JPH11511336A

JPH11511336A - 真核細胞に搬入された外来ｄｎａの改良組込み

Info

Publication number: JPH11511336A
Application number: JP9513108A
Authority: JP
Inventors: アンサン，ジュヌビエーブ; チルトン，メアリー−デル
Original assignee: ノバルティス・アクチエンゲゼルシャフト
Priority date: 1995-09-25
Filing date: 1996-09-12
Publication date: 1999-10-05
Also published as: BR9610738A; WO1997012046A1; CN1197482A; HUP9900451A2; EA001039B1; AU7128596A; CA2230966C; KR19990063713A; MX9802312A; DE69635955D1; ATE321142T1; EA199800324A1; PL191113B1; EP0853675B1; PL326087A1; DE69635955T2; CA2230966A1; KR100477413B1; AU707948B2; HUP9900451A3

Abstract

(57)【要約】本発明は、真核細胞、特に植物細胞、のゲノム内に無傷形態で外来ＤＮＡフラグメントを安定に組込むための改良法を提供する。この方法は、形質転換の標的となる真核細胞への外来ＤＮＡの組込みを促進する１またはそれ以上のタンパク質と共に外来ＤＮＡを提供することを含んでなり、そのタンパク質は、真核細胞中で発現する能力のあるキメラ遺伝子または形質転換可能ＲＮＡの形態で提供される。この方法は、アグロバクテリウムから得られた組込み促進タンパク質を用いて、無傷形態でＴ−ＤＮＡ境界と結合させた外来ＤＮＡフラグメントの安定な組込みを達成するために、特に、植物細胞に適用される。トランスジェニック培養物、組織、および生物体全体、特にトランスジェニック植物は、本発明の方法により形質転換させた細胞から再生させることができる。

Description

【発明の詳細な説明】真核細胞に搬入された外来ＤＮＡの改良組込み本発明は、一般に、外来ＤＮＡによる真核細胞、特に、植物細胞の形質転換およびかかる細胞からのトランスジェニック生物、組織または培養物の産出に関する。トランスジェニック植物の産生に組換えＤＮＡ技術を適用することから生じる広範囲の利益を利用するために、外来ＤＮＡ分子を植物細胞へ導入する幾つかの方法が開発されている。これらの方法は、植物細胞へのアグロバクテリウム介在Ｔ−ＤＮＡ導入などの修飾生物学的システムおよび電気穿孔法、マイクロインジェクション、リン酸カルシウムまたはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）介在ＤＮＡ摂取または細胞融合およびマイクロプロジェクタイル衝撃(microprojectile bombardment)(総括的およびある程度の概説については、“Plant Genetic Tran sformation and Gene Expression,A Laboratory Manual”、Draper,J.等編、Bla ckwell Scientific Publications(1988)出版、参照；Potrykus等、“Direct Gen e Transfer:State of the Art and Future Potential”、Plant Mol.Biol.Rep.3 :117-128(1985)も参照)などの物理的非生物学的システムがある。開発された方法は、外来ＤＮＡによる広範囲の植物種の安定な形質転換を可能にした。特に、物理的技術の発展は、生物学的システムに課せられた明らかな宿主範囲制限を克服してきた。しかしながら、これらの物理的方法に共通の不足点は、それらはいずれも搬入（delivered）ＤＮＡを植物細胞ゲノムへ規則正しく組込む手段を備えていないということである。そのため、これらの方法は、あまり理解されていないメカニズムによる搬入ＤＮＡの非制御組込みに左右されなければならず、外来ＤＮＡが普通、植物細胞ゲノムのシングル部位でランダムフラグメントの複数コピーとして組み込まれるということが起こる。外来ＤＮＡの植物細胞への物理的導入の結果起こる安定な形質転換事象の予測性を改良することにより、導入遺伝子の安定な発現を示す遺伝子的に安定な形質転換植物を産生するこれらのプロセスの有用性および全効率が顕著に向上することになる。この目的を達成するために取られた１つの手法は、生物学的システムにおける形質転換および／または組込みを促進するタンパク質を非生物学的搬入技術と組み合わせることであった。所望の効果を達成するためには、形質転換標的細胞への搬入の前にタンパク質自身を外来ＤＮＡ分子と結合させて、そのタンパク質が搬入される生物学的システムをできるだけまねる必要があると考えられてきた（WO95/054 71およびWO95/34647）。真核細胞外で産生され、外来ＤＮＡと組み合わせて搬入される場合に、外来ＤＮＡによる真核細胞の安定な組込み型形質転換を促進する多くのタンパク質が知られている。本発明は、かかるタンパク質は自然に安定な組込み型形質転換を促進するので、それらを真核細胞外で産生させたり、外来ＤＮＡと結合させる必要はないという発見に基づくものである。更に、かかるタンパク質をコードする翻訳可能ＲＮＡまたはキメラ遺伝子の真核形質転換標的細胞への搬入もまた、同時搬入外来ＤＮＡの安定な組込み型形質転換を効果的に促進できる。本発明の主たる目的の１つは、外来ＤＮＡで真核細胞を形質転換させることにより対象のＤＮＡを安定に組込む改良法を提供することである。この改良法は、一般に、形質転換の標的となる真核細胞に、組込みを促進する１またはそれ以上のタンパク質を産生する能力のある少なくとも１つのキメラ遺伝子またはＲＮＡを組込みたい外来ＤＮＡと組み合わせて提供することを含む。本発明の方法によれば、真核細胞を（ａ）Ｔ−ＤＮＡ境界配列と結合させた（bounded）対象のＤＮＡからなるＤＮＡフラグメント；および、（ｂ）Ｔ−ＤＮＡ境界配列と結合させたＤＮＡの組込みを促進する１またはそれ以上のタンパク質を該真核細胞中で発現する能力のある少なくとも１つのキメラＤＮＡまたはＲＮＡ分子、で形質転換させる。本発明に従う組込みの標的となる対象の外来ＤＮＡフラグメントは、当業者が無傷形態で真核細胞ゲノムへ組込むことを望むあらゆるＤＮＡフラグメント、例えば、植物細胞または得られた植物体または植物細胞培養物において対象となる特定の生物学的活性ＲＮＡ（例えば、アンチセンスＲＮＡまたはリボザイム）またはタンパク質を発現するように設計したキメラ遺伝子であり得る。該外来ＤＮＡの組込みを促進する能力のあるタンパク質は、特に、Ｔ−ＤＮＡ境界配列と結合させた対象のＤＮＡの真核細胞ゲノムへの組込みを目的として使用されるアグロバクテリウムＴiまたはＲiプラスミドのビルレンス（virulence 、vir）領域によりコードされるタンパク質である。特に、本発明は、非生物学的搬入法によるアグロバクテリウム・ツメファシエンス介在Ｔ−ＤＮＡ導入および組込みの陽性特性を兼ね備えた外来ＤＮＡにより植物細胞を安定に形質転換する改良法を提供する。この改良法は、Ｔ−ＤＮＡ境界配列と結合させた、植物細胞ゲノムへ組込みたい外来ＤＮＡフラグメントを、植物細胞中で外来ＤＮＡの組込みを促進するアグロバクテリウム由来のタンパク質を発現する能力のある少なくとも１つのキメラ遺伝子またはＲＮＡと共に、植物細胞に提供することを含む。本発明により提供されるアグロバクテリウム由来のタンパク質は、特に、ＶirＤ１、ＶirＤ２、ＶirＣ１、ＶirＣ２またはＶirＥ２に相当する。好ましくは、ＶirＤ２とＶirＤ１、ＶirＣ１、ＶirＣ２、ＶirＥ２のいずれかの組み合わせ、またはそれらの副組み合わせを使用する。最も好ましくは、ＶirＤ２単独、ＶirＤ１とＶirＤ２の組み合わせ、またはＶirＤ１、Ｖ irＤ２およびＶirＥ２の組み合わせの使用である。アグロバクテリウム由来のタンパク質が植物細胞中で発現することにより、予測可能な終点を有する無傷フラグメントとして外来ＤＮＡが組込まれることになる。本発明によれば、Ｔ−ＤＮＡ境界配列と結合させた外来ＤＮＡフラグメントを、電気穿孔法、マイクロインジェクション、誘導摂取およびマイクロプロジェクタイル衝撃などの非生物学的手段により植物細胞へ搬入できる。本発明によれば、アグロバクテリウム由来のタンパク質もまた、ＤＮＡ（植物細胞中で発現可能なキメラ遺伝子）またはＲＮＡ（植物細胞中で翻訳可能なＲＮＡ）の形態で非生物学的手段により植物細胞へ搬入できる。外来ＤＮＡフラグメントおよびＤＮＡまたはＲＮＡ形態のアグロバクテリウム由来のタンパク質は、外来ＤＮＡを搬入した後および外来ＤＮＡを組込む前に、アグロバクテリウム由来のタンパク質が植物細胞中に存在するように、一時的に搬入する。これは、好ましくは、これらの成分の一段階での同時搬入により達成できる。あるいは、形質転換の標的となる植物細胞は、アグロバクテリウム由来のタンパク質を発現する能力のあるキメラ遺伝子で予め安定に形質転換させておいた植物または細胞培養物から得ることもできる。本発明のその他の態様では、別のＤＮＡフラグメントで安定に形質転換させた植物細胞を再生させて、所望の導入遺伝子を安定に発現し、かつその導入遺伝子の安定な発現をメンデル特性として受け継ぐ後代へと継代する稔性トランスジェニック植物を生産する。下記の定義は本発明の理解を助けることを意図する：組込み：本明細書で使用する“組込み”は、真核細胞に搬入される外来ＤＮＡ分子が真核細胞のゲノムＤＮＡへ安定に取り込まれるプロセスを総括的に表すために使用する。マイクロプロジェクタイル衝撃：本明細書で使用する“マイクロプロジェクタイル衝撃”は、マイクロプロジェクタイル上の核酸をコーティングし、コーティング化マイクロプロジェクタイルを生細胞内へと打ち込むことにより、ＤＮＡおよびＲＮＡを含む核酸を生細胞へ搬入する一般的方法を表すために使用する(例えば、実施例１−４、米国特許第5,036,006号；WO91/02071（植物およびその細胞の形質転換へのこのアプローチの応用を記載している）参照；また、米国特許第5,302,523号；Koziel等、Biotechnology 11:194-200(1993)(粒子衝撃によるトウモロコシのElite近交系の形質転換を記載している)；Vasil等、Biotechnology 11:1553-1558(1993)；Weeks等、Plant Physiol.102:1077-1084(1993)；Tanaka, T.等、“Successful expression in pollen of various plant species of in v itro synthesized mRNA introduced mRNA introduced by particle bombardment ”,Plant Mol.Biol.28:337-341(1995)；Vasil等、Biotechnology 10:667-674(19 92)；R.Walker.L.等、“GUS Messenger RNA Delivery and Expression in Plant Cells via Particle Bombardment”,In Vitro Cell Dev．Biol.26:70A-#218(19 90)；Iida,A.等、Appl.Microbiol.Biotechnol.33:560-563(1990)；Gordon-Kamm 等、Plant Cell 2:603-618(1990)；Fromm等、Biotechnology 8:833-839(1990)； Mori kawa,H.等、Appl.Microbiol.Biotechnol.31:320-322(1989)参照)。エアゾールビームインジェクション：本明細書で使用する“エアゾールビームインジェクション”は、核酸を生細胞へエアゾールビームの形態で物理的に搬入する方法を表すために使用する(例えば、米国特許第5,240,842号参照)。電気穿孔法：本明細書で使用する“電気穿孔法”は、細胞を生体分子の存在下で電気的衝撃または放電に付すことにより、生体分子、特にＤＮＡおよびＲＮＡなどの核酸を生細胞へ搬入する方法を表すために使用する（例えば、米国特許第 5,231,019号；“Plant Genetic Transformation and Gene Expression,A Labora tory Manual”Draper,J.等編、Blackwell Scientific Publications(1988)出版の第３.３章；Saul,M.W.等、“Direct DNA Transfer to Protoplasts With and Without Electroporation”，Plant Molecular Biology Manual A1:1-16(1988) ；Okada,K.等、“Introduction of Functional RNA into Plant Protoplasts by Electroporation”，Plant Cell Physiol.27(4):619-626(1986)；Shillito,R.D .等、“High Efficiency Direct Gene Transfer to Plants”，Biotechnology 3 :1099-1103(1985)；EP-292 435(チバ−ガイギー)、EP-392 225（チバ−ガイギー）およびWO93/07278（チバ−ガイギー）参照）。マイクロインジェクション：本明細書で使用する“マイクロインジェクション ”は、生体物質、特に、ＤＮＡまたはＲＮＡを直接、生細胞へと機械的に注入する方法を表すために使用する(例えば、“Plant Genetic Transformation and Ge ne Expression,A Laboratory Manual”、前掲の３.４章；Graessmann,M.等、“M icroinjection of Tissue Culture Cells”、Methods in Enzymology 101:482-4 92(1983)参照)。誘導摂取：本明細書で使用する“誘導摂取”は、生体物質、特に核酸の生細胞による摂取を誘導する方法を総括的に表すために使用する（例えば、米国特許第 5,036,006号の背景の章参照）。このような方法には、特に、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）介在摂取（例えば、“Plant Genetic Transformation and Gen e Expression,A Laboratory Manual”Draper,J.等編、Blackwell Scientific Pu blications(1988)出版の第３.２章；Saul,M.W.等、“Direct DNA Transfer to P ro toplasts With and Without Electroporation”，前掲；Negrutiu等、Plant Mol . Biol 8：363-373(1987)）および熱ショック処理（米国特許第5,231,019号参照）がある。ＶirＤ：本明細書で使用した“ＶirＤ”は、Ｔ−ＤＮＡ導入に必要な機能を与えるＴiまたはＲiプラスミドのビルレンス(Ｖir)Ｄオペロンに由来する遺伝子またはタンパク質を表すために使用する(概説は、Zambryski P.C.,“Chronicles from the Agrobacterium-plant cell DNA transfer story”，Ann.Rev.Plant P hysiol.Plant Mol.Biol.43：465-490(1992)参照)。この領域由来の特定の遺伝子および対応するタンパク質は、ＶirＤオペロン上のそれらが生じるところの番号により示す。例えば、ビルレンスＤオペロンの第１遺伝子は、“ＶirＤ１”と表し、第２遺伝子は、“ＶirＤ２”と表す。ビルレンス領域ＤＮＡは、アグロバクテリウム介在Ｔ−ＤＮＡ導入の際、通常、植物細胞へ導入されることも植物ゲノム内へ組込まれることもない。更に、vi r遺伝子産物は、細菌ＴiまたはＲiプラスミド由来のＴ−ＤＮＡエレメントを植物ゲノムへ移動させるようにトランスで自然に作用する。Ｔ−領域とvir領域は、機能を損なうことなく、異なるプラスミド上で分離することができる(De Fram ond,A.J.等、Bio/Technology 1:262-269(1983)；Hoekema等、Nature 303:179-18 0(1983)；Bevan,M．Nucleic Acids Res.12:8711-8721(1984))。ＶirＤ遺伝子座の５'半分によりコードされる２つのポリペプチドは、アグロバクテリウムから植物細胞：ＶirＤ１およびＶirＤ２へのＴ−ＤＮＡ導入に対するＤＮＡプロセッシングの開始において重要な役割を果す。ＶirＤ１およびＶir Ｄ２タンパク質は、ＶirＤオペロンの第１遺伝子および第２遺伝子によりそれぞれコードされいる(Stachel S.E.& Nester E.W.“The genetic and transcriptio nal organization of the vir region of the A6 Ti plasmid of Agrobacterium tumefaciens.EMBO J.5:1445-1454(1986))。遺伝子研究により、Ｔ−鎖形成がＶ irＤオペロン産物により媒介されることが示された(Yanofsky等、Cell 47:471-4 77(1986)；Stachel等、EMBO J.6:857-863(1987))。特に、ＶirＤオペロンの第１および第２遺伝子は、Ｔ−ＤＮＡ境界切断に必要なポリペプチドをコードすることが示されている(De Vos & Zambryski,Mol.Plant Microbe Inter.2:43-52(19 89)；Filichkin & Gelvin,Mol Microbiol 8:915-926(1993)；Jayaswal等、J.Bac teriol.169；5035-5045(1987)；Porter等、Nucleic Acids Res.15:7503-7515(19 87)；Stachel等、EMBO J．6:857-863(1987))。この活性は、Ｔ−ＤＮＡ境界配列による一本鎖切れ目（ニック）の生成をもたらす(Stachel S.E.等、“Generatio n of single-stranded T-DNA molecules during the initial stage of T-DNA t ransfer from Agrobacterium tumefaciens to plant cells”Nature(London)322 :706-712(198)；Yanofsky等、Cell 47:471-477(1986)；Wang等、Science 235:58 7-591(1987)；Albright等、J.Bacteriol.169:1046-1055(1987))。ＶirＤ１／Ｖi rＤ２は、Ｔ−ＤＮＡ境界配列を第３および第４塩基間で切断する。一旦これらのニック化分子が作られれば、Ｔ−ＤＮＡのボトム鎖（Ｔ−鎖）の遊離の鎖状ss ＤＮＡコピーが観測される(Stachel等、Nature(London)322:706-712(1986)；Sta chel等、EMBO J.6:857-863(1987))。ＶirＤ２は、Ｔ−ＤＮＡの５'末端に共有結合した状態にある(概説は、Zupan J.R.& Zambryski,P．“Transfer of T-DNA fr om Agrobacterium to the plant cell”．Plant Physiol.107:1041-1047(1995) 参照)。ＶirＤ２のＣ−末端５０％を失ったvirＤ２変異体の研究により、Ｔ−ＤＮＡ境界をニックするために必要なのはＶirＤ２のＮ−末端５０％のみであることが示された。しかしながら、この変異体は感染植物上の腫瘍を誘引することができない。よって、このＣ−末端は、植物細胞におけるＴ−ＤＮＡの導入にある役割を持つようである(Zambryski P.C.,“Chronicles from the Agrobacterium-plan t cell DNA transfer story”Ann.Rev.Plant Physiol．Plant Mol.Biol.43:465- 490(1992))。このドメインは、二裂（bipartite）核局在化シグナル(ＮＬＳ)を含有する(Howard等、Cell 68:109-118(1992))。ＮＬＳ配列の生物学的能力は、二裂ＮＬＳの２つの基本的構造がＶirＤ２から欠失した場合にアグロバクテリウムが発癌性を劇的に低減するという観測により確認された(Shurvinton,Proc.Nat l.Acad.Sci.(USA)89.11837-11841(1992))。ＶirＤ２単独はインビトロで一本鎖ＤＮＡ上の部位特異的ＤＮＡ切断−連結反応を行使し、これはこのタンパク質がＤＮＡ切断に必要な触媒活性を有することを示すものである(Pansegrau等、Proc.Natl.Acad.Sci.90:11538-11542(1993))。 pＴiＣ５８のＶirＤ１およびＶirＤ２は、インビトロでのＴ−境界特異的切断を触媒するのに十分であることが、Scheiffle等、J.Biol.Chemistry 270:1269-127 6(1995)に報告されている(それ以外にJasper等、Proc.Natl.Acad.Sci.91:694-69 8(1994)参照)。Ｉ型のトポイソメラーゼ活性は、VirＤ１−含有抽出物について報告された(Gh ai & Das,Proc.Natl.Acad.Sci.86:319-3113(1989))。この活性は、ＶirＤ１の特徴であり、ＶirＤ２による切断に備えて、ＤＮＡを弛緩するのに必要であると提案された。しかしながら、より高度に精製されたＶirＤ１タンパク質はトポイソメラーゼ活性を示さなかった(Scheiffle等、J.Biol.Chemistry 270:1269-1276(1 995))。ＶirＤ２の配列分析により、オクトピン、ノパリンまたはリゾゲン型プラスミドのいずれかを持つアグロバクテリウムの各株間でＮ末端が８５％保存されることが明らかとなった(Hirayama等、Mol.Gen.Genet.213:229-237(1988)；Wang等、 J.Bacteriol.172:4432-4440(1990)；Yanofsky等、Cell 47:471-477(1986))。Ｃ −末端は２５％だけ保存されるが、最大の類似性は、ＮＬＳシグナルを持つ最後３０アミノ酸にある(Zambryski，1992に概説)。ＶirＥ：本明細書で使用する“ＶirＥ”は、Ｔ−ＤＮＡ導入に必要な機能を与えるＴiおよびＲiプラスミドのビルレンス(Ｖir)Ｅオペロンに由来する遺伝子または対応するタンパク質を表すために使用する。用語“ＶirＥ２”は、本明細書では、ＶirＥオペロン上のＶirＥ２遺伝子の産物として同定された一本鎖ＤＮＡ (ssＤＮＡ)結合タンパク質を表すために使用する(Gielt,C.等、Proc.Natl.Acad. Sci.84:9006-9010(1987)；Citovsky等、Science 240:501-504(1988))。ＶirＥ２は、Ｔ−鎖をその長さに沿ってコーティングすると考えられる。このタンパク質と一本鎖ＤＮＡとの相互作用は非特異的である。ノパリンＶirＥ２タンパク質(H irooka等、J.Bacteriol.169:1529-1536(1987))およびオクトピンＶirＥ２タンパク質(Winans等、Nucleic Acids Rex.15:825-837(1987))は、核局在化シグナルを含有する。ＶirＥ２タンパク質は、Ｔ−複合体の主要部分であると考えられており、核への輸送を援助し得る(概説は、Zupan & Zambryski,Plant Physiol.107 :1041-1047(1995))。virＥ２遺伝子を発現するトランスジェニック植物は、アグロバクテリウムのＶirＥ変異体を補足でき、ＶirＥ２タンパク質が植物細胞において重要な役割を果たすことを証明している(概説は、Zupan & Zambryski,Plant Physiol.107:1041-1047(1995)参照)。ＶirＣ：本明細書で使用する“ＶirＣ”は、２つのポリペプチド、ＶirＣ１およびＶirＣ２をコードするＴiおよびＲiプラスミドのＶirＣ遺伝子座を表すために使用する(Yanofsky M.F.& Nester E.W.“Molecular characterization of a h ost-range-determining locus from Agrobacterium tumefaciens”，J.Bacterio l.168:237-243(1986))。この遺伝子座は、アグロバクテリウムにおけるＴ−ＤＮＡ境界ニック形成を増強することが示されている(Toro N.等、“Role of the ov erdrive sequence in T-DNA border cleavage in Agrobacterium”，Proc.Natl. Acad.Sci.(USA)85(22):8558-8562(1988))。ＶirＣもまた、ＶirＤ１およびＶir Ｄ２遺伝子の産物が制限されている場合に異種Ｅ.coli系にてＴ−鎖産生を増強することが示されている(De Vos G．& Zambryski P.“Expression of Agrobacte rium nopaline specfic VirD1,VirD2 and VirC1 and their requirement for T- strand production in E.coli.”Molec.Plant.Microbe Inter.2:42-52(1989))。ＶirＣ１は、ＤＮＡアフィニティー・クロマトグラフィーによりオクトピン・オーバードライブ配列（overdrive sequences)と相互作用することが示されているが、ＶirＣ１の正確な機能は不明である。それは、ＶirＤ１およびＶirＤ２と、または境界反復配列（リピート）および／またはオーバードライブ配列と結合して、ニック形成およびＴ−鎖産生を促進することもある(Toro N等、“The Agrob acterium tumefaciens virC1 gene product binds to overdrive,a T-DNA trans fer enhancer”J.Bacteriol.171:6845-6849(1989))。Ｔ−ＤＮＡ境界：本明細書で使用する“Ｔ−ＤＮＡ境界”は、約２５bpの不完全直列反復ＤＮＡ配列を表すことを意図し、ＤＮＡフラグメントの両端にそれが存在することにより、そのフラグメントがＴ−ＤＮＡとして認識され、アグロバクテリウムタンパク質による作用を受ける。Ｔ−ＤＮＡのいずれかの末端に生じるＴ−ＤＮＡ境界は、慣用的に“左”および“右”と表される。右境界のコンセンサス配列は、５'−ＧＮＮＴＧＮＣＡＧＧＡＴＡＴＡＴＮＮＮＮＮＮＧＴＮＡＮ−３'（配列番号１）であり、左境界のコンセンサス配列は、５'−ＧＧＴＧＧＣＡＧＧＡＴＡＴＡＴＮＮＮＮＮＮＴＧＴＡＡＡ−３'（配列番号２）である(Jo uanin等、Plant Mol.Biol.12:75-85(1989))。これらの境界間のいずれのＤＮＡもアグロバクテリウムから植物細胞へと移行する(概説は、Zambryski P.C.,“Ch ronicles from the Agrobacterium-plant cell DNA transfer story”,Ann.Rev. Plant Physiol.Plant Mol．Biol.43:465-490(1992))。様々な形質転換植物系列のＴ−ＤＮＡ含量の研究により、Ｔ−ＤＮＡの植物ゲノムへの組込みは、しばしば（右境界の場合）これらの境界反復配列の位置で、または（左境界の場合）その近くで起こることが明らかとなった(Slightom等、E MBO J.4:3069-3077(1985)；Gheysen等、Genes & Dev.5:287-297(1991)；Mayerho fer等、EMBO J.10:697-704(1991)；Ohta等、Plant J.7:157-164(1995)；Koncz等、Proc.Natl.Acad.Sci.86:8467-8471(1989))。左境界と右境界との構造的類似性にもかかわらず、境界機能の研究は、Ｔ−ＤＮＡ境界は別々に利用されることを示している。右境界配列の欠失または逆位は、Ｔ−ＤＮＡ導入の殆ど完全な損失をもたらすのに対し、左境界反復配列の欠失は、殆ど全く影響がない(Shaw C.H.等、“The right hand copy of the nopalin e Ti plasmid 25 bp repeat is required for tumor formation”Nucleic Acids Res.12:6031-6041(1984)；Jen G.C.& Chilton M-D,“The right border region of pTiT37 T-DNA is intrinsically more active than the left border in pr omoting T-DNA transformation”Proc.Natl.Acad.Sci(USA)83:3895-3899(1986)) 。