ中に２分間５．０．５Ｍトリス，ｐＨ７．４，１．５ＭＮａＣｌ中に２分間６．２ｘＳＳＣ（標準食塩−クエン酸緩衝液）中に２分間浸漬したワットマン濾紙上に置く。次に、フィルターを、１０ｘＳＳＣ中に浸漬したワットマン濾紙上に置き、そして変性ＤＮＡを、紫外線処理（Spectrolinker ＸＬ-1500 ＵＶクロスリンカー）によってニトロセルロースに対して架橋させる。次に、フィルターを室温で自然乾燥させた後、６ｘＳＳＣの溶液中において緩やかに撹拌しながら６０℃で１時間プレハイブリダイゼーションさせる（例えば、Techne ＨＢ−１Ｄハイブリダイザーを用いる）。プレハイブリダイゼーションは、フィルター上の非特異的ＤＮＡ結合部位を塞ぐ。どのコロニーが目的のＤＮＡインサートを有するかを確認するために、ニトロセルロースフィルターに対して架橋したＤＮＡを、膵臓ｃＤＮＡライブラリー（上を参照されたい）のＨＣＰＢＰＣＲ生成物から製造された放射性標識³²Ｐ− ＤＮＡプローブとハイブリッド形成させる。約５０ｎｇのＤＮＡを、全容量５０ μｌ中においてＴ７ＤＮＡポリメラーゼを用いて５０μＣｉの³²Ｐ−ｄＣＴＰ（約３０００Ｃｉ／ミリモル）で標識し（Pharmacia T7 Quickprimeキット）、そしてその反応を３７℃で１５分間進行させた。次に、標識されたプローブを９５℃まで２分間加熱して二本鎖ＤＮＡを変性させ、速やかに１０ｍｌの６ｘＳＳＣに対して６０℃で加え、そしてこの溶液を、フィルター上のプレハイブリダイゼーション溶液を交換するのに用いる。緩やかな撹拌を伴うインキュベーションを、６０℃で約３時間続ける。この時間後、ハイブリダイゼーション溶液を排出し、そしてフィルターを２ｘＳＳＣ中において６０℃で各１５分間２回洗浄する。次に、フィルターを緩やかに吸取乾燥させ、密着フィルム（Saranラップまたは類似物）で覆い、そしてＸ線フィルム（例えば、Kodak Xomat-ＡＲＳ）に対して室温で一晩中暴露した。フィルムの現像後、目的のインサートを有するコロニーは、Ｘ線フィルム上で最も強い暴露（最も暗いスポット）を与えたものとして識別された。この実験系において、コロニーの約５０％が正のハイブリダイゼーションを与えた。これから１２個のコロニーを更にスクリーニングするために選択した。これらコロニーを二重フィルターから採取し、テトラサイクリン１０μ ｇ／ｍｌを含有するＬ寒天栄養培地上に画線接種し且つ維持し、そしてテトラサイクリン１０μｇ／ｍｌを含有するＬブイヨン栄養培地中で増殖させた。選択された単離物は、正しい寸法のインサートについてプライマーFSPTS1および6HIS9E10R1BS1（配列番号：４０および配列番号：４１）を用いて、そして内部プライマーＢＰＢ２（配列番号：３３）およびFSPT1で開始するために、ＰＣＲによって検査された。ＢＰＢ２は、成熟遺伝子内で開始するようにおよび約４３０塩基対のフラグメントを生じるように設計される。ＰＣＲスクリーニングのために、選択された単離物のコロニーを採取し且つ蒸留水２００μｌ中に分散させ、そして密封試験管中において１００℃で１０分間加熱した。次に、その懸濁液をミクロ遠心機中で１０分間遠心分離してペレット細胞破片にし、そしてその上澄み１μｌをＰＣＲスクリーニングでのＤＮＡ鋳型として用いた。典型的に、上澄み１μｌを、２０ピコモルの２種類のオリゴヌクレオチドプライマーFSPT1および6HIS9E10R1BS1、またはFSPT1およびＢＰＢ２、２００μＭの最終濃度までのｄＮＴＰ、Ｔａｑポリメラーゼ反応緩衝液並びに０．５単位のＴａｑポリメラーゼと一緒に、最終容量２０μｌ中で混合した。ＰＣＲインキュベーションは、９４℃１．５分間、５０℃２分間および７２℃２分間のサイクル２５回に続いて、反応の最後に７２℃９．９分間の１回のインキュベーションを用いて行われた。ＰＣＲ生成物は、正しい寸法のＤＮＡについて（プライマーFSPTS1から6HIS9E 10R1BS1までの約１０００塩基対およびプライマーFSPTS1からＢＰＢ２までの約４３０塩基対）アガロースゲル電気泳動によって分析された。１２クローン全部が、正しい寸法のＰＣＲＤＮＡ生成物を与えた。次に、それらクローンの内６個を、プラスミドＤＮＡ製造用に取った（Qiagen Maxiキットを用い、テトラサイクリン１０μｇ／ｍｌを含むＬブイヨン中において３７℃で一晩の培養物１００ｍｌから）。次に、これらプラスミドＤＮＡ標品を、バクテリオファージＴ７ＤＮＡポリメラーゼを包含するＵＢＳシークエナーゼＤＮＡ配列決定キットを用いて、ＰＣＲ生成物インサートの部分にわたって配列決定した。或いは、自動ＤＮＡ配列決定サービスを用いて（ＡＢＩ配列決定装置を用いる）ＤＮＡを配列決定した。クローンは、いくつかの別々のオリゴヌクレオチドプライマーを用いて配列決定された。１５０４、１５９０および１７３１として知られる３種類のプライマーは、発現ベクターと挿入された遺伝子との間のクローニング結合部を検査するのに用いられ（配列番号：４２、４３および４４）、更には、挿入された遺伝子の始めと終りからの配列データを与えた。６７９、６７７、１８０２および１２８０（配列番号：３３、３４、４５および３５）として知られるものを含めた他のプライマーは、挿入された遺伝子配列の残りの部分を確認するのに用いられた。修飾された成熟ＨＣＰＢ遺伝子を有するこのプラスミドは、ｐＩＣＩ 1712として知られている。ＰｅｌＢ配列の始めから（Ｈｉｓ）₆−ｃ−ｍｙｃ標識の終りまでの、アミノ酸翻訳を示したクローン化遺伝子の確認された配列は、配列番号：４６として示され、ＤＮＡ番号はＰｅｌＢの最初のコドンにおいて１から始まり、そしてペプチド番号は成熟ＨＣＰＢにおいて１から始まる。修飾ＨＣＰＢの制御された発現を得るために、ｐＩＣＩ1712プラスミドＤＮＡを、塩化カルシウム形質転換コンピテント大腸菌発現菌株中に形質転換した。これらの菌株の中に含まれるのは、主要炭素源としてアラビノースを用いて成長することができないものであり且つアラビノース（Ａｒａ）オペロンを欠失した染色体であった。好ましい菌株は、ＭＳＤ213（Casadabanら，Journal of Molecul ar Biology,138,179-208,1980の菌株ＭＣ1000）として知られ、不完全な遺伝子型Ｆ^-AraΔ(Ara-Leu)ΔLacX74 GalV GalK StrRを有する。もう一つ好ましい菌株は、ＭＳＤ525（菌株ＭＣ1061）として知られ、遺伝子型AraD139Δ(Ara Leu)769 7ΔLac74 GalU HsdR RpsLを有する。プラスミドｐＩＣＩ266中のＡｒａＢプロモーターからの遺伝子の制御された発現に適した同様の表現型を有する大腸菌株は、The E.coli Genetic Stock Centre,Department of Biology，エール大学，ＣＴ，米国から得ることができる。形質転換の選択は、テトラサイクリン１０μｇ／ｍｌを含有するＬ寒天栄養培地上において３７℃で一晩中であった。シングルコロニーを形質転換プレートから採取し、テトラサイクリン１０μｇ／ｍｌを含有するＬ寒天栄養培地上で画線接種により精製し且つ維持し、そしてテトラサイクリン１０μｇ／ｍｌを含有するＬブイヨン栄養培地中で増殖させた。ｐＩＣＩ1712形質転換発現菌株全部を同様に処理して、クローン化ＨＣＰＢ遺伝子の発現について調べた。１．シングルコロニーを用いて、２５ｍｌユニバーサルコンテナ中のテトラサイクリン１０μｇ／ｍｌ含有Ｌブイヨン栄養培地１０ｍｌに接種した。２．２５０ｍｌ三角フラスコ中で３７℃まで予熱されたテトラサイクリン１０ μｇ／ｍｌ含有Ｌブイヨン栄養培地７５ｍｌに、一晩培養物０．７５ｍｌ（１％ｖ／ｖ）を接種した。インキュベーションは、振とうしながら３７℃で続けられ、そして成長を５４０ｎｍでの吸光度で監視した。クローン化タンパク質発現の誘導は、培養物の指数的成長の間に必要とされ、これは、５４０ｎｍで０．４〜０．６のＯ．Ｄ．として確かめられ、概して、接種から９０〜１５０分間を要した。３．細胞が必要な光学濃度に達した時点で、フラスコを室温で３０分間置くことによって培養物を約３０℃まで冷却させた。次に、アラビノースを１％（ｗ／ｖ）の最終濃度まで加え、そしてインキュベーションを３０℃で振とうしながら４〜６時間続けた。４．インキュベーション後、最終光学濃度測定値を得、そして細胞を遠心分離によって採集した。最終Ｏ．Ｄ．測定値を用いて、細胞ペレットを再懸濁させるのに用いられるタンパク質アクリルアミドゲル（Laemmli）添加緩衝液の容量を計算する。１未満のＯ．Ｄ．では、０．１Ｏ．Ｄ．単位ごとに１０μｌの容量を用い、そして１より大のＯ．Ｄ．では、０．１Ｏ．Ｄ．単位ごとに１５μｌの容量を用いる、Laemmli添加緩衝液は、２％ＳＤＳ、２％β−メルカプトエタノール、１０％グリセロールおよび０．１％ブロモフェノールブルーを含有する０．１２５Ｍトリス−ＨＣｌｐＨ６．８から成る。５．再懸濁後、試料を１００℃で１０分間加熱することによって変性させた後、遠心分離して、粘稠な細胞破片を上澄みから分離した。発現試料、通常、上澄み２０μｌを、典型的に、タンパク質の電気泳動分離のために１７％ＳＤＳアクリルアミドゲル上に加えた。概して、二重のゲルを調製したので、一方は全タンパク質について染色しうるし（クーマシーまたは同様の染料および標準条件を用いる）、そしてもう一方は、ウェスタン分析を用いて具体的な生成物を示すように処理しうる。ウェスタン分析用に、流れたゲル中のタンパク質を、半乾燥電気泳動ブロッティング装置（Bio-radまたは類似物）を用いて、ナイロン膜（例えば、Problot， Applied Biosystems）に移した。処理前および中、膜が確実に湿った状態であるように注意を払った。タンパク質をゲルから移した後、５％低脂肪乳粉末（Marv elまたは類似物）のリン酸緩衝溶液（ＰＢＳ）中溶液を室温で緩やかに撹拌しながら５時間用いて、更に結合するのを阻止した。次に、膜を、０．０５％トゥイーン２０含有ＰＢＳ中において室温で緩やかに撹拌しながら各５分間３回洗浄した。次に、洗浄された膜を、一次抗体である単クローン性抗体９Ｅ１０マウス抗ｃ−ｍｙｃペプチド（上を参照されたい）と一緒に、０．０５％トゥイーン２０および０．５％低脂肪乳粉末含有ＰＢＳ中の適当な希釈（典型的に、腹水では１０，０００につき１またはハイブリドーマ培養物上澄みでは４０につき１）において室温で緩やかに撹拌しながら一晩中インキュベートした。次に、膜を、０．０５％トゥイーン２０含有ＰＢＳ中において室温で緩やかに撹拌しながらそれぞれ少なくとも５分間３回洗浄した。次に、洗浄された膜を、二次抗体であるホースラディッシュペルオキシダーゼ標識抗マウスＩｇＧ（典型的に、ヤギで生じた、SigmaからのＡ4416など）と一緒に、０．０５％トゥイーン２０および０．５％低脂肪乳粉末含有ＰＢＳ中の適当な希釈（典型的に、１０，０００につき１）において室温で緩やかに撹拌しながら少なくとも３時間インキュベートした。次に、膜を、０．０５％トゥイーン２０含有ＰＢＳ中において室温で緩やかに撹拌しながらそれぞれ少なくとも１０分間３回洗浄した。次に、その膜を、Amersham ECLウェスタン検出キット法を用いて処理し、そしてAmersham Hyperfilm ECLに対して、まず最初に３０秒間、続いて適当な時間暴露して、発現されたタンパク質バンドの鮮明な像を与えた。ペルオキシダーゼ標識タンパク質の膜上での検出に同様の感度を有する他の方法を用いることができる。ｐＩＣＩ266（ｐＩＣＩ1712）中のクローン化された標識ＨＣＰＢの充分な発現は、大腸菌株ＭＳＤ213およびＭＳＤ525において、ベクター（ｐＩＣＩ266）だけのクローンと比較した場合に約３５，０００ダルトンでの更に別の強いタンパク質バンドを示したクーマシー染色ゲルによって示され、同様の寸法のバンドは、ｃ−ｍｙｃペフチド標識のウェスタン分析検出によって強いシグナルを与えた。参考例８成熟ＨＣＰＢの大腸菌からの発現大腸菌で成熟ＨＣＰＢをクローニングし且つ発現させる方法は、参考例７で記載された方法と極めて類似していた。再度、ｐＩＣＩ266をクローニングベクターとして用いたが、この場合、成熟ＨＣＰＢ遺伝子のＰＣＲの出発物質は、発現ベクター中の標識遺伝子であるプラスミドｐＩＣＩ1712であった。２２６４および２２６５（配列番号：４８および４９）として知られる二つのオリゴヌクレオチドを、参考例７と同様の条件を用いるが、ｐＩＣＩ1698の代わりにｐＩＣＩ17 12ＤＮＡを用いるＰＣＲ反応で（プライマーFSPTS1および6HIS9E10R1BS1の代わりに）用いた。最初の上部鎖オリゴヌクレオチド２２６４は、ｐＩＣＩ1712で開始し且つＮｃｏＩ制限酵素部位をＰｅｌＢリーダー配列中に包含し、そして挿入された成熟ＨＣＰＢ遺伝子（配列番号：４６の３６〜６６までのＤＮＡ塩基）の出発点まで続くように設計された。次の下部鎖オリゴヌクレオチド２２６５は、（Ｈｉｓ）₆−ｃ−ｍｙｃ標識配列（配列番号：４６の９６５〜９８７までのＤＮＡ塩基に対して相補的）が始まる前の、成熟ＨＣＰＢ遺伝子の終りで開始し、そしてその遺伝子の終りに翻訳終結コドン（TAA TAAに対して相補的）、続いてＥｃｏＲＩ（GAATTC）制限酵素部位およびフィルイン塩基を導入するように設計された。このオリゴプライマーは、ＰＣＲで遺伝子中に戻って成熟遺伝子配列を単離する。ＰＣＲ生成物のアリコートを、正しい寸法（約９７０塩基対）のＤＮＡについてアガロースゲル電気泳動によって分析し、そして正しい寸法のバンドが優先的に含まれることが判った。反応配合物からの残りの生成物を、参考例７と同様に精製した。単離されたＤＮＡを、酵素ＮｃｏＩおよびＥｃｏＲＩで制限消化し、そして正しい寸法（約９４０塩基対）のバンドを参考例７と同様に精製した。参考例７と同様に製造されたｐＩＣＩ266二本鎖ＤＮＡを、ＮｃｏＩおよびＥｃｏＲＩ酵素で、完全な消化を確実にするように極めて慎重に制限消化した。正しい寸法（約５６００塩基対）のＤＮＡは、参考例７と同様に精製された。制限消化されたおよび精製されたＤＮＡ試料両方のアリコートを、既知の標準と比較されるアガロースゲル電気泳動を用いて、純度および濃度評価について検査した。これらの評価から、連結配合物は、参考例７と同様に、ＨＣＰＢ遺伝子をｐＩＣＩ266ベクター中にクローン化するように製造された。連結反応後、参考例７と同様に、そのＤＮＡ混合物を用いて大腸菌株ＤＨ５α を形質転換し、コロニーを採取し且つハイブリダイゼーションによって調べた。次に、クローンの内６個を、プラスミドＤＮＡ製造用に取り、続いてそれらを、参考例７と同様に、ＰＣＲ生成物の部分にわたって配列決定した。クローンは、１５０４、１８０２、６７９、１２８０、６７７および１７３１（配列番号：４２、４５、３３、３５、３４および４４）として知られる６種類の別々のオリゴヌクレオチドプライマーを用いて配列決定された。配列決定結果から、必要な成熟ＨＣＰＢ遺伝子配列を含むプラスミドを含有するクローンを選択したが、それはｐＩＣＩ1736として知られている。ＰｅｌＢ配列の始めからＥｃｏＲＩ制限部位までの、アミノ酸翻訳を示したクローン化遺伝子の確認された配列は、配列番号：５０として示され、ＤＮＡ番号はＰｅｌＢの最初のコドンにおいて１から始まり、そしてペプチド番号は成熟ＨＣＰＢにおいて１から始まる。成熟ＨＣＰＢの制御された発現を得るために、ｐＩＣＩ1736プラスミドＤＮＡを、参考例７と同様に、塩化カルシウム形質転換コンピテント大腸菌発現菌株中に形質転換した。ｐＩＣＩ1736形質転換発現菌株全部を、参考例７と同様に処理して、クローン化ＨＣＰＢ遺伝子の発現について調べた。しかしながら、この場合、成熟ＨＣＰＢはＣ末端標識を有していないので、ｃ−ｍｙｃペプチド標識に特異的な９Ｅ１０単クローン性抗体抗体をウェスタン分析で用いることはできない。したがって、一次抗体は、精製ヒト膵臓カルボキシペプチダーゼＢと交差反応することが前に示されたウサギで生じた抗ウシカルボキシペプチダーゼＡ（Bi ogenesisから）であった。二次抗体は、ホースラディッシュペルオキシダーゼで標識され且つヤギで生じた抗ウサギＩｇＧ抗体であった（Sigma Ａ9169または類似物）。ｐＩＣＩ266（ｐＩＣＩ1736）中のクローン化された成熟ＨＣＰＢの発現は、大腸菌株ＭＳＤ213およびＭＳＤ525において、ベクター（ｐＩＣＩ266）だけのクローンと比較した場合に約３４，０００ダルトンで更に別のタンパク質バンドを示したクーマシー染色ゲルによって示された。同様の寸法のバンドは、抗ウシカルボキシペプチダーゼＡを用いるウェスタン分析検出によってシグナルを与えた。参考例９成熟ＨＣＰＢのＣＯＳ細胞からの発現プレＨＣＰＢをコードしている遺伝子を、ＰＣＲによってｐＩＣＩ1698から生成した（参考例１）。ＰＣＲは、鋳型ｐＩＣＩ1689（１０μｇ）並びに配列番号：１および配列番号：２（それぞれ１００ピコモル）のオリゴを用いて、１０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．３）、５０ｍＭＫＣｌ、１．５ｍＭＭｇＣｌ₂ 、各０．１２５ｍＭのｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰおよびｄＴＴＰ並びに２．５単位のＴａｑＤＮＡポリメラーゼ（Amplitaq，Perkin-Elmer Cetus）を含有する緩衝液（１００μｌ）中で行われた。反応を鉱油（１００μｌ）で覆い、そして９４℃１分間、５３℃１分間および７２℃２．５分間を２５サイクル回に加えて７２℃１０分間のインキュベーションを行った。９８５ｂｐのＰＣＲ生成物は、１％アガロース（Agarose Ｉ型，Sigma Ａ-6013）ゲル上での電気泳動に続くゲルからのバンドの切除およびGeneclean（Geneclean IIキット，Stratech Sc ientific Ltd．またはBio 101 Inc.）の使用によるＤＮＡフラグメントの単離によって単離された。Genecleanキットは、（１）６Ｍヨウ化ナトリウム、（２）塩化ナトリウム／エタノール／水洗浄を行うための塩化ナトリウム、トリスおよびＥＤＴＡの濃厚溶液；（３）Glassmilk（ＴＭ）−特別に配合されたシリカマトリックスの水中懸濁液１．２５ｍｌが入っている１．５ｍｌバイアルを含む。これは、Proceedings of the National Academy of Sciences USA(1979),76巻，615頁で公表されたVogelsteinおよびGillespieの方法に基づくＤＮＡ精製技術である。或いは、“Molecular Cloning-a laboratory manual”第２版，Sambroo k、FritschおよびManiatis（Cold Spring Harbor Laboratory,1989）で記載された方法のいずれかを用いることができる。簡単にいうと、Geneclean法は次の通りである。ゲル切片１容量に対して、キットからのヨウ化ナトリウム溶液３容量を加える。アガロースは、その配合物を５５℃で１０分間加熱することによって溶融された後、Glassmilk（５〜１０μｌ）を加えられ、充分に混合され、そして周囲温度で１０分間放置される。グラスミルクを回転下降させ（spun down）、そしてキットからのNEW WASH（５００μｌ）で３回洗浄する。洗浄緩衝液をGl assmilkから除去し、それを自然乾燥させる。ＤＮＡは、乾燥したGlassmilkを水（５〜１０μｌ）と一緒に５５℃で５〜１０分間インキュベートすることによって溶離される。溶離したＤＮＡを含有する水性上澄みを、遠心分離によって回収する。溶離工程を繰返し、そして上澄みをプールすることができる。プレＨＣＰＢ遺伝子は、ＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄIIIを用いて、１００ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１０ｍＭ塩化マグネシウム、５０ｍＭＮａＣｌ、０．０２５％トリトンＸ−１００および各２５単位のＨｉｎｄIIIおよびＥｃｏＲＩ（New England Biolabs）を含有する１００μｌ反応中において３７℃ で１時間消化された。消化されたフラグメントは、切断されていないフラグメントについて上記のようにアガロースゲル電気泳動およびGenecleanによって精製され、そしてpBluescript（Stratagene Cloning Systems）中にクローン化された。 pBluescript KS+ＤＮＡ（５μｇ）を、上記のように１００μｌ反応中においてＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄIII（各２５単位）で完全に消化させた。子ウシ腸アルカリホスファターゼ（１μｌ；New England Biolabs，１０単位／μｌ）を、消化されたプラスミドに対して加えて５′リン酸基を除去し、そしてインキュベーションを３７℃で更に３０分間続けた。ホスファターゼ活性は、７０℃で１０分間のインキュベーションによって破壊された。ＥｃｏＲＩ−ＨｉｎｄIIIで切断されたプラスミドは、上記のようにアガロースゲルから精製された。ＥｃｏＲＩ−ＨｉｎｄIIIで消化されたプレＨＣＰＢ遺伝子（５０ｎｇ）と、上の切断されたプラスミドＤＮＡとを、３０ｍＭトリス−Ｈｃｌ（ｐＨ７．８）、１０ｍＭＭｇＣｌ₂、１０ｍＭＤＴＴ、１ｍＭＡＴＰ、５０μｇ／ｍｌＢＳＡおよび４００単位のＴ４ＤＮＡリガーゼ（New England Biolabs,Inc.）を含有する溶液２０μｌ中において２５℃で４時間連結した。反応のアリコート１μｌを用いて、コンピテント大腸菌ＤＨ５α細胞（ＭＡＸ効率ＤＨ５αコンピテント細胞，Life Technologies Ltd）２０μｌを、細胞と一緒に与えられたプロトコールを用いて形質転換した。形質転換された細胞を、アンピシリン１００μｇ／ｍｌを加えたＬ寒天上にプレーティングした。可能性のあるプレＨＣＰＢクローンは、ＰＣＲによって識別された。それぞれのクローンに、２５サイクルのＰＣＲの前に細胞を含む配合物を９４℃で５分間インキュベートしたこと（熱開始法）並びに配列番号：３および４のオリゴが配列番号：１および２のオリゴの代わりになること以外は、プレＨＣＰＢ遺伝子の製造について上で記載されたようにＰＣＲを行った。