JPH11511030A - 新規なヒトｇ−蛋白質結合レセプター - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、ヒトＧ−蛋白質結合レセプターポリペプチドおよびかかるポリペプチドをコードするＤＮＡ（ＲＮＡ）および組換え技法によりかかるポリペプチドを産生する方法を開示する。さらに、このようなポリペプチドを利用し、該ポリペプチドに対するアンタゴニストおよびアゴニストを同定する方法ならびに該アゴニストおよびアンタゴニストを治療にて用い、各々、Ｇ−蛋白質結合レセプターポリペプチドの発現不足および過剰発現に関する症状を治療する方法も開示する。さらにまた、Ｇ−蛋白質結合レセプター核酸配列における突然変異および可溶形のレセプターのレベルの変化を検出する診断方法も開示する。

Description

【発明の詳細な説明】 新規なヒトＧ−蛋白質結合レセプター 発明の背景 本発明は新たに同定されたポリヌクレオチド、かかるポリヌクレオチドにより コードされるポリペプチド、かかるポリヌクレオチドおよびポリペプチドの使用 、ならびにかかるポリヌクレオチドおよびポリペプチドの産生に関する。より詳 細には、本発明のポリペプチドはヒト７−トランスメンブランレセプターである 。本発明はまたかかるポリペプチドの作用の阻害に関する。 多くの医学的に重要な生物学的プロセスが、Ｇ−蛋白質および／または第二メ ッセンジャー、例えばｃＡＭＰが関与するシグナル導入経路に関与している蛋白 質により媒介されていることは十分に確立されている［Ｌefkowitz、ネイチャー （Ｎature）、３５１：３５３−３５４（１９９１）］。本明細書において、こ れらの蛋白質をＧ−蛋白質との経路に関与する蛋白質またはＰＰＧ蛋白質という 。これらの蛋白質として、ＧＰＣレセプター、例えばアドレナリン作動物質およ びドーパミン［Ｋobilka，B.K.ら、ＰＮＡＳ、８４：４６−５０（１９８７）； Ｋobilka，B.K.ら、サイエンス（Ｓcience）、２３８：６５０−６５６（１９８ ７）；Ｂunzow，J.R.ら、ネイチャー（Ｎature）、３３６：７８３−７８７（１ ９８８）］、Ｇ−蛋白質それ自身、エフェクター蛋白質、例えばホスホリパーゼ Ｃ、アデニルシクラーゼおよびホスホジエステラーゼ、および作動蛋白質、例え ば蛋白キナーゼＡおよび蛋白キナーゼＣ[Ｓimon，M.I.、サイエンス（Ｓcience ）、２５２：８０２−８（１９９１）]に関する蛋白質が挙げられる。 例えば、シグナル導入の一形態において、ホルモン結合の効果が、細胞内の、 酵素、アデニルシクラーゼの活性化である。ホルモンによる酵素活性化はヌクレ オチドＧＴＰの存在に依存しており、ＧＴＰもホルモン結合に影響を与える。Ｇ −蛋白質はホルモンレセプターをアデニル酸シクラーゼと結合させる。Ｇ−蛋白 質はホルモンレセプターにより活性化された場合にＧＴＰと結合ＧＤＰを交換す ることが明らかにされた。ついで、ＧＴＰを有する形態が活性化アデニル酸シク ラーゼと結合する。Ｇ−蛋白質それ自身により触媒されるＧＴＰのＧＤＰへの加 水分解はＧ−蛋白質をその基底不活性状態に戻す。このように、Ｇ−蛋白質は、 レセプターからエフェクターへのシグナルを中継する中間体として、またシグナ ルの存続期間を調節する時計としての２つの役割を果たす。 Ｇ−蛋白質結合レセプターの膜蛋白遺伝子の超科は７つの推定トランスメンブ ラン領域を有するものと特徴付けられている。該領域は細胞外または細胞質ルー プにより結合するトランスメンブランａ−ヘリックスを表すと考えられている。 Ｇ−蛋白質結合レセプターは広範囲の生物学的に活性なレセプター、例えばホル モン、ウイルス、成長因子および神経レセプターを包含する。 Ｇ−蛋白質結合レセプターは、少なくとも８個の分岐親水性ループと連結して いる、約２０ないし３０個のアミノ酸のこれら７個の保存疎水性鎖を有すること を特徴とする。結合レセプターのＧ−蛋白質科は精神病および神経学的障害の治 療に用いられる神経弛緩薬と結合するドーパミンレセプターを包含する。この科 に属する他の構成要素として、カルシトニン、アドレナリン、エンドセリン、ｃ ＡＭＰ、アデノシン、ムスカリン、アセチルコリン、セロトニン、ヒスタミン、 トロンビン、キニン、卵胞刺激ホルモン、オプシン、内皮分化遺伝子−１レセプ ター、ロドプシン、発臭剤、サイトメガロウイルスレセプターなどが挙げられる 。 ほとんどのＧ−蛋白質結合レセプターは、機能的蛋白質構造を安定化させると 考えられるジスルフィド結合を形成する最初の２個の細胞外ループのそれぞれに １個の保存システイン残基を有する。７個のトランスメンブラン領域は、ＴＭ１ 、ＴＭ２、ＴＭ３、ＴＭ４、ＴＭ５、ＴＭ６およびＴＭ７と表される。ＴＭ３は シグナル導入に関与する。 システイン残基のホスホリル化および脂質化（パルミチル化またはファルネシ ル化）はいくつかのＧ−蛋白質結合レセプターのシグナル導入に影響を与えうる 。ほとんどのＧ−蛋白質結合レセプターは第三の細胞質ループおよび／またはカ ルボキシ末端内に潜在的ホスホリル化部位を含有する。ｂ−アドレノレセプター な どの数種のＧ−蛋白質結合レセプターの場合、蛋白質キナーゼＡおよび／または 特異性レセプターキナーゼによるホスホリル化はレセプター脱感作を媒介する。 いくつかのレセプターでは、Ｇ−蛋白質結合レセプターのリガンド結合部位は 数種のＧ−蛋白質結合レセプタートランスメンブラン領域により形成される親水 性ソケットを有し、このソケットはＧ−蛋白質結合レセプターの疎水性残基によ り囲まれていると考えられている。Ｇ−蛋白質結合レセプタートランスメンブラ ンヘリックスの親水面は内側に向いており、極性リガンド結合部位を形成すると 考えられる。ＴＭ３はＴＭ３アスパラギン酸塩残基を含むなどリガンド結合部位 を有することで数種のＧ−蛋白結合レセプターに関与する。加えて、ＴＭ５セリ ン、ＴＭ６アスパラギンおよびＴＭ６またはＴＭ７フェニルアラニンまたはチロ シンもリガンド結合に関与する。 Ｇ−蛋白質結合レセプターは細胞内でヘテロトリマーＧ−蛋白質により種々の 細胞内酵素、イオンチャネルおよびトランスポーターと結合しうる［Ｊohnsonら 、エンドセルラー・レビュー（Ｅndoc.，Ｒev.）、１０：３１７−３３１（１９ ８９）を参照のこと］。種々のＧ−蛋白質ａ−サブユニットが特定のエフェクタ ーを優先的に刺激し、細胞内の種々の生物学的機能を調節している。Ｇ−蛋白質 結合レセプターの細胞質残基のホスホリル化は、いくつかのＧ−蛋白質結合レセ プターのＧ−蛋白質結合を調節する重要なメカニズムと同定された。Ｇ−蛋白質 結合レセプターは哺乳動物宿主内の多数の部位において見られる。 発明の要約 本発明の一態様によれば、新規ポリペプチドならびに生物学的に活性で、診断 または治療上有用なフラグメントおよび誘導体が提供される。本発明のポリペプ チドはヒト起源のものである。 本発明の別の態様によれば、ｍＲＮＡ、ＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡなら びにそのアンチセンス類似体を含む本発明のポリペプチドをコードする単離され た核酸分子および生物学的に活性な、診断上または治療上有用なそのフラグメン が提供される。 本発明のさらに別の態様によれば、組換え技術によるこのようなポリペプチド の産生法であって、本発明のポリペプチドをコードする核酸配列を含む組換え原 核および／真核宿主細胞を前記ポリペプチドの発現、その後の前記ポリペプチド の回収を促進する条件下で培養することからなる方法が提供される。 本発明のさらに別の態様によれば、このようなポリペプチドに対する抗体が提 供される。 本発明のさらに別の態様によれば、本発明のレセプターポリペプチドと結合し 、それを活性化するか、またはその活性化を阻害する化合物およびレセプターリ ガンドのスクリーニング法が提供される。 本発明のさらに別の態様によれば、Ｇ−蛋白質結合レセプターの発現不足に関 連する症状の治療に、本発明のレセプターポリペプチドを刺激するこのような活 性化化合物を使用する方法が提供される。 本発明のさらに別の態様によれば、Ｇ−蛋白質結合レセプターの過剰発現に関 連する症状の治療に、このような抑制化合物を用いる方法が提供される。 本発明のさらに別の態様によれば、少なくとも１つの本発明のＧ−蛋白質結合 レセプターのトランスメンブラン領域のフラグメント、コンセンサスフラグメン トおよび／または保存的アミノ酸置換を有する配列である、天然に存在しない合 成、単離および／または組換えＧ−蛋白質結合レセプターポリペプチドであって 、レセプターがＧ−蛋白質結合レセプターリガンドと結合するか、またはＧ−蛋 白質結合レセプターリガンド結合を定量的または定性的に調節するようなポリペ プチドが提供される。 本発明のさらに別の態様によれば、診断、治療および／または研究の用途に用 いられる、合成または組換えＧ−蛋白質結合レセプターポリペプチド、その保存 的置換および誘導体、抗体、抗イディオタイプ抗体、リガンドに結合するかまた はその予想される生物学的性質によりリガンド結合を調節することによりＧ−蛋 白質結合レセプター機能の潜在的モジュレーターとして用いることのできる組成 物および方法が提供される。 本発明のさらに別の目的は、レセプタータイプおよびサブタイプとして、種々 のＧ−蛋白質結合レセプターまたはそのフラグメントを阻害または模倣するよう に設計された、合成、単離または組換えポリペプチドを提供することである。 本発明のさらに別の態様によれば、本発明の核酸配列と特異的にハイブリッド 形成するのに十分な長さの核酸分子を有してなる診断用プローブも提供される。 本発明のさらに別の目的によれば、本発明の核酸配列における突然変異に関連 した疾患または疾患に対する感受性を検出するための診断検定法も提供される。 本発明のこれらおよび他の態様は本明細書の記載から当業者に自明である。 図面の簡単な記載 図１は、本発明の新規Ｇ−蛋白質結合レセプターのｃＤＮＡ配列および対応す る推定アミノ酸配列を示す。配列決定は３７３自動式ＤＮＡシーケンサー（Ａpp lied Ｂiosystems，Ｉnc.）を用いて行った。 図２は、ＲＡＣＥにより新規Ｇ−蛋白質結合レセプター遺伝子の５'および３' 未知配列のクローニングを示す。 