JPH11511007A - α−ホルドチオニンの高スレオニン誘導体 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 スレオニン残基を用いる位置特異的置換によって作製されるα-ホルドチオニンの誘導体は、植物中にスレオニンを提供する。

Description

【発明の詳細な説明】 α-ホルドチオニンの高スレオニン誘導体技術分野 本発明は、飼料処方物の改善に関する。詳細には、本発明は、植物中の高い比 率のスレオニンを提供するα-ホルドチオニン（α-hordothionin）の誘導体に関 する。発明の背景 飼料処方物は、動物に、成長するために重要な必須の栄養を提供するために必 要とされる。しかし、作物植物は、一般に、栄養的品質の乏しい食物供給源にさ れる。なぜなら、これらは動物に必須であるが、動物が合成することができない 低比率の数種のアミノ酸を含有するからである。 長年、研究者は、育種計画を通して重要な作物のタンパク質における必須アミ ノ酸のバランスを改善しようと試みてきた。貯蔵タンパク質およびこれらのタン パク質をコードする遺伝子の発現についてより多くが知られるにつれて、そして 形質転換系がより種々の植物について開発されるにつれて、種子タンパク質の栄 養的品質を改善することについての分子的アプローチは、より慣習的なアプロー チに対する代替物を提供し得る。従って、特定のアミノ酸のレベルを、バイオテ クノロジーを介して、所定の作物で増量し得る。 １つの代替法は、食物または飼料の補充を回避するのに十分なレベルで、好都 合のアミノ酸組成の異種タンパク質を発現することである。例えば、硫黄アミノ 酸に富む多くの種子タンパク質が同定されている。このようなタンパク質の良好 な発現に対する鍵は、種子特異的プロモーターを有する効率的な発現カセットに 関する。遺伝子制御領域がmRNAの高レベルの合成を指示しなければならないだけ でなく、このmRNAが安定なタンパク質に翻訳されなければならない。 作物植物からしばしば失われている、動物の栄養に必要である必須アミノ酸に は、メチオニン、スレオニン、およびリジンがある。育種、変異選択、および／ または作物植物中に蓄積される貯蔵タンパク質の組成の変更によるこれらの遊離 アミノ酸のレベルを増大させる試みは、最小限の成功しかおさめていない。通常 、トランスジェニック貯蔵タンパク質の発現は、低すぎた。ファゼオリン(phase olin)促進ブラジルナッツ 2S発現カセットは、有効なキメラの種子特異的遺伝子 の一例である。しかし、たとえブラジルナッツタンパク質が総メチオニンおよび 結合メチオニンの量を増大し、それにより栄養価を改善するとしても、種子中に 蓄積するメチオニンの総量に関しては閾値の制限があるようである。種子は、メ チオニンの供給源としては不十分なままである。 所望のアミノ酸を含有するタンパク質のレベルを変化させることによる特定の なアミノ酸レベルの増量に対する代替物は、アミノ酸生合成の改変である。組換 えDNAおよび遺伝子移入技術は、アミノ酸生合成経路における鍵となる段階を触 媒する酵素活性を変化させるために適用されてきた。Glassman、米国特許第5,25 8,300号；Galiliら、欧州特許出願第485970号；(1992);（本明細書中にその全体 が参考として援用される）。しかし、種子中のアミノ酸レベルの改変は、これら のアミノ酸を組み込むタンパク質のレベルの変化と常には相関しない。Burrowら 、Mol. Gen. Genet.;第241巻；431〜439頁；(1993)；（本明細書中にその全体が 参考として援用される）。葉中の遊離リジンレベルの顕著な増大は、DHDPS変異 体についての選択により、または植物中でE. coli DHDPSを発現することにより 得られているが、これらの変化が、結合標的アミノ酸を増加し得ることを示すこ とが残っている。結合標的アミノ酸は、全アミノ酸の約90％以上の存在する。従 って、種子の栄養価に対して最小の影響力が存在する。 上記のことに基づくと、植物の種子中の必須アミノ酸であるスレオニン、メチ オニン、およびリジンのレベルを増大させる方法に対する必要性が存在する。 従って、本発明の目的は、植物を遺伝的に改変して、このような植物中の必須 アミノ酸であるスレオニンのレベルを増大させるための方法を提供することであ る。 本発明のさらなる目的は、野生種の同一種子よりも高レベルの必須アミノ酸で あるスレオニンを含有する食物および／または飼料のための種子を提供すること である。