JPH11514877A

JPH11514877A - In vitro growth of functional islets of Langerhans and their use in vivo

Info

Publication number: JPH11514877A
Application number: JP9516734A
Authority: JP
Inventors: ペック，アモン，ビー．; ジー．コーネリウス，ジャネット
Original assignee: ユニバーシティオブフロリダリサーチファウンデイション，インコーポレイテッド
Priority date: 1995-10-25
Filing date: 1996-10-23
Publication date: 1999-12-21
Also published as: EP0871455A4; EP0871455A1; CA2235509A1; WO1997015310A1; AU7468396A; AU739771B2; MX9803263A

Abstract

(57)【要約】本発明は、インビトロ培養で機能性膵島を成長させることを初めて可能にする新しい方法に関する。本発明はまた、糖尿病のインビボの治療のために、インビトロで成長させた膵島様構造を哺乳動物への体内移植のために使用することに関する。本発明はさらに、正常膵臓組織で観察されるものと同じ機能的、形態的および組織学的特徴を有する臓器をインビボで成長させるための、インビトロで成長した膵島体内移植物を使用する方法に関する。これらの細胞をインビトロで臓器をインビボで成長させることができる能力は、糖尿病に関する研究と治療のための重要な新しい未知を切り開くものである。 (57) [Summary] The present invention relates to a new method which makes it possible for the first time to grow functional islets in in vitro culture. The invention also relates to the use of islet-like structures grown in vitro for in vivo transplantation into mammals for the in vivo treatment of diabetes. The invention further relates to methods of using in vitro grown islet transplants to grow in vivo organs having the same functional, morphological and histological characteristics as observed in normal pancreatic tissue. The ability of these cells to grow in vitro and in vivo in organs opens up important new unknowns for research and treatment of diabetes.

Description

【発明の詳細な説明】機能性ランゲルハンス島のインビトロ成長およびそのインビボの使用発明の背景糖尿病は、国民の大きな健康問題である。全国糖尿病諮問評議会（National D iabetes Advisory Board）が作成した「糖尿病と戦うための全国長期計画の１９８７年報告（1987 Report of The National Long-Range Plan to Combat Diabet es）」に提示されるように、米国では６００万人が糖尿病であることが知られており、さらに５００万人が未だ診断されていないが糖尿病である。毎年、５００，０００を超える糖尿病の新しい症例が確認されている。１９８４年には、糖尿病は、３５，０００人のアメリカ人の死亡の直接の原因であり、そしてさらに９５，０００人の死亡の一因であった。糖尿病の目の合併症が、２０〜７４歳の米国人の法的な盲の新規症例の主な原因である。下肢切断のリスクは、糖尿病の人では糖尿病でない人よりも１５倍大きい。腎疾患は、糖尿病でしばしば起きる重篤な合併症である。末期腎疾患の治療を受けている米国の全ての新規患者の約３０％は、糖尿病に罹患している。糖尿病の人はまた、歯周病のリスクも高い。歯周感染は、急速に進行し、歯を喪失するでなく、代謝機能を低下させる。糖尿病の女性は、妊娠の重篤な合併症のリスクが高い。最近の統計によれば、母親が糖尿病である乳児の死亡率は約７％であることが示唆されている。糖尿病の経済的負担は明らかに甚大である。毎年、糖尿病またはその合併症の患者は、病院において２４００万患者日を費やす。糖尿病に帰することのできる全年間経費の控えめに見積もった推定額は、少なくとも２４０億ドルである（米国糖尿病協会（American Diabetes Association）推定、１９８８年）；しかし、追加の医療経費がしばしば糖尿病自体よりも糖尿病の特異的合併症によるものであるため、この糖尿病全体の経済的影響はさらに大きい。糖尿病は、身体が炭水化物、脂肪、およびタンパク質を適正に維持および使用することができなくなる、慢性の複雑な代謝疾患である。糖尿病は、種々の遺伝および環境因子により発生し、インスリン産生の欠損またはその利用の障害により引き起こされる血中グルコースの高レベルを特徴とする。糖尿病の多くの症例は、２つの臨床タイプに分かれる：Ｉ型、すなわち若年発症型、およびII型、すなわち成人発症型。Ｉ型糖尿病は、しばしばインスリン依存性糖尿病（Insulin Dependent Diabetes）、またはＩＤＤと呼ばれる。各型は、異なる予後、治療、および病因を有する。約５〜１０％の糖尿病患者は、ＩＤＤである。ＩＤＤは、通常膵ランゲルハンス島のインスリン産生β細胞の破壊のため、インスリンを産生することが一部または完全にできないことを特徴とする。ＩＤＤの患者は、疾患を制御するために毎日インスリン注射をしないと死んでしまうであろう。Ｉ型ＩＤＤが自己免疫の原因病理を有することを示唆する証拠が蓄積され始めた１９７０年代半ばまで、糖尿病の病因を解明する上での前進はほとんどなかった。ＩＤＤが、遺伝的に罹患しやすい体質の人の膵ランゲルハンス島のインスリン産生β細胞を選択的に破壊する進行性の自己免疫応答から起こることは、今や一般に受け入れられている。ＩＤＤのβ細胞に対する自己免疫は、体液性（バエッケスコフ（Baekkeskov）ら，1982；バエッケスコフ（Baekkeskov）ら，1990；レディー（Reddy）ら，1988；ポンテシッリ（Pontesilli）ら，1987）および細胞介在性（レディー（Reddy）ら，1988，前述；ポンテシッリ（Pontesilli）ら，1987，前述；ワン（Wang）ら，1987）免疫機作の両方を含む。体液性免疫は、 β細胞膜（抗６９kDおよび膵島細胞表面自己抗体）、β細胞内容物（抗カルボキシペプチダーゼＡ₁、抗６４kDおよび／または抗ＧＡＤ自己抗体）、および／またはβ細胞分泌産物（抗インスリン）に対する自己抗体の出現を特徴とする。血清はＩＤＤを運搬しないが、抗β細胞自己抗体は非常に若年齢で発生するため、恐らく抗原の模倣物が関与する環境性引き金因子の問題を提起している。ＩＤＤの自然経過における細胞介在性免疫反応性の存在は、インスリン炎と呼ばれる膵島内の炎症性病変を証拠とする。炎症性／免疫細胞が浸潤するインスリン炎は、組織学的に明瞭に目で見ることができ、ＴおよびＢリンパ球、単球およびナチュラルキラー細胞を含む、多くの細胞型を含むことが証明されている（シグノア（ Signore）ら，1989；ジャーペ（Jarpe）ら，1991）。ヒトＩＤＤのモードとしてのＮＯＤ（非肥満糖尿病）マウスを用いる養子免疫細胞移入（adoptive tra nsfer）により、ＩＤＤの病因における自己攻撃性Ｔリンパ球の主要な役割が確立された（ベンデラック（Bendelac）ら，1987；ミラー（Miller）ら，1988；ハナフサ（Hanafusa）ら，1988；ベンデラック（Bendelac）ら，1988）。残念なことに、膵β細胞の破壊の基礎となる機作は未だ不明のままである。以下の刊行物に報告されている努力を含む膵細胞を培養するための最近の努力は、培養において単層または凝集体として成長する分化した細胞または部分的に分化した細胞の培養に集中してきた。これらの報告とは対照的に、本発明は、新生中にインビボで正常な島（islet）が作成するのと非常によく似た細胞器質化の形態と程度を有する島様の構造が作成される、方法と構造を開示している。ガズダー（Gazdar）ら（1980）は、移植可能なラット膵細胞腫瘍から樹立した連続性で、クローン性の、インスリン−およびソマトスタチン−分泌細胞株を開示した。しかし開示された細胞は、腫瘍原性であり、多分化能ではなかった。エイ・ジェイ・ブロザーズ（Brothers，A.J.）（ＷＯ９３／００４４１，1993 ）は、長期培養で維持した膵細胞を含むホルモン分泌細胞を開示した。しかし、培養された細胞は、多分化能幹細胞とは対照的に、分化しており、膵様構造を再生する能力とは対照的に、ホルモン分泌性の表現型について早期に選択されている。コースグレン（Korsgren）らは、ブタ胎児膵細胞の分化を誘導する能力について化合物のインビトロスクリーニングを開示した。本発明は、胎児組織の使用に依存しない。ジェイ・エイチ・ニールセン（Nielsen，J.H．）（ＷＯ８６／０１５３０，19 86）は、全部または一部が分化したベータ細胞の増殖方法を開示した。しかし、この開示は、培養して成長する膵島細胞の供給源として胎児組織に依存していた。マックエボイ（McEboy）ら（1982）は、ラット胎児膵島の組織培養の方法を開示して、Ａ、Ｂ、およびＤ細胞の合成培地維持、成長および分化に及ぼす血清の効果を比較した。またも膵島細胞の供給源は、胎児組織である。ザヤス（Zayas）ら（ＥＰ０３６３１２５，1990）は、膵内分泌細胞の増殖の方法を開示した。この方法は、胎児膵組織の使用に依存しており、そしてコラーゲンを含む合成構造は、体内移植のためこれらの細胞に埋め込んで調製しなければならない。こうして作成された培養細胞の凝集体は体内移植の際、血中グルコースレベルに影響を与えるまでに６０〜９０日間を要し、血糖値が正常に（eu glycemia）に近づくまでに１１０〜１２０日間を要する。これとは対照的に、本発明は、体内移植の際、受容者の糖血症状態（glycemic state）に、より迅速に効果を及ぼす器質化の保持のためにコラーゲンまたは他の合成手段を必要としない、インビトロで成長した膵島様構造を提供する。クーン（Coon）ら（ＷＯ９４／２３５７２，1994）は、膵細胞の拡張した非形質転換細胞培養物を作成する方法を開示した。凝集した培養細胞は次に体内移植のためコラーゲンマトリックスに包埋され、これはザヤス（Zayas）ら（前述）の構造に付随する欠点有し、本発明により作成される構造との相違が注目される。従来の報告にもかかわらず、本発明は、機能性膵島様構造が、インスリン、グルカゴンおよび／またはソマトスタチンを発現する細胞を含有し、これを、臨床的に糖尿病の哺乳動物に体内移植することにより、（インスリン治療を止めた後も）健康を維持させることができ驚くべきものである。このことは、最近の三次元イメージング（ブレルジェ（Brelje）ら，1989）と共に、膵ランゲルハンス島の従来の免疫蛍光組織学（レイシー（Lacey）ら，1957；バウム（Baum）ら，196 2；デュボア（Dubois），1975；ペレティア（Pelletier）ら，1975；ラーソン（ Larsson）ら，1975）により、血中グルコースレベルの変化に応答する、迅速でありながら精密に制御された応答のための膵島の注目すべき構造および細胞器質化が明らかになったためである。このような構造をインビトロで作成することができることは、特に胚形成期に膵臓内の島の発生は、主に膵管上皮細胞（ピクテット（Pictet）ら，1972）すなわち非島細胞と結合している未分化の前駆細胞から開始されるらしいことを考慮すると、予測できなかった。膵管上皮細胞は、迅速に増殖し、そして次に種々の島関連細胞集団に分化する（ヘラーストルム(Hel lerstrom)，1984；ワイアー（Weir）ら，1990；タイテルマン（Teitelman）ら， 1993；ビーティー（Beattie）ら，1994）。生じた膵島は、インスリン産生β細胞が、非β細胞の外被により囲まれたコアを形成するスフェロイド構造を、に構成される。グルカゴン産生α細胞（膵島が背葉に由来する場合）、あるいは膵ペプチド産生ＰＰ細胞（膵島が腹葉に由来する場合）は大部分、外側皮質内に存在する（ブレルジェ（Brelje）ら，前述，1989；ワイアー（Weir）ら，前述， 1990）。本質的に樹状であるソマトスタチン産生δ細胞は、内側皮質内に存在し、偽足を延ばしてα（またはＰＰ）細胞およびβ細胞に神経を分布している。これらスフェロイド膵島構造は、膵管上皮から分離し、まわりの外分泌組織へと短い距離を移動する傾向にある。血管新生が誘導した血管形成により、成熟膵島への直接細動脈血流が生じる（ボナー−ワイアー（Bonner-Weir）ら，1982；タイテルマン（Teitelman）ら，1988；メンガー（Menger）ら，1994）。血中グルコースは、β細胞増殖を刺激することができるため、血管形成は、さらにβ細胞の数を増大させるように作用しうる。同様に、神経発生は、交感神経、副交感神経およびペプチド作動性ニューロンによる膵島の神経支配を導く（ワイアー（Weir ）ら，上記文，1990）。従って我々が機能性膵島様構造をインビトロで作成して、次にこれを体内移植して膵様構造を作成することができることは、非常に驚くべきことである。残念なことに、膵島の細胞器質化は、Ｉ型インスリン依存性糖尿病（ＩＤＤ）のような疾患では破壊されることがあり、進行性の体液性および細胞介在性の自己免疫応答によりインスリン産生β細胞の特異的な破壊を起こすことがある（エイセンバース（Eisenbarth），1986；ライター（Leiter）ら，1987）。β細胞は大部分は分化した最終段階の細胞であると考えられているため、生体が新しいβ 細胞を生成する能力は限定されていると考えられ、一旦β細胞の多くが破壊されると規則的なインスリン治療を一生余儀なくされる。しかし、実験動物において、β細胞集団が正常な血糖値を維持するために増加したり減少したりすることが証明された（ボナー−ワイアー（Bonner-Weir）ら，1994）。この形成性は、膵島成長の２つの経路により発生しうる：第一に、新生、すなわち膵管上皮の分化による新しい膵島の成長、そして第二に、肥大、すなわち既に存在するβ細胞の複製による拡張である。胚形成期に、β細胞集団は最初に新しい細胞の分化から拡張するが、胎児後期には分化したβ細胞が複製する。そして複製は、出生後の拡張の主な手段であるようだが、複製する能力は加齢により消失するようである。成人膵島細胞は、新生児の膵島細胞成長を開始させることが知られている刺激、例えば、グルコース、成長ホルモンおよびいくつかのペプチド成長因子に応答することにより複製することが証明された（スウェン（Swenne），1992；ヘラーストルム（Hellerstrom）ら，1988；ボナー−ワイアー（Bonner-Weir）ら，1989；マリーニッセン（Marynissen）ら，1993；ニールセン（Neilsen）ら，1992；ブレルジェ（Brelje）ら，1993）。これらの観察結果は、成人ではβ細胞成長のレベルが低いため、機能上の要求に応じられることを示唆している。例えば、妊娠または慢性肥満において、β細胞集団は顕著に増加するが、妊娠の終了または体重低下により、増加したβ細胞のアポトーシス死によりβ細胞集団は急速に減少するため、これは可逆的である。全ての型の膵臓内分泌細胞が同じ膵管上皮から分化することは、一般に受け入れられている（ピクテット（Pictet）ら，1972，前述；ヘラーストルム(Hellers trom)，1984，前述；ワイアー（Weir）ら，1990，前述；タイテルマン（Teitelm an）ら，1993，前述）が、これらが共通の幹／前駆細胞に由来するかどうかは不明である。正常な成人の膵臓では、膵管上皮内の約０．０１％の細胞が、膵島細胞ホルモンを発現し、刺激されて、新生を暗示する新しい膵島を形成するための形態変化を受けることができる。この新生は実験的に、ダイズトリプシンインヒビターによる食餌療法（ウィーバー（Weaver）ら，1985）、高レベルのインターフェロン−γ（グー（Gu）ら，1993）、部分膵切除（ボナー−ワイアー（Bonner -Weir）ら，1993）、膵臓の頭部のセロファンによる包装（ローゼンバーグ(Rose nberg)ら，1992）、特異的な成長因子（オトンコスキ（Otonkoski）ら，1994）および臨床的ＩＤＤの発症により誘導された。最近になって、膵島β細胞の新生における調節要素として、再生ラット膵島のサブトラクションしたｃＤＮＡライブラリーにおいて同定されたＲｅｇ遺伝子に注目が集まった（ワタナベ（Watana be）ら，1994；オトンコスキ（Otonkoski）ら，1994）。Ｒｅｇ遺伝子のアップレギュレーション（例えば、肝細胞成長因子／分散因子による）は、β細胞増殖を誘導して細胞集団を増加させ、一方Ｒｅｇ遺伝子のダウンレギュレーション（例えば、ニコチンアミドによる）は、「プレ−β」細胞の成熟細胞への分化を誘導する。すなわち前駆／幹細胞の集団が成人膵管に残っており、特異的刺激に応答してインビボでこの集団の分化が喚起される。この作用は、現実には低レベルで連続的に起こる。インビトロで膵島新生を再現するための集中的な努力が払われたが、ほとんど成功するに至っていない。今や我々は初めて、培養した哺乳動物由来の膵島産生幹細胞（ＩＰＳＣ）の成長と拡張、さらには膵島様構造へのこれらの分化を可能にする条件を報告する。多くの方策（例えば、骨髄置換、免疫抑制薬および自己抗原免疫化）が、膵β 細胞に対する免疫的攻撃を阻止するための可能な手段として研究されてきた。しかしこれらのアプローチを有効にするためには、最終的に臨床疾患が発現する個人を同定する必要がある。しかし、大部分のβ細胞が既に破壊される点まで免疫的攻撃が進行しているため、患者が同定されるときには有効な介入治療を行うには遅すぎることが多い。β細胞が最終段階の分化した細胞であると考えられるため、生体が新しいβ細胞を再生する能力はほとんどなく、このため規則的なインスリン治療を一生余儀なくされると、以前は考えられていた。この問題を克服するための最近のアプローチ１つが、膵島細胞移植である。膵島細胞移植は、膵島が同種異系であり、そのため同種免疫応答を引き起こしうるという不利な点を有する。従って、ＩＤＤ患者から直接、機能性β細胞を含有するランゲルハンス島を成長させることには大きな利点がある。発明の要約本発明は、インスリン産生β細胞さらには他の型の膵島細胞を含有する機能性膵島を、膵島産生幹細胞（ＩＰＳＣ）のもとである多分化能幹細胞の長期培養物で成長させることができるという発見に関する。本発明の新規な方法は、ＩＰＳＣが成人個体の膵臓にも存在するという発見を利用する。この細胞は、好ましくは膵島細胞の供給源となる同じ哺乳動物種に由来する標準血清（同種血清）を補足した最少高アミノ酸栄養培地で培養することができる。細胞成長のいくつかの異なる段階により、ＩＰＳＣとそれに続く子孫が選択され、次にこれらは分化誘導されて、先行技術の偽膵島または偽膵組織とは区別しうる膵島様構造を形成する。第１段階では、膵臓からの細胞の初代培養物を低血清、低グルコース、高アミノ酸基本培地に入れる。次にこの培養物を数週間静置して、間質細胞の樹立させ、分化した細胞の大多数を死滅させる。一旦この間質細胞層が成熟すれば、同種標準血清とグルコースを補足した高アミノ酸培地で培養細胞に再度栄養補給することにより、細胞分化を開始させることができる。さらなる期間の成長後、インスリン、グルカゴン、ソマトスタチンおよび他の内分泌ホルモンを産生する細胞を含有する機能性膵島を、標準法を用いて回収することができる。膵由来非膵島細胞（膵管由来細胞）を使用して、β細胞を含む新しい膵島様構造を培養して成長できることは、これまで知られても推測されてもいなかった。インビトロで膵島様組織を成長させるための培養法の偶然の発見により、これまでは糖尿病研究に対して大きな長年にわたる障壁であったものが排除された。本明細書に記載される新規な方法および材料は、糖尿病の機作のさらなる理解を可能にする。さらに、培養ＩＰＳＣから膵島様構造を作成することが可能になって、今や糖尿病のいくつかの治療が初めて可能になった。例えば、本発明により、培養膵島および／または膵島細胞をインビボでインスリンを産生することができるため、患者のインスリン治療の必要性を制御または排除するための方法として、糖尿病個体からの新しい培養膵島を患者に体内移植することができる。すなわち、本発明はまた、ＩＤＤのインビボ治療のために哺乳動物種への体内移植のための、本発明のインビトロ成長膵島の使用に関する。本発明はまた、続いて起こる免疫的破壊に抵抗するための膵島細胞の遺伝子操作を非常に容易にする。例えば、培養膵島細胞は、破壊的免疫プロセスを阻害または防止するタンパク質またはペプチドを発現させるために形質転換することができる。他の有用なタンパク質またはペプチドも発現させることができる。さらに、ＧＡＤ、６４kD膵島細胞表面抗原（ペイトン（Payton）ら，1995）、または分化した膵細胞で同定された任意の他のマーカーのような特異的な自己抗原は、標準遺伝子ノックアウト法または選択法により排除して、自己免疫攻撃を受けないかまたは受けにくい分化した膵細胞を作成することができる。このような変異体またはノックアウト細胞株を作成する方法は、当該分野でよく知られており、例えば、米国特許第５，２８６，６３２号；米国特許第５，３２０，９６２号；米国特許第５，３４２，７６１号；およびＷＯ９０／１１３５４；ＷＯ９２／０３９１７；ＷＯ９３／０４１６９；ＷＯ９５／１７９１１（これらは全て本明細書に参考のため組み込まれる）に開示された相同組換え法がある。さらに、細胞が膵様構造に分化するときにヒト白血球抗原（ＨＬＡ）マーカーを発現しないように修飾された幹細胞を調製することにより、万能ドナー細胞が作成される（特に上記ＷＯ９５／１７９１１を参照のこと）。個体の膵細胞から機能する膵島のインビトロでの成長を可能にしたことが、主な技術上の革新であり、このことがＩＤＤを治療および研究するための新しい方策の使用を促進する。多分化能幹細胞が成人膵臓に存在するという発見により、細胞の供給源として胎児組織を使用する必要性が（排除することなく）回避される。本発明はまた、本明細書に記載される方法によりインビトロで作成される膵島細胞に関する。これらの細胞は、インビトロで培養される哺乳動物膵細胞懸濁物から作成され、機能性膵島細胞および膵島様組織構造を生み出す。本発明はさらに、膵幹細胞、すなわち、正常膵臓を作り上げる全ての異なる型の細胞および組織の形成を生じる前駆細胞のインビトロでの成長、増殖、および分化に関する。さらに、本発明は、正常膵臓で観察されるものと同様な機能的、形態的および組織学的特徴を示す膵様構造または「外膵臓（ecto-pancreas）」臓器を産生するための、インビトロ成長した膵幹細胞のインビボでの使用に関する。すなわち、インビトロ成長膵細胞からインビボで機能性「外膵臓」を産生できる能力を使用して、膵臓の損傷または破壊を引き起こす（または膵臓の損傷または破壊により引き起こされる）ことが知られている、広範な膵臓疾患を処置し、後退させまたは治療することができる。図面の簡単な説明図１Ａ〜１Ｄは、本発明の方法により成長した細胞を示す。図２は、本発明により成長した膵島様構造を示す。図３Ａ〜３Ｈは、３Ａからのインビトロの膵島様構造の発生の一連の段階を示し、これは本明細書に記載される培養条件下で、数週間培養後の少数の細胞を示す、これが生き延びて「発芽（bud）」し始め（図３Ｂ、写真の上右側の暗い構造）、そして分裂し（図３Ｃ、写真のいくつかの位置）、高度に器質化した構造（図３Ｄ〜３Ｈ）を形成するまでを示している。図４は、図３Ｇ〜３Ｈに示される構造の顕微鏡写真を示しており、その高度に器質化した形態を示す。図５は、膵島様構造横断面のＨ／Ｅ染色を示しており、中央にβ細胞そして周辺にグルカゴン産生細胞という、高度に器質化した形態が示される。図６Ａ〜６Ｆは、図３Ｈに示す膵島様構造が初代培養から採取されるまでの一連の顕微鏡写真を示す。図６Ｂでは、構造が崩壊し、細胞の大部分が死んでいるが、図６Ｃでは、新しい構造が発達する。図６Ｄでは、いくつかの新しい構造が形成されている。この一連の連続継代工程は、ＩＰＳＣが枯渇するまで、何回も反復することができる。新しい構造が形成される代わりに、図６Ｅのように構造が崩壊するこの事象において、図６Ｆに示されるように分化した細胞は増加する。クーン（Coon）ら（上記ＷＯ９４／２３５７２を参照のこと）のような研究者により作成されたのは、この型の増殖した分化細胞であると考えられる。図７は、インスリン治療中止後の対照および体内移植ＮＯＤマウスからのデータを示す。図８は、外膵臓を示す。略語と定義ＩＰＳＣは、膵島産生幹細胞（Islet Producing Stem Cells）である。ＩＰＳＣは、胎児または成人膵臓で発見される膵管上皮細胞（これは、本発明によりインビトロで膵島様構造になる能力を有する）由来の細胞（すなわち、これらは膵臓由来であるが、分化膵島細胞由来ではない）の小さな集団である。膵管上皮細胞がインビボで体内移植されると、膵様構造が形成される。膵様構造および膵管上皮細胞が、本来の膵臓の位置以外の位置にインビボで体内移植されると、膵様構造は外膵臓と呼ばれる。多分化能性の膵幹細胞は、ＩＰＳＣを生じる、膵臓で発見された細胞である。成熟した膵島細胞は、ＩＰＳＣから生じ、膵ホルモンを産生する分化した細胞である。膵島様構造、または若い膵島（young-islets）は、我々がＩＰＳＣから培養で生じることを発見した、細胞の高度に器質化した構造である（図３Ｈ、図４Ａおよび４Ｂ、および図５に示される横断面を参照のこと）。この構造は、ＩＰＳＣではない、解離した膵組織から培養した大部分の細胞が死んだ後、個々のＩＰＳＣにより形成された細胞増殖巣から「発芽」する。膵島様構造の体内移植により、最終分化が起こって充分に成熟した膵島細胞が生成する。発明の詳細な説明本発明により初めて、機能性ランゲルハンス島をインビトロで成長させることができる。本発明の方法により、インスリン、グルカゴン、ソマトスタチンまたは他の内分泌ホルモンを産生することができる培養細胞が生成する。他の有用なタンパク質も、例えば、膵島細胞を、目的のタンパク質をコードするＤＮＡにより形質転換することにより産生することができる。これらの機能性培養細胞を成長することが可能であることにより、当業者は以前には不可能であった方法を実施することができる。インビトロで作成された膵島様構造が、正常な新生でインビボで作成される膵島の特質のほとんどを有するため、以下の開示において、膵島様構造という用語は、「若い膵島」という用語と交換可能であるとして読むべきである。これらの構造の未成熟な性質によりインビボの体内移植が可能になり、急速な最終分化および血管形成が引き続いて起こり、治療を必要とする糖尿病またはプレ糖尿病哺乳動物のような受容者の、損傷を受けたか消耗した膵島に対する機能する置換物を提供する。本発明の方法では、哺乳動物の膵臓から、幹細胞を含む細胞の懸濁液を作成する。好ましくは、幹細胞は、プレ糖尿病哺乳動物の膵臓からのものである。しかし、既に糖尿病の徴候を示す哺乳動物からの膵島産生幹細胞（ＩＰＳＣ）を本発明に利用することができることも企図されている。細胞懸濁液は、標準法を用いて調製される。次に細胞懸濁液を、ＩＰＳＣの成長を促進する栄養培地で培養し、同時にＩＰＳＣ以外の分化または成熟した細胞の持続する成長を重度に消耗させる。好適な実施態様において、栄養培地は、高濃度のアミノ酸を含むものである。このような培地の１つは、クリックのＥＨＡＡ培地（Click's EHAA medium ）として知られており、当業者には公知であり、容易に利用可能なものである（ペック（Peck）とバッチ（Bach），1973、この目的のため参考のため本明細書に組み込まれる）。他の同等な栄養培地は、当業者ならば調製して使用することができる。このような培地に必要なことは、グルコースをほとんどまたは全然含まない（約１mM未満）ことと血清濃度が低い（約０．５％未満）ことである。好ましくは高アミノ酸濃度は、培養される種の細胞に必須であることが知られており、培養細胞の炭素源を提供する。さらに、少なくとも１つの基本的な脂質前駆体、好ましくはピルビン酸が提供される。これらの条件は、ほとんどの分化した細胞型には非常にストレスが多く、そのため生存できない。しかし驚くべきことに、再度栄養補給することなく膵組織からの細胞を長期培養する（約３週間）と、ＩＰＳＣは生き残り、長期培養後増殖し始める。次の培養段階では、膵島細胞の起源である同じ種の哺乳動物からの標準血清を補足した培地を利用する。すなわち、マウス膵島の場合は、培地に標準マウス血清を補足し、一方ヒト膵島細胞の場合は、培地に標準ヒト血清を補足する。標準血清の調製は、当業者に公知である。本発明の細胞培養法に使用される標準血清の濃度は、約０．５％〜約１０％の範囲であるが、マウスについては好ましくは約１％である。ヒト血清については、もっと高濃度が好ましく、例えば、約５％である。標準血清および約２．５〜１０mMグルコースを補足した栄養培地で調製した細胞懸濁液を、次に細胞成長を促進する条件下で、好ましくは約３５〜４０℃、および好ましくは約５％ＣＯ₂の雰囲気でインキュベートする。従ってこのインキュベーションは、当業者にはよく知られている標準法を使用して行われる。この間、間質または膵管上皮細胞は増殖して単層を確立し、これが最終的に膵島様構造を生成させる。細胞分化の開始は、クリックのＥＨＡＡ培地または上述のように標準血清を補足した同様な培地で培養物に栄養再補給することにより行われる。迅速な栄養再補給は、相当な細胞分化による広範な膵島細胞増殖巣および膵島様構造形成を誘導することが見い出された。我々は、栄養再補給培地に比較的高濃度のグルコース（約１０〜２５mM、好ましくは１６．７mM）を含有させることにより、細胞分化がさらに増強されることを見いだした。さらに、ＩＰＳＣの成長および分化を最適化し制御するために、Ｒｅｇ遺伝子をアップレギュレートする因子（例えば、肝細胞成長／分散因子）、および他の細胞成長因子（例えば、インスリン様成長因子、上皮成長因子、ケラチノサイト成長因子、繊維芽細胞成長因子、ニコチンアミド）、および細胞成長および分化を調節する他の因子を含むが、これらに限定されない、任意の多くの他の生物学的因子を培養物に加えることができることが企図される。任意のこれら種々の因子、またはその組合せを、異なる段階で、異なる接種密度で、およびＩＰＳＣ分化の経過において接種からの異なる時間で使用することにより、ＩＰＳＣ培養が最適化される。さらに、分化の経過においてＩＰＳＣ培養により産生される成長を増大させる因子は、単離し、配列決定し、クローン化し、大量に産生し、そしてＩＰＳＣ培養物に加えて、培養物の成長および分化を促進することができる。この関連因子は、分化の初期、中期および後期からのＩＰＳＣ培養上清を濃縮し、ＩＰＳＣの成長および分化を増大させるこれら濃縮物の能力について試験することにより同定される。正の効果は、正および負の上清の二次元ゲル電気泳動、精製および正の濃縮物にのみ存在するスポットのＮ末端配列決定およびこれに続くこれらの因子をコードする遺伝子のクローニングおよび発現による濃縮物中の分子組成に相関している。膵島様構造の細胞の組織学的観察を行うと、少なくとも３つの別々の細胞型が同定可能であり、対照マウスの膵島から調製される膵島細胞と類似しているようであった。これらの細胞増殖巣内で細胞分化が起こるのに要する時間は、栄養再補給の頻度が上昇するにつれ、低下した。我々は、膵島由来間質細胞と膵島細胞増殖巣を新しい培養フラスコに連続して移送することにより、膵島産生培養物を増殖させ拡張することができた。これは、本明細書に記載される方法（例えば、ＩＤＤの代謝の問題を後退させるための）に使用するために必要充分な数の膵島の生成を促進する。本発明によりインビトロで産生した膵島様構造および／または膵島細胞が、ＩＤＤを後退させることができるかどうかを決定するために、膵島様構造をＮＯＤマウスに体内移植した。膵島移植を受けたマウスは、インスリン依存性糖尿病の後退を示したが、一方未処理ＮＯＤマウスは、疾患の臨床的徴候を示した。さらに、体内移植の期間中、自己免疫の病的発生は観察されなかった。すなわち、本発明の膵島の体内移植は、ヒトを含む哺乳動物の糖尿病を治療するために使用することができる。本発明の好適な実施態様において、糖尿病の進行は、免疫的攻撃に関与する特異的な因子に抵抗性であるよう改変した自己由来膵島の体内再移植により、遅らせるか停止させることができる。例えば、膵島は、細胞毒性Ｔ細胞に抵抗性であるように改変することができる［例えば、デュリノビック（Durinovic）ら，199 4（糖尿病マウスのインスリン炎誘導性Ｔ細胞に類似した膵島特異的Ｔ細胞およびＴ細胞受容体配列を同定）；エリアス（Elias）とコーヘン（Cohen），1994（特異的糖尿病原性Ｔ細胞クローンの生成を止めることによる、ＮＯＤマウスの糖尿病治療に有用なペプチド配列を同定）；コンラッド（Conrad）ら，1994（膵島浸潤性Ｔ細胞の増殖を引き起こす膜結合型膵島細胞スーパー抗原を報告）；サンタマリア（Santamaria）ら，1994（糖尿病および膵島細胞破壊にはＢ７−１とＴＮＦαの同時発現が必要であることを報告；いずれの抗原も、免疫的攻撃に対する体内移植した膵島の抵抗性を改善するために、既知の方法により排除することができる）］。全膵島の長期培養が利用可能になれば、これはまた、β細胞の細胞認識、膵島浸潤の様式、およびβ細胞破壊の免疫機作を含む、ＩＤＤの病因の探究に使用することができる。