遺伝子分析は、Ｔ−ＤＮＡ導入が極性であり、境界反復配列の配向により決定される極性をもつことを示している(Wang等、Cell 38:455-462(1984)；Peralta and Ream,Proc.Natl.Acad.Sci.82:5112-5116(1985))。これは、恐らく、Ｔ−鎖が右から左方向に産生されるという事実に起因する(Albright等、“Processing of the T-DNA of Agrobacterium tumefaciens generates border nicks and lin ear,si ngle-stranded T-DNA”J.Bacteriol.16,1046-1055(1987))。Ｔ−ＤＮＡ境界の配列情況は、その活性に大きく影響を与える。右境界周囲の配列は極性ＤＮＡ導入を増強し、左境界周囲の配列は極性ＤＮＡ導入を減弱する (Wang K.等、“Sequence context of the T-DNA border repeat element determ ins its relative activity during T-DNA transfer to plant cells”Mol.Gen. Genet.210：338-346(1987))。“オーバードライブ”と呼ばれる２４bpのシス活性配列は、オクトピンプラスミドの右境界の隣に存在する(Peralta等、EMBO J.5 :1137-1142(1986);Shurviton & Ream，J.Bacteriol.173:5558-5563(1991))。オーバードライブは、境界から数千塩基対離れた位置にある場合でさえＴ−ＤＮＡ導入を刺激する(Van Haaren M.J.J.等、“Overdrive is a T-region transfer e nhancer which stimulates T-strand production in A.tumefaciens”Nucleic A cids Res.15:8983-8997(1987))。しかしながら、それは、独自にＴ−ＤＮＡ導入を媒介することはできない（Peralta,E.G.等、“overdrive”，a T-DNA transmi ssion enhancer on the Agrobacterium tumefaciens tumor-inducing plasmid” EMBO J.5:1137-1142(1986)；Van Haaren M.J.J.等、“Functional analysis of the Agrobacterium tumefaciens octopine Ti-plasmid left and right T-regi on border fragment”Plant Mol．Biol.8:95-104(1987)）。このオーバードライブ配列は、元々オクトピンＴiプラスミドＴＬ−ＤＮＡ右境界反復配列の右側の領域に位置していた。同様の配列がオクトピンpＴi ＴＲ−領域の、およびアグロピンpＲi ＴＬ−およびＴＲ−領域の右境界反復配列の隣に存在する(Slightom 等、“Nucleotide sequence analysis of TL-DNA Agrobacterium thizogenes ty pe plasmid．Identification of open reading frames”J.Biol.Dhem.261:108-1 21(1986)；Jouanin等、“Analysis of TR-DNA/plant junctions in the genome of a Convolvulus arvensis clone transformed with Agrobacterium rhizogene s strain A4”Plant Mol.Biol.12:75-85(1989))。右境界近くの配列の比較により、各右境界反復配列の右とは異なる間隔で現れるコア配列（５'−ＴＧＴＴＴＧＴＴ−３'）と呼ばれる８bpの領域が明らかとなった。マンノピン型 pＲi８１９６Ｔ−ＤＮＡ右境界は、オーバードライブ配列に関連するどの配列も含有しないが、異なる８bp配列（５'−ＡＴＴＡＧＴＴＣ−３'）を６回繰り返して含有する(Han sen G.等、“Agrobacterium rhizogenes pRi8196 T-DNA：Mapping and DNA sequ ence of functions involved in manopine synthesis and hairy root differen tiation”Proc.Natl.Acad.Sci(USA)88:7763-7767(1991))。この配列は、オーバードライブとまさしく機能的に等価である(Hansen G.等“A T-DNA transfer enh ancer sequence in the vicinity of the right border of Agrobacterium rhiz ogenes pRi8196”Plant Mol.Biol.20:113-122(1992))。ノパリンＴ−ＤＮＡ境界近くにはオーバードライブ配列と密接に類似する配列はない（Wnag K.等、“Seq uence context of the T-DNA border repeat element determinnes its relativ e activity during T-DNA transfer to plant cells”Mol.Gen.Genet.210:338-3 46(1987)）が、そのことは、この領域に存在するある配列が類似の役割を果たすことを排除するものではない。実施例で使用した２５bp右境界配列は、pＴiＡch５に由来する(Van Haaren,M. J.J.,Plant Mol.Biol.13：523-531(1989))。プラスミドpＮeoＰＢluc上に存在する右境界は、ｐＴiＴ３７に由来する(Bevan,Nucleic Acids Res.12:8711-8721(1 984))。右境界に近接した配列はＤＮＡの植物細胞への導入を増強できるが、実施例に記載の実験では、ルシフェラーゼ遺伝子の発現の混乱が起こる可能性を最少に抑えるため、最少の長さの右境界配列を選択した。しかしながら、オーバードライブなどのエンハンサー様配列を含有するより長い右境界配列を使用してもよい。真核細胞において、対象のＤＮＡの組込みを促進するタンパク質を産生する能力のあるキメラ遺伝子は、実施例にて例示するように標準遺伝子工学技術を用いて構築できる。かかるキメラ遺伝子は、真核細胞において作動可能に連結したコード配列の発現を支配する適切な調節シグナル（例えば、プロモーター、リーダー配列、転写ターミネーター、ポリアデニル化部位）に作動可能に連結させたタンパク質をコードするＤＮＡ配列からなる。このようなコード配列および調節シグナルは、当分野では十分に報告されている。組込み促進タンパク質の発現を向上するためには、標的真核細胞における発現に最適なコード配列の合成物を使用してもよい。真核細胞において、組込みを促進するタンパク質を産生する能力のあるmＲＮＡは、実施例にて例示するように、所望のタンパク質をコードする翻訳可能なキャップ形成ポリ−Ａ mＲＮＡ転写物を調製するための標準システムを用いて調製できる。当分野で利用できる標準技術を用いて、外来ＤＮＡの安定な組込みを促進するタンパク質をコードする外来ＤＮＡおよびキメラ遺伝子またはＲＮＡを様々な方法で植物細胞に与えることは、当業者には容易に明らかであろう。これらの成分を真核細胞へと搬入する正確な方法は、外来ＤＮＡの安定な組込みを促進するタンパク質が外来ＤＮＡフラグメントをもつ同一の細胞にて下記の適切な期間中に産生される限り、重要ではない。外来ＤＮＡの無傷形態での安定な組込みを促進する有益な作用を達成するためには、外来ＤＮＡフラグメントが真核細胞へ提供される前、または外来ＤＮＡが真核細胞に組込まれた後に、この作用を備えたタンパク質が真核細胞中で産生される必要はない。その代わりに、これらのタンパク質は、外来ＤＮＡフラグメントが真核細胞へ提供された後および外来ＤＮＡが組込まれる前の一時的な期間それらが十分な量で存在するように、植物細胞中で産生される必要があるだけである。コード化タンパク質がこの適当な期間中に産生されるようにキメラ遺伝子または翻訳可能なＲＮＡを真核細胞に与えるためのあらゆる手法が使用できる。本明細書に与えた実施例にて例示するように、これらのタンパク質を適当な時間枠中に十分な量で産生させる方法の１つは、そのタンパク質をコードするキメラ遺伝子または翻訳可能なＲＮＡを外来ＤＮＡフラグメントと共に真核細胞へ導入することである(即ち、各成分の同時搬入)。この手法は、核酸分子（ＤＮＡまたはＤＮＡおよびＲＮＡ）の単回搬入に関連するため、好まれる。この手法について考えられるその他の有益な態様は、真核細胞の正常な成長および発生に逆効果を与え得る組込み促進タンパク質の安定な産生ではなく。むしろ適当な期間中の組込み促進タンパク質の一時的な産生を達成するのに使用できることである。一実施態様では、本発明を用いて、アグロバクテリウム介在Ｔ−ＤＮＡ形質転換をまねるために、Ｔ−ＤＮＡ境界と結合させた無傷の外来ＤＮＡフラグメントによる植物細胞の安定な形質転換を達成する。本発明のこの態様によれば、次の成分を形質転換の標的となる植物細胞へ与える：（ａ）植物細胞ゲノムへ組込むことが望まれる対象の外来ＤＮＡフラグメント、該フラグメントは、１またはそれ以上のＴ−ＤＮＡ境界と結合させている（一本鎖Ｔ−ＤＮＡ境界は、Ｔ−ＤＮＡ導入、特に、１境界が左右両方の境界機能を果たすことができる環状Ｔ−ＤＮＡの導入を遂行するのに十分であり得る）；および、（ｂ）少なくとも１つのキメラ遺伝子またはＲＮＡ、かかるキメラ遺伝子またはＲＮＡはそれぞれ、外来ＤＮＡフラグメントの無傷形態での安定な組込みを単独でまたは他のアグロバクテリウム由来のタンパク質と共に促進するアグロバクテリウム由来のタンパク質を植物細胞中で産生する能力がある。本発明のこの態様に従い、植物細胞にて産生されるアグロバクテリウム由来のタンパク質には、アグロバクテリウムのＴiまたはＲiプラスミドのビルレンス領域に由来するタンパク質があるが、これらに限定されない。特に、この中には、ＶirＣ１、ＶirＣ２、ＶirＤ１、ＶirＤ２およびＶirＥ２がある。好ましくは、産生されたタンパク質は、ＶirＤ２タンパク質、またはＶirＤ２とＶirＤ１、Ｖ irＥ２のいずれか、またはＶirＤ１およびＶirＥ２の両方との組み合わせである。植物細胞中のアグロバクテリウム由来のタンパク質は、予測可能な終点をもつ無傷フラグメントとして外来ＤＮＡの組込みを引き起こす。得られた形質転換植物細胞は、そのゲノムに組込まれたアグロバクテリウムのＴ−ＤＮＡに類似する外来ＤＮＡフラグメントを有する。植物細胞中で本発明のアグロバクテリウム由来のタンパク質を産生する能力のあるキメラ遺伝子は、実施例にて例示のように、標準遺伝子工学技術を用いて構築できる。このようなキメラ遺伝子は、植物細胞中で作動可能に連結したコード配列の発現を支配する適切な調節シグナル（例えば、プロモーター、リーダー、転写ターミネーター、ポリアデニル化部位）に作動可能に連結させたアグロバクテリウム由来のタンパク質をコードするＤＮＡ配列から構成される。このようなコード配列および調節シグナルは、当分野では容易に入手可能である。実施例にて使用したＶirＤ１およびＶirＤ２コード配列は、ジーンバンク（ＧenＢank）から受託番号Ｍ１４７６２として提供される。植物細胞において本発明のアグロバクテリウム由来のタンパク質を産生する能力のあるＲＮＡは、実施例にて例示のように、所望のタンパク質をコードする翻訳可能なキャップ形成ポリ−Ａ mＲＮＡ転写物を調製するための標準システムを用いて調製できる。本発明のこの態様による組込みの標的とされる外来ＤＮＡフラグメントは、植物細胞または得られた植物体または植物細胞培養物中の、特定の生物活性ＲＮＡ（例えば、アンチセンスＲＮＡまたはリボザイム）を発現するように設計したキメラ遺伝子または対象となるタンパク質など、当業者が無傷形態で植物細胞ゲノムへ組み込みたいと望むものであればどのようなＤＮＡフラグメントであってもよい。唯一の要件は、そのフラグメントがＶｉｒＤ１およびＶｉｒＤ２タンパク質により認識および作用され得るような１またはそれ以上のＴ−ＤＮＡ境界に結合していることである。このようなＴ−ＤＮＡ境界の外来ＤＮＡフラグメントへの結合は、実施例１に記載する。当分野で利用可能な様々なメカニズムの１つまたはそれ以上による核酸の搬入を受け易いあらゆる真核細胞が、本発明に従う形質転換のための標的として使用できる。これには、カビ、酵母、動物細胞および特に植物細胞がある。酵母ついては、Ｔ−ＤＮＡの導入が示されている。Piers等、Proc.Natl.Acad.Sci.93:161 3-1618(1996)参照。動物細胞については、ＶirＤ２およびＶirＥ２（その局在シグナルの修飾後）の細胞核への局在化が示されている。Guralnick等、Plant Cel l 8:363-373(1996)参照。様々な動物細胞へ核酸を搬入する方法は、当分野ではよく知られている（例えば、“Current Protocols in Molecular Biology”,vol s.1-3,ed.by Ausubel,F.M.等、pub.by John Wily & Sons,Inc.(1995)参照；特に、第９章“Introduction of DNA into Mammalian Cells”参照）。記載の形質転換法により、通常、マーカー遺伝子の発現により同定される形質転換細胞の完全体（complete set）または集合体（collection）が得られる。次いで、細胞の植物体への再生により形質転換植物の完全体または集合体が提供される。形質転換植物細胞並びに再生させた形質転換植物体の両方の完全体はその組込み事象の性質により特徴づけることができる。本発明に従う１体の細胞または植物体は、それらがアグロ感染を用いて形質転換されたかのように、個々の植物細胞または植物体の５％以上がアグロバクテリウム右境界Ｔ−ＤＮＡ配列によりゲノムＤＮＡへつなげた対象のＤＮＡを含むことを特徴とする。好ましくは、その割合は１０％以上である。一般に、５〜７０％の割合およびより好ましくは１０〜５０％の割合で観測される。１体の形質転換植物細胞または植物体は、通常、１０またはそれ以上の独立した形質転換事象に基づく。好ましくは、１回の物理的形質転換実験により、２０、３０、４０または５０以上の独立した形質転換事象が起こる。形質転換植物細胞および植物体、並びにそれらの個々の植物細胞または植物体の後代は、本発明の更なる主題の構成要素である。植物標的として可能性のあるものには、単子葉植物および双子葉植物またはそれぞれの植物細胞、特に、農業経済的に重要な作物植物、例えば、トウモロコシおよびその他の穀物類、例えば、小麦、エンバク、ライ麦、モロコシ類、コメ、大麦、キビ、芝生および飼草など、並びに、綿、サトウキビ、テンサイ、ナタネ、バナナ、ポプラ、クルミ、タバコおよび大豆がある。当分野で利用できる様々な生物学的および非生物学的搬入メカニズムの１つまたはそれ以上による形質転換のための標的として役立ち得るあらゆる植物細胞タイプまたは植物細胞源は、本発明に従う形質転換のための標的としても働くことができる。これには、未熟および成熟胚、花粉、プトロプラスト、懸濁培養細胞、カルス細胞、子葉またはその他の種子および苗部分、および葉または葉片があるが、これらに限定されない。本発明の方法により得られる形質転換植物細胞は、対象となる組込まれた無傷外来ＤＮＡを含有する。この組込まれた外来ＤＮＡは、Ｔ−ＤＮＡ挿入事象に続いて組込まれたＤＮＡ上に典型的に保持される部分的Ｔ−ＤＮＡ境界配列を含むこともある。本発明の方法により得られた形質転換植物細胞は、当分野でよく知られている標準操作法に従い、トランスジェニック植物細胞培養物および稔性トランスジェニック植物を産生するのに使用できる。よって、本発明の更なる態様は、無傷形態でそのゲノムへ安定に組込まれたＴ −ＤＮＡ境界配列と結合させた外来ＤＮＡフラグメントを有する稔性トランスジェニック植物を産生する方法であって：ａ）本発明の方法に従い、該外来ＤＮＡを植物細胞ゲノム内へ形質転換させるか、または組込み；そして、ｂ）工程（ａ）の植物細胞を産生させて該稔性トランスジェニック植物を再生する、ことを含む。好ましくは、該稔性トランスジェニック植物は、タバコ、綿、ナタネ、大豆、トウモロコシ、小麦およびコメからなる群から選択される。該トランスジェニック植物およびそれから得られた種子内に設計された遺伝的特性は、有性生殖または栄養生長（vegetative growth）により継代されて、後代植物に維持され繁殖され得る。一般に、該維持および繁殖は、既知の農業的方法の用途を発展させて、耕作、種まきまたは収穫などの特定の目的に適合させるものである。水栽培または温室技術などの特定の方法にも適用できる。生長中の作物は昆虫または感染により引き起こされる攻撃および損害、並びに雑草による競合に無防備であるので、雑草、植物病、昆虫、線虫、およびその他の不利な条件を制御して、収量を向上するための処置が取られる。それらには、土壌の耕耘または雑草および感染植物の除去などの機械的処置、並びに、除草剤、殺菌剤、殺生殖体剤（gametocides）、殺線虫剤、生長調節剤、成熟剤および殺虫剤などの農業化学の適用がある。本発明によるトランスジェニック植物および種子の有利な遺伝的特性は、更に、害虫、除草剤またはストレスに対する耐性、栄養価の向上、収率の増加または倒伏または飛散による損失の低下を導く構造の改良などの改善された特性を有する植物の開発を目指す植物品種改良において使用できる。様々な品種改良段階は、交雑させる系列の選択、親系列の授粉の支配または適切な後代植物の選択などの十分に定義されたヒトの介入を特徴とする。望まれる特性によって、様々な品種改良処置が取られる。当面の技術は、当分野でよく知られており、ハイブリダイゼーション、同系交配、戻し交配、多系交配、変種混合、種間ハイブリダイゼーション、異数体技術等があるが、これらに限定されない。ハイブリダイゼーション技術は、機械的、化学的または生化学的手法により雄性または雌性不稔植物を得るための植物の不稔化も含む。異種系列の花粉を用いて雄性不稔植物を交差授粉すれば、雄性不稔であるが雌性稔性である植物のゲノムは確実に両方の親系列の特性を均一に獲得する。そのため、本発明のトランスジェニック種子および植物体は、例えば、除草剤または農薬処置などの常法の効率を高めたり、その修飾した遺伝的特性により該方法の手間を省かせるように改良された植物系列の品種改良に使用できる。または、改良されたストレス耐性を有する新規作物を得ることもでき、その最適化された遺伝的“素質”により、比較的不利な発育条件に耐えることのできなかった生産物よりも良好な品質の収穫生産物が得られる。種子生産において、種子の生殖特質と均一性は必須の生産物特性であるのに対し、農家に収穫され販売される種子の生殖特質と均一性は重要視されていない。作物を他の作物や雑草種子のない状態に維持すること、種子由来の疾病を制御すること、および良好に生殖する種子を産生することは困難であるので、純粋な種子の生育、調整およびマーケティングの分野に携わる種子生産者は、かなり大規模の十分に特性化された種子生産手段を開発してきた。そのため、農家が自家作物から集めた種子を用いずに、特定の品質基準に合致する保証された種子を購入するのは普通のことである。種子として使用される繁殖材料は、習慣的に、除草剤、殺虫剤、殺真菌剤、殺菌剤、殺線虫剤、軟体動物駆除剤またはそれらの混合剤を含む保護剤コーティングで処理される。習慣的に使用される保護剤コーティングには、カプタン、カルボキシン、チラム(ＴＭＴＤ(登録商標))、メタラキシル(Apron(登録商標))、およびピリミホス−メチル(Actellic(登録商標))などの化合物がある。所望ならば、これらの化合物を、処方の分野で習慣的に採用される更なる担体、界面活性剤または適用促進アジュバントと共に処方して、細菌、真菌または動物害虫により引き起こされる損傷から保護する。保護剤コーティングは、繁殖物質を液体製剤に浸すか、または、複合湿潤または乾燥製剤でコーティングすることにより適用できる。芽または果実への処置などのその他の適用法もまた可能である。本発明の更なる態様は、本発明のトランスジェニック植物、トランスジェニック植物材料、またはトランスジェニック種子の使用を特徴とする上記例示の方法などの新規農法を提供することである。本方法の成分（即ち、外来ＤＮＡおよびその外来ＤＮＡの組込みを促進するタンパク質をコードするキメラ遺伝子またはＲＮＡ）が当分野で利用可能な標準技術を用いる様々な方法で植物細胞に提供され得ることは、当業者には容易に理解される。これらの成分を植物細胞に提供する正確な手段は、外来ＤＮＡの安定な組込みを促進するタンパク質が上記の適当な期間で産生される限り、重要ではない。植物細胞に提供する各成分の正確な量も同様に重要ではなく、成分が搬入される手段および形態によって変わり得る。所望ならば、当業者は、特定の搬入システムを用いてそれぞれの最適レベルを測定するために提供する各成分の量を定型的に変えてもよい。成功した組合わせの１つを実施例１に記載しており、これを更なる最適化のための出発点として役立てることができる。本方法の成分の植物細胞への搬入は、核酸を植物細胞へ搬入するために当分野で利用できる様々な技術によって達成でき、それらの技術には、アグロバクテリウム介在Ｔ−ＤＮＡ形質転換（例えば、“Plant Genetic Transformation Metho ds and Transgenic Plants”と題するＷＯ９５／３５３８８参照）などの生物学的メカニズムおよびマイクロプロジェクタイル衝撃、電気穿孔法、マイクロインジェクション、誘導摂取およびエアゾールビームインジェクションなどの非生物学的メカニズムを含むが、必ずしもこれらに限定されない。好ましい手法では、一回の操作で本方法の全ての成分（即ち、外来ＤＮＡおよびその外来ＤＮＡの組込みを促進するタンパク質をコードするキメラ遺伝子またはＲＮＡ）をレシピエント植物細胞へ搬入する。本発明により搬入される、組込み促進タンパク質をコードするmＲＮＡは、それが分解される前の限られた期間に植物細胞においてコード化タンパク質を産生すると予想される。このmＲＮＡから産生されたタンパク質は、同じくそれが正常な細胞プロセスにより分解される前の限られた期間に植物細胞中に残っていることが予想される。従って、これらのタンパク質は、本方法に従い、ＲＮＡの形態で植物細胞へ一過的に搬入できる。これらのタンパク質の一過的搬入は、かかるタンパク質が連続して存在すると不要な作用を与え得るような場合に好まれることもある。これと同じ効果は、容易に組込むことができない形態の組込み促進タンパク質をコードするキメラ遺伝子を機能的な形態で植物細胞ゲノムへ搬入することにより、達成できる。組込み促進タンパク質をキメラ遺伝子により細胞へ提供する場合、様々な成分が結合したり、一本鎖ＤＮＡ分子として搬入されることもあるが、好ましくは、それぞれのキメラ遺伝子を別のＤＮＡ分子としての外来ＤＮＡフラグメントと共に同時搬入する。別個のＤＮＡ分子としての搬入は、外来ＤＮＡフラグメントに対するキメラ遺伝子の比率を変化させ、かつ最適化させるものである。これらの構築物を別個の分子上に設計することもまた同じく一層便利である。無作為組込みによるかかるキメラ遺伝子のゲノムへの安定な取り込みは、Ｔ−ＤＮＡ境界と結合させた外来ＤＮＡの直接組込みに比べ測定可能な頻度で起こることが期待できる。外来ＤＮＡの直接組込みとこのような無作為組込み事象の分離を容易にするために、組込み促進タンパク質をコードするキメラ遺伝子は好ましくは、外来ＤＮＡとは別の一本鎖ＤＮＡ分子として搬入できる。この手法を用いると、キメラ遺伝子のコピーはＴ−ＤＮＡ境界と結合させた外来ＤＮＡの直接組込みとは異なる遺伝子座に組込まれるようである。その結果、外来ＤＮＡを含む直接組込み事象と形質転換植物細胞から得られた植物の連続的な品種改良により無作為に組込まれたＶirＤ１およびＶirＤ２遺伝子の分離は、容易に達成され。好ましい実施態様では、組込み促進タンパク質をコードするキメラＤＮＡ遺伝子またはＲＮＡを植物細胞へ搬入するための媒体として植物ウイルスベクターを用いる。このようなベクターは、所望のＤＮＡまたはＲＮＡの植物細胞における取り込みおよび発現のために、ジェミニウイルスレプリコン(Ugaki,M.,Nucleic Acids Research 19:371-377(1994))などの植物ＤＮＡウイルスレプリコンおよびＲＮＡウイルスベクター(Sablowski,R.W.,Proc.Natl.Acad.Sci.92：6901-6907(1995)) から誘導できる。これらのベクターは典型的には標的植物細胞中で複製するので、かかるベクターへ組込んだキメラ遺伝子またはＲＮＡは増幅し、そこから産生されるタンパク質が増大する。また、このタイプのウイルスベクターは植物細胞ゲノム内に組込まれることはなく、何故ならば、その元となるウイルスレプリコンが通常組み込まれないからである。よって、本方法は、かかるタンパク質をコードするキメラ遺伝子の組込みという危険を低減しながら、大量の組込み促進タンパク質を一過的に産生するという利点を有する。このようなウイルスベクターを使用して、予め形質転換の標的となる植物細胞に全体的に感染させることも有利であり得る。この手法は、組込み促進タンパク質またはタンパク質群をコードするＤＮＡまたはＲＮＡを同時搬入する必要性を回避することにより、多量に組込むことが望まれる外来ＤＮＡの搬入を可能にするものである。植物ウイルスベクターもまた、植物細胞への組込みの標的となる外来ＤＮＡフラグメントを搬入するための媒体として使用できる。これらのベクターは典型的に標的植物細胞中で複製するため、この手段にこれらを使用すれば、組込みに利用できる多数の外来ＤＮＡフラグメント鋳型を増幅する。植物ウイルスベクターを使用して、組込みの標的となる外来ＤＮＡフラグメントおよび組込み促進タンパク質をコードするキメラ遺伝子の両方を植物細胞へ搬入する場合、同一のウイルスベクターを使用して両方の成分を搬入することもでき、または２つの別個のウイルスベクターを使用してもよい。アグロバクテリウム介在形質転換がウイルスベクターを植物細胞へ搬入するために使用される技術である場合、その手法は、“アグロ感染”として知られている(Grimsley等、Nat ure 325:177-179(1987)参照)。組込み促進タンパク質をコードするキメラ遺伝子と外来ＤＮＡとの同時搬入に代わるものとして、既にそのゲノムへ安定に取り込まれたこれらのキメラ遺伝子を含有するトランスジェニック植物細胞へ外来ＤＮＡを搬入してもよい。標準技術を用いた、組込み促進タンパク質をコードするキメラ遺伝子を含むＤＮＡ分子での形質転換により産生したトランスジェニック植物体またはトランスジェニック植物細胞培養物は、かかるトランスジェニック植物細胞の供給源として使用できる。この手法を用いると、外来ＤＮＡを必要とする直接組込み事象を、形質転換植物細胞から得られた植物の連続的品種改良により安定に組込まれたキメラ遺伝子から分離できる（例えば、Peerbolte,R.等、“Transformation of plant pr otoplasts with DNA:cotransformation of non-selected calf thymus carrier DNA and meiotic segregation of transforming DNA sequences”，Plant.Mol.B iol.5(4):235-246(1985)参照）。本明細書では本発明を１つの植物細胞の形質転換に関して記載しているが、当業者ならば、本発明を基礎とする（マイクロインジェクションを除く）搬入法は典型的には、細胞培養物、カルスまたは植物体全体から摘出した組織形態の植物細胞集団に適用されることを理解するであろう。結果として、安定に形質転換した植物細胞を形質転換植物細胞と非形質転換植物細胞の混合集団から同定および／または選択するこれらの搬入法と共に使用するための様々な技術が開発されてきた(例えば、Dekeyser,R.等、“Evaluation of selectable markers for rice transformation”，Plant Physiol.90(1):217-223(1989)参照)。これらの技術は、同様にして本発明と併せて使用することもできる。外来ＤＮＡ成分に関して、非生物学的搬入法を用いる本発明の方法に従う植物細胞の形質転換は、２つの基本的なタイプの組込み事象：（１）かかる組込み事象を促進するタンパク質の存在により支配されるＴ−ＤＮＡ境界と結合させた無傷外来ＤＮＡフラグメントの単純な挿入、および（２）使用した非生物学的搬入法に特有の外来ＤＮＡの様々な部分および置換物（permutations）の無作為挿入、に帰着することが意図される。これら２つのタイプの組込み事象は、外来ＤＮＡフラグメントまたはそのサブフラグメントをプローブとして用いる制限処理したゲノムＤＮＡのサザン・ブロット・ハイブリダイゼーション、無傷形態の外来ＤＮＡフラグメントの存在を検出するように設計したポリメラーゼ連鎖反応(ＰＣＲ)ベースの技術などの標準分子分析手段を形質転換植物細胞のゲノムＤＮＡに応用することにより、容易に識別できる。両方のタイプの挿入事象を含有する植物細胞の場合、かかる事象は、それから得られたトランスジェニック植物において典型的な品種改良手法により分離できる。これらの手段を用いると、本発明の適用により生じるＴ−ＤＮＡと結合させた無傷外来ＤＮＡフラグメントの簡単な挿入を有するトランスジェニック植物細胞または植物体を同定でき、これらを使用して、トランスジェニック植物細胞培養物および／またはトランスジェニック植物体および後代を産生できる。