ＰＣＲ反応の試料（１０μｌ）を、１％アガロースゲル上の電気泳動によって分析した。プレＨＣＰＢ遺伝子含有クローンは、１．２ｋｂのＰＣＲ生成物の存在によって確認された。１．２ｋｂを生じたクローンを、大規模なプラスミドＤＮＡ製造に用い、そしてインサートの配列を、ＤＮＡ配列分析によって確認した。pBluescript中のプレＨＣＰＢ遺伝子を含有するプラスミドは、ｐＭＦ１５と称された。真核性細胞中でＨＣＰＢを発現できるベクターを生成するために、ＣＧ−Syst em(^TM)系（Celltech Biologics）を用いた（ＷＯ87/04462号、ＷＯ89/01036号、ＷＯ86/05807号およびＷＯ89/10404号）。その手順は、ベクターｐＥＥ１２［このベクターは、Bebbingtonら（1992）Bio/Technology 10,169-175で記載されたｐＳＶ２．ＧＳと同様であり、部位特異的突然変異誘発によって除去されてマルチリンカー部分に独特の部位を与えるｐＳＶ２．ＧＳ中に本来存在している多数の制限部位を有する］のＨｉｎｄIII−ＥｃｏＲＩ部分中へのプレＨＣＰＢ遺伝子のクローニングを必要とする。発現ベクターを構築するために、プラスミドｐＥＥ１２およびｐＭＦ１５を、上記のようにＥｃｏＲＩ−ＨｉｎｄIIIで消化した。それぞれの消化物からの適当なベクター（ｐＥＥ１２から）およびインサート（ｐＭＦ１５から）を、１％アガロースゲルから単離し且つ互いに連結させ、そしてコンピテントＤＨ５α細胞を形質転換するのに用いた。形質転換された細胞を、アンピシリン（１００μｇ／ｍｌ）を加えたＬ寒天上にプレーティングした。コロニーは、上記のようにＰＣＲによって、ＣＭＶプロモーター（配列番号：５）中およびＨＣＰＢ遺伝子（配列番号：６）中で開始するオリゴについてスクリーニングされた。１．３６５ｋｂのＰＣＲ生成物を生産するクローンを大規模なプラスミドＤＮＡ製造用に用い、そしてインサートの配列を、ＤＮＡ配列分析によって確認した。ｐＥＥ１２中のプレＨＣＰＢ配列を含有するプラスミドは、ｐＭＦ４８と称された。プレプロＨＣＰＢのプレプロ配列を含有する第二の真核性発現プラスミドｐＥＥ１２は、上記のように製造された。配列番号：７および８のオリゴを最初のＰＣＲで用いて、ｐＭＦ１８（参考例１１で記載される）からのプレプロ配列の遺伝子を単離した。この場合、ＰＣＲは、ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ不含の配合物を最初に９４℃で５分間インキュベートすることによる熱開始法で行われた。次に、ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ（２．５単位）を加え、そしてＰＣＲを上記のように２５サイクル通して続けた。３６０ｂｐフラグメントをpBluescript中にクローン化してｐＭＦ６６を与え、続いてｐＥＥ１２（配列番号：７および８を用いるＰＣＲによってスクリーニングする）中にクローン化してｐＭＦ６７を与えた。真核細胞での発現のために、プレＨＣＰＢおよびプレプロ配列を発現できる遺伝子を含有するベクターを、ＣＯＳ−７細胞中に同時トランスフェクションした。ＣＯＳ細胞は、起点欠損ＳＶ４０ウイルスで形質転換されたアフリカミドリザル腎細胞系ＣＶ−１であり、ＳＶ４０複製起点を含有する環状プラスミドを極めて高いコピー数まで複製するそれらの能力のために、種々のタンパク質の短期の過渡的発現に広く用いられてきた。２種類の広く利用可能なＣＯＳ細胞クローンであるＣＯＳ−１およびＣＯＳ−７がある。ＣＯＳ細胞のトランスフェクションの基本的な方法論は、Bebbingtonによって、Methods:A Companion to Methods i n Enzymology(1991)2,141頁で記載されている。ＨＣＰＢの発現には、プラスミドベクターｐＭＦ４８およびｐＭＦ６７（それぞれ４μｇ）を用いて、６ウェル培養プレート中の１０％熱失活ウシ胎児血清（ＦＣＳ）含有ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）２ｍｌ中において、ポリヌクレオチドのリポフェクチン− 陽イオン脂質媒介供給として知られる方法［Felgnerら，Methods:A Companion t o Methods in Enzymology(1993)5,67-75中］によって、ＣＯＳ−７細胞（２ｘ１０⁵個）をトランスフェクションした。細胞を、ＣＯ₂インキュベーター中において３７℃で２０時間インキュベートした。プラスミドＤＮＡの血清不含培地（２００μｌ；OPTI-MEM還元血清培地；GibcoBRL製品番号31985）中配合物を、LIPOF ECTIN試薬（１２μｌ；GibcoBRL製品番号18292-011）と緩やかに混合し、そして周囲温度で１５分間インキュベートした。細胞を血清不含培地（２ｍｌ；OPTI-M EM）で洗浄した。血清不含培地（６００μｌ；OPTI-MEM）をＤＮＡ／LIPOFECTIN に対して加え、そしてその配合物を細胞上にのせて、それらをＣＯ₂インキュベーター中において３７℃で６時間インキュベートした。ＤＮＡ含有培地を１０％ＦＣＳ含有標準ＤＭＥＭと交換し、そして細胞を前と同様に７２時間インキュベートした。細胞上澄み（２５０μｌ）を、参考例３で記載のように、Ｈｉｐｐ− Ａｒｇに対するＨＣＰＢ活性について分析した（５時間検定）。LIPOFECTIN試薬で処理されたがプラスミドＤＮＡ不含のＣＯＳ細胞上澄みは、基質の１．２％を加水分解したが、プレＨＣＰＢおよびプレプロ配列を発現したプラスミドの配合物でトランスフェクションされたＣＯＳ細胞上澄みは、Ｈｉｐｐ−Ａｒｇ基質の６１％を加水分解した。プレＨＣＰＢプラスミドのみでトランスフェクションされたＣＯＳ細胞は、LIPOFECTIN試薬単独で処理されたＣＯＳ細胞で見られる水準でＨｉｐｐ−Ａｒｇを加水分解した。 LIPOFECTIN試薬は、陽イオン脂質塩化Ｎ−［１−（２，３−ジオレイルオキシ）プロピル］−ｎ，ｎ，ｎ−トリメチルアンモニウム（ＤＯＴＭＡ）およびジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）のメンブランフィルター濾過水中の１：１（ｗ／ｗ）リポソーム配合物である。それは、ＤＮＡと自然に結合して脂質−ＤＮＡ複合体を形成する。Felgnerら，Proc.Natl.Acad.Sci. USA(1987)84,7431を参照されたい。参考例１０プロＨＣＰＢの大腸菌からの発現大腸菌でプロＨＣＰＢをクローニングし且つ発現させる方法は、参考例７で記載された方法と極めて類似していた。再度、ｐＩＣＩ266をクローニングベクターとして用い、そしてプロＨＣＰＢ遺伝子のＰＣＲの出発物質は、プラスミドｐＩＣＩ1698であった（参考例６で記載の通り）。２３１０および２２６５（配列番号：５２および４９）として知られる二つのオリゴヌクレオチドを、参考例７と同様の条件を用いて、ＰＣＲ反応で（プライマーFSPTS1および6HIS9E10R1BS1 の代わりに）用いた。最初の上部鎖オリゴヌクレオチド２３１０は、ｐＩＣＩ1698で開始し、そしてＮｃｏＩ制限酵素部位をＰｅｌＢリーダー配列（配列番号：４６の５１〜６６までのＤＮＡ塩基）から、挿入されたプロＨＣＰＢ遺伝子（配列番号：３８の４０〜５７までのＤＮＡ塩基）の出発点まで加えるように設計された。次の下部鎖オリゴヌクレオチド２２６５は、（Ｈｉｓ）₆−ｃ−ｍｙｃ標識配列（配列番号：４６の９６５〜９８７までのＤＮＡ塩基に対して相補的）が始まる前の、成熟ＨＣＰＢ遺伝子の終りで開始し、そしてその遺伝子の終りに翻訳終結コドン（TAA TAAに対して相補的）、続いてＥｃｏＲＩ（GAATTC）制限酵素部位およびフィルイン塩基を導入するように設計された。このオリゴプライマーは、ＰＣＲで遺伝子中に戻ってプロ遺伝子配列を単離する。ＰＣＲ生成物のアリコートを、正しい寸法（約１２４０塩基対）のＤＮＡについてアガロースゲル電気泳動によって分析し、そして正しい寸法のバンドが優先的に含まれることが判った。反応配合物からの残りの生成物を、参考例７と同様に精製した。単離されたＤＮＡを、酵素ＮｃｏＩおよびＥｃｏＲＩで制限消化し、そして正しい寸法（約１２１０塩基対）のバンドを参考例７と同様に精製した。参考例７と同様に製造されたｐＩＣＩ266二本鎖ＤＮＡを、ＮｃｏＩおよびＥｃｏＲＩ酵素で、完全な消化を確実にするように極めて慎重に制限消化した。正しい寸法（約５６００塩基対）のＤＮＡは、参考例７と同様に精製された。制限消化されたおよび精製されたＤＮＡ試料両方のアリコートを、既知の標準と比較されるアガロースゲル電気泳動を用いて、純度および濃度評価について検査した。これらの評価から、連結配合物は、参考例７と同様に、プロＨＣＰＢ遺伝子をｐＩＣＩ266ベクター中にクローン化するように製造された。連結反応後、参考例７と同様に、そのＤＮＡ混合物を用いて大腸菌株ＤＨ５α を形質転換し、コロニーを採取し且つハイブリダイゼーションによって調べた。４種類の正のハイブリダイゼーション単離物を、ＰＣＲによって、正しい寸法のインサートについてプライマー２３１０および２２６５（配列番号：５２および４９）を用いて、１対の内部プライマー１２７９（配列番号：３６）および６７９（配列番号：３３）で開始することについて、参考例７と同様に検査した。ＰＣＲ生成物を、正しい寸法（プライマー２３１０〜２２６５の約１２００塩基対およびプライマー１２７９〜６７９の約５８０塩基対）のＤＮＡについてアガロースゲル電気泳動によって分析した。クローン全部が、正しい寸法のＰＣＲＤＮＡ生成物を与えた。次に、クローンの内４個全部を、プラスミドＤＮＡ製造用に取り、続いてそれらを、参考例７と同様に、ＰＣＲ生成物の部分にわたって配列決定した。クローンは、１５０４、１８０２、６７９、１２８１、１５９０および１５９２（配列番号：４２、４５、３３、３７、５３および５４）として知られる６種類の別々のオリゴヌクレオチドプライマーを用いて配列決定された。配列決定結果から、必要なプロＨＣＰＢ遺伝子配列を含むプラスミドを含有するクローンを選択したが、それはｐＩＣＩ1738として知られている。ＰｅｌＢ配列の始めからＥｃｏＲＩ制限部位までの、アミノ酸翻訳を示したｐＩＣＩ1738中のクローン化プロＨＣＰＢ遺伝子の確認された配列は、配列番号：５５として示され、ＤＮＡ番号はＰｅｌＢの最初のコドンにおいて１から始まり、そしてペプチド番号は成熟ＨＣＰＢにおいて１から始まる。プロＨＣＰＢの制御された発現を得るために、ｐＩＣＩ1738プラスミドＤＮＡを、参考例７と同様に、塩化カルシウム形質転換コンピテント大腸菌発現菌株中に形質転換した。ｐＩＣＩ1738形質転換発現菌株全部を、参考例７と同様に処理して、クローン化ＨＣＰＢ遺伝子の発現について調べた。しかしながら、この場合、プロＨＣＰＢはＣ末端標識を有していないので、ｃ−ｍｙｃペプチド標識に特異的な９Ｅ１０単クローン性抗体抗体をウェスタン分析で用いることはできない。したがって、一次抗体は、精製ヒト膵臓カルボキシペプチダーゼＢと交差反応することが前に示されたウサギで生じた抗ウシカルボキシペプチダーゼＡ（Bi ogenesisから）であった。二次抗体は、ホースラディッシュペルオキシダーゼで標識され且つヤギで生じた抗ウサギＩｇＧ抗体であった（Sigma Ａ0545または類似物）。ｐＩＣＩ266（ｐＩＣＩ1738）中のクローン化されたプロＨＣＰＢの発現は、ベクター（ｐＩＣＩ266）だけのクローンと比較した場合に約４０，０００ダルトンで更に別のタンパク質バンドを示したクーマシー染色ゲルによって大腸菌から示され、そしてクローンは標識ＨＣＰＢを生産した（参考例７）。同様の寸法のバンドは、抗ウシカルボキシペプチダーゼＡを用いるウェスタン分析検出によってシグナルを与えた。参考例１１プロＨＣＰＢのＣＯＳ細胞からの発現プレプロＨＣＰＢの遺伝子を、参考例９で記載のようにＰＣＲによって、鋳型としてのｐＩＣＩ1689、並びに配列番号：１および７のオリゴを用いて１２７０ｂｐのＰＣＲ生成物を与えることによって製造した。その遺伝子を、参考例９で記載のように、ＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄIIIを用いて消化し、そして最初にpBl uescript KS+中に（ｐＭＦ１８を与える）、続いてＤＨ５α中のｐＥＥ１２中に（ｐＭＦ４９を与える）クローン化した。プラスミドｐＭＦ４９は、参考例９で記載のように、LIPOFECTIN試薬の使用によってＣＯＳ−７細胞中にトランスフェクションされ、そして細胞上澄み（２５０μｌ）は、トリプシン（７００μ ｇ／ｍｌ）を用いて５０ｍＭトリス−Ｈｃｌ（ｐＨ７．６）、１５０ｍＭＮａＣｌ中において４℃で１時間活性化後に、参考例３で記載のように、Ｈｉｐｐ− Ａｒｇに対するＨＣＰＢ活性について検定された（５時間検定）。これらの条件下で、Ｈｉｐｐ−Ａｒｇ基質の完全な加水分解は達成されたが、LIPOFECTIN試薬単独で処理された（プラスミドＤＮＡ不含）ＣＯＳ細胞からの上澄みは、トリブシンで活性化された場合、Ｈｉｐｐ−Ａｒｇ基質の３０％を加水分解した。参考例１２天然ＨＣＰＢの精製天然のおよび異なった突然変異酵素の二つの経路による初期精製についてシステムを決定した。好ましい経路を最初に記載する。組換え酵素を含有する組換え大腸菌細胞ペーストを−７０℃での貯蔵から取り且つ融解させた。細胞ペーストの重量をグラムで測定し、そしてその細胞ペーストの初期重量と等しい容量まで緩衝液Ａ（２００ｍＭトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン塩酸塩（TRIS−ＨＣｌ）、２０％スクロース、ｐＨ８．０）を加えることでペーストを再懸濁させた。その細胞懸濁液を時々緩やかに混合しながら室温で２０分間インキュベートした後、等容量の蒸留水を加え且つ完全に混合した。再度、細胞懸濁液を時々緩やかに混合しながら室温で２０分間インキュベートした。得られた粗浸透圧ショック産物を、４℃において９８０００ｘｇで９０分間の遠心分離によって清澄化した後、その上澄みを、ペレット化した不溶性部分から傾瀉除去した。デオキシリボヌクレアーゼ１を、その上澄みに対して０．１ｍｇ／ｍｌの最終濃度まで加えた。その混合物を室温で絶えず振とうしながら、PharmaciaからのＣＮＢｒ活性セファロース４Ｂおよびジャガイモ塊茎からのカルボキシペプチダーゼインヒビター（ｃ− 0279，Sigma）を用いる指示にしたがって調製されたカルボキシペプチダーゼインヒビターＣＮＢｒ活性セファロースアフィニティーカラムに対してそれを充填するのに充分に粘度が減少するまでインキュベートした。上澄みをｐＨ８．０に調整し、そして１０ｍＭ TRIS-ＨＣｌ、５００ｍＭ塩化ナトリウム、ｐＨ８．０で予め平衡されたアフィニティーカラム上に充填した。上澄みを充填後、フロースルー（flow through）の吸光度がベースラインに戻るまでカラムを洗浄した後、結合した物質を溶離緩衝液（１００ｍＭ炭酸ナトリウム、５００ｍＭ塩化ナトリウム、ｐＨ１１．４）によってカラムから溶離した。溶離した画分を−２０ ℃で凍結させたが、組換えカルボキシペプチダーゼ含有画分は、ウェスタンブロット分析により、抗ｃ−ｍｙｃ標識抗体（９Ｅ１０）を用いて、続いて４−クロロナフトールおよび過酸化水素に対する暴露で着色反応を与えた抗マウス−ホースラディッシュペルオキシダーゼ結合体（ａ−9044，Sigma）を用いて確認された。組換えカルボキシペプチダーゼＢ含有画分をプールし、濃縮し、そしてそのｐＨをｐＨ７．５に調整した後、急速凍結させ且つ−２０℃で貯蔵した。プールされた試料の精製は、必要ならば、イオン交換およびゲル浸透クロマトグラフィーなどの既知の方法を用いて更に行うことができる。第二経路は、好ましい経路で用いられたようなペリプラズムショックに対立するものとして、大腸菌細胞の完全な溶解を必要とする。組換え酵素を含有する組換え大腸菌細胞ペーストを取り、溶解緩衝液（５０ｍＭ TRIS−ＨＣｌ、１５％スクロース、ｐＨ８．０）中に再懸濁させた。リゾチームを１ｍｇ／ｍｌの濃度まで加え、そして同時に、ドデシル硫酸リチウム（ＬＤＳ）を加えた（懸濁液２５ｍｌにつき２５％溶液８０μｌ）。その懸濁液を時々振とうしながら氷上で３０分間インキュベートした後、デオキシリボヌクレアーゼ１を０．１ｍｇ／ｍｌの濃度まで加え、そして再度、懸濁液を時々振とうしながら氷上で３０分間インキュベートした。次に、その懸濁液を２００ｍｌ容量に分配し、そして細胞の破壊を完全にするために、噴出間隔３０秒間で１０ｘ３０秒間噴出の音波処理を行った。音波処理された懸濁液を、４℃において９８，０００ｘｇで９０分間遠心分離した後、その上澄みを、ペレット化した不溶性部分から傾瀉除去した。その上澄みをｐＨ８．０に調整し、そして１０ｍＭ TRIS −ＨＣｌ、５００ｍＭ塩化ナトリウム、ｐＨ８．０で予め平衡されたアフィニティーカラム上に充填した。上澄みを充填後、フロースルーの吸光度がベースラインに戻るまでカラムを洗浄した後、結合した物質を溶離緩衝液（１００ｍＭ炭酸ナトリウム、５００ｍＭ塩化ナトリウム、ｐＨ１１．４）によってカラムから溶離した。溶離画分を−２０℃で凍結させたが、組換えカルボキシペプチダーゼ含有画分は、ウェスタンブロット分析により、抗ｃ−ｍｙｃ標識抗体（９Ｅ１０）に続いて、４−クロロナフトールおよび過酸化水素に対する暴露で着色反応を与えた抗マウス−ホースラディッシュペルオキシダーゼ結合体（ａ−9044，Sigma ）を用いて確認された。組換えカルボキシペプチダーゼＢ含有画分をプールし、濃縮し、そしてそのｐＨをｐＨ７．５に調整した後、急速凍結させ且つ−２０℃ で貯蔵した。プールされた試料の精製は、必要ならば、イオン交換およびゲル浸透クロマトグラフィーなどの既知の方法を用いて更に行うことができる。ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびクーマシー染色ニトロセルロースブロットによって分析された両経路からのプールされた物質の試料は、クーマシー染色バンドを組換えカルボキシペプチダーゼＢの正しい分子量で与えた。エドマン分解法を用いる自動タンパク質／ペプチドシークエンサーによって配列決定されたこれらバンドは、精製される具体的な組換えカルボキシペプチダーゼＢの正の対合を与えた。参考例１３ネズミＡ５Ｂ７Ｆ（ａｂ′）₂−ＨＣＰＢ融合タンパク質のＣＯＳ細胞からの発現腫瘍関連抗原と結合できる具体的な抗体は、マウス単クローン性抗体Ａ５Ｂ７である。Ａ５Ｂ７抗体は、ヒト癌胎児性抗原（ＣＥＡ）に対して結合し、そして結腸直腸癌を標的とするのに特に適している。Ａ５Ｂ７は、DAKO Ltd.，マナー・コーチャード（Manor Courtyard）16，ヒューンデン・アベニュー（Hughenden Avenue），ハイ・ワイコム（High Wycomb），バッキンガムシャーＨＰ１３５５ＲＥ，英国イングランドから入手可能である。抗体フラグメントは、ＩｇＧ抗体全体から、例えば、Mariani,M.ら（1991），Molecular Immunology 28,69-77 によって記載のＦ（ａｂ′）₂フラグメントなどの慣用的な手段によって製造することができる。概して、抗体（または抗体フラグメント）−酵素結合体は、少なくとも二価であるはずである、すなわち、少なくとも２個の腫瘍関連抗原（同じであってよいしまたは異なっていてよい）に対して結合することができる。抗体分子は、例えば、欧州特許第239400号で開示されたような「ＣＤＲ接合（graf ti ng）」によるまたは米国特許第4816567号で開示されたようにヒト定常領域部上へ完全な可変部を接合することによるような既知の方法によってヒト化することができる。ヒト化抗体は、抗体（または抗体フラグメント）の免疫原性を減少させるのに有用でありうる。抗体Ａ５Ｂ７のヒト化変形は、ＰＣＴＷＯ92/01059 号で開示された。単クローン性抗体Ａ５Ｂ７を生じるハイブリドーマは、the European Collect ion of Animal Cell Cultures,Division of Biologics,PHLS Centre for Applie d Microbiology and Research，ポートン・ダウン（Porton Down），ソールズベリー，ウィルトシャーＳＰ４ＯＪＧ，英国で寄託された。寄託の日は１９９３年７月１４日であり、寄託番号は、93071411番である。抗体Ａ５Ｂ７は、Fenge Ｃ、Fraune ＥおよびSchuegerl Ｋ，“Production of Biologicals from Animal Cells in Culture”（Spier ＲＥ、Griffiths ＪＲおよびMeignier Ｂ監修）Bu tterworth-Heinemann,1991,262-265、およびAnderson ＢＬおよびGruenberg ＭＬ，“Commercial Production of Monoclonal Antibodies”（Seaver Ｓ監修），Marcel Dekker,1987,175-195中で実証されたような当該技術分野において知られている標準的な技法を用いて寄託されたハイブリドーマから得ることができる。細胞は、充分な水準の抗体産生を維持するために、限界希釈によって時間ごとに再クローニングする必要がありうる。この実施例は、Ａ５Ｂ７ハイブリドーマからのｃＤＮＡの製造、特異的Ｆｄおよび軽鎖フラグメントのＰＣＲによる単離、これらフラグメントの完全なＤＮＡ配列の決定、Ｆｄ−ＨＣＰＢ融合遺伝子並びに軽鎖およびＦｄ−ＨＣＰＢ融合タンパク質両方を真核細胞で生産できる同時発現ベクターの引続きの製造、ＨＣＰＢからのプレプロ配列を用いる同時トランスフェクションによるＦ（ａｂ′）₂ −ＨＣＰＢのＣＯＳ細胞からの発現を記載する。（ａ）ｍＲＮＡのハイフリドーマ細胞からの製造真核細胞からのポリＡ＋ｍＲＮＡの単離にはいくつかの方法がある（Sambrook J.、Fritsch E.F.、Maniatis T.，Molecular Cloning:A Laboratory Manual，C old Spring Harbor Laboratory Press，第２版，1989年，８章，３頁、以下、Ma niatisと称する）。