さらに、本法は、膵島移植、自己由来膵島置換、および人工膵島の開発を促進する。本発明の方法によるこれらの細胞および膵島様構造の成長は、細胞分化および機能に関する重要な側面を学生に教え理解を深めるのに非常に有用である。本発明のさらなる実施態様において、ＩＰＳＣを生じる多分化能膵幹細胞が、哺乳動物から単離された膵細胞からインビトロで成長された。本発明の方法と共にこれらのインビトロで成長した細胞を用いた驚くべき発見は、内分泌および外分泌組織を形成するための細胞分化を含め、正常膵と同様な機能的、形態的および組織学的特性および特徴を示す臓器をインビボで成長させ産生することが可能なことである。本発明によりインビボで産生された外膵臓（体腔内の異常部位に存在する膵様臓器）は、大きな科学的発見であり、膵炎、膵臓癌およびＩＤＤを含むが、これらに限定されない多くの膵臓関連疾患を研究し、処置し、後退させるかまたは治療するための新規な手段を提供する。これは、病変組織の除去と本発明により作成された膵島様構造の体内移植により達成される。さらに、この膵島様構造は、本来の膵臓部位に体内移植することができる。本発明は、膵幹細胞の培養方法およびインビトロでの若い膵島の産生法を提供し、今やこの細胞型の成長および分化の研究が可能になった。従って、細胞培養、精製、単離および解析の全ての既知の方法を、いくつの型の細胞が膵細胞分化に関与するかという重要な問題に集中することができる。これらの方法は、蛍光活性化細胞ソーター解析（fluorescence activated cell sorting）（ＦＡＣＳ）、磁気ビーズ利用法（例えば、この目的に特別に適応させた市販されていて利用可能なダイナビーズ（DYNA BEADS）の使用におけるように）、磁気安定化流動床（magnetically stabilized fluidized beds）（ＭＳＦＢ、米国特許第５，４０９，８１３号を参照のこと）の使用、および任意の多くの当該分野で公知の方法を含むが、これらに限定されない。このプロセスの経路は、今や綿密に吟味できる。このプロセスの各段階に特異的なマーカー（細胞表面、細胞内、タンパク質またはｍＲＮＡ）の同定も、以下の標準法（これらに限定されない）の利用により現在は容易に同定可能である［膵幹細胞の成熟のプロセスを通して異なる、細胞、細胞表面マーカー、および細胞成分に対するモノクローナル抗体を含む抗体の産生；成熟および分化プロセスの異なる段階で膵細胞により発現される抗原に特異的に応答するＴリンパ球の産生（例えば、ウェグマン(Wegmann)ら，1993を参照のこと）；Ｔ細胞により認識される細胞表面マーカーの同定と除去（そのため分化したβ細胞が存在すれば破壊される（上記引用文献を参照のこと））；成熟の異なる段階をもたらすのに重要な因子および分化している細胞により産生される異なる因子の同定；成熟プロセスの異なる段階の細胞から単離される核酸のサブトラクティブハイブリダイゼーション（細胞分化の各側面で重要な遺伝子産物の正確な位置づけが可能になる）；分化したディスプレイＰＣＲ（differenti ated display PCR）（リアング(Liang)ら，1992を参照のこと）；任意にプライムしたＰＣＲ（arbitrarily primed PCR）（ウェルシュ（Welsh）ら，1992を参照のこと）；代表差解析ＰＣＲ（representational difference analysis PCR）（ＲＤＡ−ＰＣＲ）（リシツィン（Lisitsyn），1993を参照のこと）；適切な宿主生物への体内移植のための単細胞の膵前駆細胞またはその集団のカプセル化（これにより、他の型の前駆細胞または改変細胞の体内移植においてこのような方法が証明した利点を提供する）（アルトマン（Altman）ら，1994を参照のこと）；自己抗原遺伝子のノックアウト、または耐性増強遺伝子の挿入のような、自己免疫攻撃を受けにくい細胞を産生するための膵前駆細胞の遺伝子操作；改変細胞表面抗原を提供するかまたは細胞の内部環境に異なる生物化学的性質を提供する遺伝子を含む、ＩＰＳＣに挿入することができる他の遺伝子；これらは、グルコースに対する感受性を増大または低下させる酵素を発現する遺伝子、または成長因子に対する細胞の応答性を増大または低下させる遺伝子を含む；さらに、インスリン、グルカゴンまたはソマトスタチンの産生を増大または低下させる遺伝子も導入することができる；これらの型の修飾をＩＰＳＣに導入することができる例は、電気穿孔法、ウイルスベクター、トランスフェクションまたは当該分野で公知の他の任意の多くの方法を含む（例えば、ＷＯ９５／１７９１１；ＷＯ９３／０４１６９；ＷＯ９２／０３９１７；ＷＯ９０／１１３５４；米国特許第５，２８６，６３２号；ＷＯ９３／２２４４３；ＷＯ９４／１２６５０またはＷＯ９３／０９２２２を参照のこと；これらは全てこの目的のために参考のため組み込まれる）；例えば、ヒト白血球抗原が欠失しているかまたは修飾されている、万能ドナー（ノックアウト）細胞の産生（上記ＷＯ９５／１７９１１を参照のこと）］。このプロセスは、胎児組織の使用に依存しないため、ＩＤＤに罹った哺乳動物またはＩＤＤに罹るリスクのある哺乳動物から膵組織を除去して、膵島様構造をインビボで成長させ、その構造を個体に再度体内移植して、血中グルコースの変動に応答して生理学的に適切な量のインスリンを産生させることが可能である。前述の開示および以下の例証により、添付した請求の範囲は、この重要な発明により可能になることを当業者ならば認識するであろう、本発明の種々の実施態様および側面まで拡大されることを認識されたい。また、本明細書に提示したデータにより、単離した多分化能の幹／前駆細胞から膵島のインビトロ新生は可能であるが、１）ＩＰＳＣの生成を可能にする、膵管上皮細胞の間質、または「栄養（nurs e）」細胞単層の確立；２）ＩＰＳＣの周期的再生を促進し、またＩＰＳＣの早熟な分化を防止する、特異的培養条件による幹／前駆細胞増殖の誘導；３）α、βおよびδ細胞の拡張と分化、を含む、成長のいくつかの別個の段階を含むことが明らかになった。この工程は、培養栄養および成長因子の差が、異なる割合の種々の膵島細胞型を含有する膵島を生じさせるため、培養環境により指図される。β細胞をその最終成熟段階（すなわち、インスリン含有顆粒の形成およびグルコース応答性）に誘導するインビトロ条件の同定もまた、今や達成することができる。この最終分化を達成するインビボで存在する因子は、ＩＰＳＣ培養物への細胞抽出物または成長因子の添加により同定される。我々は、１０ヶ月まで初代ＩＰＳＣ培養物を維持し、二次培養物をさらに１４〜１６ヶ月維持したが、それぞれ拡張および分化して、膵島様構造を形成することができた。プレ糖尿病の成人からの機能性膵島を拡張させることができるということは、大きな技術上の革新であり、ＩＤＤの治癒に到達するための可能な新しい方策に焦点を当てているが、恐らくこの研究の最も重要な側面は、体内移植されるとＩＰＳＣおよび膵様構造を生じる多分化能幹／前駆細胞が、正常および（プレ）糖尿病の成人の両方の膵島に存在することが証明されたことである。この知見は、β細胞のＩＤＤ患者への移植のために胎児、同種または異種組織を使用する必要性；インビボで低血糖を後退させる新規な方策を開発する必要；新しく体内移植した膵島への免疫学的応答を研究する必要性；および／または免疫的攻撃に耐性の膵島を作成する必要性を排除する。本明細書に提示されるデータに基づき、発症後のＩ型ＩＤＤ患者の充分に証明されている緩解期は、幹細胞成長が誘導される時間であり、進行中の自己免疫反応により次には置換れるのみであると推測される。自己由来膵島の体内再移植は、免疫的攻撃に対して抵抗性であるように改変された細胞を必要とすると考えられるため、本明細書に開示された膵島幹細胞の同定と培養は、上述の遺伝子を改変する試みには必須である。驚くべきことに、本発明のインビトロで生成した膵島移植片は、本明細書で検討した期間にわたって免疫的攻撃の徴候を示さなかった。自己抗原が培養細胞上で発現しないか、または培養物がマクロファージを希釈するため自己抗原が存在できないか、またはこのような移植片が周辺の寛容性を誘導するかもしれない、という可能性がある。全膵島の長期培養を利用できることにより、β細胞の細胞認識、膵島浸潤の様式、およびβ細胞破壊の免疫機作を含む、ＩＤＤの病因の探究は促進される。さらに、本法は、膵島移植、自己由来膵島置換、人工膵島の開発を促進し、インスリン治療の必要性を低下させる。従って、本発明は、膵島様構造を産生するための膵島産生幹細胞（ＩＰＳＣ）のインビトロ成長方法を提供する。この方法は、哺乳動物種からの膵細胞を、約０．５％未満の標準血清と約１mM未満のグルコースを補足した基本栄養培地で培養し、ＩＰＳＣを少なくとも約３週間成長させ、そして培養ＩＰＳＣに、約０．５〜１０％の標準血清と約２．５mM〜１０mMのグルコースを補足した栄養培地を再度栄養補給することにより成熟膵島細胞への細胞分化を開始させることを含む。膵細胞は、ヒトおよびマウスを含む任意の哺乳動物からのものであってよく、血清は同じ種からのものである。培地は、好ましくは培養される種からの細胞の成長に必須の全てのアミノ酸を、培養物が枯渇しないことを保証する量で含有する。栄養再補給では、栄養再補給培地は、好ましくは、分化を刺激するのに充分な量でグルコースと血清を含有する。さらに、本方法により、一旦分化が開始すれば、好ましくは細胞は、しばしば栄養を再補給される（ほぼ週に１回）。この方法により、膵島細胞および膵島様組織構造が産生する。この方法はまた、内分泌ホルモン（インスリン、グルカゴンおよびソマトスタチンを含むが、これらに限定されない）の供給源を提供し、そしてこれらのホルモンは、ＩＰＳＣの培地から回収することができるか、または膵様構造を産生するための哺乳動物の組織への膵島様構造の体内移植により、哺乳動物に直接放出することができる。このような体内移植は、膵様臓器を産生するための膵島様構造を哺乳動物に体内移植することにより、哺乳動物の膵疾患を治療する方法を提供する。１つの実施態様において、本発明の膵島細胞または膵島様構造は、ＩＤＤ自己抗原またはＨＬＡマーカーを産生しないように遺伝子的に修飾されるため、インスリン以外のインスリン依存性糖尿病関連自己抗原を発現しないか、あるいは該幹細胞が該膵様臓器に分化するときヒト白血球抗原を発現しないように修飾される。さらに、膵幹細胞は、インスリン、グルカゴン、ソマトスタチンおよび他の膵産生因子透過性カプセルにカプセル化することができる。また、少なくとも１つの膵幹細胞をインビボで培養し、そしてこの少なくとも１つの幹細胞を誘導して膵様構造への分化を開始させることを含む、膵幹細胞の分化を解析する方法が提供される。本方法はまた、分化プロセスにおける多くの異なる段階に特異的なｍＲＮＡまたはタンパク質マーカーの同定を可能にする。タンパク質マーカーは、細胞表面で発現するか、分泌されるか、または細胞内にあってもよい。本発明の別の側面において、リガンド結合分子および選択的に膵幹細胞またはさらに分化した膵細胞に結合するリガンド結合分子を作成する方法が提供される。この方法は、未使用Ｂリンパ球またはＴリンパ球を同定されたタンパク質マーカーと接触させて、そのＢリンパ球またはＴリンパ球を培養して拡張させてリガンド結合分子を産生する細胞の集団を得ることを含む。すなわちこれらのリガンド結合分子は、膵幹細胞、または膵幹細胞と完全に分化した膵細胞との間の任意の段階の部分的に分化した膵細胞を、単離する方法を提供する。この方法は、分化の所定の状態の細胞により発現されるタンパク質マーカーに結合する特異的なリガンド結合分子で、上記細胞を含む細胞の集団から細胞を選択することを含む。あるいは、この方法は、細胞の表面には存在しないタンパク質マーカーに結合する特異的リガンド結合分子で、上記細胞を含む細胞の集団から他の細胞を選択して除去することを含む。さらに別の側面において、本発明は、ＩＤＤに罹患しているか、またはそのリスクのある哺乳動物を治療する方法であって、ａ．哺乳動物から膵組織を取り出し；ｂ．膵組織に存在する多分化能膵細胞をインビトロで培養して膵島様構造を生成させ；そしてｃ．該膵島様構造を該哺乳動物に体内移植することからなる、上記方法を提供する。本発明のさらなる側面において、ＩＰＳＣの未分化または分化状態のいずれかにおいてインスリン依存性糖尿病自己抗原を発現しないように修飾されたＩＰＳＣを提供する。好ましくは、修飾の結果として発現されない自己抗原は、ＧＡＤ、６４kD膵島細胞抗原、およびＨＬＡマーカーから選択される。本発明の方法の一部として、多分化能幹細胞または前駆細胞からの膵島のインビトロ新生の方法であって、ａ．ＩＰＳＣの生成を可能にする、膵管上皮細胞の間質、または「栄養（nurs e）」細胞単層を確立し；ｂ．ＩＰＳＣの周期的再生を促進し、またＩＰＳＣの未熟な分化も防止する、培養条件により、幹／前駆細胞増殖を誘導し；そしてｃ．α、βおよびδ細胞を含む膵島様構造を作成するために、ＩＰＳＣを拡張および分化させる、ことからなる、上記方法が提供される。好ましくは、培養で生成した膵島様構造は、膵島様構造の中央部のインスリン特異的色素で染色される大きな分化した細胞；周辺部のグルカゴン特異的色素で染色される小さい分化した細胞；および内部皮質部のどの内分泌ホルモン特異的な色素でも染色されない増殖中の未分化細胞、を特徴とする。この構造は、さらにタンパク質分解性酵素の存在下で機械的または他の手段によりこの構造を単細胞懸濁液に破壊し、次に個々の細胞を染色すると、グルカゴン特異的色素（α細胞）、インスリン特異的色素（β細胞）またはソマトスタチン特異的色素（δ細胞）のいずれかで染色される個々の細胞集団が観察されることを特徴とする。本発明による膵島のインビトロ新生の方法は、好ましくは、ａ．グルコースをほとんどまたは全く含まず、約０．５％未満の濃度の血清、そこから膵細胞を得た種の細胞にとって必須なアミノ酸、および脂質源を含む最少培地に、該培養物中の細胞の約９９％が死ぬまで、膵細胞を分散して静置し（第Ｉ段階）；ｂ．工程（ａ）の培養物に、約１〜１０mMグルコースおよび約０．５％〜１０％血清（しかし、毒性量より少ない量）を補足した最少培地で栄養を再補給し、急速な増殖が起こるまで週に１回程度栄養を再補給し；ｃ．工程（ｂ）の培養物に、０．５％〜１０％血清および約１０〜２５mMグルコースを補足した最少培地（場合により成長因子または細胞因子を添加して）で栄養を再補給し（第III段階）；、ｄ．膵島様構造を培地中に発芽させ；ｅ．膵島様構造を回収する、ことからなる。このプロセスは、インビトロで培養中の上皮細胞と初期の増殖している膵島様構造を連続して移送することにより数回反復することができる。本明細書で使用される「生長」という用語は、生存状態の細胞の維持のことをいい、細胞の増殖および／または分化を含んでもよいが、限定はされない。「増殖」という用語は、細胞分裂の結果として培養物中に存在する細胞の数の増加のことをいう。以下は、最良の態様を含む、本発明を実施するための方法を例示する例である。これらの例は、限定的と理解されてはならない。他に記載がなければ、全ての百分率は重量百分率であり、全ての溶媒混合物の割合は容量による。例１機能性ランゲルハンス島の培養膵島細胞の単細胞懸濁液は、別のところで詳細に記載（シー（Shieh）ら，199 3）されているように、１９〜２０週齢のプレ糖尿病のオスのＮＯＤ／ＵＦマウスの膵臓から単離した全膵島から調製した。典型的には、ＮＯＤコロニーの約２５％のオスのマウスは、この週齢で明白なＩＤＤになり、重篤なインスリン炎になる。膵島細胞は、０．２５％まで標準マウス血清（ＮＭＳ）を補足したグルコースを欠損またはグルコースを含まないクリックのＥＨＡＡ培地（ペック(Peck) とバッチ（Bach），1973，前述；ペック（Peck）とクリック（Click），1973）に再懸濁して、２５cm²組織培養フラスコに入れて、５％ＣＯ₂雰囲気で３７℃でインキュベートした。この段階で、２つの結果が考えられる：第１は、膵島浸潤性細胞が優勢であり、そのため免疫細胞株の樹立が可能であるか、または第２は、膵管上皮細胞（これらの培養物中ではしばしば間質細胞と呼ばれる）が優勢であり、そのため「栄養細胞」単層の成長が可能であること。間質様細胞単層の成長は、膵島浸潤性細胞が同時にしかし限定数で入れられると生じるようであった。浸潤性細胞の数を減少させて膵島細胞を増加させることは、勾配分離により達成することができる（ジャーペ（Jarpe）ら，1991，前述）。大多数（＞９９％）の元の細胞は、このインキュベート期間に死滅し、培養皿に付着した少数の上皮様細胞が残る（図１Ａおよび３Ａ、段階Ｉ）。間質細胞培養物は、４〜５週間静置（すなわち、栄養を再補給しない）すると、増殖して培養容器の全底表面を覆った（図３Ｃおよび３Ｄ）。培養物の分化と内分泌ホルモン発現は、培養物を、ＮＭＳと、グルコースまたはショ糖または他の糖等価物を含む糖類液を補足したクリックのＥＨＡＡ培地で栄養再補給することにより開始した。典型的には、糖類はグルコースである。グルコースの濃度は、約０．２５mM〜約１０mMの間であってよいが、典型的には約２．５mMである。約０．５％の標準ＮＯＤまたはＮＭＳ血清も好ましくは含められる。インビトロで細胞培養物を栄養再補給する方法は、当該分野で公知であり、典型的には約５０％〜約９０％の古い栄養培地を除去して、培養フラスコに新鮮培地を加えることからなる。急速な栄養再補給は、細胞分化を示す膵島成長の中心（本明細書では細胞増殖巣と呼ぶ）の増大する数の形成を誘導した。栄養再補給の割合は、例えば、およそ１週間の間隔であってよい。好ましくは、栄養再補給の割合は、５〜６日の間隔である。小さな丸い細胞が、ほとんど発芽しているように、上皮単層の上に現れた（図１Ｂおよび３Ｄ、段階II）。ピークの生成時には、５０〜１００もの細胞増殖巣が、１つの２５cm²（４in² ）組織培養フラスコに同時に発生した。個々の丸い細胞は、急速な増殖を受け、娘細胞は細胞クラスターを形成した（図１Ｃ）。急速な栄養再補給は、細胞クラスターの数、さらには各クラスター内の細胞の数の増大を誘導した。膵島様構造（段階III）の誘導は、標準マウス血清（０．５％）と高レベルのグルコース（１０mM〜２５mM、好ましくは約１６．７mMグルコース：図１Ｄおよび３Ｅ〜３Ｆを参照のこと）を補足したＥＨＡＡ培地の栄養再補給により増強された。細胞増殖および分化が進行するにつれ、膵島の器質化が起こり、膵島がその周りを被膜状物質で囲まれて現れることさえあった。成熟膵島（段階IV）は、強固にクラスター化した細胞からなる平滑なスフェロイドとして現れた（図３Ｆ〜３Ｈ）。この分化は、他の種のマウスからの血清よりもＮＯＤマウスからの血清が使用されるとき増強されるようであり、そしてＮＯＤマウス血清中のさらに高レベルのインスリン様成長因子（ＩＧＦ）、上皮成長因子（ＥＧＦ）および／または肝細胞成長因子（ＨＧＦ）が、この作用を引き起こしていると考えられる。膵島は一般に一定のサイズ（約１００〜１５０μ、図２、しかし２つのクラスターの融合により、普通の約２倍のサイズの膵島が生じた）まで成長し、次に間質層から分離して培地中に浮遊した。これら遊離して浮遊する膵島は、膵臓性膵島をインビボの供給源から単離して同様な条件下で培養すると観察されるのと同様に、４８〜７２時間以内に壊れる傾向があった。次にこのプロセスは連続して数回実施される（図６Ａ〜６Ｄおよび下記例５を参照のこと）。自然に分離またはパスツールピペットを用いて間質層から除去後に回収した膵島様構造は、培地で静かに洗浄して、逆流ピペット操作により破壊して単細胞懸濁液にした。単細胞懸濁液は、細胞遠心分離により調製し、次に一般的形態およびインスリン産生用に染色した。細胞増殖巣は、内分泌ホルモンのグルカゴン（ α細胞）、インスリン（β細胞）および／またはソマトスタチン（δ細胞）を産生する細胞を含んでいた。さらに、抗インスリン抗体により細胞の主な集団が陽性染色されたが、このことは、培養膵島に含まれる主な細胞型がインスリン産生 β細胞であることを示している。図１Ａ〜１Ｄは、培養プロセス中に発生する種々の細胞型を示す。図２は、本発明の方法による細胞のインビトロ培養後に得られた充分に発達した膵島を示す。例２ヒト膵島細胞の培養ヒト膵島細胞を培養するために、例１に記載された方法と同様な方法を利用した。本発明の方法は、細胞培養を開始するのに胎児細胞を使用する必要がないため、特に有利である。好適な実施態様において、ヒト細胞は、標準ヒト血清を補足したクリックのＥＨＡＡ培地（またはその同等物）に懸濁することができる。好ましくは、培地に使用される標準ヒト血清の濃度は、第Ｉ段階および第II段階ではそれぞれ約０．２５％〜１％であり、その後の段階では５％である。培養物は、好ましくは数週間栄養再補給することなく静置する必要がある（第Ｉ段階）。約４〜５週間培養後、培養物を、例１に記載されたように標準ヒト血清とグルコースを補足したクリックのＥＨＡＡ培地で栄養再補給することにより、細胞分化を開始させることができる。次に膵島様構造を回収して、例１に記載されたようにさらなる増殖のために単細胞懸濁液を調製することができる。例３インビトロで成長した膵島細胞の体内移植ＩＤＤの合併症を後退させる、インビトロで生成したこれらの膵島様構造の有効性を試験するために、ＮＯＤマウスの膵組織から本発明の方法によりインビトロで成長させた約１５０〜２００個の細胞増殖巣といくつかの間質細胞を、逆流ピペット操作により組織培養フラスコから取り出した。次に細胞を、毎日インスリン注射により維持している同系糖尿病ＮＯＤマウスの腎被膜下に体内移植した。体内移植は、腎被膜に皮下注射針で穿刺し、穿刺部位から薄い毛細管を腎臓に通し、そして膵島細胞増殖巣を直接皮質領域に注射することにより行った。この毛細管を慎重に引き抜き、穿刺部位を焼灼した。各体内移植マウスの切開部位は、皮膚が癒合の徴候を示すまでクランプで固定した。体内移植したマウスは、４日間完全な１日用量でインスリン注射で維持し、次に２日間１日用量の半量で維持し、その後マウスをさらなるインスリン治療から完全に引き離した。対照動物は、体内移植を受けない糖尿病ＮＯＤマウスとした。インスリン停止後８〜１４日以内に、対照ＮＯＤマウスは、嗜眠、呼吸困難、体重減少、血中グルコースレベルの上昇（４００〜８００mg/dl）、消耗症候群、創傷治癒不全および１８〜２８日以内の死亡を含む、明白な疾患の急激な発症を示した（図７）。体内移植したＮＯＤマウスは、約１８０〜２２０mg/dl（これは、マウスの正常範囲のわずかに上である）の血中グルコースレベルを維持し、活動性の上昇、外科部位および採血部位の急速な治癒を示し、呼吸困難は起こさず、そして組織学的検討のため体内移植の５５日後に屠殺するまで健康なままであった（図７）。脾臓内体内移植でも同様な観察結果が得られた。これらのデータは、体内移植されたインビボで生成した膵島が、実験の時間経過にわたって安定な血中グルコースレベルを維持するために必要なインスリンを提供するという考え方と一致する。例４外膵臓のインビボ作成例３に記載されたように膵島細胞を体内移植されたマウスの体内移植部位の組織学的試験により、インビトロで生成した膵島形成性幹細胞のさらなる特徴が明らかになった。腎臓の体内移植部位から「漏出」した体内移植された細胞は、さらなる増殖と分化を受けて、高度に組織化された外膵臓を形成した。最初に、この外膵臓組織は完全に、増殖する外分泌細胞からなっており、これが器質化して神経支配する血管により完成した外分泌膵臓になった。この外分泌膵臓は、発達して膵島様内分泌構造を形成した（図８を参照のこと）。すなわち、本発明の方法により産生されたインビトロ細胞培養物は、完全に新しい膵臓を再生することができる、多分化能膵幹細胞を含有する。外分泌および内分泌組織の両方を含有する膵臓の成長は、膵炎および膵臓癌を含む膵臓疾患の治療の新しい方法を提供する。例５ＩＰＳＣの長期増殖ＩＰＳＣの長期増殖（＞１年）は、少数の上皮細胞と少数の初期の増殖する膵島様構造を、連続して新しい培養フラスコに移送することにより達成された。１つの２５cm²組織培養フラスコからの細胞を、５〜１０個の１５０cm²組織培養フラスコに拡張することに成功した。興味深いことに、連続移送は、分離された膵島様構造と同様に、一様に膵島構造の「融解」を引き起こしたが、新しい間質単層が形成された（図６Ａ〜６Ｂ）。しかし、連続して移送した培養物は、初代培養物よりもはるかに早く、そして多数（培養物の平方インチ当たり２００〜２５０個の構造も、図６Ｃ〜６Ｄ）の新しい膵島を作成した。しかし結局、多数回の連続成長および膵島様構造の産生後、一般に、膵島様構造が「融解」後、分化した細胞のみが増殖する点に到達する（図６Ｅ〜６Ｆを参照のこと）。同じことは、ほとんどの分化した細胞を死滅させる条件下で、初代膵組織を初代培養物として成長させるならば、観察しうる膵島様構造形成が存在しない場合にも起こりうる。例６膵島様構造の解析未成熟な培養で生成した膵島様構造およびその切片（それぞれ図４および５に示される）の連続切片の顕微鏡写真は、再度成長の均質性を証明している。インスリンで弱く染色される大きな幾分分化した細胞は、膵島の中央部で観察される。グルカゴンで染色された小さな分化した細胞は、明らかに周辺部にあり、一方どの内分泌ホルモン抗体でも染色されなかった相当な数の未成熟で、増殖しそして未分化な細胞は、内部皮質部に存在していた。より正確にインビトロで成長した膵島内に存在する細胞表現型を決定するために、膵島様構造を、上皮単層から分離し、静かに培地で洗浄し、次に機械的手段（例えば、逆流ピペット操作など）により、０．２５％トリプシンのようなタンパク質分解性酵素の存在下で破壊して単細胞懸濁液にして回収した。細胞遠心分離により単細胞懸濁液のスライドを調製し、一般的形態または細胞含量用に染色した。Ｈ／Ｅ染色により、いくつかの形態的に別個の成熟および未成熟細胞型が観察される。さらに、個々の細胞集団は、抗グルカゴン（α細胞）、抗インスリン（β細胞）または抗ソマトスタチン（δ細胞）抗体のいずれかにより染色され、このことは、膵島様構造を生じる幹／前駆細胞の多分化能性を示している。これらの観察結果は、２つの点を強調する：第１に、内分泌ホルモンに関する弱い染色は、インビトロで生成した膵島が比較的未成熟なままであり、そのためインビボ体内移植によりさらに分化できることを示唆しており、そして第２に、＞１００％の細胞が内分泌ホルモン染色により説明されるという事実は、いくつかの細胞は、タイテルマン（Teitelman ）ら（タイテルマン(Teitelman)ら，1993，前述）により最近報告されたように、グルカゴンとインスリンの両方を同時に発現しているに違いないことを示している。例７膵細胞の限界希釈：単一の膵幹細胞のクローニング上述の方法により、膵組織は培地に分散される。分化した膵細胞のクローン産生のための単一の幹細胞を単離するために、分散した膵細胞を当該分野で公知の方法により限界希釈を行った。すなわち、例えば、分散試料中の細胞数/mL の初回評価後に、最終希釈物が、マイクロタイターウェルまたはこの型の希釈実験に適切な他の容器当たりせいぜい平均０．３個の細胞になるように、連続１０倍希釈を行う。次に細胞を、細胞増殖巣が発生し始めるまで、静置しておく。これらの細胞増殖巣は、多分化能性の単一の幹細胞またはＩＰＳＣに由来し、培養して、膵様構造を形成するための体内移植用の膵島様構造を得ることのできる幹細胞である。例８膵幹細胞分化の異なる段階に関連するマーカーの同定、および分化の各段階に特異的なリガンド結合分子の産生例７または類似した方法により産生した単離された幹細胞の細胞増殖巣を、例１または同様な方法による分化誘導の前と後の両方に解析する。幹細胞から完全単分化能の分化した膵細胞までの各段階の細胞を以下のように解析する：Ａ．核酸：未分化の前駆細胞および完全に分化した膵細胞を含む、分化の各段階で、ｍＲＮＡを単離する。このＲＮＡを使用して、当該分野で公知の標準法（ポリＡのような万能プライマーを用いるＰＣＲに依存する増幅法を含むが、これらに限定されない）（マニアティス（Maniatis）ら，1982）によりｃＤＮＡを作成する。各増幅物は、膵幹細胞発生の各段階で発現したメッセージのライブラリーを表す。従って、幹細胞には存在しないが、完全に分化した膵細胞には存在するメッセージは、各段階からのｃＤＮＡをハイブリダイズして、ハイブリダイズせずに残るメッセージを単離することにより同定される。同様に、分化したディスプレイＰＣＲ（differentiated display PCR）、任意にプライムしたＰＣＲ（arbitrarily primed PCR）またはＲＤＡ−ＰＣＲのような方法（上記を参照のこと）を使用することができる。このように、各段階に独特なメッセージは、分化の他の段階に存在するメッセージのサブトラクションにより同定される。また、この方法により、分化プロセスの各段階の遺伝子産物は、サブトラクトされたメッセージによりコードされる産物を発現することにより同定される。次に、これらの遺伝子産物を抗原として使用して当該分野で公知の方法により、モノクローナル抗体を含む抗体が産生される（ジェイ・ダブリュー・ゴーディング（Godi ng，J.W．），1986）。続いてこれらの抗体を使用して、膵細胞の細胞表面に発現されるマーカーに対する親和性に基づき、分化の所定の段階から細胞を単離する。さらに、分化した膵細胞の表面に発現される特異的マーカーの同定により、幹細胞において突然変異を指令するために同定された配列を用いる、米国特許第５，２８６，６３２号、前述；米国特許第５，３２０，９６２号；米国特許第５，３４２，７６１号；およびＷＯ９０／１１３５４；ＷＯ９２／０３９１７；ＷＯ９３／０４１６９；およびＷＯ９５／１７９１１に開示されるような方法による、部位特異的突然変異誘発による膵細胞のノックアウト株の産生が可能になる。ノックアウト遺伝子産物を産生しない変異体細胞の選択は、その産物が存在しない細胞のクローンを提供するために選択される特異的な遺伝子産物に対する抗体を使用して達成される。Ｂ．タンパク質マーカー：未分化前駆細胞および完全に分化した膵細胞を含む分化の各段階で、当該分野で公知の標準法により、全細胞および細胞の画分に対して抗体を作成する。このプロセスの特異的な例としては下記がある：ａ）ラット抗マウスＩＰＳＣｍＡｂの産生：ＩＰＳＣ特異的抗原に対して活性化したＢリンパ球の選択を増強するために、ラットを標準マウス組織で免疫し、次に免疫後７日目にシクロホスファミドで処理する。シクロホスファミドは、反応性Ｂ細胞を選択的に死滅させ、標準マウス抗原に非応答性のラットが残る。免疫後１４日目に、マウスＩＰＳＣ培養の種々の段階から回収した細胞により、ラットに再抗原投与を行う。この２回目の抗原投与の３〜４週間後、ＩＰＳＣ培養細胞でラットを３日間再免疫して、次にＳＰＯ／２ミエローマパートナーと融合させる。陽性に反応する抗体を選択してクローン化する。ｂ）マウス抗ヒトＩＰＳＣｍＡｂの産生：マウスを標準ヒト組織で免疫し、次にシクロホスファミド処理後にヒトＩＰＳＣ培養物の種々の段階からの細胞により再抗原投与する以外は、マウス抗ヒトＩＰＳＣｍＡｂは、ラット抗マウスｍＡｂの産生に関して上述したのと同じ方法を用いて調製する。ｃ）膵島細胞増殖の種々の分化段階の同定における抗ＩＰＳＣｍＡｂの使用：ＩＰＳＣ培養細胞に対して作成したｍＡｂを使用して、ＦＡＣＳまたは当該分野で公知の他の手段（例えば、磁気安定化流動床（下記を参照のこと）など）により、これらの試薬により規定される種々の細胞集団を選別する。選別された細胞集団は、それらの分化の段階（例えば、少し例を挙げると、インスリン、グルカゴン、ソマトスタチン、β−ガラクトシダーゼ、チロシンヒドロキシラーゼ、Ｒｅｇ遺伝子の同時発現がある）およびそれらの成長能（例えば、ＩＰＳＣ培養を開始させるそれらの能力）に関して試験する。細胞表面と膵島の新生に関与する細胞の分化のマークを規定する試薬は、この領域の研究において科学界のために有用である。さらに、このような試薬は、ＩＰＳＣ自体の単離（または濃縮）を大幅に促進する。ＩＰＳＣの単離により、ＩＤＤ患者への、または直接膵臓への全膵島の体内移植の代わりに、ＩＰＳＣを体内再移植することの有効性の試験が可能になり、余分な膵臓体内移植の必要を回避することができる。さらに、これらの抗体を使用して、膵細胞の細胞表面に発現されるマーカーに対する親和性に基づき、分化の任意の所定の段階から細胞を単離する。分化した膵細胞の表面に発現する特異的マーカーの同定により、膵細胞のノックアウト株の産生が可能になる。望ましくない遺伝子産物を産生しない細胞は、産物が存在しない細胞のクローンを選択するための抗体を使用することにより選択される。同様に、分化した膵細胞のＴ細胞認識および破壊に重要なマーカーは、分化プロセスにわたって、全膵細胞またはその細胞下画分により未使用Ｔ細胞を活性化することにより同定される。Ｔ細胞活性化に重要なマーカーの同定により、次に幹細胞を修飾して、これらのマークを除去し、こうして分化した状態で自己免疫破壊に抵抗性の細胞を産生させることが可能になる。例９分化の異なる段階の膵細胞の単離例８により同定されたマーカーおよびリガンド結合分子を使用して、当該分野で公知の方法により、膵幹細胞、または部分的もしくは完全に分化した膵細胞を単離することができる。従って、米国特許第５，０６１，６２０号；５，４３７，９９４号；５，３９９，４９３号に開示される造血幹細胞単離の方法（幹細胞マーカーに対する抗体を使用して、純粋な幹細胞の集団が単離される）は、参考のため全体が本明細書に組み込まれる。同様に、米国特許第５，４０９，８１３号に開示される、磁気安定化流動床（magnetically stabilized fluidized beds ）（ＭＳＦＢ）を用いる細胞混合物からの哺乳動物細胞分離の方法は、参考のため全体が本明細書に組み込まれる。膵幹細胞の分化の各段階で同定されるマーカーに対する抗体は、磁化可能なビーズに結合し、細胞は磁気安定化流動床を通り抜ける。磁性ビーズに結合した抗体に付着する細胞、または床を流れ抜ける細胞を単離する。特異的細胞の単離に関する当該分野で公知の任意の他の多くの方法をこの目的に使用することができる。