発明の開示 現在、あるクラスの化合物である、α−ホルドチオニンは、それらのスレオニ ンの含有量を増量するように改変され得ると決定されている。α-ホルドチオニ ンは、十分に特徴付けされている45アミノ酸タンパク質である。それは、大麦（ Hordeum vulgare）の種子から単離され得る。分子は、８つのシステイン残基か ら得られる４つのジスルフィド結合によって安定化される。アミノ酸配列は、配 列番号１において提供される。その天然の形態において、このタンパク質は、特 に、アルギニン残基およびリジン残基に富み、各５残基（10％）を含む。しかし 、これは、必須アミノ酸であるスレオニンをほんの３残基（７％）しか含まない 。 このタンパク質は、合成されており、そしてコンピューターモデリングによっ て３次元構造が決定されている。このタンパク質のモデリングは、10個の荷電し た残基（５、10、17、19、および30位のアルギニン、ならびに１、23、32、38、 および45位のリジン）の全てが分子の表面上に存在することを予言する。極性ア ミノ酸（11位のアスパラギン、22位のグルタミン、および41位のスレオニン）の 側鎖もまた、分子の表面上に存在する。さらに、疎水性アミノ酸（例えば、８、 15、24、および33位のロイシンおよび18位のバリンの側鎖）もまた、溶媒に接触 可能である。 タンパク質の三次元モデリングは、10位のアルギニン残基が適切な三次元構造 を保持するために重要であり、そしてタンパク質のＣ末端残基との水素結合相互 作用によって折りたたみ可能であることを示す。その位置でのスレオニン置換は 、10位のアルギニン、２位のセリン、および45位のリジンを含む水素結合を崩壊 させ、構造の不安定化を誘導する。この置換を有する合成ペプチドは、正確に折 りたたむように作製され得ず、これは、この分析を支持する。10位のアルギニン 残基を保存することにより、正確に折りたたまれたタンパク質が提供される。 スレオニンは極性のアミノ酸であるので、表面の極性アミノ酸残基である、11 位のアスパラギンおよび22位のグルタミンが置換され；そして荷電したアミノ酸 である、１、23、32、および38位のリジンならびに５、17、19、および30位のア ルギニンがスレオニンと置換された。得られた化合物は、配列番号２で示された 配列を有する。その分子は、固相ペプチド合成により合成され得、そして安定な 構造に折りたたまれる。それは、13のスレオニン残基（29％）を有する。 配列番号２が本発明の例示であるが、それは制限であることを意図しない。ス レオニン置換はまた、荷電アミノ酸を含む位置で行われ得る。10位のアルギニン および45位のリジンのみが、タンパク質の構造を維持するために重要である。疎 水性アミノ酸を有する部位でも置換し得る。これらは、８、15、18、および24位 を含む。得られた化合物は、配列番号３に示された配列を有する。 化合物の合成は、当該分野で周知のペプチド合成法に従って行われ、従って、 本発明の一部を構成しない。インビトロにおいて、化合物は、hbtu[2-（lh-ベン ゾトリアゾール-1-イル）-1,1,3,3-テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホス フェート]を含むfastmoc^TM化学を用いてapplied biosystemsモデル431aペプチド 合成機で合成されている。これは、Raoら、Int. J. Pep ．Prot. Res.;第40巻；5 08-515頁;(1992)；（これらは、本明細書中でその全体が参考として援用される ）によって公開されている。ペプチドを、標準的なプロトコルに従って切断し、 そして標準的な方法を用いて逆相クロマトグラフィーによって精製した。各ペプ チドのアミノ酸配列を、applied biosystems 477a プロテインシークエンサー/1 20a pth分析機を用いる自動化エドマン分解によって確認した。しかし、より好 ましくは、本発明の化合物は、転写および翻訳された場合、所望の化合物を生じ る合成遺伝子を含む発現カセットの挿入によって形質転換されている細菌細胞ま たは植物細胞によってインビボで合成される。所望の配列の植物発現または細菌 発現のための適切な調節配列を提供するこのような空の発現カセットはまた、周 知であり、そして合成遺伝子のヌクレオチド配列（RNAまたはDNAのいずれか）は 、標準的な参照文献を用いてタンパク質のアミノ酸配列から容易に誘導され得る 。好ましくは、このような合成遺伝子は、所望のタンパク質の発現を増強するた めに植物が好むコドンを使用する。