一つのこのような方法は、Pharmaciaによってキットの形で提供され、比較的少数の細胞（１０⁷個またはそれ未満）の溶解に続いて、オリゴｄＴカラムに対するポリＡ＋ｍＲＮＡの結合に頼る。望ましくない細胞成分を低塩濃度で洗浄することによって除去した後、ｍＲＮＡを高塩溶液中において高温度で溶離する。ｍＲＮＡは、Quikprep ｍＲＮＡキット（Pharmacia Biotechnology Ltd.）を用いて、１０⁷個のＡ５Ｂ７ハイブリドーマ細胞から製造された。ｍＲＮＡの濃度は、Uvikon930分光光度計（Kontron Instruments）で試料を３００〜２２０ｎｍで走査し且つ２６０ｎｍで４０μｇ／ｍｌの吸光係数を用いることによって評価された。そのｍＲＮＡは、エタノール中で沈殿した２．５μｇアリコートとして貯蔵された。（ｂ）ｃＤＮＡ合成ｃＤＮＡ合成に用いられる方法は、プライマーｍＲＮＡからの逆転写に続いて、ＤＮＡポリメラーゼＩによる第二鎖の開始および合成を与えるＲＮアーゼＨ処理に頼るGublerおよびHofmanの方法に基づいた。他のｃＤＮＡ合成法は、Maniat is（８章）で論評されている。ｍＲＮＡの試料５μｇは、ＲＮアーゼ不含水を用いて７０℃でインキュベートした後に氷上で冷却することによって調製された２．５単位胎盤ＲＮアーゼインヒビター（Life Technologies Ltd.）含有溶液１０μｌ中においてオリゴｄＴ（１２〜１８マー混合物，Pharmacia Biotechnology Ltd.，０．５μｇ）を用いて開始された。次に、第１鎖のｃＤＮＡ合成を、５ｘＨ−ＲＴ緩衝液（２５０ｍＭトリス、ｐＨ８．３、２００ｍＭＫＣｌ、３０ｍＭＭｇＣｌ₂および０．５ｍｇ／ｍｌＢＳＡ）４μｌ、０．１ＭＤＴＴ（ジチオトレイトール）２μｌ、ｄＮＴＰ配合物（２０ｍＭのｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰおよびｄＴＴＰ）１μｌ、Superscript逆転写酵素（Life Technologies Ltd.）４μｌを加え且つ４２℃で１時間インキュベートすることによって行った。第二鎖反応では、ｄＮＴＰ配合物（同上）１．５μｌ、ＲＮアーゼ不含水９２．５μｌ、５ｘ反応緩衝液（１２５ｍＭトリス、ｐＨ７．５、５００ｍＭＫＣｌ、２５ｍＭＭｇＣｌ₂ 、５０ｍＭ（ＮＨ₄）₂ＳＯ₄および０．５ｍｇ／ｍｌ β−ＮＡＤ）３０μｌ、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ（１０単位，Life Technologies Ltd.）１μｌ、ＤＮＡポリメラーゼＩ（４０単位，Life Technologies Ltd.）４μｌおよびＲＮアーゼＨ（２．７単位，Life Technologies Ltd.）１μｌを加え、そしてインキュベーションを１６℃で更に２時間続けた。平滑末端付きｃＤＮＡを確実に製造するために、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼ（１０単位，Life Technologies Ltd.）２μｌを加えた後に、１６℃で５分間の最後のインキュベーションを行った。次に、７０ ℃で１０分間のインキュベーションによって酵素活性を停止させた。（ｃ）抗体遺伝子フラグメントのＰＣＲによる単離Ａ５Ｂ７ＦｄおよびＬ鎖フラグメントの単離は、ｃＤＮＡを鋳型として用いて行われた。Ｆｄフラグメントは、以下、タンパク質分解型Ｆｄと称されるヒンジ配列（ｃ末端トレオニン）の直後で終結した。第一鎖ｃＤＮＡ反応からのまたは第二鎖反応の完了後の材料は、鋳型として適している。その材料は、完了した反応からそのまま、または二回蒸留水中の希釈液（１００につき１まで）として用いうる。オリゴヌクレオチド（配列番号：１３〜１９）を、ＦｄおよびＬ鎖フラグメントの生成において用いた。それぞれの抗体フラグメントのために、５′部分オリゴヌクレオチド（Ｆｄフラグメントに対する配列番号：１３およびＬ鎖に対する配列番号：１４）は、制限酵素部位（Ｆｄに対するＨｉｎｄIIIおよびＬ鎖に対するＥｃｏＲＩ）共通Kozak配列（GCCG CCACC）をコードして、翻訳開始および天然のネズミシグナル配列の一部分を最大限にした。タンパク質分解型Ｆｄフラグメントに対する３′部分オリゴヌクレオチド（配列番号：１５）は、抗体ヒンジ領域の３′末端に対して相補的であり、タンデム翻訳終結コドン（ＴＡＧおよびＴＡＡ）をヒンジ直後に導入するように突然変異をコードし、そしてこの配列を越えてＥｃｏＲＩ制限酵素部位を含んでいた。Ｌ鎖の３′部分は、コード領域の末端に対して相補的なオリゴヌクレオチド（配列番号：１６）によって決定され、更に別の翻訳終結コドン（ＴＡＡ）およびＥｃｏＲＩ制限部位を導入した。更に、それぞれのフラグメントに対する部分的に重複した且つ相補的オリゴヌクレオチドの対（Ｆｄに対する配列番号：１７および１８並びにＬ鎖に対する配列番号：１９および６５）を用いてサイレント突然変異をそれぞれのＤＮＡ鎖中に導入した結果として、コードされたアミノ酸配列を変更することなく、ＦｄフラグメントのＣＨ１およびＬ鎖のＶＬからＢａｍＨＩが除去された。５′および３′オリゴヌクレオチドそれぞれを、適当な突然変異原性オリゴヌクレオチドと一緒に用いて、それれの抗体鎖の二つの突然変異フラグメントを生成した。精製後、二つのフラグメントを等比率で混合し、そして適切な５′および３′部分オリゴヌクレオチドを用いる第二ＰＣＲ反応の鋳型として用いた。これらの反応の生成物は、内部ＢａｍＨＩを含まない完全長さＦｄおよびＬ鎖フラグメントであった。概して、５μｌのｃＤＮＡを、１０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ８．３、５０ｍＭＫＣｌ、０．１％ゼラチン、１．５ｍＭＭｇＣｌ₂、各１．２５ｍＭのｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰおよびｄＴＴＰ、各１μモルの適当なオリゴ対並びに２．５単位のＴａｑＤＮＡポリメラーゼ（Amplitaq，Perkin-Elmer Cetus）を含有する反応１００μｌに対して加えた。それぞれの反応を鉱油１００μｌで覆い、そして９４℃で１．５分間、５０℃または５５℃１．０分間および７２℃ ２．０分間のサイクルを２５回に７２℃１０分間を加えてインキュベートした。ＤＮＡ不含の対照反応も行った。ＰＣＲ反応は、それぞれの試料５μｌを０．８％アガロース（Sigma Chemical Company Ltd.）ゲル上で試験し、それを引続き、１μｇ／ｍｌの臭化エチジウム（BOH Laboratory Supplies）溶液中で染色し、そしてＤＮＡをＵＶトランスルミネーターで可視化することによって分析された。適当な寸法のバンドは、Ａ５Ｂ７ｃＤＮＡが存在しているＰＣＲ全部で見られ、ＦｄおよびＬ鎖のフラグメントの成功した増幅が示された。対照反応でのＤＮＡバンドの不存在は、用いられた試薬が、混入したＤＮＡを含んでいなかったことを示した。それぞれのＰＣＲ生成物を、Centricon100濾過ミクロコンセントレーター（Am icon Ltd.）の使用によって精製した。それぞれの反応をコンセントレーターに加え、そしてその容量を、二回蒸留水の添加によって２ｍｌまで増加させた。次に、その装置を５００ｘｇで５分間遠心分離し（Ｈ1000Ｂローターを備えたSorv al RT6000B卓上遠心機）、そしてその「フロースルー」を捨てた。保持物質を再度２ｍｌまで希釈し、そして装置を再度遠心分離した。３回目に処理を繰返した。この手順の結果として、過剰のオリゴおよび緩衝液成分が増幅ＤＮＡから除去される。次に、これら精製ＤＮＡを、引続きのＰＣＲ反応で直接的に用いた。適当なフラグメント対を等比率で混合し、そしてアリコートを各々の５′および３′オリゴヌクレオチドと一緒に第二ＰＣＲで用いた。（ｄ）ＰＣＲで生じたフラグメントのpBluescript中へのクローニング約７７５ｂｐおよび７３０ｂｐのバンドを示した第二ＰＣＲ反応の生成物は、それぞれ、完全長さＦｄおよびＬ鎖と一致する。これら生成物を、上と同様に、 Centricon 100ミクロコンセントレーターを用いて更に精製した。次に、それぞれのＤＮＡ生成物を、３Ｍ酢酸ナトリウム５０μｌ、５００μｌまでの蒸留水および無水エタノール１ｍｌを含有する溶液１．５ｍｌ中で沈殿させた。その溶液を氷上で少なくとも１０分間インキュベートした後、１１，６００ｘｇで１０分間遠心分離した（MSE MicroCentaur）。上澄みを捨て、そしてペレットを、７０％エタノール（蒸留水中のｖ／ｖ）１ｍｌ中において更に５分間の遠心分離によって洗浄した。上澄みを捨て、そしてＤＮＡペレットを真空下で乾燥させた。それぞれのＤＮＡペレットを蒸留水中に再懸濁させた。次に、ＦｄＰＣＲ生成物を、２０ｍＭトリス−酢酸、ｐＨ７．９、１０ｍＭ酢酸マグネシウム、５０ｍＭ酢酸カリウム、１ｍＭジチオトレイトール（ＤＴＴ）および各２５単位のＨｉｎｄIIIおよびＥｃｏＲＩ（Promega Corporation）を含有する反応２００μｌ中においてＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄIIIで消化した。Ｌ鎖生成物を、９０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、１０ｍＭ塩化マグネシウム、５０ｍＭ塩化ナトリウムおよび１０単位のＥｃｏＲＩを含有する反応３０μｌ中においてＥｃｏＲＩで消化した。消化物を３７℃で１時間インキュベートした。次に、消化されたフラグメントを、０．７５％SeaPlaque GTGアガロースゲル（FMC BioProducts Ltd）上の電気泳動に続いて、ゲルからの適当なバンドの切除によって精製した。そのアガロースゲル切片を、６５℃で２分間のインキュベーションによって再溶解させ、蒸留水で４５０μｌの最終容量まで希釈し、そして３Ｍ酢酸ナトリウム５０μｌを加えた。この溶液を、トリス緩衝液ｐＨ７．６（Fisons Scientific Equipment）で平衡された等容量の液化フェノールで抽出して、１１，６００ｘｇで２分間の遠心分離（MSE MicroCentaur）を用いて水性相とフェノール性相を分離した。続いて水性相を、フェノール：クロロホルム混合物（５０：５０ｖ：ｖ）で、そして再度クロロホルムで再抽出した後、上記のようにエタノール沈殿させた。それぞれの精製されたペレットを蒸留水１０μ ｌ中に再懸濁させ、そして試料１μｌを０．８％アガロースゲル上の電気泳動によって可視化して、品質および濃度を評価した。 pBluescript（Stratagene Cloning Systems）を、ＦｄおよびＬ鎖ｃＤＮＡの初期クローニングに用いた。このphagemidベクターは、独特のＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄIIIクローニング部位、アンピシリン耐性遺伝子、並びに二本鎖または一本鎖ＤＮＡの単離のためのＣｏｌＥＩおよびｆＩ複製起点両方を有する。５μ ｇのpBluescript KS-ＤＮＡを、３０単位のＥｃｏＲＩ（Promega Corporation）を用いて、９０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、１０ｍＭＭｇＣｌ₂、５０ｍＭＮａＣｌを含有する反応１００μｌ中において、または２０ｍＭトリス− 酢酸、ｐＨ７．９、１０ｍＭ酢酸マグネシウム、５０ｍＭ酢酸カリウム、１ｍＭジチオトレイトール（ＤＴＴ）および各２５単位のＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄII I（Promega Corporation）を含有する反応１００μｌ中においてＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄIIIを用いて、３７℃で１時間完全に消化させた。子ウシ腸アルカリ性ホスファターゼ（２単位，Bohringer Mannheim）２μｌを、ＥｃｏＲＩ消化プラスミドに対して加えて５′リン酸基を除去し、そしてインキュベーションを３７℃で更に３０分間続けた。ホスファターゼ活性を７０℃で１０分間のインキュベーションによって破壊した。ＥｃｏＲＩ−ＨｉｎｄIII切断プラスミドを、上記のようにSeaPlaque GTGアガロースゲルから精製した。消化されたＦｄまたはＬ鎖ＰＣＲ生成物２５〜５０ｎｇを、それぞれ、ＥｃｏＲＩ−ＨｉｎｄIIIまたはＥｃｏＲＩ／ＣＩＰで処理されたpBluescript５０ｎｇと、３０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．８、１０ｍＭＭｇＣｌ₂、１０ｍＭＤＴＴ、１ｍＭＡＴＰおよび１．５単位のＴ４ＤＮＡリガーゼ（Promega Co rporation）を含有する溶液１０μｌ中において１６℃で２．５時間連結させた。それぞれの反応のアリコート１μｌを用いて、コンピテント大腸菌ＤＨ５α細胞（Life Technologies Ltd.）２０μｌを、細胞と一緒に与えられたプロトコールを用いて形質転換した。形質転換された細胞を、アンピシリン１００μｇ／ｍｌ、１ｍＭＩＰＴＧおよび０．２％Ｘ−ｇａｌを加えたＬ寒天上にプレーティングし、そして３７℃で一晩中インキュベートした。クローン化インサート含有クローンを、上記培地上において、胎盤プラスミド含有細胞によって生じた青色と比較される白色コロニーを生じることを基準として選択した。（ｅ）ｃＤＮＡクローンのＤＮＡ配列分析色選択によって識別された潜在的ＦｄおよびＬ鎖ｃＤＮＡクローンを、寒天プレートから採取し、そして大規模なプラスミドＤＮＡ製造に用いた。各クローンを用いて、５００ｍｌ三角フラスコ中のアンピシリン１００μｇ／ｍｌを加えたＬブイヨン２００ｍｌに接種した。培養物を振とうしながら３７℃で一晩中インキュベートした。増殖後、各培養物からの細胞を、Sorvall RC5C遠心機およびＧＳ３ローター中、４℃において５０００ｘｇで１０分間の遠心分離によってペレット化した。各培養物からの細胞ペレットを、ＴＥ緩衝液２０ｍｌ中に再懸濁させ、そしてSorvall RC5C遠心機およびＳＳ-34ローター中のオークリッジ管中、４℃において２０００ｘｇで１０分間再度遠心分離した。それぞれの洗浄されたペレットを、３ｍｌの氷冷２５％スクロース、５０ｍＭトリス、ｐＨ８．０中に再懸濁させ、そして氷上で放置した。新鮮なリゾチーム溶液（１０ｍｇ／ｍｌで１．０ｍｌ）を加え、試験管を回転させることによってその内容物を混合し、そして氷上でのインキュベーションを５分間続けた。ナトリウムエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）溶液（０．５ｍＭ，ｐＨ８．５で１．０ｍｌ）を加え、そしてその内容物を緩やかに混合した。最後に、冷トリトンＸ溶液（０．１％トリトンＸ−１００、６２．５ｍＭＥＤＴＡ、５０ｍＭトリス、ｐＨ８．０）５．０ｍｌを加え、内容物を緩やかに混合し、そして氷上でのインキュベーションを１０分間続けた。次に、細胞破片を、Sorvall RC5C遠心機およびＳＳ-34ローター中、４℃において３９，０００ｘｇで３０分間の遠心分離によってペレット化した。プラスミドＤＮＡを含有する上澄みを、塩化セシウム（Bohringer Mannheim ）１６ｇおよび臭化エチジウム溶液（１０ｍｇ／ｍｌ）１５０μｌに対して加え、そしてその容量をＴＥ緩衝液の添加によって１８．５ｍｌまで増加させた。この溶液を、１８．５ｍｌクリンプトップ付きポリプロピレン遠心管（Sorvall In struments）に移した。管を密封し、そしてSorvall TV865B（チタン、垂直）ローターおよびOTD65B遠心機中、１８℃において１８０，０００ｘｇで１６時間遠心分離した。遠心分離後、プラスミドＤＮＡを、形成されたＣｓＣｌ／ＥｔＢＲ密度勾配中で独特の橙色バンドとして可視化した。プラスミドＤＮＡをその勾配から、管壁を突き刺す皮下注射器を用いて取出した。勾配から得られた試料を、ＴＥ緩衝液で３〜４倍に希釈し、そしてＤＮＡを、等容量のイソプロピルアルコールの添加および氷上で１０分間のインキュベーションによって沈殿させた。沈殿したＤＮＡを、Sorvall RC5C遠心機およびＳＳ-34ローター中、４℃において１７，０００ｘｇでの遠心分離によってペレット化し、そして上澄みを捨てた。得られたペレットを、７０％エタノール（ｖ／ｖ）中で洗浄し、そして５分間再度遠心分離した。次に、ペレットを真空下で乾燥させ、ＴＥ緩衝液１．８ｍｌおよび３Ｍ酢酸ナトリウム溶液２００μｌ中で再懸濁させ、そして等容量のフェノールで抽出して、１７，０００ｘｇで２分間の遠心分離を用いて相を分離した。水性相を、等容量のクロロホルムに対して再抽出した後、−２０℃で等容量のエタノールの添加および氷上で１０分間インキュベートすることによってＤＮＡを沈殿させた。精製されたＤＮＡを上と同様にペレット化し、７０％エタノール５ｍｌ中で洗浄し、そしてそのペレットを真空乾燥させた。乾燥したペレットを、２回蒸留水５００μｌ中に再懸濁させ、そして、希釈された試料をＵＶ分光光度計で３００〜２２０ｎｍで走査して、５０μｇ／ｍｌ／ＯＤ２６０の吸光係数を用いることによってＤＮＡ濃度を評価した。多数の商標付きキット、例えば、Qiagen（Hyba id Ltd）もまた、プラスミドＤＮＡ精製に利用可能である。次に、この精製されたプラスミドＤＮＡを、ＤＮＡ配列分析に用いた。二本鎖ＤＮＡは、Sanger（Proc.Nat.Acad.Sci.USA 74,1977,5463頁）のジデオキシ鎖終結法によって、United States Biochemical Companyによって供給され且つ与えられたプロトコールにしたがって用いられるシークエナーゼキットなどの商標付き配列決定キットを用いてＤＮＡ配列分析に用いることができる。ＦｄおよびＬ鎖ｃＤＮＡクローンプラスミドＤＮＡのアリコート（２〜４μｇ）を、ＤＮＡ配列分析に用いた。各アリコートを、最初に、０．２ＭＮａＯＨ、０．２ｍＭＥＤＴＡと一緒に、最終容量１００μｌ中において室温で１０分間のインキュベーションによって変性させた。次に、変性したＤＮＡを、３Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ５．０）１０μｌおよびエタノール２７５μｌの添加並びに氷上で１０分間のインキュベーションによって沈殿させた。沈殿したＤＮＡは、プラスミドＤＮＡについて上で記載のように回収された。次に、変性したＤＮＡを、それぞれ０．５ピコモルの適当なプライマーと一緒に、１０％ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）含有シークエナーゼ反応緩衝液（４０ｍＭトリス、ｐＨ７．５、２５ｍＭＭｇＣｌ₂、５０ｍＭＮａＣｌ）１０μｌ中において６５℃で２分間のインキュベーションに続いて、３０℃未満まで徐々に冷却することによって配列決定のためにプライムさせた。次に、これらプライムされた鋳型を、プロトコールによる配列決定に用いたが、但し、１０％ＤＭＳＯを標識および終結混合物に加えた。配列決定反応は、６％ポリアクリルアミド：８Ｍ尿素変性ゲル（Sangerおよび Coulson，1978,FEBS lett.87,107頁）上の高分離電気泳動後に、オートラジオグラフィーによって分析された。クローン化ｃＤＮＡの完全なＦｄおよびＬ鎖配列を下記で与える（タンパク質分解型Ｆｄ鎖に対する配列番号：２０およびＬ鎖に対する配列番号：２２）。タンパク質分解型Ｆｄ含有プラスミドをｐＡＦ１、そしてＬ鎖をｐＡＦ３と称する。ＢａｍＨＩ部位の除去のためのそれぞれのフラグメント中でのサイレント突然変異の存在もまた確認された。ＤＮＡ配列は、公表された定常領域ＤＮＡ配列データと比較した場合に、抗体がＩｇＧ１κイソ型であることを示す（Kabat,E.A. 、Wu,T.T.、Bilofsky,H.、Reid-Milner,M.、Perry,H.，1987，Sequences of Pro teins of Immunological Interest，第４版，Public Health Service N.I.H．ワシントンＤＣ中）。（ｆ）Ｆｄ−ＨＣＰＢ融合ＤＮＡ配列の製造配列番号：２０のＮｃｏＩ部位（４９７位）からのＦｄ配列のＣ末端部分をコードしている遺伝子を、ＨＣＰＢ配列に対してＰＣＲによって結合した。この処理において、８アミノ酸リンカー配列のＤＮＡ（VPEVSSVF；配列番号：６７）を導入した。プラスミドｐＡＦ１に、参考例９で記載のように、配列番号：９および１０のオリゴを用いてＰＣＲ（熱開始法）を行って３３８ｂｐ生成物を与えた。同様に、ｐＩＣＩ1968に、配列番号：１１および１のオリゴを用いてＰＣＲを行って９９８ｂｐ生成物を与えた。両方の生成物を、アガロースゲル電気泳動および参考例９で記載のGenecleanによって単離し、そして９４℃で１分間および６３℃で４分間を１０サイクルに続いて９４℃で２分間の次の熱開始ＰＣＲで用いた（全容量５０μｌで各０．２ｎｇ）。隣接したオリゴ（配列番号：９および１；各１００ピコモル）を、Amplitaq（２．５単位）含有緩衝液５０μｌ中で加えた。９４℃まで３分間加熱した後、その配合物に、９４℃で１．５分間、５５ ℃で２分間および７２℃で２分間を２５サイクルに続いて７２℃で１０分間を施した。生成物は１３３６ｂｐのバンドであり、前記のように単離された後、ＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄIIIで切断され、そしてＤＨ５α中でpBluescript中にクローン化されて（クローンは、配列番号：３および４のオリゴを用いるＰＣＲによってスクリーニングされた）ｐＭＦ３５を与えた。完全なＦｄ−ＨＣＰＢ融合配列を製造するために、プラスミドｐＡＦ１およびｐＭＦ３５を、５０ｍＭ酢酸カリウム、２０ｍＭトリス−酢酸（ｐＨ７．９）、１０ｍＭＭｇＣｌ₂、１ｍＭＤＴＴ、ＥｃｏＲＩ（４０単位）およびＮｃｏＩ（２０単位）を含有する緩衝液（１００μｌ）中においてＮｃｏＩおよびＥｃｏＲＩで２時間切断した（それぞれ１０μｇ）。