これらの方法は、不要な細胞の補体による破壊；細胞のパニング；免疫親和性クロマトグラフィー；水簸法；および軟寒天単離法を含むが、これらに限定されない（アール・アイ・フレッシュリー（Freshrey，R.I. ），1988を参照）。例１０膵幹細胞の分化を引き起こす因子および幹細胞分化の異なる段階で産生される因子の解析例９の方法または同様の方法により単離された細胞を、例１の方法または同様の培養法により培養する。増殖培地に異なる因子を加えて、細胞に及ぼす分化誘導効果を観察することにより、分化を誘導するのに重要な因子を測定する。すなわち、種々の細胞からの調整培地を試験し、精製測定法として分化の誘導を使用して、膵幹細胞分化を引き起こす因子を単離する。グルコース、他の化合物、ホルモンおよび血清画分のような他の因子を、重要な分化誘導因子を単離するために同様に試験する。分化の異なる段階で産生される因子を、分化プロセスの各段階で細胞の調整培地から単離して解析する。これらの因子は、その幹細胞に及ぼすオートクリン効果および部分的に分化した幹細胞のさらなる分化に関して、同様に試験する。例１１自己抗体、ＣＴＬ抵抗性、およびＨＬＡ修飾した分化した膵細胞を産生するための膵幹細胞の遺伝子修飾例１または２により培養したかまたは例８により単離した膵幹細胞を、米国特許第５，２８６，６３２号、前述；米国特許第５，３２０，９６２号、前述；米国特許第５，３４２，７６１号、前述；およびＷＯ９０／１１３５４、前述；ＷＯ９２／０３９１７、前述；ＷＯ９３／０４１６９、前述；およびＷＯ９５／１７９１１、前述に開示されるような方法により、自己抗体およびＣＴＬ抵抗性で分化した膵細胞を作成するための、当該分野で公知の任意の方法により遺伝子修飾を行った。あるいは、抵抗性幹細胞の選択は、これらの細胞を、自己抗体またはＩＤＤ関連ＣＴＬまたはＩＤＤ特異的自己抗体で活性化したＣＴＬの存在下で培養することにより達成される。これらの方法の結果として、抗体またはＴリンパ球依存性機作による破壊に対して抵抗性の増大した細胞が作成される。このような細胞を、上記例３および４に開示されるように、適切な宿主の適切な組織に体内移植して、自己免疫プロセスによる破壊に対して抵抗性の増大した膵様構造を提供する。同様に、場合により反復プロセス（幹細胞を正常な同種リンパ球に暴露して、生存細胞を選択する）により、膵幹細胞および分化した細胞のヒト白血球抗原プロフィールを修飾する。あるいは、部位特異的突然変異誘発法を使用して、幹細胞または分化した細胞の表面からＨＬＡマーカーを除去して、こうして作成されたかまたは膵様構造から単離された新しい幹細胞を使用して、このような体内移植を必要とする受容者哺乳動物に体内移植する。具体例において、ネオマイシン耐性遺伝子ｎｅｏを有するアデノ関連ウイルス（ＡＡＶ）ベクター系が使用される。ＡＡＶを使用して、真核生物細胞をトランスフェクションすることができる（ラフェース（Laface），1988）。さらに、フレオマイシン耐性遺伝子を有するｐＢＡＢＥ−ｂｌｅｏシャトルベクター系が使用される（モーゲンスタイン（Morgenstein），1990）。このシャトルベクターは、細菌由来遺伝子によりヒト細胞を形質転換するために使用することができる。ａ）ＩＰＳＣのトランスフェクション：培養ＩＰＳＣを、電気穿孔によりｐＢＡＢＥ−２−ｂｌｅｏベクターのレトロウイルスセグメントで、または直接感染によりＡＡＶ−ｎｅｏベクターで、トランスフェクションする。確立したＩＰＳＣ培養物からの接着細胞を、Ｃ−ＰＥＧ緩衝液（ＥＤＴＡと高グルコースを補足したリン酸緩衝化生理食塩水）を用いて組織培養フラスコから静かに取り出す。これらの細胞をＤＭＥＭおよびレトロウイルスストックを含有する１０％ラット胎児血清に懸濁し、ｐＢＡＢＥ−ｂｌｅｏの場合には電気穿孔に付す（電気穿孔は、直接ウイルス感染に比較してかなり苛酷な操作であるため、電気穿孔に付される細胞は生存率について検査する。ＩＰＳＣ培養細胞の生存率は、それらの生体染色を排除する能力、および例えば、グリコサミノグリカンおよびヒドロペルオキシドのような傷害関連細胞産物の分析により測定される）。再培養した細胞をそれぞれフレオマイシンまたはネオマイシンに対する耐性について選択する。ｂ）形質転換細胞中のプロウイルスＤＮＡの同定：ネオマイシンまたはフレオマイシン耐性培養細胞を、適切なトランスフェクション性のウイルスＤＮＡの存在について試験する。Ｃ−ＰＥＧ緩衝液を用いて培養フラスコから細胞を取り出し、プロテイナーゼＫを含有する細胞溶解緩衝液で消化する。ＤＮＡをフェノール／クロロホルム抽出し、次にエタノール／酢酸ナトリウム中で沈殿させる。ネステッドＰＣＲを用いてプロウイルスＤＮＡを同定する。最初の反応には、適切な耐性遺伝子の全読み取り枠を増幅するＰＣＲプライマーを使用する。２回目のＰＣＲ反応には、ＰＣＲ産物を鋳型として使用する。既知の塩基対サイズの内部配列を増幅する、選択された内部５’および３’プライマーを使用する。最終ＰＣＲ産物は、電気泳動および／またはサザンブロットのプローブ結合後にアガロースゲルの臭化エチジウム染色により検出される。ｃ）形質転換の安定性：形質転換の長期安定性は、トランスフェクションされた細胞の長期成長培養物を維持して、上述のように、プロウイルスＤＮＡの存在に関してこれらを定期的に試験することにより測定される。これらの試験により、標的細胞としてＩＰＳＣを用いるトランスフェクション法の有効性と再現性に関する情報が提供される。さらには、これらは、ＩＤＤ患者を治療する際に形質転換したＩＰＳＣを使用するための第２の基礎を確立する。例１２インビトロ生成した膵島のカプセル化および哺乳動物への体内移植細胞のカプセル化の方法は、当該分野で公知である（例えば、アルトマン（Al tman）ら，1984，Trans．Am．Soc．Art．Organs，30: 382-386（参考のため本明細書に組み込まれる）、ここでは、ヒトインスリノーマが選択的に透過性マクロカプセルに封入される）。従って、場合により例１１により遺伝子修飾された、単離されたインビトロで作成された膵島、または例３および４により産生された膵用構造は、インスリン、グルカゴンおよびソマトスタチン透過性カプセル材料にカプセル化される。好ましくはこのようなカプセル材料は、低アレルゲン性であり、容易かつ安定に標的組織に入れられ、そして分化した細胞の破壊なしに機能性物質への分化が保証されるように、体内移植された構造をさらに保護する。本明細書に記載された実施例と実施態様は、例示目的のみにあるものであり、これに照らしての種々の修飾または変化が当業者に示唆されるが、それらは本出願および添付される請求の範囲の精神と範囲に含まれるものである。 DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION In vitro growth of functional islets of Langerhans and their use in vivo Background of the Invention Diabetes is a major public health problem. National Diabetes Advisory Council (National D iabetes Advisory Board's 19th National Long-Term Plan to Fight Diabetes 1987 Report (1987 Report of The National Long-Range Plan to Combat Diabet es), it is known that 6 million people in the United States have diabetes. And another 5 million have not yet been diagnosed but have diabetes. Every year, 500 More than 2,000 new cases of diabetes have been identified. In 1984, diabetes The disease is a direct cause of death of 35,000 Americans, and an additional 9 It contributed to 5,000 deaths. Eye complications of diabetes are a major source of new cases of legal blindness in Americans aged 20 to 74 years It is a factor. Risk of lower limb amputation is 15 times greater in people with diabetes than people without diabetes Good. Kidney disease is a serious complication often associated with diabetes. Treatment of end-stage renal disease Approximately 30% of all new patients in the United States who are receiving treatment have diabetes. sugar People with urine are also at increased risk for periodontal disease. Periodontal infection progresses rapidly and loses teeth Rather, it reduces metabolic function. Diabetic women may be at risk of serious complications of pregnancy. The disc is expensive. Recent statistics show that infants with mothers with diabetes have a mortality rate of about 7%. It is suggested that there is. The economic burden of diabetes is clearly enormous. Every year, diabetes or its complications Patients spend 24 million patient days at the hospital. Can be attributed to diabetes A conservative estimate of all-year expenses is at least $ 24 billion (US National Diabetes Association estimates, 1988); however Additional medical costs are often due to specific complications of diabetes rather than diabetes itself Therefore, the overall economic impact of this diabetes is even greater. Diabetes helps the body properly maintain and use carbohydrates, fats, and proteins Is a chronic complex metabolic disease that makes it impossible to do so. Diabetes is a variety of genetics Caused by deficiencies in insulin production or its utilization It is characterized by high levels of blood glucose caused. Many cases of diabetes Are divided into two clinical types: type I, juvenile-onset, and type II. That is, adult-onset type. Type I diabetes is often called insulin-dependent diabetes (Insulin-dependent diabetes). Dependent Diabetes) or IDD. Each type has a different prognosis, treatment, And have an etiology. About 5-10% of diabetics have IDD. IDD is usually pancreatic Langerhan Insulin production is partly due to the destruction of insulin-producing beta cells in the islets. Or completely incapable of doing so. IDD patients can help control disease Without daily insulin injections, you will die. Accumulating evidence suggesting that type I IDD has a causative pathology for autoimmunity Until the mid-1970s, little progress was made in elucidating the etiology of diabetes Was. IDD has a genetically susceptible constitution in humans What happens from a progressive autoimmune response that selectively destroys beta-producing beta cells is now Generally accepted. IDD autoimmunity against β cells is humoral (fly Baekkeskov et al., 1982; Baekkeskov et al., 1990; Reddy et al., 1988; Pontesilli et al., 1987) and Vesicle-mediated (Reddy et al., 1988, supra; Pontesilli et al.) 1987, supra; Wang et al., 1987). Humoral immunity β-cell membrane (anti-69 kD and islet cell surface autoantibodies), β-cell content (anti-carboxy Cipeptidase A₁, Anti-64 kD and / or anti-GAD autoantibodies), and / or Or the appearance of autoantibodies to β-cell secretion products (anti-insulin). blood Qing does not carry IDD, but since anti-β cell autoantibodies occur at a very young age, It raises the issue of environmental triggers possibly involving mimetics of antigens. IDD The presence of cell-mediated immunoreactivity in the natural history of Evidence of inflammatory lesions on the island. Insulitis with inflammatory / immune cell infiltration Histologically clearly visible, T and B lymphocytes, monocytes and nutrients It has been proven to contain many cell types, including L'Arkiller cells (Signor ( Signore et al., 1989; Jarpe et al., 1991). The mode of human IDD Adoptive transfer of adoptive immune cells using non-obese diabetic (NOD) mice nsfer) confirms a major role for self-aggressive T lymphocytes in the pathogenesis of IDD. (Bendelac et al., 1987; Miller et al., 1988; c). Hanafusa et al., 1988; Bendelac et al., 1988). Unfortunately At the same time, the mechanisms underlying the destruction of pancreatic beta cells remain unknown. Recent efforts to culture pancreatic cells, including the efforts reported in the following publications: Are differentiated cells or partially grown in culture as monolayers or aggregates He has concentrated on the culture of differentiated cells. In contrast to these reports, the present invention Cellular organization very similar to creating normal islets in vivo during life Disclosed are methods and structures in which island-like structures having the form and extent of are created. Gazdar et al. (1980) established from a transplantable rat pancreatic cell tumor Open continuous, clonal, insulin- and somatostatin-secreting cell lines Indicated. However, the disclosed cells were tumorigenic and not pluripotent. Brothers, A.J. (WO93 / 00441, 1993) ) Disclosed hormone-secreting cells, including pancreatic cells, maintained in long-term culture. But, Cultured cells, in contrast to pluripotent stem cells, are differentiated and recreate pancreatic-like structures. Early selection for a hormonal phenotype, as opposed to their ability to produce You. Korsgren and colleagues describe their ability to induce differentiation of porcine fetal pancreatic cells. Disclosed in vitro screening of compounds. The present invention relates to the use of fetal tissue. Not dependent. JH Nielsen (WO86 / 01530,19) 86) disclosed a method for expanding fully or partially differentiated beta cells. But, This disclosure relied on fetal tissue as a source of islet cells to grow in culture . McEboy et al. (1982) developed a method for tissue culture of rat fetal islets. As shown, the effect of serum on the maintenance, growth and differentiation of synthetic media for A, B, and D cells The effects were compared. Again, the source of islet cells is fetal tissue. (EP 0363125, 1990) describe the proliferation of pancreatic endocrine cells. Was disclosed. This method relies on the use of fetal pancreatic tissue and Synthetic structures containing gen must be prepared by implantation in these cells for implantation. I have to. Aggregates of the cultured cells thus created are subjected to blood It takes 60-90 days to affect the course level and normal blood glucose (eu It takes 110-120 days to approach glycemia). In contrast, books The invention allows the recipient to more quickly respond to the recipient's glycemic state during transplantation. No collagen or other synthetic means is required to maintain the organisation to be effective. To provide islet-like structures grown in vitro. Coon et al. (WO 94/23572, 1994) describe an expanded non-shaped form of pancreatic cells. A method for making a transformed cell culture has been disclosed. The aggregated cultured cells are then transplanted into the body Embedded in a collagen matrix, which is described by Zayas et al. It has drawbacks associated with the structure of the present invention, and the difference from the structure made by the present invention is noted. . Despite previous reports, the present invention provides that functional islet-like structures Containing cells expressing lucagon and / or somatostatin, By transplanting it into diabetic mammals (after stopping insulin therapy) It is amazing how well you can stay healthy. This is a recent tertiary Pancreatic islets of Langerhans with original imaging (Brelje et al., 1989) Conventional immunofluorescence histology (Lacey et al., 1957; Baum et al., 196). 2; Dubois, 1975; Pelletier et al., 1975; Larson ( Larsson et al., 1975), respond quickly to changes in blood glucose levels. Remarkable structure and cellular organization of islets for a well-controlled response This is because it became clear. Creating such structures in vitro It is possible that the development of islets in the pancreas, especially during embryogenesis, is mainly due to pancreatic ductal epithelial cells (Pictet et al., 1972): Is undifferentiated progenitor cells associated with non-islet cells? Considering that it will be started from the beginning, it could not be predicted. Pancreatic duct epithelial cells Proliferate rapidly and then differentiate into various islet-associated cell populations (Hellerström (Hel lerstrom), 1984; Weir et al., 1990; Teitelman et al. 1993; Beattie et al., 1994). The resulting islets are insulin-producing beta cells The vesicles form a spheroid structure that forms a core surrounded by a non-β cell envelope. Is done. Glucagon producing α cells (when the islets originate from the dorsal lobe), or Pancreatic peptide-producing PP cells (if the islets originate from the ventral lobe) are mostly in the outer cortex Exist (Brelje et al., Supra, 1989; Weir et al., Supra, 1990). Somatostatin-producing delta cells, which are essentially dendritic, reside in the medial cortex. Spreading the pseudopodia and distributing nerves to α (or PP) cells and β cells. This These spheroid islet structures separate from the epithelium of the pancreatic duct and are short-circuited to the surrounding exocrine tissues. Tend to travel a long distance. Angiogenesis-induced angiogenesis leads to mature islets Direct arteriolar blood flow occurs (Bonner-Weir et al., 1982; Thailand Teitelman et al., 1988; Menger et al., 1994). Blood gluco Angiogenesis can further stimulate β-cell proliferation, It can act to increase the number. Similarly, neurogenesis involves sympathetic, parasympathetic Induces islet innervation by and peptidergic neurons (Weir ) Et al., Sentence above, 1990). Therefore, we created functional islet-like structures in vitro It is very surprising that this can then be implanted into the body to create a pancreatic-like structure It should be. Unfortunately, cell organization of the islets is associated with type I insulin-dependent diabetes mellitus (IDD). Can be destroyed in diseases such as The autoimmune response can cause specific destruction of insulin-producing β cells (D Eisenbarth, 1986; Leiter et al., 1987). Beta cells Because most of the cells are thought to be the last stage of differentiation, The ability to produce cells is thought to be limited, and once many beta cells are destroyed Then, regular insulin treatment is forced for a lifetime. However, in laboratory animals Can increase or decrease the beta cell population to maintain normal blood glucose levels (Bonner-Weir et al., 1994). This formability is Can occur by two pathways of islet growth: first, neogenesis, the differentiation of pancreatic ductal epithelium Growth of new islets, and secondly, hypertrophy, that is, Extension by duplication. During embryogenesis, the beta cell population first begins to differentiate from new cells Although expanding, the differentiated β cells replicate in the late fetal life. And the reproduction is after birth Seems to be the main means of expansion, but the ability to replicate appears to diminish with age . Adult islet cells are stimuli known to initiate neonatal islet cell growth , For example, respond to glucose, growth hormone and some peptide growth factors (Swenne, 1992; Herras Hellerstrom et al., 1988; Bonner-Weir et al., 1989; Marynissen et al., 1993; Neilsen et al., 1992; Brelje et al., 1993). These observations indicate that β-cell growth is The low bell suggests that functional