産業上の利用可能性 以下の記載は、本発明の組成ならびにそれらを作製および使用する方法をさら に例示する。しかし、等価である当業者に公知の他の方法もまた、使用され得る ことが理解される。植物 これらの化合物をコードする遺伝子は、適切な発現カセットに挿入され、そし て植物種の細胞に導入され得る。従って、本方法の特に好ましい実施態様は、本 発明の化合物をコードするDNA配列を、植物において活性な転写イニシエーター 配列およびプロモーター配列と共に適切なリーディングフレームで植物のゲノム に挿入する工程を包含する。調節配列の制御下でのDNA配列の転写および翻訳は 、植物の組織中の上昇した量のタンパク質を提供するレベルで、タンパク質配列 の発現を引き起こす。 本発明の方法に従って形質転換されるべき好ましい植物は、トウモロコシ、ラ イ麦、大麦、小麦、モロコシ、えん麦、アワ、イネ、ライコムギ、ヒマワリ、ア ルファルファ、ナタネ、およびダイズを含む禾穀類である。 次いで、アミノ酸の適切な配列をコードする合成DNA配列が調製され得、そし てこの合成DNA配列は、適切な植物発現カセットに挿入され得る。 同様に、多数の植物発現カセットおよびベクターは、当該分野で周知である。 用語「発現カセット」は、開始配列、プロモーター配列、および終止配列を含む 制御配列の完全なセットを意味し、それらは適切なリーディングフレームで構造 遺伝子と隣接する場合、植物細胞中で機能する。発現カセットは、任意の所望の 構造遺伝子の切断および挿入に適切な一組の制限部位をしばしばおよび好ましく 含む。クローン化された遺伝子が、構造配列のために正確なリーディングフレー ム中の開始コドンを有することが重要である。 さらに、好ましくは、植物の発現カセットは、高い頻度で転写される遺伝子を 生じるために一方の末端に強力な構成的プロモーター配列を含み、そしてメッセ ンジャーRNAの適切なプロセッシングおよび輸送のために他方の末端にポリ-a認 識配列を有する。本発明のcDNAを挿入し得る、このような好ましい（空の）発現 カセットの例は、米国特許出願第07/785,648号（1991）（これは、本明細書中で その全体が参考として援用される）に開示されるように、Pioneer Hi-Bred Inte rnational,Inc.,Johnston,IAのBeachらによって開発されたpPHI4l4プラスミドで ある。非常に好ましい植物発現カセットは、１つ以上の選択マーカー遺伝子（例 えば、カナマイシン耐性遺伝子または除草剤耐性遺伝子）を含むように設計され る。 本明細書中の用語「ベクター」は、宿主細胞中で外来遺伝子を複製および発現 し得るDNA配列を意味する。代表的には、ベクターは、適切な酵素の使用により 予測可能な様式で切断され得る１つ以上のエンドヌクレアーゼ認識部位を有し、 好ましくは、このようなベクターは、抗生物質耐性または除草剤耐性を与えるさ らなる構造遺伝子配列を含むように構築され、次いで、これらは形質転換細胞を 同定および分離するためのマーカーとして作用する。好ましいマーカー/選択剤 は、カナマイシン、クロロスルフロン、ホスホノトリシン、ハイグロマイシン、 およびメトトレキセートを含む。ベクター中の外来遺伝物質が機能的に発現され る細胞は、ベクターによって「形質転換」されており、そして「形質転換体」と 呼ばれる。 特に好ましいベクターは、プラスミドであり、それは細胞の染色体の一部では ない環状二本鎖DNA分子を意味する。 上記のように、目的の遺伝子をコードするゲノムDNAおよびcDNAの両方は、本 発明において使用され得る。目的のベクターはまた、部分的にcDNAクローンから 、そして部分的にゲノムクローンから構築され得る。目的の遺伝子が単離されて いる場合、宿主細胞中の遺伝子の効率的な発現のために提供される必要な調節配 列を含む遺伝的構築物が作製される。本発明により、遺伝的構築物は、（a）目 的のタンパク質または形質をコードする最初の遺伝的配列および（b）目的の構 造遺伝子のいずれかの側に作動可能に連結された１つ以上の調節配列、を含む。 代表的には、調節配列は、プロモーターおよびターミネーターからなる群より選 択される。調節配列は、オートロガスまたはヘテロロガスな供給源由来であり得 る。 遺伝的配列中で使用され得るプロモーターとしては、NOS、OCS、およびCaMVプ ロモーターが挙げられる。 使用され得る有効な植物プロモーターは、過剰産生植物プロモーターである。 