ｐＡＦ１からのベクターフラグメント（３．４ｋｂ）を、参考例９で記載のように単離し且つ子ウシ腸アルカリ性ホスファターゼで処理し、そしてｐＭＦ３５からの精製された１．２ｋｂフラグメントに対して連結した。得られたベクターを、ＤＨ５α（１，９２２ｂｐインサートについて、配列番号：３および４のオリゴを用いるＰＣＲによってスクリーニングされた）中でクローン化し、そしてｐＭＦ３９と称した。ｐＭＦ３９からのＥｃｏＲＩ−ＨｉｎｄII Iフラグメントを、ＤＨ５α（約２，２００ｂｐインサートについて、配列番号：５および６のオリゴを用いるＰＣＲによってスクリーニングされた）中でｐＥＥ６［これは、ｈＣＭＶプロモーターの上流のＨｉｎｄIII部位がＢｇｌII部位に変換されたｐＥＥ６．ｈＣＭＶの誘導体である。StephensおよびCockett（198 9）Nucleic Acids Research 17,7110］中にクローン化してｐＭＦ４３を与えた。プラスミドｐＡＦ３（上のｅで記載された）およびｐＥＥ１２［このベクターは、Bebbingtonら（1992）Bio/Technology 10,169-175で記載されたｐＳＶ２．ＧＳと同様であり、部位特異的突然変異誘発によって除去されてマルチリンカー部分に独特の部位を与えるｐＳＶ２．ＧＳ中に本来存在している多数の制限部位を有する］。次に、それぞれの消化物からの適当なベクターおよびインサートフラグメントを、Seaplaque GTGアガロースから単離し且つ互い連結させ、そして初めの方でも記載されたようにコンピテントＤＨ５α細胞を形質転換するのに用いた。形質転換された細胞を、アンピシリン１００μｇ／ｍｌを加えたＬ寒天上にプレーティングした。形質転換からのコロニーのスクリーニングは、ＰＣＲ法によった。コロニーを蒸留水２００μｌ中に移し、そしてボルテックスによって混合した。次に、懸濁した細胞を１００℃で１分間加熱し、そして１１，６００ｘｇで２分間遠心分離した後、その上澄みをＰＣＲ反応で用いた。それぞれのＰＣＲ反応において、ＣＭＶプロモーター中で開始するオリゴ（配列番号：５）を、適宜に、軽鎖の３′部分に対して相補的なオリゴ（配列番号：１６）と一緒に用いた。ＣＭＶプロモーターから下流方向を発現する場合に挿入された抗体フラグメント遺伝子を有するクローンだけが、約２．０ｋｂの特異的ＰＣＲ生成物を生じるであろう。得られたプラスミドをｐＡＦ６と称した。同時発現ベクターを製造するために、ｐＭＦ４３（１０μｇ）を、１０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．９）、１５０ｍＭＮａＣｌ、１０ｍＭＭｇＣｌ₂、１ｍＭＤＴＴおよびＢＳＡ（１００μｇ／ｍｌ）を含有する緩衝液（１００μｌ）中においてＢｇｌ II（２０単位）およびＳａｌＩ（４０単位）で切断し、そしてアガロースゲル電気泳動によって４３４８ｂｐフラグメントを単離し且つ前に記載のGenecleanを用いて精製した。同様に、ｐＡＦ６を、ＢａｍＨＩ（４０単位）およびＳａｌＩ（４０単位）で切断し、そして７．８ｋｂベクターフラグメントを単離し、ｐＭＦ４３からのＢｇｌII−ＳａｌＩフラグメントに対して連結し、そしてＤＨ５α 中にクローン化した。コロニーは、２組のオリゴ（配列番号：１４および１２並びに配列番号：１３および６）を用いるＰＣＲによってスクリーニングされた。３６０ｂｐおよび１．３ｋｐのＰＣＲ生成物を与えたクローンをそれぞれ、ＤＮＡ配列決定によって特性決定した。正しい配列を有するクローンをｐＭＦ５３と称し、ＤＨ５α中の軽鎖／Ｆｄ−ＨＣＰＢ同時発現ベクターであった。（ｇ）Ａ５Ｂ７Ｆ（ａｂ′）₂−ＨＣＰＢのＣＯＳ細胞での発現プレプロ配列（ｐＭＦ６７）をコードしているプラスミドを用いるＣＯＳ−７細胞の同時トランスフェクションについて参考例９で記載された手順を、ｐＭＦ４８の代わりにｐＭＦ５３を用いて繰返した。ＣＯＳ細胞上澄みを、参考例３および９で記載のように、ＨＣＰＢ活性について調べた。LIPOFECTIN試薬で処理されたがプラスミドＤＮＡ不含のＣＯＳ細胞上澄みは、基質の１．２％を加水分解したが、軽鎖／Ｆｄ−ＨＣＰＢおよびプレプロ配列を発現したプラスミドの配合物でトランスフェクションされたＣＯＳ細胞上澄みは、Ｈｉｐｐ−Ａｒｇ基質の３４％を加水分解した。ｐＭＦ５３プラスミドのみでトランスフェクションされたＣＯＳ細胞は、LIPOFECTIN試薬単独で処理されたＣＯＳ細胞で見られる水準でＨｉｐｐ−Ａｒｇを加水分解した。ウェスタン分析（下記のｈを参照されたい）により、約８０ｋＤａおよび１６０ｋＤａのバンドが見られ、それぞれ、Ｆａｂ ′−ＨＣＰＢおよびＦ（ａｂ′）₂−（ＨＣＰＢ）₂に該当した。ＣＥＡＥＬＩＳＡ検定（下記のｉおよびｊを参照されたい）では、細胞上澄み（上を参照されたい）を用いて、ｊで与えられたプロトコールにしたがってＣＥＡ結合物質の存在を検出した。（ｈ）ウェスタンブロット分析ウェスタンブロット分析は、次に記載のように行われた。それぞれの上澄み試料のアリコート（２０μｌ）を、還元剤含有および不含の等容量の試料緩衝液（６２．５ｍＭトリス、ｐＨ６．８、１％ＳＤＳ、１０％スクロースおよび０．０５％ブロモフェノールブルー）と混合した。試料を６５℃ で１０分間インキュベートした後、Multiphor II装置（LKB Produkter AB）において製造者の指示にしたがって、８〜１８％アクリルアミド勾配ゲル（Pharmaci a Biotechnology ProdudtsからのExcelゲルシステム）上で電気泳動を行った。電気泳動後、分離されたタンパク質を、Novablot装置（LKB Produkter AB）を用いて、製造者によって与えられたプロトコールにしたがって、Hybond C-Super膜（Amersham International）に移した。ブロッテイング後、その膜を自然乾燥させた。抗体フラグメントの存在は、抗ネズミＦ（ａｂ′）₂抗体−ペルオキシダーゼ結合体（ICN Biomedicals，製品番号67-430-1）の使用によって検出された。ネズミＡ５Ｂ７抗体フラグメントの存在は、ＥＣＬ検出システム（Amersham Inter national）を用いて、与えられたプロトコルにしたがって可視化された。（ｉ）ＥＬＩＳＡ分析ＥＬＩＳＡ検定の標準法は、“Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology”，Burdon,R.H．およびvan Kippenberg,P.H.監修，15巻，“ Practice and Theory of Enzyme Immunoassays”，Tijssen,P.，1985，Elsevier Science Publishers B.V．で入手可能である。もう一つの情報源は、Cold Spri ng Harbor Laboratoryによって発行された“Antibodies-A Laboratory Manual” ，Harlow,E．およびLane,D.P.，1988である。（ｊ）ＡＮＴＩ−ＣＥＡＥＬＩＳＡ１．コーティング緩衝液（２回蒸留水１００ｍｌ中に炭酸−重炭酸緩衝液， Sigma C-3041を１カプセル）を調製する。２．ＣＥＡ原液（１ｍｇ／ｍｌ，Dako）５μｌを、必要な９６ウェルプレートそれぞれのコーティング緩衝液１０ｍｌに対して加える。３．希釈されたＣＥＡ１００μｌを、Nunc“Maxisorp”微量滴定プレートの各ウェルに対して加える。５０ｎｇ／ウェル／１００μｌ。４．プレートを４℃で一晩中（または室温で２時間）インキュベートする。５．プレートを、リン酸緩衝溶液＋０．０１％アジ化ナトリウム（ＰＢＳＡ）＋０．０５％トゥイーン２０で各５分間４回洗浄する。６．プレートを（衝撃（banging）乾燥後）、０．０５％トゥイーン２０含有ＰＢＳＡ中１％ＢＳＡ（Sigma A-7888）２００μｌ／ウェルで遮断する。室温で２時間インキュベートする。７．プレートを、０．０５％トゥイーン２０含有ＰＢＳＡで各５分間４回洗浄する。８．試料（培養物上澄み）および標準液（タンパク質分解Ａ５Ｂ７Ｆ（ａｂ′）₂の２倍希釈液）を適宜に充填する。試料を増殖培地（またはＰＢＳ）中で希釈する。ＰＢＳＡ＋１％ＢＳＡおよびブランクとしての希釈剤を包含させる。９．周囲温度で３時間インキュベートする。１０．プレートを、ＰＢＳＡ＋０．５％トゥイーン２０で各５分間６回洗浄する。１１．二次抗体溶液（抗マウスＩｇＧＦ（ａｂ′）₂、ヤギから、ペルオキシダーゼ結合、ICN 67-430-1、４０ｍｌのＰＢＳＡ＋１％ＢＳＡ＋０．５％トゥイーン２０中２０μｌで）を調製し、そして１００μｌ／ウェルを加える。１２．室温で１時間インキュベートする。１３．プレートを、ＰＢＳＡ＋０．５％トゥイーン２０で各５分間６回洗浄する。１４．リン酸−クエン酸過ホウ酸緩衝液（Sigma P-4922）１カプセルを２回蒸留水１００ｍｌ中に溶解させることによって展開溶液を調製する。緩衝液１００ｍｌにつきｏ−フェニレンジアミン二塩酸塩（ＯＰＤ，Sigma P-8287）３０ｍｇを加える。１５０μｌ／ウェルを加える。１５．暗所中において室温で１５分間インキュベートする。１６．２Ｍ硫酸５０μｌ／ウェルを加えることによって反応を停止させる。１７．プレートリーダーでＯＤ４９０ｎｍを読み取る。実施例１Ｄ２５３ＫＨＣＰＢ−（Ｈｉｓ）₆−ｃ−Ｍｙｃの大腸菌からのクローニングおよび発現大腸菌でＤ２５３ＫＨＣＰＢをクローニングし且つ発現する方法は、参考例７で記載された方法と極めて同様であった。再度、ｐＩＣＩ266をクローニングベクターとして用い、そしてプロＨＣＰＢ遺伝子のＰＣＲのための出発物質は、プラスミドｐＩＣＩ1698であった（参考例６で記載の通り）。しかしながら、この場合、部位特異的突然変異誘発を遺伝子のＰＣＲ増幅中に用いて、成熟遺伝子中のアミノ酸２５３位のコドンをアスパラギン酸からシリン（ＧＡＣ〜ＡＡＡ）に変更した、すなわち、Ｄ２５３Ｋ変更。２種類のＰＣＲ混合物を、参考例７で記載されたのと同様に製造した。最初の反応において、プライマーは、FSPTS1（配列番号：４０）および１３９８（配列番号：５７）であった。第二の反応において、プライマーは、6HIS9E10R1BS1（配列番号：４１）および１３９７（配列番号：５８）であった。両方の反応において、出発ＤＮＡはｐＩＣＩ1698であった。プライマー１３９８および１３９７（配列番号：５７および５８）は、アミノ酸コドン２５３周辺をアニーリングし、ＧＡＣ〜ＡＡＡ変更をＤＮＡ配列中に導入し、そして二つのＰＣＲ生成物の末端に相補的配列を生じるように設計される。他の二つのプライマーFSPTS1および6HIS9E10R1BS1（配列番号：４０および４１）は、参考例７で記載されている。２種類のＰＣＲ反応のアリコートを、正しい寸法（約７５０および２５０塩基対）のＤＮＡおよびアガロースゲル電気泳動による濃度評価について分析し、そして正しい寸法のバンドが優先的に含まれることが判った。次に、もう一つのＰＣＲを、最初の二つのＰＣＲ生成物をそれぞれ約４ｎｇ用いて、２００μＭの最終濃度までのｄＮＴＰ、Ｔａｑポリメラーゼ反応緩衝液、２単位のＴａｑポリメラーゼの存在下において最終容量８０ μｌ中で行った。その混合物を、９４℃で１０分間加熱した後、Ｔａｑ酵素を加え、そしてＰＣＲインキュベーションは、９４℃１分間および６３℃４分間のサイクルを１０回用いて行われた。これらのサイクルの完了した時点で、１２０ピコモルのそれぞれの末端プライマーFSPTS1および6HIS9E10R1BS1（配列番号：４０および４１）、追加のｄＮＴＰ（過剰の約１００μＭ）、Ｔａｑポリメラーゼ反応緩衝液および４単位のＴａｑポリメラーゼの添加によって、その反応配合物を１２０μｌとした。その混合物を９４℃で１０分間加熱した後、Ｔａｑ酵素を加え、そしてＰＣＲインキュベーションは、９４℃１．５分間、５０℃２分間および７２℃２分間のサイクルを３０回に続いて、反応の最後に７２℃９．９分間の１回のインキュベーションを用いて行われた。ＰＣＲ生成物のアリコートを、正しい寸法（約１０００塩基対）のＤＮＡについてアガロースゲル電気泳動によって分析し、そして正しい寸法のバンドが優先的に含まれることが判った。反応配合物からの残りの生成物を、参考例７と同様に精製した。単離されたＤＮＡを、酵素ＦｓｐＩおよびＥｃｏＲＩで制限消化し、そして正しい寸法（約１０００塩基対）のバンドを参考例７と同様に精製した。参考例７と同様に製造されたｐＩＣＩ266二本鎖ＤＮＡを、完全な消化を確実にするように極めて慎重に、ＫｐｎＩ酵素で制限消化し、そしてＴ４ＤＮＡポリメラーゼで平滑末端処理した。精製ＤＮＡを次いで制限酵素ＥｃｏＲＩで消化した。正しい寸法（約５６００塩基対）のＤＮＡは、参考例７と同様に精製された。制限消化されたおよび精製されたＤＮＡ試料両方のアリコートを、既知の標準と比較されるアガロースゲル電気泳動を用いて、純度および濃度評価について検査した。これらの評価から、連結配合物は、参考例７と同様に、ＨＣＰＢ遺伝子をｐＩＣＩ266ベクター中にクローン化するように製造された。連結反応後、参考例７と同様に、そのＤＮＡ混合物を用いて大腸菌株ＤＨ５α を形質転換し、コロニーを採取し且つハイブリダイゼーションによって調べた。６種類の正のハイブリダイゼーション単離物を、ＰＣＲによって、正しい寸法のインサートについてプライマーFSPITS1および6HIS9E10R1BS1（配列番号：４０および４１）を用いて、そして内部プライマーFSPTS1（配列番号：４０）および６７９（配列番号：３３）を用いる開始について参考例７と同様に検査した。ＰＣＲ生成物を、正しい寸法（プライマーFSPTS1から6HIS9E10R1BS1までの約１０００塩基対、およびプライマーFSPTS1ら６７９までの約４３０塩基対）のＤＮＡについてアガロースゲル電気泳動によって分析した。クローン全部が、正しい寸法のＰＣＲＤＮＡ生成物を与えた。次に、クローンの６個全部をプラスミドＤＮＡ製造用に取り、そして二つを、参考例７と同様に、ＰＣＲ生成物の部分にわたって配列決定した。クローンは、１２８１、６７７、１５０４、６７９、１８０２、１５９０、１２８０および１７３１（配列番号：３７、３４、４２、３３、４５、４３、３５および４４）として知られる８種類の別々のオリゴヌクレオチドプライマーを用いて配列決定された。配列決定結果から、必要なＤ２５３Ｋ−ＨＣＰＢ遺伝子配列を含むプラスミドを含有するクローンを選択したが、それはｐＩＣＩ1713として知られている。ＰｅｌＢ配列の始めからＥｃｏＲＩ制限部位までの、アミノ酸翻訳を示したｐＩＣＩ1713中のクローン化Ｄ２５３Ｋ−ＨＣＰＢ遺伝子の確認された配列は、配列番号：５９として示され、ＤＮＡ番号はＰｅｌＢの最初のコドンにおいて１から始まり、そしてペプチド番号は成熟ＨＣＰＢにおいて１から始まる。Ｄ２５３Ｋ−ＨＣＰＢの制御された発現を得るために、ｐＩＣＩ1713プラスミドＤＮＡを、参考例７と同様に、塩化カルシウム形質転換コンピテント大腸菌発現菌株中に形質転換した。ｐＩＣＩ1713形質転換発現菌株全部を、参考例７と同様に処理して、クローン化Ｄ２５３Ｋ−ＨＣＰＢ遺伝子の発現について調べた。この場合、Ｄ２５３Ｋ−ＨＣＰＢはＣ末端（Ｈｉｓ）₆−ｃ−ｍｙｃ標識を有するので、参考例７と同様に、Ｃ−ｍｙｃペプチド標識に特異的な９Ｅ１０単クローン性抗体抗体をウェスタン分析で用いた。ｐＩＣＩ266（ｐＩＣＩ1713）中のクローン化された標識Ｄ２５３Ｋ−ＨＣＰＢの発現は、大腸菌から、ベクター（ｐＩＣＩ266）だけのクローンと比較した場合に約３５，０００ダルトンで強いタンパク質バンドを示したクーマシー染色ゲルによって示され、そしてクローンは標識ＨＣＰＢを生じた（参考例７）。同様の寸法のバンドは、ｃ−ｍｙｃ標識のウェスタン分析検出によって強いシグナルを与えた。実施例２Ｄ２５３ＲＨＣＰＢ−（Ｈｉｓ）₆−ｃ−Ｍｙｃの大腸菌からのクローニングおよび発現大腸菌でＤ２５３ＲＨＣＰＢをクローニングし且つ発現する方法は、参考例８で記載された方法と極めて同様であった。再度、ｐＩＣＩ266をクローニングベクターとして用い、そしてプロＨＣＰＢ遺伝子のＰＣＲのための出発物質は、プラスミドｐＩＣＩ1712であった（参考例７で記載の通り）。しかしながら、この場合、部位特異的突然変異誘発を遺伝子のＰＣＲ増幅中に用いて、成熟遺伝子中のアミノ酸２５３位のコドンをアスパラギン酸からアルギニン（ＧＡＣ〜ＣＧＣ）に変更した、すなわち、Ｄ２５３Ｒ変更。２種類のＰＣＲ混合物を、参考例７および８で記載されたのと同様に製造した。最初の反応において、プライマーは、２２６４（配列番号：４８）および２０５８（配列番号：６１）であった。第二の反応において、プライマーは、6HIS9E10R1BS1（配列番号：４１）および２０５４（配列番号：６２）であった。両方の反応において、出発ＤＮＡはｐＩＣＩ1712であった。プライマー２０５８および２０５４（配列番号：６１および６２）は、アミノ酸コドン２５３周辺をアニーリングし、ＧＡＣ〜ＣＧＣ変更をＤＮＡ配列中に導入し、そして二つのＰＣＲ生成物の末端に相補的配列を生じるように設計される。他の二つのプライマー２２６４および6HIS9E10R1BS1（配列番号：４８および４１）は、参考例７および８で記載されている。２種類のＰＣＲ反応のアリコートを、正しい寸法（約７５０および２５０塩基対）のＤＮＡおよびアガロースゲル電気泳動による濃度評価について分析し、そして正しい寸法のバンドが優先的に含まれることが判った。次に、もう一つのＰＣＲを、最初の二つのＰＣＲ生成物をそれぞれ約４ｎｇ用いて、２００μＭの最終濃度までのｄＮＴＰ、Ｔａｑポリメラーゼ反応緩衝液、２単位のＴａｑポリメラーゼの存在下において最終容量８０μｌ中で行った。その混合物を９４℃で１０分間加熱した後、Ｔａｑ酵素を加え、そしてＰＣＲインキュベーションは、９４℃１分間および６３℃４分間のサイクルを１０回用いて行われた。これらのサイクルの完了した時点で、１２０ピコモルのそれぞれの末端プライマー２２６４および6HIS9E10R1BS1（配列番号：４８および４１）、追加のｄＮＴＰ（過剰の約１００μＭ）、Ｔａｑポリメラーゼ反応緩衝液および４単位のＴａｑポリメラーゼの添加によって、その反応配合物を１２０μｌとした。その混合物を９４℃で１０分間加熱した後、Ｔａｑ酵素を加え、そしてＰＣＲインキュベーションは、９４℃１．５分間、５０℃２分間および７２℃２分間のサイクルを３０回に続いて、反応の最後に７２℃９．９分間の１回のインキュベーションを用いて行われた。ＰＣＲ生成物のアリコートを、正しい寸法（約１０００塩基対）のＤＮＡについてアガロースゲル電気泳動によって分析し、そして正しい寸法のバンドが優先的に含まれることが判った。反応配合物からの残りの生成物を、参考例７と同様に精製した。単離されたＤＮＡを、酵素ＮｃｏＩおよびＥｃｏＲＩで制限消化し、そして正しい寸法（約１０００塩基対）のバンドを参考例７と同様に精製した。参考例７と同様に製造されたｐＩＣＩ266二本鎖ＤＮＡを、完全な消化を確実にするように極めて慎重に、ＮｃｏＩおよびＥｃｏＲＩ酵素で制限消化した。正しい寸法（約５６００塩基対）のＤＮＡは、参考例７と同様に精製された。制限消化されたおよび精製されたＤＮＡ試料両方のアリコートを、既知の標準と比較されるアガロースゲル電気泳動を用いて、純度および濃度評価について検査した。これらの評価から、連結配合物は、参考例７と同様に、ＨＣＰＢ遺伝子をｐＩＣＩ266ベクター中にクローン化するように製造された。連結反応後、参考例７と同様に、そのＤＮＡ混合物を用いて大腸菌株ＤＨ５α を形質転換し、コロニーを採取し且つハイブリダイゼーションによって調べた。次に、クローンの内３個をプラスミドＤＮＡ製造用に取り、そして参考例７と同様に、ＰＣＲ生成物の部分にわたって配列決定した。クローンは、１２８１、６７７、１５０４、６７９、１８０２、１５９０、１２８０、１７３１および１５９２（配列番号：３７、３４、４２、３３、４５、４３、３５、４４および５４）として知られる９種類の別々のオリゴヌクレオチドプライマーを用いて配列決定された。配列決定結果から、必要なＤ２５３Ｒ−ＨＣＰＢ遺伝子配列を含むプラスミドを含有するクローンを選択したが、それはｐＩＣＩ1746として知られている。ＰｅｌＢ配列の始めからＥｃｏＲＩ制限部位までの、アミノ酸翻訳を示したｐＩＣＩ1746中にクローン化されたクローン化Ｄ２５３Ｒ−ＨＣＰＢ遺伝子の確認された配列は、配列番号：６３として示され、ＤＮＡ番号はＰｅｌＢの最初のコドンにおいて１から始まり、そしてペプチド番号は成熟ＨＣＰＢにおいて１から始まる。Ｄ２５３Ｒ−ＨＣＰＢの制御された発現を得るために、ｐＩＣＩ1746プラスミドＤＮＡを、参考例７と同様に、形質転換コンピテント大腸菌発現菌株中に形質転換した。ｐＩＣＩ1746形質転換発現菌株全部を、参考例７と同様に処理して、クローン化Ｄ２５３Ｒ−ＨＣＰＢ遺伝子の発現について調べた。この場合、Ｄ２５３Ｒ−ＨＣＰＢはＣ末端（Ｈｉｓ）₆−ｃ−ｍｙｃ標識を有するので、参考例７と同様に、Ｃ−ｍｙｃペプチド標識に特異的な９Ｅ１０単クローン性抗体抗体をウェスタン分析で用いた。ｐＩＣＩ266（ｐＩＣＩ1746）中のクローン化された標識Ｄ２５３Ｒ−ＨＣＰＢの発現は、大腸菌から、ベクター（ｐＩＣＩ266）だけのクローンと比較した場合に約３５，０００ダルトンで強いタンパク質バンドを示したクーマシー染色ゲルによって示され、そしてクローンは標識ＨＣＰＢを生じた（参考例７）。同様の寸法のバンドは、ｃ−ｍｙｃ標識のウェスタン分析検出によって強いシグナルを与えた。精製は、下記の実施例３で示されたのと同様の方法を用いて行われる。実施例３突然変異Ｄ２５３ＫＨＣＰＢ−（Ｈｉｓ）₆−ｃ−Ｍｙｃタンパク質の大腸菌からの精製最初に、細胞ペースト中のカルボキシペプチダーゼＢ類似体Ｄ２５３Ｋの２０リットル発酵工程を記載する。大腸菌Ｋ１２菌株ＭＳＤ1924を、プラスミドｐＺｅｎ1713（ｐＩＣＩ1713；上の実施例１を参照されたい）で形質転換し、そして得られた菌株ＭＳＤ2230（ＭＳＤ1924 ｐＺｅｎ1713）をグリセロール凍結配合物中において−８０℃で貯蔵した。ＭＳＤ2230を、Ｌ−テトラサイクリン（１０μｇｍｌ^-1）培地含有寒天プレート上に画線接種して、３７℃で一晩の増殖後にシングルコロニーを分離した。