requirements can be met. For example, pregnancy Or, in chronic obesity, the beta cell population increases significantly, Beta cell population rapidly decreases due to increased beta cell apoptotic death due to severe decline This is reversible. It is generally accepted that all types of pancreatic endocrine cells differentiate from the same pancreatic ductal epithelium. (Pictet et al., 1972, supra; Hellersturm). trom), 1984, supra; Weir et al., 1990, supra; Teitelm an) et al., 1993, supra), but it is unclear whether they are derived from common stem / progenitor cells. It is clear. In the normal adult pancreas, about 0.01% of cells in the pancreatic duct epithelium To express and stimulate blast hormones to form new islets that are indicative of neogenesis Can undergo morphological changes. This new birth is experimentally induced by soybean trypsin inhibition. Bitter diet (Weaver et al., 1985); Feron-γ (Gu et al., 1993), partial pancreatectomy (Bonner-Wire -Weir et al., 1993), packaging of the head of the pancreas with cellophane (Rosenberg). nberg) et al., 1992), specific growth factors (Otonkoski et al., 1994). And clinical IDD. Recently, the neogenesis of islet β cells As a regulatory element in the subtracted cDNA line of regenerated rat islets Attention has been drawn to the Reg gene identified in the Bally (Watanabe (Watanabe) be) et al., 1994; Othonkoski et al., 1994). Up Reg gene Regulation (eg, by hepatocyte growth factor / dispersion factor) To increase the cell population while down-regulating the Reg gene ( (Eg, by nicotinamide) induces the differentiation of “pre-β” cells into mature cells. Lead. That is, a population of progenitor / stem cells remains in the adult pancreatic duct and responds to specific stimuli. In response, differentiation of this population is triggered in vivo. This effect is actually Occur continuously at low levels. Intensive efforts have been made to replicate islet neogenesis in vitro, but most have Has not been successful. Now we are the first to produce islets from cultured mammals Enables the growth and expansion of stem cells (IPSCs) and their differentiation into islet-like structures Report conditions for Many strategies (eg, bone marrow replacement, immunosuppressive drugs and autoantigen immunization) have It has been studied as a possible means to prevent an immune attack on cells. I However, in order for these approaches to be effective, People need to be identified. However, immunization until the point where most beta cells are already destroyed Effective interventions when patients are identified Is often too late. Beta cells are thought to be the last stage of differentiated cells Organisms have little ability to regenerate new β-cells, It was previously thought that surin treatment would be forced into life. Overcome this problem One recent approach to this is islet cell transplantation. Pancreatic islet cell transplantation Have the disadvantage that they are allogeneic and can therefore cause an allogeneic immune response. I do. Therefore, islets of Langerhans containing functional beta cells directly from IDD patients There are great benefits to growing. Summary of the Invention The present invention relates to functionalities containing insulin-producing beta cells as well as other types of islet cells. Long-term cultures of pluripotent stem cells, which are the source of islet-producing stem cells (IPSCs) About the discovery that it can be grown on. The novel method of the present invention addresses the discovery that IPSCs are also present in the pancreas of adult individuals. Use. The cells are preferably derived from the same mammalian species that is a source of islet cells. Cultivation in minimal amino acid nutrient medium supplemented with incoming standard serum (homogeneous serum) Can be. IPSC followed by progeny by several different stages of cell growth Are then induced to differentiate into pseudo-islets or pseudo-pancreatic tissue of the prior art. Form distinct islet-like structures. In the first stage, primary culture of cells from the pancreas Place in low serum, low glucose, high amino acid basal medium. The culture is then Allow to stand for a week to establish stromal cells and kill the majority of differentiated cells. Once As this stromal cell layer matures, allogeneic standard serum and high amino acids supplemented with glucose Cell differentiation can be initiated by re-feeding cultured cells with medium. Wear. After an additional period of growth, insulin, glucagon, somatostatin and Functional islets containing cells that produce other endocrine hormones are recovered using standard methods. Can be collected. Using pancreatic-derived non-islet cells (pancreatic duct-derived cells), new islet-like structures containing β cells It has never been known or assumed that cultures can be cultured and grown. With the accidental discovery of a culture method for growing islet-like tissue in vitro, Eliminated a long-standing barrier to diabetes research. Book The novel methods and materials described herein allow a better understanding of the mechanism of diabetes. Make it work. Furthermore, it became possible to create pancreatic islet-like structures from cultured IPSC For the first time, some treatments for diabetes are now possible. For example, according to the present invention, Cultured islets and / or islet cells can produce insulin in vivo As a way to control or eliminate the need for insulin therapy in patients New cultured pancreatic islets from diabetic individuals can be transplanted into the patient. Sand Thus, the present invention also provides a method for in vivo transplantation into mammalian species for in vivo treatment of IDD. The use of the in vitro-grown islets of the invention. The present invention also provides for genetic modification of islet cells to resist subsequent immune destruction. Makes the work very easy. For example, cultured islet cells inhibit disruptive immune processes. Or transforming to express a protein or peptide to be prevented. it can. Other useful proteins or peptides can also be expressed. Further GAD, 64 kD islet cell surface antigen (Payton et al., 1995), or Specific autoantigens, such as any other marker identified in differentiated pancreatic cells, Exclude by standard gene knockout or selection methods and avoid autoimmune attacks Differentiated pancreatic cells can be created that are difficult or susceptible. Such a mutation Methods for making somatic or knockout cell lines are well known in the art, For example, US Pat. No. 5,286,632; US Pat. No. 5,320,962; US Patent No. 5,342,761; and WO 90/11354; WO 92/0. 3917; WO93 / 04169; WO95 / 17911 (all of which are described herein). Which is incorporated herein by reference). In addition, cells Does not express human leukocyte antigen (HLA) marker when differentiated into pancreatic-like structures Preparation of universally modified stem cells creates universal donor cells See WO 95/17911 above). Mainly, it enabled in vitro growth of functional islets from individual pancreatic cells. Technological innovation, which is a new way to treat and study IDD Promote the use of measures. The discovery that pluripotent stem cells are present in the adult pancreas, Eliminates (without elimination) the need to use fetal tissue as a source of cells You. The present invention also relates to islets produced in vitro by the methods described herein. For cells. These cells are a mammalian pancreatic cell suspension cultured in vitro. And produces functional islet cells and islet-like tissue structures. The invention further relates to pancreatic stem cells, i.e. all the different types that make up the normal pancreas In vitro growth, proliferation, and proliferation of progenitor cells resulting in the formation of cells and tissues Regarding differentiation. Further, the present invention provides functional, similar to that observed in normal pancreas, Pancreatic-like structure or "ecto-pancreas" with morphological and histological features In vivo use of pancreatic stem cells grown in vitro to produce organs You. In other words, functional "external pancreas" can be produced in vivo from pancreatic cells grown in vitro. Ability to cause pancreatic damage or destruction (or Or caused by widespread pancreatic disease Can be retracted or treated. BRIEF DESCRIPTION OF THE FIGURES 1A-1D show cells grown by the method of the present invention. FIG. 2 shows an islet-like structure grown according to the present invention. 3A-3H show a series of steps in the development of islet-like structures in vitro from 3A. This indicates a small number of cells after several weeks of culture under the culture conditions described herein. This survives and begins to "bud" (Fig. Structure) and split (Fig. 3C, several locations in the picture), highly organized structure (FIGS. 3D to 3H) are shown. FIG. 4 shows a micrograph of the structure shown in FIGS. The organic form is shown. FIG. 5 shows H / E staining of a cross section of the islet-like structure, with β cells in the center and peripheral cells. A highly organized form of glucagon producing cells is shown on the side. FIGS. 6A to 6F show one example of the islet-like structure shown in FIG. A photomicrograph of a run is shown. In FIG. 6B, the structure has collapsed and most of the cells are dead However, in FIG. 6C, a new structure develops. In FIG. 6D, some new structures are Is formed. This series of successive passage steps is repeated many times until IPSC is depleted. Can be repeated. Instead of forming a new structure, the structure as shown in FIG. In this event, where cells collapse, differentiated cells increase as shown in FIG. 6F. . Researchers such as Coon et al. (See WO 94/23572, supra). It is believed that this type of proliferated differentiated cell was created by. FIG. 7 shows data from control and implanted NOD mice after discontinuation of insulin treatment. Data. FIG. 8 shows the outer pancreas. Abbreviations and definitions IPSC is Islet Producing Stem Cells. IPS C is a pancreatic duct epithelial cell found in the fetal or adult pancreas (which is Cells that have the ability to become islet-like structures in vitro (ie, they (Derived from the pancreas, but not from differentiated islet cells). Pancreatic duct epithelium When the vesicle is implanted in vivo, a pancreatic-like structure is formed. Pancreatic-like structure and pancreatic duct When epithelial cells are implanted in vivo in a location other than the original location of the pancreas, The structure is called the outer pancreas. Pluripotent pancreatic stem cells are cells found in the pancreas that give rise to IPSCs. Mature islet cells are differentiated cells that arise from IPSCs and produce pancreatic hormones It is. The islet-like structures, or young-islets, are It is a highly organized structure of cells that was found to occur (FIGS. 3H, 4A and 4A). And 4B, and the cross-section shown in FIG. 5). This structure is the IPSC Not most cultivated cells from dissociated pancreatic tissue die after individual IPS "Sprout" from the cell foci formed by C. By islet-like transplantation into the body Terminal differentiation takes place to produce fully mature islet cells. Detailed description of the invention Growing functional islets of Langerhans in vitro for the first time according to the invention Can be. According to the method of the present invention, insulin, glucagon, somatostatin or Produces cultured cells that can produce other endocrine hormones. Other useful Proteins are also used, for example, by transforming pancreatic islet cells with DNA encoding the protein of interest. Can be produced by transformation. These functional cultured cells were Being able to do so allows those skilled in the art to implement methods that were not possible before. Can be applied. Islet-like structures created in vitro can In the following disclosure, pancreatic islets have most of the characteristics of islets created in vivo. The term island-like structure should be read as interchangeable with the term “young islet”. It is. The immature nature of these structures allows for in vivo transplantation Diabetes, followed by rapid terminal differentiation and angiogenesis, requiring treatment Or against a damaged or depleted islet of a recipient such as a pre-diabetic mammal. To provide a functional replacement. In the method of the present invention, a suspension of cells containing stem cells is prepared from the pancreas of a mammal. You. Preferably, the stem cells are from the pancreas of a pre-diabetic mammal. Only To produce pancreatic islet-producing stem cells (IPSCs) from mammals already showing signs of diabetes It is also contemplated that it can be used explicitly. Cell suspensions are prepared using standard methods It is prepared by The cell suspension is then cultured in a nutrient medium that promotes IPSC growth. At the same time severely depletes the sustained growth of differentiated or mature cells other than IPSCs Let In a preferred embodiment, the nutrient medium contains a high concentration of amino acids. You. One such medium is Click's EHAA medium. ), Known to those skilled in the art, and readily available ( Peck and Bach, 1973, incorporated herein by reference for this purpose. Incorporated). Other equivalent nutrient media may be prepared and used by those skilled in the art. it can. All that is required of such a medium is that it contains little or no glucose Absent (Less than about 1 mM) and low serum concentration (less than about 0.5%). Preferably It is known that high amino acid concentrations are essential for Provides a carbon source for feeder cells. Further, at least one basic lipid precursor, Preferably, pyruvic acid is provided. These conditions affect most differentiated cell types Is very stressful and cannot survive. But surprisingly, Long-term culture of cells from pancreatic tissue without supplementation (about 3 weeks) SC survive and begin to proliferate after long-term culture. In the next culture stage, the origin of the islet cells Utilizing a medium supplemented with standard serum from a mammal of the same species. That is, In the case of mouse islets, the medium is supplemented with standard mouse serum, while in the case of human islet cells Supplements the medium with standard human serum. Preparation of standard sera is known to those skilled in the art. The concentration of the standard serum used in the cell culture method of the present invention ranges from about 0.5% to about 10%. Boxes, but preferably about 1% for mice. For human serum, Higher concentrations are preferred, for example, about 5%. Cells prepared in a nutrient medium supplemented with standard serum and about 2.5 to 10 mM glucose The cell suspension is then incubated under conditions that promote cell growth, preferably at about 35-40 ° C. And