発明の詳細な記載 以下の図面は本発明の例示的具体例であり、請求の範囲に包含される本発明の 範囲を制限することを意図とするものではない。 本発明の一態様によれば、図１（配列番号：２）の推定アミノ酸配列を有する 成熟ポリペプチド、またはアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（Ａ merican Ｔype Ｃulture Ｃollection，１２３０１ Ｐarklawn Ｄrive，Ｒockvi lle，Ｍaryland ２０８５２，Ｕ.Ｓ.Ａ.）に１９９６年４月３０日にＡＴＣＣ寄 託番号９８０４０で帰属されるＨＴＬＣＡ３２プラスミドを含有するエシェリヒ ア・コリＸＬ−１ブルーセルとして寄託されているクローンのｃＤＮＡによりコ ードされる成熟ポリペプチドをコードする単離核酸（ポリヌクレオチド）が提供 される。 本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドはヒト脳組織由来のｃＤ ＮＡライブラリーから単離された。これはＧ−蛋白結合レセプター科に構造的に 関連している。これは４０４アミノ酸残基の蛋白質をコードするオープンリーデ ィングフレームを含有する。蛋白質はラットのアドレノメジュリンレセプターに 対して最高の相同性を示し、３７２アミノ酸鎖長にわたって７４％の同一性およ び９４％の類似性を示す。アドレノメジュリン（ＡＭ）は心臓血管機能にて主た る機能を発揮する強力な血管拡張性ペプチドである。その全身性投与は迅速かつ 十分な血圧の低下および肺血流の増加をもたらす。その他の作用は気管支拡張作 用であり、飲酒慣習の阻害剤およびアンジオテンシン誘発のアルドステロン分泌 の阻害剤である。これらすベての機能は、Ｋapastら、The Journal of Biologic al Chemistry，vol．２７０，Ｎo.４３，ｐｐ２５３４４−２５３４７、１９９ ５およびその中に記載されている文献に記載されている。前記した文献を出典明 示により本明細書の一部とする。かくして、本発明のレセプターは、結局、以下 に記載するように、これらのレセプターに結合する種々の疾患および異常を治療 および診断するのに有用である。 本発明のレセプターポリペプチドに対する潜在的リガンドは、アドレノメジュ リン、アミリン、ＣＧＲＰ（カルシトニン遺伝子関連蛋白質）、カルシトニン、 アナンダミド、セロトニン、アドレナリンおよびノルアドレナリン、血小板活性 化因子、トロンビン、Ｃ５ａ、およびブラジキニン、ケモカイン、および血小板 活性化因子を包含するがこれに限定されない。 本発明のポリヌクレオチドはＲＮＡの形態であるかまたはＤＮＡの形態であり 、このＤＮＡは、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡおよび合成ＤＮＡを包含する。ＤＮＡ は二本鎖または一本鎖であり、一本鎖の場合はコーディング鎖または非コーディ ング（アンチセンス）鎖である。成熟ポリペプチドをコードするコーディング配 列は図１（配列番号：１）に示されるコーディング配列または寄託クローンのコ ーディング配列と同一であるか、または異なるコーディング配列であり、このコ ーディング配列は、遺伝子コードの重複または縮重の結果、図１（配列番号：１ ）のＤＮＡと同じ成熟ポリペプチドまたは寄託されたｃＤＮＡをコードする。 図１（配列番号：１）の成熟ポリペプチドまたは寄託されたｃＤＮＡによりコ ードされる成熟ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、成熟ポリペプチ ドに関するコーディング配列のみ；成熟ポリペプチドに関するコーディング配列 （および所望により付加的なコーディング配列）および非コーディング配列、例 えば、イントロンまたは成熟ポリペプチドに関するコーディング配列の非コーデ ィング配列５'および／または３'を有する。 このように、「ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド」なる語は、ポリ ペプチドに対するコーディング配列だけを含むポリヌクレオチド、ならびに付加 的なコーディングおよび／または非コーディング配列を含むポリヌクレオチドを 包含する。 本発明はさらに、図１（配列番号：２）の推定アミノ酸配列を有するポリペプ チドのフラグメント、類似体および誘導体をコードする前記したポリペプチドの 変異型または寄託されたクローンのｃＤＮＡによりコードされるポリペプチドに 関する。ポリヌクレオチドの変異型は、ポリヌクレオチドの天然に存在する対立 変異型または天然に存在しないポリヌクレオチドの変異型である。 かくして、本発明は図１（配列番号：２）に示されるのと同じ成熟ポリペプチ ドまたは寄託されたクローンのｃＤＮＡによりコードされる同一の成熟ポリペプ チドをコードするポリヌクレオチドならびにこのようなポリヌクレオチドの変異 型を包含し、この変異型は図１（配列番号：２）のポリペプチドまたは寄託され たクローンのｃＤＮＡによりコードされるポリペプチドのフラグメント、誘導体 または類似体をコードする。このようなヌクレオチド変異型は欠失変異型、置換 変異型および付加または挿入変異型を包含する。 前記のように、ポリヌクレオチドは、図１（配列番号：２）に示されるコーデ ィング配列または寄託クローンのコーディング配列の天然に存在する対立変異型 であるコーディング配列を有する。当該分野にて知られているように、対立変異 型は、コードされたポリペプチドの機能を実質的に変更しない１またはそれ以上 のヌクレオチドの置換、欠失または付加を有するポリヌクレオチド配列の代替形 態である。 ポリヌクレオチドはまたＴＭおよび本発明の完全長ポリペプチドの細胞内領域 から開裂されたポリペプチドの細胞外部分である本発明の可溶形のレセプターポ リペプチドをコードする。 本発明のポリヌクレオチドはまた本発明のポリペプチドの精製を可能にするマ ーカー配列とフレーム中で融合したコーディング配列を有する。そのマーカー配 列はｐＱＥ−９ベクターにより供給されたヘキサヒスチジンタグであって、細菌 宿主の場合、マーカーと融合した成熟ポリペプチドの精製が可能になるか、また は例えば哺乳動物宿主、例えばＣＯＳ−７細胞を用いた場合、そのマーカー配列 はヘマグルチニン（ＨＡ）タグである。ＨＡタグはインフルエンザヘマグルチニ ン蛋白由来のエピトープに対応する［Ｗilson，I.ら、セル（Ｃell）、３７：７ ６７（１９８４）］。 「遺伝子」なる用語は、ポリペプチド鎖の産生に関与するＤＮＡのセグメント を意味し；コーディング領域の前および後の領域（リーダーおよびトレイラー） ならびに個々のコーディングセグメント（エクソン）間の介在配列（イントロン ）を包含する。 本発明の完全長遺伝子のフラグメントは、完全長遺伝子を単離し、その遺伝子 と高い配列類似性または同様の生物学的活性を有する他の遺伝子を単離するため のｃＤＮＡライブラリーのハイブリダイゼーションプローブとして用いられる。 このタイプのプローブは好ましくは少なくとも２０または３０塩基を有し、例え ば５０またはそれ以上の塩基を含有する。プローブはまた完全長転写物に対応す るｃＤＮＡクローンおよび調節およびプロモーター領域、エクソンおよびイント ロンを含む本発明の完全遺伝子を含有するゲノムクローンまたはクローンを同定 するのにも用いられる。スクリーンの一例として、公知のＤＮＡ配列を用いるこ とにより遺伝子のコーディング領域を単離し、オリゴヌクレオチドプローブを合 成することが挙げられる。本発明の遺伝子配列と相補的な配列を有する標識され たオリゴヌクレオチドを用い、ヒトｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡまたはｍＲＮＡのラ イブラリーをスクリーンしてプローブがハイブリッド形成するライブラリーの構 成因子を決定する。 本発明はさらに、少なくとも７０％、好ましくは少なくとも９０％、より好ま しくは少なくとも９５％の配列間の同一性がある場合、前記した配列とハイブリ ッ ド形成するポリヌクレオチドに関する。本発明は特に厳しい条件下で前記したポ リヌクレオチドとハイブリッド形成するポリヌクレオチドに関する。本明細書に おいて用いる場合、「厳しい条件」なる用語は、配列間に少なくとも９５％、好 ましくは少なくとも９７％の同一性がある場合にのみハイブリッド形成が起こる ことを意味する。好ましい具体例において前記したポリヌクレオチドとハイブリ ッド形成するポリヌクレオチドは、実質的に図１（配列番号：１）のｃＤＮＡま たは寄託されたｃＤＮＡによりコードされる成熟ポリペプチドと同じ生物学的機 能または活性を保持するポリペプチドをコードする。 別法として、ポリヌクレオチドは、前記のように、本発明のポリヌクレオチド とハイブリッド形成し、それと同一性を有し、活性を保持してもまたは保持しな くてもよい少なくとも２０塩基、好ましくは３０塩基、より好ましくは５０塩基 を有してもよい。例えば、かかるポリヌクレオチドは配列番号：１のポリヌクレ オチドについてのプローブとして、例えばポリヌクレオチドの回収のためにまた は診断プローブとしてもしくはＰＣＲプライマーとして用いられる。 このように、本発明は、配列番号：２のポリペプチドをコードするポリヌクレ オチドと少なくとも７０％の同一性、好ましくは少なくとも９０％、より好まし くは少なくとも９５％の同一性を有するポリヌクレオチドならびにそのフラグメ ント（少なくとも２０または３０塩基、好ましくは５０塩基を有する）、かかる ポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドに関する。 本明細書にて用いる寄託菌は、特許手続上の微生物の寄託の国際的承認に関す るブダペスト条約の下に維持されている。これらの寄託菌は当業者の便宜のため のみに提供され、３５Ｕ.Ｓ.Ｃ.§１１２の下で寄託菌が必要とされる承認のた めに提供されるものではない。寄託菌中に含まれるポリヌクレオチドの配列、な らびにこれによりコードされるポリペプチドのアミノ酸配列は、出典明示により 本明細書の一部をなし、本明細書中の配列記載と対立する事象を調節するもので ある。