本発明で使用され得る過剰産生植物プロモーターとしては、クロロフィルα-β 結合タンパク質のプロモーター、およびダイズ由来のリブロース-1,5-二リン酸 カルボキシラーゼの小サブユニット（ss）のプロモーターが挙げられる。例えば 、Berry-Loweら、J. Molecular and App. Gen. ;第１巻；483-498頁；(1982)（ これは、本明細書中で参考として援用される）を参照のこと。これら２つのプロ モーターは、真核植物細胞中で光誘導されることが公知である。例えば、An Agr icultural Perspective ，A．Cashmore，Pelham，New York; 29-38頁;(1983)；G ．Coruzziら、J. Biol. Chem.，第258巻；1399頁（1983）；およびP．Dunsmuir ら、J. Molecular and App. Gen.；第２巻；285頁;（1983）（これら全ては、本 明細書中で参考として援用される）;を参照のこと。 所望の制御配列に作動可能に連結された、本発明のタンパク質についての構造 遺伝子を含む発現カセットは、適切なクローニングベクター中に連結され得る。 一般に、宿主細胞に適合性の種由来の複製配列および制御配列を含むプラスミド ベクターまたはウイルス（バクテリオファージ）ベクターが使用される。代表的 には、クローニングベクターは、複製起点ならびに形質転換された宿主細胞中の 表現型選択マーカーを提供し得る特定の遺伝子を保有する。代表的には、抗生物 質または選択された除草剤に耐性を与える遺伝子が使用される。遺伝物質が標的 細胞に導入された後、首尾良く形質転換された細胞および／または細胞のコロニ ーは、これらのマーカーに基づく選択によって単離され得る。 代表的には、中間宿主細胞は、本発明の実施において、クローニングベクター のコピー数を増加させるために使用される。増加したコピー数を有すれば、目的 の遺伝子を含むベクターは、所望の植物細胞への導入のために有意な量で単離さ れ得る。本発明の実施において使用され得る宿主細胞としては、E. coli、S. ty phimurium 、およびSerratia marcescensのような細菌宿主を含む原核生物が挙げ られる。酵母または糸状菌のような真核生物宿主もまた、本発明において使用さ れ得る。これらの宿主もまた微生物であるので、細胞中でタンパク質の発現を引 き起こさない植物プロモーターがベクター中で使用されることを確実にすること が必要である。 次いで、単離されたクローニングベクターは、任意の便利な技術（（プロトプ ラストにおける）エレクトロポレーション、細胞培養または組織培養中の単子葉 植物または双子葉植物由来の細胞中へのレトロウイルス、ボンバードメント、お よびマイクロインジェクションを含む）を用いて植物細胞中に導入され、外来DN Aとして、植物発現カセットのDNA配列の少なくとも１コピーを含む形質転換され た植物細胞が提供される。好ましくは、単子葉植物種は、トウモロコシ、モロコ シ、小麦、またはイネから選択され、そして双子葉植物種は、ダイズ、アルファ ルファ、ナタネ、ヒマワリ、またはトマトから選択される。公知の技術を用いて 、プロトプラストは再生され得、そして細胞培養物または組織培養物は再生され て、本発明によるタンパク質の遺伝子を保有および発現する完全な稔性植物を形 成し得る。従って、本発明の非常に好ましい実施態様は、形質転換されたトウモ ロコシ植物であり、その細胞は、外来DNAとして本発明の発現カセットのDNA配列 の少なくとも１コピーを含む。 本明細書中で提供される植物ベクターは、agrobacterium tumefaciensに組み 込まれ得、次いで、これはベクターを感受性の（主として双子葉植物種由来の） 植物細胞に移入するために使用され得ることもまた、当業者によって認識される 。従って、本発明は、発現カセツトが、細胞をagrobacterium tumefaciensに感 染させることによって細胞中に導入される、agrobacterium tumefaciens感受性 双子葉植物中のスレオニンレベルを増加させる方法を提供する。このプラスミド は、本発明の植物発現カセットを含むように改変されている。