preferably about 5% CO 2_TwoIncubate in the atmosphere. Therefore this in Cuvulation is performed using standard methods well known to those skilled in the art. This During that time, stromal or pancreatic ductal epithelial cells proliferate and establish a monolayer, which eventually becomes islet-like Generate the structure. Initiation of cell differentiation can be performed by clicking EHAA medium or as described above. It is performed by re-feeding the culture in a similar medium supplemented with standard serum as described above. You. Rapid re-supplementation results in extensive pancreatic islet cell foci and pancreas with substantial cell differentiation It was found to induce island-like structure formation. We have relatively low resupplementation media High concentrations of glucose (about 10-25 mM, preferably 16.7 mM) And that cell differentiation is further enhanced. In addition, IPSC Up-regulate Reg genes to optimize and control growth and differentiation Factors (eg, hepatocyte growth / dispersion factors), and other cell growth factors (eg, , Insulin-like growth factor, epidermal growth factor, keratinocyte growth factor, fibroblast Growth factors, nicotinamide) and other factors that regulate cell growth and differentiation Add any number of other biological agents to the culture, including but not limited to To It is contemplated that it can. Any of these various factors, or combinations thereof, At different stages, at different inoculation densities, and in the course of IPSC differentiation. Use at these different times optimizes the IPSC culture. further, Factors that increase the growth produced by IPSC culture during the course of differentiation are simply Isolated, sequenced, cloned, produced in large quantities, and added to IPSC cultures. Thus, growth and differentiation of the culture can be promoted. This related factor is The IPSC culture supernatant from the early, middle and late stages is concentrated and the growth and Identified by testing for the ability of these concentrates to increase differentiation. Positive effects are associated with two-dimensional gel electrophoresis of positive and negative supernatants, purification and positive concentrates. N-terminal sequencing of only existing spots and subsequent encoding of these factors Cloning and expression of correlated genes correlate with molecular composition in concentrates . Histological observation of islet-like cells reveals that at least three distinct cell types Identifiable and similar to islet cells prepared from control mouse islets Met. The time required for cell differentiation to occur within these cell foci is As the frequency of replenishment increased, it declined. We continuously transferred islet-derived stromal cells and islet cell foci into new culture flasks. The transfer allowed the islet production culture to grow and expand. this is The methods described herein (eg, to reverse IDD metabolism problems) )) To promote the generation of a sufficient number of islets to be used. The islet-like structures and / or islet cells produced in vitro according to the present invention may comprise To determine if DD can be retracted, NOD islet-like structures Transplanted into mice. Mice receiving islet transplantation have insulin-dependent diabetes Untreated NOD mice showed regression, while clinical signs of disease were shown. Further Furthermore, no pathological development of autoimmunity was observed during the transplantation. That is, the book The islet transplantation of the invention is used to treat diabetes in mammals, including humans. Can be In a preferred embodiment of the invention, the progression of diabetes is characterized by an immune attack. Intracorporeal re-transplantation of autologous islets modified to be resistant to extraneous factors delays Can be turned off or stopped. For example, islets are resistant to cytotoxic T cells. [Eg, Durinovic et al., 199 4 (Islet-specific T cells similar to insulitis-induced T cells in diabetic mice and And T cell receptor sequences); Elias and Cohen, 1994 ( Sugars in NOD mice by stopping generation of specific diabetogenic T cell clones Conrad et al., 1994 (islet identified a peptide sequence useful for treating urine) Reported membrane-bound islet cell superantigen causing proliferation of infiltrating T cells); Santamaria et al., 1994 (B7-1 and T for diabetes and islet cell destruction). Reported that co-expression of NFα was required; both antigens responded to immune challenge Elimination by known methods to improve the resistance of transplanted islets Can be done)]. If long-term culture of whole islets becomes available, this will also Pathogenesis of IDD, including vesicle recognition, mode of islet infiltration, and immune mechanisms of beta cell destruction Can be used for inquiry. In addition, the method includes islet transplantation, autologous islet replacement, And promote the development of artificial islets. These cells and islets according to the method of the invention The growth of like structures teaches and understands key aspects of cell differentiation and function. It is very useful for In a further embodiment of the invention, the pluripotent pancreatic stem cells that give rise to IPSC are: It was grown in vitro from pancreatic cells isolated from mammals. The method of the present invention A surprising finding using these in vitro grown cells is that endocrine and extracellular Functional, morphological, and similar to normal pancreas, including cell differentiation to form secretory tissue Grow and produce in vivo organs that exhibit histological properties and characteristics That is what. External pancreas produced in vivo according to the present invention (in an abnormal site in a body cavity) Pancreatic organs present) is a major scientific finding, and has been linked to pancreatitis, pancreatic cancer and IDD. Study, treat, and reverse many pancreatic-related diseases, including but not limited to Or provide new means for treating. This involves removing the diseased tissue and This is achieved by implanting the islet-like structure created according to the present invention in the body. Furthermore, this pancreas The islet-like structures can be implanted into the original pancreas site. The present invention provides a method for culturing pancreatic stem cells and a method for producing young pancreatic islets in vitro Now it is possible to study the growth and differentiation of this cell type. Therefore, cell culture All types of cells, pancreatic cell differentiation, To Focus on the key issues of involvement. These methods use fluorescent Fluorescence activated cell sorting (FACS) Use of magnetic beads (eg, commercially available and specifically adapted for this purpose) Magnetically stabilized fluidized bed (as in the use of possible DYNA BEADS) (Magnetically stabilized fluidized beds) (MSFB, US Patent No. 5,40) 9,813) and any of a number of methods known in the art. Including, but not limited to. The path of this process can now be scrutinized You. Markers specific to each step of the process (cell surface, intracellular, protein Or mRNA) can also be identified using the following standard methods (but not limited to these): Are now readily identifiable [different through the process of pancreatic stem cell maturation, Antibodies, including monoclonal antibodies to cells, cell surface markers, and cellular components Production; antigens expressed by pancreatic cells at different stages of the maturation and differentiation process Production of T lymphocytes that respond specifically (see, eg, Wegmann et al., 1993). See) and identification and removal of cell surface markers recognized by T cells (see If any differentiated β cells are present, they are destroyed (see the above cited references)); Factors important in effecting different stages of ripening and produced by differentiating cells Identification of different factors; of nucleic acids isolated from cells at different stages of the maturation process Subtractive hybridization (gene production important in various aspects of cell differentiation) Products can be accurately positioned); differentiated display PCR (differenti ated display PCR) (see Liang et al., 1992); Arbitrarily primed PCR (see Welsh et al., 1992). ); Representative difference analysis PCR (RDA-PCR) (see Lisitsyn, 1993); Encapsulation of unicellular pancreatic progenitor cells or populations for implantation into living organisms ( This allows for such a method in the transplantation of other types of progenitor cells or modified cells. Provides the proven benefits of the law) (see Altman et al., 1994). Self-knockout of self-antigen genes or insertion of resistance-enhancing genes Genetic manipulation of pancreatic progenitor cells to produce cells that are less susceptible to immune attack; modified cells Biochemistry providing surface antigens or different to the internal environment of cells Other genes that can be inserted into IPSCs, including genes that provide genetic properties; These are genes that express enzymes that increase or decrease sensitivity to glucose. Genes that increase or decrease the responsiveness of cells to genes or growth factors. Or increase the production of insulin, glucagon or somatostatin or Reduced genes can also be introduced; these types of modifications can be introduced into IPSCs Examples that can be performed are electroporation, viral vectors, transfection Or any of many other methods known in the art (eg, WO 95/17 911; WO93 / 04169; WO92 / 03917; WO90 / 11354 U.S. Patent No. 5,286,632; WO93 / 22443; WO94 / 126. 50 or WO 93/09222; all of which are suitable for this purpose. Incorporated for reference); for example, human leukocyte antigen is missing or Production of decorated universal donor (knockout) cells (see WO 95/179 above) 11)]]. Since this process does not depend on the use of fetal tissue, I Removing pancreatic tissue from mammals with DD or at risk for IDD Leaving the islet-like structure to grow in vivo and re-implanting the structure into an individual Produce physiologically relevant amounts of insulin in response to changes in blood glucose It is possible to Based on the foregoing disclosure and the following illustrations, the appended claims disclose this important invention. Various embodiments of the present invention will recognize that those skilled in the art will recognize that Recognize that it is expanded to the way and side. In addition, the data presented herein suggest that isolated pluripotent stem / progenitor cells Although it is possible to in vitro regenerate pancreatic islets, 1) The stroma of pancreatic ductal epithelial cells, or "nurs", which allows the generation of IPSCs e) establishment of a cell monolayer; 2) promote periodic regeneration of IPSCs and prevent premature differentiation of IPSCs; Induction of stem / progenitor cell proliferation by specific culture conditions; 3) expansion and differentiation of α, β and δ cells, And several distinct stages of growth, including: This process Pancreatic containing different proportions of different islet cell types, differing in culture nutrition and growth factors island Is dictated by the culture environment to produce β cells are brought to their final maturation stage That is, in vivo induced insulin-containing granule formation and glucose responsiveness) Identification of toro conditions can now also be achieved. Achieve this terminal differentiation Factors present ex vivo are the addition of cell extracts or growth factors to IPSC cultures Is identified by We maintain primary IPSC cultures for up to 10 months and add a further 14 Maintained for ~ 16 months, but each expanded and differentiated to form islet-like structures. I was able to. Can expand functional islets from adults with pre-diabetes Is a major technological innovation and a possible new approach to reaching the healing of IDDs. Although the focus is on new strategies, perhaps the most important aspect of this research is Pluripotent stem / progenitor cells that give rise to IPSCs and pancreatic-like structures It has been shown to be present in both islets of (pre) diabetic adults. This Have found that fetal, allogeneic or xenogeneic tissues can be used for transplantation of β-cells into IDD patients. Need to develop new strategies to reverse hypoglycemia in vivo; Need to study immunological response to transplanted islets; and / or Eliminates the need to create islets that are resistant to attack. Based on the data presented herein, sufficient proof of type I IDD patients after onset The remission phase is the time during which stem cell growth is induced and the ongoing autoimmune response It is presumed that, in response, it is only replaced next. Retransplantation of autologous islets into the body May need cells that have been modified to be resistant to immune attack Therefore, the identification and culture of islet stem cells disclosed herein modify the above-described genes. It's essential for changing attempts. Surprisingly, the in vitro generated islet grafts of the present invention have been identified herein. There were no signs of an immune attack over the period considered. Autoantigen on cultured cells Not expressed in cells or autoantigen present due to culture diluting macrophages May not, or such grafts may induce peripheral tolerance, There is a possibility. Being able to use long-term culture of whole pancreatic islets, Exploring the pathogenesis of IDD, including recognition, mode of islet infiltration, and immunological mechanisms of beta cell destruction Research is promoted. In addition, this method provides for islet transplantation, autologous islet replacement, Promotes onset and reduces the need for insulin therapy. Accordingly, the present invention provides an islet-producing stem cell (IPSC) for producing islet-like structures. Provided in vitro. The method comprises isolating pancreatic cells from a mammalian species by about Culture in basal nutrient medium supplemented with less than 0.5% standard serum and less than about 1 mM glucose Cultivate, grow the IPSC for at least about 3 weeks, and add about 0. Nutrient medium supplemented with 5-10% standard serum and about 2.5 mM to 10 mM glucose Initiates cell differentiation into mature islet cells by re-feeding . The pancreatic cells can be from any mammal, including humans and mice, Serum is from the same species. The medium preferably contains cells from the species to be cultured. Contains all amino acids essential for growth in amounts that guarantee that the culture is not depleted You. For re-feeding, the re-feeding medium is preferably sufficient to stimulate differentiation. Contains large amounts of glucose and serum. Furthermore, once the differentiation is started by this method, If so, preferably the cells are