寄託菌の調製、使用または販売には許可が必要で、このような許可は本明 細書で付与されるものではない。 本発明はさらに、図１（配列番号：２）の推定アミノ酸配列を有するかまたは 寄託されたｃＤＮＡによりコードされるアミノ酸配列を有するＧ−蛋白質結合レ セプターポリペプチド、ならびにこのようなポリペプチドのフラグメント、類似 体および誘導体に関する。 図１（配列番号：２）のポリペプチドまたは寄託されたｃＤＮＡによりコード されるポリペプチドに言及する場合、「フラグメント」、「誘導体」および「類 似体」なる用語は、実質的にこのようなポリペプチドと同じ生物学的機能または 活性、すなわちＧ−蛋白質結合レセプターとしての機能を有するか、またはポリ ペプチドはＧ−蛋白質結合レセプター、例えば可溶形のレセプターとして機能し ないが、リガンドまたはレセプターとの結合能を有するポリペプチドを意味する 。類似体は、プロ蛋白質部の開裂により活性化され、活性な成熟ポリペプチドを 産生しうるプロ蛋白質を包含する。 本発明のポリペプチドは、組換えポリペプチド、天然のポリペプチドまたは合 成ポリペプチド、好ましくは組換えポリペプチドである。 図１のポリペプチド（配列番号：２）または寄託されたｃＤＮＡによりコード されるポリペプチドのフラグメント、誘導体または類似体は、（ｉ）１またはそ れ以上のアミノ酸残基が保存または非保存アミノ酸残基（好ましくは保存アミノ 残基）で置換されていて、このような置換アミノ酸残基が遺伝コードによりコー ドされているかまたはコードされていないものであるか、または（ii）１または それ以上のアミノ酸残基が置換基を含むものであるか、または（iii）成熟ポリ ペプチドが他の化合物、例えばポリペプチドの半減期を増加させるような化合物 （例えば、ポリエチレングリコール）と融合しているものであるか、または（iv ）さらに別のアミノ酸が成熟ポリペプチドと融合し、成熟ポリペプチドの精製に 用いられるものであるか、または（ｖ）ポリペプチドのフラグメントが可溶性、 すなわち膜に結合してなく、膜結合レセプターのリガンドに結合しているもので ある。このようなフラグメント、誘導体および類似体は本明細書の教示から当業 者の範囲内にあると考えられる。 本発明のポリペプチドおよびポリヌクレオチドは好ましくは単離された形態で 提供され、好ましくは等質になるよう精製される。 「単離」なる用語は、物質がその最初の環境（例えば、天然に存在する場合に は、自然環境）から取り出されたことを意味する。例えば、生体に天然に存在す るポリヌクレオチドまたはポリペプチドは単離されていないが、その天然系にお ける共存物質の一部または全部から分離された同じポリヌクレオチドまたはポリ ペプチドは単離されている。このようなポリヌクレオチドはベクターの一部とす ることができ、および／またはこのようなポリヌクレオチドまたはポリペプチド は組成物の一部とすることができ、このようなベクターまたは組成物はその天然 環境にないように単離される。 本発明のポリペプチドは、配列番号：２のポリペプチド（特に成熟ポリペプチ ド）ならびに配列番号：２のポリペプチドと少なくとも７０％の類似性（好まし くは少なくとも７０％の同一性）を有するポリペプチド、より好ましくは配列番 号：２のポリペプチドと少なくとも９０％の類似性（好ましくは少なくとも９０ ％の同一性）を有するポリペプチド、さらにより好ましくは配列番号：２のポリ ペプチドと少なくとも９５％の類似性（より好ましくは少なくとも９５％の同一 性）を有するポリペプチドを包含し、またこのようなポリペプチドの部分も包含 し、このようなポリペプチドの部分は一般に少なくとも３０アミノ酸、より好ま しくは少なくとも５０アミノ酸を含有する。 当該分野で知られているように、２つのポリペプチド間の「類似性」は、一方 のポリペプチドのアミノ酸配列およびその保存アミノ酸置換を第二ポリペプチド の配列と比較することにより決定される。 本発明のポリペプチドのフラグメントまたは一部はペプチド合成によって対応 する完全長ポリペプチドの産生に用いられる；したがって、フラグメントは完全 長ポリペプチドを産生するための中間体として用いられる。本発明のポリヌクレ オチドのフラグメントまたは一部を用いて本発明の完全長ポリヌクレオチドを合 成することができる。 本発明はまた本発明のポリヌクレオチドを含むベクター、本発明のベクターを 用いて遺伝子操作される宿主細胞および組換え技術による本発明のポリペプチド の産生に関する。 宿主細胞は、例えばクローニングベクターまたは発現ベクターであってもよい 本発明のベクターで遺伝子操作（形質導入または形質転換またはトランスフェク ション）される。ベクターは、例えぱ、プラスミド、ウイルス粒子、ファージな どの形態であってもよい。遺伝子操作された宿主細胞は、プロモーターの活性化 、形質転換体の選択またはＧ−蛋白質結合レセプター遺伝子の増幅に適するよう に修飾した、通常の栄養培地中で培養できる。温度、ｐＨなどの培養条件は、発 現に関して選択した宿主細胞に関して既に用いられているものであり、当業者に は自明である。 本発明のポリヌクレオチドは組換え技術によるポリペプチドの産生に用いられ る。このように、例えばポリヌクレオチドはポリペプチドの発現のための種々の 発現ベクターのいずれかに含まれる。このようなベクターは、染色体、非染色体 および合成ＤＮＡ配列、例えばＳＶ４０の誘導体；バクテリアプラスミド；ファ ージＤＮＡ；バクロウイルス；酵母プラスミド；プラスミドおよびファージＤＮ Ａ、ワクイニアウイルス、アデノウイルス、家禽ポックスウイルス、および偽狂 犬病などのウイルスＤＮＡの組み合わせ由来のベクターを包含する。しかし、宿 主中で複製可能であり、生存できるならば他のベクターを用いてもよい。 適当なＤＮＡ配列を種々の操作によりベクター中に挿入することができる。一 般に、ＤＮＡ配列は、当該分野で公知の操作により適当な制限エンドヌクレアー ゼ部位中に挿入される。このような操作および他の操作は当業者の範囲内である と考えられる。 発現ベクター中のＤＮＡ配列を、適当な発現調節配列（プロモーター）に操作 可能に結合させて、ｍＲＮＡ合成を行う。このようなプロモーターの代表例とし て、ＬＴＲまたはＳＶ４０プロモーター、イー・コリｌａｃまたはｔｒｐ、ファ ージラムダＰ_Lプロモーターおよび原核または真核細胞またはそのウイルス中の 遺伝子発現を調節することが知られている他のプロモーターが挙げられる。発現 ベクターはまた、翻訳開始のリボソーム結合部位および転写ターミネーターを含 む。ベクターは、発現の増幅に適当な配列も有する。 加えて、発現ベクターは、好ましくは、真核細胞培養についてジヒドロ葉酸還 元酵素またはネオマイシン耐性、あるいはイー・コリにおけるテトラサイクリン またはアンピシリン耐性などの形質転換された宿主細胞の選択のための表現型特 性をもたらすような１またはそれ以上の選択可能なマーカー遺伝子を有する。 前記した適当なＤＮＡ配列、ならびに適当なプロモーターまたは調節配列を有 するベクターを用い、適当な宿主を形質転換させ、宿主が蛋白質を発現させるよ うにしてもよい。 適当な宿主の代表例として、イー・コリ、ストレプトマイセス、サルモネラ・ チフィムリウムなどの細菌細胞；酵母細胞などの真菌細胞；ショウジョウバエＳ ２およびシロナヨトウＳｆ９細胞などの昆虫細胞；ＣＨＯ、ＣＯＳまたはＢowes 黒色腫細胞などの動物細胞；アデノウイルス；および植物細胞等が挙げられる。 適当な宿主の選択は、本明細書の教示から当業者の範囲内にあると考えられる。 特に、本発明はすでに広範囲にわたり記載したような１またはそれ以上の配列 を有してなる組換え構築物も包含する。構築物は、本発明の配列が正または逆の 向きでその中に挿入される、プラスミドまたはウイルスベクターなどのベクター を有してなる。この具体例の好ましい態様において、構築物はさらに、例えば配 列に操作可能に結合したプロモーターを含む調節配列を有してなる。多数の適当 なベクターおよびプロモーターが当業界で公知であり、商業的に入手可能である 。以下のベクターを例示のために挙げる。細菌性：ｐＱＥ７０、ｐＱＥ６０、ｐ ＱＥ−９（Ｑiagen）、ｐｂｓ、ｐＤ１０、ファージスクリプト、ｐｓｉＸ１７ ４、pbluescript ＳＫ、pbsks、ｐＮＨ８Ａ、ｐＮＨ１６ａ、ｐＮＨ１８Ａ、ｐ ＮＨ４６Ａ（Ｓtratagene）；ｐＴＲＣ９９ａ、ｐＫＫ２２３−３、ｐＫＫ２３ ３−３、ｐＤＲ５４０、ｐＲＩＴ５（Ｐharmacia）。真核細胞性：ｐＷＬＮＥＯ 、ｐＳＶ２ＣＡＴ、ｐＯＧ４４、ｐＸＴ１、ｐＳＧ（Ｓtratagene）ｐＳＶＫ３ 、ｐＢＰＶ、ｐＭＳＧ、ｐＳＶＬ（Ｐharmacia）。しかし、他のプラスミドまた はベクターも宿主中で複製可能で、生存可能ならば用いることができる。 プロモーター領域はＣＡＴ（クロラムフェニコールトランスフェラーゼ）ベク ターまたは選択可能なマーカーを有する他のベクターを用いていずれか望ましい 遺伝子から選択できる。２つの適当なベクターはｐＫＫ２３２−８およびｐＣＭ ７である。特に例示する細菌プロモーターは、ｌａｃＩ、ｌａｃＺ、Ｔ３、Ｔ７ 、ｇｐｔ、ラムダＰ_R、Ｐ_Lおよびｔｒｐを包含する。真核細胞プロモーターはＣ ＭＶ即時型、ＨＳＶチミジンキナーゼ、初期および後期ＳＶ４０、レトロウイル ス由来のＬＴＲ、およびマウスメタロチオネイン−Ｉを包含する。適当なベクタ ーおよびプロモーターの選択は、当業者のレベル内にある。 さらに別の具体例において、本発明は前記の構築物を含有する宿主細胞に関す る。宿主細胞は、哺乳動物細胞などのより高等な真核細胞、または酵母細胞など のより低級な真核細胞、あるいは宿主細胞は細菌細胞などの原核細胞とすること ができる。構築物の宿主細胞への導入は、リン酸カルシウムトランスフェクショ ン、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介トランスフェクション、またはエレクトロポレ ーションにより行うことができる［Ｄavis,L.，Ｄibner,M.，Ｂattey,I.、ベー シック・メソッズ・イン・モレキュラ・バイオロジー（Ｂasic Ｍethods in Ｍo lecular Ｂiology），（１９８６）］。 宿主細胞の構築物を常法にて用い、組換え体配列によりコードされる遺伝子産 物を産生することができる。