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 ＦＩ Ｃ１２Ｐ 13/08 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｃ //(Ｃ１２Ｐ 13/08 Ｃ１２Ｒ 1:91） (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，Ｌ Ｕ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ， ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，Ｓ Ｚ，ＵＧ)，ＵＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，Ｉ Ｓ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ， ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，Ｓ Ｄ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．配列番号３の配列を有するタンパク質であって、ここで、１、５、７、８、 11、15、17、18、19、22、23、24、30、32、34、38、および41位の１つ以上にお けるアミノ酸残基がスレオニンであり、そして該位置における残りの残基が、配 列番号１中の対応する位置における残基である、タンパク質。 ２．１、５、７、11、17、19、22、23、30、32、34、38、および41位におけるア ミノ酸残基の１つ以上がスレオニンである、請求項１に記載のタンパク質。 ３．１、５、７、11、17、19、22、23、30、32、34、38、および41位における少 なくとも５つのアミノ酸残基がスレオニンである、請求項２に記載のタンパク質 。 ４．１、５、７、11、17、19、22、23、30、32、34、38、および41位における少 なくとも７つのアミノ酸残基がスレオニンである、請求項３に記載のタンパク質 。 ５．配列番号３の配列を有するタンパク質をコードするヌクレオチド配列であっ て、ここで、１、５、７、８、11、15、17、18、19、22、23、24、30、32、34、 38、および41位の１つ以上におけるアミノ酸残基がスレオニンであり、そして該 位置における残りの残基が、配列番号１中の対応する位置における残基である、 ヌクレオチド配列。 ６．配列番号３の配列を有するタンパク質をコードするRNA配列であって、ここ で、１、５、７、８、11、15、17、18、19、22、23、24、30、32、34、38、およ び41位の１つ以上におけるアミノ酸残基がスレオニンであり、そして該位置にお ける残りの残基が、配列番号１中の対応する位置における残基である、RNA配列 。 ７．配列番号３の配列を有するタンパク質をコードするDNA配列であって、ここ で、１、５、７、８、11、15、17、18、19、22、23、24、30、32、34、38、およ び41位の１つ以上におけるアミノ酸残基がスレオニンであり、そして該位置にお ける残りの残基が、配列番号１中の対応する位置における残基である、DNA配列 。 ８．発現カセットであって、植物細胞における前記DNA配列の発現を引き起こす 植物調節配列に作動可能に連結された、請求項７に記載のDNA配列を含む発現カ セット。 ９．細菌の形質転換ベクターであって、細菌細胞中で発現カセットの複製を引き 起こす、細菌の発現調節配列に作動可能に連結された、請求項８に記載の発現カ セットを含む、細菌の形質転換ベクター。 １０．外来プラスミドとして、請求項９に記載の細菌の形質転換ベクターの少な くとも１コピーを含む、細菌細胞。 １１．請求項８に記載の発現カセットの少なくとも１コピーを含む、形質転換さ れた植物細胞。 １２．前記細胞が単子葉植物種の細胞である、請求項１１に記載の形質転換され た植物細胞。 １３．前記細胞が、トウモロコシ、モロコシ、小麦、およびイネの細胞からなる 群より選択される、請求項１２に記載の形質転換された植物細胞。 １４．前記細胞が双子葉植物種の細胞である、請求項１１に記載の形質転換され た細胞。 １５．細胞が、ダイズ、アルファルファ、ナタネ、ヒマワリ、タバコ、およびト マトの細胞からなる群より選択される、請求項１４に記載の形質転換された細胞 。 １６．請求項１３に記載の細胞を含む、トウモロコシの細胞または組織培養物。 １７．植物細胞または種子のスレオニン含有量を増量させる方法であって、該細 胞または種子において、請求項１に記載のタンパク質を発現する工程を包含する 、方法。 １８．前記植物が双子葉植物である、請求項１７に記載の方法。 １９．前記植物が単子葉植物である、請求項１７に記載の方法。 ２０．前記植物の種子のスレオニン含有量を増量させる、請求項１９に記載の方 法。