often re-fed (approximately once a week). this The method produces islet cells and islet-like tissue structures. The method also includes endocrine hormones (insulin, glucagon and somatosta Sources including, but not limited to, Mon can be recovered from the culture medium of IPSC or produce pancreatic-like structures Release directly into mammals by implanting islet-like structures into mammalian tissues for can do. Such transplantation involves islet-like structures to produce pancreatic organs. A method for treating pancreatic disease in mammals by implanting the structure into mammals Offer. In one embodiment, the islet cells or islet-like structures of the invention have ID Genetically modified to not produce D autoantigen or HLA marker Does not or does not express insulin-dependent diabetes-related autoantigen other than insulin Or the stem cells do not express human leukocyte antigen when differentiated into the pancreatic-like organ. Decorated. In addition, pancreatic stem cells contain insulin, glucagon, somatostatin and And other pancreatic factor-permeable capsules. Also, less Culturing at least one pancreatic stem cell in vivo, and replacing the at least one stem cell with Analyze pancreatic stem cell differentiation, including inducing differentiation to initiate pancreatic-like structures A method is provided. The method also highlights many different stages in the differentiation process. Different Identification of specific mRNA or protein markers. Protein marker The protein may be expressed on the cell surface, secreted, or intracellular. Book In another aspect of the invention, a ligand binding molecule and optionally a pancreatic stem cell or Provided are methods for making a ligand binding molecule that binds to a pancreatic cell that has been differentiated into a cell. This Is a protein marker that identifies unused B lymphocytes or T lymphocytes Culturing and expanding the B or T lymphocytes by contacting Obtaining a population of cells that produce the binding molecule. That is, these ligand binding The combined molecule may be derived from pancreatic stem cells or any stage between pancreatic stem cells and fully differentiated pancreatic cells. Methods for isolating partially differentiated pancreatic cells of the hierarchy are provided. This method of differentiation Specific ligase that binds to a protein marker expressed by a cell in a given state Selecting a cell from a population of cells comprising said cell with a cell binding molecule. Ah Alternatively, the method binds to a protein marker that is not present on the surface of the cell Select other cells from a population of cells, including the cells, with a specific ligand binding molecule Including removing. In yet another aspect, the invention relates to a method for treating IDD. Or treating a mammal at or at risk thereof, comprising: a. Removing pancreatic tissue from the mammal; b. Pluripotent pancreatic cells present in pancreatic tissue are cultured in vitro to produce islet-like structures Let it run; and c. Implanting the islet-like structure in the mammal Or a method as described above. In a further aspect of the invention, either the undifferentiated or differentiated state of the IPSC Modified to Not Express Insulin-Dependent Diabetes Autoantigen in Mice Provide C. Preferably, the autoantigen not expressed as a result of the modification is GAD , 64 kD islet cell antigen, and HLA markers. As part of the method of the present invention, the incorporation of islets from pluripotent stem or progenitor cells A method of in vitro renewal, a. The stroma of pancreatic ductal epithelial cells, or "nurs", allows the generation of IPSCs. e) establishing a cell monolayer; b. Promotes periodic regeneration of IPSCs and also prevents immature differentiation of IPSCs, Culturing conditions induce stem / progenitor cell proliferation; and c. Extending IPSC to create islet-like structures containing α, β and δ cells And differentiate, Provided above. Preferably, islet-like structures produced in culture Is a large, differentiated cell stained with an insulin-specific dye in the center of the islet-like structure. Vesicles; small differentiated cells stained with a glucagon-specific dye in the periphery; and inside Proliferating undifferentiated cells that are not stained with any endocrine hormone-specific pigment in the cortical cortex Vesicles. This structure is also mechanical in the presence of proteolytic enzymes. Or break this structure into a single cell suspension by other means, then stain individual cells Then, glucagon specific dye (α cells), insulin specific dye (β cells), etc. Or individual cell collection stained with either somatostatin-specific dye (δ cells) The group is observed. The method of in vitro neogenesis of islets according to the invention ,Preferably, a. Serum with little or no glucose and a concentration of less than about 0.5%, Pancreatic cells derived therefrom contain essential amino acids and lipid sources for the cells Pancreatic cells are dispersed and left to stand in a small medium until about 99% of the cells in the culture have died ( Stage I); b. Add about 1 to 10 mM glucose and about 0.5% to 10% to the culture of step (a). Re-supplement the nutrients with minimal medium supplemented with% serum (but less than the toxic amount) Resupply nutrition about once a week until rapid growth occurs; c. Add 0.5% -10% serum and about 10-25 mM glue to the culture of step (b). In minimal medium supplemented with course (optionally with growth or cellular factors) Resupply nutrition (stage III); d. Germinating islet-like structures in the medium; e. Recovering islet-like structures, Consisting of This process involves in vitro growth of epithelial cells and early growing islet-like It can be repeated several times by transferring the structure continuously. The term "growth" as used herein refers to the maintenance of a living cell. And may include, but is not limited to, cell growth and / or differentiation. "Increase The term `` proliferation '' refers to the increase in the number of cells present in a culture as a result of cell division. That means. The following is an example illustrating a method for practicing the invention, including the best mode. . These examples should not be understood as limiting. Unless otherwise stated, all Percentages are weight percentages and all solvent mixture proportions are by volume.Example 1 Culture of functional islets of Langerhans Single cell suspensions of islet cells are described in detail elsewhere (Shieh et al., 199). 3) As noted, 19-20 week old pre-diabetic male NOD / UF mice Prepared from whole pancreatic islets isolated from the pancreatic pancreas. Typically, about 2 of the NOD colonies 5% of male mice develop overt IDD at this age and develop severe insulinitis Become. Pancreatic islet cells were purified from glucose supplemented with standard mouse serum (NMS) to 0.25%. Click EHAA medium lacking glucose or glucose-free (Peck And Bach, 1973, supra; Peck and Click, 1973) Resuspend in 25cm^Two5% CO in tissue culture flask_TwoAt 37 ° C in an atmosphere Incubated. At this stage, two consequences are possible: first, islet infiltration Sex cells predominate, allowing the establishment of immune cell lines, or Are predominantly pancreatic ductal epithelial cells (often called stromal cells in these cultures) Yes, so that the growth of "vegetative cell" monolayers is possible. Formation of stromal-like cell monolayer Length appeared to occur when islet-infiltrating cells were placed simultaneously but in a limited number . Increasing islet cells by reducing the number of infiltrating cells is achieved by gradient separation (Jarpe et al., 1991, supra). Majority (> 99% ) Original cells are killed during this incubation period and a few Skin-like cells remain (FIGS. 1A and 3A, stage I). Stromal cell culture for 4-5 weeks When allowed to stand (ie, without resupplying nutrients), it grows and fills the entire bottom surface of the culture Covered (FIGS. 3C and 3D). Differentiation of the culture and endocrine hormone expression can be achieved by culturing the culture with NMS, glucose or Is a click EHAA medium supplemented with a saccharide solution containing sucrose or other sugar equivalents Started by re-feeding. Typically, the saccharide is glucose. G The concentration of Lucose may be between about 0.25 mM to about 10 mM, but typically about 2.5 mM. About 0.5% of standard NOD or NMS serum is also preferably included. It is. Methods for re-feeding cell cultures in vitro are known in the art. , Typically about 50% to about 90% of the old nutrient medium is removed and a fresh culture flask is added. It consists of adding fresh medium. Rapid re-supplementation of pancreatic islet growth It induced the formation of an increasing number of centers (referred to herein as cell foci). Nutrition The rate of replenishment may be, for example, approximately one week apart. Preferably, nutrition The replenishment rate is 5-6 day intervals. Small round cells are almost germinating As above (FIGS. 1B and 3D, stage II). At the time of peak generation, as many as 50-100 foci of cell growth are in one 25 cm^Two(4in^Two ) Simultaneously developed in tissue culture flask. Individual round cells undergo rapid proliferation, Daughter cells formed cell clusters (FIG. 1C). Rapid re-supplementation is It induced an increase in the number of stars, as well as the number of cells in each cluster. Islet-like structure The induction of (Step III) is based on standard mouse serum (0.5%) and high levels of glucose ( 10 mM to 25 mM, preferably about 16.7 mM glucose: FIGS. 1D and 3E-3F. ) Supplemented with EHAA medium supplemented with EHAA. Cell proliferation As the breeding and differentiation progresses, the organization of the islets occurs and the islets become Even appearing surrounded by substances. Mature pancreatic islets (stage IV) It appeared as a smooth spheroid consisting of transformed cells (FIGS. 3F-3H). This Of sera from NOD mice rather than sera from mice of other species At higher levels, and even higher levels of NO in NOD mouse serum. Surin-like growth factor (IGF), epidermal growth factor (EGF) and / or hepatocytes Growth factor (HGF) is thought to be causing this effect. Islets are common To a certain size (approx. 100-150μ, Fig. 2, but for fusion of two clusters) More than twice the size of normal islets) and then separate from the stromal layer And suspended in the medium. These free floating islets transform pancreatic islets in vivo 48 to 48, as observed when isolated from a source of and cultured under similar conditions. There was a tendency to break within 72 hours. This process is then performed several times in a row. (See FIGS. 6A-6D and Example 5 below). Pancreas recovered after natural separation or removal from the stromal layer using a Pasteur pipette The island-like structures are gently washed with medium, disrupted by reverse flow pipetting, and suspended in single cells. It became a suspension. Single cell suspensions are prepared by cytocentrifugation and then And stained for insulin production. Cell growth foci are glucagon (endocrine hormone) produce α cells), insulin (β cells) and / or somatostatin (δ cells) Contains living cells. In addition, anti-insulin antibodies allow the main population of cells to be positive The primary cell type in cultured islets is insulin production This indicates that it is a β cell. 1A-1D show the species generated during the culture process. Each cell type is shown. FIG. 2 shows the results obtained after in vitro culture of cells according to the method of the invention. Shows well-developed pancreatic islets.Example 2 Culture of human islet cells To culture human islet cells, a method similar to that described in Example 1 was utilized. Was. The method of the present invention does not require the use of fetal cells to initiate cell culture. This is particularly advantageous. In a preferred embodiment, the human cells are supplemented with standard human serum. The added click can be suspended in EHAA medium (or equivalent). Preferably, the concentration of the standard human serum used in the medium is determined in stages I and II Are about 0.25% to 1%, respectively, and 5% in the subsequent stages. Culture Should be allowed to stand, preferably without re-nutrition for several weeks (Phase I) . After culturing for about 4 to 5 weeks, the culture is ligated with standard human serum as described in Example 1. By re-feeding with Click EHAA medium supplemented with the course, Can be started. Next, the islet-like structures were recovered and described in Example 1. Thus, single cell suspensions can be prepared for further growth.Example 3 In vivo transplantation of pancreatic islet cells grown in vitro The presence of these in vitro-generated islet-like structures reverses the complications of IDD In order to test the efficacy, pancreatic tissue of NOD mice was Approximately 150-200 cell foci and some stromal cells grown in b Removed from tissue culture flask by pipetting. The cells are then Allogeneic diabetic NOD mice maintained by phosphorus injection were implanted under the renal capsule . In the case of an internal transplant, the kidney capsule is punctured with a hypodermic needle and a thin capillary tube is inserted into the kidney from the puncture site. Through And injection of islet cell foci directly into the cortical area. This hair The tubule was carefully withdrawn and the puncture site cauterized. The incision site of each implanted mouse Clamped until skin showed signs of healing. 4 days after implanted mice Insulin injection at full daily dose for the next 2 days then half daily dose for 2 days Mice were then completely separated from further insulin treatment. Control animals And a diabetic NOD mouse that did not undergo internal transplantation. Within 8-14 days after insulin cessation, control NOD mice had lethargy, dyspnea, Weight loss, elevated blood glucose levels (400-800 mg / dl), wasting syndrome Sudden onset of overt illnesses, including impaired wound healing and death within 18-28 days (FIG. 7). About 180-220 mg / dl (NOD mouse) Which is slightly above the normal range of mice) Indicates increased activity, rapid healing of surgical and blood collection sites, and dyspnea occurs. No, and remain healthy until sacrificed 55 days after transplantation for histological examination (FIG. 7). Similar observations were obtained with spleen internal transplantation. These de The data indicate that the in vivo-generated islets implanted in vivo Provides insulin needed to maintain stable blood glucose levels Agree with the idea.Example 4 In Vivo Creation of the External Pancreas Set of implanted sites in mice implanted with islet cells as described in Example 3 Histological studies reveal further characteristics of in vitro generated islet-forming stem cells It became clear. Transplanted cells that “leak” from the kidney transplant site are Following further growth and differentiation, they formed a highly organized outer pancreas. First, this The outer pancreatic tissue is completely composed of proliferating exocrine cells, which are organized The exocrine pancreas was completed by innervating blood vessels. This exocrine pancreas develops To form islet-like endocrine structures (see FIG. 8). That is, the present invention In vitro cell culture produced by the method can regenerate a completely new pancreas Containing pluripotent pancreatic stem cells. Contains both exocrine and endocrine tissues Pancreatic growth provides a new way of treating pancreatic disease, including pancreatitis and pancreatic cancer I do.Example 5 Long-term growth of IPSC Long-term proliferation of IPSCs (> 1 year) requires a small number of epithelial cells and a small number of early growing pancreas The islet-like structure was achieved by continuously transferring to a new culture flask. 