別法として、本発明のポリペプチドは通常のペプチ ド合成器により合成できる。 成熟蛋白質は、哺乳動物細胞、酵母、細菌または他の細胞において適当なプロ モーターの調節下で発現させることができる。さらに、無細胞翻訳系を使用して 、本発明のＤＮＡ構築物由来のＲＮＡを用いてこのような蛋白質を産生すること ができる。原核および真核宿主について用いられる適当なクローニングおよび発 現ベクターは、Ｓambrookら、モレキュラ・クローニング：ア・ラボラトリー・ マニュアル（Ｍolecular Ｃloning：Ａ Ｌaboratory Ｍanual）、第２版、Ｃold Ｓpring Ｈarbor，Ｎ.Ｙ.（１９８９）に記載されており、その開示を出典明示 により本発明の一部とする。 高等な真核細胞による本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡの転写は、エ ンハンサー配列をベクター中に挿入することによって増加する。エンハンサーは ＤＮＡシス−作用エレメントで、通常約１０ないし３００ｂｐの、プロモーター に作用してその転写を増加させるものである。例えば、複製開始点ｂｐ１００な いし２７０の後側のＳＶ４０エンハンサー、サイトメガロウイルス初期プロモー ターエンハンサー、複製開始点の後側のポリオーマエンハンサーおよびアデノウ イルスエンハンサーが挙げられる。 一般に、組換え発現ベクターは、複製の開始点および宿主細胞の形質転換を可 能にする選択可能なマーカー、例えばイー・コリのアンピシリン耐性遺伝子およ びエス・セレビシエＴＲＰ１遺伝子、ならびに高度に発現された遺伝子由来のプ ロモーターを有して、下流の構造配列の転写を行う。このようなプロモーターは 、とりわけ、３−ホスホグリセレートキナーゼ（ＰＧＫ）、ａ−ファクター、酸 ホスファターゼ、または熱ショック蛋白質などの解糖酵素をコードするオペロン から誘導できる。異種構造配列は、翻訳開始および終止配列を有する適当な相に て組み立てられる。所望により、異種配列は、望ましい特性を付与する、例えば 発現された組換え産物の安定化または簡素化精製をもたらすＮ−末端同定ペプチ ドを含む融合蛋白質をコードできる。 細菌を使用する場合の有用な発現ベクターは、望ましい蛋白質をコードする構 造ＤＮＡ配列を適当な翻訳開始および終止シグナルと共に機能性プロモーターを 有する操作可能な解読相中に挿入することにより構築される。ベクターはベクタ ーの維持を確実にし、望ましいならば宿主内での増幅をもたらすような１または それ以上の表現型選択マーカーおよび複製開始点を有してなるであろう。形質転 換に適当な原核宿主はイー・コリ、バチルス・サチリス、サルモネラ・チフィム リウムおよび種々のシュードモナス、ストレプトマイセスおよびスタフィロコッ カス属に含まれる種を包含するが、選択の問題として他のものを利用してもよい 。 限定するものではないが、代表例として、細菌を用いる場合の有用な発現ベク ターは、選択マーカーおよび周知のクローニングベクターｐＢＲ３２２（ＡＴＣ Ｃ３７０１７）の遺伝要素を有してなる市販のプラスミドに由来する複製の細菌 開始点を有することができる。このような市販のベクターとして、例えばｐＫＫ ２２３−３（ファーマシア・ファイン・ケミカルズ）およびＧＥＭ１（プロメガ ・ バイオテック）が挙げられる。これらのｐＢＲ３２２「主鎖」セクションが、適 当なプロモーターおよび発現される構造配列と結合する。 適当な宿主株を形質転換させ、宿主株を適当な細胞濃度にまで増殖させた後、 選択されたプロモーターを適当な手段（例えば、温度シフトまたは化学誘導）に より誘発させ、細胞をさらに一定期間培養する。 細胞は典型的には遠心分離により収穫し、物理的または化学的手段により破砕 し、さらに精製するために得られた粗抽出物を保存する。 蛋白質の発現に用いた微生物細胞は、凍結−解凍サイクル、超音波処理、機械 的破壊、または細胞溶解剤の使用を含むいずれか都合のよい方法で破壊でき、こ のような方法は当業者には周知である。 種々の哺乳動物細胞培養系もまた、組換え蛋白質を発現させるのに用いること ができる。哺乳動物発現系の例は、Ｇluzman、セル（Ｃell）、２３：１７５（ １９８１）に記載されているサル腎臓線維芽細胞のＣＯＳ−７ライン、および適 合性ベクターの発現能を有する他のセルライン、例えば、Ｃ１２７，３Ｔ３，Ｃ ＨＯＨＳ２９３、ＨｅＬａおよびＢＨＫセルラインを包含する。哺乳動物発現ベ クターは、複製開始点、適当なプロモーターおよびエンハンサー、ならびに必要 なリボソーム結合部位、ポリアデニル化部位、スプライスドナーおよびアクセプ ター部位、転写終止配列および５'フランキング非転写配列を有してなるであろ う。ＳＶ４０スプライス由来のＤＮＡ配列およびポリアデニル化部位を用いて所 望の非転写遺伝要素を得る。 本発明のＧ−蛋白質結合レセプターポリペプチドは硫酸アンモニウムまたはエ タノール沈降、酸抽出、アニオンまたはカチオン交換クロマトグラフィー、ホス ホセルロースクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、アフィ ニティークロマトグラフィー、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィーおよ びレクチンクロマトグラフィーを包含する方法により、組換え細胞から回収およ び精製できる。成熟蛋白質の配置を完成するにおいて、必要ならば、蛋白質再生 工程を用いることができる。最終的に、高性能液体クロマトグラフィー（ＨＰＬ Ｃ）を最終精製段階に用いることができる。 本発明のポリペプチドは天然に精製された産物、または化学合成法の産物であ るか、または原核または真核宿主（例えば、培地中の細菌、酵母、高等植物、昆 虫および哺乳物細胞）から組換え技術により産生されてもよい。組換え体製造法 において用いた宿主に応じて、本発明のポリペプチドをグリコシル化してもよく 、またはグリコシル化しなくてもよい。本発明のポリペプチドはまた初めのメチ オニンアミノ酸残基を有していてもよい。 本発明のＧ−蛋白結合レセプターは、本発明のレセプターポリペプチドを活性 化する（アゴニスト）かまたは活性化を抑制する（アンタゴニスト）化合物のス クリーニング法に用いられる。 一般に、このようなスクリーニング法は、本発明のレセプターポリペプチドを その表面に発現する適当な細胞を提供することを包含する。このような細胞は、 哺乳動物、酵母、ショウジョウバエまたはイー・コリ由来の細胞を包含する。特 に、本発明のレセプターをコードするポリヌクレオチドを用いて細胞をトランス フェクションさせ、それによりＧ−蛋白質結合レセプターを発現させる。ついで 、発現したレセプターを試験化合物と接触させて、結合、刺激または機能的応答 の抑制を観察する。 このようなスクリーニング法の一つは、トランスフェクションさせて本発明の Ｇ−蛋白質結合レセプターを発現するメラニン保有細胞の使用を包含する。この ようなスクリーニング技術は、ＰＣＴ ＷＯ９２／０１８１０（１９９２年２月 ６日公開）に記載されている。 かくして、例えば、かかる方法は、レセプターをコードするメラニン保有細胞 細胞をレセプターリガンドおよびスクリーンされる化合物の両方と接触させるこ とにより本発明のレセプターポリペプチドの活性化を抑制する化合物のスクリー ニングに用いることができる。リガンドによる生じたシグナルの抑制は、化合物 がレセプターの潜在的アンタゴニストであること、すなわち、レセプターの活性 化を阻害することを示す。 スクリーンは、このような細胞とスクリーンされる化合物を接触させ、かかる 化合物がシグナルを発生する、すなわち、レセプターを活性化するかどうかを測 定することにより、レセプターを活性化する化合物を決定するのに用いることが できる。 別のスクリーニング技術は、例えばサイエンス（Ｓcience）、第２４６巻、１ ８１−２９６ページ（１９８９年１０月）に記載されているようなレセプター活 性化により起こる、細胞外pＨ変化を測定する系におけるＧ−蛋白質結合レセプ ターを発現する細胞（例えば、トランスフェクションされたＣＨＯ細胞）の使用 を包含する。例えば、化合物を本発明のレセプターポリペプチドを発現する細胞 と接触させ、第二のメッセンジャー応答、例えばシグナル導入またはｐＨ変化を 測定して、潜在的化合物がレセプターを活性化するかまたは阻害するかを決定す る。 別のこのようなスクリーニング技術は、Ｇ−蛋白質結合レセプターをコードす るＲＮＡをツメガエル嚢胞体中に導入して一時的にレセプターを発現させること からなる。ついで、レセプター嚢胞体をレセプターリガンドおよびスクリーンさ れる化合物と接触させ、続いてレセプターの活性化を阻害すると考えられる化合 物のスクリーニングの場合には、カルシウムシグナルの阻害または活性化の検出 を行う。 他のスクリーニング技術は、レセプターがホスホリパーゼＣまたはＤと結合す るＧ−蛋白質結合レセプターを発現させることからなる。このような細胞の代表 例として、内皮細胞、平滑筋細胞、胚腎臓細胞などが挙げられる。スクリーニン グは前記のようにレセプターの活性化の検出またはホスホリパーゼの第２シグナ ルからのレセプターの阻害または活性化の検出により行う。 他の方法は、標識されたリガンドが細胞表面にレセプターを有する細胞と結合 することの阻害を測定することにより本発明のアンタゴニストのレセプターポリ ペプチドの活性化を阻害する化合物をスクリーニングすることからなる。このよ うな方法は、細胞がその表面上でレセプターを発現するように真核細胞をＧ−蛋 白質結合レセプターをコードするＤＮＡでトランスフェクションし、細胞を標識 された形態の公知リガンドの存在下で化合物と接触させることからなる。リガン ドは、例えば放射能により標識できる。レセプターと結合した標識されたリガン ドの量を、例えばレセプターの放射能を測定することにより測定する。レセプタ ーと結合する標識されたリガンドの減少により確認されるように化合物がレセプ ターと結合する場合、標識されたリガンドのレセプターとの結合は阻害される。 Ｇ−蛋白質結合レセプターは哺乳動物宿主において偏在し、多くの病理を含む 多くの生物学的機能に関与している。したがって、一方でＧ−蛋白質結合レセプ ターを刺激し、他方でＧ−蛋白質結合レセプターの機能を阻害しうる化合物およ び薬物を見つけることが望ましい。 例えば、Ｇ−蛋白質結合レセプターを活性化する化合物を治療目的、例えば喘 息、パーキンソン病、急性心不全、尿停留、および骨粗しょう症の治療に用いる ことができる。特に、本発明のレセプターを活性化する化合物は、肺血流の不足 により引き起こされるような種々の心臓血管の病気または高血圧を治療するのに 有用である。加えて、これらの化合物はまた、流体または電解質のホメオスタシ スの異常制御に関連する種々の生理学的障害およびアンジオテンシン誘発の異常 なアルドステロン分泌に伴う疾患を治療するにおいても有用である。 一般に、Ｇ−蛋白質結合レセプターの活性化を阻害する化合物を種々の治療目 的、例えば、とりわけ、低血圧および／または高血圧、狭心症、心筋梗塞、潰瘍 、喘息、アレルギー、良性前立腺肥大および分裂症、躁病興奮、鬱病、譫妄、痴 呆または重度の精神薄弱を含む精神病的および神経学的障害、ハンチントン病ま たはジルドラトゥーレット症候群などの運動異常に用いられる。Ｇ−蛋白質結合 レセプターを阻害する化合物はまた内因的食欲不振の反転および病的飢餓の調整 に有用である。特に、本発明のレセプターの活性化を阻害する化合物は、肺血流 の過剰により引き起こされるような種々の心臓血管の病気または低血圧を治療す るのに有用である。加えて、これらの化合物はまた、流体または電解質のホメオ スタシスの異常制御に関連する種々の生理学的障害およびアンジオテンシン誘発 の異常なアルドステロン分泌に伴う疾患を治療するにおいても有用である。 抗体は本発明のＧ−蛋白質結合レセプター、または場合によっては、Ｇ−蛋白 質結合レセプターと結合するが、第二のメッセンジャー応答を惹起せず、Ｇ−蛋 白質結合レセプターの活性が防止されるようなオリゴペプチドを拮抗するかもし れない。抗体は、抗体の抗原結合部位と一般に結合する独自の決定因子を認識す る抗イディオタイプ抗体を包含する。潜在的アンタゴニスト化合物はまた、生物 学的機能を失った、Ｇ−蛋白質結合レセプターと結合した場合に応答を惹起しな いＧ−蛋白質結合レセプターのリガンド、すなわちリガンドのフラグメントと密 接に関連する蛋白質も包含する。 アンチセンス技術の使用により調製されるアンチセンス構築物は、三重螺旋形 成またはアンチセンスＤＮＡまたはＲＮＡにより遺伝子発現を調節するのに用い られ、この方法は共にポリヌクレオチドのＤＮＡまたはＲＮＡへの結合に基づく 。例えば、本発明の成熟ポリペプチドをコードする、ポリヌクレオチド配列の５ 'コーディング部は約１０ないし４０塩基対の長さのアンチセンスＲＮＡオリゴ ヌクレオチドを設計するのに用いられる。ＤＮＡオリゴヌクレオチドは、転写に 関与する遺伝子の領域に相補的にあるように設計され［三重螺旋−Ｌeeら、ニュ ークレイック・アシッズ・リサーチ（Ｎucl.Ａcids Ｒes.）、６：３０７３（１ ９７９）；Ｃooneyら、サイエンス（Ｓcience）、２４１：４５６（１９８８） ；およびＤervanら、サイエンス（Ｓcience）、２５１：１３６０（１９９１） を参照のこと］、これによりＧ−蛋白質結合レセプターの転写および産生を防止 する。アンチセンスＲＮＡオリゴヌクレオチドは、in vivoでｍＲＮＡとハイブ リッド形成し、ｍＲＮＡ分子のＧ−蛋白質結合レセプター中への翻訳を遮断する ［アンチセンス−Ｏkano、ジャーナル・オブ・ニューロケミストリー(Ｊ.Ｎeuroch em.)、５６：５６０（１９９１）；オリゴデオキシヌクレオタイズ・アズ・アン チセンス・インヒビターズ・オブ・ジーン・エクスプレッション（Ｏligodeoxyn ucleotides as Ａntisense Ｉnhibitors of Ｇene Ｅxpression，ＣＲＣ Ｐress ，Ｂoca Ｒaton，ＦＬ）（１９８８）］。前記オリゴヌクレオチドはまた、アン チセンスＲＮＡまたはＤＮＡがin vivoにて発現され、Ｇ−蛋白質結合レセプタ ーの産生を阻害するように、細胞にデリバリーすることもできる。 Ｇ−蛋白質結合レセプターと結合してリガンドと接近しにくくなるようにして 正常な生物学的活性を防止する小分子、例えば小ペプチドまたはペプチド様分子 も本発明のレセプターポリペプチドの活性化を阻害するのに用いることができる 。 可溶性形態のＧ−蛋白質結合レセプター、例えばレセプターのフラグメントを 、本発明のポリペプチドについてのリガンドと結合させ、リガンドが膜結合Ｇ− 蛋白質結合レセプターと相互作用するのを防止することによりレセプターの活性 化の阻害に用いることができる。 本発明はさらに過剰のＧ−蛋白質結合レセプター活性と関連した異常な症状の 治療法であって、対象に前記した阻害化合物を医薬上許容される担体と共に、リ ガンドのＧ−蛋白質結合レセプターとの結合を遮断することによるかまたは第二 のシグナルを阻害することにより活性化を阻害するのに有効な量で投与し、それ により異常な症状を軽減することからなる方法を提供する。 本発明はまたＧ−蛋白質結合レセプター活性の発現不足と関連した異常な症状 の治療法であって、対象に治療上有効量の前記した本発明のレセプターポリペプ チドを活性化する化合物を医薬上許容される担体と共に投与して、異常な症状を 軽減することからなる方法も提供する。 可溶形のＧ−蛋白質結合レセプター、およびこのようなレセプターを活性化ま たは抑制する化合物を適当な医薬担体と組み合わせて用いてもよい。このような 組成物は治療上有効量のポリペプチドまたは化合物と医薬上許容される担体また は賦形剤とを含んでなる。このような担体は、食塩水、緩衝食塩水、デキストロ ース、水、グリセロール、エタノールおよびその組み合わせを包含するが、これ に限定されない。処方は投与方法に適合するものでなければならない。 本発明はまた、１またはそれ以上の本発明の医薬組成物の成分を充填した１ま たはそれ以上の容器からなる医薬パックまたはキットを提供する。このような容 器と合わせて、医薬または生物学的製品の製造、使用または販売を規制する政府 機関により規定された形態の注意書であって、政府機関により、ヒト投与につい ての製造、使用または販売が承認されたことを反映する注意書を添付できる。 加えて、医薬組成物は他の治療化合物と組み合わせて用いてもよい。 本明細書に記載された医薬組成物は、局所、静脈内、腹腔内、筋肉内、皮下、 鼻腔内または皮内経路によるなど通常の方法で投与される。医薬組成物は、特定 の適応症の治療および／または予防に有効な量で投与される。一般に、医薬組成 物は、少なくとも１０μｇ／体重ｋｇの量で投与され、ほとんどの場合、一日当 たり約８ｍｇ／体重ｋｇを超えない量で投与される。ほとんどの場合、用量は、 投与経路、症状などを考慮して毎日約１０μｇ／体重ｋｇないし約１ｍｇ／体重 ｋｇである。 Ｇ−蛋白質結合レセプターポリペプチド、およびこのようなポリペプチドを活 性化または抑制する化合物はまた、このようなポリペプチドをin vivoで発現す ること（「遺伝子治療」と称することが多い）により本発明にしたがって用いら れる化合物である。 このように、例えば、患者からの細胞をex vivoでポリペプチドをコードする ポリヌクレオチド（ＤＮＡまたはＲＮＡ）で処理し、ついでその処理した細胞を ポリペプチドで治療する患者に提供する。このような方法は当業界で周知である 。例えば、当業界で公知の手順により、本発明のポリペプチドをコードするＲＮ Ａを含有するレトロウイルス粒子の使用により細胞を処理する。 同様に、細胞をin vivoでのポリペプチドの発現に関して、例えば当該分野で 公知の手順によりin vivoで処理する。当該分野で公知のように、本発明のポリ ペプチドをコードするＲＮＡを含有するレトロウイルス粒子産生用プロデューサ ー細胞を、in vivoでの細胞処理およびin vivoでのポリペプチドの発現のために 患者に投与する。このような方法によるこれらおよび他の本発明のポリペプチド の投与法は本発明の示唆により当業者には明らかである。例えば、細胞処理のた めの発現ビヒクルは、レトロウイルス以外、例えばアデノウイルスを、これは適 当なデリバリービヒクルと組み合わせた後、in vivoでの細胞処理に用いる。 前記したレトロウイルスベクターの由来するレトロウイルスは、モロニーネズ ミ白血病ウイルス、脾臓壊死ウイルス、ラウス肉腫ウイルスなどのレトロウイル ス、ハーベイ肉腫ウイルス、ニワトリ白血症ウイルス、テナガザル白血病ウイル ス、ヒト免疫不全ウイルス、アデノウイルス、骨髄増殖性肉腫ウイルスおよび乳 房腫瘍ウイルスを包含するが、これに限定されない。一例において、レトロウイ ルスプラスミドベクターはモロニーネズミ白血病ウイルスに由来する。 ベクターは１またはそれ以上のプロモーターを含む。用いられる適当なプロモ ーターは、レトロウイルスＬＴＲ；ＳＶ４０プロモーター；およびＭillerら、 バイオテクニクス（Ｂiotechniques）、第７巻、Ｎｏ.９，９８０−９９０（１ ９８９）に記載されているヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、 または他のプロモーター（例えば、ヒストン、ｐｏｌ ＩＩＩおよびｂ−アクチ ンプロモーターを包含するがこれに限定されない真核細胞プロモーターなどの細 胞プロモーター）を包含するが、これに限定されない。用いられる他のウイルス プロモーターは、アデノウイルスプロモーター、チミジンキナーゼ（ＴＫ）プロ モーターおよびＢ１９パルボウイルスプロモーターを包含するが、これに限定さ れない。適当なプロモーターの選択は、本明細書の教示から当業者には自明であ る。 本発明のポリペプチドをコードする核酸配列は、適当なプロモーターの制御下 にある。用いられる適当なプロモーターは、アデノウイルス主後期プロモーター などのアデノウイルスプロモーター；またはサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プ ロモーターなどの異種プロモーター；呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）プロモー ター；ＭＭＴプロモーター、メチタルチオネインプロモーターなどの誘導プロモ ーター；熱ショックプロモーター；アルブミンプロモーター；ＡｐｏＡＩプロモ ーター；ヒトグロビンプロモーター；単純ヘルペスチミジンキナーゼプロモータ ーなどのウイルスチミジンキナーゼプロモーター；レトロウイルスＬＴＲ（前記 の修飾レトロウイルスＬＴＲを包含する）；ｂ−アクチンプロモーター；および ヒト成長ホルモンプロモーターを包含するが、これに限定されない。プロモータ ーはポリペプチドをコードする遺伝子を制御する固有のプロモーターであっても よい。 レトロウイルスプラスミドベクターを用いてパッケージングセルラインを形質 導入し、プロデューサーセルラインを形成する。トランスフェクションされるパ ッ ケージング細胞の例は、ＰＥ５０１、ＰＡ３１７、ｙ−２、ｙ−ＡＭ、ＰＡ１２ 、Ｔ１９−１４Ｘ、ＶＴ−１９−１７−Ｈ２、ｙＣＲＥ、ｙＣＲＩＰ、ＧＰ＋Ｅ −８６、ＧＰ＋ｅｎｖＡｍ１２、およびＭiller、ヒューマン・ジーン・セラピ ー（Ｈuman Ｇene Ｔherapy）、第１巻、５−１４ページ（１９９０）（全体を 出典明示により本発明の一部とする）に記載されているＤＡＮセルラインを包含 するが、これに限定されない。ベクターはパッケージング細胞を当業界で公知の 手段により形質導入する。このような手段は、エレクトポレーション、リポソー ムの使用、およびＣaＰＯ₄沈降を包含するが、これに限定されない。別法として 、レトロウイルスプラスミドをリポソーム中に封入するか、または脂質と結合さ せ、宿主に投与してもよい。 プロデューサーセルラィンは、ポリペプチドをコードする核酸配列を含む感染 性レトロウイルスベクター粒子を生成する。ついで、このようなレトロウイルス ベクター粒子を用いて、真核細胞をin vitroまたはin vivoのいずれかで形質導 入してもよい。導入された真核細胞はポリペプチドをコードする核酸配列を発現 するであろう。導入される真核細胞は胚幹細胞、胎生期癌細胞、ならびに造血幹 細胞、肝細胞、線維芽細胞、筋芽細胞、ケラチノサイト、内皮細胞、気管支上皮 細胞を包含するが、これに限定されない。 本発明はまた、本発明のＧ−蛋白質結合レセプターと結合する能力を有するこ とが知られていないリガンドがこのようなレセプターと結合できるかどうかを決 定する方法であって、Ｇ−蛋白質結合レセプターを発現する哺乳動物細胞をリガ ンドと、リガンドがＧ−蛋白質結合レセプターと結合できるような条件下で接触 させ、レセプターと結合するリガンドの存在を検出し、これによりリガンドがＧ −蛋白質結合レセプターと結合するかどうかを決定することからなる方法を提供 する。 本発明はさらに、本発明のヒトＧ−蛋白質結合レセプターと細胞表面で特異的 に相互作用し、結合する薬物を同定するための薬物のスクリーニング法であって 、Ｇ−蛋白質結合レセプターをコードする単離ＤＮＡ分子を有してなる哺乳動物 細胞を複数の薬物と接触させ、哺乳動物細胞と結合する薬物を決定し、これによ り、 本発明のヒトＧ−蛋白質結合レセプターと特異的に相互作用し、結合する試薬を 同定する方法を提供する。ついで、かかる薬物を治療的に用いて、本発明のレセ プターを活性化するか活性化を阻害する。 本発明はまた、細胞の表面上でのＧ−蛋白質結合レセプターの発現を、Ｇ−蛋 白質結合レセプターをコードするｍＲＮＡの存在の検出により行う方法であって 、細胞から全ｍＲＮＡを得、このようにして得られたｍＲＮＡをハイブリッド形 成条件下でヒトＧ−蛋白質結合レセプターをコードする核酸分子の配列内に含ま れる配列と特異的にハイブリッド形成できる本発明の核酸プローブと接触させ、 プローブとハイブリッド形成したｍＲＮＡの存在を検出し、これにより細胞によ るＧ−蛋白質結合レセプターの発現を検出する方法を提供する。 本発明はまた、本発明のレセプターポリペプチドをコードする核酸配列におけ る突然変異の存在に関連する疾患および異常または疾患および異常に対する感受 性を検出する診断法の一部としてのＧ−蛋白質結合レセプター遺伝子の使用に関 する。このような疾患は、例えば細胞の形質転換に関連し、例えば腫瘍および癌 および高および低血圧を含む種々の心臓血管障害、および異常な血流および異常 なアンジオテンシン誘発のアルドステロン分泌および他に流体および電解質のホ メオスタシスの異常制御により生じる疾患である。 ヒトＧ−蛋白質結合レセプター遺伝子中に突然変異を有する個体を種々の技術 によりＤＮＡレベルで検出することができる。診断用核酸を血液、尿、唾液、組 織生検および剖検物質などの患者の細胞から得る。ゲノムＤＮＡを検出に直接用 いるか、またはＰＣＲを用いて分析前に酵素的に増幅してもよい［Ｓaikiら、ネ イチャー（Ｎature）、３２４：１６３−１６６（１９８６）］。ＲＮＡまたは ｃＤＮＡを同様の目的に用いてもよい。一例として、Ｇ−蛋白質結合レセプター 蛋白質をコードする核酸と相補的なＰＣＲプライマーを用いて、Ｇ−蛋白質結合 レセプター突然変異を同定し、分析することができる。例えば、欠失および挿入 は、正常な遺伝子型と比較して、増幅された産物の大きさの変化により検出でき る。点突然変異は、増幅されたＤＮＡを放射標識したＧ−蛋白質結合レセプター ＲＮＡと、また放射標識したＧ−蛋白質結合レセプターアンチセンスＤＮＡ配列 とハイブリッド形成させることにより同定できる。完全に一致した配列はＲＮas eＡ消化によるかまたは融点の違いにより一致しないものから区別できる。 参考遺伝子と突然変異を有する遺伝子間の配列の違いは、直接ＤＮＡ配列決定 法により明らかにされる。加えて、クローン化されたＤＮＡセグメントを特異的 ＤＮＡセグメントを検出するためのプローブとして用いてもよい。この方法の感 度は、ＰＣＲと組み合わせた場合に非常に向上する。例えば、配列決定プライマ ーを二本鎖ＰＣＲ産物または修飾ＰＣＲにより得られた一本鎖鋳型分子と共に用 いる。配列決定は、放射標識したヌクレオチドを用いた常法によるかまたは蛍光 タグを用いた自動配列決定法により行う。 ＤＮＡ配列の違いに基づく遺伝的試験は、変性剤を含むかまたは含まないゲル 中のＤＮＡフラグメントの電気泳動移動度の変化を検出することにより達成され る。小さな配列の欠失および挿入は、高分割ゲル電気泳動法により視覚化できる 。異なる配列のＤＮＡフラグメントは、異なるＤＮＡフラグメントの移動度がゲ ル中の異なる位置でその比融点または部分融解温度にしたがって妨害される変性 ホルムアミド勾配ゲル上で区別される［例えば、Ｍyersら、サイエンス（Ｓcien ce）、２３０：１２４２（１９８５）を参照のこと］。 特定の位置での配列の変化は、ヌクレアーゼ保護分析、例えばＲＮaseおよび Ｓ１保護または化学的開裂法により明らかにされる［例えば、Ｃottonら、ＰＮ ＡＳ、ＵＳＡ、８５：４３９７−４４０１（１９８５）を参照のこと］。 このように、特定のＤＮＡ配列の検出は、ハイブリッド形成、ＲＮase保護、 化学的開裂、直接ＤＮＡ配列決定または制限酵素の使用［例えば、レストレクシ ョン・フラグメント・レングス・ポリモルフィズム（ＲＦＬＰ）］およびゲノム ＤＮＡのサザンブロッティングにより達成される。 より一般的なゲル電気泳動およびＤＮＡ配列決定に加えて、突然変異もまたin situ分析により検出できる。 本発明はまた種々の組織における本発明のレセプターポリペプチドの可溶形の レベルの変化を検出する診断法に関する。宿主由来のサンプル中の可溶性レセプ ターポリペプチドのレベルの検出に用いる検定は、当業者には周知であり、放射 線免疫検定、競合性結合検定、ウェスタンブロット分析および好ましくはＥＬＩ ＳＡ検定を包含する。 ＥＬＩＳＡ検定は、まずレセプターポリペプチドの抗原に特異的な抗体、好ま しくはモノクローナル抗体を調製することからなる。加えて、レセプター抗体を モノクローナル抗体に対して調製する。レセプター抗体に、検出可能な試薬、例 えば放射能、蛍光またはこの例ではホースラディッシュペルオキシダーゼ酵素を 結合させる。サンプルを宿主から取り出し、サンプル中の蛋白質と結合する固体 支持体、例えばポリスチレン皿上でインキュベートする。ついで、皿上のいずれ のフリーな蛋白質結合部位もウシ血清アルブミンなどの非特異的蛋白質と一緒に インキュベートすることによりカバーする。次に、モノクローナル抗体を皿中で インキュベートし、その間にモノクローナル抗体がそのポリスチレン皿に結合し た本発明のレセプターポリペプチドに結合する。すベての未結合モノクローナル 抗体を緩衝液で洗い出す。ホースラディッシュペルオキシダーゼに結合したレセ プター抗体を皿に入れ、その結果レセプター抗体がレセプター蛋白質と結合した モノクローナル抗体と結合する。ついで、未結合レポーター抗体を洗い流す。つ いで、ペルオキシダーゼ基質を皿に加え、所定の時間内に発色した量が標準曲線 と比較した場合に、患者サンプルの所定の体積中に存在するレセプター蛋白質の 量の尺度である。 本発明の配列はまた、染色体同定についても重要である。配列を特異的に標的 とし、個々のヒト染色体上の特定の位置でハイブリッド形成できる。さらに、染 色体上の特定位置を同定する必要がある。実際の配列データ（繰り返し多形性） に基づく染色体マーキング試薬は、現在のところ、染色体位置のマーキングにつ いてはほとんど利用不可能である。本発明によるＤＮＡの染色体についてのマッ ピングは、これらの配列を疾患に関連する遺伝子と相関させる重要な第一段階で ある。 簡単にいうと、配列は、ｃＤＮＡからＰＣＲプライマー（好ましくは１５−２ ５ｂｐ）を調製することにより染色体にマッピングすることができる。３’非翻 訳領域のコンピューター分析を用い、増幅工程を複雑にする、ゲノムＤＮＡにお いて１以上のエクソンに及ばないプライマーを迅速に選択する。これらのプライ マーを次に個々のヒト染色体を含有する細胞ハイブリッドのＰＣＲスクリーニン グに用いる。プライマーに対応するヒト遺伝子を含有するハイブリッドのみが増 幅フラグメントを産生する。 体細胞ハイブリッドのＰＣＲマッピングは特定のＤＮＡを特定の染色体につい て指定する迅速な方法である。本発明に同じオリゴヌクレオチドプライマーを用 いて、サブローカライゼーションを特定の染色体からのフラグメントのパネルま たはラージゲノムクローンのプールに関して同様に達成できる。同様にその染色 体のマッピングに用いることができる他のマッピング法はin situ雑種形成、標 識したフローソーテッド染色体を用いたプレスクリーニングおよび染色体特異性 ｃＤＮＡライブラリーを構築するための雑種形成によるプレセレクションを包含 する。 ｃＤＮＡクローンの分裂中期染色体範囲への蛍光in situ雑種形成（ＦＩＳＨ ）を用いて一段階にて正確な染色体位置を得ることができる。この技術は５０ま たは６０塩基の短いｃＤＮＡに関して用いることができる。この技術の報文とし て、Ｖermaら、ヒューマン・クロモゾームズ：ア・マニュアル・オブ・ベイシッ ク・テクニクス（Ｈuman Ｃhromosomes：Ａ Ｍanual of Ｂasic Ｔechniques， Ｐergamon Ｐress，Ｎew Ｙork（１９８８）を参照のこと。 一旦、配列が正確な染色体位置について位置決定されると、染色体上の配列の 物理的位置を遺伝子地図データと相関させることができる。このようなデータは 、例えばヴイ・マッククジック（Ｖ.ＭcＫusick）、メンデリアン・インヘリタ ンス・イン・マン（Ｍendelian Ｉnheritance in Ｍan）（ジョン・ホプキンス 大学医学図書館からオンラインで入手可能）にて見られる。同じ染色体領域につ いて位置決定された遺伝子と病気間の関係を次に結合分析により確認する（物理 的に隣接する遺伝子の共通遺伝）。 次に、感染および未感染個体間のｃＤＮＡまたはゲノム配列における違いを決 定する必要がある。突然変異が感染個体のいくつかまたはすベてにおいて観察さ れるが、正常な個体においては観察されない場合、突然変異が疾患の原因である 可能性がある。 物理的位置決定および遺伝地図決定技術の最新の方法によれば、疾患に関連す る染色体領域に正確に限定されたｃＤＮＡは、５０と５００の間の潜在的原因遺 伝子の１つでありえる。（これは、１メガベースマッピングレゾリューションお よび１遺伝子／２０ｋｂとする）。 ポリペプチド、そのフラグメントまたは他の誘導体、またはその類似体、また はこれを発現する細胞は、これに対する抗体を産生する免疫原として用いること ができる。これらの抗体は、例えばポリクローナルまたはモノクローナル抗体と することができる。本発明はまた、キメラ、一本鎖、およびヒト化抗体、ならび にＦａｂフラグメント、またはＦａｂ発現ライブラリーの産物を包含する。種々 の当業界で公知の方法は、このような抗体およびフラグメントの産生に用いられ る。 本発明の配列に対応するポリペプチドに対して産生される抗体は、ポリペプチ ドを動物に直接注射するか、またはポリペプチドを動物、好ましくはヒト以外の 動物に投与することにより得ることができる。こうして得られた抗体を次にポリ ペプチド自身と結合させる。このように、ポリペプチドのフラグメントだけをコ ードする配列であっても全ての固有のポリペプチドを結合する抗体の産生に用い ることができる。ついで、このような抗体を用いてポリペプチドを発現する組織 からポリペプチドを単離することができる。 モノクローナル抗体を調製する場合、連続セルライン培養により産生される抗 体を付与するいかなる技術も用いることができる。例として、ハイブリドーマ技 術［ＫohlerおよびＭilestein、１９７５、ネイチャー（Ｎature）、２５６：４ ９５−４９７］、トリオーマ技術、ヒトＢ−細胞ハイブリドーマ技術［Ｋozbor ら、１９８３、イムノロジー・トゥデイ（Ｉmmunology Ｔoday）４：７２］およ びヒトモノクローナル抗体を産生するＥＢＶ−ハイブリドーマ技術［Ｃoleら、 １９８５、モノクローナル・アンチボディーズ・アンド・カンサー・セラピー（ Ｍonoclonal Ａntibodies and Ｃancer Ｔherapy，Ａlan Ｒ.Ｌiss，Ｉnc.）、 ７７−９６ページ］が挙げられる。 一本鎖抗体の産生に関して記載した技術（米国特許第４９４６７７８号）を、 本発明の免疫原性ポリペプチド産物に対する一本鎖抗体の産生に適用できる。ま た、トランスジェニックマウスを用いて、本発明の免疫原性ポリペプチド産物に 対するヒト化抗体を発現させてもよい。 本発明をさらに以下の実施例を参照して記載する；しかし、本発明はこのよう な実施例に限定されない。特記しないかぎり、全ての部または量は重量基準であ る。 以下の実施例の理解を助けるために、頻出法および／または用語を記載する。 「プラスミド」はその前に小文字ｐおよび／またはその後に続く大文字および ／または数字で表される。本明細書の出発プラスミドは商業的に入手可能である か、制限されることなく公に入手可能であるか、または入手可能なプラスミドか ら公開された方法にしたがって構築できる。加えて、記載されているものと等価 なプラスミドは当業界で公知であり、当業者には自明である。 ＤＮＡの「消化」はＤＮＡのある配列でのみ作用する制限酵素を用いてＤＮＡ を触媒的に開裂することを意味する。本明細書で用いる種々の制限酵素は商業的 に入手可能であり、当業者に公知の反応条件、コファクターおよび他の要件を用 いた。分析を目的とする場合、典型的には１ｍｇのプラスミドまたはＤＮＡフラ グメントを約２０ｍｌの緩衝溶液中約２単位の酵素に用いる。プラスミドを構築 するためにＤＮＡフラグメントを単離することを目的とする場合、典型的には５ ないし５０ｍｇのＤＮＡを大容量にて２０ないし２５０単位の酵素で消化する。 特定の制限酵素についての適当な緩衝液および基質の量は製造業者により明記さ れている。３７℃で約１時間のインキュベーション時間が通常用いられるが、供 給者の指示により変動しうる。消化後、反応物をポリアクリルアミドゲル上で直 接電気泳動に付し、所望のフラグメントを単離する。 開裂させたフラグメントを寸法分離に付し、Ｇoeddel,Ｄ.ら、ニュークレイッ ク・アシッズ・リサーチ（Ｎucleic Ａcids Ｒes.）、８：４０５７（１９８０ ）により記載されている８％ポリアクリルアミドゲルを用いて行う。 「オリゴヌクレオチド」は化学的に合成されていてもよい一本鎖ポリデオキシ ヌクレオチドまたは２本の相補ポリデオキシヌクレオチド鎖のいずれかを意味す る。このような合成オリゴヌクレオチドは、５’ホスフェートを有しないので、 キナーゼの存在下、ホスフェートをＡＴＰと共に添加しないで他のオリゴヌクレ オチドとライゲートしないであろう。合成オリゴヌクレオチドは脱ホスホリル化 されていないフラグンメントとライゲートするであろう。 「ライゲーション」は二本鎖核酸フラグメントの間にホスホジエステル結合を 形成するプロセスを意味する［Ｍaniatis，Ｔ.ら、前掲、１４６ページ］。特記 しないかぎり、ライゲーションは、公知の緩衝液および条件を用い、０.５ｍｇ の略等モル量のライゲートされるＤＮＡフラグメントに付き１０単位のＴ４ＤＮ Ａリガーゼ（「リガーゼ」）を用いて行う。 特記しないかぎり、形質転換は、Ｇraham，Ｆ.およびＶan der Ｅb，Ａ.、バ イロロジー（Ｖirology）、５２：４５６−４５７（１９７３）の方法に記載さ れているように行う。 以下の実施例は例示目的のみで提示されたものであって、本発明の範囲をなん ら制限するものではない。 実施例１ ヒト小脳ポリ（Ａ）＋ＲＮＡ由来のｃＤＮＡ合成 アダプター−ライゲート二本鎖を、ヒト小脳ポリ（Ａ）＋ＲＮＡ（Ｎippon Ｇ ene Ｃo.,Ｌtd.）から、Ｍarathon ｃＤＮＡ Ａmplification Ｋit(Ｃlontech Ｌaboratories,Ｉnc.)を用いることで調製した。ｃＤＮＡをトリシン−ＥＤＴＡ 緩衝液で２００倍に希釈し、これを以下のＰＣＲのための鋳型ＤＮＡとして用い た。 実施例２ ＲＡＣＥ（ｃＤＮＡ末端の迅速な増幅）による新規なＧ−蛋白質結合レセプター （ＨＴＬＣＡ３２）の５'および３'不明配列領域のクローニング ＨＴＬＣＡ３２の５'および３'不明配列領域をクローニングするために、ＨＴ ＬＣＡ３２の配列に基づいて、５'領域増幅（５'−ＲＡＣＥ）について、２種の プライマー、すなわち、 5'-TGATAGGGCAGCCAGCACATGACAAAGACGGC-3'（AM2）（配列番号：３） および 5'-AAGGTGCCATGAAGAGGCACATGGGCT-3'（HT5r-2） （配列番号：４） を合成し、３'領域増幅（３'−ＲＡＣＥ）について、さらに２種のプライマー、 すなわち、 5'-AGTGACCTTGGAGAGATCCACAACTGGACC-3'（AM1） （配列番号：５） および 5'-ATCCTCAACATGGCCATCGCGGAACTG-3'（HT3r-2） （配列番号：６） を合成した（配列番号２）。これらをＭarathon ｃＤＮＡ Ａmplification Ｋit に結合したアダプタープライマーＡＰ１およびＡＰ２を組み合わせて用い、５' −ＲＡＣＥおよび３'−ＲＡＣＥを行った（図２）。等量のＴag Ｓtart Ａntibo dy（Ｃlontech Ｌaboratories，Ｉnc.）を含む混合物中、ＤＮＡポリメラーゼと してＥx Ｔaqを用いて非特異的産物およびプライマー二量体の増殖を防止した。 反応混合物をＥx Ｔaqに結合する緩衝液（２．５マイクロリットル）、ｄＮＴＰ Ｓ（２００マイクロモル）、Ｅx ＴaqおよびＴaq Ｓtart Ａntibodyの混合溶液 （０.５マイクロリットル）加えることにより調製した。各２００ナノモルのプ ライマーおよび実施例１にて合成した２.５マイクロリットルの鋳型ｃＤＮＡを その反応混合物に加え、つづいて水で全容量２５マイクロリットルとした。 第１のＰＣＲ反応を、５'−ＲＡＣＥについてＡＰ１およびＡＭ２を用いて、 ３'−ＲＡＣＥについてＡＰ１およびＡＭ１を用いて実施した。ＰＣＲ温度条件 は以下のとおりであった：９４℃で１分間、つづいて９８℃で１０秒間および７ ２℃で５分間を５サイクル、９８℃で１０秒間および７０℃で５分間を５サイク ル、および９８℃で１０秒間および６８℃で５分間を２５サイクルで変性させた 。 Ｇene Ａmp ９６００termal cycler（Ｐerkin−Ｅlmer）を用いた。１マイク ロリットル部の第１のＰＣＲ反応混合物をトリシン−ＥＤＴＡ緩衝液で１００マ イクロリットルに希釈し、第２の次のＰＣＲを鋳型として２.５マィクロリット ルの希釈物を用いて行った。５'−ＲＡＣＥの場合、ＡＰ１およびＨＴ５r−２を 組み合わせてプライマーとして用い、一方、３'−ＲＡＣＥの場合、ＡＰ２およ びＨＴ３r−２をプライマーとして用いた。