ＭＳＤ2230の６個のシングルコロニーを、Ｌ−テトラサイクリン（１０μｇｍｌ^-1 ）寒天の表面から取出し、Ｌ−テトラサイクリン（１０μｇｍｌ^-1）ブイヨン１０ｍｌ中に再懸濁させ、そしてこの培養物１００μｌを、Ｌ−テトラサイクリン（１０μｇｍｌ^-1）ブイヨン７５ｍｌが入っている６個の２５０ｍｌエレンマイヤーフラスコにそれぞれ速やかに接種した。往復振とう機（３００ｒｐｍ）上において３７℃で１５〜１６時間増殖後、フラスコの内容物をプールし且つ用いて、図６で記載の増殖培地１５リットルが入っている一つの発酵槽（Ｕ30Ｄ容器， B.Braun，Melsungen，ドイツ）に接種した。発酵は、３７℃の温度および６．７のｐＨで行われ、その６．７のｐＨは、６Ｍ水酸化ナトリウムまたは６Ｍ硫酸の添加によって自動的に設定値に制御された。溶存酸素張力（ｄＯＴ）設定値は、５０％空気飽和であり、それは、２００〜１０００ｒｐｍの発酵槽撹拌機速度の自動調整によって維持された。発酵槽への空気流は、Tylanマスフロー（mass flow）調節器によって１．３容器容量／分（ｖｖｍ）に相当する２０標準リットル／分で維持された。接種して４．５時間後に、酵母エキス溶液（２２５ｇｌ^-1）を、発酵槽中に１９０〜２１０ｍｌ時^-1の速度で２８．５時間供給した。酵母エキス供給を開始してから１．５時間後に、発酵温度設定値を２５℃まで低下させた。約１時間後のこの温度が得られた時点で、０．５％の発酵槽中最終濃度を与えるように５０％アラビノースを一度に加えることによって、カルボキシペプチダーゼ類似体Ｄ２５３Ｋの発現を誘導した。誘導から１〜２時間後に、グリセロール（７１４ｇｌ^-1 ）および硫酸アンモニウム（１４３ｇｌ^-1）の混合物を、発酵槽中に４５〜５５ｍｌ時^-1の速度で採集するまで供給した。発酵は、これらの条件下において、発酵槽接種後約７５時間まで続け、その時点で、発酵槽内容物のアリコートを１リットル遠心ボトルに移すことによって培養物を採集した。消耗した培地は、So rvall RC-3B遠心機での遠心分離（７，０００ｘｇ，４℃，３０分間）によって細菌細胞から分離された。この工程は、典型的に、約２０ｇｌ^-1の最終乾量を生じる。細胞ペーストを次のように精製した。組換え酵素Ｄ２５３ＫＨＣＰＢを含有する組換え大腸菌細胞ペーストを、−７０℃での貯蔵から取り且つ融解させた。細胞ペーストの重量を測定し、３０９グラムであることが判った。そのペーストを、緩衝液Ａ［２００ｍＭトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン塩酸塩（TR IS-ＨＣｌ）、２０％スクロース、ｐＨ８．０］の添加で再懸濁させて、３２０ｍｌの再懸濁容量を与えた。その細胞懸濁液を、時々緩やかに混合しながら室温で２０分間インキュベートした後、等容量の蒸留水を室温で加え、そして完全に混合した。細胞懸濁液を、再度、時々緩やかに混合しながら室温で２０分間インキュベートした。得られた粗浸透圧ショック産物を、４℃において９８０００ｘｇで９０分間の遠心分離によって清澄化した後、その上澄みを、ペレット化した不溶性部分から傾瀉除去して、２４０ｍｌの清澄化容量を与えた。デオキシリボヌクレアーゼ１（２４ｍｇ）を蒸留水（５ｍｌ）中に溶解させ、そしてその上澄みに対して加えた。その混合物を、絶えず振とうしながら室温で３０分間インキュベートして、 PharmaciaからのＣＮＢｒ活性セファロース４Ｂおよびジャガイモ塊茎からのカルボキシペプチダーゼインヒビター（ｃ−0279，Sigma）を用いる指示にしたがって調製されたカルボキシペプチダーゼインヒビターＣＮＢｒ活性セファロースアフィニティーカラムに対して上澄みを充填するのに充分にその粘度を減少させた。上澄みを、１０ｍＭ TRIS−ＨＣｌ、５００ｍＭ塩化ナトリウム、ｐＨ８．０（緩衝液Ｂ）で１：１に希釈し、ｐＨ８．０に調整し、カルボキシペプチダーゼインヒビターアフィニティーカラム上に０．５ｍｌ／分で一晩中充填した。そのカラムは、４℃で緩衝液Ｂを用いて予め平衡された。上澄みを充填後、フロースルーの吸光度がベースラインに戻るまでカラムを洗浄した後、結合した物質を、溶離緩衝液（１００ｍＭ炭酸ナトリウム、５００ｍＭ塩化ナトリウム、ｐＨ１１．４）によって４℃でカラムから溶離し、１ｍｌ画分を集めた。溶離した画分は、組換えカルボキシペプチダーゼ含有画分を決定するために試料を採取した後に、−２０℃で凍結された。これは、ウェスタンブロット分析により、抗ｃ−ｍｙｃ標識抗体（９Ｅ１０）を用い、続いて４−クロロナフトールおよび過酸化水素に対する暴露で着色反応を与えた抗マウス−ホースラディッシュペルオキシダーゼ結合体（ａ−9044，Sigma）を用いて行われた。画分１１〜４４は、組換えカルボキシペプチダーゼＢを含有することが確認された。これらをプールし、そのｐＨをｐＨ７．５に調整し、そしてMillipore Centrifugal Ultrafree-20（１０，０００分画分子量）を用いて濃縮した後、急速凍結させ且つ−２０℃で貯蔵した。ここで詳述された精製は、Ｄ２５３Ｋ突然変異カルボキシペプチダーゼ４．７ｍｇを０．９５ｍｌの容量中において８０％の純度で与えた。実施例４アスパラギン酸フェノールマスタードプロドラッグの合成（化合物５ａ、図７）（２Ｓ），２−（３−｛４−［ビス−（２−クロロエチル）−アミノ）−フェノキシカルボニル｝−プロピオニルアミノ）−コハク酸参考例４で示されたのと同様の方法を用いた。（２Ｓ），２−（３−｛４−［ビス−（２−クロロエチル）−アミノ）−フェノキシカルボニル｝−プロピオニルアミノ）−コハク酸ジベンジルエステル（４ａ）を、８０ｐｓｉで２時間水素化して、所望の最終生成物５ａ（収率：８６％）を与えた。５ａ：¹ＮＭＲ（ＣＤ₃ＯＤ）：２．６５−２．７５（ｔ，２Ｈ）；２．８−２．９（ｍ，４Ｈ）；３．７−３．７５（ｍ，４Ｈ）；３．８−３．８５（ｍ，４Ｈ）；４．７５（ｔ，１Ｈ）；６．７−６．８（ｍ，２Ｈ）；７．０−７．１（ｍ，２Ｈ）。ＭＳ（ＥＳＩ）：４７１−４７３（ＭＮａ）⁺ 分析（Ｃ₁₈Ｈ₂₂Ｎ₂Ｏ₇Ｃｌ₂１．４Ｈ₂Ｏ）計算値％Ｃ：４５．５６Ｈ：５．２７Ｎ：５．９０実測値％Ｃ：４５．７９Ｈ：５．６０Ｎ：５．９１出発物質化合物４ａは、次のように製造された。（２Ｓ），２−アミノコハク酸ジベンジルエステル（化合物２ａ）を反応させて、ジエチルエーテル／ヘキサンでの再結晶後に、（２Ｓ），２−（３−カルボキシプロピオニルアミノ）−コハク酸ジベンジルエステル（化合物３ａ）を与えた（収率：８０％）。３ａ：¹ＮＭＲ（ＣＤＣｌ₃）：２．４２−２．６（ｍ，２Ｈ）；２．６−２．７５（ｍ，２Ｈ）；２．８５（ｄｄ，２Ｈ）；３．１（ｄｄ，１Ｈ）；４．９（ｄｄ，１Ｈ）；５．０５（ｄｄ，２Ｈ）；５．１５（ｓ，２Ｈ）；６．７（ｄ，１Ｈ）；７．２５−７．５（ｍ，１０Ｈ）。ＭＳ（ＥＳＩ）：４３６［ＭＮａ］⁺ 分析（Ｃ₂₂Ｈ₂₃ＮＯ₇０．４Ｈ₂Ｏ）：計算値％Ｃ：６２．８２Ｈ：５．７０Ｎ：３．３３実測値％Ｃ：６３．２Ｈ：５．７５Ｎ：２．９３ａを反応させて所望の出発物質４ａ（収率：７８％）を与えた（撹拌を室温で３時間維持し、そして精製は、ジエチルエーテル／ヘキサン（７０／３０Ｖ／Ｖ、溶離剤として）を用いるフラッシュクロマトグラフィーによって行われた）。４ａ：¹ＮＭＲ（ＣＤＣｌ₃）：２．５５−２．６５（ｍ，２Ｈ）；２．８−２．９（ｍ，２Ｈ）；２．９（ｄｄ，１Ｈ）；３．１（ｄｄ，１Ｈ）；３．６（ｄｄ，４Ｈ）；３．７（ｄｄ，４Ｈ）；４．９（ｄｄ，１Ｈ）；５．０５（ｄｄ，２Ｈ）；５．１５（ｓ，２Ｈ）；６．５８（ｄ，１Ｈ）；６．６５（ｄ，２Ｈ）；６．９５（ｄ，２Ｈ）；７．２５−７．４（ｍ，１０Ｈ）。ＭＳ（ＥＳＩ）：６５１−６５３（ＭＮａ）⁺ 実施例５グルタミン酸フェノールマスタードプロドラッグの合成（５ｂ、図７）（２Ｓ），２−（３−｛４−［ビス−（２−クロロエチル）−アミノ）−フェノキシカルボニル｝−プロピオニルアミノ）−ペンタン二酸参考例４で示されたのと同様の方法を用いた。（２Ｓ），２−（３−｛４−［ビス−（２−クロロエチル）−アミノ）−フェノキシカルボニル｝−プロピオニルアミノ）−ペンタン二酸ジベンジルエステル（４ｂ）を、６０ｐｓｉで３時間水素化して、所望の最終生成物５ｂ（収率：９３％）を与えた。５ｂ：¹ＮＭＲ（ＣＤ₃ＯＤ）：１．９−２．０（ｍ，１Ｈ）；２．１−２．２（ｍ，１Ｈ）；２．３５−２．４５（ｍ，２Ｈ）；２．５５−２．７（ｍ，２Ｈ）；２．８−２．９（ｍ，２Ｈ）；３．６５−３．７（ｍ，４Ｈ）；３．７２−３．８（ｍ，４Ｈ）；４．４−４．５（ｍ，１Ｈ）；６．７５（ｄ，２Ｈ）；６．９５（ｄ，２Ｈ）。ＭＳ（ＥＳＩ）：４８５−４８７（ＭＮａ）⁺ 出発物質化合物４ｂは、次のように製造された。（２Ｓ），２−アミノペンタン二酸ジベンジルエステル（２ｂ）を反応させて、（２Ｓ），２−（３−カルボキシプロピオニルアミノ）−ペンタン二酸ジベンジルエステル（３ｂ）を与えた（収率：定量的）。３ｂ：¹ＮＭＲ（ＣＤＣｌ₃）：２．０−２．１（ｍ，１Ｈ）；２．２−２．３（ｍ，１Ｈ）；２．３−２．５（ｍ，４Ｈ）；２．６−２．７（ｍ，２Ｈ）；４．６５（ｄｄ，１Ｈ）；５．０５（ｓ，２Ｈ）；５．１５（ｓ，２Ｈ）；６．５（ｄ，１Ｈ）；７．３−７．４（ｍ，１０Ｈ）。ＭＳ（ＥＳＩ）：４５０［ＭＮａ］⁺ ３ｂを反応させて所望の出発物質４ｂを与えた（収率：８２％）。４ｂ：¹ＮＭＲ（ＣＤＣｌ₃）：１．９５−２．０５（ｍ，１Ｈ）；２．２−２．３（ｍ，１Ｈ）；２．３−２．５（ｍ，２Ｈ）；２．６（ｄｔ，２Ｈ）；２．８ −３．０（ｍ，２Ｈ）；３．６（ｄｄ，４Ｈ）；３．７（ｄｄ，４Ｈ）；４．７（ｄｄ，１Ｈ）；５．１（ｓ，２Ｈ）；５．２（ｓ，２Ｈ）；６．３（ｄ，１Ｈ）；６．６（ｄ，２Ｈ）；６．９５（ｄ，２Ｈ）；７．３−７．４（ｍ，１０Ｈ）。ＭＳ（ＥＳＩ）：６６５−６６７（ＭＮａ）⁺ 実施例６Ｈｉｐｐ−ＡｓｐおよびＨｉｐｐ−Ｇｌｕプロドラッグ類似体に対する突然変異ヒトＣＰＢおよび天然ヒトＣＰＢの活性の検定。参考例１２で記載のように製造されたヒトＣＰＢ（Ｄ２５３ＫおよびＤ２５３Ｒ；実施例１〜３）および天然ヒトＣＰＢの精製突然変異体を、ヒプリル−Ｌ−アスパラギン酸（Ｈｉｐｐ−Ａｓｐ，参考例２）か、ヒプリル−Ｌ−グルタミン酸（Ｈｉｐｐ−Ｇｌｕ，参考例１）かまたはヒプリル−Ｌ−アルギニン（Sigma Chemical Company，製品番号Ｈ6625）を馬尿酸に変換するそれらの能力について、ＨＰＬＣに基づく検定を用いて検定した。反応混合物（２５０μｌ）は、ヒトＣＰＢ（天然または突然変異）４μｇおよび０．５ｍＭのＨｉｐｐ−ＡｓｐまたはＨｉｐｐ−Ｇｌｕを０．０２５Ｍトリス −ＨＣｌ、ｐＨ７．５中に含んでいた。試料を３７℃で５時間インキュベートした。その反応を、８０％メタノール、２０％蒸留水、０．２％トリフルオロ酢酸の２５０μｌを加えることによって終結させ、そして生じた馬尿酸の量をＨＰＬＣによって定量した。ＨＰＬＣは、Hewlett Packard 1090 Series 11（ダイオードアレイを含む）ＨＰＬＣシステムを用いて行われた。試料（５０μｌ）を、Hichrom Hi-RPBカラム（２５ｃｍ）上に注入し、そして４０％メタノール、６０％蒸留水、０．１％トリフルオロ酢酸の移動相を用いて１ｍｌ／分の流量で分離した。生じた生成物（馬尿酸）の量は、既知量の馬尿酸（Sigma-Ｈ6375）で作成された検量線から決定された。結果は、表１で示され、そして酵素４μｇを用いて３７℃で５時間の場合の基質の生成物への変換百分率として表される。データは、ヒトＣＰＢ中の２５３位における天然酵素中で存在するアスパラギン酸残基の代わりのリシンかまたはアルギニンの導入が、酵素の基質特異性を変化させるために、その酵素がＨｉｐｐ−ＡｓｐかまたはＨｉｐｐ−Ｇｌｕを変換できることを示している。対照的に、天然酵素は、これら化合物をどちらも馬尿酸に変換できないが、Ｈｉｐｐ−Ａｒｇを馬尿酸に変換する。最良の活性は、Ｄ２５３Ｋ突然変異体およびＨｉｐｐ−Ｇｌｕ基質で見られた。実施例７Ｈｉｐｐ−ＡｓｐおよびＨｉｐｐ−Ｇｌｕを含むＨＣＰＢ突然変異体のＫｍおよびｋｃａｔの測定精製Ｄ２５３ＫＨＣＰＢ、［Ｑ５４Ｒ，Ｄ１４５Ａ，Ｄ２５３Ｋ］ＨＣＰＢ、［Ｇ２５１Ｎ，Ｄ２５３Ｋ］ＨＣＰＢおよび［Ｇ２５１Ｔ，Ｄ２５３Ｋ］ＨＣＰＢをそれぞれ、実施例３、参考例１２、実施例２７および実施例２８で記載のように製造し、Ｈｉｐｐ−Ａｓｐ（参考例２）および／またはＨｉｐｐ−Ｇｌｕ（参考例１）に対して検定して、これらの基質のＫｍおよびＫｃａｔを測定した。Ｈｉｐｐ−ＧｌｕおよびＨｉｐｐ−Ａｓｐを、０．０２５Ｍトリス−ＨＣｌ緩衝液、ｐＨ７．５中でそれぞれ０．２５〜８．０ｍＭおよび０．２５〜５．０ｍＭの範囲で希釈した。必要な場合、基質試料を１ＭＮａＯＨでｐＨ７．５に調整した。Ｄ２５３ＫＨＣＰＢ（Ｈｉｐｐ−Ａｓｐに対して４μｇ／ｍｌおよびＨｉｐｐ−Ｇｌｕに対して０．５μｇ／ｍｌ）、［Ｑ５４Ｒ，Ｄ１４５Ａ，Ｄ２５３Ｋ］ＨＣＰＢ（Ｈｉｐｐ−Ｇｌｕに対して１．５μｇ／ｍｌ）、［Ｇ２５１Ｎ，Ｄ２５３Ｋ］ＨＣＰＢ（Ｈｉｐｐ−Ｇｌｕに対して０．１４μｇ／ｍｌ）および［Ｇ２５１Ｔ，Ｄ２５３Ｋ］ＨＣＰＢ（Ｈｉｐｐ−Ｇｌｕに対して０．０２μｇ／ｍｌ）をこれらの基質（反応容量５００μｌ）に対して加えて反応を開始した。試料を３７℃で５時間インキュベートした。反応は、０．２％ＴＦＡ含有メタノール／蒸留水（８０／２０）５００μｌの添加によって終結した。生成された馬尿酸の量を、実施例６で記載のようにＨＰＬＣによって定量した。ＫｍおよびＶｍａｘ値は、ENZFITTERソフトウェアプログラム（Biosoft，Perk in Elmer）を用いて計算された。ｋｃａｔは、Ｖｍａｘから、反応混合物中の酵素濃度（ＨＣＰＢに対する３４ＫＤａの分子量を用いる）で割ることによって計算された。結果を表２ａおよび２ｂで示す。データは、ヒトＣＰＢ中の２５３位のアスパラギン酸をリシン残基で置き換えた結果として、適度な酵素速度論でＨｉｐｐ−ＡｓｐおよびＨｉｐｐ−Ｇｌｕ両方を馬尿酸に変換できる酵素が生じることを確証する。ｋｃａｔ／ｋｍは、Ｄ２５３ＫＨＣＰＢでのＨｉｐｐ−Ａｓｐ基質と比較して、Ｈｉｐｐ−Ｇｌｕで約７倍大きい。追加の突然変異の導入は、Ｈｉｐｐ−Ｇｌｕに対するＤ２５３ＫＨＣＰＢの活性を１００倍まで増加させる。実施例８グルタミン酸プロドラッグに対する突然変異ＨＣＰＢおよび天然ＨＣＰＢの活性の検定。実施例３および参考例１２でそれぞれ記載のように製造された精製Ｄ２５３ＫＨＣＰＢおよび天然ヒトＣＰＢを、グルタミン酸プロドラッグ（実施例５）からグルタミン酸を酵素的に開裂するそれらの能力について検定した。開裂は、非酵素的に自己破壊して活性フェノールマスタード薬を放出する中間体（参考例５）を遊離する。グルタミン酸プロドラッグの中間体への変換率は、ＨＰＬＣの基づく検定を用いて測定された。プロドラッグを、０．０２５Ｍトリス−ＨＣＬ緩衝液、ｐＨ７．５中で０．２５〜５．０ｍＭの範囲で希釈した。必要な場合、プロドラッグ試料を１ＭＮａＯＨでｐＨ７．５に調整した。Ｄ２５３Ｋ突然変異ＨＣＰＢまたは天然ＨＣＰＢを、両方とも０．２５ｍｇ／ｍｌの最終濃度で、これらの基質（予め３７℃まで２分間暖められた反応容量２５０μｌ）に対して加えて反応を開始した。試料を３７℃で４分間インキュベートした。反応は、２５０μｌの９８．８％ＭｅＣＮ、０．２％ＴＦＡの添加によって終結し、そしてその試料を氷上においた。次に、生成された中間体の量をＨＰＬＣによって定量した。ＨＰＬＣ分離は、０．１％ＴＦＡ含有ＭｅＣＮ／蒸留水（５５／４５Ｖ／Ｖ）の移動相を用いてプロドラッグ（保持時間４．９分）および中間体（保持時間８．４分）の分離を行ったこと以外は実施例６で記載のように行われた。生成された中間体の量は、既知量の中間体で作成された検量線から定量された。複製試料中の天然および突然変異（Ｄ２５３Ｋ）ＨＣＰＢを用いて５．０ｍＭおよび０．２５ｍＭプロドラッグで生成された中間体の量を、表３で示す。突然変異ヒト酵素（Ｄ２５３Ｋ）およびプロドラッグのＫｍ、Ｖｍａｘおよびｋｃａｔ値は、実施例７で記載のENZFITTERソフトウェアを用いて、一定範囲の基質濃度（０．２５〜５．０ｍＭ）に対して生成された中間体の量から計算された。Ｄ２５３Ｋ突然変異ＨＣＰＢの結果は、次の通りであった。Ｋｍ＝１．２５ｍＭＶｍａｘ＝１．１７Ｘ１０^-4ｍＭ秒^-1 ｋｃａｔ＝０．０１６秒^-1 データは、ヒトＣＰＢ中の２５３位における天然酵素中に存在するアスパラギン酸残基の代わりのリシン残基の導入が、酵素の基質特異性を変化させるために、その酵素が、グルタミン酸プロドラッグをその自己破壊性中間体に変換できることを示している。対照的に、天然酵素はプロドラッグをその中間体に変換できない。プロドラッグは比較的細胞障害性ではないし（実施例９）、しかもその中間体は非酵素的に破壊されて、腫瘍細胞を死滅させる遊離フェノールマスタード薬（実施例９）を放出するので、これらの結果は、ＣＰＢの活性部位残基の突然変異が、比較的細胞障害性でないプロドラッグを、腫瘍細胞を死滅させうる強力な細胞障害性薬へと変換できる突然変異ヒト酵素を生じることができるということを示している。実施例９グルタミン酸プロドラッグおよびフェノールマスタード薬のＬｏＶｏヒト結腸直腸腫瘍細胞での細胞障害性。グルタミン酸プロドラッグ（実施例５）および対応するフェノールマスタード薬（図７，化合物６）の腫瘍細胞に対する示差的細胞障害性は、次の手段によって示された。ＬｏＶｏ結腸直腸腫瘍細胞を、５Ｘ１０^-4〜５ｘ１０^-8Ｍの最終濃度範囲にわたるプロドラッグまたは薬物と一緒に、９６ウェル（細胞２，５００個／ウェル）微量滴定プレート中において３７℃で１時間インキュベートした。次に、細胞を洗浄し、そして３７℃で更に３日間インキュベートした。死滅した細胞を洗浄除去した後、ＴＣＡを加え、そしてプレートに対して付着した細胞タンパク質の量を、P.Skehanら，J.Natl.Cancer Inst.82,1107(1990)で記載のようにＳＲＢ染料の添加によって評価した。化合物の力価は、細胞増殖を５０％まで阻害するのに必要な濃度（ＩＣ₅₀）によって評価された。フェノールマスタード薬を用いるＬｏＶｏ細胞の処理で、約１μＭのＩＣ₅₀が見られた。対照的に、グルタミン酸プロドラッグは、約５０μＭのＩＣ₅₀ではるかに細胞障害性が低かった（図５）。したがって、突然変異ＣＰＢグルタミン酸プロドラッグは、腫瘍細胞に対する細胞障害性がフェノールマスタード薬よりも約５０倍少ない。実施例３で記載のように製造された突然変異ＨＣＰＢ（Ｄ２５３Ｋ）１００μ ｇを、グルタミン酸プロドラッグが入っている検定ウェルに対して加えた場合、活性薬の細胞障害性に匹敵する細胞障害性が見られ、したがって、一層強力な薬物を放出する突然変異酵素によるプロドラッグの変換が示される。各ウェルに対する１００μｇの天然ヒトＣＰＢの添加は、グルタミン酸プロドラッグの細胞障害性をほとんど増加させない。これらの研究は、比較的不活性なプロドラッグを、腫瘍細胞を死滅させうる強力な細胞障害性薬へと選択的に変換する突然変異ヒトＣＰＢ酵素（Ｄ２５３Ｋ）の可能性を示している。実施例１０ヒト化Ａ５Ｂ７Ｆ（ａｂ′）₂−Ｄ２５３ＫＨＣＰＢ融合タンパク質の製造参考例１３で記載された手順を繰返したが、ネズミＡ５Ｂ７軽鎖およびＦｄ配列はヒト化Ａ５Ｂ７の配列で置き換えられ、そしてＨＣＰＢ配列はＤ２５３Ｋ配列で置き換えられる。参考例１３（ｆ）で記載された８アミノ酸リンカー配列は、同等のヒト配列APPVAGPS（配列番号：６６）で置き換えられる。融合タンパク質は、参考例１３で記載のように、ＨＣＰＢプレプロ配列を用いる同時トランスフェクションによってＣＯＳ細胞から発現される。融合タンパク質の大規模な発現は、本質的には参考例１３で記載のように、プラスミドベクター（それぞれ７５０μｇ）をＣＯＳ−７細胞（１ｌ）中に一時的に導入することによって行われる。生成物は、融合タンパク質を含有する上澄みを固定化タンパク質のＡ上を通過させ且つ結合した融合タンパク質を高ｐＨ緩衝液で溶離することによってかまたは、融合タンパク質を含有する上澄みを固定化カルボキシペプチダーゼインヒビターの上に続いて組換えカルボキシペプチダーゼ酵素の精製に用いられる経路に通過させ且つ実施例３の酵素で用いられたのと同様の高ｐＨでの溶離することによって精製される。これらの経路は両方とも、ゲル浸透クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー単独かまたはそれらの組合せによって融合タンパク質を更に精製することを必要とすることがありうる。参考例１３で記載された手順を繰返したが、配列番号：２０および２２でそれぞれ示されるＦｄおよび軽鎖のネズミ配列は、配列番号：２４および２６でそれぞれ示されるヒト化配列で置き換えられる。参考例１３でのＨＣＰＢ配列は、Ｄ２５３Ｋ配列［実施例１で記載されたが、（Ｈｉｓ）₆−ｃ−Ｍｙｃ標識を含まない］で置き換えられる。参考例１３でのＰＣＲの鋳型（ｐＩＣＩ1698）は、ｐＩＣＩ1713（実施例１で記載された）で置き換えられる。配列番号：２４および２６で示されるヒト化配列は、Edwards（1987）Am.Biot ech.Lab.5,38-44、Jayaramanら（1991）Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88,4084-4088 、FoguetおよびLubbert（1992）Biotechniques 13,674-675、およびPierce（199 4）Biotechniques 16,708で記載されたものを含めた様々な方法によって製造される。実施例１１Ｄ２５３ＫＨＣＰＢの製造のための振とうフラスコ発酵大腸菌株ＭＳＤ213を、プラスミドｐＩＣＩ1713（実施例１を参照されたい）で形質転換し、そして得られた菌株ＭＳＤ213 ｐＺｅｎ1713をグリセロール原液として−８０℃で貯蔵した。ＭＳＤ213 ｐＺｅｎ1713のアリコートを、Ｌ−テトラサイクリンの寒天プレート上に画線接種して、３７℃で一晩増殖後にシングルコロニーを分離した。ＭＳＤ213 ｐＺｅｎ1713のシングルコロニーを取出し、そしてＬ−テトラサイクリンブイヨン７５ｍｌが入っている２５０ｍｌエレンマイヤーフラスコ中に接種した。往復振とう機上において３７℃で１６時間増殖後、フラスコの内容物を用いて、Ｌ−テトラサイクリンブイヨン６００ｍｌが入っている９個の２ＬエレンマイヤーフラスコそれぞれにＯＤ５５０＝０．１まで接種した。次に、それらフラスコを往復振とう機上において２０℃で、培養物の光学濃度を測定することによって評価される増殖がＯＤ５５０＝０．５に達するまでインキュベートした。この時点で、Ｌ−アラビノースを培養物に対して０．０１％ｗ／ｖの最終濃度まで加えることによって、異型タンパク質生産を誘導し、そしてインキュベーションを上記のように２０℃で更に４２時間続けた。消耗した培地を、Sorvall RC-3B遠心機での遠心分離（７，０００ｘｇ，４℃，３０分間）によって細菌細胞から分離し、そして細胞ペーストを−７０℃で貯蔵した。実施例１２［Ｇ２５１Ｎ，Ｄ２５３Ｒ］ＨＣＰＢ−（Ｈｉｓ）₆−ｃ−Ｍｙｃの大腸菌からのクローニングおよび発現大腸菌で［Ｇ２５１Ｎ，Ｄ２５３Ｒ］ＨＣＰＢをクローニングし且つ発現する方法は、参考例８で記載された方法と極めて同様であった。［Ｇ２５１Ｎ，Ｄ２５３Ｒ］ＨＣＰＢの遺伝子を実施例２で記載のように製造したが、ＰＣＲ部位特異的突然変異誘発のための出発物質は、ｐＩＣＩ1712の代わりにプラスミドｐＩＣＩ1764（実施例２で記載された）中のＤ２５３ＲＨＣＰＢ遺伝子であった。しかしながら、この場合、部位特異的突然変異誘発を遺伝子のＰＣＲ増幅中に用いて、成熟遺伝子中のアミノ酸２５１位のコドンをグリシンからアスパラギン（ＧＧＣ〜ＡＡＣ）に変更した、すなわち、Ｇ２５１Ｎ変更。２種類のＰＣＲ混合物を、参考例７および８で記載されたのと同様に製造した。最初の反応において、プライマーは、２２６４（配列番号：４８）および１０３８（配列番号：６８，配列番号：６１に代わって）であった。第二の反応において、プライマーは、6HIS9E10R1BS1（配列番号：４１）および１０４３（配列番号：６９，配列番号：６２に代わって）であった。両方の反応において、出発ＤＮＡはｐＩＣＩ1764であった。プライマー１０３８および１０４３（配列番号：６８および６９）は、アミノ酸コドン２５１周辺をアニーリングし、ＧＧＣ〜ＡＡＣ変更をＤＮＡ配列中に導入し、そして二つのＰＣＲ生成物の末端に相補的配列を生じるように設計される。ＰｅｌＢ配列の始めからＥｃｏＲＩ制限部位までの、アミノ酸翻訳を示したｐＭＣ12.5.4中にクローン化されたクローン化［Ｇ２５１Ｎ，Ｄ２５３Ｒ］ＨＣＰＢ遺伝子の確認された配列は、アミノ酸番号２５１がアスパラギン（Ａｓｎ）に変更され且つその関連コドンがＡＡＣに変更されていることを除いて、配列番号：６３として示されるものと同様であり、ＤＮＡ番号はＰｅｌＢの最初のコドンにおいて１から始まり、そしてペプチド番号は成熟ＨＣＰＢにおいて１から始まる。［Ｇ２５１Ｎ，Ｄ２５３Ｒ］ＨＣＰＢの制御された発現を得るために、ｐＭＣ 12.5.4プラスミドＤＮＡを、参考例７と同様に、形質転換コンピテント大腸菌発現菌株ＭＳＤ213中に形質転換した。ｐＭＣ12.5.4形質転換発現菌株を、参考例７と同様に処理して、クローン化［Ｇ２５１Ｎ，Ｄ２５３Ｒ］ＨＣＰＢ遺伝子の発現について調べた。この場合、［Ｇ２５１Ｎ，Ｄ２５３Ｒ］ＨＣＰＢはＣ末端（Ｈｉｓ）₆−ｃ−ｍｙｃ標識を有するので、参考例７と同様に、Ｃ−ｍｙｃペプチド標識に特異的な９Ｅ１０単クローン性抗体抗体をウェスタン分析で用いた。ｐＩＣＩ266（ｐＭＣ12.5.4）中のクローン化された標識［Ｇ２５１Ｎ，Ｄ２５３Ｒ］ＨＣＰＢの発現は、大腸菌から、ベクター（ｐＩＣＩ266）だけのクローンと比較した場合に約３５，０００ダルトンで強いタンパク質バンドを示したクーマシー染色ゲルによって示され、そしてクローンは標識ＨＣＰＢを生じた（参考例７）。同様の寸法のバンドは、ｃ−ｍｙｃ標識のウェスタン分析検出によって強いシグナルを与えた。実施例１３［Ｇ２５１Ｎ，Ｄ２５３Ｋ］ＨＣＰＢ−（Ｈｉｓ）₆−ｃ−Ｍｙｃの大腸菌からのクローニングおよび発現大腸菌で［Ｇ２５１Ｎ，Ｄ２５３Ｋ］ＨＣＰＢをクローニングし且つ発現する方法は、参考例８で記載された方法と極めて同様であった。［Ｇ２５１Ｎ，Ｄ２５３Ｋ］ＨＣＰＢの遺伝子を実施例２で記載のように製造したが、ＰＣＲ部位特異的突然変異誘発のための出発物質は、ｐＩＣＩ1712の代わりにプラスミドｐＩＣＩ1713（実施例１で記載された）中のＤ２５３ＫＨＣＰＢ遺伝子であった。しかしながら、この場合、部位特異的突然変異誘発を遺伝子のＰＣＲ増幅中に用いて、成熟遺伝子中のアミノ酸２５１位のコドンをグリシンからアスパラギン（ＧＧＣ〜ＡＡＣ）に変更した、すなわち、Ｇ２５１Ｎ変更。２種類のＰＣＲ混合物を、参考例７および８で記載されたのと同様に製造した。最初の反応において、プライマーは、２２６４（配列番号：４８）および２２６１（配列番号：７０，配列番号：６１に代わって）であった。第二の反応において、プライマーは、 6HIS9E10R1BS1（配列番号：４１）および２２６０（配列番号：７１，配列番号：６２に代わって）であった。両方の反応において、出発ＤＮＡはｐＩＣＩ1713 であった。プライマー２２６１および２２６０（配列番号：７０および７１）は、アミノ酸コドン２５１周辺をアニーリングし、ＧＧＣ〜ＡＡＣ変更をＤＮＡ配列中に導入し、そして二つのＰＣＲ生成物の末端に相補的配列を生じるように設計される。ＰｅｌＢ配列の始めからＥｃｏＲＩ制限部位までの、アミノ酸翻訳を示したｐＭＣ43.1中にクローン化されたクローン化［Ｇ２５１Ｎ，Ｄ２５３Ｋ］ＨＣＰＢ遺伝子の確認された配列は、アミノ酸番号２５１がアスパラギン（Ａｓｎ）に変更され且つその関連コドンがＡＡＣに変更されていることを除いて配列番号：５９として示されるものと同様であり、ＤＮＡ番号はＰｅｌＢの最初のコドンにおいて１から始まり、そしてペプチド番号は成熟ＨＣＰＢにおいて１から始まる。［Ｇ２５１Ｎ，Ｄ２５３Ｋ］ＨＣＰＢの制御された発現を得るために、ｐＭＣ 43.1プラスミドＤＮＡを、参考例７と同様に、形質転換コンピテント大腸菌発現菌株ＭＳＤ213中に形質転換した。ｐＭＣ43.1形質転換発現菌株を、参考例７と同様に処理して、クローン化［Ｇ２５１Ｎ，Ｄ２５３Ｋ］ＨＣＰＢ遺伝子の発現について調べた。この場合、［Ｇ２５１Ｎ，Ｄ２５３Ｋ］ＨＣＰＢはＣ末端（Ｈｉｓ）₆−ｃ−ｍｙｃ標識を有するので、参考例７と同様に、Ｃ−ｍｙｃペプチド標識に特異的な９Ｅ１０単クローン性抗体抗体をウェスタン分析で用いた。ｐＩＣＩ266（ｐＭＣ43.1）中のクローン化された標識［Ｇ２５１Ｎ，Ｄ２５３Ｋ］ＨＣＰＢの発現は、大腸菌から、ベクター（ｐＩＣＩ266）だけのクローンと比較した場合に約３５，０００ダルトンで強いタンパク質バンドを示したクーマシー染色ゲルによって示され、そしてクローンは標識ＨＣＰＢを生じた（参考例７）。同様の寸法のバンドは、ｃ−ｍｙｃ標識のウェスタン分析検出によって強いシグナルを与えた。実施例１４［Ｇ２５１Ｔ，Ｄ２５３Ｋ］ＨＣＰＢ−（Ｈｉｓ）₆−ｃ−Ｍｙｃの大腸菌からのクローニングおよび発現大腸菌で［Ｇ２５１Ｔ，Ｄ２５３Ｋ］ＨＣＰＢをクローニングし且つ発現する方法は、参考例８で記載された方法と極めて同様であった。［Ｇ２５１Ｔ，Ｄ２５３Ｋ］ＨＣＰＢの遺伝子を実施例２で記載のように製造したが、ＰＣＲ部位特異的突然変異誘発のための出発物質は、ｐＩＣＩ1712の代わりにプラスミドｐＩＣＩ1713（実施例１で記載された）中のＤ２５３ＫＨＣＰＢ遺伝子であった。しかしながら、この場合、部位特異的突然変異誘発を遺伝子のＰＣＲ増幅中に用いて、成熟遺伝子中のアミノ酸２５１位のコドンをグリシンからトレオニン（ＧＧＣ〜ＡＣＴ）に変更した、すなわち、Ｇ２５１Ｔ変更。２種類のＰＣＲ混合物を、参考例７および８で記載されたのと同様に製造した。最初の反応において、プライマーは、２２６４（配列番号：４８）および１０３８（配列番号：６８，配列番号：６１に代わって）であった。第二の反応において、プライマーは、6H IS9E10R1BS1（配列番号：４１）および２６５９（配列番号：７２，配列番号：６２に代わって）であった。両方の反応において、出発ＤＮＡはｐＩＣＩ1713であった。プライマー１０３８および２６５９（配列番号：６８および７２）は、アミノ酸コドン２５１周辺をアニーリングし、ＧＧＣ〜ＡＣＴ変更をＤＮＡ配列中に導入し、そして二つのＰＣＲ生成物の末端に相補的配列を生じるように設計される。ＰｅｌＢ配列の始めからＥｃｏＲＩ制限部位までの、アミノ酸翻訳を示したｐＭＣ46.4.1中にクローン化されたクローン化［Ｇ２５１Ｔ，Ｄ２５３Ｋ］ＨＣＰＢ遺伝子の確認された配列は、アミノ酸番号２５１がトレオニン（Ｔｈｒ）に変更され且つその関連コドンがＡＣＴに変更されていることを除いて配列番号：５９として示されるものと同様であり、ＤＮＡ番号はＰｅｌＢの最初のコドンにおいて１から始まり、そしてペプチド番号は成熟ＨＣＰＢにおいて１から始まる。［Ｇ２５１Ｔ，Ｄ２５３Ｋ］ＨＣＰＢの制御された発現を得るために、ｐＭＣ 46.4.1プラスミドＤＮＡを、参考例７と同様に、形質転換コンピテント大腸菌発現菌株ＭＳＤ213中に形質転換した。ｐＭＣ46.4.1形質転換発現菌株を、参考例７と同様に処理して、クローン化［Ｇ２５１Ｔ，Ｄ２５３Ｋ］ＨＣＰＢ遺伝子の発現について調べた。この場合、［Ｇ２５１Ｔ，Ｄ２５３Ｋ］ＨＣＰＢはＣ末端（Ｈｉｓ）₆−ｃ−ｍｙｃ標識を有するので、参考例７と同様に、Ｃ−ｍｙｃペプチド標識に特異的な９Ｅ１０単クローン性抗体抗体をウェスタン分析で用いた。ｐＩＣＩ266（ｐＭＣ46.4.1）中のクローン化された標識［Ｇ２５１Ｔ，Ｄ２５３Ｋ］ＨＣＰＢの発現は、大腸菌から、ベクター（ｐＩＣＩ266）だけのクローンと比較した場合に約３５，０００ダルトンで強いタンパク質バンドを示したクーマシー染色ゲルによって示され、そしてクローンは標識ＨＣＰＢを生じた（参考例７）。同様の寸法のバンドは、ｃ−ｍｙｃ標識のウェスタン分析検出によって強いシグナルを与えた。実施例１５［Ｇ２５１Ｎ，Ｄ２５３Ｋ，Ｔ２６６Ｇ］ＨＣＰＢ−（Ｈｉｓ）₆−ｃ−Ｍｙｃの大腸菌からのクローニングおよび発現大腸菌で［Ｇ２５１Ｎ，Ｄ２５３Ｋ，Ｔ２６６Ｇ］ＨＣＰＢをクローニングし且つ発現する方法は、参考例８で記載された方法と極めて同様であった。［Ｇ２５１Ｎ，Ｄ２５３Ｋ，Ｔ２６６Ｇ］ＨＣＰＢの遺伝子を実施例２で記載のように製造したが、ＰＣＲ部位特異的突然変異誘発のための出発物質は、ｐＩＣＩ1712 の代わりにプラスミドｐＭＣ43.1（実施例１３で記載された）中の［Ｇ２５１Ｎ，Ｄ２５３Ｋ］ＨＣＰＢ遺伝子であった。しかしながら、この場合、部位特異的突然変異誘発を遺伝子のＰＣＲ増幅中に用いて、成熟遺伝子中のアミノ酸２６６位のコドンをトレオニンからグリシン（ＡＣＣ〜ＧＧＣ）に変更した、すなわち、Ｔ２６６Ｇ変更。２種類のＰＣＲ混合物を、参考例７および８で記載されたのと同様に製造した。最初の反応において、プライマーは、２２６４（配列番号：４８）および１０４５（配列番号：７３，配列番号：６１に代わって）であった。第二の反応において、プライマーは、6HIS9E10R1BS1（配列番号：４２）および５５（配列番号：７４，配列番号：６２に代わって）であった。両方の反応において、出発ＤＮＡはｐＭＣ43.1であった。ＰＣＲ、クローニング、発現および識別の方法は、実施例１４の場合と同様であった。配列決定結果から、必要な［Ｇ２５１Ｎ，Ｄ２５３Ｋ，Ｔ２６６Ｇ］ＨＣＰＢ遺伝子配列を含むプラスミドを含有するクローンを選択したが、それは、ｐＭＣ47.1として知られている。実施例１６ペプチド標識を含む他の突然変異ＨＣＰＢの大腸菌を用いる発現多数の他の突然変異ＨＣＰＢを、参考例７および８並びに実施例１２、１３、１４および１５で記載された方法と同様に構築した。それぞれの場合において、オリゴは、上記と同様の方法によって独特の変更を遺伝子配列中に導入するように構築された。若干の場合、追加の突然変異は、突然変異遺伝子の完全な配列決定で確認され、そしてこれらはＰＣＲ反応中に導入されたと考えられる。基質類似体に対する酵素活性を有する突然変異体（以下の実施例１８を参照）が確認されたが、これらの例を下記の表４で与える。酵素活性は、浸透圧ショックによるペリプラズムタンパク質部分の放出によって大腸菌ＭＳＤ213中のｐＩＣＩ1713 （Ｄ２５３ＫＨＣＰＢ）またはｐＩＣＩ1746（Ｄ２５３ＲＨＣＰＢ）から見出されるものに相対して示される。この物質を、以下ペリプラズムショック産物またはショック産物と称し、そして次の手順によって製造する。１．シングルコロニーを用いて、テトラサイクリン１０μｇ／ｍｌおよび０．０１％（ｗ／ｖ）の最終濃度までのアラビノースを含有するＬブイヨン栄養培地７５ｍｌに接種した。インキュベーションは、２０℃で振とうしながら（２５０ｒｐｍ）約６０時間行った。２．次に、細胞を、４℃で遠心分離によって採集した。３．細胞ペレットを、ｐＨ７．５の２００ｍＭトリス−ＨＣｌ中、１ｍＭＥＤＴＡ含有２０％スクロース（ｗ／ｖ）３００マイクロリットル中に再懸濁させ、そして室温で１５分間インキュベートした。４．ペリプラズムショック産物を、蒸留水４５０マイクロリットルの添加によって生じさせ、そして室温で１５分間更にインキュベーションした。５．細胞残留物を遠心分離によって除去し、そして上澄みを、製造後できるだけ早く酵素活性について検定したが、検定前に４℃で保持された。ａ＝Ｄ２５３ＫＨＣＰＢと同等の活性ｂ＝Ｄ２５３ＲＨＣＰＢと同等の活性ｃ＝突然変異ＨＣＰＢ（参考例７および８で記載された）の７５％の活性ｄ＝突然変異ＨＣＰＢ（参考例７および８で記載された）の２５％の活性ｅ＝Ｄ２５３ＫＨＣＰＢの活性の＞１０倍ＮＡＤ＝活性は検出されなかった実施例１７Ｈｉｐｐ−Ｇｌｕ、Ｈｉｐｐ−ＡｓｐおよびＨｉｐｐ−Ａｒｇプロドラッグ類似体に対するある範囲のヒトＣＰＢ突然変異体の活性の検定。この実施例は、実施例６で記載されたある範囲の突然変異体に基づく。ヒトＣＰＢの精製突然変異体（Ｄ２５３Ｋ；［Ｇ２５１Ｋ，Ｄ２５３Ｒ］；［Ｇ２５１Ｎ，Ｄ２５３Ｒ］；［１２０１Ｓ，Ｄ２５３Ｋ］；［Ｇ２５１Ｎ，Ｄ２５３Ｋ］；［Ｑ５４Ｒ，Ｄ１４５Ａ，Ｄ２５３Ｋ］；［Ｇ２５１Ｔ，Ｄ２５３Ｋ］；［Ｇ２５１Ｓ，Ｄ２５３Ｋ］；［Ａ２４８Ｎ，Ｇ２５１Ｎ，Ｄ２５３Ｋ］；［Ａ２４８Ｓ，Ｇ２５１Ｎ，Ｄ２５３Ｋ］および［Ｓ２０５Ｎ，Ｇ２５１Ｎ，Ｄ２５３Ｋ］−実施例３、１２、１３、１６、２８、３０、３１、３２および３３で記載された）を、ヒプリル−Ｌ−グルタミン酸（Ｈｉｐｐ−Ｇｌｕ，参考例１）、ヒプリル−Ｌ−アスパラギン酸（Ｈｉｐｐ−Ａｓｐ，参考例２）およびヒプリル−Ｌ−アルギニン（Sigma Chemical Company，製品番号Ｈ6625）を馬尿酸に変換するそれらの能力について、実施例６で記載されたのと同様のＨＰＬＣに基づく検定を用いて検定した。反応混合物（５００μｌ）は、突然変異ヒトＣＰＢ（突然変異体に応じて０．０１〜１２．５μｇ）および０．５ｍＭのＨｉｐｐ−ＧｌｕまたはＨｉｐｐ−ＡｓｐまたはＨｉｐｐ−Ａｒｇを０．０２５Ｍトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．５中に含んでいた。試料を３７℃で３０分間インキュベートした。その反応を、４０％メタノール、６０％蒸留水、０．２％トリフルオロ酢酸の５００μｌを加えることによって終結させ、そして生じた馬尿酸の量を、実施例６で記載の通りであるが、２０％メタノール、８０％の５０ｍＭリン酸緩衝液、ｐＨ６．５の移動相を用いるＨＰＬＣによって定量した。馬尿酸は２３０ｎｍで検出された。結果は、表５で示され、そして３７℃で３０分間の場合の基質の生成物への変換百分率として表される。データは、１１種類の突然変異体全部が、Ｈｉｐｐ−ＧｌｕおよびＨｉｐｐ− Ａｓｐ基質を代謝変換する能力を有し、しかも全部が、Ｈｉｐｐ−Ａｒｇ（天然ヒトＣＰＢの基質、実施例６）を変換する能力を最小限にしかまたは全く示さないことを示している。この検定における最良の突然変異体は、Ｈｉｐｐ−Ｇｌｕに対して［Ｇ２５１Ｔ，Ｄ２５３Ｋ］およびＨｉｐｐ−Ａｓｐに対して［１２０１Ｓ，Ｄ２５３Ｋ］であった。実施例１８［Ｇ２５１Ｔ，Ｄ２５３Ｋ］ＨＣＰＢおよび他のＨＣＰＢ突然変異体の活性の検定。［Ｇ２５１Ｔ，Ｄ２５３Ｋ］ＨＣＰＢの活性は、実施例１７で記載された検定条件を用いるが、精製酵素の代わりに、［Ｇ２５１Ｔ，Ｄ２５３Ｋ］ＨＣＰＢ粗製大腸菌ヘリプラズムショック産物（ショック産物）試料そのままかまたは１０につき１若しくは１００につき１の希釈液５０μｌを用いて測定された。試料を３７℃で２４時間インキュベートした。比較のために、Ｄ２５３ＫＨＣＰＢを、反応容量が２５０μｌに減少し且つそのままのＤ２５３Ｋショック産物試料１２５μｌを含んでいたことを除いて同様の検定で検定した。他のＨＣＰＢ突然変異体については、反応容量は２５０μｌであり且つそのままのショック産物かまたは５０につき１の希釈のショック産物１２５μｌを含んだ。ショック産物試料は、実施例１６で記載のように製造された。２４時間以内に生じた馬尿酸の量を、実施例１７で記載のようにＨＰＬＣによって定量したが、結果は表６で示され、そして３７℃で２４時間の場合の基質の生成物への変換百分率として表される。データは、突然変異体［Ｇ２５１Ｔ，Ｄ２５３Ｋ］が、Ｈｉｐｐ−Ｇｌｕを馬尿酸に変換することにおいて、Ｄ２５３Ｋよりも少なくとも５０倍活性であることを示す。［Ｇ２５１Ｔ，Ｄ２５３Ｋ］突然変異体は、Ｈｉｐｐ−Ａｒｇ（天然ＣＰＢの基質、実施例６）と比較して、Ｈｉｐｐ−Ｇｌｕに対して９００倍を越えて活性である。実施例１９実施例２１のプロドラッグおよび実施例２２の対応する薬物のＬｏＶｏ腫瘍細胞での細胞障害性。実施例２１のプロドラッグおよび実施例２２の薬物のＬｏＶｏヒト結腸直腸腫瘍細胞での示差的細胞障害性は、実施例９で記載のように示された。プロドラッグで処理されたＬｏＶｏ腫瘍細胞は、９０５μＭのＩＣ₅₀を有したが、薬物で処理された細胞は、８４μＭのＩＣ₅₀を有した（３回の別々の実験からの平均データ）。典型的な実験を図１５で示す。このように、プロドラッグは、ＬｏＶｏ結腸直腸腫瘍細胞に対する細胞障害性が、本明細書中で記載されたＨＣＰＢの適当な突然変異体と一緒に用いる有効性が示された薬物よりも１０倍を越えて少なかった。実施例３で記載のように製造されたＤ２５３ＫＨＣＰＢ突然変異体を、ＬｏＶｏ腫瘍細胞および実施例２１のプロドラッグが入っている検定ウェルに対して加えた場合、増加した細胞死滅が見られた。プロドラッグ（５００μＭ）に対する２．４〜１１．７５μｇ／ｍｌのＤ２５３ＫＨＣＰＢの添加は、実施例２２の活性薬２００μＭで見られたものに匹敵する毒性を引き起こした（図１６）。これらの研究は、更に、比較的細胞障害性でないプロドラッグを、腫瘍細胞を死滅させうる強力な細胞障害性薬へと選択的に変換するヒトＣＰＢの突然変異酵素の可能性を示している。実施例２０Ｄ２５３ＫＨＣＰＢおよび他のＨＣＰＢ突然変異体による実施例２４のプロドラッグの変換。実施例２４のプロドラッグを実施例２５の薬物に変換する精製Ｄ２５３ＫＨＣＰＢ（実施例３）の能力は、次のように示された。Ｄ２５３ＫＨＣＰＢ（７．５μｇ）、０．５ｍＭプロドラッグを０．０２５Ｍトリス−ＨＣｌ緩衝液、ｐＨ７．５中に含有する反応混合物（５００μｌ）を、３７℃で５分間インキュベートした。反応は、ＭｅＣＮ（５００μｌ）に加えて０．２％トリフルオロ酢酸を加えることによって停止した。次に、生じた薬物の量をＨＰＬＣによって定量した。ＨＰＬＣ分離は、７０％ＭｅＣＮ、３０％蒸留水および０．１％トリフルオロ酢酸の移動相を用いてプロドラッグ（保持時間３．８分）および薬物（保持時間４．９分）の分離を行い且つ化合物を２６０ｎｍで検出したことを除いて実施例６で記載のように行われた。生じた薬物の量は、既知量の薬物で作成された検量線から定量された。Ｄ２５３ＫＨＣＰＢ（１５μｇ／ｍｌ）は、この検定において３７℃で５分間にプロドラッグの７０．４％を加水分解して薬物を生じた（反応の最後の薬物濃度は０．３５２ｍＭであった）。同様の検定条件を用いる他のＨＣＰＢ突然変異体によるプロドラッグの薬物への変換を表７で示す。［Ｑ５４Ｒ，Ｄ１４５Ａ，Ｄ２５３Ｋ］ＨＣＰＢおよび［Ｇ２５１Ｔ，Ｄ２５３Ｋ］ＨＣＰＢ突然変異体の量は、反応混合物中において０．７５μｇまで減少した。データは、ＨＣＰＢ突然変異体がプロドラッグを薬物に変換できることを示し、更に、モデル基質Ｈｉｐｐ−ＧｌｕおよびＨｉｐｐ−Ａｓｐに対して見られた活性はマスタードプロドラッグに適応しうるという根拠を与える。実施例２１Ｎ−［Ｎ−（４−｛４−［ビス−（２−クロロエチル）−アミノ］−３−メチルフェノキシ｝−ベンゾイル）−Ｌ−アラニン］−Ｌ−グルタミン酸の製造（反応スキームについては図１７を参照されたい）Ｎ−［Ｎ−（４−｛４−［ビス−（２−クロロエチル）−アミノ］−３−メチルフェノキシ｝−ベンゾイル）−Ｌ−アラニン−Ｌ−グルタミン酸ジベンジルエステル（化合物８；１３０ｍｇ）の酢酸エチル（５ｍＬ）中溶液に対して、３０％Ｐｄ／Ｃ（５０％水分；２５ｍｇ）を加えた。その混合物を水素雰囲気下で１時間撹拌した。触媒を、CELITE（珪藻シリカ）を介する濾過によって除去し、そして濾液を蒸発乾固させて、標題化合物（化合物１１）を油状物、８８ｍｇ（収率８８％）として与えた。ＮＭＲＤＭＳＯｄ₆ ７．９−６．６（ｍ，７Ｈ）；４．８５（ｍ，１Ｈ）；４．６（ｍ，１Ｈ）；３．４（ｍ，８Ｈ）；２．２５（ｓ，３Ｈ）；２．４−１．９（ｍ，４Ｈ）；１．４５（ｄ，３Ｈ）；ＭＳＥＳＩ，５６６［Ｍ−Ｈ］^- 出発物質化合物８は、次のように製造された。４−ヒドロキシ安息香酸（１３．８ｇ，０．１モル）をメタノール中に溶解させ、そしてこの溶液に対して、ナトリウムメトキシド（１０．８ｇ，０．２モル）を加えた。次に、その溶液を蒸発乾固させた。得られた固体に対して、ＤＭＦ（５００ｍＬ）、続いて４−フルオロ−２−メチル−１−ニトロベンゼン（Aldr ichから５−フルオロ−２−ニトロトルエンとして入手可能）（１０．２ｍＬ，０．１モル）を加えた。その混合物を１２５℃で２時間加熱し、冷却し、そして水３Ｌ中に注ぎ、２ＭＨＣｌでｐＨ２まで酸性にし、そして酢酸エチルで２回抽出した。合わせた有機層を水で洗浄し、乾燥させ、そして蒸発乾固させた。得られた固体をエーテルで研和して、４−（３−メチル−４−ニトロフェノキシ） −安息香酸（化合物１）を白色固体６．１ｇ（収率２２％；融点＝１８７〜１９０℃）として与えた。イソブチレン（３４ｇ）のジクロロメタン（１００ｍＬ）中溶液に対して、化合物１（５ｇ）を５℃で、続いて濃硫酸（０．５ｍＬ）を加えた。その混合物を周囲温度で２日間撹拌し、そして飽和重炭酸ナトリウム溶液（２００ｍＬ）中に注いだ。水性相をジクロロメタンで抽出し、そして合わせた有機抽出液を乾燥させ且つ蒸発させて油状物を与えた。その油状物を、ヘキサン中５％酢酸エチルを用いるクロマトグラフィーによって分離して、４−（３−メチル−４−ニトロフェノキシ）−安息香酸ｔ−ブチルエステル（化合物２）、２．５ｇ（収率４２％；融点＝８１〜８３℃）を与えた。化合物２（２．１５ｇ，５ｍＭ）の酢酸エチル（３５ｍＬ）中溶液に対して、３０％Ｐｄ／Ｃ（５０％水分）（４００ｍｇ）を加えた。その混合物を水素雰囲気下で２時間撹拌した。その混合物を、CELITEを介して濾過し、そして濾液を蒸発させて、４−（４−アミノ−３−メチルフェノキシ）−安息香酸ｔ−ブチルエステル（化合物３）を固体（１．９ｇ，収率９９％）として与えた。融点８４− ８６℃ 化合物３（２ｇ）の１：１酢酸／水（３０ｍｌ）中溶液に対して、エチレンオキシド（５ｇ）を与えた。周囲温度で２日間放置した後、その混合物を飽和重炭酸ナトリウム溶液（２００ｍＬ）中に注ぎ、そして酢酸エチルで２回抽出した。合わせた有機抽出液を水で洗浄し、乾燥させ、そして蒸発させて、４−｛４−［ビス（２−ヒドロキシエチル）−アミノ］−３−メチルフェノキシ）安息香酸ｔ −ブチルエステル（化合物４）を油状物（２．５ｇ，収率９９％）として与えた。ＮＭＲＣＤＣｌ₃ ８．０（ｄ，２Ｈ）；７．３−６．９（ｍ，７Ｈ）；３．６（ｔ，４Ｈ）；３．２（ｔ，４Ｈ）；２．３（ｓ，３Ｈ）；１．５（ｓ，９Ｈ）。化合物４（２．５ｇ）の１：１アセトニトリル／四塩化炭素（９０ｍｌ）中溶液に対して、イミダゾール（１．７ｇ）およびトリフェニルホスフェン（６．６ｇ）を加えた。その混合物を周囲温度で３時間撹拌し、そして蒸発乾固させた。その残留物を１Ｍクエン酸溶液と酢酸エチルとに分配した。有機層を水で洗浄し、乾燥させ、そして蒸発乾固させた。その残留物を、ヘキサン／酢酸エチル（９：１）を用いるクロマトグラフィーによって分離して、４−｛４−［ビス（２− クロロエチル）−アミノ］−３−メチルフェノキシ）−安息香酸ｔ−ブチルエステル（化合物５）を油状物（１．２ｇ，収率４４％）として与えた。ＮＭＲＣＤＣｌ₃ ７．９５（ｄ，２Ｈ）；７．２−６．９（ｍ，７Ｈ）；３．４（ｍ，８Ｈ）；２．３（ｓ，３Ｈ）；１．６（ｓ，９Ｈ）。化合物５のジクロロメタン（５ｍｌ）およびトリフルオロ酢酸（１０ｍｌ）中溶液を、周囲温度で２時間撹拌した。その混合物を蒸発乾固させ、酢酸エチルと一緒に２回共沸させて、４−｛４−［ビス（２−クロロエチル）−アミノ］−３ −メチルフェノキシ）−安息香酸（化合物６）を固体トリフルオロ酢酸塩（１．０ｇ，収率７３％）として与えた。融点、９１〜３℃。Ｎ−Ｂｏｃ−Ｌ−アラニン−Ｌ−グルタミン酸ジベンジルエステル（Beilharz ら，1983,36,751-8）（化合物７，２５０ｍｇ，０．５ｍＭ）のジクロロメタン（２ｍＬ）中溶液に対して、トリフルオロ酢酸（４ｍＬ）を加えた。その溶液を周囲温度で１時間放置した後、蒸発乾固させた。その残留物を、酢酸エチル中に再溶解させ、飽和重炭酸ナトリウム溶液で洗浄し、乾燥させ、そして蒸発させて油状物（除去されたＢｏｃ基を含む化合物７）を与えた。ＤＭＦ（２ｍＭ）中のこの油状物を、ＤＭＦ（２ｍＭ）中の化合物６（２５５ｍｇ）に対して、続いてヒドロキシベンゾトリアゾール（７０ｍｇ）、１−（３−ジメチルアミノプロピル）−３−エチルカルボジイミド塩酸塩（ＤＥＣＩ；１１５ｍｇ）およびトリエチルアミン（０．１８ｍＬ）に対して加えた。その混合物を周囲温度で１時間撹拌し、飽和重炭酸ナトリウム溶液（１００ｍＬ）および酢酸エチル（１００ｍＬ）中に注いだ。有機層を分離し、水および続いて０．５Ｍクエン酸で洗浄し、乾燥させ、そして蒸発乾固させた。その残留物を、酢酸エチル／ヘキサン（１：１）を用いるクロマトグラフィーによって分離して、所望の出発物質を油状物（１５０ｍｇ，収率４０％）として与えた。ＮＭＲＣＤＣｌ₃ ７．８（ｄ，２Ｈ）；７．４−６．７（ｍ，７Ｈ）；５．２（ｓ，２Ｈ）；５．０（ｓ，２Ｈ）；４．７（ｍ，２Ｈ）；３．４（ｍ，８Ｈ）；２．３（ｓ，３Ｈ）；２．４５−２．０（ｍ，４Ｈ）；１．４（ｄ，３Ｈ）。実施例２２Ｎ−（４−｛４−［ビス−（２−クロロエチル）−アミノ］−３−メチルフェノキシ｝−ベンゾイル）−Ｌ−アラニンの製造（反応スキームについては図１７を参照されたい）Ｎ−（４−｛４−［ビス−（２−クロロエチル）−アミノ］−３−メチルフェノキシ｝−ベンゾイル）−Ｌ−アラニン−ｔ−ブチルエステル（４００ｍｇ；化合物９）をジクロロメタン（４ｍｌ）中に溶解させ、そしてトリフルオロ酢酸（８ｍｌ）を加えた。その混合物を周囲温度で１時間放置し、蒸発乾固させ、そして酢酸エチルと一緒に２回共沸させて、標題化合物（化合物１０；実施例２１のプロドラッグに対応する薬物）を油状物（０．４３ｇ，収率５２％）として与えた。ＮＭＲＤＭＳＯｄ₆ ８．５（ｄ，１Ｈ）；７．８−６．５（ｍ，７Ｈ）；４．４（ｍ，１Ｈ）；３．５５（ｔ，４Ｈ）；３．３５（ｔ，４Ｈ）；２．３（ｓ，３Ｈ）；１．４（ｄ，３Ｈ）。ＭＳ（Ｍ＋Ｈ）⁺，４３９出発物質化合物９は、次のように製造された。４−｛４−［ビス（２−クロロエチル）−アミノ］−３−メチルフェノキシ） −安息香酸（実施例２１の化合物６）（５８６ｍｇ，１ミリモル）のジメチルホルムアミド（２ｍＬ）中混合物に対して、ヒドロキシベンゾトリアゾール（１３５ｍｇ）、１−（３−ジメチルアミノプロピル）−３−エチルカルボジイミド塩酸塩（２３０ｍｇ）、続いてＬ−アラニン−ｔ−ブチルエステル塩酸塩（１８１ｍｇ）およびトリエチルアミン（０．５４ｍＬ）を加えた。その混合物を周囲温度で２時間撹拌し、飽和重炭酸ナトリウム溶液（６０ｍＬ）中に注ぎ、酢酸エチルで２回抽出し、そして合わせた抽出液を水で洗浄し、１Ｍクエン酸溶液で洗浄し、乾燥させ、そして蒸発乾固させた。その残留物を、ヘキサン／酢酸エチル（４：１）を用いるクロマトグラフィーによって分離して、所望の出発物質を油状物（０．４ｇ，収率８１％）として与えた。ＮＭＲＣＤＣｌ₃ ７．８（ｄ，２Ｈ）；７．３−６．７（ｍ，７Ｈ）；４．６（ｍ，１Ｈ）；３．４（ｍ，８Ｈ）；２．３（ｓ，３Ｈ）；１．５（ｄ，３Ｈ）；１．５（ｓ，９Ｈ）。実施例２３プロドラッグおよびヒト化抗体−突然変異ＨＣＰＢ融合タンパク質の異種移植マウスでの抗腫瘍活性。適当なプロドラッグおよびヒト化抗体−突然変異ＨＣＰＢ融合タンパク質（実施例１０）の抗腫瘍有効性は、次のモデルで示すことができる。ＬｏＶｏ結腸直腸腫瘍細胞（ＥＣＡＣＣ番号87060101）（１Ｘ１０^-7個）を、無胸腺ヌードマウスに皮下注射する。腫瘍が直径４〜５ｍｍの時点で、該結合体を１０〜１００ｍｇ／ｋｇの用量で静脈内投与する。融合タンパク質を腫瘍に対して局在化させ、そして残留する結合体が血流および正常組織から除去されるのに適当な時間的間隔（１〜４日間）を与えた後、プロドラッグを、マウスに対して１回かまたは多数回量として１０〜１０００ｍｇ／ｋｇの範囲の用量で静脈内かまたは腹腔内に投与する。抗体−酵素融合タンパク質およびプロドラッグの組合せは、未処置対照腫瘍または同用量の結合体か若しくはプロドラッグ単独で処置された腫瘍よりもかなり遅く腫瘍を成長させる。これらの研究は、ヒト化抗体 −突然変異ＣＰＢ融合タンパク質および突然変異ＣＰＢプロドラッグの組合せが、有意の抗腫瘍活性をもたらすことを示している。実施例２４Ｎ−［Ｎ−（４−｛４−［ビス−（２−クロロエチル）−アミノ］−フェノキシ｝−ベンゾイル）−Ｌ−アラニン］−Ｌ−グルタミン酸の製造標題化合物は、実施例２１で示されたのと同様にではあるが、４−（３−メチル−４−ニトロフェノキシ）−安息香酸（実施例２１の化合物１）の代わりに４ −（４−ニトロフェノキシ）−安息香酸（Ravickら（1933），JACS,55,1289-129 0）を置き換えて製造された。ＮＭＲＤＭＳＯｄ₆，８．４（ｄ，１Ｈ）；８．３（ｄ，１Ｈ）；７．８（ｄ，１Ｈ）；７．０５−６．７５（ｍ，６Ｈ）；４．５（ｍ，１Ｈ）；４．２５（ｍ，１Ｈ）；３．７（ｓ，８Ｈ）；２．４−１．６（ｍ，４Ｈ）；１．４（ｄ，３Ｈ）。ＭＳＥＳＰ，５５１［Ｍ−Ｈ）^- 実施例２５Ｎ−（４−｛４−［ビス−（２−クロロエチル）−アミノ］−フェノキシ｝−ベンゾイル）−Ｌ−アラニン標題化合物（実施例２４のプロドラッグに対応する薬物である）は、実施例２２で示されたのと同様にではあるが、４−｛４−［ビス（２−クロロエチル）− アミノ］−３−メチルフェノキシ）−安息香酸の代わりに４−｛４−［ビス（２ −クロロエチル）−アミノ］−フェノキシ）−安息香酸（実施例２４で中間体として製造される）を置き換えて製造された。ＮＭＲＣＤＣｌ₃ ７．７５（ｄ，２Ｈ）；７．０−６．４（ｍ，６Ｈ）；４．６（ｍ，１Ｈ）；３．６−３．４（ｍ，８Ｈ）；１．６（ｄ，２Ｈ）。ＭＳＥＳＰ，４２３［Ｍ−Ｈ）^- 実施例２６Ｄ２５３ＲＨＣＰＢ−Ｈｉｓ₆−ｃＭｙｃの大腸菌からの精製実施例１１で記載された手順を、プラスミドｐＩＣＩ1713をｐＩＣＩ1746（実施例２で記載された）で置き換えて繰返した。Ｌ−テトラサイクリン６００ｍｌが入っている１２個の２Ｌエレンマイヤーフラスコを、実施例１１で用いられた９個のフラスコの代わりに発酵用に用いた。組換え大腸菌細胞ペーストを、−７０℃での貯蔵から取り且つ融解させた。細胞ペーストの重量を測定し、そして８２．４ｇであることが判った。そのペーストを、緩衝液Ａ［２００ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．０），２０％スクロース］の添加で再懸濁させて、再懸濁容量１３０ｍｌを与えた。細胞懸濁液を、時々緩やかに混合しながら室温で２０分間インキュベートした後、等容量の蒸留水を室温で加え、そして完全に混合した。その細胞懸濁液を、再度、時々緩やかに混合しながら室温で２０分間インキュベートした。得られた粗浸透圧ショック産物を、４℃において９８０００ｘｇで９０分間の遠心分離によって清澄化した後、その上澄みをペレット化した不溶性部分から傾瀉除去した。その上澄みを、１０ｍＭトリス−ＨＣｌ、５００ｍＭ塩化ナトリウム、ｐＨ８．０（緩衝液Ｂ）で１：１に希釈し、５００ｍｌの全容量に対してｐＨ８．０に調整し、そしてカルボキシペプチダーゼインヒビターアフィニティーカラム上に０．５ｍｌ／分で一晩中充填した。ＣＮＢｒ活性セファロース４Ｂ（第一アミン含有リガンドの固定用の予め活性化された４％アガロースゲル；Pharmacia製品番号17-0430-01）およびジャガイモ塊茎からのカルボキシペプチダーゼインヒビター（ｃ−0279，Sigm a）を用いて指示にしたがって調製されたカラム。カルボキシペプチダーゼ精製のこの寸法に用いられたマトリックスの量は、Pharmacia XK 16カラム中に充填された１５ｍｌであった。マトリックスの１５ｍｌ量を製造するために、乾燥マトリックス５ｇおよびカルボキシペプチダーゼインヒビター８０ｍｇを用いた。アフィニティーカラムを製造する手順は、次の通りであった。凍結乾燥マトリックス（５ｇ）を１ｍＭＨＣｌ中に懸濁させた。膨脹したゲルを半融ガラス濾過器上において数回のアリコートで加えられた１ｍＭＨＣｌ（１ｌ）で洗浄した。カルボキシペプチダーゼインヒビター（８０ｍｇ）を、０．５ＭＮａＣｌ含有０．１Ｍ重炭酸ナトリウム（ｐＨ８．３）（カップリング緩衝液；２５ｍｌ）中に溶解させた後、密栓容器中でゲルと混合した。その混合物を室温で１時間または４℃で１８時間転倒型で回転させた後、過剰のリガンドを、少なくとも５ゲル容量のカップリング緩衝液で洗浄除去した。ゲルを０．１Ｍトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）に移し、そして室温で２時間放置した後、少なくとも５ゲル容量の０．５ＭＮａＣｌ含有０．１Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ４．０）で、続いて少なくとも５ゲル容量の０．５ＭＮａＣｌ含有０．１Ｍトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）で洗浄した。カラムは、４℃において緩衝液Ｂで予め平衡された。上澄みを充填後、フロースルーの吸光度がベースラインに戻るまでカラムを洗浄した後、結合した物質を、溶離緩衝液（１００ｍＭ炭酸ナトリウム、５００ｍＭ塩化ナトリウム、ｐＨ１１．４）によって４℃でカラムから溶離し、１ｍｌ画分を集めた。溶離した画分は、組換えカルボキシペプチダーゼＢ含有画分を決定するために試料を採取した後に、−２０℃で凍結された。これは、ウェスタンブロット分析によって、抗ｃ −ｍｙｃ標識抗体（９Ｅ１０）を用い、続いて４−クロロナフトールおよび過酸化水素に対する暴露で着色反応を与えた抗マウス−ホースラディッシュペルオキシダーゼ結合体（ａ−9044，Sigma）を用いて、または銀染色ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって行われた。画分２０〜６６は、組換えカルボキシペプチダーゼＢを含有することが確認された。カラムを再度平衡させた後、最初の充填中にカラムから集められた希薄上澄みをカラム上に再度通過させた。集められた画分の溶離条件および分析は、最初の溶離からのものと一致した。画分２５〜６０は、組換えカルボキシペプチダーゼＢを含有することが確認された。これらを、最初の通過からの画分と一緒にプールし、そのｐＨをｐＨ７．５に調整し、そしてMillipore Centrifugal Ultrafree-20（１０，０００分画分子量濾過装置）を用いて濃縮した後、急速凍結させ且つ−８０℃で貯蔵した。ここで詳述された精製は、３．５ｍｇ／ｍｌのＤ２５３Ｒ突然変異ＨＣＰＢを５５０マイクロリットルの容量中において８７％の純度で与えた。実施例２７［Ｇ２５１Ｎ，Ｄ２５３Ｋ］ＨＣＰＢ−Ｈｉｓ₆−ｃＭｙｃの大腸菌からの精製実施例２６で記載された手順を、プラスミドｐＩＣＩ1746をｐＭＣ43.1（実施例１３で記載された）で置き換えて繰返した。細胞ペーストの重量は９４ｇであり、これを緩衝液Ａ１１０ｍｌ中に再懸濁させた。ポテーター（potator）インヒビターカラム上に充填された、緩衝液Ｂで希釈後の浸透圧ショック産物の容量は、５００ｍｌであった。最初の溶離において、画分１０〜２７を集めた。次の通過において、画分１０〜３９を溶離で集めた。精製は、１．２４ｍｇ／ｍｌの［Ｇ２５１Ｎ，Ｄ２５３Ｋ］ＨＣＰＢを９００マイクロリットルの容量中において９５％の純度で与えた。実施例２８［Ｇ２５１Ｔ，Ｄ２５３Ｋ］ＨＣＰＢ−Ｈｉｓ₆−ｃＭｙｃの大腸菌からの精製実施例２６で記載された手順を、プラスミドｐＩＣＩ1746をｐＭＣ46.4.1（実施例１４で記載された）で置き換えて繰返した。細胞ペーストの重量は４６ｇであり、これを緩衝液Ａ６５ｍｌ中に再懸濁させた。ポテーターインヒビターカラム上に充填された、緩衝液Ｂで希釈後の浸透圧ショック産物の容量は、２６０ｍｌであった。最初の溶離において、画分８〜２８を集めた。次の通過において、画分４１〜７９を溶離で集めた。精製は、０．６７ｍｇ／ｍｌの［Ｇ２５１Ｔ，Ｄ２５３Ｋ］ＨＣＰＢを５００マイクロリットルの容量中において９５％の純度で与えた。実施例２９薬剤組成物下記は、ヒトにおいて治療目的に用いることができる本発明の典型的な薬剤剤形を例示する。注射用液剤（ｉ）溶液１ｍｌにつき次のものを含有する注射用滅菌水性溶液。実施例１０の抗体−酵素１．０ｍｇ酢酸ナトリウム三水和物６．８ｍｇ塩化ナトリウム７．２ｍｇトゥイーン２００．０５ｍｇ結合体の典型的な用量は３０ｍｇであり、３日後にプロドラッグを伴う。（ii）最終プロドラッグ剤形製剤には、次のものを組合せる。実施例２１のプロドラッグ６００ｍｇをそれぞれ含有するガラスバイアル（３ｘ２０ｍｌ）；２．１５％（ｗ／ｖ）炭酸水素ナトリウム１１ｍｌが入っている３個のアンプル；針（３ｘ１８Ｇ）；バイアルに排出口を付けるための疎水性フィルター；および水性溶液のための３個の使い捨て滅菌０．２２ミクロンフィルター。材料は全て２〜８℃で貯蔵される必要がある。これらの作業は、好ましくは、滅菌条件下で行われることになっている。投薬する１時間以内に、プロドラッグのバイアル１個に、針および疎水性フィルターで排出口を付ける。次に、滅菌２．１５％ｗ／ｖ炭酸水素ナトリウム（１０ｍｌ）を、注射器および針によって栓を介して直接的に加える。排出口を用いて、なお適当にバイアルを緩やかに旋回させて、透明な溶液（これは、遊離塩基として５０ｍｇ／ｍｌであろう）を得る。必要な投薬量を、滅菌フィルターを介して滅菌注射器中に吸引する。次に、フィルターを外装滅菌針と交換し、そして注射器ユニットを投与前に冷却した状態にする。それぞれの残りのバイアルは、１時間間隔で同様に調製されて、例えば、３回の別々の投薬を１時間間隔で与えることを可能にする。実施例３０［Ｇ２５１Ｓ，Ｄ２５３Ｋ］ＨＣＰＢ−（Ｈｉｓ）₆−ｃ−Ｍｙｃの大腸菌からのクローニング、発現および精製大腸菌で［Ｇ２５１Ｓ，Ｄ２５３Ｋ］ＨＣＰＢをクローニングし且つ発現する方法は、参考例８で記載された方法と極めて同様であった。［Ｇ２５１Ｓ，Ｄ２５３Ｋ］ＨＣＰＢの遺伝子を実施例２で記載のように製造したが、ＰＣＲ部位特異的突然変異誘発のための出発物質は、ｐＩＣＩ1712の代わりにプラスミドｐＩＣＩ1713（実施例１で記載された）中の［Ｄ２５３Ｋ］ＨＣＰＢ遺伝子であった。しかしながら、この場合、部位特異的突然変異誘発を遺伝子のＰＣＲ増幅中に用いて、成熟遺伝子中のアミノ酸２５１位のコドンをグリシンからセリン（ＧＧＣ〜ＴＣＴ）に変更した、すなわち、Ｇ２５１Ｓ変更。２種類のＰＣＲ混合物を、参考例７および８で記載されたのと同様に製造した。最初の反応において、プライマーは、２２６４（配列番号：４８）および１０３８（配列番号：６８，配列番号：６１に代わって）であった。第二の反応において、プライマーは、6H IS9E10R1BS1（配列番号：４２）および５４（配列番号：７５，配列番号：６２に代わって）であった。両方の反応において、出発ＤＮＡはｐＩＣＩ1713であった。ＰＣＲ、クローニング、発現および識別の方法は、実施例１４の場合と同様であった。配列決定結果から、必要な［Ｇ２５１Ｓ，Ｄ２５３Ｋ］ＨＣＰＢ遺伝子配列を含むプラスミドを含有するクローンを選択したが、それはｐＭＣ49.2として知られている。［Ｇ２５１Ｓ，Ｄ２５３Ｋ］ＨＣＰＢの精製のために、実施例２６で記載された手順を、プラスミドｐＩＣＩ1746をｐＭＣ49.2で置き換えて繰返した。細胞ペーストの重量は７７ｇであり、これを緩衝液Ａ１００ｍｌ中に再懸濁させた。ポテーターインヒビターカラム上に充填された、緩衝液Ｂで希釈後の浸透圧ショック産物の容量は、３９５ｍｌであった。最初の溶離において、画分１１〜４０を集めた。次の通過において、画分１２〜３３を溶離で集めた。精製は、１．７ｍｇ／ｍｌの［Ｇ２５１Ｓ，Ｄ２５３Ｋ］ＨＣＰＢを５００マイクロリットルの容量中において８６％の純度で与えた。実施例３１［Ａ２４８Ｎ，Ｇ２５１Ｎ，Ｄ２５３Ｋ］ＨＣＰＢ−（Ｈｉｓ）₆−ｃ−Ｍｙｃの大腸菌からのクローニング、発現および精製大腸菌で［Ａ２４８Ｎ，Ｇ２５１Ｎ，Ｄ２５３Ｋ］ＨＣＰＢをクローニングし且つ発現する方法は、参考例８で記載された方法と極めて同様であった。［Ａ２４８Ｎ，Ｇ２５１Ｎ，Ｄ２５３Ｋ］ＨＣＰＢの遺伝子を実施例２で記載のように製造したが、ＰＣＲ部位特異的突然変異誘発のための出発物質は、ｐＩＣＩ1712 の代わりにプラスミドｐＭＣ43.1（実施例１３で記載された）中の［Ｇ２５１Ｎ，Ｄ２５３Ｋ］ＨＣＰＢ遺伝子であった。しかしながら、この場合、部位特異的突然変異誘発を遺伝子のＰＣＲ増幅中に用いて、成熟遺伝子中のアミノ酸２４８位のコドンをアラニンからアスパラギン（ＧＣＴ〜ＡＡＣ）に変更した、すなわち、Ｇ２４８Ｎ変更。２種類のＰＣＲ混合物を、参考例７および８で記載されたのと同様に製造した。最初の反応において、プライマーは、２２６４（配列番号：４８）および１０２４（配列番号：７６，配列番号：６１に代わって）であった。第二の反応において、プライマーは、6HIS9E10R1BS1（配列番号：４２）および１０２８（配列番号：７７，配列番号：６２に代わって）であった。両方の反応において、出発ＤＮＡはｐＭＣ43.1であった。ＰＣＲ、クローニング、発現および識別の方法は、実施例１４の場合と同様であった。配列決定結果から、必要な［Ａ２４８Ｎ，Ｇ２５１Ｎ，Ｄ２５３Ｋ］ＨＣＰＢ遺伝子配列を含むプラスミドを含有するクローンを選択したが、それはｐＭＣ50.2として知られている。［Ａ２４８Ｎ，Ｇ２５１Ｎ，Ｄ２５３Ｋ］ＨＣＰＢの精製のために、実施例２６で記載された手順を、プラスミドｐＩＣＩ1746をｐＭＣ50.2で置き換えて繰返した。細胞ペーストの重量は８３ｇであり、これを緩衝液Ａ１００ｍｌ中に再懸濁させた。ポテーターインヒビターカラム上に充填された、緩衝液Ｂで希釈後の浸透圧ショック産物の容量は、５６０ｍｌであった。最初の溶離において、画分２３〜４０を集めた。次の通過において、画分１８〜４０を溶離で集めた。精製は、１．０ｍｇ／ｍｌの［Ａ２４８Ｎ，Ｇ２５１Ｎ，Ｄ２５３Ｋ］ＨＣＰＢを１０００マイクロリットルの容量中において９０％の純度で与えた。実施例３２［Ａ２４８Ｓ，Ｇ２５１Ｎ，Ｄ２５３Ｋ］ＨＣＰＢ−（Ｈｉｓ）₆−ｃ−Ｍｙｃの大腸菌からのクローニング、発現および精製大腸菌で［Ａ２４８Ｓ，Ｇ２５１Ｎ，Ｄ２５３Ｋ］ＨＣＰＢをクローニングし且つ発現する方法は、参考例８で記載された方法と極めて同様であった。［Ａ２４８Ｓ，Ｇ２５１Ｎ，Ｄ２５３Ｋ］ＨＣＰＢの遺伝子を実施例２で記載のように製造したが、ＰＣＲ部位特異的突然変異誘発のための出発物質は、ｐＩＣＩ1712 の代わりにプラスミドｐＭＣ43.1（実施例１３で記載された）中の［Ｇ２５１Ｎ，Ｄ２５３Ｋ］ＨＣＰＢ遺伝子であった。しかしながら、この場合、部位特異的突然変異誘発を遺伝子のＰＣＲ増幅中に用いて、成熟遺伝子中のアミノ酸２４８位のコドンをアラニンからセリン（ＧＣＴ〜ＴＴＣ）に変更した、すなわち、Ｇ２４８Ｓ変更。２種類のＰＣＲ混合物を、参考例７および８で記載されたのと同様に製造した。最初の反応において、プライマーは、２２６４（配列番号：４８）および１０２４（配列番号：７６，配列番号：６１に代わって）であった。第二の反応において、プライマーは、6HIS9E10R1BS1（配列番号：４２）および１０３０（配列番号：７８，配列番号：６２に代わって）であった。両方の反応において、出発ＤＮＡはｐＭＣ43.1であった。ＰＣＲ、クローニング、発現および識別の方法は、実施例１４の場合と同様であった。配列決定結果から、必要な［Ａ２４８Ｓ，Ｇ２５１Ｎ，Ｄ２５３Ｋ］ＨＣＰＢ遺伝子配列を含むプラスミドを含有するクローンを選択したが、それはｐＭＣ51.2として知られている。［Ａ２４８Ｓ，Ｇ２５１Ｎ，Ｄ２５３Ｋ］ＨＣＰＢの精製のために、実施例２６で記載された手順を、プラスミドｐＩＣＩ1746をｐＭＣ51.2で置き換えて繰返した。細胞ペーストの重量は７１．５ｇであり、これを緩衝液Ａ１００ｍｌ中に再懸濁させた。ポテーターインヒビターカラム上に充填された、緩衝液Ｂで希釈後の浸透圧ショック産物の容量は、５２０ｍｌであった。最初の溶離において、画分１０〜４０を集めた。次の通過において、画分１０〜３２を溶離で集めた。３度目の通過において、画分１５〜４０を溶離で集めた。精製は、０．８ｍｇ／ｍｌの［Ａ２４８Ｓ，Ｇ２５１Ｎ，Ｄ２５３Ｋ］ＨＣＰＢを１５００マイクロリットルの容量中において８０．５％の純度で与えた。実施例３３［Ｓ２０５Ｎ，Ｇ２５１Ｎ，Ｄ２５３Ｋ］ＨＣＰＢ−（Ｈｉｓ）₆−ｃ−Ｍｙｃの大腸菌からのクローニング、発現および精製大腸菌で［Ｓ２０５Ｎ，Ｇ２５１Ｎ，Ｄ２５３Ｋ］ＨＣＰＢをクローニングし且つ発現する方法は、参考例８で記載された方法と極めて同様であった。［Ｓ２０５Ｎ，Ｇ２５１Ｎ，Ｄ２５３Ｋ］ＨＣＰＢの遺伝子を実施例２で記載のように製造したが、ＰＣＲ部位特異的突然変異誘発のための出発物質は、ｐＩＣＩ1712 の代わりにプラスミドｐＭＣ43.1（実施例１３で記載された）中の［Ｇ２５１Ｎ，Ｄ２５３Ｋ］ＨＣＰＢ遺伝子であった。しかしながら、この場合、部位特異的突然変異誘発を遺伝子のＰＣＲ増幅中に用いて、成熟遺伝子中のアミノ酸２０５位のコドンをセリンからアスパラギン（ＴＣＡ〜ＡＡＣ）に変更した、すなわち、Ｓ２０５Ｎ変更。２種類のＰＣＲ混合物を、参考例７および８で記載されたのと同様に製造した。最初の反応において、プライマーは、２２６４（配列番号：４８）および１０１０（配列番号：７９，配列番号：６１に代わって）であった。第二の反応において、プライマーは、6HIS9E10R1BS1（配列番号：４２）および１０１６（配列番号：８０，配列番号：６２に代わって）であった。両方の反応において、出発ＤＮＡはｐＭＣ43.1であった。ＰＣＲ、クローニング、発現および識別の方法は、実施例１４の場合と同様であった。配列決定結果から、必要な［Ｓ２０５Ｎ，Ｇ２５１Ｎ，Ｄ２５３Ｋ］ＨＣＰＢ遺伝子配列を含むプラスミドを含有するクローンを選択したが、それはｐＭＣ51.2として知られている。［Ｓ２０５Ｎ，Ｇ２５１Ｎ，Ｄ２５３Ｋ］ＨＣＰＢの精製のために、実施例２６で記載された手順を、プラスミドｐＩＣＩ1746をｐＭＣ52.1で置き換えて繰返した。細胞ペーストの重量は７７ｇであり、これを緩衝液Ａ１００ｍｌ中に再懸濁させた。ポテーターインヒビターカラム上に充填された、緩衝液Ｂで希釈後の浸透圧ショック産物の容量は、４２０ｍｌであった。最初の溶離において、画分１０〜４０を集めた。次の通過において、画分１２〜２９を溶離で集めた。精製は、０．８ｍｇ／ｍｌの［Ｓ２０５Ｎ，Ｇ２５１Ｎ，Ｄ２５３Ｋ］ＨＣＰＢを６５０マイクロリットルの容量中において８５％の純度で与えた。実施例３４［Ｇ２５１Ｔ，Ｄ２５３Ｒ］ＨＣＰＢ−（Ｈｉｓ）₆−ｃ−Ｍｙｃの大腸菌からのクローニングおよび発現大腸菌で［Ｇ２５１Ｔ，Ｄ２５３Ｒ］ＨＣＰＢをクローニングし且つ発現する方法は、参考例８で記載された方法と極めて同様であった。［Ｇ２５１Ｔ，Ｄ２５３Ｒ］ＨＣＰＢの遺伝子を実施例２で記載のように製造したが、ＰＣＲ部位特異的突然変異誘発のための出発物質は、ｐＩＣＩ1712の代わりにプラスミドｐＩＣＩ1746（実施例２で記載された）中の［Ｄ２５３Ｒ］ＨＣＰＢ遺伝子であった。しかしながら、この場合、部位特異的突然変異誘発を遺伝子のＰＣＲ増幅中に用いて、成熟遺伝子中のアミノ酸２５１位のコドンをグリシンからトレオニン（ＧＧＣ〜ＡＣＴ）に変更した、すなわち、Ｇ２５１Ｔ変更。２種類のＰＣＲ混合物を、参考例７および８で記載されたのと同様に製造した。最初の反応において、プライマーは、２２６４（配列番号：４８）および１０３８（配列番号：６８，配列番号：６１に代わって）であった。第二の反応において、プライマーは、6HIS9E10R1BS1（配列番号：４２）および７９４（配列番号：８１，配列番号：６２に代わって）であった。両方の反応において、出発ＤＮＡはｐＩＣＩ1746 であった。ＰＣＲ、クローニング、発現および識別の方法は、実施例１４の場合と同様であった。配列決定結果から、必要な［Ｇ２５１Ｔ，Ｄ２５３Ｒ］ＨＣＰＢ遺伝子配列を含むプラスミドを含有するクローンを選択したが、それはｐＭＣ55.2として知られている。実施例３５［Ｉ２０１Ｔ，Ｄ２５３Ｒ］ＨＣＰＢ−（Ｈｉｓ）₆−ｃ−Ｍｙｃの大腸菌からのクローニングおよび発現大腸菌で［Ｉ２０１Ｔ，Ｄ２５３Ｒ］ＨＣＰＢをクローニングし且つ発現する方法は、参考例８で記載された方法と極めて同様であった。［Ｉ２０１Ｔ，Ｄ２５３Ｒ］ＨＣＰＢの遺伝子を実施例２で記載のように製造したが、ＰＣＲ部位特異的突然変異誘発のための出発物質は、ｐＩＣＩ1712の代わりにプラスミドｐＩＣＩ1746（実施例２で記載された）中の［Ｄ２５３Ｒ］ＨＣＰＢ遺伝子であった。しかしながら、この場合、部位特異的突然変異誘発を遺伝子のＰＣＲ増幅中に用いて、成熟遺伝子中のアミノ酸２０１位のコドンをイソロイシンからトレオニン（ＡＴＣ〜ＡＣＴ）に変更した、すなわち、Ｉ２０１Ｔ変更。２種類のＰＣＲ混合物を、参考例７および８で記載されたのと同様に製造した。最初の反応において、プライマーは、２２６４（配列番号：４８）および１００３（配列番号：８２，配列番号：６１に代わって）であった。第二の反応において、プライマーは、6HIS9E10R1BS1（配列番号：４２）および７９５（配列番号：８３，配列番号：６２に代わって）であった。両方の反応において、出発ＤＮＡはｐＩＣＩ17 46であった。ＰＣＲ、クローニング、発現および識別の方法は、実施例１４の場合と同様であった。配列決定結果から、必要な［Ｉ２０１Ｔ，Ｄ２５３Ｒ］ＨＣＰＢ遺伝子配列を含むプラスミドを含有するクローンを選択したが、それはｐＭＣ57.2として知られている。実施例３６［Ａ２４８Ｎ，Ｇ２５１Ｔ，Ｄ２５３Ｋ］ＨＣＰＢ−（Ｈｉｓ）₆−ｃ−Ｍｙｃの大腸菌からのクローニングおよび発現大腸菌で［Ａ２４８Ｎ，Ｇ２５１Ｔ，Ｄ２５３Ｋ］ＨＣＰＢをクローニングし且つ発現する方法は、参考例８で記載された方法と極めて同様であった。［Ａ２４８Ｎ，Ｇ２５１Ｔ，Ｄ２５３Ｋ］ＨＣＰＢの遺伝子を実施例２で記載のように製造したが、ＰＣＲ部位特異的突然変異誘発のための出発物質は、ｐＩＣＩ1712 の代わりにプラスミドｐＭＣ46.4（実施例１４で記載された）中の［Ｇ２５１Ｔ，Ｄ２５３Ｋ］ＨＣＰＢ遺伝子であった。しかしながら、この場合、部位特異的突然変異誘発を遺伝子のＰＣＲ増幅中に用いて、成熟遺伝子中のアミノ酸２４８位のコドンをアラニンからアスパラギン（ＧＣＴ〜ＡＡＣ）に変更した、すなわち、Ｇ２４８Ｎ変更。２種類のＰＣＲ混合物を、参考例７および８で記載されたのと同様に製造した。最初の反応において、プライマーは、２２６４（配列番号：４８）および１０２４（配列番号：７６，配列番号：６１に代わって）であった。第二の反応において、プライマーは、6HIS9E10R1BS1（配列番号：４２）および１０２８（配列番号：７７，配列番号：６２に代わって）であった。両方の反応において、出発ＤＮＡはｐＭＣ46.4であった。ＰＣＲ、クローニング、発現および識別の方法は、実施例１４の場合と同様であった。配列決定結果から、必要な［Ａ２４８Ｎ，Ｇ２５１Ｔ，Ｄ２５３Ｋ］ＨＣＰＢ遺伝子配列を含むプラスミドを含有するクローンを選択したが、それはｐＭＣ59.3として知られている。実施例３７［Ａ２４８Ｓ，Ｇ２５１Ｔ，Ｄ２５３Ｋ］ＨＣＰＢ−（Ｈｉｓ）₆−ｃ−Ｍｙｃの大腸菌からのクローニングおよび発現大腸菌で［Ａ２４８Ｓ，Ｇ２５１Ｔ，Ｄ２５３Ｋ］ＨＣＰＢをクローニングし且つ発現する方法は、参考例８で記載された方法と極めて同様であった。［Ａ２４８Ｓ，Ｇ２５１Ｔ，Ｄ２５３Ｋ］ＨＣＰＢの遺伝子を実施例２で記載のように製造したが、ＰＣＲ部位特異的突然変異誘発のための出発物質は、ｐＩＣＩ1712 の代わりにプラスミドｐＭＣ46.4（実施例１４で記載された）中の［Ｇ２５１Ｔ，Ｄ２５３Ｋ］ＨＣＰＢ遺伝子であった。しかしながら、この場合、部位特異的突然変異誘発を遺伝子のＰＣＲ増幅中に用いて、成熟遺伝子中のアミノ酸２４８位のコドンをアラニンからセリン（ＧＣＴ〜ＴＴＣ）に変更した、すなわち、Ｇ２４８Ｓ変更。２種類のＰＣＲ混合物を、参考例７および８で記載されたのと同様に製造した。最初の反応において、プライマーは、２２６４（配列番号：４８）および１０２４（配列番号：７６，配列番号：６１に代わって）であった。第二の反応において、プライマーは、6HIS9E10R1BS1（配列番号：４２）および１０３０（配列番号：７８，配列番号：６２に代わって）であった。両方の反応において、出発ＤＮＡはｐＭＣ46.4であった。ＰＣＲ、クローニング、発現および識別の方法は、実施例１４の場合と同様であった。配列決定結果から、必要な［Ａ２４８Ｓ，Ｇ２５１Ｔ，Ｄ２５３Ｋ］ＨＣＰＢ遺伝子配列を含むプラスミドを含有するクローンを選択したが、それはｐＭＣ60.3として知られている。実施例３８ヒト化Ａ５Ｂ７Ｆ（ａｂ′）₂−［Ｇ２５１Ｔ，Ｄ２５３Ｋ］ＨＣＰＢ融合タンパク質の製造実施例１０で記載された手順を、Ｄ２５３ＫＨＣＰＢの配列を［Ｇ２５１Ｔ，Ｄ２５３Ｋ］ＨＣＰＢの配列で置き換えて繰返す。［Ｇ２５１Ｔ，Ｄ２５３Ｋ］ＨＣＰＢの配列は、実施例１４で記載されている。実施例３９［Ａ２４８Ｓ，Ｇ２５１Ｔ，Ｄ２５３Ｋ］ＨＣＰＢ−（Ｈｉｓ）₆−ｃ−Ｍｙｃの精製および酵素活性実施例３で記載された手順を、ＭＳＤ2230をＭＳＤ2812（ＭＳＤ1924 ｐＺＥＮ1921）で置き換えて繰返した。プラスミドｐＺＥＮ1921は、ｐＭＣ60.3としても知られている。プラスミドｐＭＣ60.3の製造は、実施例３７で記載されている。細胞ペーストの二つの試料を別々に処理した。貯蔵から得られた細胞ペーストの重量は、第一試料で５９３ｇおよび第二試料で５５８ｇであった。これらを緩衝液Ａ（それぞれ７５０ｍｌおよび７１０ｍｌ）中に再懸濁させて、浸透圧ショック産物を製造した。一連の二つのポテーターインヒビターカラム上に充填された、緩衝液Ｂで希釈後の浸透圧ショック産物の容量は、各試料について３ｌであった。最初の精製において、二つのカラムからプールされた画分は、１８〜８０（カラム１）および３０〜６３（カラム２）であった。第二の精製において、二つのカラムからプールされた画分は、２１〜７３（カラム１）および２３〜６８（カラム２）であった。組合せの精製は、２．６ｍｇ／ｍｌの［Ａ２４８Ｓ，Ｇ２５１Ｔ，Ｄ２５３Ｋ］ＨＣＰＢを４．４ｍｌの容量中において８３％の純度で与えた。Ｈｉｐｐ−Ｇｌｕ、Ｈｉｐｐ−ＡｓｐおよびＨｉｐｐ−Ａｒｇ基質に対する酵素活性は、実施例１７で記載のように測定された。Ｈｉｐｐ−Ｇｌｕに対するＫｍおよびｋｃａｔの測定は、実施例７で記載の通りであった。Ｋｍ（ｍＭ）１．１ｋｃａｔ（ｓ^-1）１９ｋｃａｔ／Ｋｍ（ｍＭ^-1ｓ^-1）１７．３実施例４０［Ｇ２５１Ｔ，Ｄ２５３Ｒ］ＨＣＰＢ−（Ｈｉｓ）₆−ｃ−Ｍｙｃの精製および酵素活性実施例３で記載された手順を、ＭＳＤ2230をＭＳＤ2803（ＭＳＤ1924 ｐＺＥＮ1907）で置き換えて繰返した。プラスミドｐＺＥＮ1907は、ｐＭＣ55.2としても知られている。プラスミドｐＭＣ55.2の製造は、実施例３４で記載されている。細胞ペーストの二つの試料を別々に処理した。貯蔵から得られた細胞ペーストの重量は、第一試料で６６０ｇおよび第二試料で４８４ｇであった。これらを緩衝液Ａ（それぞれ８００ｍｌおよび７００ｍｌ）中に再懸濁させて、浸透圧ショック産物を製造した。一連の二つのポテーターインヒビターカラム上に充填された、緩衝液Ｂで希釈後の浸透圧ショック産物の容量は、それぞれ１．６ｌおよび１．４ｌであった。最初の精製において、二つのカラムからプールされた画分は、２０〜７０（カラム１）および２０〜６５（カラム２）であった。第二の精製において、チャートレコーダーで与えられた溶離ピークプロフィールに対応する両方のカラムから単一画分を集めた。組合せの精製は、３．６ｍｇ／ｍｌの［Ｇ２５１Ｔ，Ｄ２５３Ｒ］ＨＣＰＢを１．４ｍｌの容量中において５０％の純度で与えた。Ｈｉｐｐ−Ｇｌｕ、Ｈｉｐｐ−ＡｓｐおよびＨｉｐｐ−Ａｒｇ基質に対する酵素活性は、実施例１７で記載のように測定された。Ｈｉｐｐ−ＧｌｕおよびＨｉｐｐ−Ａｓｐに対するＫｍおよびｋｃａｔの測定は、実施例７で記載の通りであった。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号ＦＩＣ０７Ｋ 16/30 Ｃ０７Ｋ 19/00 19/00 Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｎ 1/21 9/48 9/48 Ａ６１Ｋ 37/54 //(Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (31)優先権主張番号９６１２２９５．７ (32)優先日 1996年６月12日 (33)優先権主張国イギリス（ＧＢ） (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)，ＵＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者デイヴィーズ，デイヴィッド・ハウイギリス国チェシャーエスケイ10 ４ティージー，マックレスフィールド，オルダリー・パーク，ミアサイド，ゼネカ・ファーマシューティカルズ（番地なし) (72)発明者ダウェル，ロバート・イアンイギリス国チェシャーエスケイ10 ４ティージー，マックレスフィールド，オルダリー・パーク，ミアサイド，ゼネカ・ファーマシューティカルズ（番地なし) (72)発明者ヘナム，ジョン・フレデリックイギリス国チェシャーエスケイ10 ４ティージー，マックレスフィールド，オルダリー・パーク，ミアサイド，ゼネカ・ファーマシューティカルズ（番地なし) (72)発明者マーシャム，ピーター・ロバートイギリス国チェシャーエスケイ10 ４ティージー，マックレスフィールド，オルダリー・パーク，ミアサイド，ゼネカ・ファーマシューティカルズ（番地なし) (72)発明者スレイター，アンソニー・マイケルイギリス国チェシャーエスケイ10 ４ティージー，マックレスフィールド，オルダリー・パーク，ミアサイド，ゼネカ・ファーマシューティカルズ（番地なし) (72)発明者エンヌカン，ローラン・フランソワーズ・アンドレフランス共和国エフ−51064 ランス・セデックス，ゼネカ−ファルマ・ソシエテ・アノニム，サントル・ドゥ・ルシェルシュ，ゾーヌ・アンデュストリエル・シュド −エスト，ボアット・ポスタル 401

Claims

【特許請求の範囲】１．ヒトにおいて実質的に非免疫原性である結合体であって、腫瘍関連抗原と結合することができる標的到達（targeting）部分を含み、該標的到達部分が、プロドラッグを抗腫瘍性薬に変換することができるカルボキシペフチダーゼＢ（ＣＰＢ）酵素の突然変異型に対して結合していて、ここにおいて、該プロドラッグは、ヒトにおいて天然の非突然変異酵素によって抗腫瘍性薬にほとんど変換されない上記結合体。２．標的到達部分が抗体である請求項１に記載の結合体。３．抗体がＦ（ａｂ′）₂抗体フラグメントである請求項２に記載の結合体。４．酵素が、相補的極性を有するプロドラッグを代謝回転できるようなその活性部位の極性変化を含むように突然変異している請求項１〜３のいずれか１項に記載の結合体。５．酵素が、次の膵臓ヒトＣＰＢ突然変異体、Ａｒｇ、Ａｓｎ、ＧｌｎまたはＬｙｓのいずれか一つによって置換されたアミノ酸Ａｓｐ２５３を、場合により、Ａｒｇ、ＬｙｓまたはＡｓｎのいずれか一つによって置換された天然のアミノ酸Ｇｌｎ５４；Ｖａｌ、Ｌｅｕ、ＩｌｅまたはＡｌａのいずれか一つによって置換された天然のアミノ酸Ａｓｐ１４５；ＳｅｒまたはＴｈｒのいずれか一つによって置換された天然のアミノ酸Ｉｌｅ２０１；Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ｈｉｓ、ＬｙｓまたはＡｒｇのいずれか一つによって置換された天然のアミノ酸Ｓｅｒ２０５；Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、ＡＳｎ、Ｇｌｎ、Ｌｙｓ、ＡｒｇまたはＨｉｓのいずれか一つによって置換された天然のアミノ酸Ｉｌｅ２４５；Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ、ＳｅｒまたはＴｈｒのいずれか一つによって置換された天然のアミノ酸Ａｌａ２４８；Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ｓｅｒ、Ｇｌｎ、Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｖａｌ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ａｌａまたはノルロイシンのいずれか一つによって置換された天然のアミノ酸Ｇｌｙ２５１；およびＳｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｌａ、Ｖａｌ、ＬｅｕまたはＩｌｅのいずれか一つによって置換された天然のアミノ酸Ｃｙｓ２８８から選択されるいずれか一つまたはそれ以上のアミノ酸置換との組合せで有する膵臓ヒトＣＰＢのいずれか一つである請求項４に記載の結合体。６．酵素が、次の膵臓ヒトＣＰＢ突然変異体、ＡｒｇまたはＬｙｓのいずれか一つによって置換された天然アミノ酸Ａｓｐ２５３およびＴｈｒ、Ａｓｎ、Ｓｅｒ、Ｇｌｎ、ＬｙｓまたはＶａｌのいずれか一つによって置換された天然のアミノ酸Ｇｌｙ２５１を、場合により、Ａｒｇによって置換された天然のアミノ酸Ｇｌｎ５４；Ａｌａによって置換された天然のアミノ酸Ａｓｐ１４５；Ｓｅｒによって置換された天然のアミノ酸Ｉｌｅ２０１；Ａｓｎによって置換された天然のアミノ酸Ｓｅｒ２０５；Ｓｅｒ、ＡｌａまたはＨｉｓのいずれか一つによって置換された天然のアミノ酸Ｉｌｅ２４５；Ｈｉｓ、ＳｅｒまたはＡｓｎのいずれか一つによって置換された天然のアミノ酸Ａｌａ２４８；およびＳｅｒまたはＡｌａのいずれか一つによって置換された天然のアミノ酸Ｃｙｓ２８８から選択されるいずれか一つまたはそれ以上のアミノ酸置換との組合せで有する膵臓ヒトＣＰＢのいずれか一つである請求項４に記載の結合体。７．酵素が、次の膵臓ヒトＣＰＢ突然変異体、ＡｒｇまたはＬｙｓのいずれか一つによって置換された天然アミノ酸Ａｓｐ２５３およびＴｈｒ、ＡｓｎまたはＳｅｒのいずれか一つによって置換された天然のアミノ酸Ｇｌｙ２５１を、場合により、Ａｒｇによって置換された天然のアミノ酸Ｇｌｎ５４；Ａｌａによって置換された天然のアミノ酸Ａｓｐ１４５；Ｓｅｒによって置換された天然のアミノ酸Ｉｌｅ２０１；グのいずれか一つを含む請求項９または１０のいずれか１項に記載の二成分系。１２．次の化合物、（ａ）Ｎ−（４−｛４−［ビス−（２−クロロエチル）−アミノ］−３−メチルフェノキシ｝−ベンゾイル）−Ｌ−アラニン；（ｂ）Ｎ−［Ｎ−（４−｛４−［ビス−（２−クロロエチル）−アミノ］−３ −メチルフェノキシ｝−ベンゾイル）−Ｌ−アラニン］−Ｌ−グルタミン酸；（ｃ）Ｎ−（４−｛４−［ビス−（２−クロロエチル）−アミノ］−フェノキシ｝−ベンゾイル）−Ｌ−アラニン；若しくは（ｄ）Ｎ−［Ｎ−（４−｛４−［ビス−（２−クロロエチル）−アミノ］−フェノキシ｝−ベンゾイル）−Ｌ−アラニン］−Ｌ−グルタミン酸またはその薬学的に許容しうる塩のいずれか一つの化合物。１３．請求項１または請求項４〜８のいずれか１項に記載の突然変異ＣＰＢ酵素。１４．請求項１３に記載の突然変異ＣＰＢ酵素をコードしうるポリヌクレオチド配列。１５．請求項１４に記載のポリヌクレオチド配列を含むベクター。１６．請求項１４に記載のポリヌクレオチド配列を含む宿主細胞。１７．請求項１３に記載の突然変異ＣＰＢ酵素を製造する方法であって、請求項１６に記載の宿主細胞から該酵素を発現させ、そして場合により、該酵素を少なくとも部分的に精製することを含む上記方法。１８．請求項９〜１０のいずれかに記載の第一成分および薬学的に許容しうる担体または希釈剤を含む薬剤組成物。１９．請求項９または１１のいずれかに記載の第二成分および薬学的に許容しうる担体または希釈剤を含む薬剤組成物。２０．結合体を製造する方法であって、請求項１〜３のいずれか１項に記載の腫瘍関連抗原と結合することができる標的到達部分およびプロドラッグを抗腫瘍性薬に変換することができる酵素を結合させることを含み、ここにおいて、該酵素が、請求項１または請求項４〜８のいずれか１項に記載の宿主ＣＰＢ酵素の突然変異型である上記方法。２１．the National Collection of Industrial and Marine Bacteria（ＮＣＩＭＢ）で寄託番号ＮＣＩＭＢ40694として寄託されるプラスミドｐＣＧ330。２２．２４３位でコードされたシステイン残基が存在する１０９位から前方の配列番号：３９で定義された成熟ヒト膵臓カルボキシペプチダーゼＢまたはその突然変異体をコードしているヌクレオチド配列。２３．２４３位でコードされたシステイン残基が存在するヒト膵臓カルボキシペプチダーゼＢまたはその突然変異体を製造する方法であって、２４３位でコードされたシステイン残基が存在する１０９位から前方の配列番号：３９で定義された成熟ヒト膵臓カルボキシペプチダーゼＢまたはその突然変異体をコードしているヌクレオチド配列の宿主細胞中での発現を含む上記方法。２４．宿主中の腫瘍細胞を処置する方法であって、該宿主に対する有効量の第一成分の投与、該第一成分を全身循環から実質的に除去させること、および有効量の第二成分を投与することを含み、ここにおいて、該成分が、請求項９〜１１のいずれか１項に記載の系を形成する上記方法。