1 One 25cm^TwoCells from tissue culture flasks were 5-10 150 cm^TwoTissue culture Successfully expanded to Lasco. Interestingly, continuous transfer can Like the islet-like structure, it uniformly caused “melting” of the islet structure, A layer was formed (FIGS. 6A-6B). However, continuously transferred cultures are not Much faster than nutrients, and in large numbers (200-25 per square inch of culture) Zero structures also created the new islets of FIGS. 6C-6D). But after all, After continuous growth and the production of islet-like structures, the islet-like structures generally differentiate after melting. A point is reached where only those cells that have proliferated (see FIGS. 6E-6F). The same is Primary pancreatic tissue is used as primary culture under conditions that kill most differentiated cells. Growth can occur in the absence of observable islet-like structure formation You.Example 6 Analysis of islet-like structure Islet-like structures and their sections generated in immature cultures (FIGS. 4 and 5, respectively) Micrographs of serial sections (shown) again demonstrate growth homogeneity. Inn Large, slightly differentiated cells weakly stained with surin are observed in the center of the islets . The small differentiated cells stained with glucagon are clearly peripheral, while A substantial number of immature, proliferating and non-staining Undifferentiated cells were present in the inner cortex. Grow more precisely in vitro Pancreatic islet-like structures from epithelial monolayers to determine the cellular phenotype Separate, gently wash with media, then use mechanical means (eg, reverse flow pipetting, etc.) ) Destroys in the presence of proteolytic enzymes such as 0.25% trypsin This was recovered as a single cell suspension. Single cell suspension slide by cell centrifugation Were prepared and stained for general morphology or cell content. By H / E staining, Such morphologically distinct mature and immature cell types are observed. In addition, individual cells The population consists of anti-glucagon (α-cells), anti-insulin (β-cells) or Stained with any of the chin (δ cell) antibodies, which results in islet-like structures To Shows pluripotency of stem / progenitor cells. These observations highlight two points First: Weak staining for endocrine hormones is associated with in vitro generated islets Remains relatively immature and can be further differentiated by in vivo implantation. And, secondly,> 100% of the cells are endocrine hormone stained The fact that some cells are described by Teitelman (Teitelman ) Et al. (Teitelman et al., 1993, supra) as recently reported. Shows that both glucagon and insulin must be expressed simultaneously I have.Example 7: limiting dilution of pancreatic cells: cloning of a single pancreatic stem cell By the method described above, the pancreatic tissue is dispersed in the medium. Clonal production of differentiated pancreatic cells To isolate a single stem cell for life, the dispersed pancreatic cells are known in the art. Limit dilution was performed by the method. That is, for example, the initial number of cells / mL After the second evaluation, the final dilution is used for microtiter wells or this type of dilution experiment. 10-fold serial dilutions to an average of at most 0.3 cells per other suitable container Perform the parole. The cells are then allowed to settle until cell growth foci begin to develop. these Cell foci are derived from single pluripotent stem cells or IPSCs and cultured , Stem cells capable of obtaining pancreatic islet-like structures for transplantation into the body to form pancreatic-like structures It is.Example 8 Identification of Markers Associated with Different Stages of Pancreatic Stem Cell Differentiation and Different Stages of Differentiation Of floor-specific ligand-binding molecules A cell foci of isolated stem cells produced by Example 7 or a similar method Analyze both before and after differentiation induction by one or similar method. Complete from stem cells The cells at each stage up to the unipotent differentiated pancreatic cells are analyzed as follows: A.Nucleic acid: Each of the differentiation, including undifferentiated progenitor cells and fully differentiated pancreatic cells At this stage, the mRNA is isolated. Using this RNA, standard methods known in the art can be used. (Including amplification methods that rely on PCR using universal primers such as polyA, (Not limited to these) (Maniatis et al., 1982). create. Each amplification is a library of messages expressed at each stage of pancreatic stem cell development. Represents Lee. Therefore, it is absent from stem cells but present in fully differentiated pancreatic cells The message is that the cDNA from each step is hybridized and Identified by isolating the remaining message. Similarly, differentiated data Display PCR (differentiated display PCR), arbitrarily primed PCR (Arbitrarily primed PCR) or a method such as RDA-PCR (see above). That) can be used. Thus, messages unique to each stage are Identified by message subtractions that are present at other stages of the process. Also By this method, the gene products at each stage of the differentiation process were subtracted. Identified by expressing the product encoded by the message. Next, Using these gene products as antigens, monoclonal methods can be used by methods known in the art. Antibodies, including internal antibodies (J.D. ng, J.W. 1986). These antibodies are then used to develop on the cell surface of pancreatic cells. Isolate cells from a given stage of differentiation based on their affinity for the expressed marker You. Furthermore, by identifying specific markers expressed on the surface of differentiated pancreatic cells, U.S. Patent No. U.S. Pat. No. 5,320,962; U.S. Pat. No. 342,761; and WO90 / 11354; WO92 / 03917; W O93 / 04169; and WO95 / 17911. Enables the production of knockout strains of pancreatic cells by site-directed mutagenesis . Selection of mutant cells that do not produce a knockout gene product depends on the presence of that product. Against specific gene products selected to provide clones of cells Achieved using the body. B.Protein marker: Including undifferentiated progenitor cells and fully differentiated pancreatic cells At each stage of differentiation, total cells and fractions of cells are harvested by standard methods known in the art. To create an antibody. Specific examples of this process include: a)Production of rat anti-mouse IPSC mAb: Active against IPSC-specific antigen Rats were immunized with standard mouse tissues to enhance the selection of sexualized B lymphocytes. Then, 7 days after immunization, the cells are treated with cyclophosphamide. Cyclophosphamide is Reactive B cells are selectively killed, leaving rats unresponsive to standard mouse antigens. On day 14 post immunization, cells recovered from various stages of mouse IPSC culture, La Re-challenge the cells. Three to four weeks after the second antigen administration, IPSC culture Re-immunize rats with cells for 3 days, then fuse with SPO / 2 myeloma partner Let it. Antibodies that react positively are selected and cloned. b)Production of mouse anti-human IPSC mAb: Immunize mice with standard human tissue, Next, cells from various stages of human IPSC culture after cyclophosphamide treatment Except for more re-challenge, mouse anti-human IPSC mAb was Prepared using the same method as described above for the production of mAbs. c)Use of anti-IPSC mAbs in identifying various differentiation stages of islet cell proliferation : Using mAbs generated against IPSC cultured cells, FACS or Other means known in the art (eg, magnetically stabilized fluidized beds (see below), etc.) Thus, various cell populations defined by these reagents are selected. Finely screened The population of cells is responsible for their stages of differentiation (eg, insulin, Cagon, somatostatin, β-galactosidase, tyrosine hydroxylase, Reg gene co-expression) and their growth potential (eg, IPSC culture) Test their ability to initiate Reagents that define markers of cell differentiation involved in cell surface and islet neogenesis Useful for the scientific community in area research. Further, such reagents are It greatly facilitates the isolation (or enrichment) of the PSC itself. Due to the isolation of IPSC, I Instead of transplanting whole islets into DD patients or directly into the pancreas, IPSCs Test of the efficacy of internal re-transplantation, reducing the need for extra pancreas Can be avoided. In addition, these antibodies can be used to express markers expressed on the cell surface of pancreatic cells. Cells are isolated from any given stage of differentiation based on their affinity for. Differentiated Identification of specific markers expressed on the surface of pancreatic cells allows for the knockout of pancreatic cells Can be produced. Cells that do not produce unwanted gene products are present Selection is made by using antibodies to select clones of cells that do not. Similarly, markers important for T cell recognition and destruction of differentiated pancreatic cells are Activate unused T cells by whole pancreatic cells or subcellular fractions thereof Identified by The identification of markers important for T cell activation has led to The cells are modified to remove these marks, and in this differentiated state It becomes possible to produce cells that are resistant to breaking.Example 9 Isolation of Pancreatic Cells at Different Stages of Differentiation Using the markers and ligand binding molecules identified according to Example 8, Pancreatic stem cells or partially or fully differentiated pancreatic cells Can be isolated. Thus, U.S. Pat. Nos. 5,061,620; 5,437 No. 5,994,493, the method of isolating hematopoietic stem cells (stem cells). A pure population of stem cells is isolated using an antibody against the marker) And is hereby incorporated by reference in its entirety. Similarly, US Pat. No. 5,409,813 No. 4,387,849, magnetically stabilized fluidized beds ) (MSFB) for the separation of mammalian cells from a cell mixture The entirety of which is incorporated herein. Markers identified at each stage of pancreatic stem cell differentiation Antibodies bind to the magnetizable beads and cells pass through a magnetically stabilized fluidized bed. Exit. Cells that attach to antibodies bound to magnetic beads or that flow through the bed Is isolated. Any of the many other methods known in the art for isolating specific cells Can be used for These methods involve the unwanted destruction of cells by complement; Panning; immunoaffinity chromatography; elutriation; and soft agar isolation However, the present invention is not limited to these (Freshrey, R.I. ), 1988).Example 10 Factors causing pancreatic stem cell differentiation and production at different stages of stem cell differentiation Analysis of factors Cells isolated by the method of Example 9 or a similar method may be combined with the method of Example 1 or a similar method. Culture by the culture method described above. Differential factors are added to the growth medium to induce differentiation on cells. By observing the induction effect, factors important for inducing differentiation are measured. sand In other words, test conditioned media from various cells and use differentiation induction as a purification assay Then, a factor that causes pancreatic stem cell differentiation is isolated. Glucose, other compounds, e Lumon and other factors, such as serum fraction, to isolate important differentiation-inducing factors Test in the same manner. Factors produced at different stages of differentiation are used to prepare cells at different stages of the differentiation process. Isolate from the ground and analyze. These factors affect the effect of autocrine on stem cells. The same is tested for further differentiation of the fruits and partially differentiated stem cells.Example 11 Producing differentiated pancreatic cells with autoantibodies, CTL resistance, and HLA Modification of pancreatic stem cells to perform Pancreatic stem cells cultured according to Example 1 or 2 or isolated according to Example 8 were No. 5,286,632, supra; US Pat. No. 5,320,962, supra; No. 5,342,761, supra; and WO 90/11354, supra; W WO 92/03917, supra; WO 93/04169, supra; and WO 95/1. 