本発明は、アグロバクテリウムＴ−ＤＮＡ導入システムに基づく改良組込みシステムに限定されるものではないと理解されるべきである。Ｖirタンパク質およびＴ−ＤＮＡ境界に類似する組込み促進タンパク質および認識配列を利用する更なるシステムは、本発明に従い修飾して、形質転換の標的となる真核細胞における単純な組込み事象の頻度を改善することができる。例えば、蓄積データは、アグロバクテリウムから植物へのＴ−ＤＮＡ導入とプラスミド介在細菌コンジュゲーションとの間に密接な関係が存在することを示唆している。配列の関連が、（ｉ）Ｔ−境界のニック領域とincＰ導入起点；(ii)virＤオペロンの遺伝子クラスターとリラキサーゼオペロン（ＴraＩ／ＴraＪ）、との間に見いだされている。ＴraＩとＶirＤ２並びにそれらの標的−ＲＰ４ oriＴニック領域およびＴ−境界反復配列は、それぞれ、顕著な類似性を共有している(“Plant Transformation ”と題するＷＯ８８／０３５６４参照)。インビトロでは、ＴraＩおよびＶirＤ２はそれぞれ、各自のコグネイトニック部位を支える一本鎖オリゴヌクレオチドにおいてニックを生成するのに十分である（Pansegrau等、Proc.Natl.Acad.Sci. (USA)90:11538-11542(1993)参照）。過剰の切断産物の存在下で、ＴraＩおよびＶirＤ２の両方はまた、２片の一本鎖ＤＮＡをつなげる反対の反応を触媒できる。ＶirＤ２もまた、oriＴの切断を触媒できる。ジェミニウイルスＲepタンパク質または細菌ファージおよびプラスミドのローリングサークル型複製に関係するタンパク質と、もう一方の、細菌接合性ＤＮＡ導入、またはアグロバクテリウムから植物ゲノムへのＴ−ＤＮＡの導入および組込みに携わるタンパク質との間に機能的類似体性が見いだされている(Heyraud-Nitschke F,等、Nucl.Acids Res.910 -916(1995))。図面の簡単な説明第１図（Ａ-Ｂ）：実施例１記載の実験に用いるプラスミド構造を示す。これらプラスミドの組成を実施例１の“材料と方法”の項に記載する。ＲＢは２５−bp の右境界配列に対応する。制限部位は次のように表す：Ｅ＝ＥcoＲＩ；Ｐ＝Ｐst Ｉ．第２図：ｐＮeoＲＢＬucプラスミドの概要図式を示す。ＬＢ：左境界；ＲＢ：右境界。図式の上段箱型囲いは形質転換体のサザンブロット分析に用いるプローブを示す。制限部位は次のように表す：Ｅ＝ＥcoＲＩ；Ｐ＝Ｐst；Ｘ＝ＸbaＩ；Ｈ＝ＨindIII。“ＮＰＴII”はネオマイシン・ホスフォトランスフェラーゼII・オープンリーディングフレームを表す。“ＮＯＳＴ”はノパリン・シンターゼターミネーターを表す。“ＣaＭＶ３５Ｓ”はカリフラワー・モザイクウイルス（ＣaＭＶ）からの３５Ｓプロモーターを表す。“ＬＵＣ”はルシフェラーゼのオープンリーディングフレームを表す。“３５ＳＴ”はＣaＭＶ３５Ｓ転写物のターミネーターを表す。第３図：ｐＮeoＲＢＬuc、p３５ＳＤ１およびp３５ＳＤ２プラスミドでの形質転換後の植物ＤＮＡ標的部位の配列分析を示す。数値は標的クローン呼称番号を表す。ｐＮeoＲＢＬucが有する右境界配列は小文字で表す（Ｒb列結合）。フラグメント１、２a、３および５は、タバコＰＳII（Ｘ６２４２６;nt９０８）と１００％の相同性、タバコＮtpII１０（Ｘ７００８８;nt５７３）と１００％の相同性、タバコのリブロース・１，５−ビスホスフェートカルボキシラーゼ（Ｘ０２３５３;nt２１７４）と１００％の相同性、およびペチュニアのクロロフィル結合タンパク質（Ｍ２１３１７;nt１０１３）と８０％の相同性をそれぞれ示す。第４図（Ａ-Ｆ）：実施例３および４で使用するプラスミド地図を示す。使用する略号は実施例３の“材料および方法”の項に記載する。第５図（Ａ-Ｂ）：実施例５で使用するプラスミドpwＡdhＤ１、pwＡdhＤ２、pw ＢarＲＢＬuc、およびpＢＡＲＲＢＬucの図解描写。第６図：プラスミドｐＣlＢ１７１１の図解描写（実施例１参照）第７図：プラスミドｐＣlＢ１７１１deltaＢの図解描写（実施例７参照）第８図：プラスミドｐＣlＢ１７１１deltaＢ-Ｈ,Ｎの図解描写（実施例７参照）第９図：プラスミドｐＣlＢ１７１１deltaＢ-Ｈ,Ｎ-Ｂの図解描写（実施例７参照）第１０図：プラスミドｐＣlＢ１７１１-Ｈ,Ｎの図解描写（実施例７参照）第１１図：プラスミドｐＢＳ-ＮＣの図解描写（実施例７参照）第１２図：プラスミドｐＢＳ-ＮＣ-ＲＢの図解描写（実施例７参照）第１３図：プラスミドＵbiＰＡＴdlの図解描写（実施例７参照）第１４図：プラスミドＬＢ.ＵbiＰＡＴdlの図解描写（実施例７参照）第１５図：プラスミドpＡＶＭ１の図解描写（実施例７参照）第１６図：プラスミドｐ３５ＳＤ２の図解描写（実施例８参照）第１７図（Ａ-Ｂ）：virＤ２オープンリーディングフレーム含有プラスミドｐ３５ＳＤ２のＥcoＲＩフラグメントからフラグメントＡ-Ｃを調製する工程の図解描写（実施例８参照）第１８図：プラスミドｐＴＣ１８２の図解描写（実施例８参照）第１９図：プラスミドｐＴＣ１８２-Ａの図解描写（実施例８参照）第２０図：プラスミドｐＴＣ１８２-Ａ-Ｂの図解描写（実施例８参照）第２１図：プラスミドｐＵＣ２１の図解描写（実施例８参照）第２２図：プラスミドｐＣ２１-Ｘの図解描写（実施例８参照）第２３図：プラスミドppＵＣ２１-Ｃの図解描写（実施例８参照）第２４図：プラスミドｐＵＣ２１-virＤ２の図解描写（実施例８参照）第２５図：プラスミドＴ７polyＡの図解描写（実施例８参照）第２６図：プラスミドＴ７virＤ２polyＡの図解描写（実施例８参照）実施例ここで用いる標準の組換えＤＮＡおよび分子クローニング技術は周知の技術であり、次の文献に記載されている：ジェイ・サムブルーク（Ｊ．Ｓambrook）、イー・エフ・フリッシュ（Ｅ．Ｆ．Ｆritsch）およびティ・マニアティス（Ｔ．Ｍ aniatis）、分子クローニング：実験室マニュアル、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー、コールド・スプリング・ハーバー（Ｃold Ｓpring Ｈar bor）、ニューヨーク（１９８９）；ティー・ジェイ・シルハヴィ（Ｔ．Ｊ．Ｓi lhavy）、エム・エル・バーマン（Ｍ．Ｌ．Ｂerman）およびエル・ダブリュ・エンクイスト（Ｌ．Ｗ．Ｅnquist）、遺伝子融合の実験、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー、コールド・スプリング・ハーバー、ニューヨーク（１９８４）。実施例１：植物細胞の“アグロリスティック(agrolistic)”形質転換：ＶirＤ１とＶirＤ２遺伝子およびＴ-ＤＮＡ-境界選択マーカー遺伝子のバイオリスティック（biolistic）搬入後ら植物中で産生されたＴ-鎖の組込みＡ．要約ビルレンス遺伝子ＶirＤ１およびＶirＤ２は、Ｔ-ＤＮＡを植物核ＤＮＡに挿入する際に、宿主植物細胞へ搬入するに先立って、アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａgrobacterium tumefaciens）中のＴiプラスミドからＴ−鎖を摘出するために必要である。我々はプラスミドＤＮＡのバイオリスティック搬入法を採用し、植物中のＶirＤ１およびＶirＤ２によってＴ-ＤＮＡ境界配列の結合および/または部位特異的ニック形成を試験した。金マイクロプロジェクタイルを３種のプラスミド混合物で被覆した；３種のプラスミドはそれぞれ、ＣaＭＶ３５Ｓプロモーター制御下のＶirＤ１およびＶirＤ２コード領域およびＣaＭＶ３５Ｓとルシフェラーゼコード領域との間に挿入した右境界配列を含むテスト遺伝子を含む。我々はルシフェラーゼの一過性発現を測定し、テスト遺伝子の完全度および転写利用率を試験した。タバコおよびトウモロコシの両細胞で、ルシフェラーゼの一過性発現はＶirＤ１およびＶirＤ２プラスミドを同時に搬入したことにより強く阻害された。阻害はテスト遺伝子プラスミドに対するＶirＤプラスミドの比が増大するとより大きくなった。有意な阻害は境界配列の一方向でのみ、すなわち、ルシフェラーゼｍＲＮＡの鋳型であるＤＮＡ鎖のＶirＤ２ニック形成を導く方向にのみ起こった。ＶirＤ１のみあるいはＶirＤ２のみでは効果が少なかった。選択マーカーおよびルシフェラーゼテスト遺伝子、さらにＶirＤプラスミドの混合物を有する形質転換ベクターをバイオリスティックに搬入すると適度の頻度で“アグロリスティック”挿入物が生成し、その植物ＤＮＡをもつ右結合部は、Ｔ-ＤＮＡ挿入事象について期待される配列を正確に保持していた。我々は幾つかの形質転換体系列にバイオリスティックと“アグロリスティック”事象の両方が起こっていることを見出した。Ｂ．序論粒子衝撃による遺伝子搬入法は、植物の形質転換に広く応用されるようになったことで、広範囲に受け入れられる技術となっている（総説、アール・ゴイ（Ａ hl Ｇoy）およびデュウジング（Ｄuesing）、１９９５）。例えば、ヨーロッパ・アワノメイガ幼虫耐性トウモロコシがこの技術により開発されている（コジール(Ｋoziel)ら、１９９３）。製品開発の過程では、導入遺伝子の構造とコピー数ならびにその安定性を確立しなければならない。最も望ましい製品は単一の単純な挿入物をもつものであって、外来プラスミドベクターＤＮＡを含まないものである。しかし、粒子衝撃による植物の形質転換では、導入遺伝子がプラスミドベクターを含む複数のコピーを組込んでしまう傾向がある（クライン（Ｋlein）ら、１９８８、クラインら、１９８９；ゴードン−カム・ダブリュ・ジェイ（Ｇ ordon-Ｋamm Ｗ.Ｊ.）ら、１９９０；バジル（Ｖasil）ら、１９９２；ワン・ワイ(Ｗan Ｙ.)およびルモー・ピー（Ｌemaux Ｐ.）、１９９４）。この手法は、組込み前もしくは組込み中にプラスミド・コンカテマーの形成を促進すると思われる。バイオリスティック形質転換により挿入された複数のコピーは、一般には遺伝子連鎖しており、引き続く繁殖中に分離することはできない。導入遺伝子の複数のコピーは幾つかの機構により、その発現を不安定なものとする（総説、マツケ・エム（Ｍatzke Ｍ）およびマツケ・エイ(Ｍatzke Ａ)、１９９５）：導入遺伝子の複数のコピーは相互作用して互いに不活化し合い、かつ、“共抑制”または“遺伝子沈黙”などと様々に呼ばれる発生機構的メカニズムによって関係する宿主遺伝子をも不活化してしまう。さらに、相同組換えが複数のコピーの遺伝的不安定性を招く可能性もある。このような理由で、挿入した導入遺伝子のコピー数を減らすのが、導入した遺伝子の信頼性を維持するのに有益であることを証明する必要がある。アグロバクテリウム介在形質転換により導入した外来遺伝子の組込みパターンは、一般に植物細胞の粒子衝撃より得られるものと著しく異なっている（総説、チルトン（Ｃhilton）、１９９３）。バイオリスティック搬入により作製した無傷でかつ再編成した導入遺伝子のコピー数は、アグロバクテリウム系で植物に導入した導入遺伝子のコピー数を大幅に上回ることがしばしばである。アグロバクテリウムは、移入された遺伝子を腫瘍誘発プラスミド（Ｔi）または根誘発プラスミド（Ｒi）と呼ばれるプラスミドに組込むメカニズムを発達させている（総説、カド、１９９３）。ＴiのＴ-ＤＮＡ（導入ＤＮＡ）またはＲiプラスミドＤＮＡと呼ばれる特定の部分は、Ｔi/Ｒiプラスミド上の２５−ｂｐの直列反復境界配列にフランクしており、この部分が細菌から植物細胞核へ移動して植物染色体ＤＮＡに組込まれることになる。ＤＮＡ導入の精巧な機構が一連のビルレンス (vir)遺伝子によりコード化されている（総説、ザンブリスキー（Ｚambryski）、１９９２）。vir遺伝子を活性化するとＴ-ＤＮＡ境界反復配列内に部位特異的ニックを生成させ、Ｔ-ＤＮＡの下部鎖に相当する直鎖状一本鎖ＤＮＡ分子（Ｔ- 鎖）を生じる。ニック形成はＶirＤオペロン、ＶirＤ１およびＶirＤ２によりコードされた二種類のポリペプチドを必要とする（スタッチェル（Ｓtachel）およびネスター（Ｎester）、１９８６；スタッチェルら、１９８７；ヘレーラ−エストレーラ（Ｈerrera-estrella）ら、１９８８；デボス（ＤeＶos）およびザンブリスキー(Zambryski)、１９８９；ダレンバーガー（Ｄurrenberger）ら、１９８９；ハワード（Ｈoward）ら、１９８９；コウコリコバ−ニコラ（Ｋoukolikov a-Ｎicola）ら、１９９３）。ＶirＤ１はＤＮＡ−弛緩活性を示し（ガイ(Ｇhai) およびダス（Ｄas）、１９９０；フィリックキン(Ｆilichkin)およびゲルビン( Ｇelvin)、１９９３）、一方、ＶirＤ２は境界配列の低位鎖を切断するエンドヌクレアーゼ活性を有する（スタッチェル（Ｓtachel）ら、１９８６；ヤノフスキー（Ｙanofsky）ら、１９８６；ワング（Ｗang）ら、１９８７；オルブライト（Ａlbright）ら、１９８７）。イン・ビトロの実験は、精製したＶirＤ２は一本鎖ＤＮＡを特異的に切断することを証明している（パンセグロウ（Ｐansegrau）ら、１９９３；ヤスパー（Ｊasper）ら、１９９４）。スーパーコイル状または弛緩状二本鎖ＤＮＡはイン・ビトロでＶirＤ２のみでは切断の基質として作用しない（ヤスパーら、１９９４）。ＶirＤ２はチロシン残基２９（ダーレンバーガー（Ｄurrenberger）ら、１９８９；ボーゲル(Ｖogel)およびダス(Ｄas)、１９９２；パンセグロウ(Ｐansegra u)ら、１９９３）を介してニック化ＤＮＡの５'末端（ワード(Ｗard)およびバーンズ(Ｂarnes)、１９８８；ヤング(Ｙoung)およびネスター(Ｎester)、１９８８；ハワード(Ｈoward)ら、１９８９）に共有結合する。左境界配列の二番目の切断はＴ-鎖を遊離する。このＴ-鎖はさらに一本鎖結合タンパク質ＶirＥ２により、その長方向に沿って被覆される。ＶirＤ２およびＶirＥ２は、Ｔ-鎖を植物細胞核に導くと信じられている核局在化シグナル（ＮＬＳ）を含有している（ヘレーラ−エストレーラ（Ｈerrera-Ｅstrella）、１９９０；ハワード（Ｈoward）ら、１９９２；シャービントン（Ｓhurvinton）ら、１９９２；チンランド（Ｔi nland）ら、１９９２；ロッシ（Ｒossi）ら、１９９３）。ＶirＤ２およびＶir Ｅ２のＮＬＳはタバコ中およびトウモロコシ中に認められている（チトウスキー（Ｃitovsky）ら、１９９４）が、その効力は組織の成長段階に依存している。最近のデータは、ＶirＤ２がＴ-鎖の５'末端を植物ＤＮＡに連結させるのに介在している可能性があるという見解を支持している（チンランド（Ｔinland）ら、１９９５）。本研究で我々は新規な植物形質転換技法を開発した；それはアグロバクテリウム系の幾つかの利点と、広範な作物植物用のバイオリスティックならびに他の搬入システムにおいて確立された高い効力とを結び付けたものである。企図したことは、Ｔ-ＤＮＡ挿入物でのような、ベクター配列をもたない対象遺伝子を組込み、コピー数を制御することである。我々の方法は選択マーカーを側面にフランクしているＴ-ＤＮＡ境界配列含有形質転換プラスミドと共に同時搬入されたＶi rＤ１およびＶirＤ２遺伝子の植物発現カセットを用いることである。我々は、一過性発現したＶirＤ１およびＶirＤ２遺伝子産物が、実際に、イン・プランタでのＴ-ＤＮＡ境界配列を切断することができるし、さらに、バイオリスティック搬入の後にさらにＴ-ＤＮＡ型の挿入事象（“アグロリスティック”事象）を提示することができることを見出した。Ｃ．材料と方法１．プラスミド本研究に用いるプラスミド挿入物総ての構造を第１図に示す。ｐＣlＢ１７１１は、カリフラワー・モザイクウイルス３５Ｓ（ＣaＭＶ３５Ｓ）プロモーターにより駆動するホタル・ルシフェラーゼ遺伝子含有ｐＵＣ誘導体である。ｐＣlＢ１７１１の構築ｐＣlＢ１７１１は３５Ｓ発現シグナルに結合したルシフェラーゼ遺伝子を含んでいる。親ベクターｐＣlＢ７１０（ロスシュタイン（Ｒothstein）ら、１９８７）は、ルシフェラーゼ遺伝子挿入に先立って、非反復制限部位ＰstＩおよびＮarＩを除去することによって改変した。ＣaＭＶプロモーターの上流に位置するＰstＩ部位は、隣接のＳaＩＩおよびＳphＩ制限部位で切断し、合成リンカー［５'−ＴＣＧＡＣＡＴＧ−３'］を連結させてＳaＩＩ部位を創製し、ＳphＩおよびＰstＩ部位を除くことにより除去した。ＣaＭＶポリアデニル化配列の３'側に位置するＮarＩ部位は、ＮarＩおよびＮdeＩで切断し、５２bpフラグメントを切除し、次いで、クレノウ消化および平滑末端連結により除去した。プラスミドｐＪＤ２０４（オウ（Ｏw）ら、サイエンス２３４：８５６−８５９（１９８６））およびｐＤＯ０４３２（デュ・ウエット（Ｄe Ｗet）ら、モル・セル・ビオル（Ｍol．Ｃell．Ｂiol.）７（２）：７２５７２７（１９８７））はそれぞれ、ドナルド・ヘリンスキー博士（Ｄr．Ｄonald Ｈelinski）およびスチーブ・ハウエル博士（Ｄr．Ｓteve Ｈowell）より入手した。ルシフェラーゼ遺伝子、２２bpのルシフェラーゼ５'ＵＴＬおよび約１３０bpの３'末端を含むｐＪＤ２０４からの１８２６bp ＨindＩＩＩ−bamＨＩフラグメントは、３５Ｓプロモーターとポリアデニル化シグナルとの間に来るように、ｐＣlＢ７１０のＢamＨＩ部位中に、オリゴ体５'−ＧＡＴＣＣＣＴＧＣＡＧＡ−３'（配列番号３）および５' −ＡＧＣＴＴＣＴＧＣＡＧＧ−３'（配列番号４）から製造した合成リンカーで連結した。ｐＣlＢ１７０１はルシフェラーゼ遺伝子フラグメントを、修飾したｐＣlＢ７１０ベクターに挿入することにより製造した。ｐＣlＢ１７１１は、ｐＣlＢ１７０１をＰstＩおよびＮarＩで消化し、生成したプラスミドを遺伝子のリーダーと５'末端を含むリンカーＲ５Ｂ１で連結することにより構築した。リンカーＲ５Ｂ１は下記の相補的オリゴマーから製造したフラグメントからなる。Ｔ-ＤＮＡ境界を導入するために、ＬＢＡ５２６９（バン・ハーレン（Ｖan Ｈ aaren）ら、１９８９）の右境界配列に対応する二種類の合成オリゴヌクレオチドをアニールして二本鎖：５'−ＡＴＣＣＧＧＣＡＧＧＡＴＡＴＡＴＡＣＣＧＴＴＧＴＡＡＴＴＣＴＧＣＡ−３'（配列番号７）とした。ＢamＨＩ-ＰstＩにフランクしたこの二本鎖を、ｐＣlＢ１７１１のプロモーターとルシフェラーゼをコードする配列との間の対応する部位に挿入し、ｐＲＢ(+)Ｌucとした。ｐＲＢ(-) Ｌucでは、右境界配列はプロモーターに関し逆方向に導入した。ｐＮeoＲＢＬuc はタバコ懸濁細胞の安定な形質転換用に設計され、左境界配列、ネオマイシン・ホスフォトランスフェラーゼ遺伝子（nptＩＩ）およびルシフェラーゼ遺伝子をプロモーターとｐＲＢ(+)Ｌuc由来のルシフェラーゼコード領域との間に挿入した右境界と共に含んでいる（第２図）。Ｎos(nopaline syntase; ノパリン・シンターゼ)プロモーターにより駆動するnptＩＩ遺伝子はプラスミドｐＢin１９から２.２ kb ＳacＩＩ-ＨindＩＩＩフラグメントとして切り出した（ビーバン（Ｂevan）、１９８４）。左境界配列はｐＢin１９からＢgＩＩＩ-ＥcorＩフラグメントとして切り出した。これら両方のフラグメントはｐＲＢ(+)ＬucのＸbaＩ- ＨindＩＩ部位に挿入した。ｐＮeoＬucは、ＣaＭＶ３５Ｓプロモーターとルシフェラーゼコード領域の間に挿入した右境界配列をもたないｐＮeoＲＢlucの等価物である。ｐＴiＡ６からのＶirＤ１およびＶirＤ２遺伝子は発現ベクターｐＭＦ６（カリス（Ｃallis）ら、１９８７）にサブクローンしたものであり、ＣaＭＶ３５Ｓプロモーター（０.５ kb）、Ａdｈ１第１イントロン（０.５ kb）およびノパリン・シンターゼ（nos）ポリアデニル化領域（０.２５ kb）からなる（第１図）。ＶirＤ１コード配列に対応するｐＡＤ１１８７（ガイ（Ｇhai）およびダス（Ｄas）、１９８９）からの０.６ kb ＥcoＲＩ-ＰstＩをｐＭＦ６にクローン化してp３５ＳＡdhＤ１とした。ＶirＤ２コード配列はｐＡＤ１１９０（ガイおよびダス、１９８９）から１.８ kb ＥcoＲＩフラグメントとして切り出し、ｐＭＦ６にクローン化した。得られるプラスミド、p３５ＳＡdhＤ２およびp３５ＳＡdh Ｄ２(rev)は、ＶirＤ２コード領域をセンスまたはアンチセンス方向のいずれかに有していた。Ａdh１イントロン配列をp３５ＳＡdhＤ１，p３５ＳＡdhＤ２およびp３５ＳＡdhＤ２(rev)から除去して、それぞれ、p３５ＳＤ１、p３５ＳＤ２およびp３５ＳＤ２(rev)とし、タバコ組織用にデザインした実験に使用した。ｐＧＵＳは、ＣaＭＶ３５Ｓプロモーターの制御下β−グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）をコードする配列ＧＵＳ遺伝子とヒマの実カタラーゼ遺伝子イントロンを含有するｐＵＣ誘導体である（オオタら、１９９０）。２．植物材料トウモロコシ懸濁細胞：トウモロコシ（ジー・メイズ・エル；Zea mays Ｌ.）の懸濁培養は、Ｂ７３に関係する選択株の未成熟胚から選択した凍結保存胚形成ＩＩ型カルスから起こした。凍結保存カルス（ディマイオ（ＤiＭaio）およびシリトオ(Ｓhillito)、１９９２）約１ｇをスクロース３０g/lおよび２,４−ジクロロフェノキシ酢酸（２,４−Ｄ）（２Ｎ６３Ｓ）２mg/lを添加したＮ６液体培地（チュウ(Ｃhu)ら、１９７５）に加えた。培養物は暗所にて１５０rpmのオービタル・シェーカーにより２５℃で培養した。懸濁培養物は７日ごとに、充填細胞量１mlを新鮮な２Ｎ６３Ｓ液体培地に移すことで継代培養した。衝撃実験に使用するトウモロコシ細胞懸濁液は３日令の急速生育培養物から取り出した。衝撃処理前に、約０.５ml充填量の細胞を減圧下、７−ｃｍフィルター（ワットマン、Ｎo.４）によりろ過した。ろ過物をスクロース１２０ｇ/lを含有するゲルライト固化Ｎ６培地に移した。塗布した細胞を衝撃処理前に２５℃に４時間保持した。衝撃処理後、塗布物を２５℃２４時間培養した。タバコ懸濁細胞：ニコチアナ・タバクム（Ｎicotiana tabacum）細胞株ＮＴ-１( アン（Ａn）、１９８５)を、２,４−Ｄ２ mg/lおよびスクロース（３０g/l）を添加したムラシゲースクーグ培地（ＭurashigeおよびＳkoog）（ＭＳ３Ｓ）で育成した。細胞は週に一度、５００mlフラスコ中で５mlの接種物として新鮮培地１００mlに加えることで継代培養した。フラスコをロータリーシェーカー上１２５ rpm、２７℃で培養した。４日後、培養物の一部０.５ mlを滅菌フィルター（ワットマンＮo.４）に展開し、それを次いで１２％スクロース添加ＭＳ培地に移し、衝撃処理前に４時間室温保持した。３．植物細胞の衝撃処理組織を金マイクロプロジェクタイルで衝撃処理し、プラスミド混合物を沈殿させた。全実験において、トウモロコシおよびタバコ用内部対照としてｐＧＵＳプラスミドＤＮＡを使用した。同時形質転換実験では、金粒子は同一質量の全プラスミドＤＮＡ（標的プレート当たり０.５μg各プラスミドＤＮＡ）または基質プラスミドに対して２：１のモル比でＶirＤ１およびＶirＤ２遺伝子を担持するプラスミドを担持していた。安定な形質転換実験では、同時形質転換混合物はnpt ＩＩ選択プラスミドに対して５：１の分子量比でＶirＤ１およびＶirＤ２遺伝子を担持するプラスミドを含有していた。標的プレート当たり衝撃に要するプラスミド混合物の各アリコートは選択マーカー０.１μgおよびp３５ＳＤ１およびp３５ＳＤ２プラスミドＤＮＡ各０.５μgからなっていた。各ＤＮＡの適切な量を総量１０μlに混合し、１.０μm金ミクロ担体（６０mg/ml）５０μl上に沈積するように２.５ＭＣaＣl₂ ５０μlおよび０.１Ｍスペルミジン遊離塩基２０μlで沈殿させた。ミクロ投射物による衝撃処理はＰＤＳ−１０００Ｈeバイオリスティック装置（デュポン）で実施したが、その際、遮断スクリーン棚の下８cmの位置にサンプルを載せた１５００ psi破砕ディスクを使用した。４．タバコ懸濁細胞の安定な形質転換衝撃処理の２４時間後、タバコ細胞をカナマイシン３００μg/ml含有ＭＳ３Ｓプレート上に移植した。衝撃処理から約３週間後に生成した個々の微小カルスをカナマイシン３００μg/ml添加新鮮プレート上に移植した。同じ培地上２度の継代培養の後、タバコ細胞約１００mgをカナマイシン３００μg/ml添加液体培地２５mlに接種し、懸濁培養を開始した。５．一過性発現アッセイ供給者の推奨に従って、組織抽出物中のルシフェラーゼを測定した（ルシフェラーゼ・アッセイ・システム、プロメガ（Ｐromega））。β−グルクロニダーゼ活性はＧＵＳ-ライト・キット（トロピックス（Ｔropix））を用い、化学発光アッセイ法により定量した。ルシフェラーゼおよびβ−グルクロニダーゼ活性は、アナリティカル・ルミネッセンス・モデル２００１ルミノメーターにより測定し、２５℃１０秒間積算して光単位で表す。６．ＤＮＡ抽出およびサザン・ブロット・ハイブリダイゼーション細胞培養物は培養１０日後にろ過、回収し、液体窒素中凍結した。ＤＮＡは記載のように単離した（ホール（Ｈall）ら、１９９１）。ゲノムＤＮＡ約５μgをＥcoＲＩでの消化に用いた。０.７％アガロースゲル上分離した後、ＤＮＡを遺伝子スクリーン/メンブレンに移し、製造業者記載の条件に従いハイブリダイゼーションを実施した（ＮＥＮリサーチ・プロダクト、デュポン）。ＤＮＡプローブはファルマシア社のオリゴ標識キットを用い、［a-³² Ｐ］dＣＴＰで標識した。この新しいプローブはnptＩＩ遺伝子の２−kb ＰstＩフラグメントに相当する（第２図）。該 lucプローブはルシフェラーゼ遺伝子の０.７ kb ＸbaＩ-ＥcoＲＩフラグメントに相当する(第２図)。プローブを除去するために、メンブレンを０.１％ＳＤＳ溶液で１００℃５分間処理し剥ぎ取った。７．Ｔ-ＤＮＡ/植物ＤＮＡ結合物のクローニング形質転換したタバコカルスからのＤＮＡ（３０μg）をＥcoＲＩで消化し、１％シー・プラーク(sea-plaque)アガロースゲル（ＦＭＣ）上分離用電気泳動に付した。クローン化すべきフラグメントのサイズに合わせてアガロース薄片をゲルから切り出し、ＤＮＡをＱＩＡクイック・ゲル・抽出キット（キアゲン（Ｑia gen））でアガロースから抽出した。次いで、フラグメントをｐＵＣ１９の脱ホスフォリル化ＥcoＲＩ部位にクローン化した。連結反応混合物はエレクトロポレーション（電気穿孔法）によりＥ.coli ＨＢ１０１に形質転換するのに用いた。適正な挿入物を有するプラスミド含有コロニーを、０.５ kb ＣaＭＶ３５Ｓプロモーターフラグメントをプローブとして用いるコロニーフィルター・ハイブリダイゼーションにより同定した。ドナープラスミドＤＮＡと植物ＤＮＡとの結合物の配列は、プライマー５'−ＣＣＡＣＴＡＴＣＣＴＴＣＧＣＡＡＧＡＣＣ−３'（配列番号８）を用い分析した；該配列はＣaＭＶ３５Ｓ中の右境界配列から１０６−bpの距離に位置している。Ｄ．結果１．実験設計ＶirＤ１およびＶirＤ２遺伝子産物が植物細胞中で発現したときに、Ｔ-ＤＮＡ境界配列をニックするか否かを探求するために、我々は試験プラスミドpＢＲ( ＋)Ｌucを構築した；該プラスミドはプロモーターとルシフェラーゼ遺伝子のコード領域との間に基質Ｔ-ＤＮＡ境界配列を含有している。ＣaＭＶ３５Ｓプロモーターとルシフェラーゼコード領域との間に右境界配列を挿入しても、植物組織内でのルシフェラーゼ遺伝子の発現を阻害はしない（データ非開示）。境界配列は、ＶirＤ１およびＶirＤ２遺伝子産物により導入された部位特異的切れ目（ニック）がルシフェラーゼｍＲＮＡの鋳型であるＤＮＡ鎖に切れ目（ニック）を入れるようにし、その結果、ルシフェラーゼ転写と酵素の生成が減少するような方法で配置した。ｐＲＢ(+)ＬucおよびvirＤ遺伝子を担持するプラスミドで植物細胞を同時衝撃処理後、境界配列でのニック形成のいずれもがルシフラーゼ活性をアッセイすることで定量的に測定し得るようにする。しかし、ルシフェラーゼ活性の低下は、ＶirＤ１およびＶirＤ２遺伝子産物がプロモーターとコード配列との間に位置する境界配列に結合するためということでも説明し得る；その結合がルシフェラーゼ遺伝子の転写を阻害するからである。それ故、これら二つの可能性を区別するためにプロモーターに関して逆方向に境界配列を有するプラスミドｐＲＢ(-) Ｌucを試験した。もしルシフェラーゼ活性の低下が,ＶirＤ遺伝子産物が境界配列に結合した結果であるならば、その時は境界配列が逆方向でもその低下が観察されるはずである。ＶirＤ１およびＶirＤ２タンパク質が、境界配列に切れ目（ニック）を生じる前に衝撃処理植物細胞に一過性に生じる以上、そのような切れ目（ニック）の形成は多分、ルシフェラーゼ遺伝子の転写が既に始まってから後に起こるだろう。それ故、ルシフェラーゼ活性の測定は植物細胞中のＶirＤ１およびＶirＤ２活性よりも、多分下回った値となるはずである。植物細胞中でＶirＤ１およびＶirＤ２遺伝子を発現させるために、それぞれのオープン・リーディング・フレーム（ＯＲＦ）をＣaＭＶ３５Ｓプロモーターの制御下に置いた。ＶirＤ２ＯＲＦを、コントロールとして作動するプロモーターに関し、アンチセンスの方向に導入した。トウモロコシ・アルコール・デヒドロゲナーゼ１・イントロン１の存在がトウモロコシ中の遺伝子の発現を増大させるということが判明していたので（カリス(Ｃallis)ら、１９８７）、我々もまたトウモロコシの一過性発現実験に用いるp３５ＳＡdhＤ１およびp３５ＳＡdhＤ２（プロモーターとＶirＤ１およびＶirＤ２ＯＲＦ遺伝子をそれぞれコードする領域との間に挿入したイントロンを含む）を構築した。β−グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）遺伝子を発現するプラスミドｐＧＵＳを、ＤＮＡ導入の効率を制御するための内部基準として各衝撃処理ごとに包含させた。全ての場合に、ＤＮＡ搬入効率の多様性を補正するために、レポーターの活性をＧＵＳ活性に対するルシフェラーゼ活性の比として表わす。２．イン・プランタでのＶirＤ１およびＶirＤ２遺伝子産物による境界配列の切断を試験するための一過性発現アッセイトウモロコシおよびタバコ細胞がＴ-ＤＮＡ境界配列を介して転写に影響するその能力を個々に試験するために、まず一時的にＶirＤ１およびＶirＤ２遺伝子で同時搬入した我々のテストプラスミドで該細胞を別々に形質転換した。ｐ３５ＳＤ１ＤＮＡまたはp３５ＳＡdhＤ１ＤＮＡをｐＲＢ(+)ＬＵＣＤＮＡと共に同時搬入した後、ＧＵＳ活性に対するルシフェラーゼの８０％制御レベルをタバコおよびトウモロコシ組織で観察した（表１および表２；下表参照）。ｐ３５ＳＤ２ＤＮＡ（タバコ）またはp３５ＳＡdhＤ２ＤＮＡ（トウモロコシ）をｐＲＢ(+)ＬＵＣＤＮＡと共に同時搬入すると、ＧＵＳ活性に対するルシフェラーゼの制御レベルが５０％および８０％となる（第１表および第２表；下記参照）。表１．タバコ細胞中のＶirＤ１およびＶirＤ２の活性。プラスミド構成物を第１図に描出し、バイオリスティック装置によりタバコ細胞に搬入した。括弧内の数字はプラスミドのモル比を示す。培養２４時間後、組織を均一化し、酵素活性を定量した。活性をルシフェラーゼ（Ｌuc）対β−グルクロニダーゼ（Ｇlu）の比で表わす。衝撃処理ごとに分析し、データを繰返し６回の平均値プラス・マイナス標準偏差として表わす。％コントロール値は、対照プラスミドで観察される活性に対するルシフェラーゼ対β−グルクロニダーゼ活性の比から定量した。表２．トウモロコシ細胞中のＶirＤ１およびＶirＤ２の活性。活性は第１表の脚注記載と同様に表わす。二つのvir遺伝子は一緒になると相乗効果を示すように思われた。等量のｐＲＢ(+)ＬＵＣＤＮＡをＶirＤ１およびＶirＤ２担持プラスミドと共に（１：１：１の比）バイオリスティック装置により同時搬入すると、ルシフェラーゼ活性がタバコの場合は対照の約２０％に（第１表）、またトウモロコシ細胞の場合には１０％にまで（第２表）低下する。ＶirＤ１およびＶirＤ２プラスミドの比がテストプラスミドに対して高い（２：２：１）場合には、ルシフェラーゼ活性が更に低下して、タバコ細胞では約１０％（第１表）に、トウモロコシ細胞では１％（第２表）となる。同様の実験を、対照プラスミドp３５ＳＤ２(rev)(タバコ)またはp３５ＳＡdhＤ２(rev)(トウモロコシ)をアンチセンス方向のＶirＤ２コード配列共に用いて実施すると、予想どおりにＶirＤ１単独で実施した実験と同様の結果を与えた（第１表および第２表）。この事実は、我々の内部標準ＧＵＳ遺伝子が、搬入した総ＤＮＡ濃度を変化させる効果に対し効果的に制御したことを証明している。テストプラスミドのＴ-ＤＮＡ境界を方向逆転させると、ルシフェラーゼ遺伝子の一過性発現に対するＶirＤ１および/またはＶirＤ２遺伝子の影響が消失するか大幅に減少した。pＢＲ(-)Ｌucをp３５ＳＤ１およびp３５ＳＤ２プラスミドでタバコ細胞に衝撃処理しても、ルシフェラーゼ活性の有意な低下は認めなかった。同様に、ｐＢＲ(-)Ｌucをp３５ＳＤ１またはp３５ＳＤ２と共にそれぞれ別個に同時搬入しても、ルシフェラーゼ活性の有意な低下を示さなかった（第１表）。これらの観察が強く示したことは、ｐＢＲ(+)ＬucテストプラスミドとＶir Ｄ１およびＶirＤ２遺伝子で見られたルシフェラーゼ活性の低下は、アグロバクテリウムで観察されたと同様のvir遺伝子産物により生じた右境界配列での鎖特異的切れ目（ニック）の結果ということである（総説として、ザンブリスキー（ Zambryski）、１９９２）。３．安定な形質転換体の分析ＶirＤ１およびＶirＤ２遺伝子産物の活性を評価するために、タバコ懸濁細胞の安定な形質転換を次いで実施した；その評価はこれらの遺伝子をその基質ＤＮＡと共にバイオリスティック装置により同時搬入した後のＤＮＡ組込みパターンに基づいた。これらの実験にはｐＮeoＲＢＬucを用いた；このものは左境界Ｔ- ＤＮＡ、選択可能マーカーとしてのnptＩＩ、および３５ＳＲＢ(+)Ｌuc遺伝子を、プロモーターとルシフェラーゼコード領域の間に挿入した右境界Ｔ-ＤＮＡと共に含有している。下記、結果と考察に示すように、我々は、境界配列上のＶir Ｄ１およびＶirＤ２活性の結果として、Ｔ-鎖を生じることになったタバコ・ゲノムへのこれらＤＮＡ挿入を“アグロリスティック事象”と命名した。これに対し、我々は、バイオリスティック装置により遺伝子を植物細胞中に搬入した結果通常起こる過程を表わすＤＮＡ挿入断片を“バイオリスティック事象”と命名した。バイオリスティック事象と推定上のアグロリスティック事象を区別する当初の基準は、Ｔ-ＤＮＡの切除によりｐＮeoＲＢＬucからＬucコード領域が排除されてしまったために形質転換したクローンにルシフェラーゼ活性が欠如しているということであった。分子のレベルでは、アグロリスティック事象を表わす導入遺伝子は、neoプローブとはハイブリダイズするが、lucプローブとはしないはずである。更に、アグロリスティック事象では、導入したＤＮＡと植物ＤＮＡとの間の結合部配列はＴ-鎖の右境界末端に厳密に対応するはずである。両型の事象は同一の植物細胞内で起こることもあるが、そのようなクローンはルシフェラーゼ活性が存在するということで、遺伝子的にはバイオリスティック事象として記録する。バイオリスティック事象と推定上のアグロリスティック事象の双方をサザン・ハイブリダイゼーションにより探求し、各挿入タイプの頻度を測定した。タバコ懸濁細胞はｐＮeoＲＢＬucプラスミドＤＮＡをp３５ＳＤ１およびp３５ＳＤ２ＤＮＡと共に１：５：５の比率で被覆したマイクロプロジェクタイルで衝撃処理した。対照として、ｐＮeoＲＢＬucプラスミドを単独で衝撃処理し、また、境界欠損対照プラスミドpＮeoＬucもp３５ＳＤ１およびp３５ＳＤ２ＤＮＡと共に共衝撃処理した。安定な形質転換体は、カナマイシン含有培地上に生育させて選択した。単一衝撃フィルター当たり平均４０のカナマイシン耐性クローンが出現したが、一つまたは二つだけのカルスにつき更にプレートごとに分析した。同数のカナマイシン抵抗カルスを、対照プラスミドｐＮeoＲＢＬuc ＤＮＡ単独またはp ＮeoＬuc ＤＮＡプラスp３５ＳＤ１ＤＮＡおよびp３５ＳＤ２ＤＮＡでの衝撃処理後に回収した。アグロリスティック事象の頻度を大まかに推定するには、総カナマイシンカルスに対し、ルシフェラーゼを発現しないと分析されたカナマイシン耐性カルスの総数比を算出することで実施できた。この基準によると、アグロリスティック事象の頻度は約１０％であった；分析した３２カルス株の内、３株はルシフェラーゼ活性を発現しなかった。上に議論したように、アグロリスティック事象とバイオリスティック事象が同一の植物細胞に起こり得るという理由で、この数値は多分アグロリスティック事象の頻度としては低い評価である。４．対照“バイオリスティック”事象のサザン・ブロット分析 (i)pＮeoＲＢＬuc単独、および(ii)p３５ＳＤ１およびp３５ＳＤ２ＤＮＡで衝撃処理したpＮeoＬucプラスミドでそれぞれ衝撃処理した後、得られた対照カナマイシン耐性カルス株からのＤＮＡにつきサザン・ブロット・ハイブリダイゼーションを実施した。ゲノムＤＮＡをＥcoＲＩで消化した；これはneoプローブおよびlucプローブの双方に類似したｐＮeoＲＮＬucプラスミドから３.９ kbのフラグメントを生じる（第２図）。ゲノムＤＮＡ消化物をneoプローブとハイブリダイズさせると、全てのレーンに予測したサイズ（３.９ kb）のハイブリッド・バンドを示した；未反応のフラグメントコピー数は、ハイブリダイゼーション強度をコピー対照レーンと比較して、核当たり１から１０以上と変化した。プローブとして使用した境界欠損対照プラスミドpＮeoＬucと共にp３５ＳＤ１および p３５ＳＤ２ＤＮＡで同時衝撃処理した形質転換株をサザン・ブロット分析すると、これらの株にはnptＩＩ遺伝子の無傷の再編成コピー双方が存在することが明らかとなった。このような再編成はバイオリスティック装置によって得られた形質転換体にはしばしば見られることである。５．アグロリスティック事象候補のサザンブロット分析サザンブロット分析を、pＮeoＲＢＬucの同時衝撃により得た１６種のカナマイシン耐性カルスのＤＮＡにつき、ハイブリダイゼーション・プローブとしてp ３５ＳＤ１およびp３５ＳＤ２ＤＮＡを使用し実施した。サザン・ブロット分析では、ルシフェラーゼ活性が陽性と判定された３２種およびルシフェラーゼを発現しないと判定した３種から１３種のカルス株を無作為に選定した。ルシフェラーゼ陽性カルス株からのＤＮＡはneoプローブとハイブリッド形成する予測サイズ（３.９ kb）のバンドを含んでいた。無傷のnptＩＩ遺伝子コピー数は、ハイブリダイゼーション強度をコピー対照レーンと比較して、核当たり１から１０の範囲であった。観察されたコピー数はpＮeoＬuc ＤＮＡならびにp３５ＳＤ１およびp３５ＳＤ２ＤＮＡで形質転換したカルスでは非常に少なかった。 pＮeoＲＢＬucと共にp３５ＳＤ１およびp３５ＳＤ２ＤＮＡで衝撃処理した形質転換カルス全てについてそのＤＮＡには３.４ kbのバンドを観察した。このサイズのフラグメントはこれらの株においてＶirＤ２プローブとハイブリッド形成することが判明した。Ｎeoプローブ用フラグメントは、p３５ＳＤ１およびp３５ＳＤ２構築物にも存在するターミネーター配列の断片を含んでいた；それは標識プローブの僅か１.２％を表わすに過ぎないが、ＶirＤ遺伝子挿入物のコピーは多数あるはずで、目視し得る大きさのシグナルを生じはずである。ブロットをlucプローブとハイブリッド形成させると、３群の形質転換カルス株が識別し得た：(i)neoプローブおよびlucプローブとハイブリッド形成する挿入物をもつカルス株；(ii)その一部の挿入物がneoプローブのみとハイブリッド形成し、一部がneoおよびlucプローブの双方とハイブリッド形成するカルス株； (iii)neoプローブとのみハイブリッド形成する挿入物をもつカルス株。このカルスの第１の群は、多分、アグロリスティック事象を含んでいなかったのだ。カルスの第２の群は多分２種の事象を含んでいた：その一つはアグロリスティック事象で、neoプローブとハイブリッド形成する４.８ kb、４.６ kbおよび５kbフラグメントの存在により証明されるもの、およびもう一つはバイオリスティック事象で、lucプローブとハイブリッド形成する３.９ kbフラグメントの存在により証明されるものである。カルスの第３の群は、neoプローブとのみハイブリッド形成するという能力に基づき、推定上のアグロリスティック事象のみを示した。三種のカルスはこの群に入る；一番目は３.２ kbのハイブリッド・バンドを含むもの、二番目は３.８kbと５kbという二つのハイブリッド・バンドを含むもの、そして三番目は５.５ kbの一本のバンドを含むものである。これら三つのハイブリダイゼーションパターンは特異であり、明らかに独立した単一細胞形質転換事象を表わしている。サザンハイブリダイゼーションにより分析した１６種の形質転換タバコ株の内で、１０種がバイオリスティック事象を示し、３種が推定上のアグロリスティック事象を示し、３種が両方を示した。６．推定上のアグロリスティック事象の分子分析推定上のアグロリスティック挿入事象の性質は、組込んだＤＮＡとそのような推定上の事象と一致するハイブリダイゼーションパターンを示すカルス株中の植物ＤＮＡとの間の結合部の配列を決定することにより最終的に証明した。これらの結合をもつカルス株からのＤＮＡフラグメントをクローン化し、Ｔ-ＤＮＡ境界の内側から外側へ向けて配列を決定した（方法参照）。ヌクレオチド配列は、それぞれのフラグメントが右境界/植物ＤＮＡ結合部を示す配列を含んでいることを明らかにした。Ｔ-ＤＮＡの右側末端は、Ｔ-ＤＮＡの右境界配列のニック形成部位と一致した。５例の内４例の植物ヌクレオチド配列は、ｃＤＮＡについてすでに他所で報告されているタバコ結合配列と完全に一致した。興味深いことに４例全てにおいて、Ｔ-ＤＮＡの右境界は、遺伝子の５'−非翻訳領域のポリアデニル化部位に近い高ＡＴ領域で植物遺伝子に関してアンチセンス方向に向いたＣaＭＶ３５Ｓプロモーターと共に挿入されている。付加的ヌクレオチドおよび反復配列は、右側結合部位には見られなかった。標的部位の欠如が起きたのか否かは、挿入フラグメントの左境界が決まっていないので結論し得ない。対照として、右境界配列とその両側に隣接領域を含むＤＮＡフラグメントを、バイオリスティック事象ＤＮＡフラグメントと一致するハイブリダイゼーションパターンを示すカルス株からクローン化した。これらの事象からのヌクレオチド配列は右境界配列−植物ＤＮＡ結合を示さず、むしろ右境界配列全長および期待したルシフェラーゼコード配列は範囲外にあることを示していた。Ｅ．結論Ｔiプラスミドがコードするビルレンスタンパク質ＶirＤ１およびＶirＤ２はアグロバクテリウムにとってＴ−鎖形成のために必要である。ここで我々は、Ｃ aＭＶ３５Ｓプロモーターの制御下で境界配列を巻き込んでいるプラスミドと共に、二種類のビルレンス遺伝子ＶirＤ１およびＶirＤ２をバイオリスティック装置によって導入した後に、インプランタ中でＴ-ＤＮＡが形成されたことの証明と植物細胞中への組込みを紹介する。形質転換したタバコカルスの約１０％がアグロリスティック挿入物、すなわち、ＶirＤ１およびＶirＤ２遺伝子産物が作用した後に組込まれたＤＮＡのみを有していた。形質転換したカルスの同様のフラクションは、アグロリスティック事象とバイオリスティック事象の両方を含んでいた。アグロリスティック事象中の導入遺伝子::植物ＤＮＡ結合部には、右境界配列内に部位特異的切断があることを証明した；この事実は２５−bpの反復配列をもつ最初の３ヌクレオチドに続く右境界Ｔ-ＤＮＡ末端につき開示する集積データと一致している（ゲイセン（Ｇheysen）ら、１９９１；メイエルホッファー（Ｍayerhofer）、１９９１；オオバ、１９９５）。組込み事象の正確さは、植物細胞核の組換え工程にはＶirＤ２が直接関与しているものとして判断されている（チンランド（Ｔinland）ら、１９９５）。アグロリスティック事象の組込み部位は、ここでは、転写された領域で同定する；これは、異種植物（コンツ（Ｋoncz）ら、１９８９；ハーマン(Ｈerman)ら、１９９０；カートバンディット(Ｋertbundit)ら、１９９１）中Ｔ-ＤＮＡは潜在的に転写可能性のあるゲノムの位置に、植物染色体（チャイら、１９８６；ウォールロート(Ｗallroth)ら、１９８６）に無作為分布したＴ-ＤＮＡ挿入物と共に優先的に組込まれるというデータを支持する。Ｔ-ＤＮＡ組込みは通常、植物ＤＮＡ中での大きな再配列とは関係ないが、標的植物ＤＮＡ配列の欠失、逆位および複製がＴ-ＤＮＡ形質転換の間に起こる。ここで実験したアグロリスティック事象にとって、植物の標的部位では注目すべき主要な再編成はなかった。オープンリーディングフレームに対しアンチセンスの方向を向いた右境界にＣ aＭＶ３５Ｓプロモーターをもつ既知タバコ光誘導および/または光合成遺伝子を、ポリアデニル化シグナル近傍にアグロリスティックに組込むと、一致したパターンとなるのは興味がそそられる。この方向でＴ-ＤＮＡ構造を挿入することはアンチセンス転写を生じることになり、相当するタバコ遺伝子の発現を不活化することになる。しかしながら、これらの非光合成培養ＮＴ１細胞はこのような光合成遺伝子を必要としない。右境界配列での切断が頻繁に起こると思われる一過性発現実験に基づいて、基質分子を見かけ上高率で切断した。驚くべきことに、この比率は安定な形質転換には維持されなかった。このことはＶirＤ２で切断した後の右境界配列連結反応により説明することができた；と言うのは、イン・ビトロ・アッセイがＶirＤ２はＴ-ＤＮＡ境界配列を含む一本鎖オリゴヌクレオチドの範囲内で部位−特異的切断−結合反応を触媒することを示しているからである（パンセグロー（Ｐanse grau）ら、１９９３）。もう一つの解釈は、効率的なアグロバクテリウム介在形質転換に必要な一本鎖結合ＶirＥ２が欠如しているからというものである。Ｔ- 鎖に結合し、防御することのできる植物細胞中の非特異的一本鎖結合タンパク質ＶirＥ２に等価なものがある、と仮定することはできるが、virＥ２遺伝子をＶi rＤ１およびＶirＤ２と共に付加すると、アグロリスティック事象の回収効率が改善するはずである。我々がまた知り得た欠点は、ＶirＤ１およびＶirＤ２遺伝子を一緒にして形質転換プラスミドと共に同時搬入すると、多分、バイオリステイックに高頻度で同じ形質転換株に組込まれてしまうことである；同時形質転換はバイオリスティック装置によると非常に効率的である。これら不要の遺伝子は異なった種類の外来ＤＮＡの代表である。しかし、我々はそれらが独特の挿入メカニズムをもつという理由で、それらが“アグロリスティック”挿入フラグメントに結合せず、トランスジェニック植物の引き続く育種により除去することができると仮定する。この仮説は再生しないこれらのトランスジェニックＮＴ１細胞では試験することができない。このアグロリスティック形質転換システムは幾つかの他と異なる利点をもつ： (i)このシステムはバイオリスティック形質転換法に影響を受け易い植物標的組織に直ちに適用することができる；(ii)挿入されたＤＮＡは外来のベクターＤＮＡをもたない；(iii)ＶirＤ１およびＶirＤ２遺伝子なしで搬入したＤＮＡの場合より関心のある遺伝子コピーの挿入が少ない。この場合、不安定性に関係する可能性のある相同性領域が最小となる。このように、アグロバクテリウムＴ-ＤＮＡ挿入メカニズムの簡潔で精度の高いアグロリスティック手法をバイオリスティック搬入の最良の形態と組み合わせると、農業的に価値の高いトランスジェニック作物植物の生産に広く適用可能な新しい技術を提供することができる。実施例２：植物発現カセットの構築トランスジェニック植物体または植物細胞中での発現を企図した遺伝子配列を発現カセット中の適当なプロモーターの後と適当な転写ターミネーターの上流に集め、キメラ遺伝子を創製する。これらの発現カセットは、実施例３に記載した植物形質転換ベクターに容易に移すことができる。プロモーターの選択発現カセットまたはキメラ遺伝子に用いるプロモーターの選択は、トランスジェニック植物体中の導入遺伝子の空間的一時的発現パターンを決めることになる。選択したプロモーターが特定の細胞型（葉部表皮細胞、葉肉細胞、根部表層細胞など）において、あるいは特定の組織もしくは器官（例えば、根部、葉部または花部）において導入遺伝子を発現することになり、この選択が導入遺伝子において望ましい位置での発現に反映することになる。一方で、選択したプロモーターは光誘発または他の一時的な制御プロモーターの下で遺伝子の発現を駆動させることも可能である。別の変法では、選択したプロモーターを化学的に制御する。この場合には、必要とするときのみ、化学誘発物質で誘発処理し、導入遺伝子の発現を誘発することができる。転写ターミネーター種々の転写ターミネーターが発現カセット用として入手可能である。これらのものは導入遺伝子とその適正なポリアデニル化部分を超える転写を終了させる。適当な転写ターミネーターおよび植物中で作用することが知られているものは、ＣaＭＶ３５Ｓターミネーター、tmlターミネーター、ノパリン・シンターゼ・ターミネーター、エンドウrbcＳＥ９ターミネーターである。これらは単子葉および双子葉植物の両方で使用することができる。発現を増強または制御する配列多くの配列がその転写単位内で遺伝子発現を増強することが判明しているが、これらの配列はトランスジェニック植物での発現を増加させるために、本発明の遺伝子と結合させて用いることができる。種々のイントロン配列は、特に単子葉植物細胞での発現を高めることが示されている。例えば、トウモロコシのＡdh１遺伝子のイントロンは、トウモロコシ細胞に導入すると、その同族プロモーターの下で野生型遺伝子の発現を有意に高めることが判明している。イントロン１がとりわけ効果的であることが分かり、クロラムフェニコール・アセチルトランスフェラーゼとの融合構築物中で高い発現を示した（カリス（Ｃallis）ら、ジーン・デベロープ（Ｇenes Ｄevelop.）１：１１８３−１２００（１９８７））。同じ実験系において、トウモロコシ・ブロンズ１（bronze １）遺伝子からのイントロンは発現増大において同様の効果を示した（カリスら、上記）。イントロン配列は植物形質転換ベクター中に、典型的には非翻訳リーダー内に常套的に包含されている。ウイルスから誘導した多数の非翻訳リーダー配列もまた発現を高めることが知られている。特に、タバコ・モザイク・ウイルス（ＴＭＶ、“オメガ−配列”）、トウモロコシ・クロロティック・モットル・ウイルス（ＭＣＭＶ）、およびアルファルファ・モザイク・ウイルス（ＡＩＭＶ）からのリーダー配列は発現増大に効果的であることが示されている（例えば、ガリー（Ｇallie）ら、ヌクレイック・アシド・リサーチ（Ｎucl．Ａcids Ｒes.）１５：８６９３−８７１１（１９８７）；スクゼスキー（Ｓkuzeski）ら、プラント・モレキュラー・バイオロジー（Ｐlant Ｍolec．Ｂiol.）１５：６５−７９（１９９０））。実施例３：バイオリスティックに搬入したＤＮＡ中の部位特異的組換えを実施するための“ヒット・エンド・ラン”法：リコンビナーゼｍＲＭＡの同時搬入Ａ.要約我々はバイオリスティック装置を用いてＤＮＡおよびｍＲＮＡを植物細胞に共搬入する方法を記載する。我々は種々の条件でマイクロプロジェクタイル上に沈着したＤＮＡおよびＲＮＡの安定性と回収率をゲル電気泳動法により証明した。活性ｍＲＮＡの搬入にはＣaＣl₂単独またはＣaＣl₂＋スペルミジン＋トリスバッファーによる沈着が有効であったが、非緩衝スペルミジンはＲＮＡをフラグメント化した。効率的な沈着法とトウモロコシおよびタバコ細胞へのバイオリスティック搬入法を用いて、我々はホタル・ルシフェラーゼをコードするイン・ビトロ合成のキャップ・ポリアデニル化ｍＲＮＡの発現を証明した。速度論的研究が証明するところによると、ルシフェラーゼｍＲＮＡの発現は同時に搬入された３５Ｓ/ルシフェラーゼＤＮＡの一過性発現よりも早い段階でピークに達した。バイオリスティックに搬入したＲ、すなわち、ザイゴサッカロマイセス・ルークシー（Ｚygosaccharomyces rouxii）の部位特異的リコンビナーゼをコードするｍＲＮＡの活性を証明するために、我々はトウモロコシ細胞に向け、ＲＳの逆方向コピーが両側に隣接した逆転３５Ｓプロモーター、それに続く３５Ｓリーダー、ルシフェラーゼ遺伝子および３５Ｓターミネーター領域を含む基質プラスミドを共搬入した。基質プラスミド単独では有意なルシフェラーゼ発現が起こらなかったが、ＲｍＲＮＡを同時搬入すると、その３５Ｓプロモーターがリコンビナーゼによりはじかれて、ルシフェラーゼ酵素が産生された。導入遺伝子の挿入と発現を制御する部位特異的組換え酵素システムの有効な使用について、ｍＲＮＡとして一時的にリコンビナーゼ活性を導入する利点と共に考察する。Ｂ．序論植物細胞へ遺伝子搬入するのに粒子衝撃を用いるときは、導入遺伝子ＤＮＡが無作為にゲノム中に、一般には多くのコピーを含む単位部位に入り込む（クライン（Ｋlein）ら、１９８８；クラインら、１９８９；ゴードン−カム・ダブリュ・ジェイ（Ｇordon-Ｋamm Ｗ.Ｊ.）ら、１９９０；バジル（Ｖasil）ら、１９９２；ワン・ワイ(Ｗan Ｙ.)およびルモー・ピー(Ｌemaux Ｐ.)、１９９４）。導入遺伝子の編成、挿入位置、時に認められる高コピー数などが幾つものメカニズムによる発現を不安定なものとする：例えば、導入遺伝子の複数コピーが相互作用して、アンチセンスまたはメチル化あるいはまだよく解明されていない他の“ 沈黙”のメカニズムにより互いに不活性化する（総説：マツケ・エム（Ｍatzke Ｍ）およびマツケ・エイ(Ｍatzke Ａ.)、１９９５）。導入遺伝子の複数コピーは単一挿入部位に連結するので、減数分裂を経て引き続き植物の生成に至る過程でコピー数を減少させることはできない。導入遺伝子発現の基礎研究のために、また農業的応用において導入遺伝子作物植物の商業生産にとって、導入した遺伝子の編成と発現における改良は優先順位が高い。部位特異的組換えシステムは、導入遺伝子の挿入パターンを単純化すること、および植物ゲノム中であらかじめ定められた部位にそれらを振り向けることの有用な手段となり得る（アルバート (Ａl bert)ら、１９９５）。数種の部位特異的リコンビナーゼが植物細胞中で活性であることが示されている（総説参照：オーデル(Ｏdell)およびラッセル(Ｒussell)、１９９４）：バクテリオファージＰ１のＣre/loxシステム、サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓac charomyces cerevisiae）の２μプラスミドからのＦＬＰ/ＦＲＴ組換えシステム、およびザイゴサッカロマイセス・ルークシー（マツザキら、１９８８）のpＳＲ１プラスミドからのＲ/ＲＳシステム。これらのシステムは簡単な故に利用度の高いものである；完全に操作する場合であっても、それらが必要とするのは単一のリコンビナーゼタンパク質（Ｃre，ＦＬＰ，Ｒ）およびその対応する標的、すなわち、短い所定の組換え部位（それぞれ、lox，ＦＬＰ，ＲＳ）である。更に、これらの組換え頻度は著しく高い。リコンビナーゼはその組換え反応により、認識部位の位置と方向に依存して三種のＤＮＡ再編成を媒介する。もしＤＮＡフラグメントが互いに逆方向の関係にある二つの部位に結合したならば、介在したＤＮＡの反転が起こる。もし二つの認識部位が同一方向にあるとすれば、介在ＤＮＡの切除と環状化が起こる。認識部位が別のＤＮＡ分子上にあるときは、遺伝子の交換が起こり、もし一方が環状であれば、その分子は他の分子に直鎖状に組込まれることになる。部位特異的リコンビナーゼ活性は簡易化するのに用いることができる；また標的導入遺伝子を植物に導入することができる。しかし、もしこの活性が持続するものであれば、組換え構造が不安定なものになりかねない。それ故に、リコンビナーゼ活性を一過性のものとして発現させることが望ましい。これは最近の研究で達成されたことであるが、そこではlox-含有導入遺伝子を、Ｃreを発現するトランスジェニック植物（アルバート（Ａlbert）ら、１９９５）中のlox部位に標的として組込んだことを証明している。lox部位はプロモーターとcre遺伝子のコード領域とのあいだに位置しているので、部位特異的組換えの結果はＣre発現を不活性化し、生成物を安定化した。実験した全ての組込み結果は、サザン・ハイブリダイゼーション分析に基づくと単一コピーであった。本研究で我々はバイオリスティック遺伝子搬入法を使用するためにＲ/ＲＳ部位特異リコンビナーゼシステムを適応した。Ｒ/ＲＳシステムはタバコで効果的に作用することが示されている：Ｒ遺伝子を一過性に原形質体に形質転換すると、その遺伝子産物は、ＤＮＡの部位特異的反転または切除により潜在性グルクロニダーゼ遺伝子となった（オノウチら、１９９２）。我々がここに証明するのは、バイオリスティック処理によりトウモロコシおよびタバコ細胞に搬入したＲ-リコンビナーゼは、効率は低いが（効率はパラメーターを最適化することで増加させ得た）同様に作用し、そのプロモーターを刺激して潜在ルシフェラーゼ遺伝子を始動させるということである。更に、リコンビナーゼを産生するにはＮＡよりもむしろｍＲＮＡを使用すると、ＤＮＡ基質を細胞中に導入した後、迅速にそれを産生するようになるが保証される。標的ＲＳ-部位は３bpの不斉コアにより隔てられた一対の１４bp 逆方向反復配列からなる３１bpのパリンドローム・ヌクレオチド配列を含んでいる（マツザキら、１９８８）。トランスジェニック植物の生産のためには、Ｒ− 遺伝子が植物ゲノムに挿入されるのを避けるために、そして形質転換の初期段階においてリコンビナーゼの発現が一過性でのみ起こるように、ＤＮＡよりもむしろリコンビナーゼｍＲＮＡを利用するのが望ましい。我々が以下に記載するのは、Ｒ−リコンビナーゼをコードするｍＲＮＡを標的ＲＳ−含有潜在ルシフェラーゼＤＮＡ構築物と共に同時導入する方法であって、それによってルシフェラーゼ遺伝子発現を活性化する一過性リコンビナーゼ活性を得た。Ｃ．材料と方法１．植物材料トウモロコシ細胞トウモロコシ（ジー・メイズ・エル；Ｚea mays Ｌ.）の懸濁培養はＢ７３関連選択株の未成熟胚から選択した凍結保存胚芽タイプIIカルスから開始した。凍結保存カルス（ディマイオ(ＤiＭaio)およびシリート(Ｓhillito)、１９９２）を急速融解し、その約１ｇをスクロース３０g/lおよび２,４−ジクロロフェノキシ酢酸（２,４−Ｄ）(２Ｎ６３Ｓ)添加Ｎ６液体培地（チュウ（Ｃhu）ら、１９７５）５０mlに加えた。培養物を暗所２５℃、オービタル・シェーカー１５０rp mの条件で培養した。懸濁培養物は、７日ごとに充填細胞量２mlを２Ｎ６３Ｓ液体培地に移すことによって継代培養した。細胞２００mgを含む培養物を滅菌デュラポアー・フィルター上に拡散し、浸透圧調整剤として１２％スクロース添加培地２Ｎ６上に置いた。平板化した細胞を衝撃処理に先立ち、４時間室温に保持し、衝撃後には２４時間まで保持した。タバコ細胞ニコチアナ・タバクム（Ｎicotiana tabacum）細胞株ＮＴ−１（アン（Ａn）、１９８５）を、２,４−Ｄ２mg/lおよびスクロース３０g/l添加ムラシゲ−スクーグ（Ｍurashige & Ｓkoog，１９６２）培地上で生育した。細胞は、５００ml フラスコ中接種材料５mlを新鮮な培地１００mlに加えることにより週に一度継代培養した。フラスコをロータリー・シェーカー上１２５rpm、２７℃で培養した。継代培養の４日後、細胞の一部０.５mlを無菌フィルター（ワットマンＮo.４）上に拡散した。次いで、フィルターを１２％スクロース添加ＭＳ培地に移し、衝撃処理前には４時間室温に保持し、衝撃処理後は２４時間まで保持した。２．プラスミドＴ７ＬＵＣＡ５０鋳型（第４図）を構築した：これはホタル・ルシフェラーゼｍＲＮＡのイン・ビトロ転写のためのものである：まず、lucをＴ７プロモーターに結合させ、次いで、Ｔ７/lucフラグメントをポリＡ挿入断片を含むpＵＣ１８に挿入した。Ｔ７プロモーターをlucコード領域に結合させるために、該Ｔ７プロモーターをＢgIIIとしてpＥＴ３（ローゼンバーグ（Ｒosenberg）ら、１９８７）から切り出し、pＵＣ１９のＢamＨＩ部位にクローン化してｐＡＴ２６を形成させた。配列＋９ないし＋２６をＰＣＲ介在欠失によりＢamＨＩ部位で置換し、ｐＡＴ２７を形成させた。pＣＩＢ１７１１(第４Ｃ図、下記参照)からＢam ＨＩ/Ａsp７１８フラグメントとして切り出した３５Ｓ−リーダー−ルシフェラーゼをｐＡＴ２７に導入して、Ｔ７Ｌucを形成させた。このプラスミドからのＴ７/luc挿入断片をＸbaＩ/Ａsp７１８フラグメントとしてpＵＣ１８Ａ５０Ｘに移動した。ｐＵＣ１８Ａ５０Ｘはオリゴヌクレオチド対を、Ａsp７１８(５')およびＨindIII(３')突出末端にフランクした５０Ａ−残基と共に含むpＵＣ１８誘導体である；そのＥcoＲＩ部位を合成オリゴヌクレオチドでＸbaＩ部位に変換した。ｐＴ７ＲecＡ５０（第４Ｂ図）はｐＵＣ１８Ａ５０Ｘ誘導体であり、このものはＴ７プロモーター、３５Ｓリーダー、およびそのポリＡ−コード領域に加えてリコンビナーゼコード領域を含む。３５Ｓリーダー/リコンビナーゼ・フラグメントをｐＲec（下記参照）から切り出してＢamＨＩ/Ａsp ７１８とし、ｐＡＴ２７に連結してｐＴ７Ｒecを形成させる。ｐＴ７ＲecからのＸbaＩ/ＫpnＩフラグメントを次にｐＵＣ１８Ａ５０Ｘに挿入してｐＴ７ＲecＡ５０を形成させた。ｐＣlＢ１７１１（第４Ｃ図）はｐＣlＢ７１０（ロススタイン（Ｒothstein）ら、１９８７）の誘導体であって、ｐＪＤ２０４（ド・ウエット(de Ｗet)ら、１９８７）からのホタル・ルシフェラーゼ・コード領域をＨindIII-ＢamＨＩとして、５'端ＢamＨＩ/ＰstＩ/ＨindIIIオリゴアダプターをもつｐＣＩＢ７１０ベクターのＢamＨＩ部位に導入し、ｐＣlＢ１７０１を形成させたものである。得られるプラスミドの３５Ｓプロモーター/リーダーはＢamＨＩ部位が転写開始点に確実に位置するように、そのＥcoＲＶ-ＢamＨＩフラグメントをpＤＯ４３５（オウ(Ｏw)ら、１９８６）のものと置換することにより調製し、pＣlＢ１７００とした。pＣlＢ１７００からのハイブリッド３５Ｓリーダー（５０bp）/ルシフェラーゼ・リーダー（２２bp）をＰstＩ部位でＮarＩ経由luc遺伝子に移し、５８bpの３５Ｓリーダーに相当する合成オリゴヌクレオチドおよびluc ＯＲＦの開始点と置き換えた（参照：カロッジー（Ｃarozzi）ら、この構築の詳細については発表準備中）。ｐＲec（第４Ｄ図）はｐＣlＢ１７１１の誘導体であるが、これは３５Ｓプロモーター、リーダーおよびターミネーター配列を保持し、リコンビナーゼ・コード領域と置き換えたルシフェラーゼ・コード領域を有する。これを達成するために、ｐＧＡＨＲ（オノウチら、１９９１）からのリコンビナーゼ遺伝子５'末端をＢamＨＩ/ＢgIIIフラグメントとしてｐＳＰ７２（プロメガ（Ｐromega））の対応する部位にクローン化し、ベクターＸholおよび挿入フラグメントＰvull部位間のＤＮＡをオリゴヌクレオチド:５'-ＴＣＧＡＧＴＴＧＣＡＴＧＣＡＧ-３' （配列番号９）と置き換えた；その結果、リコンビナーゼの開始コドン（下線）がＳphＩ部位に変わった。ベクターｐＣlＢ１７１１を同様に修飾し、３５Ｓ− リーダーの末端を以下のようにＳphＩと置き換えた：３５Ｓプロモーター/リーダーを含むＰstＩ/ＦcoＲＩフラグメントをｐＳＧpoly１１ベクターにサブクローン化し、ＢamＨＩ部位ユニークとした。ＢamＨＩ/ＸbaＩで消化後、ＳphＩ部位を含むリンカーを導入した：５'-ＧＡＴＣＧＣＡＧＣＡＴＧＣ(ＣＴＡＧ)-３' （配列番号１０；括弧内はオリゴヌクレオチドの相補鎖配列を示す）。得られた修飾ＰstＩ/ＥcoＲＩフラグメントは３−経路連結反応によりpＣlＢ１７１１バックボーンに復元した。続いて、内部ＳphＩ部位であるという理由で、二つの連続した連結反応において、リコンビナーゼ遺伝子を導入し、luc遺伝子に置き換えた。ｐ１ＲＳＬuc（第４Ｅ図）はｐＣlＢ１７１１の誘導体であって、３１−bp ＲＳ部位をルシフェラーゼ遺伝子の３５Ｓ−プロモーターと３５Ｓリーダーの間に挿入したものである。ＨindIIとＰstＩ部位間のプロモーターを先ずpＳＧpoly７にサブクローン化してpＳＧ３５Ｓを形成させ、次いで、ユニークＢamＨＩ部位に、ＲＳ（太字）およびＨindIII(下線)をもつ下記の配列に相当するオリゴ対を連結させた：５'-ＧＡＴＣＡＡＧＣＴＴＴＴＧＡＴＧＡＡＡＧＡＡＴＡＣＧＴＴＡＴＴＣＴＴＴＣＡＴＣＡＡ(ＧＡＴＣ)-３'（配列番号１１）挿入したオリゴ体を上に示したように時計回りであるように配列して決めたクローンを選択し、そのＲＳ-含有ＸbaＩ/ＰstＩサブフラグメントを３経路連結反応によりｐＣlＢ１７１１バックボーンに復元し、p１ＲＳＬucとした。ｐ２ＲＳＬuc（第４Ｆ図）はpＣlＢ１７１１の誘導体であって、反対方向３５Ｓプロモーターの両側に合成ＲＳ部位を導入してあり、かつ、luc遺伝子の残余部分に関して３５Ｓプロモーター全体が逆になっているものである。上記の３５Ｓ−プロモーター・サブクローンpＳＧ３５ＳをＨindII/ＸbaＩで消化し、ＲＳ（太字）およびＰstＩ部位（下線）をもつ下記配列に相当するオリゴ対を導入した：５'-ＡＧＣＴＡＣＴＧＣＡＧＴＴＧＡＴＧＡＡＡＧＡＡＴＡＣＧＴＴＡＴＴＣＴＴＴＣＡＴＣＡＡ(ＣＴＡＧ)-３'（配列番号１２）得られるクローンをＢamＨＩで消化し、ＲＳの二番目のコピーを前段に記載したオリゴ対に連結反応により導入した。クローンは、第二ＲＳ部位の方向が第一のものと反対のものを選択した（すなわち、５'-ＧＡＴＣＡＡＧＣＴＴＴＴＧＡＴＧＡＡＡＧ-ＡＡＴＡＣＧＴＴＡＴＴＣＴＴＴＣＡＴＣＡＡ(ＧＡＴＣ)-３'（配列番号１３）は時計回りと反対方向だった）。パリンドロームＲＳ配列の方向は下線の中心不斉トリヌクレオチドＣＧＴ（または他鎖のＡＣＧ）により明確にした。得られた２ＲＳプロモータークローンから、ＨindII/ＰstＩフラグメントを切り出し、２経路連結反応によりpＣlＢ１７１１に復元し、３５Ｓ−プロモーター・フラグメントの方向を逆転してp２ＲＳＬucを形成した。３．ｍＲＮＡの合成Ｔ７ＬucＡ５０およびＴ７ＲecＡ５０プラスミド（第４Ａおよび４Ｂ図）を、ポリ(Ａ)伸長部の直下流で切断するＨindIIIにより直鎖状化した。直鎖状化したＤＮＡをフェノール/クロロホルムで抽出し、次いで、エタノール沈殿した。直鎖状化したＤＮＡをイン・ビトロ転写するに当たり、［ｍ⁷Ｇ(５')ppp(５')］を含むＴ７キャップ−スクライブ（Ｃap-Ｓcribe）キット（ベーリンガー）からのＴ７ポリメラーゼを使用した。幾つかの実験では、転写産物を直ちにＲＮＡ分解酵素（ＲＮase）不含デオキシリボヌクレアーゼ（ＤＮase）（０.０３u/ml、ウオーシントン・バイオケミカル(Ｗorthington Ｂiochemical）でrＲＮアシン（r ＲＮasin；プロメガ（Ｐromega））(１u/ml)の存在下３７°５分処理した；最後に、フェノール/クロロホルムで抽出し、次いで、エタノール沈殿した。ｍＲＮＡの完全度および濃度をアガロースゲル電気泳動法により定量した。４．バイオリスティック供給体の滅菌金粒子（１.０μm−バイオラッド（Ｂiorad）、０.３μｍ−ヒレウス（Ｈerae us））を滅菌するに当たり、粒子６０mgを１００％エタノールと０.１％ＤＥＰＣ中に入れた。粒子をＲＮＡ分解酵素不含水で３度すすぎ、ＲＮＡ分解酵素不含水１mlまたはＲＮＡ分解酵素不含５０％グリセリン溶液１mlに再懸濁した。調製した粒子５０μl部を６回のショットに用いた。マクロキャリアーを１００％エタノールと０.１％ＤＥＰＣに浸漬し、１００％エタノールにより３回すすぎ、風乾した。ストップスクリーンはオートクレーブ処理した。５．核酸沈着バイオラッド（ＢioＲad）の指示書に従い、ＤＮＡを金粒子（６０mg/ml）懸濁液５０μlに沈着させた。ｍＲＮＡをテキストに示された種々の条件下で金粒子懸濁液５０μlに沈殿させた。全ての沈殿剤はＲＮＡ分解酵素不含であり、連続的に攪拌しながら４℃で金粒子懸濁液に加えた。全試薬を添加したのち、３分間攪拌を続け、次いで、簡単なミクロ遠心分離（１分）により沈積した。上清を除き、粒子を冷却１００％エタノールで１度洗浄し、１００％エタノール６０μ lに懸濁した。この混合物を攪拌し、１０μl部をピペットでマクロキャリアーディスク上に移し、層流フード中風乾した。６．植物細胞へのマイクロプロジェクタイル搬入マイクロプロジェクタイルを粒子加速器（ＰＤＳ−１０００/Ｈe装置）により、発射装置から５.５cmの位置に据えた１１００−１５５０psi破砕サンプルディスクを用いて植物細胞に搬入した。１００μｍメッシュのステンレス・スクリーンを停止板と組織の中間位置に置いた。標的プレートを１回（タバコ細胞）または２回（トウモロコシ細胞）投射処理した。７．ルシフェラーゼ・アッセイルシフェラーゼをプロメガ(Ｐromega)のルシフェラーゼ・アッセイ・システムにより供給業者の推奨に従い、組織抽出物としてアッセイした。ルシフェラーゼ活性をアナリティカル・ルミネッセンス・モデル２００１ルミノメーターにより検出し、２５℃で１０秒間集積した光単位で表した。比活性を算出するために、タンパク質濃度をバイオラッド・タンパク質・アッセイ・キットにより定量した。Ｄ．結果１．金粒子上未処理ｍＲＮＡの沈着ｍＲＮＡ搬入および続く発現を最適化するために、ｍＲＮＡを金粒子に沈着させる幾つかの方法を検討し、沈着物および上清中のｍＲＮＡの状態および回収率をアガロースゲル電気泳動法により分析した。各フラクションを“上清”（最初の沈殿反応から直接ピペット分離した）、“金”（ｍＲＮＡ沈積後水中に懸濁した金）および“水溶出物”（ｍＲＮＡ被覆金粒子を水に懸濁し、遠沈した後の上清）と名付けた。水溶出物は、植物細胞に搬入後、沈着したｍＲＮＡがどの程度直ぐに再溶解したかを定量するために試験した。デュポンのＤＮＡ沈殿法を１.０ＭＣaＣl₂および１６mＭスペルミジンの条件で実施したが、ｍＲＮＡは酷く分解した（データ非開示）。スペルミジン遊離塩基がＲＮＡをアルカリ水解してしまうらしい。そこで、スペルミジンを用いず、ＣaＣl₂を種々の濃度とし（１.０Ｍ，０.３Ｍおよび０.０７Ｍ）、ｍＲＮＡを金粒子に沈着させてみた。１.０ＭＣaＣl₂が優れた結果を与え、ＲＮＡ付着金粒子を１.０ＭＣaＣl₂中−２０℃で一夜培養すると、効率が９０−１００％に改善されることが分かった。２度エタノール洗浄した粒子は、１度のみのものよりもより容易にｍＲＮＡを水溶出物中に溶出した；これは多分ＣaＣl₂が除去されたためである。２．バイオリスティック搬入後のルシフェラーゼｍＲＮＡの一過性発現この方法で金粒子に沈着させたｍＲＮＡがバイオリスティック搬入過程を無事通り抜け、植物細胞中で一過性に機能し得るかどうかを調べるために、イン・ビトロ合成したルシフェラーゼｍＲＮＡを植物細胞に搬入した。ＣaＭＶ３５Ｓリーダー配列および５０アデニレート残基を有するポリ(Ａ)末端部を、植物細胞中でルシフェラーゼ発現が増強されるようにＴ７ＬucＡ５０鋳型構築物に包含させた。キャップ形成ルシフェラーゼｍＲＮＡを金粒子上に１.０ＭＣaＣl₂で沈着させ、−２０℃で一夜培養した；この粒子をトウモロコシおよびタバコ懸濁細胞中で衝撃処理した。ルシフェラーゼ・アッセイは搬入後、２、６および２４時間目に実施した。結果を下記第３表に示す。２時間目まで、有意なルシフェラーゼ活性が検出された。活性は６時間目まで増加したが、２４時間目までには減少した。これに対して、バイオラッドＤＮＡ処方により金粒子に沈着した３５Ｓ−ルシフェラーゼ遺伝子（pＣＩＢ１７１１）を含むＤＮＡプラスミドの一過性発現は、２４時間目で最大であった。３．Ｒ/ＲＳリコンビナーゼ・システムがトウモロコシ中で機能していること；逆方向プロモーターーがルシフェラーゼ一過性発現を始動させることの証明部位特異的リコンビナーゼシステムＲ/ＲＳ（ザイゴサッカロマイセス・ルクシー（Ｚ．rouxii）から）が、タバコで機能すると報告されている（オノウチら、１９９１）ようにトウモロコシ中でも機能するか否かを試すために、二重の一過性発現アッセイを用いた；そこでは、トウモロコシ細胞中一過性発現するＲ− リコンビナーゼは、同時搬入した潜在性ルシフェラーゼ遺伝子を一過性発現させるために、プロモーターのフリップを必要とする。陽性の対照として、二重アッセイをタバコ細胞で試験した。マイクロプロジェクタイル衝撃処理により、３５Ｓ −リコンビナーゼ遺伝子含有pＲecプラスミド（第４Ｄ図）を潜在性ルシフェラーゼプラスミドp２ＲＳＬuc（第４Ｆ図）と共にトウモロコシ細胞に同時搬入した。ｐ２ＲＳのプロモーターをフリップすると、プロモーターとluc発現の効果が未知のluc遺伝子との間に起こるＲＳ(３１bp)のコピーを止めてしまう。そこで我々は陽性対照プラスミドを構築した；それ故、p１ＲＳＬucを構築し（第４Ｅ図）、リコンビナーゼにより反転したp２ＲＳＬucの産生を予想どおり促進した。ｐ１ＲＳＬucはＣaＭＶ３５Ｓプロモーターを、正しい向きではあるが、リーダーとルシフェラーゼ・コード配列からＲＳ部位一個分隔てて含んでいる。ｐ１ＲＳＬucはタバコおよびトウモロコシの両方でpＣlＢ１７１１と同様のレベルで発現することが判明した（データ未開示）；該遺伝子のＲＳ“フットプリント ”はluc発現への影響がほんの僅かである。ｐ２ＲＳＬucおよびpＲecの混合物、ならびに対照プラスミドp２ＲＳＬuc単独、p１ＲＳＬucおよびp１ＲＳＬucプラスpＲecを、バイオラッド（ＢioＲad）プロトコールにより金粒子上に沈着させ、タバコおよびトウモロコシ細胞に向け衝撃処理した（第４表）。Ｒ-リコンビナーゼはタバコにおいてluc遺伝子を少なくとも４％の効率で２４時間まで刺激したが（２６,０００ vs ５９７,０００光単位/μgタンパク質）、その過程はトウモロコシでは効果の発現が非常に低く、効率は高々０.２７％であった（５３ vs ２０,０００光単位/μgタンパク質）。トウモロコシで検出された非常に低い活性は実際には有意であり、再現性もあることが判明した。この実験でトウモロコシ中のリコンビナーゼ活性を制限する特徴は、核内の事象（遅い転写、偽スプライス部位、ｍＲＮＡが核外へ出ることができない）または細胞質の事象（翻訳停止、希コドンの使用、ｍＲＮＡの不安定、など）である。もし問題が核にあるとすれば、それはリコンビナーゼｍＲＮＡのバイオリスティック搬入により回避できると期待した；それは多分転写物を直接細胞質に導入するはずである。ザイゴサッカロマイセス・ルークシー（Ｚ．rouxii）リコンビナーゼの標的部位は、ここに採用した３１bpのパリンドローム配列を含む５８bp領域（マツザキら、モレキュラー・アンド・セルラー・バイオロジ（Ｍolecular and Ｃellular Ｂiology）８、９５５−９６２(１９８８)）にあらかじめ狭んでおく。我々の結果は、我々の潜在ルシフェラーゼ構築物のプロモーターをＲ−遺伝子介在フリッピングに付せば、３１bpパリンドロームで十分であるということを示している。このように、この短縮したＲＳ配列は、タバコおよびトウモロコシの両方で部位特異的組換えを行うのに十分である。４．リコンビナーゼｍＲＮＡ活性を経るルシフェラーゼＤＮＡの一過性発現リコンビナーゼｍＲＮＡはＲＮＡ回収に好適な条件、１.０ＭＣaＣl₂および −２０℃一夜培養で、p２ＲＳＬuc ＤＮＡと共に金粒子上に共沈殿させた。粒子をトウモロコシ細胞に衝撃処理し、ルシフェラーゼ活性を２時間および２４時間後に測定した。結果を下記第５表に示す。ルシフェラーゼ発現は衝撃処理後２時間では無視し得るものであった。２４時間では、ルシフェラーゼ発現がｍＲＮＡリコンビナーゼ処理および２ＲＳ潜在性ルシフェラーゼプラスミドに作用する３５Ｓ−リコンビナーゼＤＮＡの双方において明白であった。反転反応が平衡に近付くに従って、プロモーターの配向が５０％オンおよび５０％オフの安定した状態になる。予測し得るルシフェラーゼ発現の最高レベルは、ｐ１ＲＳＬuc活性レベルの５０％となるはずである。ｍＲＮＡ−駆動フリッピングは理論上最高値の６７％という驚く程高い効率で達し得た。ＤＮＡ−駆動反転の効率もまた有意に改善されたが、p１ＲＳＬuc発現の極端に低いレベルが示すのは、ｍＲＮＡ用に開発した沈殿法がＤＮＡにとって非常に効果があったということであった。それ故に、ＤＮＡおよびＲＮＡの両方にとって効果のある最適妥協点を求めるために更に沈殿条件を検討した。５．ｍＲＮＡおよびＤＮＡを金粒子上へ効率的に共沈着ＤＮＡとｍＲＮＡとを同時搬入する効率を改善する努力過程で、我々は沈殿混合物中にスペルミジンを用い再試験した；しかし、そこではpＨを下げ、ＲＮＡの分解をできるだけ避けるためにトリス・バッファーを添加した。５０mＭトリス・バッファーｐＨ７.５の存在下で、１.０ＭＣaＣl₂および２、４、１０または１６mＭスペルミジンを用いるとき、ＤＮＡおよびｍＲＮＡは粒子上に共沈着した。核酸の沈着効率を上記のようにアガロースゲル電気泳動法により試験した。未処理ＤＮＡおよびｍＲＮＡが全てのスペルミジン濃度において効率的に粒子上に沈着した（データ非開示）。最低濃度ではより多くのＤＮＡおよびｍＲＮＡが粒子から離れて水中に再溶解した；これが一過性発現および安定な形質転換のために利点となる可能性がある。最終の精製において、我々はトリス・バッファーの濃度を変え、生物活性の基準により効能をテストした：２mＭスペルミジンを５ｍＭ（処理Ａ）または５０ｍＭ（処理Ｂ）トリス・バッファーpＨ７.５と共に用い、Ｌuc ｍＲＮＡを沈着させ、トウモロコシ細胞中に衝撃処理した。衝撃処理後５時間目で、処理Ａおよび処理Ｂで一過性発現レベルがそれぞれ１,０９１および８,０００光単位/μgタンパク質であった。５０mＭトリスを用いて達成したより高いｍＲＮＡ活性は、以前の沈殿条件、１.０ＭＣaＣl₂、−２０℃一夜培養（第１表）におけるよりも３〜４倍の改善が見られる。処理ＡおよびＢは、トウモロコシおよびタバコ細胞に衝撃処理したp２ＲＳＬu c ＤＮＡと共にリコンビナーゼｍＲＮＡを沈着させるのに用いた。ルシフェラーゼ活性を２４時間目に測定し、その結果を下記第６表に示した。ＤＮＡ発現が５ mＭおよび５０ｍＭトリスにより改善された；しかし、そのレベルはバイオラッドの沈殿手法を用いて達成したレベルには達しなかった（第４表）。ｍＲＮＡ発現に好適な条件、５０mＭトリスは最高の効率を与え、そのリコンビナーゼ活性はトウモロコシおよびタバコで、それぞれ１８.９％および９.４％であった。リコンビナーゼ効率は第５表に示したものよりも低いが、ＤＮＡ発現のより高いレベルは安定な形質転換を達成するのに重要である。我々の結論は、スペルミジン濃度を低くし、トリスで緩衝化することがＲＮＡで使用可能であり、ＤＮＡの発現を改善し得るということである。Ｅ．考察我々はここに粒子衝撃処理によりｍＲＮＡとＤＮＡを同時搬入する方法を発表する；この方法はＤＮＡ分子上のｍＲＮＡをコードするタンパク質を一過性に作用させることができる。ｍＲＮＡおよびＤＮＡを同時搬入することは、安定な形質転換から生じる永続的発現の可能性なしにトランス作用機能を細胞内に導入することを可能とする。ｍＲＮＡをコードするリコンビナーゼは搬入時間という短期間に、一過性に活性なだけである。このやり方は供与体ＤＮＡを、得られる植物中でリコンビナーゼ発現というやっかいな問題を起こさずに、植物ゲノム中のＲＳ部位に部位特異的に導入するのに用いることができる。アガロースゲルおよびルシフェラーゼ発現の研究は、両方ともに、ＤＮＡ搬入に好適な条件はｍＲＮＡにとっても最適というものではなく、その逆もそうであるということを示している。異なる沈着条件を選ぶことによって、標的植物細胞中の再編成ＤＮＡの最適レベルを達成するために、二つの内のいずれかを有利とすることができる。沈着後の金粒子上核酸を電気泳動により分析する方法は、異なる沈着条件の効率を定性的もしくは定量的に評価する簡潔な手段であると証明した。この手法は粒子衝撃による核酸の搬入条件を更に磨き上げる探索研究に用いることができる。しかし、電気泳動法は全体的な損傷を検出するだけなので、最終的診断は生物活性によらなければならない。この研究において外から導入したｍＲＮＡ分子は、効率的な転写発現の役割を果たすことが分かっている３つの特徴もつように設計した。翻訳において初期の本質的段階である真核細胞開始因子を結合するための認識部位として作用するように、５'末端にキャップを加えた。非アデニル化ｍＲＮＡは電気穿孔したタバコ、ニンジン、トウモロコシおよびコメのプロトプラストにおいて、そのアデニル化した対照物よりも約１００ないし２００倍翻訳効率が低いので、イン・ビトロ転写に際し５０個のアデニル化残基ポリ(Ａ)端末を３'末端側に合成導入した（ガリー（Ｇallie）ら、１９８９、植物細胞）。ポリアデニル化ｍＲＮＡの効率もまた、５'キャップの存在下大きさの順に増大することが示されている（ガリー、１９９１）。ＣaＭＶ３５Ｓの非翻訳リーダー配列はタバコとトウモロコシの両方に関与し、その発現を増大させることが示されている（ガリーら、１９８９、植物細胞；ドウソン・デイ(Ｄowson Ｄay)ら、１９９３）。ｍＲＮＡを植物細胞に直接搬入するのは細胞機能の研究に利益を与える。ｍＲＮＡの安定性と翻訳効率を、転写因子、処理工程および細胞質への移送とは別にイン・ビボで実験することができる。エレクトロポレーション（電気穿孔法）( ヒッグス(Ｈiggs)およびコルバート(Ｃolbert)、１９９３)およびポリエチレングリコール（ガリー、１９９３、植物細胞レポート）はｍＲＮＡを植物プロトプラストに導入する有用な効率的方法であることが証明されている。しかし、これらの搬入方法はプロトプラストに限られるが、バイオリスティック搬入法は多くの種類の植物細胞および器官に広く適用し得る。形質転換した植物中で安定的に発現したときに不利益となるかあるいは非常に有害であるようなタンパク質は、バイオリスティック手段により搬入したｍＲＮＡから一過性発現させることができる。例えば、Ｒ/ＲＳ植物でのリコンビナーゼ発現は、丁度、リコンビナーゼ遺伝子含有植物と標的部位含有植物との間に起こる遺伝的交差がキメラ組換え活性とＦ１植物でのモザイク発現に至るように、切り出しのモザイク・パターンとすることができた(ラッセル(Ｒussell)ら、１９９２；オノウチら、１９９５)。作物植物で成功裏に改良したトランスジェニック構築物を生産するために、このＲ/ＲＳシステムを用いて、もとの植物の確実な位置に一種または複数種の新しい遺伝子を置換することができる。このように、第一のトランスジェニックカセットおよびその選択マーカー（ＲＳ部位の両側に配置）は、異なる選択マーカーと共に第二のものと置換することができる。第二のものは、順々に、もう一度第一の選択可能マーカーを用いて第三のものと置き換え得る。この手法は必要とする選択マーカーの数を減らすことになるし、トランスジェニックカセットにもとづく位置効果変動を避けることにもなる。部位特異的組換えシステムを植物中で使用すると、導入遺伝子の挿入および発現の制御が容易になる可能性が高い。リコンビナーゼ・システムはゲノムのあらかじめ定めた場所に挿入するのを可能とし、いわゆる“位置効果”を回避できる（フクシゲおよびサオアー（Ｓauer）、１９９２；ラクソ(Ｌakso)ら、１９９２；オーゴーマン(Ｏ'Ｇorman)ら、１９９１）。リコンビナーゼ介在の導入遺伝子欠失および逆位事象は、遺伝子発現の制御および選択マーカー遺伝子の除去を可能にする（総説として参照：オーデル(Ｏdell)およびラッセル(Ｒussell)、１９９４）。リコンビナーゼ活性をｍＲＮＡの形で導入すれば、形質転換過程の初期に組換え事象を発生させ、モザイク化の危険を減少させることによってその利用範囲を拡大することができる。更に、ｍＲＮＡ搬入は、リコンビナーゼ遺伝子情報がゲノムに導入されるのを避ける部位特異的組込みの図式を設計するのに非常に大きな自由度を与えるようになる。実施例４：組込み促進タンパク質ＶirＤ１およびＶirＤ２をコードするｍＲＮＡとＤＮＡとをタバコおよびトウモロコシ細胞に共衝撃処理発明の詳細な説明で述べたように、翻訳可能なＲＮＡを経由する形質転換の標的とされる真核細胞に搬入した組込み促進タンパク質は、翻訳可能ＲＮＡが分解するまでの一定時間、産生されることが期待される。このＲＮＡが産生するタンパク質は、それが通常の細胞内過程を経て分解されるまでの一定時間、植物細胞中に留まることが期待される。このように、組込み促進タンパク質を翻訳可能なＲＮＡの形で搬入することは、そのようなタンパク質を一時的に搬入する方法の代表である。このようなタンパク質の一過性搬入は、そのタンパク質が継続して存在すると望ましくない効果を示す可能性のある場合に好ましい。以下の実施例では、ＶirＤ１およびＶirＤ２タンパク質をＴ−ＤＮＡ境界に結合させたＤＮＡフラグメントと共に植物細胞に搬入する手法について記載する。報告された結果では、これらのＶirタンパク質が産生されて、関連する組込み促進活性を該ＤＮＡフラグメントに与えたとしている。使用した植物材料：トウモロコシ細胞：Ｂ７３に関連する選択株(２７１７)の未成熟胚から選択した凍結保存胚発生型 IIカルスからトウモロコシ（Ｚea mays Ｌ.）を起こし、その懸濁培養物をスクロース３０g/lおよび２,４−ジクロロフェノキシ酢酸（２,４−Ｄ）（２Ｎ６３Ｓ）添加Ｎ６液体培地（チュー(Ｃhu)ら、１９７５）で生育させた。培養物を暗所、２５℃オービタル・シェーカー１５０rpmで培養した。懸濁培養物を７日ごとに、充填細胞量１mlを新鮮な２Ｎ６３Ｓ液体培地に移すことにより継代培養した。衝撃実験に使用するトウモロコシ細胞懸濁液は３日齢の急速生育培養物から採取した。衝撃処理する前に、約０.５mlの充填細胞量を７−cmのフィルター（ワットマンＮo.４）上に減圧濾取した。タバコ細胞：ニコチアナ・タバクム（Ｎicotiana tabacum）細胞株ＮＴ−１を２,４−Ｄ２ mg/lおよびスクロース(３０g/l)添加ムラシゲ−スクーグ（Ｓkoog）培地中で生育させた。細胞を、５００mlフラスコ中接種材料５mlを新鮮な培地１００mlに加えることにより週に一度継代培養した。フラスコをロータリー・シェーカー１２５rpm、２７℃で培養した。継代培養の４日後、細胞の一部０.５mlを無菌フィルター（ワットマンＮo.４）上に拡散した。次いで、フィルターをＭＳ培地に移した。プラスミド構築：１− Ｔ７プロモーターおよびポリＡ末端含有ベクターの構築：ポリリンカー（ＳphＩ-ＥcoＲＩ-ＮheＩ-ＣlaＩ-ＢgIII-Ａsp７１８-ＨindIII -Ｘhol-Ｈind*III;ＨindIII部位を不活性化する）をpＴ７ＲecＡ５０（実施例３参照）のＳphＩ-ＨindIII部位に挿入した。次いで、オリゴＡsp７１８-Ａ(５０) -ＤraＩ-ＨindIIIをpＴ７-Ａ５０を起こす対応部位に挿入した。２− pＴ７Ｄ１Ａ５０の構築：以前にpＳＧ５（p３５Ｓadh１Ｄ１のＥcoＲＩ−ＢamＨＩフラグメントから）のＥcoＲＩ-ＢamＨＩにクローン化したvirＤ１コード領域を含むＥcoＲＩ-ＢgII Iフラグメントを、ＥcoＲＩおよびＢgIIIで消化したｐＴ７-Ａ５０に挿入した。３− pＴ７Ｄ２Ａ５０の構築： virＤ２コード領域の二つのフラグメント、ＥcoＲＩ-ＢamＨ１(５'−末端)およびＢamＩ-ＣlaＩ(３'−末端)をpＴ７-Ａ５０のＥcoＲＩ-ＣlaＩにクローン化した。３'−末端をＢamＨＩ-ＣlaＩフラグメントに変換するために、まず３'− 末端をｐブルースクリプト・プラスミドpＳＫのＢamＨＩ-ＥcoＲＶにＢamＨＩ- ＨaeIIIフラグメントとしてクローン化した。ｍＲＮＡの合成：Ｔ７Ｄ１Ａ５０およびＴ７Ｄ２Ａ５０プラスミドを、ポリ(Ａ)伸長部の直下流で切断するＸhoＩにより直鎖状化した。直鎖状化したＤＮＡをフェノール/クロロホルムで抽出し、次いで、エタノール沈殿した。直鎖状化したＤＮＡをイン・ビトロ転写するに当たり、［ｍ⁷Ｇ(５')ppp(５')］を含むＴ７キャップ−スクライブ（Ｃap-Ｓcribe）キット（ベーリンガー）からのＴ７ポリメラーゼを使用した。ＶirＤaおよびＶirＤ２をコードするｍＲＮＡの完全度および濃度をアガロースゲル電気泳動法により決定した。バイオリスティック供給体の滅菌：金粒子（０.３μｍ−ヒレウス（Ｈeraeus））を滅菌するに当たり、粒子６０m gを１００％エタノールと０.１％ＤＥＰＣ中に入れた。粒子をＲＮＡ分解酵素不含水で３度すすぎ、ＲＮＡ分解酵素不含５０％グリセリン溶液１mlに再懸濁した。調製した粒子５０μl部を６回のショットに用いた。マクロキャリアーを１００％エタノールと０.１％ＤＥＰＣに浸漬し、１００％エタノールにより３回すすぎ、風乾した。ストップスクリーンはオートクレーブ処理した。核酸沈着：ＤＮＡ（１μg）およびｍＲＮＡ（約８μg；４μg virＤ１および４μg virＤ２または対照として８μg非特異性ｍＲＮＡ）を金粒子（６０mg/ml；０.３um）懸濁液５０μl中に、トリス・バッファー（１Ｍ）０.５μl、ＣaＣl₂(２.５Ｍ) ５０μlおよび０.１Ｍスペルミジン２.５μlを連続して加えることにより沈着させた。全試薬を添加したのち、３分間攪拌を続け、次いで、簡単なミクロ遠心分離（１分）により沈積した。上清を除き、粒子を冷却１００％エタノールで１度洗浄し、１００％エタノール６０μlに懸濁した。この混合物を攪拌し、１０μl部をピペットでマクロキャリアーディスク上に移し、層流フード中風乾した。植物細胞へのマイクロプロジェクタイル搬入マイクロプロジェクタイルを粒子加速器（ＰＤＳ−Ｈe １０００；デュポン）により、発射装置から５.５cmの位置に据えた１１００psi破砕サンプルディスクを用いて植物細胞に搬入した。１００μｍメッシュのステンレス・スクリーンを停止板と組織の中間位置に置いた。標的プレートを２回投射処理した。ルシフェラーゼ・アッセイルシフェラーゼをプロメガ（Ｐromega）のルシフェラーゼ・アッセイ・システムにより供給業者の推奨に従い、組織抽出物としてアッセイした。ルシフェラーゼ活性をアナリティカル・ルミネッセンス・モデル２００１ルミノメーターにより検出し、２５℃で１０秒間集積した光単位で表した。比活性を算出するために、タンパク質濃度をバイオラッド・タンパク質・アッセイ・キットにより定量した。結果：ルシフェラーゼのアッセイを衝撃処理２４時間後に実施した。virＤ１およびv irＤ２のｍＲＮＡを、３５Ｓプロモーターとルシフェラーゼ・コード配列との間に挿入した右境界配列を含むp３５ＳＲＢＬucと共に同時衝撃処理した。対照実験においては、p３５ＳＲＢＬucを非特異的ｍＲＮＡと共に衝撃処理した。最初の実験結果を下記第７表に開示する。続く実験結果は実施例８に記載し、第１４表に開示する。結論：virＤ１ｍＲＮＡおよびvirＤ２ｍＲＮＡをpＲＢ(+)Ｌuc ＤＮＡと共に同時搬入した後、この実験ではルシフェラーゼ活性が５０％低下するのを観察した（第７表）。ｍＲＮＡとして植物細胞に搬入した二種のvir遺伝子は相乗作用を示すように思われた。これらの観察は、ルシフェラーゼ活性に低下が見られたのは、virＤ１およびvirＤ２タンパク質が右境界配列に鎖特異的ニックを入れた結果であることを強く示している。実施例５：インプランタ(in planta)で産生したトウモロコシゲノムにおけるＴ鎖組込み要約この明細書で「アグロリスティック(agrolistic)」と称する新規植物形質転換技術が開発されたことにより、Ｔ−ＤＮＡ挿入体の場合と同様、ベクター配列を伴わない、対象となる遺伝子のみの組込みおよびコピー数の制御が可能となった。この方法では、選択マーカーにフランクしているＴ−ＤＮＡ境界配列を含むベクターと共にバイオリスティック(biolistic)装置により同時搬入（codelivered ）されるビルレンス遺伝子の植物発現カセットを使用する。この試験では、小麦萎縮ウイルス（ＷＤＦ）が、植物発現可能なビルレンス遺伝子（virＤ１、virＤ２およびvirＥ２）および左右境界配列にフランクさせた選択マーカーをトウモロコシ細胞へ導入するための複製ベクターとして選択された。virＤ１およびvir Ｄ２遺伝子産物は、実際にインプランタでＴ−ＤＮＡ境界配列を切断し、バイオリスティック搬入後にＴ−ＤＮＡ型挿入事象（「アグロリスティック」事象）を誘発し得ることが見いだされた。序論アグロバクテリウムは、形質転換による植物細胞の遺伝子操作または遺伝子工学用の手段として広く使用されている。その病原性プラスミドの特定領域Ｔ−ＤＮＡを転移させ、植物ゲノムへ安定した状態で組込む。Ｔ−ＤＮＡは、境界配列と呼ばれる２５塩基対の直列反復配列により範囲が定められている（再検討のため、ズパンおよびザンブリスキ、１９９５参照）。Ｔ−境界間に位置するＤＮＡ配列があればそれらは全て、アグロバクテリウムから植物細胞へ有効に移行され得る。しかしながら、Ｔ−ＤＮＡ導入および組込みは、細菌の宿主範囲によって制限されており、ほとんどの双子葉植物については有効に形質転換し得るが、単子葉植物については僅かに過ぎない（再検討のため、チルトン、１９９４）。アグロバクテリウムの限られた宿主範囲から生じるギャップを埋めるため、単子葉植物の遺伝子形質転換の有効な方法を見いだすことが望ましい。可能な一方法は、複合体の再構築に必要な手段を全て植物細胞に供給することによりインプランタでＴ−複合体を産生させることから成る。それらの手段は、１）境界配列にフランクさせた対象の遺伝子、および２）植物発現カセットの制御下にあるビルレンス遺伝子である。virＤ１およびvirＤ２遺伝子産物は、Ｔ−ＤＮＡプロセッシングの重要段階に不可欠である（再検討のため、ズパンおよびザンブリスキ、１９９５参照）。virＤ２は鎖特異的エンドヌクレアーゼであり、virＤ１に補助されると境界配列を特異認識する。切断下において、virＤ２は、一本鎖ＤＮＡまたはＴ−鎖の５'末端に共有結合したままである。Ｔ−鎖は、一本鎖結合性タンパク質virＥ２により保護される。産生した核タンパク質複合体は、植物細胞へ移出される。virＤ２は、Ｔ鎖を植物細胞核中へ導く核局在化シグナルを含む。virＤ２は、植物ゲノムへのＴ鎖の５'末端のライゲーションに関与し得る（ティンランドら、１９９５）。この試験では、小麦萎縮ウイルス（ＷＤＶ、ウガキら、１９８７）を植物における複製ベクターとして選択することにより、インプランタでのＴ鎖の形成および植物ゲノムへのその組込みを試験した。上記のベクターを使用する目的は、ジェミニウイルスを高コピー数で植物細胞核において増殖させ、高レベル発現させることである。原材料および方法プラスミド（概略図については図５参照） pＣｌＢ１７１１は、カリフラワーモザイクウイルス３５Ｓ（ＣaＭＶ３５Ｓ）プロモーターにより推進される蛍ルシフェラーゼ遺伝子を含むｐＵＣ誘導体である。それは実施例３に記載されている。ｐwiＢarＲＢＬucは、トウモロコシ浮遊細胞の安定した形質転換用に設計されたもので、左境界配列、ＣaＭＶ３５Ｓプロモーターにより駆動されるＢar遺伝子（トンプソンら、１９８７）および右境界配列がプロモーターおよびルシフェラーゼコード領域間に挿入されたルシフェラーゼ遺伝子を含む。bar遺伝子をpＣlＢ３０６４（コジエルら、１９９３）からＨindIII-ＥcoＲＩフラグメントとして切除した。左境界をＢgIII-ＥcoＲＩフラグメントとしてpＢin１９から切除した（ベヴァン、１９８４）。 pＴｉＡ６からのvirＤ１およびvirＤ２遺伝子を、まずＣaＭＶ３５Ｓプロモーター（０.５kb）、Ａdh１第１イントロン（０.５kb）およびノパリンシンターゼ（nos）ポリアデニル化領域（０.２５kb）から成る発現ベクターpＭＦ６（カリスら、１９８７）へサブクローニングした。ｐＡＤ１１８７（フォーゲルおよびダス、１９９２）からの０.６kb ＥcoＲＩ-ＰstＩフラグメントおよびpＡＤ１１９０からの１.８kbフラグメントをｐＭＦ６へクローニングすることにより、それぞれｐ３５ＳＡdhＤ１およびp３５ＳＡdhＤ２を生成した。３５Ｓプロモーター制御下でvirＤ１遺伝子を含むｐ３５ＳＡdhＤ１からのＸbaＩ-ＮotＩフラグメントを、修飾ｐwi-１１のＮheＩ-Ｎot部位へサブクローニングした。ポリリンカー（ＮheＩ−ＮotＩ−ＳpeＩ−ＫnpＩ−ＢgIII）を、ｐwi-１１（ウガキら、１９８７）の唯一のＢamＨＩ-Ｓalｌ部位へ導入した。３５Ｓプロモーター制御下v irＤ２コード配列を含むｐ３５ＳＡdhＤ２からのＮotＩフラグメントを、ｐwi− １１の唯一のＮotＩ部位へサブクローニングした。virE２コード領域を、アグロバクテリウムＴｉ−プラスミドｐＴiＡ６（受託番号Ｘ０４７８４）（ウィナンズら、１９８７）の３kb ＸhoＩフラグメントを含むpw１０８から切除した。pw １０８の６８７bpのＳacＩ-ＳmaＩフラグメントを、まずｐＢluescript ＫＳ-（ストラタジーン、インコーポレイテッド）の対応する部位へクローニングすると、ｐＫＳ３'Ｅ２が生成した。pw１０８からの９２４bp ＨaeIII-ＳacＩを、ｐＫＳ３'Ｅ２からのＳacＩ-ＰstＩ断片およびＥcoＲＩ-付着および平滑末端（５'- ＡＡＴＴＣＡＴＧＧＡＴＣＴＴＴＣＴＧＧＣＡＡＴＧＡＧＡＡＡＴＣＣＡＧＧ- ３'、配列番号１４）にフランクさせた１対のアニール化ＤＮＡオリゴヌクレオチドと合わせ、ｐＢluescriptＫＳ-のＥcoＲＩ-ＰstＩ部位へクローニングして、ｐＫＳＥ２を製造した。次いで、全virＥ２コード領域を包含するＸhoＩ-Ｐst Ｉフラグメントを、ｐＭＦ６のＸhoＩ-ＰstＩフラグメントへサブクローニングすることにより、ｐ３５ＳＡdhＥ２を製造した。３５Ｓプロモーター、Ａdh１イントロン、virＥ２コード領域およびＮosターミネーターを含むＮotＩ-ＸbaＩフラグメントを、ｐwi-１１のＮotＩ-ＮheＩ部位へクローニングした。ｐＧＵＳは、ＣaＭＶ３５Ｓプロモーター制御下のβ−グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）コード配列およびトウゴマカタラーゼ(catalse)遺伝子イントロンを含むｐＵＣ誘導体である（オータら、１９９０）。トウモロコシ浮遊細胞ゼア・マイス品種ブラック・メキシカン・スウィート（ＢＭＳ）の懸濁培養を、３０g／lのショ糖および２mg／lの２,４−ジクロロフェノキシ酢酸（２,４− Ｄ）を補ったＮ６培地（チューら、１９７５）（２Ｎ６３Ｓ）で維持した。衝撃処理実験に使用されるトウモロコシ細胞懸濁液を、３日齢の急生長培養物から採取した。衝撃処理前、約０.５mlの充填細胞量を、７cmフィルター（ホワットマン、Ｎ°４）により真空濾過した。１２０g／lのショ糖を含むフィトアガー凝固２Ｎ６培地における衝撃処理前、平板培養細胞を２５℃で４時間保った。安定した形質転換を行うため、衝撃処理の２４時間後フィルターを２Ｎ６３Ｓ凝固培地に移した。それに続いて、培養中の細胞の大多数が生長を止めるまで、増加濃度のバスタを含む新鮮培地上でフィルターを８日間隔で移した。これは一般に８〜１０mg／lのバスタを含む平板培養における選別の４〜６週間後に行われた。次いで、フィルター上に発生した独立カルスを、バスタ（１０mg／l）を補ったフィトアガー凝固培地に移した。同培地で２継代培養後、ＤＮＡ単離用にバスタ（１０mg／l）を補った２５ml液体培地中に約１００mgのトウモロコシ細胞を接種することにより、懸濁培養を開始した。植物細胞の衝撃処理：組織に金マイクロプロジェクタイルを衝撃処理すると、プラスミド混合物が沈澱した。ｐＧＵＳプラスミドＤＮＡを一過性実験における内部対照として使用した。同時形質転換実験の場合、金粒子は、等質量の全プラスミドＤＮＡ（１標的プレート当たり各プラスミドＤＮＡ０.５μg）のいずれかを担持していた。安定した形質転換実験の場合、同時形質転換混合物は、ビルレンス遺伝子をもつプラスミドとbar選択プラスミドを１：１または２：１のモル比で含んでいた。１標的プレートにつき衝撃処理されたプラスミド混合物の各アリコートは、０.４μg の選択マーカーおよびｐwi３５ＳＡdhＤ１およびｐwiＡdh３５ＳＤ２および／またはｐwiＡdh３５ＳＥ２プラスミドＤＮＡの各々０.４μgまたは０.８μgにより構成された。適量の各ＤＮＡを、総体積１０μl中で混合し、５０μlの２.５モルＣaＣl₂および０．１モルのスペルミジン不含有塩基２０μｌにより沈澱を誘発すると、０.３μmの金微小担体５０μl（６０mg／ml）に対して沈澱が生じた。マイクロプロジェクタイル衝撃処理は、サンプルを停止スクリーン棚の８cm下方に配置した１１００psi破裂ディスクを用いるＰＤＳ−１０００Ｈeバイオリスティック装置（デュポン）により行われた。一過性発現検定供給業者（ルシフェラーゼ検定システム、プロメガ）の勧告に従い、ルシフェラーゼを組織抽出物において検定した。ＧＵＳ−光キット（トロピックス）を用いる化学発光検定法により、β−グルクロニダーゼ活性を測定した。ルシフェラーゼおよびβ−グルクロニダーゼ活性は、２５℃で１０秒にわたって集積された分析用ルミネセンスモデル２００１ルミノメーターにより検出される光単位として表されている。ＤＮＡ抽出およびサザンブロットハイブリダイゼーション接種１０日後濾過により細胞培養物を採取し、液体窒素中で凍結させた。ＤＮＡを記載された要領で単離した（ホールら、１９９１）。約１０μgのゲノムＤＮＡを、ＥcoＲＩ消化用に使用した。０.７％アガロースゲルでの分離後、ＤＮＡをアマーシャム・ハイボンドプラス膜に移し、製造業者（アマーシャム）により記載された条件に従いハイブリダイゼーションを行った。ファルマシアのオリゴ標識キットを用いて［ａ−³²Ｐ］dＣＴＰによりＤＮＡプローブを標識した。Ｂarプローブは、Ｂar遺伝子の０.５kb ＢgIIIフラグメントに相当する。lucプローブは、ルシフェラーゼ遺伝子の０.７kb ＸbaＩ−Ｅco ＲＩフラグメントに対応する。プローブを除去するため、１００℃で５分間０. １％ＳＤＳ溶液により膜を剥した。Ｔ−ＤＮＡ／植物ＤＮＡ結合部のクローニングトランスジェニックトウモロコシカルスからのＤＮＡ（３０μg）を、ＥcoＲＩにより消化し、０.８％アガロースゲルにおける分取電気泳動にかけた。クローン化するフラグメントの大きさに対応するアガロースの薄片をゲルから切り取り、遺伝子クリーンキットでＤＮＡをアガロースから抽出した。次いで、フラグメントをｐＵＣ１８の脱リン酸化ＥcoＲＩ部位にクローン化した。ライゲーション混合物を用いて、電気穿孔によりＥ.coli ＨＢ１０１細胞を形質転換した。正確な挿入片を伴うプラスミドを含むコロニーを、プローブとして０.５kb Ｂarフラグメントを用いるコロニーフィルターハイブリダイゼーションにより同定した。次いで、陽性クローン由来のＤＮＡをＢamＨＩ-ＥcoＲＩで消化した。ＢamＨＩは、右境界配列から３bpの距離に位置する部位を有する。このフラグメントを、ｐＵＣ１８の対応する部位に再クローン化した。植物ＤＮＡとドナープラスミドＤＮＡとの結合部の配列を、普遍プライマーを用いて分析した。結果インプランタでのvirＤ１およびvirＤ２遺伝子産物による境界配列の切断に関して試験する一過性発現検定法植物細胞での発現時にvirＤ１およびvirＤ２遺伝子産物がＴ−ＤＮＡ境界配列をニックし得るか否かを調べるため、試験プラスミドｐwiＲＢＬucおよびｐＲＢＬucを検定した。それらは、プロモーターおよびルシフェラーゼ遺伝子のコード領域間に基質Ｔ−ＤＮＡ境界配列を含んでいた。ｐＲＢＬucはｐＵＣ誘導体であり、ｐwiは、トウモロコシ細胞で複製し得る小麦萎縮ウイルス（ＷＤＶ）由来のベクターであり、２つの相補的センスＯＲＦ、ウイルス複製に必要とされるＣ１およびＣ２およびＥ.coli由来のｐ１５Ａ複製起点により構成される。このベクターは、ウイルス拡散および徴候発現に関与するＯＲＦＶ１およびＯＲＦＶ２を含まない（ウガキら、１９９１）。virＤ１およびvirＤ２遺伝子産物により導入された部位特異的ニックにより、ルシフェラーゼｍＲＮＡの鋳型であるＤＮＡ鎖が破壊されるため、ルシフェラーゼ転写物および酵素の産生は減らすべきである。ｐＲＢＬucまたはｐwiＲＢＬucおよびＣaＭＶ３５Ｓプロモーター制御下vir Ｄ遺伝子をもつプラスミドによる植物細胞の同時衝撃処理後、境界配列におけるニック形成は全て、ルシフェラーゼ活性を検定することにより当然定量的に測定可能である。ルシフェラーゼ遺伝子の高レベル発現は、ｐＲＢＬuc ＤＮＡまたはｐwiＲＢＬuc ＤＮＡで衝撃処理されたトウモロコシ細胞において達成された。ｐＲＢＬu c ＤＮＡまたはｐwiＲＢＬuc ＤＮＡとｐwiＤ１ＤＮＡおよびｐwiＤ２ＤＮＡをトウモロコシ細胞へ同時搬入することにより、ＧＵＳに対するルシフェラーゼ活性の１０倍減少がもたらされた（表８）。またｐwiＤ２ＤＮＡとｐwiＲＢＬu c ＤＮＡの搬入によっても、ＧＵＳに対するルシフェラーゼ活性の１０倍減少がもたらされた。この結果は、ＷＤＶが１個の環状一本鎖ＤＮＡから成るゲノムを有するという事実により説明され得る。それらは二本鎖中間体を介して感染細胞の核で増え、それに続いてウイルス鎖ＤＮＡのローリングサークル型複製用鋳型として使用される（サウンダーズら、１９９１、ステンガーら、１９９１）。vi rＤ２は、インビトロで一本鎖オリゴヌクレオチドを切断することが示された（パンセグラウら、１９９３、ジャスパーら、１９９４）。即ち、virＤ１は、ジェミニウイルスのssＤＮＡ形態の切断に必要とされない。安定な形質転換体の分析トウモロコシ浮遊細胞の安定した形質転換に対し、バイオリスティック装置によるこれらの遺伝子とそれらの基質ＤＮＡの同時搬入後のＤＮＡ組込みパターンに関するvirＤ１およびvirＤ２遺伝子産物の活性の評価を行った。これらの実験の場合、我々は、左Ｔ−ＤＮＡ境界、選択マーカーとしてＢar、および右Ｔ−ＤＮＡ境界がプロモーターとルシフェラーゼコード領域の間に挿入された３５ＳＲＢＬuc遺伝子を含むｐwiＢarＲＢＬucおよびｐＢarＲＢＬucを使用した。virＤ介在組込み事象に関するスクリーンは、ｐＢarＲＢＬucまたはｐwiＢarＬucからＴ−ＤＮＡを切除することによるＬucコード領域の排除から生じる、形質転換クローンにおけるルシフェラーゼ活性の欠如を示した。境界配列でvir遺伝子産物の活性の後にＴ鎖が産生される上記事象を、「アグロリスティック事象」と命名した。対照的に、「バイオリスティック事象」とは、トウモロコシゲノムにおける挿入体であり、バイオリスティック装置により植物細胞への遺伝子搬入後に通常生じるプロセスを示すものであった。トウモロコシ浮遊細胞を、１：１：１または１：２：２の割合でｐＢarＲＢＬ ucまたはｐwiＢarＲＢＬucプラスミドＤＮＡと一緒にｐwiＤ１およびｐwiＤ２ＤＮＡでコーティングしたマイクロプロジェクタイルにより衝撃処理した。対照として、ｐwiＢarＲＢＬucおよびｐＢarＲＢＬucプラスミドについても単独で衝撃処理した。バスタ含有培地での生長具合によって安定な形質転換体を選択した。衝撃処理の３−４週間後、１フィルター当たり平均８〜１０のバスタ耐性コロニーが現れたが、サブセットのみさらに各プレートから分析した。ｐ３５ＡdhＥ２プラスミドＤＮＡを他のビルレンス遺伝子と同時搬入すると、１フィルター当たり僅かに多い数（１２−１５）のカルスが回収された。総バスタカルスに対するルシフェラーゼを発現しないものと分析されたバスタ耐性カルスの総数の割合により、アグロリスティック事象の頻度を概略的に見積もることができた。この基準によると、ｐＢarＲＢＬucをｐwi３５ＳＡdhＤ１およびｐwi３５ＳＡdhＤ２プラスミドＤＮＡと同時搬入した場合、アグロリスティック事象の頻度は約２０％であった。使用される標的プラスミドがｐwiＢarＲＢＬucである場合、頻度は約４０％に増加した。またｐwi３５ＳＡdhＥ２を上記プラスミドと同時搬入すると、この頻度は約５０％に増加した。サザン分析分子レベルにおいて、アグロリスティック事象を示す挿入断片は、当然lucプローブではなくＢarプローブとハイブリダイズする。さらに、アグロリスティック事象において、導入されたＤＮＡと植物ＤＮＡとの結合部の配列は、当然Ｔ鎖の右境界末端に正確に対応する。両タイプの事象とも同じ植物細胞で起こり得るが、上記クローンは、遺伝子的にはルシフェラーゼ活性の存在に基づいたバイオリスティック事象として評価される。バイオリスティックおよび推定的アグロリスティックの両事象についてサザンハイブリダイゼーションにより調査して挿入断片の各タイプの頻度を測定した。（ｉ）ｐwiＢarＲＢＬuc ＤＮＡ、（ii）ｐwiＢarＲＢＬuc、ｐwiＤ１およびｐwiＤ２ＤＮＡ、（iii）ｐwiＢarＲＢＬuc、ｐwiＤ１、ｐwiＤ２およびｐwiＥ２ＤＮＡ、（iv）ｐＢarＲＢＬuc ＤＮＡおよび（ｖ）ｐＢarＲＢＬuc、ｐwiＤ１、ｐwiＤ２ＤＮＡによる衝撃処理後に得られたバスタ耐性カルスラインからのＤＮＡにおいてサザンブロットハイブリダイゼーションを遂行した。ブロット分析により、第９表に要約した３群のトランスジェニックカルスラインが示された。即ち、（ｉ）barおよびneoプローブ両方とハイブリダイズするカルスライン、（ii）barプローブのみとハイブリダイズする挿入断片もあれば、両プローブとハイブリダイズする挿入断片もあるカルスライン、（iii）barプローブのみとハイブリダイズする挿入断片を伴うカルスライン。第１群のカルスはアグロリスティック事象を含まないと思われた。第２群のカルスは２タイプの事象、すなわちアグロリスティック事象およびバイオリスティック事象を含むと思われた。第３群のカルスは推定的アグロリスティック事象のみを呈した。例えば、ｐwiＢarＲＢＬuc、ｐwiＤ１およびｐwiＤ２形質転換実験から分析された１０トランスジェニックトウモロコシラインのうち、３つがバイオリスティック事象を含み、６つが推定的アグロリスティック事象を含み、１つが両方を有していた。個別ラインのハイブリダイゼーションパターンは特有であり、カルスラインが独立した形質転換事象であることを示していた。推定的アグロリスティック事象の分子分析推定的アグロリスティック事象の性質を、組込みＤＮＡと植物ＤＮＡ間の結合部の配列を決定することにより証明した。ヌクレオチド配列は、これらのフラグメントの各々が右境界／植物ＤＮＡ結合部を含むことを示した。挿入片の右端点は、アグロリスティック事象に関して予測されたとおり、Ｔ−ＤＮＡの右境界配列のニック形成部位と同一であった。ＤＮＡをバイオリスティック装置によりトウモロコシ細胞に搬入した。括弧内の数はプラスミドの割合を示す。２４時間インキュベーション後、組織をホモジネートし、酵素活性を測定した。β−グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）を発現するプラスミド、ｐＧＵＳは、ＤＮＡ導入効率に関する対照として各衝撃処理に含まれており、レポーター遺伝子の活性はルシフェラーゼ対ＧＵＳ活性の割合として表されている。独立した衝撃処理を分析し、データは３回＋または−標準偏差の平均値として示されている。括弧内の数は形質転換実験に使用されたＤＮＡの濃度を示す。Ｂ＝バイオリスティック事象、Ａ＝推定的アグロリスティック事象、サザン＝サザン分析したカルスの数、カルス＝ルシフェラーゼ活性について分析したカルスの数実施例６：トウモロコシおよびタバコ細胞における単一プロモーターによるvir Ｄ１およびvirＤ２の発現。植物細胞における細菌遺伝子の発現を達成するためには、原核生物プロモーターでは植物細胞中で転写できないため、細菌遺伝子の個々のコード領域を別々の植物プロモーターに融合させなければならない。各遺伝子を別々のプロモーターに融合することは実行可能であるが、その場合いくつかの問題点を呈し得る。例えば、同じプロモーターが異なる遺伝子に対して使用される場合のサイレンシングである。この実施例で立証された戦略は、唯一の植物プロモーターに２個の遺伝子を縦に連結することである。このポリジーンメッセージはアグロバクテリウムのvirＤオペロンに属するvirＤ１およびvirＤ２の２種のコード配列を含む。 virＤオペロンの５'半分によりコードされるこれら２つのポリペプチドは、アグロバクテリウムから植物細胞へのＴ−ＤＮＡ導入に関するＤＮＡプロセッシングの開始において主要な役割を演じる。virＤ２は、virＤ１により補助されて第３および第４塩基間のＴ−ＤＮＡ境界配列を切断する鎖特異的エンドヌクレアーゼである。virＤ２は、Ｔ−ＤＮＡの５'末端に共有結合したままであり、植物細胞へＴ−ＤＮＡを導き、植物ゲノムへのＴ−ＤＮＡの５'末端のライゲーションに関与すると考えられている。これら２種のタンパク質は、植物プロモーターにフックされたとき植物細胞中で機能的であることが示された。この実施例では、単一植物プロモーターにより駆動されるvirＤ１およびvirＤ２遺伝子から成る発現単位に遺伝子操作を加え、インプランタでの機能的発現を立証した。個々の遺伝子を転写融合体または翻訳融合体としてつなげ、後者の場合には植物細胞においてそれらの酵素活性を保持していることが示された。材料および方法Ｄ１−Ｄ２またはＤ２−Ｄ１融合体の構築２タイプの融合体を構築した。１）転写融合体： virＤ１およびvirＤ２コード領域間に小空間（３３nt）が存在するvirＤ１およびvirＤ２コード領域の配列を使用した。ｐ３５ＳＤ１の１.１kbのＮotＩ-Ｐs tＩフラグメントおよびｐ３５Ｄ２の１.５kbのＰstＩ-ＸbaＩフラグメントをｐＳＫ＋のＮotＩ-ＳpeＩ部位へクローン化して、ｐ３５ＳtpＤ１Ｄ２を産生した。２）翻訳融合体：ビルレンス遺伝子virＤ１およびvirＤ２についても、投入された介在配列を介して融合させることにより、両タンパク質の自由な動きが可能となり、翻訳後切断が行われやすくなっている。ｐ３５ＳＤ１Ｄ２の場合、virＤ１コード領域は融合体の５'末端にあり、ｐ３５ＳＤ２Ｄ１はプロモーターの直後にvirＤ２領域を含んでいた。修飾は全てＤＮＡ配列決定により確認された。ｐ３５ＳＤ１Ｄ２の構築： virＤ１とvirＤ２をコードする融合体virＤ１−virＤ２を作製するため、vir Ｄ１の停止コドンとvirＤ２の開始コドンを除去した。これは、ｐ３５ＳＤ１の０.４８kbのＥcoＲＩ-ＢanＩおよびｐ３５ＳＤ２の０.２５kbのＰvuＩ-ＨindIII 断片に対しＢanＩ-付着およびＰvuＩ-付着末端にフランクさせた、一対のアニール化ＤＮＡオリゴヌクレオチドをｐＵＣ２１のＥcoＲＩ-ＨindIIIへクローニングすることにより行われた。アニール化した対は、次のオリゴヌクレオチドにより構成されていた：次いで、virＤ１コード領域、リンカーおよびvirＤ２コード領域の５'末端を含むこの構築物のＥcoＲＩ-ＰstＩフラグメントをｐ３５ＳＤ２のＥcoＲＩ-Ｐst Ｉ部位へ挿入して、ｐ３５ＳＤ１Ｄ２を生成した。ｐ３５ＳＤ２Ｄ１の構築：同様に、プラスミドｐＤ２Ｄ１は、同じ介在配列を通じてvirＤ１コード領域にフレーム内結合したｐＤ２Ｄ１の５'末端にvirＤ２コード領域を含む。まずvi rＤ１のＮ−末端コード配列を重複オリゴヌクレオチドから再構築することにより、５'末端にＥcoＲＩ部位を与え、virＤ１の第１コドンを欠失する（；配列番号１７）。アニールしたこれらのオリゴヌクレオチドをｐＢluescriptＫＳ＋（ストラタジーン、インコーポレイテッド）へクローン化すると、ｐＫＳ５'Ｄ１が得られた。次いで、ｐ３５ＳＤ２からの１.３kbのＳacII-ＢfaＩフラグメントおよびＳacII-ＥcoＲＩ-切断ｐＫＳ５'Ｄ１プラスミドＤＮＡを、virＤ２の天然停止コドンを欠く形になるように、５'末端にＢfaＩ部位の改変を含むリンカーと結合させた(5′-TATCCTTCTACTCCCCCAACTCCCTCTCCTAGCACGCCTCCGACAC- CTAGC-3′(配列番号１８)および5′-AATTGGCTAGGTGTCGGAGGCGTGCTAGGAGAG-GGAGT TGGGGGAGTAGAAGGA-3′(配列番号１９))。次いで、virＤ２コード領域、リンカーおよびvirＤ１コード領域の５'末端を包含するＥcoＲＩ-ＣlaＩフラグメントを、ｐ３５ＳＤ１のＥcoＲＩ-ＣlaＩ部位へクローン化してｐ３５ＳＤ２Ｄ１を製造した。試験プラスミドの構築：ｐwＢarＲＢＬuc、ｐＲＢＬucの構築は、実施例５に記載されている。植物材料：バイオリスティック装置による衝撃処理用のトウモロコシ（Ｂ３７−誘導体）およびタバコ（ＮＴ−１）浮遊細胞の製造は、先の実施例に記載されている。植物細胞の衝撃処理：組織を金マイクロプロジェクタイルにより衝撃処理すると、そこにプラスミドの混合物が沈澱した。同時形質転換実験の場合、金粒子は、０.５μgまたは１μ gの試験プラスミドと共にタバコおよびトウモロコシ細胞のそれぞれについてヘルパープラスミド合計２μgまたは４μgを担持していた。ｐＵＣ１８プラスミドのＤＮＡの適量を混合することにより、混合物中に等質量のプラスミドＤＮＡを維持した（表１０および表１１参照）。２.５モルのＣaＣl₂および０.１モルのスペルミジン不含有塩基により、５０μlの３μm金微小担体（６０mg／ml）にＤＮＡが沈澱した。微小発射体衝撃処理は、停止スクリーンシェルフの８cm下方にサンプルを配置させた１５５０psi破壊ディスクを用いるＰＤＳ−１０００Ｈeバイオリスティック装置（デュポン）により遂行された。一過性発現検定：供給会社（ルシフェラーゼ検定システム、プロメガ）の薦めるとおり、組織抽出物においてルシフェラーゼを検定にかけた。ルシフェラーゼ活性は、２５℃で１０秒間にわたり集積されたアナリティカル・ルミネセンス・モデル２００１ルミノメーターにより検出される光単位として表されている。比活性を計算するため、バイオ-ラッドタンパク質検定キットを用いてタンパク質濃度を測定した。結果および検討：融合体設計戦略： virＤ１およびvirＤ２遺伝子は、アグロバクテリウム・ツメファシエンスのオクトピンｐＴｉＡ６プラスミドから得られた。ｐ３５ＳtpＤ１Ｄ２が運ぶ転写融合体は、天然介在配列がvirＤオペロンに存在するvirＤ１およびvirＤ２のコード領域を含む。ｐ３５ＳＤ１Ｄ２およびｐ３５ＳＤ２Ｄ１が運ぶ翻訳融合体は、介在配列を介して融合されたvirＤ１およびvirＤ２コード領域を含むことにより、両タンパク質の動きが自由となり、翻訳後切断が行われやすくなる。インプランタでのポリジーンの機能的発現転写および翻訳融合体の機能的発現を検定するため、ｐ３５ＳｔｐＤ１Ｄ２、ｐ３５ＳＤ１Ｄ２およびｐ３５ＳＤ２Ｄ１を、バイオリスティック装置により試験プラスミドと共に植物細胞へ同時搬入した。試験プラスミドには、プロモーターとルシフェラーゼ遺伝子のコード領域間に挿入された右境界配列が含まれており、この配列内での鎖特異的切断によりルシフェラーゼ発現が低減化されるように設計した。２タイプの試験プラスミド、すなわちｐＵＣ−誘導プラスミド（ｐＲＢＬuc）および小麦萎縮ジェミニウイルス由来のプラスミド（ｐwＢarＲＢＬu c）をトウモロコシ細胞において検定した。トウモロコシおよびタバコ細胞を、別々のプロモーターにより各々駆動される virＤ１およびvirＤ２遺伝子と同時搬入された試験プラスミドで一時的に形質転換することにより、それらがＴ−ＤＮＡ境界配列を通して転写に影響を与える能力を試験した。ｐ３５ＳＤ１ＤＮＡおよびｐ３５ＳＤ２ＤＮＡをｐＲＢＬucまたはｐwＢarＲＢＬuc ＤＮＡと同時搬入後、０.３％および１％の対照レベルのルシフェラーゼ活性をタバコおよびトウモロコシ組織において観察した（第１０表、第１１表および第１２表）。転写融合体中で一緒の２種のvir遺伝子は、活性が軽微であると思われた。等量のｐＲＢＬucおよびｐ３５ＳtpＤ１Ｄ２ＤＮＡ（１：１の割合）をバイオリスティック装置により同時搬入すると、ルシフェラーゼ活性はタバコでは対照の約５７％（第１２表）およびトウモロコシ細胞では６０−８０％（第１０表および第１１表）に低下した。ｐ３５ＳtpＤ１Ｄ２プラスミド対試験プラスミドの比が高いとき(２：１)、ルシフェラーゼ活性はそれ以上はあまり低下しなかった。翻訳融合体を運ぶｐ３５ＳＤ１Ｄ２プラスミドを用いる類似実験は、タバコでは対照の約１２％（第１２表１２）およびトウモロコシ細胞では２２−４７％（第１０表および第１１表）のルシフェラーゼ活性の低下を示した。ｐ３５ＳＤ１Ｄ２プラスミド対試験プラスミドの比が高いとき（２：１）、ルシフェラーゼ活性はどの場合においてもさらに約２−５％に低下した。翻訳融合体ｐ３５ＳＤ２Ｄ１におけるビルレンス遺伝子の天然配向が逆転しても、ｐ３５ＳＤ１Ｄ２の場合と同様であった（第１０、１１および１２表）。これらの観察結果は、翻訳融合体がインプランタでも機能的であったことを強く示している。第１０表：ＤＮＡをバイオリスティック装置によりトウモロコシ細胞に搬入した。括弧内の数は、プラスミドの割合を示す。２４時間インキュベーション後、組織をホモジネートし、ルシフェラーゼ活性を測定し、光単位／μg（タンパク質）として表した。独立した衝撃処理を分析し、データは３回反復値＋または−標準偏差の平均値として与えられている。第１１表：第１０表に関する脚注参照。第１２表：表１０に関する脚注参照。実施例７：形質転換効率におけるvirＥ２の役割トウモロコシ細胞において、「ヒーリング」ベクターがアグロリスティック事象の頻度を高める能力について試験した。使用されたこのベクターは、右境界の左にあるＴ−ＤＮＡ構造の内側にポリアデニル化シグナルを含んでいた。実験の第２部において、virＥ２をvirＤ１およびvirＤ２遺伝子と同時搬入した。このタンパク質は、Ｔ−ＤＮＡの製造ではなくＴ−ＤＮＡの効果的な導入に必要とされることが示されている（スタッヒェルら、１９８６）。virＥ２は、協同的および非特異的にインビトロで一本鎖ＤＮＡに結合する。virＥ２は、Ｔ鎖の保護に関与し得る。virＥ２タンパク質は、ビルレンス遺伝子の誘導後にアグロバクテリウム・ツメファシエンスで製造される最も豊富なタンパク質である（スタッヒェルら、１９８６）。virＥ２は核局在化シグナルを有し、それらは植物で認識されるため（再検討のため、ズパンおよびザンブリスキ、１９９５参照）、この遺伝子がインプランタで導入される場合さらに高率の形質転換が予測される。材料および方法：ｐＡＶＭ１の構築：右境界にポリアデニル化シグナルを含むベクター（図６− １５参照）Ａ部。ｐＣｌＢ１７１１−ＨＮの構築ｐＣｌＢ１７１１を、ＢamＨＩにより消化し、再ライゲーションすると、１７１１デルタＢが形成され、そこでＥcoＲＩ部位（現時点では唯一(ユニーク)）を切断し、オリゴヌクレオチドの挿入により破壊し、ＨindIIIおよびＮotＩ部位が同時に作製される。配列分析により、我々は、これらの部位が（ＳacＩ部位の後）ＫpnＩ、次いでＨindIIIの配向にあるクローンを同定した。もとのプラスミドの失われた部分を回復するため、まず正しい配向でＬucコード領域を運ぶ大型Ｂ amＨＩフラグメントを挿入して、１７１１−ＨＮ−Ｂを形成させた。次いで、そのＸbaＩ挿入片を、もとのｐＣｌＢ１７１１の対応する部分により置き換え、失われたリーダー配列を再導入した。Ｂ部。Ｌucコード領域末端のＥcoＲＩとＢamＨＩ部位の間に合成オリゴヌクレオチド境界配列を導入し、ＮotＩ／ＣlaＩフラグメントをｐＢluescriptにサブクローニングすると、挿入片中のＥcoＲＩおよびＢamＨＩ部位は唯一になった。境界オリゴヌクレオチドを挿入することによりｐＢＳ−ＮＣ−ＲＢを形成後、その修飾ＮotＩ／ＣlaＩ挿入片をｐＣｌＢ１７１１−ＨＮバックボーンに戻してｐＣｌＢ１７１１−ＨＮ−ＲＢを形成した。Ｃ部。ｐＵｂiＰＡＴデルタｌへの左Ｔ−ＤＮＡ境界の挿入ｐＵＣＩＡＣのイントロンにおける望ましくないＥcoＲＩ部位を排除するために、プラスミド（dam−マイナス株ＳＣＳ１１０で成長）をＣlaＩで消化してＥc oＲＩ部位を含む小さな２断片を除去した。次いで、オリゴヌクレオチドを導入してＣlaＩ部位を除去し、ＳphＩ部位を作製して、プラスミドｐＵｂｉＰＡＴデルタｌを形成させた。キメラＰＡＴ遺伝子の末端にある現時点で唯一のＥcoＲＩ部位へ、一端から６８塩基対の位置にあるＴ−ＤＮＡの左境界を運ぶノパリン型Ｔｉプラスミドである（ヤダヴ、Ｎ.Ｓ.、ヴァンダーレイデン、Ｊ.、ベネット、Ｄ.バーンズ、Ｗ.Ｍ.、およびチルトン、Ｍ.Ｄ．１９８２）、ｐＴｉＴ３７のＥcoＲＩ断片２９をクローン化した。短い直列反復配列がノパリンＴｉプラスミド上のＴ−ＤＮＡにフランクして（プロシーディング・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシーズ・オブ・ザ・ユナイテッド・ステーツ・オブ・アメリカ７９、６３２２−６３２６）、ＬＢ−ＵｂｉＰＡＴデルタ１を形成する。Ｄ部。ｐＡＶＭ１の組立ｐＣｌＢ１７１１−ＨＮ−ＲＢのＨindIII挿入フラグメントを切断し、ＬＢ− ＵｂiＰＡＴデルタｌのＨindIII部位へライゲーションした。マッピングにより左および右境界が正しい導入配向でＰＡＴ遺伝子にフランクしている構築物が同定された。生成したプラスミドは、Ｌuc遺伝子プロモーターおよびＴ−ＤＮＡの外側のコード領域を有するが、そのターミネーターは右境界のちょうど内側にある。トウモロコシ浮遊細胞：ゼア・マイス（トウモロコシ）品種ブラック・メキシカン・スウィート（ＢＭＳ）の懸濁培養を、３０g／lのショ糖および２mg／lの２,４−ジクロロフェノキシ酢酸（２,４−Ｄ）を補ったＮ６培地（２Ｎ６３Ｓ）（チューら、１９７５）で維持した。衝撃処理実験に使用したトウモロコシ細胞懸濁液は、３日齢の急成長培養物から採取した。衝撃処理前、約０.５mlの充填細胞量を７cmフィルター（ホワットマン、Ｎ°４）により真空濾過した。１２０g／lショ糖含有フィトアガー凝固２Ｎ６培地での衝撃処理前に、平板培養細胞を２５℃で４時間保った。安定した形質転換にするため、衝撃処理の２４時間後フィルターを２Ｎ６３Ｓ凝固培地へ移した。それに続いて、培養中の細胞の大多数が生長を止めるまで、８日間隔で増加濃度のバスタを含む新鮮な培地においてフィルターを移した。これは一般に８〜１０mg／lのバスタを含むプレートでの４〜６週間の選別後に行われた。次いで、フィルターで生じた独立カルスを、バスタ（１０mg／l）を補ったフィトアガー凝固培地へ移した。同培地で２継代後、ＤＮＡ単離用にバスタ（１０mg／l）を補った２５ml液体培地中へ約１００mgのトウモロコシ細胞を接種することにより懸濁培養を開始させた。植物細胞の衝撃処理：金マイクロプロジェクタイルにより組織を衝撃処理すると、プラスミドの混合物が沈澱した。同時形質転換混合物は、ビルレンス遺伝子を運ぶプラスミドとba r選択プラスミドを１：１.３の割合で含んでいた。１標的プレート当たり衝撃処理したプラスミド混合物の各アリコートは、選択マーカー０.６μg並びにｐ３５ＳＡdhＤ１およびｐ３５ＳＡdhＤ２および／またはｐ３５ＳＡdhＥ２プラスミドＤＮＡ各々０.８μgにより構成されていた。各ＤＮＡの適量を総容量１０μl中で混合し、５０μlの２.５モルＣaＣl₂および２０μlの０.１モルのスペルミジン不含有塩基により沈澱させると、０.３μm金微小担体（６０mg／ml）５０μl への沈澱が起こった。マイクロプロジェクタイル衝撃処理は、停止スクリーンシェルフの８cm下方にサンプルを配置させた１１００psi破壊ディスクを用いるＰＤＳ−１０００Ｈeバイオリスティック装置（デュポン）により行われた。ＤＮＡ抽出およびサザンブロットハイブリダイゼーション接種の１０日後濾過により細胞培養物を採取し、液体窒素中で凍結させた。記載された要領でＤＮＡを単離した（ホールら、１９９１）。約１０μgのゲノムＤＮＡを、ＥcoＲＩでの消化用に使用した。０.７％アガロースゲルでの分離後、ＤＮＡをアマーシャム・ハイボンド・プラス膜に移し、製造業者（アマーシャム）により記載された条件に従いハイブリダイゼーションを行った。ファルマシアのオリゴ標識キットを用いて［ａ−³²Ｐ］dＣＴＰによりＤＮＡプローブを標識した。ＰＡＴプローブは、pat遺伝子の０.７kbのＰstフラグメントに対応する。lucプローブは、ルシフェラーゼ遺伝子の０.７kbのＸbaＩ −ＥcoＲＩフラグメントに対応する。プローブを除去するため、１００℃で５分間０.１％ＳＤＳの溶液により膜を剥した。結果安定した形質転換体の分析トウモロコシ浮遊細胞の安定した形質転換を誘発し、形質転換効率に対するｐＡＶＭ１ベクターの効果について、バイオリスティック装置によりビルレンス遺伝子と上記ベクターを同時搬入後に評価した。前者のベクターは、Ｔ鎖が挿入された遺伝子のアンチセンスを発現する手段を容易に提供し得る配向で右境界内側に３５Ｓ−プロモーターを有していた。この新規タイプのベクターでは、３５Ｓ −プロモーターが、右境界内側の３５Ｓ−ターミネーターにより置き換えられており、３'末端に挿入されている場合に標的遺伝子を「回復させる(heal)」ような配向であった。この実験の場合、使用されたｐＡＶＭ１は、左Ｔ−ＤＮＡ境界、選択マーカーとしてのＰＡＴ、３５Ｓ−ターミネーター、右Ｔ−ＤＮＡ境界およびＴ−ＤＮＡ −様構造外側にルシフェラーゼ遺伝子を含んでいる。我々は、境界配列に対する vir遺伝子産物の活性の後に生じ、Ｔ鎖が形成されるトウモロコシゲノムへのそれらのＤＮＡ挿入を「アグロリスティック事象」と命名した。対照的に、バイオリスティック装置による植物細胞への遺伝子搬入後に通常生じるプロセスを示すＤＮＡ挿入を「バイオリスティック事象」と命名した。バイオリスティック事象および推定的アグロリスティック事象を区別する最初の基準は、ｐＡＶＭ１からのＴ−ＤＮＡ切除によるＬucコード領域の排除から起こる、形質転換クローンにおけるルシフェラーゼ活性の欠如であった。トウモロコシ浮遊細胞を、ｐ３５ＳＡdhＤ１、ｐ３５ＳＡdhＤ２および／またはｐ３５ＳＡdhＥ２ＤＮＡと一緒にｐＡＶＭ１プラスミドＤＮＡでコーティングしたマイクロプロジェクタイルにより衝撃処理した。対照として、ｐＡＶＭ１についても単独で衝撃処理した。バスタ含有培地での生長により、安定した形質転換体を選択した。ｐＡＶＭ１単独による衝撃処理後１フィルター当たり約５− ８カルスが回収され得た。ｐＡＶＭ１、ｐ３５ＳＡdhＤ１、ｐ３５ＳＡdhＤ２およびｐ３５ＳＡdhＥ２ＤＮＡによるトウモロコシ細胞の衝撃処理の４−５週間後、１フィルター当たり平均１０のバスタ耐性クローンが回収され得た。１プレート当たり若干のものについてのみ更に分析した。約２−３のカルスが、ｐＡＶＭ１、ｐ３５ＳＡdhＤ１およびｐ３５ＳＡdhＤ２ＤＮＡにより衝撃処理されたフィルターに出現した。この差異は、Ｔ鎖の保護に関与する一本鎖ＤＮＡ結合性タンパク質をコード化するvirＥ２遺伝子の存在に起因し得る。このタンパク質は、Ｔ−ＤＮＡ製造ではなくＴ−ＤＮＡの効果的に導入に必要であることが示された（スタッヒェルら、１９８６）。アグロリスティック事象の頻度は、全バスタ耐性カルスに対する、ルシフェラーゼを発現しなかった分析済みバスタ耐性カルス総数の割合により評価され得る。この基準によると、ｐＡＶＭ１をｐ３５ＳＡdhＤ１およびｐ３５ＳＡdhＤ２ＤＮＡと同時搬入した場合、アグロリスティック事象の頻度は約２５％であった。pwiＥ２についても上記プラスミドと同時搬入された場合、この頻度は約５０％に微増した。サザン分析分子レベルでは、アグロリスティック事象を示す導入遺伝子は、当然lucプローブではなくＢarプローブとハイブリダイズする。両タイプの事象とも同じ植物細胞で起こり得るが、上記クローンは、遺伝子的にルシフェラーゼ活性の存在に基づくバイオリスティック事象として評価される。バイオリスティックおよび推定的アグロリスティックの両事象をサザンハイブリダイゼーションにより調べ、各タイプの挿入の頻度について測定した。サザン・ブロット・ハイブリダイゼーションは、（ｉ）ｐＡＶＭ１ＤＮＡおよび（ii）ｐＡＶＭ１、ｐ３５ＳＡdhＤ１、ｐ３５ＳＡdhＤ２およびｐ３５ＳＡdhＥ２ＤＮＡによる衝撃処理後に得られたバスタ耐性カルスラインからのＤＮＡについて遂行された。結果は下記第１３表にまとめる。結論：ａ）バイオリスティック事象に対するアグロリスティック事象の割合はｐＡＶＭ１の場合約３５％であり、２０−４０％の通常見いだされるパーセンテージの範囲内に含まれる。ｂ）virＥ２の存在により、形質転換効率は改善され得る。 virＥ２は核局在化シグナルを有し、それらは植物中で認識されるため（再検討のため、ズパンおよびザンブリスキー、「プラント・フィジオロジー」１０７：１０４１−１０４７（１９９５）参照）、この遺伝子がインプランタで導入されると、さらに高率の形質転換が予測された。virＥ２遺伝子を発現するトランスジェニック植物は、アグロバクテリウムのvirＥ突然変異体を補足し得ることから、virＥ２タンパク質が植物細胞において重要な役割を演じているという証拠を提供する。実施例８：トウモロコシ細胞へのvirＤ１およびvirＤ２ｍＲＮＡの衝撃処理この実施例では、virＤ１およびvirＤ２遺伝子のｍＲＮＡとしての植物細胞への搬入およびＴ−ＤＮＡ境界配列に対するそれらの活性について記載する。材料および方法：トウモロコシ細胞：Ｂ７３に関連したエリートラインの未分化胚から選択された低温保存胚形成II 型カルスから開始されたトウモロコシ（ゼア・マイス品種）の懸濁培養を、３０ g／lのショ糖および２mg／lの２,４−ジクロロフェノキシ酢酸（２,４−Ｄ）を補ったＮ６液体培地（２Ｎ６３Ｓ）（チューら、１９７５）中で生長させた。培養物を暗所中１５０rpmでのオービタル振盪機において２５℃でインキュベーションした。１mlの充填細胞量を５０mlの新鮮な２Ｎ６３Ｓ液体培地中へ移すことにより、懸濁培養物を７日毎に継代培養した。衝撃処理実験に使用したトウモロコシ細胞懸濁液は、３日齢の急成長培養物から採取された。衝撃処理前、約０. ５mlの充填細胞量を７cmフィルター（ホワットマン、Ｎ°４）により真空濾過した。タバコ細胞：ニコチアナ・タバクムのセルラインＮＴ−１を、２mg／lの２,４−Ｄおよびショ糖（３０g／l）を補ったムラチゲおよびスクーグ培地で生長させた。５００mlフラスコ中１００mlの新鮮培地へ５mlの接種材料を加えることにより、細胞を週１回継代培養した。フラスコを１２５rpmでの回転振盪機において２７℃でインキュベーションした。継代培養４日後の細胞からの０.５mlのアリコートを、滅菌フィルター（ホワットマン・ナンバー４）へ拡散させた。次いで、フィルターをＭＳ培地へ移した。プラスミド構築：Ｔ７プロモーターおよびポリＡテイルを含むベクターの構築：次の制限部位（Sphl-EcoRI-Nhel-Clal-BgIII-Asp718-HindIII-Xhol-Hind*III 、キリング（killing）部位として最後のＨindIIIを伴う）を含むポリリンカーを、ｐＴ７ＲecＡ５０のＳphＩ−HindIII部位へ挿入した。次いで、Ａsp７１８ −Ａ(５０)−ＤraＩ−ＨindIIIと命名されたオリゴマーを対応する部位へ挿入すると、ｐＴ７−Ａ５０が形成された。このオリゴマーの相補鎖は下記配列を有する：ｐＴ７Ｄ１Ａ５０の構築：ｐＳＧ５のＥcoＲＩ−ＢamＨＩへ先にクローン化したＤ１コード領域のＥcoＲＩ−ＢgIIIフラグメント（ｐ３５ＳＡdh１Ｄ１のＥcoＲＩ−ＢamＨＩフラグメントから）。ｐＴ７Ｄ２ポリＡの構築：（図１６−２６参照）Ａ．調製されたフラグメントの単離 virＤ２コード領域をｐ３５ＳＤ２から切除し、分取ゲル電気泳動およびアガロースからのＤＮＡ抽出により単離した。内部部位は、virＤ２の５'および３' 末端の調製をサブフラグメントで行うことを必要とした。５'末端から単離したＨindIII／ＥcoＲＩフラグメントをＰvuＩでトリミングしてフラグメントＡを製造した。３'末端から単離したＢamＨＩ／ＥcoＲＩフラグメントをＨaeIIIでトリミングしてフラグメントＣを製造した。中央フラグメントＢは、ＨindIII／Ｂam ＨＩ消化により得られた。Ｂ．フラグメントＡおよびＢのクローニングベクターｐＴＣ１８２をＨindIIIおよびＳphＩで消化し、ＳphＩ末端に対するフラグメントＡ＋アダプターオリゴ（開始コドンを復元）を適所へライゲーションすると、ｐＴＣ１８２−Ａが形成された。このプラスミドをＨindIIIおよびＢ amＨＩで消化し、フラグメントＢをＡの３'末端にライゲーションした。合わせたフラグメントＡＢを切除し、生成したプラスミドｐＴＣ１８２−Ａ−ＢのＢam ＨＩ／SphＩ消化後にゲル精製した。Ｃ．修飾ｐＵＣ２１ベクターにおけるフラグメントＡＢおよびＣのクローニングＢamＨＩおよびＸbaＩ部位間のｐＵＣ２１ポリリンカー部分を除去し、ほとんどの部位を復元したオリゴヌクレオチド対により置き換え、この構築で必要とされるＢgIII部位を付加した。生成したプラスミドｐＵＣ２１−Ｘを、ＢamＨＩおよびＥcoＲＶで消化し、フラグメントＣをベクターへライゲーションして、ｐＵＣ２１−Ｃを形成した。次に、この生成物をＢamＨＩおよびＳphＩで消化し、上記からの単離フラグメントＡＢをライゲーションして、virＤ２を再構築した。生成したプラスミドｐＵＣ２１−virＤ２をＳphＩおよびＢgIIIで消化後、調製したvirＤ２ＯＲＦを含むフラグメントＡＢＣをゲル精製した。Ｄ．Ｔ７転写ベクターへのvirＤ２のクローニング上記転写ベクター、Ｔ７ポリＡを、ＳphＩおよびＢgIIIで消化し、フラグメントＡＢＣ（＝virＤ２）をＴ７プロモーター下方および４２Ａ残基のブロック上方の位置へライゲーションした。ｍＲＮＡ合成：Ｔ７Ｄ１Ａ５０およびＴ７Ｄ２Ａ５０プラスミドを、ＸhoＩにより直鎖状化し、ポリ（Ａ）伸長部のすぐ下流を切断した。直鎖状化したＤＮＡをフェノール／クロロホルム抽出し、次いでエタノール沈澱した。［ｍ⁷Ｇ(５')ppp(５')］を含むＴ７キャップ-スクライブキット（ベーリンガー）のＴ７ポリメラーゼを用いて、直鎖状化ＤＮＡのインビトロ転写を行った。ｍＲＮＡの正確さおよび濃度をアガロースゲル電気泳動により測定した。バイオリスティック供給材料の滅菌：金粒子（０３μm−ヘラエウス）を、１００％エタノールおよび０.１％ＤＥＰＣ中に６０mgの粒子を入れることにより滅菌した。粒子をリボヌクレアーゼ不含有水により３回リンスし、次いで１mlのリボヌクレアーゼ不含有５０％グリセリン溶液に再懸濁した。製造された粒子５０μlずつを６ショットに使用した。巨大担体を１００％エタノールおよび０.１％ＤＥＰＣ中に沈め、次いで１００％エタノール中で３回リンスし、風乾した。停止スクリーンをオートクレーブにかけた。核酸沈澱：０.５μlのトリス緩衝液（１モル）、５０μlのＣaＣl₂および０.１モルのスペルミジン２.５μlを連続して加えることにより、ＤＮＡ（１μg）およびｍＲＮＡ（約８μg：４μgのＤ１および４μgのＤ２または８μgの非特異的ｍＲＮＡ）が金粒子（６０mg／ml、０.３μm）の５０μl懸濁液へ沈澱した。全薬剤を加えた後、旋回混合を３分間続行した後、短い超遠心分離（１分）により粒子が沈降した。上清を除去し、粒子を冷１００％エタノールで１回洗浄し、１００％エタノール６０μｌに再懸濁した。この混合物を旋回混合し、１０μlずつを微小担体ディスクへピペットで移し、層流フードで風乾した。植物細胞へのマイクロプロジェクタイル搬入サンプルを発射アセンブリーから５.５cmのところに配した１５５０psi破壊ディスクを用いて、粒子加速装置（ＰＤＳ−Ｈｅ１０００、デュポン）によりマイクロプロジェクタイルを植物細胞へ搬入した。１００μmメッシュステンレススチール製スクリーンを、ストッピングプレートおよび組織間の中間に置いた。標的プレートを２度衝撃処理した。ルシフェラーゼ検定：ルシフェラーゼおよびＧusを、供給業者の薦めるとおりプロメガのルシフェラーゼ検定システムで組織抽出物において検定した。ルシフェラーゼおよびβ−グルクロニダーゼ活性は、２５℃で１０秒間アナリティカル・ルミネセンスモデル２００１ルミノメーターにより検出される光単位として表される。結果：衝撃処理の２４時間後にルシフェラーゼ検定を行った。Ｄ１およびＤ２のｍＲＮＡを、右境界配列が３５Ｓプロモーターとルシフェラーゼコード配列の間に挿入されているｐ３５ＳＲＢＬucと同時衝撃処理した。対照実験では、ｐ３５ＳＲＢＬucを非特異ｍＲＮＡで衝撃処理するか、またはＤ１およびＤ２ｍＲＮＡを、境界配列を全く含まないｐＬＵＣＤＮＡと同時搬入した。結果は下記第１４表に示す。２４時間インキュベーション後、組織をホモジネートし、酵素活性を測定した。β−グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）を発現するプラスミド、ｐＧＵＳを、ＤＮＡ導入効率の対照として各衝撃処理に含ませ、レポーター活性をルシフェラーゼ対ＧＵＳ活性の割合として表す。独立衝撃処理を分析し、データを３回反復値＋または−標準偏差の平均値として示す。％対照値は、β−グルクロニダーゼに対するルシフェラーゼ活性対対照プラスミドにより観察される活性の割合から測定される。結論：ｐＲＢ(＋)Ｌuc ＤＮＡとＤ１ｍＲＮＡおよびＤ２ｍＲＮＡの同時搬入後、ルシフェラーゼ活性が１０倍減少した。ｍＲＮＡとして植物細胞へ搬入される２種のvir遺伝子は、相乗効果を有すると思われた。これらの観測結果は、観測されたルシフェラーゼ活性の減少がvir遺伝子産物による右境界配列での鎖特異的ニックの結果であることを強く示していた。ｍＲＮＡ搬入の利点は、その効果が必ず一過性である点である。ヘルパープラスミドの外来ＤＮＡは全く存在しない。実施例９：プロトプラストにおける「アグロリスティック」形質転換技術は、遺伝子操作および作物品種の改良のための重要な手段である（ラスキン、１９９６）。様々な形質転換システムにより、稔性植物を生じ得る細胞へ外来遺伝物質を直接導入することができる。これらのシステムには、電気穿孔または直接ＤＮＡ摂取によるプロトプラストへのＤＮＡ搬入、細胞へのマイクロインジェクション、およびＤＮＡコーティングしたマイクロプロジェクタイルでの衝撃処理による遺伝子導入がある（再検討のため、モリッシュおよびフロム、１９９２参照）。既存の搬入システムでは、外来遺伝子の複数コピーを組込む傾向がある。ベクター配列を伴わない外来遺伝子の単純な組込みパターンをもたらす方法が要望されている。ここに記載されている「アグロリスティック」と称される形質転換方法は、外来遺伝子の挿入およびベクター配列の排除という単純なパターンでトランスジェニック物質を生じさせる可能性を有する。この方法では、選択マーカーにフランクしているＴ−ＤＮＡ境界配列を含むプラスミドと同時搬入される、Ｔ−ＤＮＡの形成および保護において重要な役割を演じるビルレンス遺伝子（virＤ１、vir Ｄ２およびvirＥ２）に対する植物発現カセットを使用する。先の実施例において、これらの成分全てをバイオリスティック装置により植物細胞へ搬入するとき、この技術的方法は有用であることが示されている。この実施例では、我々は、これらの成分全てを搬入するためのプロトプラストへの直接ＤＮＡ搬入方法を使用する。我々は、この方法で搬入されたvirＤ１およびvirＤ２遺伝子産物が実際にＴ−ＤＮＡ型挿入事象を誘発し得ること、およびvirＥ２遺伝子産物を含ませると、形質転換頻度が高められ得ることを見いだした。材料および方法プラスミドｐＣｌＢ１７１１は、カリフラワーモザイクウイルス３５Ｓ（ＣａＭＶ３５Ｓ）プロモーターにより駆動される蛍ルシフェラーゼ遺伝子を含むｐＵＣ誘導体であり、実施例３に記載されている。Ｔ−ＤＮＡ境界を導入するため、ＬＢＡ５２６９（ファン・ハーレンら、１９８９）の右境界配列に対応する２種の合成オリゴヌクレオチドをアニーリングすることにより、二本鎖：５'-ＡＴＣＣＧＧＣＡＧＧＡＴＡＴＡＴＡＣＣＧＴＴＧＴＡＡＴＴＣＴＧＣＡ−３'（配列番号２２）を生成した。ＢamＨＩ−ＰstＩ部位にフランクさせたこの二本鎖を、プロモーターおよびルシフェラーゼコード配列間においてｐＣｌＢ１７１１での対応する部位へ挿入すると、ｐＲＢＬucが得られた（図２参照）。ｐＮeoＲＢＬucは、左境界配列、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子（nptII）およびルシフェラーゼ遺伝子を含み、右境界はプロモーターおよびｐＲＢ(＋)Ｌucからのルシフェラーゼコード領域間に挿入されている。nos（ノパリンシンターゼ）プロモーターにより駆動されるnptII遺伝子を、２.２kbのＳacII−ＨindIII断片としてプラスミドｐＢin１９から切除した。左境界配列をＢgIII−ＥcoＲＩフラグメントとしてｐＢin１９から切除した。これら両断片をｐＲＢ(＋)ＬucのＸbaＩ−Ｈ indIII部位へ挿入した。ｐＮeoＬucはｐＮeoＲＢlucの均等物であり、ＣaＭＶ３５Ｓプロモーターおよびルシフェラーゼコード領域間に右境界配列は挿入されていない。ｐＴiＡ６からのvirＤ１およびvirＤ２遺伝子を、ＣaＭＶ３５Ｓプロモーター（０.５kb）、Ａdh１第１イントロン（０.５kb）およびノパリンシンターゼ（no s）ポリアデニル化領域（０.２５kb）から成る発現ベクターｐＭＦ６（カリスら、１９８７）へサブクローニングした（図１）。virＤ１コード配列に対応するｐＡＤ１１８７由来の０.６kbのＥcoＲＩ−ＰstＩフラグメントを、ｐＭＦ６へクローン化すると、ｐ３５ＳＡdhＤ１が生成された。virＤ２コード配列をｐＡＤ１１９０（ガイおよびダス、１９８９）由来の１.８kbのＥcoＲＩフラグメントとして切除し、ｐＭＦ６でクローン化すると、ｐ３５ＳＡdhＤ２が生成された。 virＥ２コード領域を、アグロバクテリウムＴiプラスミドｐＴiＡ６（受託番号Ｘ０４７８４）（ウィナンズら、１９８７）の３kbのＸhoＩ断片を含むpw１０８からクローン化した。まずpw１０８の６８７bpのＳacＩ−ＳmaＩフラグメントをｐＫＳ(−)の対応する部位へクローン化してｐＫＳ３'Ｅ２を生成した。pw１０８由来の９２４ｂｐのＨaeIII−ＳacＩを、ｐＫＳ３'Ｅ２由来のＳacＩ−Ｐst Ｉ断片およびＥcoＲＩ−付着および平滑末端にフランクさせた一対のアニール化ＤＮＡオリゴヌクレオチド（５'−ＡＡＴＴＣＡＴＧＧＡＴＣＴＴＴＣＴＧＧＣＡＡＴＧＡＧＡＡＡＴＣＣＡＧＧ−３'、配列番号２３）と合わせ、ｐＢluescri pt ＫＳ−（ストラタジーン、インコーポレイテッド）のＥcoＲＩ−ＰstＩ部位へクローン化してｐＫＳＥ２を生成した。次いで、全virＥ２コード領域を包含するＸhoＩ−ＰstＩ断片をｐＭＦ６のＸhoＩ−ＰstＩへサブクローン化して、ｐ３５ＳＡdhＥ２を生成した。植物材料トウモロコシ浮遊細胞：ゼア・マイス品種ブラック・メキシカン・スウィート（ＢＭＳ）の懸濁培養物を、３０g／lのショ糖および２mg／lの２,４−ジクロロフェノキシ酢酸（２,４ −Ｄ）を補ったＮ６培地（２Ｎ６３Ｓ）（チューら、１９７５）で維持した。実験に使用されるトウモロコシ細胞懸濁液は、３日齢の急生長培養物から採取された。プロトプラストは、『ブラック・メキシカン・スウィートコーン：組織培養物に関するその用途。生物学的研究用トウモロコシ』、Ｗ.Ｆ.シェリダン、シャーロッテスヴィル編、Ｖａ.プラント・モレキュラー・バイオロジー・アソーシエーション（１９８２）（３８５−３８８頁）に記載された要領で、トウモロコシ同系交配ＢＭＳ（ブラック・メキシカン・スウィート）の細胞懸濁培養物から単離された。形質転換の２日後パロモマイシン（２００mg／l）を培地に含ませた。形質転換の４週間後に現れた独立微小カルスを、２００μg／mlパロモマイシンを補った新鮮なプレートへ移した。同培地での２回の継代培養後、２００μg／m lのパロモマイシンを補った２５mlの液体培地中へ約１００mgのトウモロコシ細胞を接種することにより、懸濁培養を開始させた。第１５表に記載された要領でｐ３５ＳＡdhＤ１、ｐ３５ＳＡdhＤ２および／またはｐ３５ＳＡdhＥ２の存在または非存在下異なる濃度のｐＮeoＲＢＬuc ＤＮＡによりプロトプラストを形質転換した。ＤＮＡ抽出およびサザンブロットハイブリダイゼーション接種の１０日後濾過により細胞培養物を採取し、液体窒素中で冷凍した。ＤＮＡを記載された要領（ホールら、１９９１）で単離した。約１０μgのゲノムＤＮＡを、ＥcoＲＩでの消化に使用した。０.７％アガロースゲルでの分離後、製造会社（アマーシャム）により記載された条件に従い、ＤＮＡをハイボンド＋膜へ移し、ハイブリダイゼーションを行った。ファルマシアのオリゴ標識キットを用いて、ＤＮＡプローブを［ａ−³²Ｐ］dＣＴＰにより標識した。neoプローブは、nptII遺伝子の０.３kbのＰstＩ−ＳphＩフラグメントに対応する。lucプローブは、ルシフェラーゼ遺伝子の０.７kbのＸbaＩ−ＥcoＲＩフラグメントに対応する。プローブを除去するため、１００℃で５分間０.５％ＳＤＳの溶液により膜を剥した。結果：実験的設計遺伝子試験によるＶirＤ１−および−ＶirＤ２介在挿入事象に関するスクリーニングを行えるベクターを設計した。ベクターｐＮeoＲＢＬucは、Ｔiプラスミドからの天然左境界、nos−ＮＰＴII−nos（ノパリンシンターゼプロモーターおよびターミネーター配列を伴うキメラネオマイシンホスホトランスフェラーゼII 遺伝子）、３５Ｓプロモーター、合成右境界配列およびルシフェラーゼコード領域を含む。通常の機構により形質転換されるパロモマイシン耐性トウモロコシカルスは、ほぼ不変的にルシフェラーゼ遺伝子を含み、ルシフェラーゼを発現する。反対に、ルシフェラーゼを発現できないクローンは、ＶirＤ１およびＶirＤ２介在切除およびＴ−鎖組込みの候補産物であった。植物細胞においてvirＤ１、vir Ｄ２およびvirＥ２遺伝子を発現させるため、それらの各オープン・リーディング・フレーム（ＯＲＦ）をＣaＭＶ３５Ｓプロモーターの制御下に置いた。安定な形質転換体の分析：様々な比率のｐ３５ＳＡdhＤ１およびｐ３５ＳＡdhＤ２および／またはｐ３５ＳＡdhＥ２ＤＮＡと共にｐＮeoＲＢＬucプラスミドＤＮＡを用いて、プロトプラストを形質転換した。対照として、ｐＮeoＲＢＬucプラスミドについても単独で搬入した。パロマイシン含有培地での生長により、安定な形質転換体を選択した。ｐＮeoＲＢlucをvirＤ１およびvirＤ２遺伝子により同時形質転換すると、１プレート当たり平均１２０のパロモマイシン耐性クローンが現れたが、３０のカルスについてのみさらに分析した。virＥ２をビルレンス遺伝子のプールに加えると、パロモマイシン耐性カルスの数は２５０に達し得る。一連の各実験から３０のパロモマイシン耐性クローンを分析すると、約１０− ４０％はルシフェラーゼを発現しないことが分かり、これはvirＤ１−virＤ２介在組込み事象の約１０−４０％頻度を示していた。両挿入片を含むクローンは９０％ルシフェラーゼ陽性群に含まれるため、これは「アグロリスティック」事象の頻度を過少評価したと思われる。virＥ２遺伝子の存在または非存在下での実験から回収されたルシフェラーゼを発現しないカルスの頻度に顕著な差異はなかった。形質転換体クローンのサザンブロット分析：サザンブロットハイブリダイゼーションは、（ｉ）ｐＮeoＲＢＬuc単独、（ii ）ｐ３５ＳＡdhＤ１およびｐ３５ＳＡdhＤ２ＤＮＡと同時形質転換されたｐＮe oＲＢＬucプラスミドおよび（iii）ｐ３５ＳＡdhＤ１、ｐ３５ＳＡdhＤ２およびｐ３５ＳＡdhＥ２ＤＮＡと同時形質転換されたｐＮeoＲＢＬucプラスミドによる衝撃処理後に得られた対照パロモマイシン耐性カルスラインからのＤＮＡで行われた。ゲノムＤＮＡをＥcoＲＩで消化した結果、neoおよびlucの両プローブと相同であるｐＮeoＲＢＬucプラスミド由来の３.９kbのフラグメントが生成する。Ｅco ＲＩは、ｐＮeoＲＢＬucのＴ−ＤＮＡ構造部分内側に一部位およびルシフェラーゼコード領域にもう一つの部位を有する。ｐＮeoＲＢＬuc単独によるプロトプラストの形質転換から回収された対照形質転換体は、予想通りlucおよびneoの両プローブとハイブリダイズする３.９kbのＥcoＲＩフラグメントを呈した。このフラグメントのコピー数は５より大きく、さらに再編成および／またはフラグメント化ＤＮＡの複数コピーが見られた。ｐＮeoＲＢＬucとｐ３５ＳＡdhＤ１、ｐ３５ＳＡdhＤ２および／またはｐ３５ＳＡdhＥ２プラスミドＤＮＡの同時搬入後に得られたパロモマイシン耐性カルスラインからのＤＮＡのサザンブロット分析は、第１５表に示されている。サザンブロット分析の場合、ルシフェラーゼ活性について陰性試験したカルスラインが選択された。例えば、実験＃８で回収し、サザンハイブリダイゼーションにより分析した８種のトランスジェニックトウモロコシラインのうち、４種はバイオリスティック事象を呈し、４種は推定的アグロリスティック事象を呈した。同じハイブリダイゼーションフィルターに含まれるコピー数標準値との比較により判断したところによると、ＮＰＴII遺伝子コピーの推定数は一般に１形質転換体ゲノムについて１または２であった。neoプローブおよびlucプローブとハイブリダイズするゲノムＤＮＡを含むカルスラインは、ｐＮeoＬuc ＤＮＡ単独での形質転換から回収したカルスラインよりも少ないコピー数を呈した。第１５表：形質転換の４週間後に個々のカルスの数を評価した。結論：これらの結果は、この技術方法がプロトプラストへ搬入された外来遺伝子の組込みのパターンを単純化し得ることを明白に示している。ＶirＤ１−ＶirＤ２− 介在組込みの頻度は約２０−３０％であった。さらに、virＥ２を加えることにより、形質転換効率が改善された。この技術方法により、外来ＤＮＡを伴わず、対象の遺伝子組込みの単純なパターンをもつ形質転換植物の回収が促進されるはずである。実施例１０：未分化接合子胚の直接衝撃処理によるトウモロコシのＣＧ００５２６遺伝子型の形質転換および選択剤としてのホスフィノトリシンの使用による形質転換カルスの単離。バイオリスティック（商標）装置を用いる衝撃処理用ＤＮＡの製造。トウモロコシの未分化胚またはＩ型カルスは、コジエルら、「バイオテクノロジー」１１：１９４−２００（１９９３）（これらの関連部分を引用して説明の一部とする）に記載された要領で形質転換され得る。本質的には公開された方法に従い、マイクロメートルサイズの金（一般的には直径１.０mmまたは０.３mm）の存在下での化学沈降によるマイクロプロジェクタイル衝撃処理用にＤＮＡを製造する。金に加えて、マイクロメートルサイズの他の高密度粒子、例えばタングステンまたは白金が使用され得る。この方法の一修飾法では、まず粒子を水に懸濁し、音波処理することにより粒子自体を製造する。次いで、音波処理された粒子が遠心分離により沈澱し、これを５０％グリセリン水溶液に再懸濁する。次に、この方法で製造される粒子を、体積５０μl中１管当たり約３mgの金粒子を含む個々の管に等分する。使用されるプラスミドの数、それらのサイズおよび所望のＤＮＡの最終濃度により異なる量でＤＮＡを各管に加える。次に、約３分間旋回混合しながら、２.５モルのＣaＣl₂約５０μlおよび０.１モルのスペルミジン約２０μlをその順序で各管に加える。次いで、ＤＮＡ／金複合体を静かに遠心分離にかける。上清を除去する。粒子を２５０μlの無水エタノールで１回洗浄し、再沈澱させ、次いで、約７５μlの新鮮な無水エタノールに再懸濁する。こうして準備された各管は、ＰＤＳ−１０００／Ｈｅによる６「ショット」に対して十分なＤＮＡ／金複合体を含む。十分に懸濁したＤＮＡ／金複合体１０μlを、無振動環境において各巨大担体シートへピペットで移す。ＰＤＳ−１０００／Ｈｅ装置では、異なる与圧グレードでも利用可能なプラスチックディスクの破裂によりヘリウムのバーストが放出される。例えば、ヘリウム１平方インチ当たり２００、４５０、６５０、９００、１１００、１３５０、１５５０、１８００、２０００および２２００ポンドで破裂する単一ディスクまたはディスクの組み合わせが得られる。このガスのバーストが巨大担体シートを推進し、これはステンレススチールスクリーンより停止される。スクリーンは、異なるメッシュサイズ、例えば１０×１０、１６×１６、２４×２４などを有し得る。他の設定項目は、巨大担体飛行距離、ギャップ距離および粒子飛行距離である。これらの設定項目は、製造業者の使用者用マニュアルに詳記されている。典型的には、ギャップ距離約５.５mm、巨大担体飛行距離約１０mmおよび粒子飛行距離約６〜９cmが使用される。さらに、スクリーンまたはバッフルは、停止スクリーンおよび標的プレート間の粒子飛行距離内に挿入され得る。上記のスクリーンまたはバッフルが膨張する気体からの衝撃波を妨害することにより、標的への損害が低減化される。一例では、開口部約１００μmのステンレススチールスクリーンを使用する。他の開口部サイズおよび材料組成も使用され得る。未分化胚またはＩ型胚形成カルスは、異なるパターンで標的プレートに配置され得る。一連の実験を通して、未分化胚に関する最適化パターンが展開される。一最適化パターンにおいて、未分化胚は円形パターンで配置され、この円形は直径約２cmである。未分化胚は円形の周縁部に配置される。約２５の未分化胚を各標的プレートに置く。さらに、標的プレートは、巨大担体発射アセンブリーに対してある角度に方向転換され得る。この結果、粒子拡散による未分化胚の求基的部分の最大飽和が確実になる。胚形成応答を生じさせるのは、未分化胚の求基的部分である。Ｉ型胚形成カルスの衝撃処理の一例では、カルスを、栄養培地上の直径約１cm の円の周縁に置く。衝撃処理装置の機械的設定項目は、未分化胚の衝撃処理に関して上記で列挙した設定項目と同様または類似した位置に配置され得る。標的パターンおよびガン設定項目は相互関係を有することに注目すべきである。言い替えれば、微小発射体衝撃処理装置における他の機械的設定項目の使用により、標的プレートでの受容組織の他の最適配置がもたらされ得る。機械的設定項目および標的パターンの他の組み合わせもこの発明の範囲内に含まれる。形質転換未分化胚は、自家受粉の約１４日後に得られる。未分化接合子胚を、１プレート当たり未分化胚２５で胚発生カルス形成を誘導および促進し得る培地を含む相異なる標的プレート間に分割する。未分化接合子胚を、バイオ・ラッドからのＰＤＳ１０００／Ｈｅ装置を用いてプラスミドｐ３５ＳＡdhＤ１、ｐ３５ＳＡdhＤ２およびＴ−ＤＮＡ標的プラスミド（ｐbarＲＢlucまたはｐＡＶＭ１）の混合物により衝撃処理する。virＥ２遺伝子に関する発現可能なＤＮＡも含まれ得る。本質的に上記の公開された方法に従い、０.３または１μm金粒子に対しプラスミドを沈澱形成させる。各標的プレートは、１１００−１３００psiのバースト圧力を用いてプラスミドおよび金製品により２回発射される。プラスミドｐbarＲＢlucは、ホスフィノトリシン耐性をコードするキメラ遺伝子を含むため、この物質を用いて、インビトロで形質転換細胞を選択する。この選択は衝撃処理の１日後３mg／Ｌで適用され、全部で８−１２週間維持される。こうして得られた胚形成カルスは、１mg／１ホスフィノトリシンの存在下で再生される。１９９１年９月１３日付けアメリカ合衆国特許出願０７／７５９２４３（この関連部分を引用して説明の一部とする）に記載された要領で、ＰＰＴに対する耐性についてクロロフェノールレッド（ＣＲ）試験により全カルスを試験する。この検定法では、どの細胞がＰＰＴの存在下で生長しているかを示すｐＨ高感度指示薬染料を使用する。生長する細胞は、培地においてｐＨ変化をもたらし、指示薬のクロロフェノールレッドを（赤から）黄色に変える。ＰＰＴに対する耐性遺伝子を発現する植物は、この試験で容易に同定される。ＣＲ試験による陽性の植物を、bar遺伝子の存在に関するＰＣＲにより検定する。選択マーカー遺伝子を含む植物を、ルシフェラーゼ遺伝子の発現について検定する。ルシフェラーゼ活性の欠如は、カルスがアグロリスティック事象であり得ることの指標である。アグロリスティック事象は、Ｔ−ＤＮＡの挿入と類似した方法でＤＮＡがトウモロコシＤＮＡへ組み込まれているものであるが、アグロバクテリウムは介在しない。ルシフェラーゼ遺伝子発現について陰性の植物を、サザーンブロットにより検定する。サザンブロット分析により観察されるバンドパターンは、どの形質転換体が実際にアグロリスティックであるかを示していた。実施例１１：未分化接合子胚の直接衝撃処理によるトウモロコシのＡ１８８遺伝子型の形質転換および選択剤としてのホスフィノトリシンの使用による形質転換植物の単離。遺伝子型Ａ１８８の雌穂を自家受粉すると、約１２−１４日後に未分化接合子胚が得られる。未分化接合子胚を、２ＪＭＳ＋５ＤcプラスＡgＮＯ₃培地に置く。１６−２０時間後、未分化接合子胚を同培地（ただし、１２％ショ糖含有）へ移す。３−５時間後、未分化接合子胚を、ＰＤＳ１０００／Ｈe装置を用いてプラスミドｐ３５ＳＡdhＤ１、ｐ３５ＳＡdhＤ２およびＴ−ＤＮＡ標的プラスミド（ｐbarＲＢlucまたはｐＡＶＭ１）の混合物により衝撃処理する。virＥ２遺伝子について発現可能なＤＮＡも含まれ得る。上記要領で、本質的にはバイオ・ラッドから公表された方法に従い、プラスミドを０.３または１μm金粒子へ沈澱させる。バースト圧力１１００−１３００psiのヘリウムを用いて粒子を搬入する。各標的プレートをプラスミドおよび金粒子製品により２回発射する。一夜インキュベーション後、２％ショ糖および５−１０mg／Ｌのホスフィノトリシンを含む新鮮な維持培地へ未分化胚を移し、ほぼ２週間毎に同培地へ継代培養する。こうして得られた胚形成カルスは、１mg／Ｌホスフィノトリシンの存在下で再生される。再生する全植物を、ＰＰＴ耐性についてクロラムフェニコールレッド（ＣＲ）試験により試験する。この検定では、どの細胞がＰＰＴの存在下で生長しているかを示すｐＨ高感度指示薬染料を使用する。ＰＰＴ耐性を示す葉片は、培地においてｐＨ変化をもたらし、指示薬を（赤から）黄色に変える。ＰＰＴに対する耐性遺伝子を発現する植物は、この試験で容易に同定される。ＣＲ試験による陽性の植物を、bar遺伝子の存在に関するＰＣＲにより検定する。選択マーカー遺伝子を含む植物を、ルシフェラーゼ遺伝子の発現について検定する。ルシフェラーゼ活性の欠如は、カルスがアグロリスティック事象であり得ることの指標である。アグロリスティック事象は、Ｔ−ＤＮＡの挿入と類似した方法でＤＮＡがトウモロコシＤＮＡへ組み込まれているものであるが、アグロバクテリウムは介在しない。ルシフェラーゼ遺伝子発現について陰性の植物を、サザンブロットにより分析する。サザンブロットにおけるバンドパターンは、どの形質転換体が実際にアグロリスティックであるかを示している。実施例１２：未分化接合子胚から誘導されたＩ型カルスの衝撃処理によるトウモロコシのＣＧ００５２６遺伝子型の形質転換および選択剤としてのホスフィノトリシンの使用による形質転換カルスの単離。Ｉ型カルスは、標準培養技術を用いて未分化接合子胚から得られる。遺伝子を搬入するため、約３００mgのＩ型カルスを、外科用メスで切り刻み、１８％ショ糖含有標準培養培地で３回リンスすることにより調製し、即座に再び１８％ショ糖含有半固体培養培地上へ置く。約４時間後、バイオ・ラッドからのＰＤＳ１０００／Ｈeバイオリスティック装置を用いて組織を衝撃処理する。バイオ・ラドからの標準プロトコールを用いて、プラスミドを０.３または１μm金粒子へ沈澱させる。遺伝子搬入の約１６−２０時間後、カルスを２％ショ糖およびバスタとして１０mg／Ｌホスフィノトリシン含有標準培養培地へ移す。カルスを８週間選択培地で継代培養した後、植物産生のために残存生長しているカルスを標準再生培地へ移す。再生する全植物を、ＰＰＴ耐性についてクロラムフェニコールレッド（ＣＲ）試験により試験する。この検定では、どの細胞がＰＰＴの存在下で生長しているかを示すｐＨ高感度指示薬染料を使用する。生長する細胞は、培地においてｐＨ変化をもたらし、指示薬を（赤から）黄色に変える。ＰＰＴに対する耐性遺伝子を発現する植物は、この試験で容易に同定される。ＣＲ試験による陽性の植物を、bar遺伝子の存在に関するＰＣＲにより検定する。選択マーカー遺伝子を含む植物を、ルシフェラーゼ遺伝子の発現について検定する。ルシフェラーゼ活性の欠如は、カルスがアグロリスティック事象であり得ることの指標である。アグロリスティック事象は、Ｔ−ＤＮＡの挿入と類似した方法でＤＮＡがトウモロコシＤＮＡへ組み込まれているものであるが、アグロバクテリウムは介在しない。ルシフェラーゼ遺伝子発現について陰性の植物を、サザンブロットにより分析する。サザンブロットにおけるバンドパターンは、どの形質転換体が実際にアグロリスティックであるかを示している。実施例１３：未分化接合子胚から誘導された破砕性懸濁培養細胞を衝撃処理することによるＢ７３から誘導されたトウモロコシの遺伝子型のカルスの形質転換および選択剤としてのホスフィノトリシンの使用による形質転換カルスの単離。破砕性カルスは、アメリカ合衆国特許第５３５０６８９号（これを引用して説明の一部とする）に記載されたＢ７３から誘導された遺伝子型の平板培養未分化胚から誘導された。懸濁培養物をＮ６培地で毎週継代培養した。継代培養の３−５日後に取られた細胞は、それらを７１０μmステンレススチールフィルターで濾過し、次いでそれらをデュラポア（ＣＧＣ１２８０／８１参照）膜表面へ分布させることにより採取された。約０.４gの細胞を、各々直径４７mm膜の表面に分布させた。ＰＤＳ１０００／Ｈe装置を用いて、vir遺伝子（３５ＳＡdhＤ１、ｐ３５ＳＡdhＤ２）を運ぶプラスミドおよびＴ−ＤＮＡ標的プラスミド（pbarＲＢlucまたはｐＡＶＭ１）の混合物による衝撃処理前の３−５時間、１２％ショ糖含有Ｎ６培地に膜を置いた。等量（１：１：１）のＶirＤ１、virＤ２および３５Ｓ−bar 標的Ｔ −ＤＮＡ（２ショットとして各々合計１.３μg）または過剰のvir遺伝子（２ショットとして２：２：１μg）のいずれかを細胞に搬入した。virＥ２遺伝子について発現可能なＤＮＡも上記実験に含まれ得る。上記要領で、本質的にはバイオ・ラッドから公表された方法に従い、プラスミドを０.３または１μm金粒子へ沈澱させた。バースト圧力１１００−１３００ps iのヘリウムを用いて粒子を搬入した。各標的プレートは２ショットを受けた。一夜インキュベーション後、２％ショ糖および３mg／Ｌのホスフィノトリシンを含む新鮮な維持培地へカルスを伴う膜を移した。３週間後、各フィルターからの細胞を、３プレートの１０mg／Ｌバスタ含有２Ｎ６培地の表面へ拡散させた。４週間後、生長しているコロニーを、３mg／ｌバスタを含む新鮮な２Ｎ６へ移し、１週間後こうして得られたカルスをＰＰＴ耐性に関するクロロフェノールレッド（ＣＲ）試験により試験した。この検定では、どの細胞がＰＰＴの存在下で生長しているかを示すｐＨ高感度指示薬染料を使用する。生長する細胞は、培地においてｐＨ変化をもたらすため、指示薬を（赤から）黄色に変える。ＰＰＴに対する耐性遺伝子を発現するカルスは、この試験で容易に同定された。陽性片が培地を黄色またはオレンジ色に変えたことから、少なくともある程度のＰＰＴ耐性を示しており、それらを５mg／ｌバスタ含有２Ｎ６培地に置いた。ＣＲ試験による陽性のカルスを、barまたはＰＡＴ遺伝子の存在に関するＰＣＲにより検定した。第１６表：‡（１）および（２）は２回反復処理であった。＊このコロニーはルシフェラーゼについて陽性であった。 §これらの１つは推定的アグロリスティック事象であった。選択マーカー遺伝子を含むカルスラインに対し、ルシフェラーゼ遺伝子の発現について検定を行った。ルシフェラーゼ活性の欠如は、カルスがアグロリスティック事象であり得ることの指標であった。アグロリスティック事象は、Ｔ−ＤＮＡの挿入と類似した方法でＤＮＡがトウモロコシＤＮＡへ組み込まれているものであるが、アグロバクテリウムは介在しない。ルシフェラーゼ遺伝子発現について陰性のカルスラインを、サザンブロットにより分析した。サザンブロットにおけるバンドパターン（図）は、どの形質転換体が実際にアグロリスティックであるかを示していた。この表は、この実験で分析された２３セルラインのうち、１１はルシフェラーゼ活性を欠き、そしてサザンブロットにより分析されたもののうち９セルライン中４セルラインはＴ−ＤＮＡ様挿入片のみを含み、２セルラインはＴ−ＤＮＡ様挿入片および非生物学的（この場合バイオリスティック）ＤＮＡ搬入方法を用いた後に見いだされる典型的挿入片の両方を含んでいたことを示している。実施例１４：未分化接合子胚から誘導されたＩ型カルス細胞の衝撃処理によるトウモロコシのＣＧ００５２６遺伝子型のカルスの形質転換および選択剤としてのホスフィノトリシンの使用による形質転換カルスの単離。カルスは、コジエルら、「バイオテクノロジー」１１：１９４−２００(１９９３)に記載された遺伝子型ＣＧ００５２６の平板培養未分化胚から誘導される。維持培地（２ＤＧ４＋０.５mg／１２,４−Ｄ）において培養物を週１回継代培養し、継代培養物を３−５時間１２％ショ糖含有２ＤＧ４培地に置いた２−３日後に細胞塊を採取する。１プレート当たり１６標的カルス片を直径８−１０mmの環状に配置させる。ＰＤＳ１０００／Ｈｅ装置を用いて、vir遺伝子（３５ＳＡd hＤ１、ｐ３５ＳＡdhＤ２）を運ぶプラスミドおよびＴ−ＤＮＡ標的プラスミド（pbarＲＢlucまたはｐＡＶＭ１）の混合物によりカルスを衝撃処理する。等量（１：１：１）のＶirＤ１、virＤ２および３５Ｓ−bar 標的Ｔ−ＤＮＡ（２ショットとして各々合計１.３μg）または過剰のvir遺伝子（２ショットとして２：２：１μg）のいずれかを細胞に搬入する。virＥ２遺伝子について発現可能なＤＮＡも含まれ得る。上記要領で、本質的にはバイオ・ラッドから公表された方法に従い、プラスミドを０.３または１μm金粒子へ沈澱させた。バースト圧力６５０psiのヘリウムを用いて粒子を搬入する。各標的プレートは２ショットを受ける。一夜インキュベーション後、２％ショ糖を含む新鮮な維持培地へカルスを移す。さらに２週間後、望ましいカルス（典型的なＩ型形態を示す）を、１２０mg／Ｌバスタ（ＰＰＴ）含有維持培地へ継代培養する。４週間後、生長しているカルスを、３０mg／ｌのバスタを含む新鮮な維持培地へ移す。カルスを全部で８週間選択培地で継代培養した後、残存し、生長しているカルスを植物製造用の標準再生培地へ移す。再生する植物を全てＰＰＴ耐性に関するクロロフェノールレッド（ＣＲ）試験により試験する。この検定では、どの細胞がＰＰＴの存在下で生長しているかを示すｐＨ高感度指示薬染料を使用する。生長する細胞は、培地においてｐＨ変化をもたらすため、指示薬を（赤から）黄色に変える。ＰＰＴに対する耐性遺伝子を発現する植物は、この試験で容易に同定される。ＣＲ試験による陽性の植物を、bar遺伝子の存在に関するＰＣＲにより検定する。選択マーカー遺伝子を含む植物に対し、ルシフェラーゼ遺伝子の発現について検定を行う。ルシフェラーゼ活性の欠如は、カルスがアグロリスティック事象であり得ることの指標である。アグロリスティック事象は、Ｔ−ＤＮＡの挿入と類似した方法でＤＮＡがトウモロコシＤＮＡへ組み込まれているものであるが、アグロバクテリウムは介在しない。ルシフェラーゼ遺伝子発現について陰性の植物を、サザンブロットにより分析する。サザンブロットにおけるバンドパターンは、どの形質転換体が実際にアグロリスティックであるかを示している。実施例１５：vir遺伝子およびＴ−ＤＮＡ標的配列によるトウモロコシプロトプラストの形質転換ゼア・マイスの懸濁培養物からのプロトプラストの製造およびＤＮＡによる形質転換方法は、アメリカ合衆国特許５３５０６８９に記載されている。プロトプラストの形質転換に使用されるＤＮＡは、例えばプラスミドｐ３５ＳＡdhＤ１、ｐ３５ＳＡdhＤ２およびＴ−ＤＮＡ標的プラスミド（ｐbarＲＢlucまたはｐＡＶＭ１）の混合物により構成される。virＥ２遺伝子について発現可能なＤＮＡもまた含まれ得る（実施例７参照）。カルスはプロトプラストから回収され、植物は選択剤としてホスフィノトリシンを用いて記載された要領で再生される。形質転換プロトプラスト誘導細胞は、ＤＮＡ処理の１０日後から開始して３−５mg／ＬＰＰＴを含む選択培地の適用により選択される。再生する植物を全てＰＰＴ耐性に関するクロロフェノールレッド（ＣＲ）試験により試験する。この検定では、どの細胞がＰＰＴの存在下で生長しているかを示すｐＨ高感度指示薬染料を使用する。生長する細胞は、培地においてｐＨ変化をもたらすため、指示薬を（赤から）黄色に変える。ＰＰＴに対する耐性遺伝子を発現する植物は、この試験で容易に同定される。ＣＲ試験による陽性の植物を、bar遺伝子の存在に関するＰＣＲにより検定する。選択マーカー遺伝子を含む植物に対し、ルシフェラーゼ遺伝子の発現について検定を行う。ルシフェラーゼ活性の欠如は、カルスがアグロリスティック事象であり得ることの指標である。アグロリスティック事象は、Ｔ−ＤＮＡの挿入と類似した方法でＤＮＡがトウモロコシＤＮＡへ組み込まれているものであるが、アグロバクテリウムは介在しない。ルシフェラーゼ遺伝子発現について陰性の植物を、サザンブロットにより分析する。サザンブロットにおけるバンドパターンは、どの形質転換体がＴ−ＤＮＡ様挿入片を有するかを示している。境界配列のクローニングおよび配列決定を行うことにより、挿入片の性質が確認され得る。この発明の具体的な実施態様は限られた数しか上記では詳記していないが、当技術分野に精通していれば、この発明の新たな教示内容および利点から実質的に逸脱することなく、多くの修飾が具体的な実例において可能であることは容易に理解できるはずである。従って、上記修飾は全て、この発明の範囲内に含まれるものとする。実施例に引用した文献の目録 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───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)，ＵＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＵ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＣＡ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＥＥ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＰ，ＫＲ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＴ，ＬＶ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＲＯ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ

Claims

【特許請求の範囲】１．真核細胞を（ａ）Ｔ−ＤＮＡ境界配列と結合させた対象のＤＮＡからなるＤＮＡフラグメントで；および、（ｂ）Ｔ−ＤＮＡ境界配列と結合させたＤＮＡの組込みを促進する１またはそれ以上のタンパク質を該真核細胞中で発現する能力のある少なくとも１つのキメラＤＮＡまたはＲＮＡ分子で、形質転換させることを含んでなる、該細胞のゲノムへ対象となるＤＮＡを組込む方法。２．処理工程ａ）およびｂ）が同時に実施される、請求の範囲第１項に記載の方法。３．該真核細胞が植物細胞である、請求の範囲第１項に記載の方法。４．該キメラＤＮＡまたはＲＮＡ分子がアグロバクテリウムＴiまたはＲiプスラミドのビルレンス領域によりコードされた１またはそれ以上のタンパク質をコードするキメラ核酸分子からなる、請求の範囲第１項に記載の方法。５．該キメラＤＮＡまたはＲＮＡ分子がＶirＤ２、ＶirＤ１、ＶirＣ１、Ｖir Ｃ２またはＶirＥ２をコードする、請求の範囲第４項に記載の方法。６．該キメラＤＮＡまたはＲＮＡ分子がＶirＤ２単独；またはＶirＤ１およびＶirＤ２の組み合わせ；ＶirＤ１、ＶirＤ２およびＶirＥ２の組み合わせ、をコードする、請求の範囲第５項に記載の方法。７．該キメラＤＮＡまたはＲＮＡ分子がＶirＤ２をコードする、請求の範囲第５項に記載の方法。８．Ｔ−ＤＮＡ境界配列と結合させた対象のＤＮＡが植物ウイルスベクターの一部である、請求の範囲第３項に記載の方法。９．該ＤＮＡ遺伝子が植物ウイルスベクターの一部である、請求の範囲第３項に記載の方法。 10．Ｔ−ＤＮＡ境界配列に結合させた対象のＤＮＡおよび該ＤＮＡ遺伝子が植物ウイルスベクターの一部である、請求の範囲第３項に記載の方法。 11．該植物細胞が双子葉植物の細胞である、請求の範囲第３項に記載の方法。 12．該双子葉植物が、タバコ、綿、アブラナおよび大豆からなる群から選択される、請求の範囲第１１項に記載の方法。 13．該植物細胞が単子葉植物の細胞である、請求の範囲第３項に記載の方法。 14．該単子葉植物が、トウモロコシ、コムギおよびコメからなる群から選択される、請求の範囲第１３項に記載の方法。 15．該対象のＤＮＡがキメラ遺伝子を含んでなる、請求の範囲第１項に記載の方法。 16．該キメラ遺伝子が該真核細胞中でタンパク質を発現する能力のある、請求の範囲第１５項に記載の方法。 17．Ｔ−ＤＮＡ境界配列に結合させた該対象のＤＮＡおよび該ＤＮＡ遺伝子が一本鎖ＤＮＡ分子の成分である、請求の範囲第１項に記載の方法。 18．ゲノム内に組込まれたＴ−ＤＮＡ境界配列と結合させたＤＮＡを有する稔性トランスジェニック植物を産生する方法であって、ａ）該ＤＮＡを請求の範囲第３項の方法に従って植物細胞のゲノムへ形質転換させ；そして、ｂ）その形質転換植物細胞を稔性トランスジェニック植物へと再生させること、を含んでなる、方法。 19．該稔性トランスジェニック植物が、タバコ、綿、ナタネ、大豆、トウモロコシ、小麦およびコメからなる群から選択される、請求の範囲第１８項に記載の方法。 20．Ｔ−ＤＮＡ境界配列と結合させた対象のＤＮＡの真核細胞ゲノムへの組込みを目的とする形質転換法における、アグロバクテリウムのビルレンスタンパク質をコードする遺伝子の使用。 21．該遺伝子がＶirＤ２、ＶirＤ１、ＶirＣ１、ＶirＣ２またはＶirＥ２をコードするキメラ遺伝子である、請求の範囲第２０項に記載の使用。 22．物理的形質転換実験にて得られたトランスジェニック植物細胞または植物体の完全体であって、該植物細胞または植物体の５％またはそれ以上が、アグロバクテリウム右境界Ｔ−ＤＮＡ配列によりゲノムＤＮＡにつなげた対象のＤＮＡを含んでなる、完全体。 23．マイクロプロジェクタイル衝撃により得られた、請求の範囲第２２項に記載の植物細胞または植物体の完全体。 24．該植物細胞または植物体の１０％から７０％が、アグロバクテリウム右境界Ｔ−ＤＮＡ配列により植物ゲノムＤＮＡにつなげた対象のＤＮＡを含んでなる、請求の範囲第２２項に記載の植物細胞または植物体の完全体。 25．２０またはそれ以上の独立した形質転換事象から得られた、請求の範囲第２２項に記載の植物細胞または植物体の完全体。 26．１０またはそれ以上の独立した形質転換事象から得られた、請求の範囲第２４項に記載の植物細胞または植物体の完全体。 27．請求の範囲第２２項に記載の植物細胞または植物体の後代。