反応混合物を、プライマーの組み合 わせおよび鋳型を除いて、第１のＰＣＲと同じ方法にて調製した。 ＰＣＲ温度条件は以下のとおりであった：９４℃で１分間、つづいて９８℃で １０秒間および７２℃で５分間を５サイクル、９８℃で１０秒間および７０℃で ５分間を５サイクル、および９８℃で１０秒間および６８℃で５分間を２２サイ クルで変性させた。 第２のＰＣＲ産物を１.２％アガロースゲルを用いて分離し、臭化エチジウム で染色した。５'−ＲＡＣＥセカンダリーＰＣＲ産物より約７００ｂｐバンドお よび３'−ＲＡＣＥセカンダリーＰＣＲ産物より約１２００ｂｐバンドを含有す るアガロースゲルのスライスを剃刀で切断し、ついでＵltra Ｆree フィルター ユニット（Ｍillipore）を用いて濾過した。溶出液をフェノール：クロロホルム で溶出し、エタノール中に沈降させた。増幅産物をＴＡクローニングキット（Ｉ nvitrogen Ｃo.）を用いてサブクローンに付した。その組換えベクターをＥ.Ｃo li ＪＭ１０９能力細胞中に導入し、形質転換体を産生した。ついで、ｃＤＮＡ 挿入フラグメントを有する形質転換クローンを、アンピシリン、ＩＰＴＧ（イソ プロピルチオ−ベータ−Ｄ−ガラクトシド）およびＸ−gal（５−ブロモ−４− クロロ−３−インソリル−ベータ−Ｄ−ガラクトシド）含有のＬＢ（Ｌuria−Ｂ ertani）寒天培地にて選択した。個々のクローンをアンピシリン含有のＬＢ培地 にて培養し、自動プラスミド抽出装置（Ｋurabo）で処理し、プラスミドＤＮＡ を調製した。配列決定をＤyeＤeoxyターミネーターサイクルシーケンシングキッ ト（Ｐerkin−Ｅlmer）を用いて行い、ＤＮＡ配列を蛍光自動シーケンサーを用 いて決定し、得られたヌクレオチド配列のデータをＤＮＡＳＩＳ（Ｈitachi Ｓy stem Ｅngineering）を用いて分析した。その結果、開始コドンおよび終止コド ンを各々含有するフラグメントを獲得するのに成功した。 実施例３ 新規なＧ−蛋白質結合レセプターについての全コーディング領域を含有する ｃＤＮＡフラグメントの、ＰＣＲによる調製 実施例２にて得られた配列に基づき、開始コドンおよび終止コドンを各々含有 する次の２種類のプライマーを合成した： 5'-CGTCGACTGGTCCCAATGTCAGTGAAACC-3'（HTLCA-F）（配列番号：７） 5'-GTCTGGCCTCTACCTCAGCTGGGTGTAAG-3'（HTLCA-R）（配列番号：８） ＨＴＬＣＡ−Ｆは、配列番号：１により特定されるＤＮＡの配列−６ないし１ ４（開始コドンＡＴＧのＡを番号１とする）と、その５'側に加えられている制 限酵素ＳalＩ部位とからなる。ＨＴＬＣＡ−Ｒは配列番号１で特定されるＤＮＡ の配列１２０１ないし１２２９に相補的な配列であり、終止コドンを含有する。 反応混合物は、鋳型として実施例１において調製したｃＤＮＡ（２.５マイク ロリットル）を用い、プライマーとしてＨＴＬＣＡ−ＦおよびＨＴＬＣＡ−Ｒを 組み合わせて用いる以外、実施例２と同じ方法にて調製した。温度条件は次のと おりであり、９４℃で１分間、つづいて９８℃で１０秒間を３２サイクル、６８ ℃で１分間で変性させた。こうして得られたバンド（約１２３０ｂｐ）を実施例 ２と同様に回収し、ＴＡクローニングキットを用いて（E.coli JM109）能力細胞 に導入し、形質転換体を得た。挿入されたｃＤＮＡフラグメントの配列決定によ りクローン（E.coli JM109／FHTLCA32）がＨＴＬＣＡ３２の全コーディング領域 を有することがわかった。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 ＦＩ Ａ６１Ｋ 31/00 ６０９ Ａ６１Ｋ 31/00 ６０９Ｆ ６１１ ６１１Ｃ ６１３ ６１３ ６１３Ｅ ６１９ ６１９Ｅ ６２６ ６２６Ｇ ６２６Ｌ ６２６Ｎ ６３７ ６３７Ｅ ６４３ ６４３Ｄ 45/00 45/00 Ｃ０７Ｋ 14/705 Ｃ０７Ｋ 14/705 16/28 16/28 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ Ｃ１２Ｑ 1/68 Ｃ１２Ｑ 1/68 Ａ Ｇ０１Ｎ 33/15 Ｇ０１Ｎ 33/15 Ｚ 33/50 33/50 33/566 33/566 // Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｐ 21/08 (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，Ｌ Ｕ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ， ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，Ｓ Ｚ，ＵＧ)，ＵＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ ，ＢＲ，ＣＡ，ＣＮ，ＣＺ，ＥＥ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＬ， ＩＳ，ＪＰ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＴ，Ｌ Ｖ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ ，ＲＯ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＳ， ＵＺ，ＶＮ (72)発明者 ルーベン，スティーブン・エム アメリカ合衆国20832メリーランド州 オ ルネー、ヘリテイジ・ヒルズ・ドライブ 18528番 (72)発明者 リー，イ アメリカ合衆国20878メリーランド州 ゲ イザーズバーグ、ハワード・ランディン グ・ドライブ16125番 (72)発明者 藤井 亮 茨城県つくば市春日７−９ 武田春日ハイ ツ303 (72)発明者 日沼 州司 茨城県つくば市春日７−９ 武田春日ハイ ツ1402

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １． （ａ）配列番号：２に示すポリペプチドをコードするポリヌクレオチド； （ｂ）ＡＴＣＣ寄託番号９８０４０に含まれるＤＮＡによって発現されるポリ ペプチドをコードするポリヌクレオチド； （ｃ）（ａ）または（ｂ）のポリヌクレオチドとのハイブリッド形成能を有し 、これと少なくとも７０％同一であるポリヌクレオチド； （ｄ）（ａ）、（ｂ）または（ｃ）のポリヌクレオチドのポリヌクレオチドフ ラグメント からなる群より選択される構成因子を有してなる単離されたポリヌクレオチド。 ２．配列番号：２に示すアミノ酸１ないしアミノ酸４０４を有してなるポリペ プチドをコードする請求項１記載のポリヌクレオチド。 ３．請求項１のポリヌクレオチドを含有するベクター。 ４．請求項３のベクターで遺伝子操作された宿主細胞。 ５．請求項４に記載の宿主細胞から前記ＤＮＡによりコードされるポリペプチ ドを発現させることからなるポリペプチドの産生法。 ６．請求項３に記載のベクターで細胞を遺伝子操作することからなるポリペプ チドの発現能を有する細胞の産生法。 ７．（ｉ）配列番号：２の推定アミノ酸配列を有するポリペプチドおよびその フラグメント、類似体および誘導体；および（ii）ＡＴＣＣ寄託番号９８０４０ のｃＤＮＡによりコードされるポリペプチドおよびそのポリペプチドのフラグメ ント、類似体および誘導体からなる群より選択されるポリペプチド。 ８．ポリペプチドが配列番号：２の推定アミノ酸配列を有する請求項７記載の ポリペプチド。 ９．請求項７に記載のポリペプチドに対する抗体。 １０．請求項７に記載のポリペプチドを活性化する化合物。 １１．請求項７に記載のポリペプチドの活性化を阻害する化合物。 １２．治療上有効量の請求項１０に記載の化合物を患者に投与することからな るレセプターを活性化する必要のある患者の治療法。 １３．治療上有効量の請求項１１に記載の化合物を患者に投与することからな るレセプターを阻害する必要のある患者の治療法。 １４．化合物がポリペプチドであり、アゴニストをコードし、そのアゴニスト をin vivoで発現するＤＮＡを患者に付与することにより治療上有効量の化合物 を投与することからなる請求項１２記載の方法。 １５．化合物がポリペプチドであり、アンタゴニストをコードし、そのアンタ ゴニストをin vivoで発現するＤＮＡを患者に付与することにより治療上有効量 の化合物を投与することからなる請求項１３記載の方法。 １６．請求項７に記載のポリペプチドと結合し、そのポリペプチドを活性化す る化合物の同定法であって、 化合物をその表面上で請求項７に記載のポリペプチドを発現する細胞と接触さ せ、該ポリペプチドを該化合物と該ポリペプチドとの結合に応じて検出可能なシ グナルを提供することのできる第二の成分と結合させ、その接触が化合物とポリ ペプチドの結合に十分な条件下で行われ； その第二の成分により形成されるシグナルを検出することにより、ポリペプチ ドとの結合能を有する化合物を同定することからなる方法。 １７．請求項７に記載のポリペプチドと結合し、その活性化を阻害する化合物 の同定法であって、 請求項７に記載のレセプターポリペプチドと結合することが知られている分析 的に検出可能なリガンドおよび化合物をその表面上で請求項７のポリペプチドを 発現する宿主細胞と接触させ、ポリペプチドへの結合が可能である条件下、該ポ リペプチドを化合物と該ポリペプチドとの結合に応じて検出可能なシグナルを提 供することのできる第二の成分と結合させ、 リガンドとポリペプチドの相互作用から生じるシグナルが存在しないことを検 出することにより、リガンドがポリペプチドと結合するかどうかを測定すること からなる方法。 １８．請求項７に記載のポリペプチドの発現不足に関連する疾患または疾患に 対する感受性を患者にて診断する方法であって、 患者由来のサンプル中の該ポリペプチドをコードする核酸配列における変異を 測定することからなる方法。 １９．宿主由来のサンプル中の請求項７のポリペプチドの存在について分析す ることからなる診断法。