7911, by the method as disclosed above, with autoantibody and CTL resistance Genetic modification by any method known in the art to create differentiated pancreatic cells Decorated. Alternatively, the selection of resistant stem cells can be accomplished by using these cells as autoantibodies or In the presence of IDD-related CTLs or CTLs activated with IDD-specific autoantibodies This is achieved by culturing. As a result of these methods, antibodies or T-lin Cells are created that have increased resistance to destruction by puck-dependent mechanisms. This Such cells are transformed into the appropriate tissue in the appropriate host, as disclosed in Examples 3 and 4 above. Implanted pancreas-like structures with increased resistance to destruction by autoimmune processes I will provide a. Similarly, an optionally repeated process (exposing stem cells to normal allogeneic lymphocytes, (Viable cell selection) allows human leukocyte antigen mapping of pancreatic stem cells and differentiated cells. Modifies the lofil. Alternatively, using site-directed mutagenesis, Removing the HLA marker from the surface of cells or differentiated cells, Such transfer can be achieved using new stem cells isolated from high or pancreatic-like structures. It is transplanted into a recipient mammal in need of transplantation. In a specific example, an adeno-associated virus having the neomycin resistance gene neo The (AAV) vector system is used. Transform eukaryotic cells using AAV Can be sfected (Laface, 1988). In addition, A pBABE-bleo shuttle vector system having a reomycin resistance gene is used. (Morgenstein, 1990). This shuttle vector Can be used to transform human cells with bacterial-derived genes . a)IPSC transfection: Cultured IPSCs were electroporated into pB ABE-2-bleo vector retroviral segment or direct infection With the AAV-neo vector. IPS established The adherent cells from the C culture were replaced with C-PEG buffer (supplemented with EDTA and high glucose). Gently out of the tissue culture flask using phosphate buffered saline). These cells were treated with 10% rat containing DMEM and retroviral stock. Suspend in fetal serum and subject to electroporation in the case of pBABE-bleo (electroporation Is a rather harsh operation compared to direct virus infection, The cells are tested for viability. The viability of IPSC cultured cells depends on their viability. Ability to eliminate somatic staining and, for example, glycosaminoglycans and hydropels As determined by analysis of injury-related cell products such as oxides). Recultured cells Are selected for resistance to phleomycin or neomycin, respectively. b)Identification of proviral DNA in transformed cells: Neomycin or Phleo The mycin-resistant cultured cells are transformed with the appropriate transfected viral DNA. Test for presence. Remove cells from culture flask using C-PEG buffer And digest with a cell lysis buffer containing proteinase K. DNA pheno Extracted with chloroform / chloroform and then precipitated in ethanol / sodium acetate. Ne Proviral DNA is identified using Steady PCR. Appropriate for the first reaction PCR primers that amplify the entire open reading frame of the resistant gene are used. The second In the PCR reaction, the PCR product is used as a template. Internal of known base pair size Use selected internal 5 'and 3' primers, which amplify the sequence. Final P The CR product was purified by agaro gel after electrophoresis and / or Southern blot probe binding. It is detected by ethidium bromide staining of the gel. c)Transformation stability: Transformation long-term stability Maintaining a long-term growth culture of the expanded cells, as described above, the presence of proviral DNA Is measured by periodically testing these. These tests show that transfection using IPSCs as target cells Information on the effectiveness and reproducibility of the method is provided. Furthermore, these are Establishes a second basis for using transformed IPSCs in treating the elderly .Example 12 Encapsulation of in vitro generated islets and implantation into mammals Methods for cell encapsulation are known in the art (eg, Altman (Al tman) et al., 1984, Trans. Am. Soc. Art. Organs,30: 382-386 (Honmei for reference) Where human insulinomas are selectively permeable macromolecules. Encapsulated in a capsule). Thus, optionally genetically modified according to Example 11, Isolated in vitro generated islets, or produced by Examples 3 and 4 Pancreatic structures include insulin, glucagon and somatostatin permeable capsule materials Encapsulated in Preferably such an encapsulant is hypoallergenic and Can be easily and stably placed in the target tissue and treated without disruption of the differentiated cells. The implanted structure is further protected so that differentiation into active substances is guaranteed. The examples and embodiments described herein are for illustrative purposes only, Various modifications or alterations in light of this will be suggested to those skilled in the art and It is within the spirit and scope of the application and the appended claims.

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号ＦＩＡ６１Ｋ 39/395 Ｃ０７Ｋ 14/725 Ｃ０７Ｋ 14/725 Ｃ１２Ｐ 21/02 ＡＣ１２Ｎ 5/06 21/08 5/10 Ｃ１２Ｑ 1/02 15/02 1/68 ＡＣ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｅ 21/08 ＢＣ１２Ｑ 1/02 Ａ６１Ｋ 37/02 1/68 Ｃ１２Ｎ 15/00 Ｃ ────────────────────────────────────────────────── ─── Continued on the front page (51) Int.Cl. ⁶ Identification code FI A61K 39/395 C07K 14/725 C07K 14/725 C12P 21/02 A C12N 5/06 21/08 5/10 C12Q 1/02 15 / 02 1/68 A C12P 21/02 C12N 5/00 E 21/08 B C12Q 1/02 A61K 37/02 1/68 C12N 15/00 C

Claims

[Claims] 1. Islet producing stem cells (IPSCs) for producing islet cells or islet-like structures An in vitro growth method for Pancreatic cells from a mammalian species are prepared with less than about 0.5% standard serum and less than about 1 mM glucose. Cultured in a basic nutrient medium supplemented with Growing the IPSC for at least about 3 weeks, and Cultured IPSCs were supplemented with about 0.5-10% standard serum and about 2.5 mM-10 mM glucose. Re-supplementing the nutrient medium supplemented with glucose to repopulate the mature pancreatic islet cells To start The above method, comprising: 2. The pancreatic cells are human islet cells, and the serum is standard human serum. Item 2. The method according to item 1. 3. Claims wherein the pancreatic cells are mouse islet cells and the serum is standard mouse serum. 2. The method according to item 1. 4. 2. The method according to claim 1, wherein the nutrient medium comprises a high amino acid nutrient medium. . 5. The medium used to re-feed the cell culture should also contain additional glucose. The method of claim 1, comprising: 6. The method according to claim 1, wherein the nutrient supplemented with a standard serum of the same kind. Approximately 4-5 weeks of culture growth by re-feeding the pancreatic cell culture with media The above method, wherein the differentiation of the cultured stem cells is started. 7. After re-feeding the culture and initiating cell differentiation, it is re-enriched at approximately one week intervals. The method according to claim 1, wherein the feeding is performed. 8. A standard serum is obtained from the same mammalian species from which the islet cells were obtained. The method according to claim 1, wherein 9. Claim 1. The islet-like tissue structure is produced after IPSC differentiation. The described method. 10. An islet cell produced by the method according to claim 1. 11. An islet-like tissue structure produced by the method of claim 9. 12. Culturing the pancreatic cell according to claim 1; A method for producing endocrine hormones, comprising collecting mons. 13. 13. The method according to claim 12, wherein the hormone is a human hormone. 14． 13. The method according to claim 12, wherein the hormone is a mouse hormone. 15. The method according to claim 12, wherein the nutrient medium supplemented with a standard serum is used. About 4-5 weeks of culture growth by re-feeding the IPSC cell culture in situ The method above, wherein differentiation is initiated in the meantime. 16. Endocrine hormones are insulin, glucagon, and somatostatin 13. The method of claim 12, wherein the method is selected from the group consisting of: 17． Islet cells or islet-like products produced by the method according to claim 1. Producing a mammalian pancreatic organ, comprising implanting the structure into a mammalian tissue. Raw method. 18. A pancreatic-like organ of a mammal in vivo by the method of claim 17. A method for treating a pancreatic disease in a mammal, comprising producing 19. A pancreatic-like organ produced by implanting a pancreatic islet-like structure into a mammal So, the islet-like structure Islet-producing stem cells (IPSCs) present in pancreatic cells from a mammalian species are isolated from about 0. Cultured in a basal nutrient medium supplemented with less than 5% standard serum and less than about 1 mM glucose , Growing the IPSC for at least about 3 weeks, and Cultured IPSCs were supplemented with about 0.5-10% standard serum and about 2.5 mM-10 mM glucose. Re-supplementing the nutrient medium supplemented with glucose to repopulate the mature pancreatic islet cells To start The above-mentioned organ produced by the above. 20. The islet-like structure is selected from the group consisting of α cells, β cells, and δ cells 2. The method according to claim 1, comprising cells. 21. Islet-like structures or islet cells implanted in mammals undergo transplantation 18. The method of claim 17, wherein the method is autologous to a mammal. 22. 18. The method according to claim 17, wherein the mammal is a human. 23. 20. The pancreas-like organ according to claim 19, wherein the organ is produced in a human. 24. Having a pancreatic-like organ produced by the method of claim 17, Non-human mammals. 25. 18. The mammal according to claim 17, wherein the mammal is a mouse. 26. At least one pancreatic stem cell is transplanted into a mammalian tissue. A method for producing a mammalian pancreatic organ. 27. A mammalian pancreatic-like organ produced according to claim 26. 28. At least one pancreatic stem cell is an insulin-dependent diabetes other than insulin. Have been modified so that they do not express disease autoantigens, or have stem cells 2. The method according to claim 2, wherein the protein is modified so that it does not express human leukocyte antigen when Item 7. The method according to Item 6. 29. At least one pancreatic stem cell comprises insulin, glucagon, somatostati Claim 26. The capsule of claim 26, wherein said capsule is encapsulated in a porcine and other pancreatic factor permeable capsule. The method described in the section. 30. Pancreatic stem comprising culturing at least one pancreatic stem cell in vitro Analysis method of cell differentiation. 31. Induce at least one stem cell to initiate differentiation to a pancreatic-like structure 31. The method of claim 30, further comprising: 32. MRNA or protein specific for different stages of the differentiation process 32. The method of claim 31, further comprising identifying a marker. 33. Protein markers can be expressed on the cell surface, secreted, 33. The method of claim 32, wherein is in a cell. 34. Ligand binding that selectively binds to pancreatic stem cells or more differentiated pancreatic cells A method of creating a molecule, Unused B lymphocytes or T lymphocytes are obtained by the method according to claim 33. Contact with the identified protein marker, Culture and expand the B or T lymphocytes to produce ligand binding molecules Obtain a population of cells to The above method, comprising: 35. 35. A ligand binding molecule prepared by the method of claim 34. 36. Claims: wherein the antibody is a monoclonal antibody, or a T cell receptor. Item 36. The ligand binding molecule according to Item 35. 37. Pancreatic stem cells, or any stage between pancreatic stem cells and fully differentiated pancreatic cells A method for isolating partially differentiated pancreatic cells, comprising: Binds to cell surface protein markers expressed by cells at specific stages of differentiation 36. A collection of cells including the cells, comprising the ligand-binding molecule according to claim 35. Select cells from the group, or Claims that bind to cell surface protein markers that are not present on the cell surface 35. The ligand-binding molecule according to item 35, wherein the cell is a cell population containing the cell. Select and remove cells, The above method, comprising: 38. An isolated cell isolated by the method of claim 37. 39. An isolated pancreatic stem cell or population of isolated pancreatic stem cells. 40. Treat mammals with or at risk for IDD The method a. Removing pancreatic tissue from the mammal; b. Pluripotent pancreatic cells present in pancreatic tissue are cultured in vitro to produce islet-like structures Let it run; and c. Implanting the islet-like structure in the mammal The above method, comprising: 41. Insulin-dependent diabetic self in undifferentiated or differentiated IPSC IPSC modified to not express antigen. 42. Autoantigens not expressed as a result of modification are GAD, 64 kD islet cell surface 42. The repair according to claim 41, wherein the repair is selected from a surface antigen and an HLA marker. Decorated IPSC. 43. 6. The method of claim 5, wherein the glucose is about 10-25 mM. , Hepatocyte growth / dispersion factor, keratinocyte growth factor, fibroblast growth factor, epithelium Produced by growth factor, insulin-like growth factor, nicotinamide, or IPSC The autocrine growth factor is added to enhance differentiation. One Law. 44. The claim wherein the glucose concentration in the re-supplementation medium is about 16.7 mM. 44. The method according to item 43. 45. A method for the in vitro generation of pancreatic islets from multipotent stem cells or progenitor cells. What a. The stroma of pancreatic ductal epithelial cells, or "nurs", allows the generation of IPSCs. e) establishing a cell monolayer; b. Promotes periodic regeneration of IPSCs and also prevents immature differentiation of IPSCs, Culturing conditions induce stem / progenitor cell proliferation; and c. Extending IPSC to create islet-like structures containing α, β and δ cells And differentiate, The above method comprising: 46. Continuous epithelial cells in culture and early growing islet-like structures in vitro A long-term propagation method of IPSC, which comprises transferring. 47. Large differentiated cells stained with an insulin-specific dye in the center of the islet-like structure Small differentiated cells stained with glucagon-specific dyes in the periphery; and Proliferating unstained without staining for any endocrine hormone-specific pigments in the cortex and internal cortex Islet-like structures produced in culture, characterized by transformed cells, The structure is further modified by mechanical means in the presence of a proteolytic enzyme. When the cells are disrupted into a single cell suspension, and then individual cells are stained, a glucagon-specific color Element (α cells), insulin specific dye (β cells) or somatostatin specific color Characterized by the fact that individual cell populations stained with any of the The above structure. 48. A method of in vitro neogenesis of islets according to claim 45, a. Serum with little or no glucose and a concentration of less than about 0.5%, Amino acids essential for the cells of the species from which pancreatic cells were obtained, and basic lipid sources Disperse the pancreatic cells in a minimal medium containing the cells until about 99% of the cells in the culture die. Placing (stage I); b. Add about 1 to 10 mM glucose and about 0.5% to 10% to the culture of step (a). Re-supplement the nutrients with minimal medium supplemented with% serum (but less than the toxic amount) Resupply nutrition about once a week until rapid growth occurs; c. Add 0.5% -10% serum and about 10-25 mM glue to the culture of step (b). In minimal medium supplemented with course (optionally with growth or cellular factors) Resupply nutrition (stage III); d. Germinating islet-like structures in the medium; e. Recovering islet-like structures, The above method, comprising: